Regulatorische Strategien: Enzyme und Hämoglobin

Pharmazeutische Wissenschaften SS 03
Juli 03
B.Thalmann
Regulatorische Strategien: Enzyme und Hämoglobin
Chapter 10
Aspartat- Transcarbamoylase wird durch das Endprodukt des regulierten
Reaktionsweg gehemmt.
Bei der Biosynthese der Pyrimidine katalysiert die ATCase den ersten Schritt,
die Kondensation von Aspartat und Carbamoylphosphat zu NCarbamoylaspartat und Orthophosphat. Am Ende der ganzen Biosynthese stehen
die Pyrimidinnukleotide (= Cytidintriphosphat; CTP). Man stellt fest, dass
dieses Endprodukt verantwortlich ist für die Hemmung des 1. Schrittes,
ausgeführt durch die ATCase. Wenn [C] von CTP ansteigt, nimmt die
Geschwindigkeit der ATCase- Reaktion ab und umgekehrt. Zwischen Enzym
und CTP ist ein typisches Beispiel für Rückkoppelungs- und
Endprodukthemmung (feedback inhibition). Da CTP sich deutlich von den
Substraten der Reaktion unterscheidet, muss CTP sich an eine andere aktive
Stelle des Enzyms koppeln als das die Substrate tun. Solche Stellen nennt man
allosterische Zentren und CTP ist folglich ein "allosterischer" Inhibitor.
Bei der ATCase befinden sich die katalytischen und regulatorischen
Untereinheiten auf separaten Polypeptidketten.
Allosterische Enzyme zeigen eine Eigenschaft, die wir Kooperativität nennen,
d.h. die Aktivität an einem funktionellen Zentrum ( Bindung eines Moleküls ans
Zentrum) führt zu einer Konformationsänderung, was wiederum die Aktivität
am anderen Zentrum beeinflusst! (Details: 10.1.2; Erklärung zu den
Untereinheiten und zur Veränderung der Quartärstruktur.)
Eigentlich besitzt die ATCase 2 unterschiedliche quartäre Formen, die eine
dominiert wenn kein Substrat vorhanden ist, die andere im Falle einer
Interaktion. Die zwei Formen ( T = tensed) und ( R = relaxed) können bei
einem bestimmten Konzentrationsverhältnis zwischen Aspartat und
Carbamoylphosphat auch im Gleichgewicht liegen. Wo aber jeweils die Lage
des Gleichgewichts ist, hängt von der Zahl, der mit Substrat besetzten, aktiven
Zentren ab.
Zur Wirkung von CTP:
Wenn der Inhibitor CTP bindet, verschiebt sich das Gleichgewicht auf die Seite
der T-Form und erniedrigt so die Aktivität der ATCase, was eine Verringerung
von N- Carbamoylaspartat zur folge hat. Diese allosterische Regulation heisst
konzertierter Mechanismus und funktioniert nach dem "Alles oder nichts"
Prinzip( sequentieller Mechanismus; 10.1.6). Das heisst, das gesamte Enzym
wird von R- in T-Form gebracht; alle katalytischen Zentren sind gleich betroffen
von der Konformationsänderung.
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Kinetik allosterischer Enzyme
Allosterische Enzyme werden nicht nur von bestimmten Molekülen reguliert,
sondern auch die [C] der Substrate spielen bei der Reaktion eine Rolle. Ohne
Substrat liegt das Enzym in T- Form vor. Bei Bindung mit Substrat verschiebt
sich die Konformation von T nach R, wobei sich die Aktivität an allen Zentren
erhöht und so die gesamte Enzymaktivität verstärkt wird.
 Wenn sich die Konformation einer Untereinheit ändert, ist das bei den
Anderen auch der Fall, weil alle zusammenspielen (Kooperativität)!
Die Kurve einer solchen Reaktion sieht daher nicht wie die, einer MichaelisMenten- Kinetik aus, sondern gleicht einem "S" und wird Sigmoid
genannt.(Figure 10.11)
Die Effekte von Substrat auf allosterische Enzyme = homotropischer Effekt
und der Effekt von nicht- Substrat- Moleküle aufs Enzym = heterotropischer
Effekt ( z.B. CTP auf ATCase).
