Meilenstein Nr. 1: doppelt

BMBF Initiative Systembiologie
Plattform Zellbiologie
Teilprojekte
Prof. Dr. Jan G. Hengstler
Prof. Dr. A. Bader
Prof. Dr. R. Gebhardt
(Universität Leipzig)
Thema:
In
vitro
Systeme
mit
Hepatozyten:
primäre
regenerierbare Hepatozyten-Modelle
Universität Leipzig
Abteilung/Gruppe:
Kontaktperson:
Adresse:
E-mail:
Zentrum für Toxikologie
Prof. Dr. J.G. Hengstler
Johannisallee 28, 04103 Leipzig, Germany
[email protected]
(Bis 30.04.2003: Institut für Toxikologie, Universität Mainz; im Mai 2003: Umzug nach Leipzig)
Universität Leipzig
Abteilung/Gruppe:
Kontaktperson:
Adresse:
E-mail:
Institut für Biochemie
Prof. Dr. Rolf Gebhardt
Liebigstr. 16, 04103 Leipzig, Germany
[email protected];
Universität Leipzig
Abteilung/Gruppe:
Kontaktperson:
Adresse:
E-mail:
Stammzellbiologie & Zelltechnik
Univ. Professor Dr. Augustinus Bader
D 04103 Leipzig
[email protected]
Dieser Antrag umfaßt 40 Seiten.
Zellen
und
Inhalt
Seite
I. Ziele
3
II. Stand der Wissenschaft und Technik
Eigene Vorarbeiten
5
III. Arbeitsplan
1. Arbeitsgruppe Hengstler
2. Arbeitsgruppe Gebhardt
3.Arbeitsgruppe Bader
IV. Verwertungsplan
10
15
20
27
V. Arbeitsteilung/Zusammenarbeit mit Dritten
1. Vernetzung innerhalb der Plattform
2. Vernetzung außerhalb der Plattform
28
28
29
VI. Notwendigkeit der Zuwendung
29
Planungshilfen
30
Finanzierungsplan
33
Unterschriften
40
2
I. Ziele
1. In vitro Systeme mit primären Hepatozyten
Im Rahmen des Programms Systembiologie werden von mehreren Gruppen in vitro Systeme mit
primären Hepatozyten benötigt. Daher besteht eines unserer Ziele darin, den interessierten
Wissenschaftlern die beim gegenwärtigen Stand des Wissens am besten optimierten und validierten
in vitro Systeme mit Hepatozyten des Menschen, der Ratte und der Maus zur Verfügung zu stellen.
Dadurch soll ein unverzüglicher Start des Forschungsvorhabens Systembiologie ermöglicht werden.
Die folgenden in vitro Systeme stehen zur Verfügung: (i) konventionelle, zweidimensionale
Hepatozyten Kulturen auf Kollagen-beschichteten Platten (Hengstler), (ii) Sandwich-Kulturen
(Bader, Hengstler), (iii) in Alginat mikroverkapselte Hepatozyten (Hengstler), (iv) Perifusions
Kulturen (Gebhardt), 96-Well Bioreaktoren (Bader). Die spezifischen Möglichkeiten und Grenzen
der einzelnen in vitro Systeme werden unter II (Stand der Wissenschaft und Technik) im Einzelnen
aufgeführt.
2. Herstellung regenerierbarer Hepatozyten Systeme („Hepatozyten-Zellinien“)
Eine Einschränkung beim Einsatz primärer menschlicher Hepatozyten besteht darin, dass diese zur
Zeit nicht effizient in vitro expandiert werden können. Im Rahmen der vorbereitenden
Veranstaltungen zum Programm Systembiologe wurde herausgestellt, dass die Entwicklung von
„Hepatozyten-Zellinien“ eines der vorrangigen Ziele der Plattform Zellbiologie darstellen soll.
Daher möchten wir die drei beim gegenwärtigen Stand des Wissens aussichtsreichsten Strategien
zur Herstellung regenerierbarer Hepatozyten-Systeme verfolgen: (i) Konditionale Immortalisierung
primärer Hepatozyten: Es ist bekannt, dass Hepatozyten nicht proliferieren und gleichzeitig
sämtliche differenzierten Funktionen exprimieren können. Daher sieht unser Konzept vor,
Hepatozyten reversibel induzierbar (konditional) zu immortalisieren. Hierbei sollen unter
Tetracyclin abhängiger Expression von E7 und Telomerase (TET-ON-System nach Gossen und
Bujard) die Hepatozyten expandiert werden, um nach Entzug von Tetracyclin (und somit nach
Abschalten von E7 und Telomerase) eine Redifferenzierung zu erreichen. Im Gegensatz zu früheren
Versuchen zur Hepatozyten-Immortalisierung mit SV40LT haben wir schonendere
immortalisierende Faktoren (Telomerase, E7, Rb-Antisens) gewählt, um das Risiko einer
irreversiblen Dedifferenzierung zu minimieren. (ii) Generierung von Hepatozyten aus
Vorläuferzellen: Hierzu sollen u.a. mesenchymale Vorläuferzellen, aus der Leber isolierte
Vorläuferzellen und dedifferenzierte Monozyten („Kieler-Hepatozyten“) eingesetzt werden, welche
in vitro durch Generierung eines geeignete Mikromilieus zu Hepatozyten differenziert werden
sollen. (iii) Proliferation adulter Hepatozyten: Zur Zeit ist es noch nicht möglich, adulte humane
Hepatozyten in vitro zu expandieren. Dies stellt insofern eine wissenschaftliche Herausforderung
dar, da in menschlicher Leber in vivo – z.B. nach Hepatektomie – eine massive
Hepatozytenproliferation möglich ist. Wir haben Techniken entwickelt, die es ermöglichen,
kritische Parameter (vor allem: Mikroarchitektur, O2-Partialdruck, Konzentration von Wachstumsund Differenzierungsfaktoren, Nährstoffe) in der Mikroumgebung der Hepatozyten zu steuern. Es
soll untersucht werden, ob durch eine optimale Einstellung dieser Parameter eine effektive
Expansion und Redifferenzierung menschlicher Hepatozyten erreicht werden kann.
3. Analytik
Bei den Experimenten zur Herstellung von „Hepatozyten-Zellinien“ sind wir auf eine Analytik
angewiesen, die einen Vergleich der generierten mit primären Hepatozyten ermöglicht. Hierzu
stehen uns Techniken zur Verfügung, die eine umfassende Charakterisierung des Transkriptoms,
Proteoms und kritischer Funktionen der Hepatozyten ermöglichen. Die Kriterien zur Beurteilung
3
der Qualität primärer und generierter Hepatozyten wurden aufgrund von Literatur und eigenen
Daten festgelegt.
Somit garantiert unser Teilprojekt eine Versorgung des Konsortiums mit primären Hepatozyten,
entwickelt neue Hepatozytenzellinien und stellt analytische Tools zur Verfügung. Hierdurch tragen
wir – in Vernetzung mit der Plattform Modellierung und mit den Verbundprojekten – entscheidend
zum Ziel des Gesamtkonsortiums, dem Verständnis des „Systems Hepatozyte“ bei.
Vorbemerkung zur Integration der Arbeitsgruppe von Prof. Gebhardt: Die Integration der
Arbeitsgruppe von Prof. Gebhardt, Leipzig, in die Plattform Zellbiologie TP
Hengstler/Bader/Gebhardt wurde aus folgenden Gründen für förderlich in Bezug auf das
Gesamtziel des Teilprojekts erachtet: Herr Prof. Gebhardt hat mit beiden anderen Kollegen bereits
im Rahmen des BMBF-Verbundprojekts (Kz: 0311255) zusammengearbeitet und hierbei das
Perifusionssystem Modulkutivator eingebracht, das mit verschiedenen Systemen der anderen beiden
Gruppen (Sandwitch-Technik/ Kryokonservierung) gekoppelt werden kann. Er verfügt als einziger
über das Know-How zur Trennung periportaler und perizentraler Hepatocyten, sowie über
langjährige Erfahrungen bezüglich des hepatischen Glutamin- u. Ammoniakstoffwechsels,
andererseits können sich die beteiligten Gruppen bei anderen analytischen Techniken (z.B.
Fremdstoffstoffwechsel) gegenseitig unterstützen. Ferner hat die Gruppe Gebhardt ein doppelttransgenes Mausmodell mit konditionaler Expression von TGF-ß (Hepatology, 2003) entwickelt, an
dem neue Wachstumsfaktoren der Gruppe Bader getestet werden können. Die dabei verwendetet
TET-on Technologie wird in Zusammenarbeit mit der Gruppe Hengstler zur Entwicklung
konditional immortalisierter Hepatocyten mit sich ergänzenden Strategien eingesetzt. Da alle drei
Gruppen in Leipzig ansässig sind bzw. sein werden, wird ein besonders großer Synergieeffekt
(Center of Excellence) auch und gerade bei der Versorgung anderer Gruppen mit HeptaocytenSystemen erwartet.
Assoziation von Prof. F. Fändrich, Kiel: Wir halten es für wichtig, Herrn Prof. Fändrich wegen
der vielversprechenden Ergebnisse mit den Kieler Neo-Hepatozyten in unsere Plattform
Zellbiologie einzubinden. Sollte das Projekt „Neo-Hepatozyten“ mit der Universität Kiel realisiert
werden können, wird es im vorgegebenen Projektzeitraum möglich sein, ihre Beurteilung
abzuschließen. Damit wird eine Aussage vorliegen, ob aus dedifferenzierten Monozyten und
weiteren Vorläuferzelltypen voll-funktionstüchtige Neo-Hepatozyten entstehen, die primäre
Hepatozyten ersetzen können.
4
II. Stand der Wissenschaft und Technik
Eigene Vorarbeiten (Hengstler, Gebhardt)
2.1 In vitro Systeme mit Hepatozyten
In einem früheren BMBF-Projekt (Kennzeichen: 0311 258-921) haben wir (Hengster, Bader und
Gebhardt) bereits einen Forschungs-Verbund mit primären Hepatozyten aus Mensch, Maus und
Ratte versorgt. Unsere in vitro Systeme mit Hepatozyten (Abb. 1) haben inzwischen eine weite
Verbreitung gefunden und wurden u.a. ausgezeichnet mit dem Innovationspreis, RudolphBuchheim Award of the German Society for Pharmacology and Tocicology (DGPT), Aventis
Award und durch hochrangige Publikationen, z.B. in Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (Impact
factor: 20,7).
A.
B.
Abb. 1: A. Zweidimensionales Kultursystem mit menschlichen Hepatozyten auf Kollagen-beschichteten Platten. B.
In Aginat mikroverkapselte menschliche Hepatozyten nach Kryokonservierung und Auftauen. C. Primäre
Hepatozytenkultur im Kollagen (ECM) Gel. D. 96-Well Bioreaktor mit primären Hepatozyten.
2.2 Arbeiten mit Hepatozyten-Vorläuferzellen
In unseren bisherigen Arbeiten haben wir gezeigt, daß es möglich ist, in vitro expandierbare
Vorläuferzellen unter geeigneten Bedingungen zur Expression hepatozellulärer Marker zu
stimulieren (Beerheide, Hengstler, et al., 2002). Beispielsweise konnte in menschlichen
mesenchymalen aus Nabeschnurblut isolierten c-kit positiven Vorläuferzellen eine Expression von
Albumin und CYP3A4 induziert werden. Die genauere Analyse ergab jedoch, daß im Vergleich zu
primären Hepatozyten noch Unterschiede existieren, z.B. bezüglich der Expressionshöhe von
CYP2B6. Wir gehen jedoch davon aus, daß gute Aussichten bestehen, durch weitere Verfeinerung
der Bedingungen eine noch weitergehende Differenzierung via Hepatozyt zu erreichen.
Besonders vielversprechende erste Ergebnisse konnten mit dedifferenzierten menschlichen
Hepatozyten erreicht werden, die in Zusammenarbeit mit Prof. F. Fändrich aus Kiel analysiert
wurden. Nach Dedifferenzierung der Blutmonozyten und anschließender Behandlung mit einem in
Kiel entwickelten Differenzierungsprotokoll wurde ein Zelltyp generiert, der eine ausgesprochen
Hepatozyten-ähnliche Morphologie aufweist (inklusive der Ausbildung von Gallenkanalikuli) und
in unseren ersten Experimenten mit diesen Zellen eine Induzierbarkeit des Cytochrom P4501A1
aufweist, die mit primären menschichen Hepatozyten verglichen werden kann (Abb. 2). Daher
sollen diese "Kieler Neo-Hepatozyten" in dem vorgeschlagenen Arbeitsprogramm eingehend
untersucht werden.
5
Primary human hepatocytes
(mean  s.d. from 7 donors)
Jan G. Hengstler, Mainz/Leipzig
100
80
80
EROD activity
100
60
40
20
0
*
*
Solvent
control
Omeprazol
(10 µ M)
Rifampicin
(25 µ M)
(pmol/min/mg protein)
EROD activity
(pmol/min/mg protein)
Peripheral blood monocyte-derived
hepatocyte-like cells from
Prof. Fändrich and Dr. Ruhnke, Kiel
60
40
20
0
Solvent
control
Omeprazol
(10 M)
Rifampicin
(25 M)
* below detection limit of 0.04 pmol/min/mg protein
Abb. 2: Induktion von Cytochrom P4501A1 in dedifferenzierten und zu "Kieler NeoHepatozyten" redifferenzierten Monozyten (A.) im Vergleich zu primären menschlichen
Hepatozyten (B.).
1.3 Arbeiten zur konditionalen Immortalisierung von Hepatozyten
Aus früheren Arbeiten verfügen wir (Gebhardt/Hengstler) über Erfahrung bezüglich der
konditionalen (d.h. reversibel induzierbaren) Expression von Genen, die für die zelluläre
Proliferation und Differenzierung relevant sind (Hengstler et a., 2003; Ueberham et al., 2003). Als
Vorarbeit für das beantragte Projekt haben wir während der Antragsperiode bereits die für die
Immortalisierung von Hepatozyten benötigten Expressionskonstrukte hergestellt (Abb. 3). Diese
bestehen aus einem Effektor ("Treiber")-Konstrukt, das den Transaktivator tTA exprimiert. Nur in
Anwesenheit von Tetracyclin wird tTA aktiv, bindet an das tetO-Operon des "Responder"Konstrukts und induziert hierdurch die Expression unseres Zielgens, wobei wir Konstrukte mit
menschlicher Telomerase und mit E7 als Zielgene hergestellt haben. Diese Konstrukte sollen wie
im Arbeitsplan beschrieben für die Transfektion primärer, kultivierter Hepatozyten eingesetzt
werden. Über diesen in vitro Ansatz hinaus möchten wir auch immortalisierte Hepatozyten mit Hife
transgener Mäuse herstellen ("Maus-Hepatozytenzellinie"). Zu diesem Zweck haben wir bereits
transgene Mäuse hergestellt, welche das Responderkonstrukt tragen. Effektor ("Treiber")-Mäuse,
welche tTA (bzw. auch rtTA) unter dem Hepatozyten-spezifischen Promoter LAP exprimieren
wurden im Labor von Prof. H. Bujard in Heideberg hergestellt und werden zur Zeit in unserem
Tierstall mit den Telomerase bzw. E7-Respondermäusen verkreuzt.
6
A) +Tetracyclin (transiente Immortalisierung und Produktionskultur)
Leberspezifischer
Promoter
Effektor
tTA
Responder
tet O
CMV
Telomerase
polyA
polyA
Expression
 Proliferation
B) -Tetracyclin (Redifferenzierung)
Leberspezifischer
Promoter
Effektor
Responder
tTA
tet O
CMV