Hämoglobin, ein Beispiel für ein allosterisches Protein
Allosterie kommt nicht nur bei Enzymen vor, sondern auch bei Proteinen.
Betrachten wir das Protein Hämoglobin, welches den Sauerstoff kooperativ an
sich bindet. Das die Untereinheiten kooperieren, können wir am sigmoiden
Graphen sehen! Sauerstoff muss im Blut aus den Lungen, wo der
Sauerstoffpartialdruck relativ hoch ist, in die Gewebe mit niedrigerem
Sauerstoffpartialdruck transportiert werden. In den Lungen wir Hämoglobin fast
ganz mit Sauerstoff gesättigt, das heisst, 98% der Sauerstoffbindungsstellen sind
besetzt. In den Geweben angelangt, beträgt der Sättigungsgrad noch 32%. Also,
66% der Bindungsstellen tragen dem Transport bei. Ein hypothetisches, nicht
kooperatives Protein schafft gerade einmal 38% zu transportieren. Daraus
schliesst man, dass die kooperative Bindung des Hämoglobins mit Sauerstoff
eine 1,7- fach höhere Übertragungsrate von Sauerstoff hat, als nicht-kooperative
Bindungsstellen anderer Proteine. Die homotropische Regulation von
Hämoglobin durch seine Sauerstoffliganden (Substrat) erhöht demnach die
physiologische Sauerstofftransportkapazität.
Die Hämgruppe ist verantwortlich für die Bindungskapazität von Sauerstoff an
Hämoglobin. Der Hämkomplex besteht aus einer organischen Komponente
(= Protoporphyrin) und einem zentralen Eisenatom. Das im Zentrum des
Porphyrinring sitzende Eisen ist an die Stickstoffatome dessen 4 Pyrrolringe
gebunden, und liegt normalerweise in der 2+ Oxidationsstufe vor. Es kann an
jeder Seite der Hämebene 2 zusätzliche Bindungen ausbilden ( 5. Und 6.
Koordinationsstelle).
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Beim Hämoglobin ist die 5. Koordinationsstelle besetzt, beim
Desoxyhämoglobin jedoch liegt sie frei. Dort wird das Eisen oxygeniert. Die
Desoxyform entspricht der T-Form und durch die Bindung mit Sauerstoff
kommt es zur grundlegenden Konformationsänderung der Quartätstruktur, T
wechselt zu R, weil sich die Strukturveränderung des Eisenions direkt auf die
Untereinheiten auswirkt.
Der Bohr- Effekt
Ein kontrahierender Muskel hat einen grossen Bedarf an Sauerstoff und erzeugt
seinerseits viel H+ und CO2 ( = Schnelle Stoffwechselrate) Beides sind
heterotropische Effektoren von Hämoglobin; sie verstärken die Abgabe von O2.
Bei niedrigerem pH als 7,4 ( z.B in den Lungen) erniedrigt sich die Affinität des
Hämoglobins, d.h. wenn Hämoglobin in einen saureren Bereich gelangt, gibt es
sein O2 schneller ab. Beim Transport aus den Lungen (pH 7,4) in die aktiven
Muskeln (pH 7,2) kommt es zu einer hohen Rate (77%) an O2 Freisetzung.
Ohne Änderung des pH's würden wie gesagt nur 66% abgegeben. Zu dem
erleichtert eine hohe [CO2] die Freisetzung des Sauerstoffes.
 Merke: Die heterotropische Regulation von Hämolglobin durch H+ und CO2
erhöht die Effizienz des O2 Transportes bei diesem allosterischen Protein
noch mehr.
Wenn das Hämoglobin im Blut zurück in die Lungen fliesst, sind H+ und CO2,
in Form von Hydrogencarbonat (HCO3-) daran gebunden. In den Lungen wird
dann erneut Sauerstoff "geladen"...