Telomerase
polyA
polyA
keine Expression
 Redifferenzierung
Abb. 3: Bereits vorhandene Expressionskonstrukte für die Generierung reversibel
immortalisierter Hepatozyten.
Bisherige Arbeiten (AG Bader)
In der Arbeitsgruppe Bader erfolgten weitreichende Vorarbeiten zur Entwicklung und
Charakterisierung von hepatischen Systemen für verschiedenste Anwendungsziele. Es
wurden sowohl mit primären adulten und foetalen Hepatozyten, embryonalen Zellen der
Ratte, als auch mit hepatischen Zelllinien und adulten Stammzellen des Knochenmarks
Arbeiten durchgeführt. Erfahrungen mit primären Hepatoyten bestehen b ezüglich der Maus,
der Ratte, des Schweins und des Menschens.
Kulturen der diversen Zellsysteme wurden mit spezifischen Zielsetzungen etabliert und
optimiert. Zu den verfügbaren Modellen der AGB gehören folgende Modelle:
1. Statische Systeme:
Modifizierte Sandwich Kultur, serumfreie Kulturmedien und Matrixtechnologien 3-D Kokultur,
enkapsulierte Hepatozyten;
2. Dynamische Systeme: Flachmembranbioreaktor, Multiwellbioreaktor, Hohlfaserbioreaktor,
Kryotechnologie, Prozessautomatisierung
Bei der Herstellung der Bioreaktoren werden Anforderungen des GMP berücksichtigt.
Experimentelle Arbeiten nach GLP-Erfordernissen sind in den neuen Räumen des Lehrstuhls für
angewandte Stammzellbiologie und Zelltechniken in Leipzig möglich.
7
Bei diesen Modellen handelt es sich auch um pharmakologische Testsysteme. Durch
Miniaturisierung wurde Miniobioreaktor entwickelt, der ein pharmakologisches Screening
im Kleinstmaßstab und beschleunigtem Durchsatz (96-well Platte Format) ermöglicht (HTSTechnologien):
Die analytische Charakterisierungen beinhalteten die Messung von Glukose/Laktat.
Harnstoff, Ammoniak, Albumin ELISA, Phase I: CYP450 Enzymaktivitäten Ethoxyresorufin
(EROD), Ethoxycoumarin (ECOD). Pentoxyresorufin (PROD). Phase II: Glururonyltransferase
(Substrat
4-Methylumbelliferon), Sulfotransferase (Substrat: 2-Naphthol). Glutathion-STransferase (Substrat: CDNB). Immuncytochemie (GST, CYP450`s, Albumin, AFP), Albumin
mRNA in situ Hybridisierung, Histologie, Licht- und Elektronenmikroskopie. Taqman RTPCR für
die humanen Cytochrome. 80 Arzneimittel wurden getestet. Die Detoxifikation und
Biotransformation von Xenobiotika wurde auf metabolischer und genomischer Ebene
(Detektion von Kernstrangbrüchen durch Comet Assay, Ermittlung von Mutationsraten
durch HPRT-Test, sowie durch Analyse der Genexpression mittels quantitativer RT -PCR
und LightCycler) charakterisiert;
Induktionsexperimente dokumentieren die Reaktionsfähigkeit für leberspezifischen
Cytochrome inkl. der CYP 3A Gruppe, wie auch des Phase II Stoffwechsel.
Das zellbiologische Basismodell (modifiziertes Sandwich) ist seitdem z.B. bei Altana
(vorm. Byk Gulden), Bayer AG, Glaxo, Novartis, Schering innerhalb der pharmazeutischen
Entwicklung bzw. Toxikologie als prädiktives Modell etabliert (BMBF Verbundprojektes,
Alternativemethoden für Tierversuche). Das Modell und versch. Untersuchungn wurden mit
Preisen wie:
Felix-Wankel Preis, Forschungspreis des Bundesgesundheitsministers,
Research Award der European Tissue Culture Society ETCS ausgezeichnet).
Die grossen Bioreaktoren wurden eingesetzt um on line die Generierung gößerer Mengen
(mg/g Maßstab, bis 1 kg Lebermasse) von synthetisch schwer zugänglicher
Arzneimittelmetaboliten (Phase II Metaboliten) oder auch hepatischer Proteine zu
ermöglichen.
Flachmembran
Bioreaktormodell
im
scale
up
(kryokonservierbar,
links),
Hohlfaserbioreaktor bestehend nur aus oxygenienden Fasern (nicht kryokonservierbar,
rechts).
Eine präklinische Testung erfolgte als bioartifizielles Lebersupport System während einem
akuten Leberversagens im Schweinemodell. Die Überlebenszeit bei vollständiger
Hepatektomie konnte gegenüber der Kontrollgruppe verdoppelt werden.
Bei beiden Systemen, sowohl im Hohlfaserprinzip, als auch in Flachmembranmodulen
konnte eine optimale Oxygenierung als wesentliches unterstützendes, funktionserhaltendes
Prinzip erreicht werden.
8
Expansion primärer foetaler und adulter Hepatozyten und Wiederausbildung eines
metabolisch kompetenten Phänotypus durch das Mikromilieu
Der AGB ist es gelungen einen neuen Wachstumsfaktor für primäre Hepatozyten zu
entdecken und zu charakterisieren. Mit HGF konnten wir Verdopplungen der Zellzahlen
erreichen. Der Faktor hat ein anderes molekulares Verhalten als HGF, aber auch eine
erheblich stärkere Wirkung. Primäre Hepatozyten der Ratte konnten um den Faktor 30
innerhalb von 72h vermehrt werden. Dieser dramatische Effekt war jedoch abhängig von
dem gewählten Mikromilieu (Struktur und Geometrie der ECM).
Untersucht wuden: Laminin, Collagen I und IV, Fibronektin, Matrigel, fee der-Zellen wie
3T3, MRC-5 und primären Fibroblasten, Supplemente. Verglichen wurden HGF, EGF,
TGFalpha.
Metabolische Kompetenz in vitro generierter Hepatozyten
Zu den hepatischen Grundfunktionen zählen Cytochrom P450 3A abhängige Leistungen . Die
Komplexizität des hepatischen Expressionsmusters beinhaltet auch andere Subtypen, wie
CYP1A. Letzere werden jedoch auch in Endothelzellen und glatte Muskelzellen exprimiert
(Bader et. al 2003).
Primäre adulte Hepatozyten der Ratte exprimierten nach Stimulation mit Wachstumsfakoren
(EGF, HGF) bei Einbringung in ein geeignetes Mikromilieu gleichwertige katalytische
Aktivitäten vollbringen wie primäre Hepatzyten (Biotransformation des Arzneimittels
Urapidil, CYP 3A). Es gelingt adulte Zellen zu vermehren und bei den de novo
generierten Hepatozyten vergleichbare metabolischen Aktivitäten auch bei komplexen
Stoffewechselprozessen wie dem Arzneimittelmetabolismus zu erreichen. Diese
Redifferenzierung ist weniger vom verwendeten Wachstumsfaktor abhängig als von dem
Differenzierungsmilieu der Hepatozyten in vitro.
Zellspezfische Leistungen der Biotransformation (Urapidil) in primären Hepatozyten der
Ratte nach Vermehrung und Redifferenzierung. Stimulation mit Wachstumsfaktor (HGF) am
Tag 0:
9
III. Wissenschaftliche und technische Arbeitsziele des Vorhabens mit
Arbeitsplan
1. Arbeitsgruppe Hengstler (bis April 2003: Institut für Toxikologie, Universität Mainz; ab
Mai 2003: Zentrum für Toxikologie, Universität Leipzig)
1.1 Versorgung mit Hepatozyten in vitro Systemen
In vorausgegangenen BMBF-Verbundprojekten (Kennzeichen: 0311 258-921) haben wir in vitro
Systeme mit Hepatozyten des Menschen, der Ratte und der Maus (und weiterer Spezies) optimiert
und validiert. SOPs für die Isolierung von Hepatozyten und die Herstellung der in vitro Systeme
wurden aufgestellt. Um dem Verbund „Systembiologie“ einen unmittelbaren Start zu ermöglichen,
werden wir diese in vitro Systeme herstellen und unseren Kooperationspartnern (Vienken, Runge,
Weizsäcker, Keppler, König, und weitere) zur gemeinsamen Bearbeitung von Fragestellungen
innerhalb des Verbundes Systembiologie zur Verfügung stellen. Hierbei handelt es sich um
folgende in vitro Systeme mit Hepatozyten des Menschen, der Maus und in einigen Fällen auch der
Ratte:
-
Konventionelle, zweidimensionale Kulturen auf kollagenbeschichteten Platten
Dreidimensionale Kulturmodelle
o Sandwich-Kulturen,
o in Alginat mikroverkapselte Hepatozyten,
Die in vitro Systeme mit Hepatozyten sollen am Tag 2 (d.h. einen Tag nach der Isolierung) mittels
eines kommerziellen Transportdienstes an die Kooperationspartner geschickt werden. Hierbei
übernehmen wir (AG Hengstler) vollständig die Kosten für Hepatozyten-Isolierung und Herstellung
der in vitro Systeme und die jeweiligen Kooperationspartner die Kosten für den Transport.
Zusätzlich zu den aus frisch isolierten Hepatozyten hergestellten in vitro Systemen werden auch
kryokonservierte verkapselte Hepatozyten den Kooperatonspartnern zur Verfügung gestellt werden.
1.2 Konditional immortalisierte Hepatozyten
Meilenstein Nr. 1: Transfektion
In diesen Experimenten sollen durch reversibel induzierbare Expressionskonstrukte für Telomerase
und E7 ein induzierbares An- und Abschalten dieser Faktoren ermöglicht werden. In unseren
Vorarbeiten haben wir bereits die folgenden Expressionskonstrukte hergestellt (Abb. 5): (i) Das
„Treiber-Konstrukt“ ermöglicht die Expression des reversen Transaktivators rtTA. Das
Transaktivatorprotein rtTA benötigt Doxycyclin oder Anhydrotetracyclin (ATc), um aktiv zu
werden. (ii) Das „Responder-Konstrukt“ für menschliche Telomerase. Dieses Konstrukt exprimiert
Telomerase unter Kontrolle des von tTA-ahängigen Promotors (TetO). Zusätzlich kodiert das
Telomerase Konstrukt zur Expressionskontrolle EGFP, welches über eine IRES-Sequenz an das
Telomerase Konstrukt angeschlossen ist. (iii) Das „Responder-Konstrukt für menschliches E7“, das
ebenfalls unter Kontrolle von TetO das Zellzyklus-Aktivatorprotein E7 exprimiert.
Diese Konstrukte sollen mittels eines kommerziell erhältlichen „Lipofektamin-Transfektionskits in
maximal nur 25%-konfluente Kulturen mit menschlichen Hepatozyten kotransfiziert werden. Dabei
ist vorgesehen, zunächst Telomerase und E7 jeweils alleine, aber auch Telomerase und E7 synchron
zu transfizieren. Das hat den Hintergrund, dass wir eine möglichst schonende Transfektionstechnik
anstreben, welche keine irreversibel dedifferenzierenden Einflüsse zur Folge hat. Daher würden wir
eine Hepatozytenlinie bevorzugen, die durch nur einen der beiden Faktoren – Telomerase oder E7 immortalisiert wurde. Aufgrund theoretischer Überlegungen ist jedoch zu erwarten, dass beides, der
stabile Erhalt der Telomerintegrität (vermittelt durch Telomerase) und ein reversibles
10
Antagonisieren der Zellzyklusbremsen Rb und p53 (vermittelt durch E7) erforderlich sein wird. Die
Kontrolle der erfolgreichen Transfektion erfolgt anhand der Expression von EGFP im
Fluoreszenzmikroskop.
Meilenstein Nr. 2: Identifikation reversibel induzierter Klone
Erfolgreich transfizierte menschliche Hepatozyten sollen in unserem für Hepatozyten optimierten
Kulturmedium (Hengstler et al., 2000a,b) in Anwesenheit von Anhydotetracyclin gehalten werden,
um zu beobachten, ob einzelne Hepatozytenklone zu proliferieren beginnen. Von diesen
proliferierenden Hepatozytenklonen sollen etwa 40 isoliert und individuell mittels Western Blot auf
die Expression von Telomerase und/oder E7 untersucht werden. In einem nächsten Schritt soll den
Hepatozyten Anhydrotetracyclin im Kulturmedium entzogen werden, um zu untersuchen, ob (i) die
Expression von Telomerase und E7 abnimmt und (ii) die Proliferation der Hepatozyten (gemessen
an Zellzahl und immunhistochemischer Expression von ki67) gestoppt werden kann. Solche
Hepatozytenklone, deren E7- und Telomerase-Expression wieder abgeschaltet und deren
Proliferation nach Anhydrotetracyclin-Entzug wieder gestoppt werden kann, werden in Folgenden
als „reversibel induzierbar“ bezeichnet. Drei „reversibel induzierbare“ Hepatozytenklone sollen
weiter untersucht werden.
Meilenstein Nr. 3: Charakterisierung reversibel induzierbarer Klone
Drei reversibel induzierbare Hepatozytenklone sollen unter Anwesenheit von Anhydrotetracyclin
expandiert werden. Nach Erreichen der Konfluenz soll Anhydrotetracyclin entzogen und die Zellen
für 7 Tage in unserem für Hepatozyten optimierten Medium (Hengstler et al., 2000a,b) gehalten
werden. Anschließend soll zunächst ein „kleines Analysenprogramm“ (Tabelle 1) mit diesen
Hepatozyten durchgeführt werden, wobei aus Gründen der Praktikabilität nur solche Techniken
durchgeführt werden, die in unserem Labor etabliert sind und für die wir bezüglich Hepatozyen des
Menschen, der Maus und der Ratte über historische Daten verfügen :
Tabelle 1: Kriterien zur Beurteilung humaner Hepatozyten ("kleines Analysenprogramm)":
Die aufgeführten Enzymaktivitäten eignen sich zur Beurteilung menschlicher Hepatozyten. Die angegebenen
Bereiche sind wegen der interindividuellen Variabilität relativ groß. Entscheidend ist, daß jeweils der untere Wert
nicht unterschritten wird. Für die Charakterisierung von Hepatozyten in der Routine müssen nicht alle aufgeführten
Parameter bestimmt werden. Eine Minimalcharakterisierung kann sich z.B. auf die Testosteron-6-Hydroxylierung
(6-OHT) und die O-Demethylierung von Dextromethorphan (DEX) beschränken. In der Regel sind bei
ausreichender Aktivität letztgenannter Funktionen auch die anderen Enzymaktivitäten akzeptabel. Die unten
aufgeführten Aktivitäten beziehen sich jeweils auf mg Protein aus Homogenat von Hepatozyten. Falls Mikrosomen
aus Hepatozyten isoliert werden gelten etwa 5-fach höhere Werte.
I. Basisaktivitäten
Phase I-Metabolismus
1.
Aktivität: Testosteron-6-Hydroxylierung (6-OHT)
Abgefragte Enzyme: Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4)
Bereich: 50 - 1000 pmol/min/mg
2.
Aktivität: O-Demethylierung von Dextromethorphan (DEX)
Abgefragte Enzyme: CYP2D6
Bereich: 4 - 60 pmol/min/mg
3.
Ethoxyresorufin-O-deethylierung (EROD)
Abgefragte Enzyme: CYP1A1, CYP1A2
Bereich: 0,2 - 4 pmol/min/mg (liegt nur wenig über der Nachweisgrenze)
4.
Ethoxycumarin-O-dealkylase (ECOD)
Abgefragte Enzyme: CYP1A1, 1A2, 2A1, 2B6, 2C, 2E1
Bereich: 10 - 100 pmol/min/mg
11
Tabelle 1: Fortsetzung
Phase II-Metabolismus
1.
Aktivität: UDP-Glucuronidierung von 4-Hydroxybiphenyl
Abgefragte Enzyme: UDP-Glucuronosyltransferasen (UDP-GT)
Bereich: 8 - 80 nmol/min/mg
2.
Aktivität: UDP-Glucuronidierung von 4-Methylumbelliferon
Abgefragte Enzyme: UDP-Glucuronosyltransferasen (UDP-GT)
Bereich: 1 - 10 nmol/min/mg
3.
Aktivität: Konjugation von 2-Naphthol mit Sulfat
Abgefragte Enzyme: Sulfotransferasen (ST)
Bereich: 0,06 - 0,6 nmol/min/mg
4.
Aktivität: Konjugation des Substrats CDNB mit Glutathion
Abgefragte Enzyme: Glutathion-S-transferase (GST) mit Ausnahme der GSTT1
Bereich: 0,4 - 5,0 µmol/min/mg
II. Enzyminduktion
1. Rifampicin:
6-OHT mindestens 3-fach der Basisaktivität
2. Omeprazol:
EROD mindestens 3-fach der Basisaktivität
3. Phenobarbital:
6-OHT mindestens 3-fach der Basisaktivität
III. mRNA Expressionen
Die Analysen der folgenden Faktoren erfolgen mit quantitativer RT-PCR im Taqman:
- CYP3A4
- CYP2B6
- CYP2D6
- Albumin
- GATA4
- alpha1-Antitrypsin
- Faktor VIII
IV. Weitere Funktionen
Albuminsekretion: 50 - 500 ng/h/106 Hepatozyten (kann nur mit intakten Hepatozyten
bestimmt werden)
Gerinnungsfaktor VIII und IX-Sekretion
Die Ergebnisse sollen mit unseren historischen Daten verglichen werden, die für primäre
Hepatozyten (Mensch, Ratte, Maus) bereits vorliegen. Falls in diesem „kleinen
Analysenprogramm“ mit reversibel induzierten Hepatozyten ähnliche Resultate erzielt werden wie
mit den primären Hepatozyten, soll das „große Analysenprogramm“ durchgeführt werden. Dies
erfolgt in Zusammenarbeit mit weiteren Gruppen unserer Plattform (siehe Tabelle 2 des PlattformAntrags) und umfasst sämtliche dort aufgeführten Techniken, welche das Transkriptom (z.B. LeberChips; Prof. Bader), das Proteom und zahlreiche hepatozelluläre Funktionen sehr umfangreich
abtesten und daher zu einem sehr präzisen Ergebnis kommen werden, ob die generierten Zellen
Hepatozyten entsprechen. Auch diese Analysen erfolgen im Vergleich zu primären Hepatozyten.
Falls auch im „großen Analysenprogram“ gute (d.h. primären Hepatozyten entsprechende)
Resultate erzielt werden, sollen die konditional immortalisierten Hepatozyten den interessierten
Gruppen außerhalb unserer Plattform für deren systembiologische Fragestellungen zur Verfügung
gestellt werden.
12
Meilenstein Nr. 4: Transgene Mäuse und Maushepatozyten
Die beschriebenen Versuche sollen zunächst mit humanen Hepatozyten durchgeführt werden, da
nach Auskunft unserer Kooperationspartner an einer „Humanen Leberzellinie“ ein besonders großes
Interesse besteht. Gleichzeitig besteht jedoch auch ein Bedarf an konditional immortalisierten
Maushepatozyten. Zur Generierung dieser Zellen soll vergleichbar dem oben beschriebenen
Arbeitsplan für humane Hepatozyten (Meilensteine 1-3) vorgegangen werden. Gleichzeitig soll
jedoch noch eine zweite experimentelle Strategie verfolgt werden, die ggf. (dies ist jedoch nicht im
Einzelnen vorhersagbar) einfacher zum Ziel führen könnte: aus unseren Vorarbeiten stehen uns
transgene „Respondermäuse“ zur Verfügung, die E7 unter TetO-Kontrolle exprimieren. Diese
Mäuse sollen mit LAPrtTA „Driver-Mäusen“ (Schönig et al., 2003) verpaart werden. Letztere
exprimieren unter dem Hepatozyten-spezifischen Promotor LAP den Transaktivator rtTA, arbeiten
also nach dem TET-ON Prinzip. Diese Mäuse stehen uns durch unsere Kooperation mit Prof.
Helmut Bujard und Dr. Kai Schönig zur Verfügung und werden bereits auch von Prof. Gebhardt in
unserer Plattform Zellbiologie eingesetzt. Aus den verpaarten Mäusen mit Genotyp LAPrtTA x
tetOE7 sollen Hepatozyten isoliert und kultiviert werden. Die weitere Untersuchung und
Beurteilung dieser Zellen erfolgt wie unter Meilenstein 3 (zunächst "kleines Analysenprogramm"
entsprechend Tab. 1, anschließend ggf. "großes Analysenprogramm") beschrieben.
1.3 Generierung von Hepatozyten aus Vorläuferzellen
Aus einem früheren Forschungsprojekt (DFG, He2509/2-1) stehen uns zwei gut charakterisierte
somatische Stammzellinien zur Verfügung. Hierbei handelt es sich um eine mesenchymale
Vorläuferzellinie (Beerheide et al., 2002) und in Kooperation mit Prof. H. Zulewsky (Basel) eine
Nestin positive Vorläuferzellinie aus menschlichen Inseln des Pankreas (Zulewsky, Basel).
Weiterhin stehen uns Vorläuferzellen aus menschlicher Leber und aus der Leber der Maus zur
Verfügung. Mit diesen Vorläufer-Zellinien, konnten wir eine teilweise Transdifferenzierung zu
einer „Hepatozyten-ähnlichen“ Zelle erreichen (Beerheide, Hengstler et al., 2002). Nach
Behandlung mit Differenzierungsmedien als auch nach Transplantation in die Lebern von Mäusen
exprimieren diese Zellen z.B. Albumin, -Fetoprotein und weitere Marker, die typischerweise in
Hepatozyten exprimiert werden (Beerheide, Hengstler et al., 2002). Dennoch können diese aus
Vorläuferzellen gewonnenen „Hepatozyten-ähnlichen“ Zellen noch nicht als Ersatz von primären
Hepatozyten empfohlen werden, weil die Expression einiger Faktoren, z.B. CYP2B6, noch fehlt. In
unserem Arbeitsprogramm sollen daher in vitro die Schlüssel-Parameter optimiert werden, welche
eine weitere Differenzierung der generierten hepatozytenähnlichen Zellen bewirken. Hierzu sollen
folgende Parameter systematisch variiert und ihr Einfluß untersucht werden:
1.3.1 Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren im Kulturmedium
Hierzu sollen dem für Hepatozyten optimierten Kulturmedum die folgenden Wachstums- bzw.
Differenzierungsfaktoren zugesetzt werden: HGF, bFGF, EGF. Der Zusatz erfolgt sowohl einzeln
als auch in Kombination. Die Konzentrationen sollen zwischen 10 und 100 ng/ml variiert werden.
1.3.2 Optimierung von Architektur und extrazellulärer Matrix
In diesen Experimenten sollen die Stammzellen unter folgenden Bedingungen kultiviert werden: (i)
auf Kollagen beschichteten Platten, (ii) im Kollagen Sandwich, (iii) im Matrigel, (iv)
mikroverkapselt in Alginat, (v) in Bioreaktorsystemen in Kooperation mit Prof. Gebhardt, Prof.
Vienken und Prof. Bader. Unter den o.g. Bedingungen sollen die Vorläuferzellen für bis zu 21 Tage
13
gehalten werden. Danach erfolgt die Beurteilung der Qualität wie unter 1.2 (Meilenstein 3; Tabelle
1) beschrieben, wobei zunächst das „kleine“, danach ggf. das „große Analysenprogramm“ zum
Einsatz kommen soll.
1.3.3 Untersuchung der Kieler „Neo-Hepatozyten“
Meilenstein Nr. 1: Optimierung der Dexamethason-Konzentration
Wie unter „Vorarbeiten“ beschrieben, haben wir mit den „Neo-Hepatozyten“ aus dem Labor von
Prof. Fändrich bereits erste vielversprechende Ergebnisse erzielt. Bei diesen Neo-Hepatozyten
handelt es sich um hepatozytenähnliche Zellen, die aus dedifferenzierten Monozyten abgeleitet
wurden. Jedoch wurde bisher mit den „Kieler-Hepatozyten“ keine ausreichende Induktion von
CYP3A4 durch den Induktor Rifampicin erreicht. Dies könnte jedoch darauf zurückzuführen sein,
dass das „Kieler-Differenzierungsmedium“ kein Dexamethason enthält. Das ist ein permissiver
Faktor bezüglich der CYP3A4 Induktion. Daher sollen zwei experimentelle Strategien verfolgt
werden, um zu untersuchen, ob die „Kieler Neo-Hepatozyten“ zur CYP3A4-Induktion fähig sind:
(i)
Dem „Kieler-Differenzierungsmedium“ soll Dexamethason in Konzentratonen
zwischen 10 und 1000 nM zugesetzt werden. Anschließend erfolgt eine
Inkubation mit 25 µM Rifampicin für 72 h und die Bestimmung der Aktivität der
6-Hydroxylierung von Testosteron.
(ii)
Die „Kieler Neo-Hepatozyten“ sollen mit dem „Mainzer-Hepatozytenmedium“
(Hengstler et al, 2000a;b) kultiviert und auf Induzierbarkeit von CYP3A4 durch
Rifamipicin untersucht werden. Das „Mainzer-Hepatozytemedium“ wurde in
einem früheren BMBF-Verbundprojekt (Kennzeichen: 0311 258-921) für
menschliche Hepatozyten optimiert.
Meilenstein Nr. 2: Optimierung der Kulturbedingungen
Die Kieler „Neo-Hepatozyten“ sollen unter Bedingungen kultiviert werden, die für primäre
Hepatozyten optimiert wurden, wobei folgende Systeme zum Einsatz kommen sollen:
(i)
Kultur zwischen Kollagengelen (Sandwich)
(ii)
Mikroverkapselung in Alginat
(iii) Kultivierung
in
Bioreaktoren
mit
steuerbarer
Konzentration
an
Wachstumsfaktorkonzentrationen, O2-Partialdruck und Strömungseigenschaften
(Kooperation mit Prof. Gebhardt, und Prof. Viencken).
(iv)
Kultur im 96-Well Bioreaktor. Diese Untersuchung erfolgt in Kooperation mit Prof.
Bader. Die Vorzüge des 96-Well Bioreaktors bestehen in der Möglichkeit einer
Roboterisierung in Hinblick auf eine spätere industrielle Nutzung.
Meilenstein Nr. 3: Abschließende Qualitätsbeurteilung:
Die Qualitätsbeurteilung erfolgt wie unter 1.2 (Meilenstein 3; Tabelle 1) beschrieben, indem
zunächst das „kleine Analysenprogramm“ und im Falle guter Ergebnisse (d.h. vergleichbare Daten
wie bei primären Hepatozyten) das „große Analysenprogramm“ durchgeführt wird. Im Falle
zufriedenstellender Ergebnisse mit dem optimierten in vitro System der „Kieler Hepatozyten“,
sollen diese den Partnern auch außerhalb der Plattform Zellbiologie für die Bereitung auch
systembiologischer Fragestellung zur Verfügung gestellt werden.
14
2. Arbeitsgruppe Gebhardt (Institut für Biochemie, Medizinische Fakultät, Universität
Leipzig)
2.1 Serviceleistungen zur Versorgung mit (perifundierten) Hepatozyten und HepatocytenSubpopulationen
Um dem Verbund „Systembiologie“ einen unmittelbaren Start zu ermöglichen, wollen wir die von
uns in früheren Projekten etablierten und validierten Zellsysteme und Kultivierungsverfahren
(Perifusion) allen interessierten Kooperationspartnern (Bader, Guenther, Emans, Hengstler,
Vienken, und weitere) zur Nutzung, zum Austausch und zur gemeinsamen Bearbeitung der
Fragestellungen innerhalb des Verbundes Systembiologie zur Verfügung stellen. In Bezug auf die
Zellsysteme handelt es sich um Hepatocyten von Maus und Ratte (aber auch des Menschen) und
insbesondere um periportale und perizentrale Subpopulationen dieser Spezies. Außerdem haben wir
eine große Sammlung von Zellklonen, die sich vom Rattenleber-Endothel ableiten und sich
besonders gut für die Co-Kultivierung mit Hepatocyten eignen, um eine phänotypische
Stabilisierung zu erreichen. Auch diese Sammlung soll mit den Verbundpartnern ausgetauscht
werden. SOPs zu diesen Techniken wurden im Rahmen früherer Projekte erstellt und sind
großenteils bereits veröffentlicht (Gebhardt, 2002). Zusätzlich können wir die Kooperationspartner
mit Maus-Hepatocyten aus unseren doppelt-transgenen Mäusen mit konditionaler Expression von
TGF-ß versorgen. Diese Hepatocyten können, nach Anschalten der TGF-ß-Expression in vivo vor
der Isolation oder in vitro nach der Isolation und Kultivierung, Auskünfte über die Reaktion der
Hepatocyten auf TGF-ß in der natürlichen bzw. künstlichen Umgebung geben und stellen somit ein
ideales Ausgangsmaterial sowohl zur Evaluierung von Kulturbedingungen als auch für
systembiologische Untersuchungen dar.
Bezüglich der Kultivierungsverfahren haben wir zusammen mit den Kollegen Hengstler und Bader
in einem vorausgegangenen BMBF-Verbundprojekt (Kennzeichen: 0311255A-TP6) in vitro
Kultivierungssysteme optimiert und validiert. Unser Part hierbei betraf die Perifusionskultivierung
mit dem Modulkultivator. Die äußerst flexiblen Einsatzmöglichkeiten des Modulkultivators
umfassen:
-
Reinkultur von Hepatocyten auf kollagenbeschichteten Zellträgern
Co-Kultur von Hepatocyten und endothelialen Zelllinien
Sandwich-Kulturen von reinen und gemischten Zellpopulationen
Cryopräservierung von Zellpopulationen auf den dafür optimierten Zellträgern und rasches
Auftauen im Modulkultivator
Die Cryopräservierung mit/im Perifusionssystem kann von jedem Partner mit Zellen seiner Wahl
auf den von uns lieferbaren speziellen Zellträgern erfolgen, was insbesondere für menschliche
Hepatocyten, die immer stoßweise anfallen, von großer Wichtigkeit ist. Die tiefgefrorenen
Zellkulturen können auf den Trägern in Trockeneis verschickt und im Perifusionssystem aufgetaut
werden. SOPs für dieses Verfahren und für die anderen o.g. Einsatzmöglichkeiten wurden bereits
ausgearbeitet. Der Austausch mit den Kooperationspartnern wird so geschehen, daß Zellisolierung
und Perifusionskultivierung einschließlich der Kosten von unserer Arbeitsgruppe übernommen
werden und der Transport vom Empfänger getragen wird.
2.2
Systementwicklungen
2.2.1 Konditional immortalisierte (Maus-)Hepatozyten
Unsere Ansätze zu konditional immortalisierten Hepatocyten sind in Ergänzung bzw. direkter
Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Hengstler zu sehen und gehen von demselben, bisher
15
separat in den zwei Arbeitgruppen verwendeten TET-On/Off- System aus. Grund für diese teilweise