Isozyme (= Isoenzyme)
Es sind Enzyme, die sich in der As- Sequenz unterscheiden, aber dieselbe
Reaktion Katalysieren. Sie besitzen meist unterschiedliche regulatorische
Eigenschaften. Isozyme lassen sich häufig auf Grund ihrer biochemichen
Eigenschaften (z.B. Elektrophoretische Mobilität...) unterscheiden. Sie
ermöglichen eine Feineinstellung des Metabolismus, da sie spezifischen
Anforderungen bestimmter Gewebe (aerob/ anerob...) und/oder momentaner
Zustände gewachsen sind (Bsp. LDH; 10.3.).
Kovalente Modifikationen als Mittel für die Regulation der Enzymaktivität
Wenn einem Enzym kovalent eine funktionelle Gruppe angehängt wird,
verändern sich die Eigenschaften des Enzyms. Meist sind die Modifikationen
irreversibel. Phosphorylierung und Dephosphorylierung kommen am
häufigsten vor. Histone zum Beispiel, werden in vivo acetyliert und
deacetyliert; ihre kovalente Modifikation kann durch die kovalente
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Veränderung der modifizierenden Enzyme reguliert werden. Wie schon gesagt
ist die Phosphorylierung von Enzymen, Membrankanälen und anderen
Zielproteine häufig und dies sicher auch ihrer Effizienz wegen. Diesen
Mechanismus finden wir fast bei allen Stoffwechselvorgängen in
eukaryontischen Zellen. Die Phosphorylierungsreaktion wird durch
Proteinkinasen katalysiert. Das Donormolekül ist ATP. Die γPhosphorylgruppe wird auf einen spezifischen Serin-, Threonin-, oder evtl.
Tyrosinrest übertragen. Proteinphosphatasen sind die Antagonisten der Kinasen
und entfernen die Phosphorylgruppe hydrolytisch. Orthophosphat wird
freigesetzt.
 ACHTUNG: Dephosphorylierung ist nicht einfach nur die "Umkehr" von
Phosphorylierung! Letztere erfolgt nur durch die Aktivität der spezifischen
Proteinkinase und unter Spaltung von ATP...
Diese Reaktionen sind unter physiologischen Umständen irreversibel und fänden
ohne Enzyme praktisch nicht statt. Zu beachten ist jedoch, dass das Endergebins
beider Reaktionen die Spaltung von ATP zu ADP + P ist; ΔG = -50kJ/mol.
Dieser energetische Gewinn ist äusserst günstig.
 Phosphorylierung steuert die Aktivität von Proteinen strukturell,
thermodynamisch, kinetisch und regulatorisch:
1. Eine Phosphorylgruppe fügt 2 negative Ladungen ans modifizierte Protein,
(elektrostatische WW möglich)
2. 3 oder mehrere Möglichkeiten eine H- Brücke zu bilden
3. Freie Enthalpie sichert Irreversibilität und das Protein wird stabilisiert.
4. Kinetik ist den Bedingungen der Physiologischen Prozessen gerecht ( je nach
Notwendigkeit langsam oder schnell)
5. Eine einzige Kinase kann in kurzer Zeit mehrere hundert Zielproteine
phosphorylieren.
6. Koppelung des Stoffwechsels an den Energiestatus der Zelle, da ATP
(zelluläre Energiewährung) als Donormolekül.
Einige Kinasen sind nur spezifisch gerichtet und interagieren ausschliesslich
mit einem Protein, während Andere multifunktionell sind und verschiedene
Zielproteine modifizieren können.
Vergleicht man die AS- Sequenzen vieler Phosphorylierungsstellen miteinander,
zeigt sich, dass multifunktionelle Kinasen (wie die Protein- Kinase A eine ist)
verwandte Sequenzen erkennen.
z. B. die Consensussequenz:
Arg - Arg - X - Ser* - Z
Oder:
Arg - Arg - X - Thr*- Z
Wobei:
X= kleiner AS- Rest
Z= grosse, hydrophobe AS
*) Phosphorylierungsstelle
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 Kurze synthetische Peptide, die diese Consensusmotiv enthalten, werden
fast immer von Serin bzw. Threonin spezifischen Proteinkinasen
phospohryliert.