Parallelität ist die geringe Vorhersagbarkeit was das Gelingen einer einzelnen Strategie zur
Immortalisierung von Hepatocyten betrifft. Deshalb wollen wir uns alternativ zu dem von der
Gruppe Hengstler verwendeten HPV-E7 auf eine konditionale Antagonisierung von Rb durch
entsprechende Antisens-Gene („Rb-knockout“) unter Kontrolle des TetO-Promoters konzentrieren.
Bei Gelingen dieses Ansatzes soll, sofern dies zusätzlich nötig oder gewinnbringend erscheint, eine
Ergänzung/Erweiterung durch Telomerase-Induktion in direkter Kooperation mit der Gruppe
Hengstler vorgenommen werden.
Zuerst wollen wir die genannte Strategie in transgenen Mäusen erproben, da wir hier die meisten
Vorarbeiten erbracht haben, und diese im Erfolgsfall dann auf menschliche Hepatocyten anwenden.
Meilenstein 1: doppelt-transgene Mäuse mit konditionalem „Rb-knockout“
Diese Arbeiten bauen auf den von uns in Zusammenarbeit mit Prof. Bujard generierten doppelttransgenen Mäusen mit konditionaler Expression von TGF-ß auf (Ueberham et al., 2003). Aus
diesen Studien stehen uns die zwei Transaktivator-Mauslinien TALAP-1 und TALAP-2 zur
Verfügung. Vorarbeiten (s. dort) für die zusätzlichen Mauslinien, die eine Luciferase(GFP)/RbAntisens-Gen-Transkriptionseinheit unter der Kontrolle von TetO enthalten, sind bereits im Gange.
Die verpaarten Tiere hätten dann den Genotyp TALAP-2/PtetRb-Antisens-Gen und sollten, da sie mit
dem Aktivator tTA arbeiten, die Rb-Antisens-Gene in Abwesenheit von Doxocyclin exprimieren,
was sich an Hand des Reportergens Luciferase oder GFP detektieren ließe. Wir werden zuerst nur
den normalen tTA-Aktivator und nicht die reverse Form rtTA verwenden, da letztere in unseren
Händen zu einer störenden „leaky“-Expression in Anwesenheit von Doxocyclin führt, die eine
fortschreitende Dedifferenzierung zur Folge haben könnte.
Meilenstein 2: Charakterisierung der phänotypischen Konsequenzen des konditionalen Rbknockouts
Die Konsequenzen der konditionalen Ausschaltung der Zellzyklus-Repression durch Rb soll sowohl
in vivo als auch ex vivo untersucht werden. In vivo ist insbesondere das Proliferationsverhalten der
Hepatocyten in der normalen und der geschädigten Leber (z. B. nach Behandlung mit
Tetrachlorkohlenstoff , Concanavalin A oder Diethylnitrosamin) von Interesse. Bei
Langzeitstimulation (in Gegenwart von Phenobarbital) ist auch an vermehrte Tumorentwicklung zu
denken. Da in vivo bei Kurzzeitstimulation jedoch in jedem Fall mit einer Gegenregulation zu
rechnen ist, die eine unkontrollierte Vermehrung verhindert, sind vor allem ex vivo Experimente
geeignet, das proliferative Potential dieser Zellen abzuschätzen. Hierzu sollen die Zellen isoliert und
erst in Kultur die Rb-Antisens-Gene exprimiert werden. Mit solchen Kulturen werden zuerst die
Wachstumseigenschaften der Hepatocyten charakterisiert, sodann die phänotypischen
Konsequenzen sowohl während der Wachstumsphase (Entzug von DOX) als auch während der
folgenden Differenzierungsphase (Zugabe von DOX). Diese Charakterisierung erfolgt an Hand der
Analyseparameter, die in unserem Labor etabliert sind (s.u.), bzw. in Zusammenarbeit mit der
Gruppe Hengstler. Grundsätzlich können aus solchen „Primärkulturen“ Klone mit der gewünschten
Eigenschaft der konditionalen Vermehrung selektioniert werden, was in einem vertretbaren Umfang
versucht werden soll, um immortalisierte Mauszelllinien zu erhalten.
2.2.2 konditional immortalisierte Human-Hepatocyten
Meilenstein 3: Generierung und Klonierung konditional immortalisierter humaner
Hepatocyten
Die Immortalisierungsstrategie mittels Rb-Antisens-Genen soll, wenn sie bei den doppelttransgenen Mäusen erfolgreich ist, unmittelbar auf menschliche Hepatocyten angewandt werden,
wobei dann allerdings die Transfektion der erforderlichen Konstrukte in Primärzellen erforderlich
ist. Hierzu werden in zwei Schritten humane Hepatocyten mit den Konstrukten (i) tTA unter der
Kontrolle des Hepatocyten-spezifischen Promoters LAP und (ii) Rb-Antisens-Gene unter der
16
Kontrolle von TetO und eines Minimalpromoters transfiziert. Zur schonenden Transfektion werden
wir Effectene verwenden (Gaunitz et al., 2001). Nach dem ersten und dem zweiten
Transfektionsschritt soll bzw. muß eine Klonierung entsprechender Zellen mit stabiler Expression
erfolgen, wobei letztere bereits unter angeschaltetem Transgen erfolgen kann. Dabei muß nicht nur
auf die stabile Integration der Transgene in das Hepatocytengenom getestet, sondern auch die
Reversibilität der Proliferationseigenschaft überprüft werden. Für diese Techniken sind wir aus
früheren Forschungsvorhaben bestens vorbereitet.
Meilenstein 4: Phänotypische Konsequenzen der konditionalen Immortalisierung
Ähnlich wie bei den konditionalen Maushepatocyten (MS 2) müssen auch hier die Konsequenzen
für die Erhaltung des hepatozellulären Phänotyps charakterisiert werden. Dies muß an mehreren (ca.
10 – 20) Klonen erfolgen, da je nach Integrationsort der Transgene Unterschiede im
Differenzierungszustand zu erwarten sind. Die Charakterisierung erfolgt an Hand der in Tabelle 2
aufgeführten Testparameter, wobei zur Reduzierung des Aufwandes und der Kosten an eine
zumindest teilweise Zusammenlegung dieser Messungen mit ähnlichen Schritten in der AG
Hengstler gedacht ist.
17
Tabelle 2: Testparameter zur Beurteilung humaner Hepatozyten (AG Gebhardt): Die aufgeführten
Enzymaktivitäten wurden/werden zur Beurteilung menschlicher Hepatozyten in unserem Labor eingesetzt.
I. Basisaktivitäten
Phase I-Metabolismus
1.
Aktivität: Testosteron-6-Hydroxylierung (6-OHT)
Abgefragte Enzyme: Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4)
Bereich: 50 - 1000 pmol/min/mg
2.
Aktivität: O-Demethylierung von Dextromethorphan (DEX)
Abgefragte Enzyme: CYP2D6
Bereich: 4 - 60 pmol/min/mg
3.
Ethoxyresorufin-O-deethylierung (EROD)
Abgefragte Enzyme: CYP1A1, CYP1A2
Bereich: 0,2 - 4 pmol/min/mg (liegt nur wenig über der Nachweisgrenze)
4.
Ethoxycumarin-O-dealkylase (ECOD)
Abgefragte Enzyme: CYP1A1, 1A2, 2A1, 2B6, 2C, 2E1
Bereich: 10 - 100 pmol/min/mg
Phase II-Metabolismus
1.
Aktivität: UDP-Glucuronidierung von 4-Hydroxybiphenyl
Abgefragte Enzyme: UDP-Glucuronosyltransferasen (UDP-GT)
Bereich: 8 - 80 nmol/min/mg
2.
Aktivität: UDP-Glucuronidierung von 4-Methylumbelliferon
Abgefragte Enzyme: UDP-Glucuronosyltransferasen (UDP-GT)
Bereich: 1 - 10 nmol/min/mg
3.
Aktivität: Konjugation des Substrats CDNB mit Glutathion
Abgefragte Enzyme: Glutathion-S-transferase (GST)
Bereich: 0,4 - 5,0 µmol/min/mg
II. Enzyminduktion von fremdstoffmetabolisierenden Enzymen
1. Rifampicin:
6-OHT mindestens 3-fach der Basisaktivität
2. Phenobarbital:
6-OHT mindestens 3-fach der Basisaktivität
III. Stoffwechselaktivitäten
1.
Glutaminsynthetase und Glutaminsynthese
2.
Harnstoffzyklusenzyme und Harnstoffproduktion
3. Glucose-6-Phosphatase
IV. Weitere Funktionen
1. Lactatproduktion
2. Gallensäuresynthese
3. Glykogenspeicherung
18
Aus unseren früheren Arbeiten zur Validierung des Modulkultivator liegen uns Vergleichswerte für
diese Parameter vor. Interessant wird besonders die Expression der Glutaminsynthetase sein, da
diese ausschließlich in wenigen perizentralen Hepatocyten vorkommt. Aus unseren Daten und
Literaturbefunden ist nicht zu entnehmen, ob und in welcher Höhe eine Expression dieses Enzyms
in immortalisierten Hepatocyten zu erwarten ist bzw. ob sie durch entsprechende Stimuli (z.B. CoKultivierung mit unseren Zelllinien) induziert werden kann. Insbesondere diese Eigenschaften (aber
auch Gallensäuresynthese etc.) werden wir auch für die immortalisierten Hepatocyten der Gruppe
Hengstler bestimmen.
2.2.3 Generierung konditional transgener Mäuse für Lebererkrankungen
Der Erfolg unseres doppelt-transgenen Maus-Fibrosemodells für Untersuchungen zur Leberfibrose
und zum Einfluß von TGF-ß auf Maushepatocyten läßt es besonders unter wirtschaftlichen
(Verwertung) Gesichtspunkten als sehr sinnvoll erscheinen, diesem Modell weitere zur Seite zu
stellen. Ein erstes zusätzliches Modell ist bereits unter Punkt 3.2.1 (Meilenstein 1) genannt und wird
sich wahrscheinlich zusätzlich zu der Gewinnung immortalisierter Hepatocyten zur Untersuchung
von Proliferationsstörungen und ggf. Tumorentwicklung in der Leber eignen.
Meilenstein 1: doppelt-transgene Mäuse mit konditionaler Expression von ß-CateninMutanten
Ein weiteres transgenes Modell soll mit dem gleichen Ansatz (TET-On/Off-System) zur
konditionalen Expression von Mutanten des ß-Catenins führen. Für dieses Modell müssen wir nur
noch die transgenen Tiere herstellen, die die Konstrukte mit diesen ß-Catenin-Mutanten unter der
Kontrolle des TetO-Elements enthalten. Die eigentlich konditionalen Tiere erhalten wir wiederum
durch Verpaarung mit den bereits bestehenden Mauslinien TALAP-1 und TALAP-2. Von diesem
Modell versprechen wir uns einerseits ein neues Lebertumormodell, andererseits kann es aber auch
gerade für die Systembiologie große Vorteile bieten, weil hier ein zentraler Schalter (ß-Catenin)
konditional aktiviert werden kann. Damit wird insbesondere die Dynamik der Steuerung von
Proliferation, Apoptose und Stoffwechsel in der Leber einem experimentellen Zugriff zugänglich.
2.2.4 Ergänzungen/Erweiterungen des Modulkultivator
Im Hinblick auf die besonderen Erfordernisse der Systembiologie, aber auch in Bezug auf
angestrebte industrielle Einsatzmöglichkeiten des Modulkultivators soll die Expertise des Labors
für Biofluidmechanik (Prof. Affeld) und von FMC (Prof. Vienken) im Bereich Membran- und
Sensortechnik genutzt werden, um Einsätze für den Modulkultivator zu entwickeln, die
insbesondere einen Einstieg in die On-line Analytik ermöglichen. Da der Modulkultivator
grundsätzlich für analytische Zwecke ausgelegt ist, geht es nicht darum, ihn zu einem Bioreaktor
großen Stils umzugestalten, sondern die bereits jetzt schon sehr flexiblen analytischen
Einsatzbereiche zu erweitern. Gedacht ist hierbei einerseits an Einsätze für die einzelnen Module,
die zusätzliche Medienkreisläufe gestatten. Diese Arbeiten können mit der Technik von Prof. Affeld
bewältigt werden. Andererseits sollen diese Einsätze mit neuen Sensormöglichkeiten (z.B.
Lichtleiter und Detektoren) ausgestattet werden, die über bereits jetzt erfaßbare Daten (Temperatur,
pH etc.) hinaus On-line Daten zur metabolischen Leistungsfähigkeit der Zellen oder zu anderen
wichtigen Parametern liefern. Für diese Erweiterungen sollen in Zusammenarbeit mit Prof. Vienken
entsprechende Lösungen ausgearbeitet werden. Es wird erwartet, daß diese Ergänzungen den
Modulkultivator sowohl für systembiologische Anforderungen aber auch für die industrielle
Nutzung noch attraktiver machen und damit die weitere Verwertung begünstigen.
19
2.3 Charakterisierung von Hepatocyten und Generierung von Datensätzen
Meilenstein 1:
Umfassende Charakterisierung von Hepatocyten aus den angegebenen
Modellen
Bereits unter Punkt 3.2.1 u. 3.2.2 (Meilensteine 2 und 4) wurde die Charakterisierung
immortalisierter Hepatocyten von Maus und Mensch mittels der in Tabelle 2 gegebenen
Testparameter genannt. Dies ist ein eingeschränktes Programm mit dem Ziel, den hepatozellulären
Phänotyp der generiereten Zellpopulationen nachzuweisen. Für die umfassende Charakterisierung
ist dies jedoch nicht ausreichend. Hierfür sollen in Zusammenarbeit mit Prof. Hengstler und Prof.
Bader deren spezielle Analysenprogramme, sowie die im Rahmen der Plattform angebotenen GenChip- und Proteom-Techniken verwendet werden.
Meilenstein 2: Generierung von Datensätzen zur Modellierung
Als Einstieg in die systembiologische Modellierung des dynamischen Verhaltens von Hepatocyten
und als Grundlage für die einfache Überprüfung der Vorhersagekraft entsprechender
Modellierungsstrategien sollen in unserem Labor drei zusätzliche Serien von Datensätzen generiert
werden, die dann den Kooperationspartnern zur Verfügung gestellt werden. Voraussetzung für diese
Datengenerierung ist einerseits die Verwendung derjenigen Systeme aus unserem Angebot, die eine
unmittelbare Vergleichbarkeit zweier nahe verwandter Zustände und deren zeitliche Dynamik
ermöglichen. Dies werden (i) der Vergleich von perifundierten Hepatocyten in Gegenwart und
Abwesenheit von Glucocorticoiden, (ii) der Vergleich periportaler und perizentraler HepatocytenSubpopulationen und (iii) der Vergleich von Hepatocyten aus unseren doppelt-transgenen Mäusen
unter dem Einfluß von TGF-ß sein. Die zweite Voraussetzung ist wiederum die umfassende
Charakterisierung der Hepatocyten in diesen „Zuständen“, wie dies über die in Meilenstein 1
angesprochenen Kooperationen geschehen soll; basiert also auf der intensiven Zusammenarbeit
mehrerer Gruppen.
2.4
Identifizierung und Charakterisierung neuer Wachstumsfaktoren für Hepatocyten