Zyklisches AMP aktiviert die Proteinkinase A durch Veränderung ihrer
Quartärstruktur
Oft sind es Hormone die die Bildung von cAMP auslösen. CAMP entsteht durch
ringförmiges schliessen von ATP und ist ein Intrazellulärer Botenstoff. Die PKA
ist ein Enzym das Ser- /Thr- Reste phosphoryliert und so die Aktivität des
Zielproteins anschaltet. PKA selbst muss aber auch aktiviert werden und dies
geschieht eben durch cAMP. Der Aktivierungsmechanismus entspricht dem, der
besprochenen ATCase. PKA besteht aus 2 Arten von Untereinheiten. Aus
regulatorischen ( R) und katalytischen ( C). Ohne die Bindung von cAMP bilden
die Unereinheiten einen enzymatisch inaktiven Komplex. Durch die Bindung
von 4 Molekülen cAMP aktiviert die PKA durch die Dissoziation
(=Konformationsänderung) des inaktiven Komplex in eine regulatorische
Untereinheit und in 2 katalytisch aktive Untereinheiten. Somit ist PKA ein
Modell für allosterische Regulation und Phosphorylierung.
Aktivierung von Enzymen durch spezifische Proteolytische Spaltung
Viele Enzyme erhalten ihre charakteristische 3-D-Struktur durch spontane
Faltung. Andere Proteine werden erst als inaktive Vorstufen synthetisiert und
werden erst durch die Spaltung einer spezifischen Peptidbindung zu einem
aktiven Enzym (Spaltung mit ATP verbrauch). Wenn sie noch in ihrer inaktiven
Vorstufen vorliegen nennt man sie Zymogen oder Proenzym. Auf diese Weise
können Proteine auch ausserhalb der Zelle aktiviert werden. Allerdings findet
die proteolytische Spaltung nur einmal im Leben eines Enzyms statt und ist
definitiv irreversibel, nicht etwa wie allosterische Kontrolle oder kovalente
Modifikationen!
Proteolyse in biologischen Systemen:
1. Verdauungsenzyme (Chymotrypsinogen- Chymotrypsin)
2. Blutgerinnungskaskade
3. Proinsulin-Insulin
4. Prokollagen-Kollagen
u.v.m.
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Chymotrypsin ist ein Verdauungsenzym, es hydrolysiert Proteine im
Dünndarm. Seine inaktive Vorstufe, Chymotrypsinogen wird in den
Acinuszellen des Pankreas synthetisiert und ist eine Polypeptidkette von 245
AS. Bei der Spaltung der Peptidbindung zwischen Arg15 und Ile16 entsteht die
entscheidende Konformationsänderung um ein funktionelles Enzym zu bilden.
π-Chymotrypsin entsteht und wirkt seinerseits auf weitere π-Chymotrypsine ein,
jeweils 3 bleiben miteinander durch Disulfidbrücken verbunden.
Elektrostatische WW bewirkt eine Umorientierung und die Ausbildung des
Substratspezifitätszentrum.
 Das Anschalten der Enzymaktivität in einem Protein kann also durch
diskrete, streng ortsgebundene Konformationsänderungen zustande kommen,
ausgelöst durch die Spaltung einer einzigen Peptidbindung.
Trypsinogen wird durch Enteropepsidase aktiviert. Die einzige Lysin-Isoleucin
Peptidbindung im Trypsinogen wird dabei hydrolysiert, sobald Trypsinogen aus
dem Pankreas in den Zwölffingerdarm tritt. Trypsin ist neu enstanden. Dort
wirken viele Enzyme gemeinsam bei der Verdauung von Proteinen. Trypsin ist
der gemeinsame Aktivator aller Zymogene im Pankreas.
Inhibitoren
Da die Aktivierung eines Zymogens zur Protease irreversibel ist, gibt es
spezifische Proteaseinhibitoren zur Beendigung der Proteolysen. Am Beispiel
des Pankreastrypsininhibitors kann man sehen, dass das Trypsin gehemmt wird
in dem sich der Inhibitor fest ans aktive Zentrum bindet. Da dieser ein sehr
effektives Substratanaloga ist, verleiht er dem Komplex eine aussergewöhnliche
Stabilität. Der Inhibitor verändert sich strukturell nicht durch die Bindung, er ist
bereits so konzipiert, dass er perfekt komplementär ins aktive Zentrum passt; er
ist stabil und wird deshalb nur langsam umgesetzt.