Dieser Programmpunkt bezieht sich ausschließlich auf eine Zusammenarbeit mit Prof. Bader und ist
im dortigen Arbeitsprogramm ausführlich dargestellt. Grundlage ist von unserer Seite wiederum das
doppelt-transgene Mausmodell mit konditionaler Expression von TGF-ß. Da hier sowohl in vivo als
auch in vitro durch die Expression von TGF-ß einerseits Bedingungen geschaffen werden können,
die dem Einfluß bekannter Wachstumsfaktoren für Hepatocyten entgegenstehen
(Wachstumshemmung), ist es möglich, dieses System für die Suche nach alternativen Faktoren
einzusetzen, die sich ganz oder teilweise der Antagonisierung durch TGF-ß widersetzen.
Andererseits wird nach dem Abschalten des TGF-ß ein „Burst“ von Proliferation bei den
Hepatocyten beobachtet. Auch dieses Phänomen könnte zur Identifizierung neuer
Wachstumsfaktoren genutzt werden.
3. Arbeitsgruppe Bader, Universität Leipzig
Propagation und Differenzierung von Hepatozyten und ihren Progenitoren ,
Modellierung und Kontrolle von endogenen regulatorischen Signalwegen
Wissenschaftliche und/oder technische Arbeitsziele des Vorhabens
Gesamtziel:
Unser Ziel ist es, basierend auf dem Verständnis der Mechanismen der in vivo Regeneration
alternative und innovative Zelltechnologien zur Generierung von Hepatozyten durch
physiologische Regeneration in vitro zu entwickeln und für systembiologische
20
Fragestellungen des Verbundes einzusetzen. Die Verbundpartner werden vor Ort methodisch
wie auch durch den Transfer der Zellsysteme untersützt.
1. Integrative Projektziele: Unterstützung der Verbünde und Plattformen durch
regionalisierte Bereitsstellung von funktionellen und prävalidierten primären Hepatozyten
(Maus bzw. Mensch)
Die AGB steht in engen inhaltlichen und strukturellen Verbindungen mit den Verbünden
(Freiburg Timmer, v. Weizsäcker) und Stuttgart (Reuss, Eichelbaum) Rostock (spezifischen
Gruppen Guthke, Loehr) und der Modellierungsplattform (Gilles).
Die Bereitstellung der Hepatozyten und auch dieser Technologien unterstützt den „jump start“
Bedarf des Verbundes. In einer ersten Startphase werden die statischen Modelle (modifiziertes
Sandwich, enkapsulierte Hepatozyten) den Partnern geliefert und zeitgleich die Methoden der
Zellisolation humaner und tierischer Hepatozyten vor Ort in Freiburg, Stuttgart und Rostock
etabliert. Nur dadurch ist gewährleistet, dass die knappen humanen Zellresourcen durch Ergänzung
vor Ort effektiv genutzt und miteinbezogen werden können. Die AGB wird hierbei den
entsprechenden Know-How Transfer leisten und bereits in BMBF geförderten Vorarbeiten
standardisierte Protokolle vor Ort bei den Partnern umsetzen. Hierfür werden Mitglieder der AGB
vor Ort in den Verbünden mitarbeiten und lokale gemeinsam betriebene Liaisonstationen
eingerichtet. Hierfür eignet sich besonders das modifizierte Sandwichkulturmodell der AGB.
Die dynamischen Modelle, die eine höhere Komplexizität besitzen, werden in Leipzig eingesetzt
und stehen als Technologie für die Datenaquisition den Partnern für die spezifischen und
gemeinsamen (siehe unten) Fragestellungen zur Verfügung. Durch die Möglichkeit der
Prozessautomatisierung planen wir umfangreiche HTS Experimente. Die AGB wird dies durch
den Aufbau und den Einsatz von Erfahrungen mit GLP (Experimentaldesign) und GMP Prozessen
(eigene Herstellung der Systeme) unterstützen.
2. Batch-Definitionen und Prävalidierung der Hepatozytenmodelle durch transkriptionelle,
proteinbiochemische und katalytische Charakterisierung
Primäre Zellen sind naturgemäß sehr heterogen hinsichtlich ihrer metabolischen
Kompetenzen, aber auch hinsichtlich ihrer Genomexpression. Insbesondere bei humanem
Ausgangsmateralien ist eine multifaktorielle Situation hinsichtlich Prämedikation, Alter,
Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit Lebensgewohnheiten und Grunderkrankungen u.a. zu
berücksichtigen.
Diese Heterorgenität erschwert die Interpretation von Ergebnissen, insbesondere wenn der
Ausgangszustand nicht bekannt ist, bzw. die Relativität der erzielten Ergebnisse nicht
greifbar wird. Dieses Problem lösen wir durch die zur Verfügungstellung von prävalidierten
Zellen. Das analytische Grundprogramm enthält Aussagen zu dem Phase I (EROD, ECOD,
Lidocain) und Phase II (Glucuronlytranyltransferase, Sulfotransferase, und Glutathion -STransferase Aktivitäten).
Dieses einfach durchführbare Testprogramm mit photometrischen Methoden wird auch in
den regionalen Liasionstationen innerhalb der Verbünde etabliert, so dass vor Ort
zuverlässig gemessen werden kann.
Wir haben als bisher einzige AG innerhalb des Verbundes bereits einen humanen
Hepatozyten custom DNA-Chip nach 3 jähriger Vorarbeit entwickelt und jedes Gen
einzeln mit RT PCR charakterisiert und den Chip experimentell in Hepatozytenkulturen
getestet. Die Genselektion ist spezifisch für Fragestellungen der Vermehrung und
Differenzierung aber auch für den Arzneimittelstoffwechsel. Die Nutzung des Chips stellen
wir den anderen Gruppen zur Verfügung. Die Schwiergkeit bei der Entwicklung lag hierbei
weniger in der Auswahl der Gene als in einer geeigneten Sequenzselektion und dem
21
Oligonukleotiddesign. Durch die Interaktion mit dem Verbund kann die AGB neben den
Zellmodellen auch auf dieser Ebene einen „jump start“ des Verbundes unterstützen.
3. Wissenschaftliche Projektziele der AGB: Regeneration und Differenzierung von
Hepatozyten in vitro
Bisherige Versuche primäre Hepatozyten durch Immortalisationsansätze für klinische und
pharmakologische Anwendungen zur Verfügung zu stellen, sind im wesentlichen nicht an
der Vermehrungsfähigkeit, sondern an der mangelnden Funktionsfähigkeit der vermehrten
Zellen gescheitert. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Proliferation und
Differenzierung gegenläufige Prozesse sind und die bisherigen Ansätze Vermehrung zwar
induzieren, diese aber entweder nicht mehr stoppen können oder trotz Wachstumsstop keine
Redifferenzierung ermöglichen.
Dieses Schlüsselproblem wollen wir mit unserem Forschungsprojekt angehen, indem wir
uns auf die Mechanismen der Physiologie der Hepatozytenregeneration konzentrieren
und daraus zellkulturtechnologische Verfahren entwickeln wollen um primäre humane
Hepatozyten nicht nur vermehren sondern auch redifferenzieren zu können. Dieses
multifaktorielle Geschehen hängt sicherlich nicht nur von Wachstumsfaktoren sondern auch
vom Mikromilieu ab.
Die Leber ist zudem ein herausragendes Beispiel für das kontrollierte Wachstum eines nicht
tumorösen, ausdifferenzierten Gewebes außerhalb der embryonalen Entwicklung. Nach
Leberresektionen kommt es innerhalb von Tagen zu deutlichen strukturellen Wachstumsprozessen
der Leber, die bis zu Wiederherstellung der ursprünglichen Zellmasse führt. Diese in vivo Prozesse
sind erst teilweise verstanden und werden in vitro bisher nur unvollkommen beherrscht.
Ziel unseres Teilprojektes ist es die Mechanismen der hepatozellulären Regeneration durch
einen synoptischen, systembiologischen Ansatz in Interaktion mit dem Freiburger Verbund (in vivo
Regeneration) und dem systemtheoretischen Ansatz und der Modellierung (Gilles) besser zu
verstehen und daraus Zelltechnologien zu entwickeln und zu optimieren, die zu einer nachhaltigen
Regeneration adulter Zellen in vitro führen sollen. Der Kreis schließt sich durch den Einsatz von
Matrixtechnologien der AGB und einen durch die AGB entdeckten neuen Wachstumsfaktor der
bereits vielversprechende Vermehrungseffekte primärer Hepatozyten in vitro (Vermehrung um den
Faktor 30 innerhalb von 72 h) zeigt. Diese in vitro Ergebnise wurden in vivo im Modell der
Leberregeneration nach chirurgischer Leberresektion bestätigt (Bader, Schön 2003). Wir möchten
in vitro vermehrte humane Hepatoyzten durch Einsatz unserer Mikromilieukenntnise zu einem
adultem Phänotypus redifferenzieren. Durch Interaktion mit den Verbünden und der
Modellierungsplattform möchten wir die Mechanismen der Redifferenzierung und der
metabolischen Kompetenz (Stuttgart) besser verstehen.
Das Gesamtziel des Verbundes
Systembiologie mit der Generierung einer „Hepatoyztenzelllinie“ von dem mechanistischen Ansatz
der Hepatozytenregeneration aus betrachtet und verfolgt.
Arbeitsplan
1. Bereitsstellung von funktionellen und prävalidierten primären Hepatozyten (Maus bzw.
Mensch)
Die Aufgabe des Personals der AGB ist es die Standorte zu betreuen, die Methoden dort
aufzubauen und die inhaltlichen Brücken zu den Verbundprojekten mit den g emeinsam nach
unseren Methoden vorbereiteten Zellsystemen zu ermöglichen. Die Verbindung der AGB
mit dem Verbund in Freiburg besteht in der Untersuchung der Mechanismen der
Leberregeneration. Dies ist ein kritischer Aspekt für unser eigenes zelltechnologis ches
Vorhaben. Die Verbindung mit dem Verbund in Stuttgart ist im verfahrenstechnischen
Bereich gegeben aber auch hinsichtlich der spezifischen pharmakologischen Ausrichtung im
Bereich Arzneimittelmetabolismus. Diese Inhalte sind ebenso wichtig für den Stu ttgarter
22
Verbund, aber auch für die Weiterentwicklung unserer Zellmodelle, so dass eine
experimentelle Kopplung mit Informationsrückfluss an die zellbiologische Plattform
Bestandteil dieses Verbundkonzeptes ist. Ebensolche Vereinbarungen existieren für den
Rostocker Verbund mit spezifischen Gruppen (Guthke, Loehr). Eine starke inhaltliche
Zusammenarbeit wurde mit der Modellierungsplattform (Gilles) geschlossen. Die
Nachbarschaft zwischen Magdeburg und Leipzig, aber auch der systemtheoretische Ansatz
dieses Partners vereinfacht die direkte Bereitsstellung frischer Zellsyteme. In ähnlicher
Weise trifft es auch für die spezifischen Partner der zellbologischen Plattform (Evotec) zu,
die auf diese Form der Unterstützung angewiesen sind. Ein Transport innerhalb v on 24 Std.
wurde schon erfolgreich vielfach angewendet.
Die AGB hat ein Modell entwickelt das ich besonders einfach transferieren und
transportieren lässt, das modifizierte Sandwichmodell. Hierfür sind keine besonderen Geräte
erforderlich.
Zu den statischen Systemen gehören auch serumfreie Kulturmedien der AGB.
Die AGB stellt folgende statische Modelle zur Verfügung
- Modifiziertes Sandwich
- 3-D Kokultur (Untersuchung von Zellinteraktionen, Rostock)
- enkapsulierte Hepatozyten (bei Bedarf, diese Zellen sind besonders leicht einfrierbar, haben
aber derzeit noch Defizite im Phase II Stoffwechsel)
Diese Zellysteme werden einer Prävalidierung vor dem Einsatz beim Projektpartner unterzogen:
Das Standardanalysenprogramm zur Batchdefinition umfasst folgende Parameter:
A) Phase I Metabolismus - CYP450-Aktivitätsmessungen
Die Aktivität des Cytochrom-P450-Systems wird an Hepatozyten nach 0 (frischisoliert), 2, 7 und 14
Tagen in Kultur untersucht. Es werden die Aktivitäten der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase
(EROD), der 7-Pentoxyresorufin-O-depentylase (PROD) und der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase
(ECOD) bestimmt.
Nach Inokulation der Hepatozyten unter Verwendungen des supplementiertes Adhäsionsmediums
erfolgt am Tag 1 in Kultur ein Mediumwechsel auf supplementiertes serumfreies Medium
(Entwicklung der Arbeitsgruppe Leipzig), ergänzt mit den jeweiligen Induktoren der Enzyme:
Methylcholanthren (EROD, PROD), Phenobarbital (ECOD)
Rifampicin (Lidocain /6 b-OHT).
B) Phase II Metabolismus – UGT und ST, GST
UGT und ST metabolisieren die Phase II-Reaktionen von 4-Methylumbelliferon (4-MU) zu 4Methylumbelliferon-Glucuronid (4-MUG, Glucuronidierung) bzw. 4-Methylumbelliferon-Sulfat (4MUS, Sulfatierung). Sie konkurrieren um das selbe Substrat, welches in großer Menge vorhanden
ist. Sowohl das Substrat als auch die beiden Endprodukte sind über HPLC bei einer Wellenlänge
von 336 nm nachzuweisen. GST wird mit dem Substrat CDNB gemessen.
C) Proteinsekretion: Messsung von Albumin mittels ELISA
D) LDH Freisetzung: Messsung photmetrisch
Molekulare Charakterisierung der Zellsysteme durch die DNA-Chips für humane Hepatozyten der
AGB
Die bisher verfügbaren Chips sind Oligonucleotidchips. Aus dem vollen Genprogramm haben wir
unten einzelne Gene aufgelistet bei denen wir bisher häufig Regulationen in primären Hepatoyzten
(human und Ratte) gefunden haben.
23
Der Freiburger Verbund wird parallel einen Mauschip entwickeln der unseren humanen
komplementiert. Für eine Analyse werden inzwischen nur noch wenige 0.5 – 1 µg an RNA
benötigt, so dass es bis in den Grenzbereich von ca. 100 000 Hepatozyten möglich ist komplette
Chipexperimente zu realisieren. Dies ist insbesondere interessant für die oben dargestellte
Minibioreaktoren, deren einzelne Reaktionseinheiten sich in diesem Bereich bewegen können. Die
Chips werden weiterhin auch für die Charakterisierung der Zellen für den Stuttgarter Verbund
eingesetzt und im Rahmen der Zusammenarbeit mit der Modellierungsplattform (Gilles), der
zellbiologischen Plattform (alle Gruppen) und auch Gruppen aus dem Rostocker Konsortium
(Guthke, Loehr, Runge).
Die Charakterisierung aller verwendeten und transferierten Zellsysteme erfolgt mit dem DNAChip der AGB. Die Hauptarbeit und as eigentlichen Know-How in der Entwicklung des Chips
besteht in der korrekten Sequenzwahl und die Rückkopplung mit den Ergebnissen einer
notwendigen Validierung mittels RT-PCR und den biologischen Experimenten. Hier haben wir
bereits 3 Jahre Arbeit investiert.
Das Spotting der kodierenden Oligonukleotide wird innerhalb der Arbeitsgrup pe
vorgenommen. Mit adulten humanen Lebergewebe werden Kontrollhybridisierungen.
Durch das Aufbringen von virusspezifischen DNAs können die Zellkulturen auf virale
Kontaminationen geprüft werden.
Einige häufig regulierte Gene des Hepatozytenchips der AGB
cytochrome-P450 1A1
cytochrome-P450 2E1
cytochrome-P450 3A2
cytochrome-P450 4A1
alcohol dehydrogenase
aldehyde dehydrogenase
aldehyde oxidase
liver mitochond. aldehyde
dehydrogenase
monoamine oxidase B
epoxide hydrolase
galactoside -1,3glucuronyltransferase
hydroxysteroid sulfotransferase
glutathione-S-transferase
entactin
fibrillin-1
fibrillin-2
fibronectin 1
glypican (heparansulfate
proteoglycan)
plasminogen activator
n-heparansulfate sulfotransferase
collagen 4a3
laminin
fetoprotein
transthyretin
-tubulin
c-jun
hepatocyte nuclear factor 1
hepatocyte nuclear factor 4
signal transducer and activator
of transcription 3
signal transducer and activator
of transcription 5b
NTAK **
epidermal growth factor
receptor
transforming growth factor
albumin
transferrin
c-fos
c-met
basic fibroblast growth factor
transforming growth factor
-macroglobulin
ornithine transcarbamylase
glutamat dehydrogenase
glutamin synthetase
-1-microglobulin
-1-acid glycoprotein
-1-antitrypsin
fibrinogen
fibrinogen B chain
acute phase -1-protein
haptoglobin
arginase
cysteine dioxygenase
mitochond. Cytochromoxidase 1
mitochond. Cytochromoxidase 2
mitochond. Cytochromoxidase 3
mitochond. Cytochromoxidase 4
mitochond. Cytochromoxidase 5
hemopexin
glycerinaldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
glycogen synthase 2
glucokinase
aldolase B
apolipoprotein C I
apolipoprotein A-I
apolipoprotein B editing protein
apolipoprotein C-III
histone 3
cyclin D3
Erb-B2
H-ras
c-myc intron binding protein
fatty liver acid binding protein
phosphofructokinase
phosphoenolpyruvate carboxykinase
glial fibrillaryacidic protein
2. Bereitsstellung der komplexeren (dynamischen) Zellsysteme (Bioreaktoren)
2.1. Prozessautomatisierung für beschleunigte Screeningverfahren (insb. In Verbindung mit
dem Stuttgarter Verbund)
Kompetenz des Multiwell-Bioreaktors zur Erbringung gewebespezifischer Leistungen:
24
Untersuchung der Proteinsekretion: Die Proteinsekretion soll an Hand des Parameters Albumin
charakterisiert werden und mittels ELISA immunometrisch quantifiziert werden. Idealerweise sollte
der ELISA direkt unter Verwendung der Multiwellplatte mitgemessen werden.
Harnstoffsekretion: Die Harnstoffsekretion als toxikologisch verwertbarer Parameter soll on line
aus dem Überstand mittels enzmyatischer Verfahren durch Ansaugen des Überstands gemessen
werden. Hierbei kann auf etablierte Techniken zurückgegriffen werden. Jedoch müssen die
entsprechenden Geräte für diesen Zweck adaptiert werden.
Oxygenation und pH: Kulturrelevante Gase wie PCO2 und PO2 sollen über ionenselektive
Elektroden im Überstand analysiert werden. Hierzu sollen über Pumpensysteme in je nach Zelltyp
zu definierenden Intervallen Kulturmedium angesaugt werden. Die Dokumentation erfolgt sofort
über angeschlossene Rechner des Analysensystems.
Aufbau der Echtzeitmessung für Feststoffe (Glucose, Laktat):
Die Bestimmung von Glucose und Laktat ist relevant für die Beurteilung des metabolischen Status
der Zellkulturen in Abhängigkeit von der Sauerstoffversorgung.
Einsatz für Anwendungen für das 96 / 48 / 24 Mini-Well-Bioreaktors für das Screening mit
primären Zellen
Phase I und Phase II Biotransformation
Die Charakterisierungerfolgt entspechend der oben dargestellten Methoden, Phase I und II.
Zusätzlich werden LC/MS (Flüssig- Chromatographie / Massenspektrometrie – Kopplung, in
Verbindung mit Stuttgart) eingestzt.
Einsatz der grossen Bioreaktoren zur quantitativen Herstellung von Proteinen (Verb.
Stuttgart)
Hierfür werden die grossen Flachmembranbioreaktoren bzw. die Hohlfaserbioreaktoren einsetzen.
Hier können Limitierungen bezüglich der humanen Hepatozyten auftreten. In Absprache mit dem
Stuttgarter Verbund werden, humane Zelllinien, als Etablierungsinstrumente genutzt und in den
Bioreaktoren in genutzt.
1. Spezifische Wissenschaftliche Projektziele der AGB:
Entwicklung von Zelltechniken zur Regeneration und Differenzierung von Hepatozyten in
vitro
Adulte Hepatozyten können in vivo erhebliche Regenerationszyklen kurzfristig durchlaufen. Adulte
Hepatozyten haben einen ontogenetischen Prozess der Reifung durchlaufen und sind daher von
Interesse für prädiktive Modelle. Wir möchten die endogen Zellzyklusregulationen insbesonder der
adulten Hepatzyten besser verstehen und aus dieser im Netzwerk generierten Kenntnis in
Kombination mit unseren 3-D Zelltechnologien (extrazelluläre Matrix und Bioreaktoren) Verfahren
entwickeln, die zu einer quantitativen Regeneration von Hepatozyten in vitro führen. Nach
Verletzung der Leber in vivo wird parallel zur einsetzenden Proliferation der Hepatozyten die
Mikroumgebung regeneriert. Diese Mikroumgebung beinhaltet die extrazelluläre Matrix, sowie
Zytokine und Wachstumsfaktoren, welche synergistisch Hepatozyten zur Proliferation anregen.
Daraus folgernd ergibt sich die Hypothese, dass mit dem Verständnis des gesamten Netzwerkes,
welches zur hepatischen Proliferation und Differenzierung in vivo nötig ist, dieses Wissen
angewendet werden kann, um Hepatozyten in vitro zu generieren. Zusätzlich wollen wir dieses
Mikromilieu rekonstruieren. Diese Arbeiten sind somit sehr gut komplementär zu Ansätzen der
Immortalisation mit selektiven Eingriffen in den Zellzyklus (Hengstler). Wir focussieren uns hier
uns vollständig auf die pyhsiologischen / endogenen Regulationsprinzipien in der Vorstellung, dass
diese auch in vitro umsetzbar sein werden und zu nachhaltiger Differenzierungsfähigkeit führen.
Die Entwicklung von zellkulturtechnologischen Verfahren ist eng mit den Studien zur in vivo
Regeneration des Freiburger Verbundes vernetzt. Die dort durchgeführten Experimente zur
Signaltransduktion werden mit unseren gekoppelt. Biochemische Assays hierzu werden in Freiburg
ergänzend durchgeführt.
25
Analyse von Wachstum und Differenzierung in Verbindung mit der Modellierungsplattform
(Gilles):
Durch Interaktion mit dieser Gruppe möchten wir die Zusammenhänge der Regulation der
Geweberegeneration besser verstehen.
a) Analyse der Regulationsprozesse in normalen Hepatozyten in organotypischer Kultur
b) Vergleich von regenerierenden Hepatozyten mit differenzierten Hepatozyten
c) Übertragung von Mikroumgebungsbedingungen auf die Zelllinien zur Ausdifferenzierung
Übertragung unser Vorarbeiten zur Hepatozytenregeneration in vitro auf das humane
System
Unter serumfreien Kulturbedingungen sollen Hepatozyten des Menschen zur Proliferation stimuliert
werden. Der neu entdeckte humane Wachstumsfaktor TPX des Knochenmarks wird zu Kulturen der
Hepatozyten gegeben, um die Proliferation anzuregen. Konventionelle Faktoren (HGF, EGF,
TGFalpha) werden vergleichend in den Bioreaktoren verwendet.
Die Zellen werden in den Bioreaktoren expandiert und unter dem Milieudruck nach Expansion
mittels Variation der Mikroumgebung zu Hepatozyten differenziert. Dieser Prozess soll untersucht
und durch Rückkopplung mit der modellgesteuerten Systemanalyse (Gilles) als auch durch
Integration von in vivo Daten (Freiburger Verbund, Gebhardt Leipzig) optimiert und verglichen
werden.
Alle generierten Zellsysteme und Klone werden laufend charakterisiert. Langzeitkulturen werden
angelegt und Zelltechniken kontinuierlich auf die Expansionsverfahren adaptiert.
Morphologische Analysen der Zellen werden durchgeführt (Koop. Prof. Drews, Tübingen), ebenso
wie funktionelle Analysen: Albuminproduktion
mittels ELISA, Cytochrome P450 (CYP) Enzymaktivitäten, Immuncytochemie von Albumin, GST,
AFP und verschiedener CYP Enzyme, Phase II Metabolismusanalysen (UGT, ST, GST), albumin
mRNA in situ Hybridisierung, Glukose/Laktat Umsatzmessungen und Genexpressionsanalysen
durch DNA Mikroarray Analysen (Koop. Dr. Kroeger).
Im Netzwerk dieses Projektes wird der Einfluß verschiedener Parameter auf die Proliferation von
Hepatozyten der Ratte, der Maus, des Schweins und des Menschen anhand von
Genexpressionsprofilen (DNA Chips) analysiert, mit besonderer Beachtung der zonalen
Heterogenität des Leberparenchyms.
Vergleichende Untersuchungen werden mit Zellen aus dem Knochenmark und peripheren
Monozyten gemacht, die nach dem Protokoll von Huberman et al. in hepatozytenähnliche Zellen
differenziert werden (Protokoll von Huberman PNAS, 4.3.2003).
Erfolgversprechende Ergebnisse auf dem Gebiet der Proliferation und Differenzierung von
Stammzellen des Knochenmarks in hepatische Zelltypen bestehen bereits, trotzdem können diese
Zelltypen bislang aufgrund der nicht kompletten hepatischen Differenzierung noch nicht den
primären Hepatozyten ersetzen.
Erfassen der Expressionsprofile regnerierender Hepatozyten
Um komplexe Expressionsprofile von Hepatozyten untersuchen zu können, werden durch
die Verwendung von zwei Fluoreszenzmolekülen mit unterschiedlichem Emissionsspektrum
zwei cDNA-Populationen direkt miteinander verglichen.
Biochemische Charakterisierung
Die Untersuchung der Kompetenz der generierten Zelllinien zum Erbringen
gewebespezifischer Leistungen wir entsprechend der oben dargelegten Methoden für
katalytische und sekretorische Parameter durchgeführt.
Kryokonservierung
In vitro vermehrte Hepatozyten werden direkt in und mit den Bioreaktoren eingefroren um
für spätere Untersuchungen verfügbar zu sein.
26
Die Kryokonservierung der Bioreaktoren wird über ein mathematisches Modell berechnet
werden. In sich anschließenden Experimenten wird das berechnete Kryoprotokoll optimiert.
Die biochemische Kompetenz des Bioreaktors nach dem Einfrieren und Auftauen wird mit
den nicht kryokonservierten Bioreaktoren verglichen. Hierzu werden die oben aufgeführten
Untersuchungen angewendet. Durch die Kombination von mathematischen Modell und
Experiment wird die Erfolgsaussicht von uns als extrem gut angesehen.
IV. Verwertungsplan
1. Wirtschaftliche Erfolgsaussichten
Im Falle positiver Ergebnisse ist mit ausgezeichneten wirtschaftlichen Erfolgsaussichten zu
rechnen. Dies gilt insbesondere für die immortalisierten Hepatozyten oder für die aus
Vorläuferzellen gewonnenen Hepatozyten. Die guten wirtschaftlichen Aussichten basieren u.a. auf
der Tatsache, daß die Entwicklung neuer Pharmaka durch Studien an menschlichen Hepatozyten
erheblich erleichtert wird. Dies betrifft insbesondere die Untersuchung des Fremdstoffmetabolismus
durch menschliche Hepatozyten, die Identifizierung von Substanzen, welche eine Induktion von
Leberenzymen (besonders CYP3A4 und 1A1) verursachen, sowie die Identifizierung von
hepatotoxischen Substanzen. Da diese Untersuchungen idealerweise in einem relativ frühen
Stadium der Substanzentwicklung durchgeführt werden, besteht ein sehr hoher Bedarf an
menschlichen Hepatozyten. Ein weitereres großes Einsatzgebiet menschlicher Hepatozyten besteht
in der Hepatozytentransplantation. Zur Zeit können primäre menschliche Hepatozyten kommerziell
erworben werden. Wegen der Knappheit dieser Zellen sind jedoch die Preise extrem hoch, wobei 10
Millionen menschliche Hepatozyten mehr als 500.- EURO kosten (zur Verdeutlichung: für die
Untersuchung einer Substanz auf Enzyminduktion werden mindestens 100 Millionen Hepatozyten
benötigt; Bei der Hepatozytentransplantation würden in der Regel mehr als 200 Millionen
Hepatozyten transplantiert). Zur Zeit kann der Bedarf an Hepatozyten mit primären Zellen nicht
abgedeckt werden. Daher besteht ein enormes Marktpotential für "regenerierbare" Hepatozyten, das
weltweit auf mehr als 200.- Millionen EURO im Jahr eingeschätzt wird. Unsere Partner aus der
Industrie, Fresenius Medical Care, Bad Homburg sowie Cytonet GmbH sind an der Vermarktung
von (z.B. regenerierbar herstellbaren) Hepatozyten interessiert. An der Verwertung von Beiträgen
aus der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Bader ist Firma Bionethos interessiert. Daher sind alle
Voraussetzungen für die erfolgreiche wirtschaftliche Umsetzung gegeben.
2. Wissenschaftliche Erfolgsaussichten
Es wird erwartet, dass am Ende der ersten dreijährigen Förderphase die folgenden Ziele realisiert
sind :