Enzymatische Kaskaden
In biochemischen Systemen kommen oft enzymatische Kaskaden vor, das heisst
ein ausschlaggebendes Signal löst eine Kettenreaktion aus, dessen Schritte
jeweils von spezifischen Enzymen katalisiert werden. Zum Beispiel die
Blutgerinnung. Die Gerinnsel bilden sich auf Grund einer zymogenaktivierten
Kaskade, wobei ein katalisierter Gerinnungsfaktor den ersten Schritt aktiviert.
Die Aktivierungsgeschwindigkeit verläuft dabei exponentiel. Zwei Systeme
werden dabei aktiviert: das so genannte intravaskuläre System (durch
Verletzung eines Endothels der Blutgefäse) und das extravaskuläre System (
Verletzung von Geweben), die exakt kooperieren müssen um erfolgreich die
Blutung zu stoppen. Dabei entsteht ein Gerinnsel aus dem Protein Fibrin. Dieses
entsteht im letzten Schritt der Kaskade mittels Umwandlung von Fibrinogen
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durch die proteolytische Einwirkung des Enzyms Thrombin. Dem Fibrinogen
werden dabei Fibrinopeptide abgetrennt und die Zentraldomäne des Proteins
bleibt erhalten. Diese ist fähig mit ihresgleichen zu polymerisieren (Verkettung
zwischen Aminotermini und carboxylterminalen Enden) und so ein Gerinnsel
zu bilden.
Vitamin K beeinflusst die Blutgerinnung
Trombin wird ebenfalls als Zymogen synthetisiert und heisst Protrombin. Dieses
wird erst durch die Aktivierung durch Faktor X und Faktor V zu aktivem
Trombin. Vitamin K spielt bei der Synthese von Protrombin und andern
Gerinnungsfaktoren eine elementare Rolle. "Normales" Protrombin enthält
γ-Carboxyglutamat. Bei Abwesenheit von Vitamin K fehlt diese modifizierte
Aminosäure! Tatsächlich werden in der aminoterminalen Region des
Protrombins die ersten Glutamatreste von einem Vitamin K abhängigen
Enzymsystem zu γ-Carboxyglutamat carboxyliert. Carboxyglutamat ist ein guter
Calcium 2+ Chelator, was nötig ist damit sich Protrombin besser auf
Phopholipidmembranen anheften kann. Diese Bindung ist wichtig, da das
Protrombin so in die Nähe zweier Gerinnungsproteine gelangt, welches es zu
Trombin katalysieren.
Die Blutgerinnung ist überlebensnotwendig und schon ein kleiner Defekt kann
letale Folgen haben. Der bekannteste Defekt ist die als geschlechtsgebundenes,
rezessives Merkmal vererbte Bluterkrankheit ( klassische Hämophilie) bei ihr
fehlt Faktor VIII oder er hat nur eine schwache Funktionalität. Auf der andern
Seite besteht für den Organismus aber auch die Gefahr der Blutgerinsel, die die
Gefäse verstopfen können (Thrombosen). In der enzymatischen Kaskade der
Blutgerinnung ist also ein feingesteuertes Equilibrium essentiell. Interessanterweise besitzt Trombin eine doppelte Funktion. Es katalysiert einerseits die
Entstehung von Fibrin und setzt andererseits die Inaktivierung der
Gerinnungskaskade in Gang. Zusätzlich gibt es Inhibitoren (z.B Antithrombin
III) diese hemmen die Serinproteasen (Faktor XII, XI, IX und X). Antitrombin
gehört zur Familie der Serin-Protease-Inhibitoren ( Serpine ). Antithrombin
begrenzt das Ausmass der Gerinnung, aber was passiert mit den Gerinnseln,
wenn die Verletzung verheilt ist? Die Gerinnsel, aus Fibrin bestehend werden
durch Plasmin gespalten. Plasmin selbst entsteht wenn Plasminogen durch einen
gewebespezifischen Plasminogenaktivator (TPA) umgewandelt wird.
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