Die Infrastruktur sowie die Logistik für die Versorgung mit stabilen primären Hepatozyten.Systemen ist aufgebaut.

Standardisierte Kulturmodelle für Hepatozyten mit der Möglichkeit der Steuerung zur
Steuerung des Mikro-Environments und zur kontinuierlichen Probennahme sowie die
zugehörige Analytik sind vorhanden.

Transfizierte Hepatozyten mit reversibel induzierbarer Expression von immortalisierenden
Faktoren sind vorhanden. Ob mit diesen eine vollständige Redifferenzierung möglich sein
wird, nach der alle Funktionen denen primärer Hepatozyten entsprechen, liegt im
vorgegebenen Projektzeitraum im Rahmen der experimentellen Unwägbarkeit.
27

Neue transgene Mausmodelle mit konditionaler Expression von immortalisierenden oder
krankheitsrelevanten Faktoren sind vorhanden. Diese Modelle liefern Maus-Hepatocyten
mit besonderer Kompetenz zur Proliferation/Redifferenzierung und eignen sich auf Grund
des On/Off-Vergleichs komplexer dynamischer Zustände bezüglich Signaltransduktion,
Metabolismus
und
Entwicklungspotential
sowohl für systembiologische als auch krankheitsrelevante Untersuchungen.

Ein geeignetes Mikro-Environment für die Kultur adulter Leberstammzellen ist etabliert.
Die erhobenen Daten werden eine Beurteilung der Fähigkeit der Zellen zur gesteuerten
Expansion und Differenzierung ermöglichen.

Sollte das Projekt „Neo-Hepatozyten“ mit der Universität Kiel realisiert werden können,
wird es im vorgegebenen Projektzeitraum möglich sein, ihre Beurteilung abzuschließen.
Damit wird eine Aussage vorliegen, ob aus dedifferenzierten Monozyten und weiteren
Vorläuferzelltypen voll-funktionstüchtige Neo-Hepatozyten entstehen, die primäre
Hepatozyten ersetzen können.

Erste Datensätze für einfache Validierungen von Modellierungsstrategien sind verfügbar.
3. Wissenschaftliche Anschußfähigkeit
Im Falle eines positiven Ergebnisses bei den oben unter 2. (Wissenschaftliche Erfolgsaussichten)
und im Arbeitsplan aufgeführten Meilensteinen besteht eine wissenschaftliche und wirtschaftiche
Anschlußfähigkeit wie folgt:

Bei erfolgreicher Herstellung regenerierbarer Hepatozytensysteme sollen diese den
weiteren Partnern in unserer Plattform und auch außerhalb unserer Plattform zur Verfügung
gestellt werden. Zu diesem Zweck sind wir eng mit der Plattform Modellierung und den
Projektverbünden vernetzt. Gemeinsam werden wir die Neo-Hepatozyten (regenerierbare
Hepatozytensysteme bzw. Hepatozyten-Zellinien) nutzen, um systembiologische
Fragestellungen
zum
„System
Hepatozyt“
in
Bezug auf
Metabolismus,
Hepatozytenregeneration, hepatozellulären Transport und viraler Infektion zu bearbeiten.

Bei erfolgreicher Differenzierung von Vorläuferzellen zu Hepatozyten werden diese
gemeinsam mit Fresenius Medical Care, Bad Homburg, zur Herstellung und Optimierung
von Bioreaktoren genutzt werden. Im Falle einer erfolgreichen Herstellung von
Bioreaktoren werden diese im Rahmen klinischer Studien getestet werden, um zu prüfen, ob
diese Therapieform zu einer Verbesserung der Prognose bei Leberversagen führt.

Bei erfolgreicher Entwicklung regenerierbarer Hepatozytensysteme in Form von reversibel
immortalisierten Hepatozyten oder der Generierung von Hepatozyten aus Vorläuferzellen
sollen diese in Form von in vitro Systemen für die Prüfung von Arzneistoffen durch Cytonet
GmbH, Heidelberg, an Interessenten der pharmazeutischen Industrie vermarktet werden.
V. Arbeitsteilung/Zusammenarbeit mit Dritten
1. Vernetzung innerhalb der Plattform
Die Untersuchung des Hepatozyten in der Systembiologie erfordert die intensive multidisziplinäre
Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Zell-Systeme, Zell-Kultursysteme und des Zell-Monitoring.
28
Die in der Plattform zusammengeschlossenen Arbeitsgruppen bieten die benötigten Expertisen und
Ressourcen an. Durch die Kooperation zwischen den Partnern werden Synergismen möglich sein,
die weit mehr ausmachen werden als nur die Summe der Einzelprojekte. Kooperationen sind
vorgesehen u.a. mit Fresenius (Prof. Viencken) und Charité Campus Virchow zum Einsatz unserer
Hepatozyten in Bioreaktorsystemen, BioControl Jena GmbH zum Data Mining, Evotec Analytical
GmbH zu "High throughput fluorescence detection methods" und dem Fraunhofer Institut für
Molekulare Biologie zur Modellierung des Hepatozyten Endozytose Pathways. Diese intensive
Vernetzung ist durch die bereits im Prozess der Antragsstellung praktizierte Zusammenarbeit belegbar. Der Austausch von Daten, Informationen und Erfahrungen wird durch eintägige Meetings
sichergestellt, die alle 3 Monate stattfinden sollen.
2. Vernetzung außerhalb der Plattform
Über die Plattform Zellbiologie hinaus sind wir eng mit der Plattform Modellierung und den
Projektverbünden vernetzt. Gemeinsam werden wir systembiologische Fragestellungen zum
„System Hepatozyt“ in Bezug auf Metabolismus, Hepatozyten-Regeneration, hepatozellulärem
Transport und viraler Infektion bearbeiteten. Eine detaillierte Aufstellung der Vernetzung innerhalb
und außerhalb der Plattform ist unter den individuellen Matrices der Arbeitsgruppen der Plattform
Zellbiologie aufgeführt im "Plattformantrag" (siehe Punkt IV). Ein Beispiel für eine
kooperationsgetriebene exponentielle Wissensentwicklung stellen die „Kieler Neo-Hepatozyten“
dar, bei der wir gemeinsam mit der Kieler Arbeitsgruppe das Differenzierungspotential dieser
Vorläuferzellen zu Hepatozyten untersuchen. Über die BMBF-Initiative „Systembiologie“ hinaus
steht die Plattform Zellbiologie auch international mit führenden Wissenschaftlern auf dem Gebiet
der Hepatozyten-Forschung in Verbindung, z.B. mit Prof. George Michalopoulos und Prof. Steve
Strom.
VI. Notwendigkeit der Zuwendung
Die beantragte Zuwendung ist für die Durchführung des beantragte Vorhabens unbedingt
erforderlich. Das wissenschaftliche Risiko des beantragten Forschungsprojekts besteht darin, daß
zwar mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden kann, daß es
gelingen wird Hepatozyten zu immortalisieren, während es aber nicht sicher ist, ob es gelingen
wird, eine vollständige Re-Differenzierung der expandierten Hepatozyten zu erreichen. In ähnlicher
Weise kann bei der Differenzierung von Vorläuferzellen nicht mit Sicherheit davon ausgegangen
werden, daß es gelingen wird, alle von primären Zellen bekannten differenzierten Funktionen zur
Expression zu bringen.
29
Planungshilfen (Hengstler)
Meilenstein
1. Jahr
2. Jahr
3. Jahr
Versorgung mit Hepatozyten in vitro Systemen
XXXX
XXXX
XXXX
Konditional immortalisierte Hepatozyten
Meilenstein Nr. 1: Transfektion
Meilenstein Nr. 2: Identifikation reversibel
induzierter Klone
XXXX
XX
Meilenstein Nr. 3: Charakterisierung reversibel
induzierbarer Klone
Meilenstein Nr. 4: Transgene Mäuse und
Maushepatozyten
XXX
XX
XXXX
XXXX
XXXX
Optimierung der Differenzierungs- und
Wachstumsfaktoren im Kulturmedium
XXXX
XXXX
XX
Optimierung von Architektur und extrazellulärer
Matrix
XXXX
XXXX
XXX
XXXX
XX
Generierung von Hepatozyten aus Vorläuferzellen
Untersuchung der Kieler „Neo-Hepatozyten“
Meilenstein Nr. 1: Optimierung der
Dexamethason-Konzentration
Meilenstein Nr. 2: Optimierung der
Kulturbedingungen
Meilenstein Nr. 3: Abschließende
Qualitätsbeurteilung:
XXX
XX
XXX
XXXX
Anmerkung: Die genauen Inhalte der aufgeführten Meilensteine sind im Arbeitsplan beschrieben. Die Kreuze (X)
kennzeichnen Aktivitäten im entsprechenden Quartal.
30
Planungshilfen (Gebhardt)
Meilenstein
1. Jahr
2. Jahr
3. Jahr
Versorgung mit Hepatozyten in vitro Systemen
XXXX
XXXX
XXXX
Konditional immortalisierte Hepatozyten
Meilenstein Nr. 1: doppelt-transgene Mäuse
mit konditionalem Rb-knockout
Meilenstein Nr. 2:Charakterisierung des
Phänotyps
Meilenstein Nr. 3: Generierung konditional immortalisierter humaner Hepatocyten
Meilenstein Nr. 4: phänotypische Charkterisierung
XXXX
XX
XX
XX
XXXX
XXXX
XXXX
Generierung konditinal transgener Mäuse für Lebererkrankungen
Meilenstein 1: Mäuse mit ß-Catenin-Mutationen
XXXX
XXXX
XXXX
XX
XXXX
XXXX
Generierung von Datensätzen
Meilenstein 1: Umfassende Charakterisierung
Meilenstein 2: Generierung von Datensätzen
Anmerkung: Die genauen Inhalte der aufgeführten Meilensteine sind im Arbeitsplan beschrieben.
Die Kreuze (X) kennzeichnen Aktivitäten im entsprechenden Quartal.
31
Planungshilfen (Bader)
Jahr
Teilaufgabe
Meilenstein 1
Isolation primärer
Hepatozyten bei den
Partnern in gemeinsamen
Strukturen und Projekte
Meilenstein 2
Übertragung der
Vermehrungstechniken
aus das humane System
Zellininien
Meilenstein 3
Analyse von
Proliferations- und
Differenzierungsmarkern
Meilenstein 4
Chiptechnologie und
Analyse der
Genexpression mittels
DNA-Mikroarrays
Meilenstein 5
Dynamische
Untersuchungen in den
Bioreaktoren
Maus
human (primär)
human (regenerierte
Zellen)
Meilenstein 6
Kryokonservierung der
vermehrten Zellen im
Bioreaktor
1. Jahr
2. Jahr
3. Jahr
M
M
M
M
M
M
32
Finanzierungsplan
1. Hengstler, Universität Leipzig
Personalkosten
1 BATIIa
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
57 936.59 100.60 288.177 324.-
Begründung: Die beantragte BATIIa Stelle ist für Herrn Dr. Michael Ringel vorgesehen. Herr Dr.
Ringel ist Biologe und arbeitet seit 1998 gemeinsam mit Prof. Hengstler an der Universität Mainz
über in vitro Systeme mit primären Hepatozyten. Daher wäre Herr Ringel in dem vorgeschlagenen
Projekt für die folgenden Bestandteile des Arbeitsprogramms zuständig:






Versorgung mit Hepatozyten in vitro Systemen
Konditional immortalisierte Hepatozyten
Meilenstein Nr. 1: Transfektion
Meilenstein Nr. 2: Identifikation reversibel induzierter Klone
Meilenstein Nr. 3: Charakterisierung reversibel induzierbarer Klone
Meilenstein Nr. 4: Transgene Mäuse und Maushepatozyten
Wegen der ausgezeichneten Vorkenntnisse von Herrn Ringel ist seine Mitarbeit für den Erfolg des
Projekts wie auch für einen unmittelbaren Start des Vorhabens unbedingt erforderlich.
1 BATVb
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
42 396.43 248.44 112.129 756.-
Begründung: Die BATVb-Stelle ist für Frau Renate Santos vorgesehen. Frau Santos ist MTA und
arbeitet seit 2000 in der Arbeitsgruppe von Prof. Hengstler in Mainz. Frau Santos verfügt über
umfangreiche Erfahrung bei der Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten sowie über alle für
das vorgeschlagene Projekt erforderlichen analytischen Techniken. Wegen des enormen Umfangs
des Arbeitsprogramms und der Notwendigkeit viele Kooperationspartner mit Hepatozyten zu
versorgen, kann das Projekt nur bei Mitarbeit von Frau Santos erfolgreich durchgeführt werden.
Frau Santos wird im Rahmen des beantragten Projekts die folgenden Arbeiten durchführen:

Isolierung primärer Hepatozyten durch Kollagenaseperfusion aus Lebergewebe von Mensch, Ratte und Maus

Herstellung und Optimierung der in vitro Systeme mit Hepatozyten in enger Zusammenarbeit mit Dr. Ringel
und Prof. Hengstler

Durchführung der im Antrag vorgesehenen analytischen Techniken mit (i) primären Hepatozyten, (ii)
konditional immortalisierten Hepatozyten und (iii) aus Vorläuferzellen generierten Neo-Hepatozyten.
1 BATIIa/2
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
28 968.29 550.30 144.88 662.33
Begründung: Die BATIIa/2-Stelle ist für Herrn Marc Brulport vorgesehen. Herr Brulport ist
Lebensmittelchemiker und möchte arbeitet bereits in der Arbeitsgruppe von Prof. Hengstler
promovieren. Im Rahmen seiner Dissertation soll Herr Brulport in enger Zusammenarbeit mit Prof.
Hengstler die folgenden Bestandteile des Arbeitsprogramms bearbeiten:




Generierung von Hepatozyten aus Vorläuferzellen
Optimierung der Differenzierungs- und Wachstumsfaktoren im Kulturmedium
Optimierung von Architektur und extrazellulärer Matrix
Untersuchung der Kieler „Neo-Hepatozyten“
 Meilenstein Nr. 1: Optimierung der Dexamethason-Konzentration
 Meilenstein Nr. 2: Optimierung der Kulturbedingungen
 Meilenstein Nr. 3: Abschließende Qualitätsbeurteilung
Gesamte Personalkosten für 3 Jahre:
395 742.-
Verbrauchsmaterial (Kosten für ein Jahr)
Zellkulturmedien und FCS
Kunststoffzubehör für Zellkultur
Wachstums- und Differenzierungsfaktoren
Antikörper
Chemikalien
Anhydrotetracyclin (für TET-OFF-System)
Tiere und Haltungskosten
Kollagenase für Hepatozytenisolierung
Molekularbiologische Werkzeuge und Kits
Transportkosten für Versand von Hepatozyten
und zu analysierender Proben
5000.3000.5000.4000.4000.1000.3000.6000.6000.-
Gesamt:
38 000.-EURO/Jahr
1000.-
Die Notwendigkeit dieses relativ hohen Gesamtbetrags für Verbrauchsmaterial wird aus den
umfangreichen im Arbeitspan beschriebenen Experimenten deutlich und aus der Tatsache, daß eine
relativ große Zahl an Kooperationspartnern mit Hepatozyten beliefert werden soll: In unserer
Arbeitsgruppe werden die folgenden Personen ausschließlich mit Arbeiten an dem hier beantragten
Projekt beschäftigt sein: Herr Dr. M. Ringel (Biologe, Postdoc), Herr M. Brulport
(Lebensmittelchemiker, Doktorand), Frau I. Schiffer (Biologin), Frau Carolin Heimerdinger
(Doktorandin), Frau A. Gräfe (Chemieingenieurin). Somit entfallen durchschnittlich auf jede am
Projekt arbeitende Person 7 600.-EURO. Dieses Verhältnis verdeutlicht, daß die Verbrauchsmittel
relativ sparsam kalkuliert wurden.
34
Reisekosten
Plattform Meetings werden ausschließlich in Deutschland als Tages-Ereignis mit u.U. einer
Übernachtung stattfinden. Pro Person und Teilnehmer sollen die folgenden Kosten angesetzt
werden:
- Bahnfahrt / Auto:
- Tagegeld:
- Übernachtung
100,25,125,-
damit 250,- / pro Meeting angesetzt werden (Gesamtwert pro Jahr: 750,-). Wir rechnen mit drei
Meetings im Jahr, so daß für den Projektzeitraum (3 Jahre) ein Betrag pro Person von 2.250,einzusetzen wäre. Da jeweils 2 Personen (Prof. Hengstler und Dr. Ringel) die Plattformmeetings
besuchen sollen, wären hierfür 4.500.-EURO anzusetzen. Zusätzlich möchten wir in 3 Jahren zwei
Mal das Stammzell-Meeting in Keystone besuchen (jeweils eine Person). Die Kosten hierfür
betragen 2 Mal 750 EURO (Gesamt: 1500.- EURO).
Die gesamten Reisekosten betragen somit: 6 000.- EURO.
Investitionen
Fluoreszenzmikroskop: Universelles inverses Mikroskop mit Fluoreszenzansatz, Kamera und
Bildverarbeitungssystem, Nikon, Düsseldorf
Ein hochwertiges Mikroskop mit ausgezeichneter Auflösung und Fluoreszenzansatz ist für das
beantragte Forschungsprojekt zur Untersuchung und Dokumentation der Hepatozyten unbedingt
erforderlich. Sowohl die primären Hepatozyten als auch die aus Vorläuferzellen generierten
Hepatozyten
müssen
morphologisch
eingehend
untersucht
werden,
wozu
auch
immunhistochemische Untersuchungen mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern (z.B.
gegen Epitope von Gallenkanalikuli, Cytokeratine, etc.) unbedingt erforderlich sind. Eine
digitalisierte Dokumentation ist ebenfalls erforderlich, um die Daten den Kooperationspartnern
rasch zur Verfügung stellen zu können. Ein weiterer wichtiger Einsatzbereich des
Fluoreszenzmikroskops ist die Identifizierung von erfolgreich mit immortalisierenden Konstrukten
transfizierten Hepatozyten (1.2, Meilenstein 1), da als Marker EGFP eingesetzt werden soll. Da das
Fluoreszenzmikroskop z.B. zur engmaschigen Kontrole der transfizierten Hepatozyten sehr häufig
benötigt wird und die zu untersuchenden Zellkulturen nicht in andere Gebäude transportiert werden
sollen, steht ein den Anforderungen entsprechendes Mikroskop auch bei den im Gebäude
benachbarten Arbeitsgruppen nicht zur Verfügung. Daher ist das beantragte Gerät unbedingt
erforderlich.
Kosten: 40 051.-
Gesamtkosten: 553 543.- EURO
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Finanzierungsplan
2. Prof. Gebhardt, Universität Leipzig
Personalkosten
1 BAT-O IIa
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
48 366.49 333.50 320.148 019.-
Begründung: Die beantragte BATIIa Stelle ist für Herrn PD Dr. Jürgen Voigt vorgesehen. Herr Dr.
Voigt ist Biochemiker und arbeitet seit 2002 gemeinsam mit Prof. Gebhardt an transgenen Mäusen
und in vitro Systemen (Perifusion) mit daraus isolierten Hepatozyten. Herr Voigt soll im
vorgeschlagenen Projekt für die folgenden Bestandteile des Arbeitsprogramms zuständig sein:






Versorgung mit perifundierten Hepatozyten
Konditional immortalisierte Hepatozyten
Meilenstein Nr. 1: doppelt-transgene Mäuse mit konditionalem „Rb-knockout“
Meilenstein Nr. 2: Charakterisierung der phänotypischen Konsequenzen des Rb-knockout
Meilenstein Nr. 3: Generierung und Klonierung kond. immortalisierter Human-Hepatocyten
Meilenstein Nr. 4: Phänotypische Konsequenzen
Die Mitarbeit von Herrn Voigt ist wegen der ausgezeichneten Vorkenntnisse und dem großen
Engagement für den Erfolg des Projekts und für einen unmittelbaren Start des Vorhabens
unabdingbar.
1 BAT-O Vb
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
36 647.37 380.38 127.112 154.-
Begründung: Die BAT-O Vb-Stelle ist für Herrn Frank Struck vorgesehen. Herr Struck ist MTA
und arbeitet seit 1996 in der Arbeitsgruppe von Prof.Gebhardt. Herr Struck verfügt über langjährige
Erfahrung bei der Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten und Hepatocytensubpopulationen,
sowie über alle für das vorgeschlagene Projekt erforderlichen analytischen Techniken. Ohne die
Mitarbeit von Herrn Struck wäre der enorme Umfang des Arbeitsprogramms mit der Notwendigkeit
viele Kooperationspartner mit Hepatozyten zu versorgen nicht durchführbar. Herr Struck wird im
Rahmen des beantragten Projekts die folgenden Arbeiten durchführen:




Isolierung primärer Hepatozyten durch Kollagenaseperfusion aus Lebergewebe von
Mensch, Ratte und Maus
Isolierung von periportalen und perizentralen Hepatocyten-Subpopulationen aus Ratte und
Maus
Betrieb des Modulkultivator in enger Zusammenarbeit mit Dr. Voigt und Prof. Gebhardt
Durchführung der im Antrag vorgesehenen analytischen Techniken mit (i) primären
Hepatozyten und (ii) konditional immortalisierten Hepatozyten
1 BAT-O IIa/2
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
24 183.36
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
24 666.25 160.74 009.-
Begründung: Die BAT-O IIa/2-Stelle ist für Frau Christina Ende vorgesehen. Frau Ende ist
Biochemikerin und führt gerade in der Abteilung von Prof. Gebhardt ihre Diplomarbeit durch. Im
Rahmen ihrer anschließenden Dissertation soll Frau Ende in enger Zusammenarbeit mit Prof.
Gebhardt die folgenden Aufgaben des Arbeitsprogramms bearbeiten:


Generierung konditional transgener Mäuse für Lebererkrankungen
Generierung von Datensätzen
Gesamte Personalkosten für 3 Jahre:
334 182.-
Investitionen
1 Modulkultivator-1 (InViSys)
EUR 15.500,-
Begründung: Die große Zahl von Perifusionen, die im geplanten Projekt durchgeführt werden
müssen, kann nur dann erbracht werden, wenn zwei Geräte parallel betrieben werden, die teils auch
zeitlich versetzt gefahren werden können. Dies ist besonders dann wichtig, wenn kryokonservierte
Zellen der Partner perifundiert werden sollen. Hierzu ist zu dem von unserer Gruppe für das Projekt
zur Verfügung gestellten Gerät die Beschaffung eines zusätzlichen Modulkultivators absolut
erforderlich.
Verbrauchsmaterial (Kosten für ein Jahr)
Zellkulturmedien und FCS
Kunststoffzubehör für Zellkultur
Wachstums- und Differenzierungsfaktoren
Antikörper
Chemikalien
Tiere und Haltungskosten
Kollagenase für Hepatozytenisolierung
Molekularbiologische Werkzeuge und Kits
DNA-Chips
Transportkosten für Versand von Hepatozyten
und zu analysierender Proben
Gesamt:
7000.2000.4000.4000.3000.3000.4000.5000.5000.1000.38 000.-EURO/Jahr
(114.000,- EUR/3 Jahre)
Der relativ hohe Gesamtbetrag für Verbrauchsmaterial begründet sich mit der Tatsache, daß eine große Zahl an
Kooperationspartnern mit Hepatozyten und Hepatocyten-Subpopulationen beliefert werden soll und umgekehrt
kryokonservierte Hepatocyten, die von den Partnern geliefert werden, perifundiert werden. Zusätzlich fallen die hohen
Kosten für die molekularbiologischen Arbeiten und die DNA-Chip-Analysen an.
Reisekosten
1. Jahr
a) Plattform-Meetings (3 x):
Prof. Gebhardt
Fahrtkosten gemeinsam EUR 100,Dr. Voigt
je Person Tagegeld
EUR 25,37
Frau Ende
je Person Übernachtung EUR 125,=
EUR 550,-
EUR 1.650,-
2. Jahr
a) Plattform-Meetings (3 x):
Prof. Gebhardt
Fahrtkosten gemeinsam EUR 100,Dr. Voigt
je Person Tagegeld
EUR 25,Frau Ende
je Person Übernachtung EUR 125,=
EUR 550,EUR 1.650,b) Zuschuß Ann. Meeting ASCB 2005 (USA)
(nur 1 Person)
EUR 750,-
3. Jahr
a) Plattform-Meetings (3 x):
Prof. Gebhardt
Fahrtkosten gemeinsam EUR 100,Dr. Voigt
je Person Tagegeld
EUR 25,Frau Ende
je Person Übernachtung EUR 125,=
EUR 550,EUR 1.650,b) Zuschuß Ann. Meeting ASCB 2005 (USA)
(nur 1 Person)
EUR 750,-
Reisekosten gesamt: EUR 6450,Gesamtkosten:
EUR 470.132,-
3. Bader, Universität Leipzig
Personalkosten
Für die Leitung der Zellkultur und Analysen von Proliferationsmechanismen, Transkriptomanalysen
und Wachstumsfaktorkaskaden wird ein besonders in der Zellbiologie und Molekularbiologie,
speziell mit DNA Mikroarrays erfahrener, wissenschaftlicher Mitarbeiter benötigt. Als Kandidat
kommt hier Humanbiologe Herr Dr. Heinrich, in Betracht, der weitreichende Erfahrungen auf dem
Gebiet der Humanbiologie sowie von Mikroarrayanalysen und Mausmodellen besitzt.
1 BATIIa (Ost)
2004 (oder entsprechend - 1. Jahr): 47 860.2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
47 860.2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
47 860.Gesamt:
143580.Die wissenschaftlich experimentellen Arbeiten, insbesondere auf dem Gebiet der Mikromillieu
Analysen und Proliferationsexperimente, werden durch einen naturwissenschaftlichen Doktoranden
der Biologie mit einer biotechnologischen Schwerpunkbildung in der Reaktortechnik bearbeitet
werden müssen. Hierfür ist Herr Marc Metzger vorgesehen. Er beendet gerade seine Diplomarbeit
in der AG von Prof. Bader.
1 BATIIa/2 (Ost)
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
28 404.38
2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
Gesamt:
28 404.28 404.85 212.-
Die Durchführung der zellbiologischen Experimente, wie auch die Vorbereitung komplexer
Kulturmedien, erfordert eine äußerst erfahrene Technikerin / Techniker.
Weiterhin ist eine Mitarbeit bei der Durchführung der Batchdefinitionen im Rahmen der
biochemischen Charakterisierung unabdingbar. Die Person muss auch bein den Isolationen der
humane Zellen mit der notwendigen Sicherheit und Flexibilität mitwirken.
1 BATVa (Ost)
2004 (oder entsprechend dem 1. Jahr):
40 860.2005 (oder entsprechend dem 2. Jahr):
40 860.2006 (oder entsprechend dem 3. Jahr):
40 860.Gesamt:
122 580.Verbrauchsmaterial
Zellkulturmedien
15600.Isolationspuffer zur Hepatozytenisolation
15000.Kulturgefäße
10000.Pipetten
10000.Wachstumsfaktoren
20000.Serum
5000.Beschichtungen (extrazelluläre Matrizes)
10000.Antikörper zur Analyse
7000.Slides für Mikroarrays
20000.Oligos für Mikroarrays
10000.Funktionelle Analysen
20000.Kosten für 3 Jahre:
139000.REISEN: 6000 € (3 Jahre)_
Gesamtkosten:
499 972 €
39
Unterschriften
Leipzig, 26.03.2003
Prof. Dr. J.G. Hengstler
Prof. Dr. A. Bader
Prof. Dr. R. Gebhardt
40