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Klausur Biotechnologie 2013
1) a) In welchen Wirtssystemen werden heutzutage rekombinante Arzneistoffe
produziert? geben Sie auch wissenschaftliche Artnamen oder Zelllinien an (wenn
möglich)! Definieren Sie folgende Begriffe und geben Sie jeweils ein Beispiel
dafür an.
b) Vergleichen Sie die verschiedenen Wirtssysteme hinsichtlich Geschwindigkeit,
Kosten und Glykosylierung.
2) a) Erklären Sie die Funktion folgender Vektorelemente und geben Sie jeweils ein
konkretes Beispiel an:
Auxotrophiemarker
Sekretionssignal
Promotor
Tags
Reportergen
b) Was versteht man unter dem Begriff "shuttle vector"?
c) Warum verwendet man zur heterologen Genexpression oft "regulierbare
Promotoren"? Erklären Sie die Regulation an Hand eines konkreten Beispiels!
3) Nennen Sie 8 auf dem Markt eingeführte rekombinante Wirkstoffe und erklären
Sie knapp (stichwortartig) deren biologische Funktion und pharmazeutische
Anwendung!
Lösung:
1)
A)
Prokaryontisch:
 Escherichia coli ( E. coli BL21)
 Bacillus subtilis (für Proteasen)
Eukaryontisch
 Hefen (Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris)
 Säugetierzellen (Chinese Hamster Ovary Cells, Baby Hamster Kidney Cells,
Myelomzelle)
 Insektenzellen (Sf9-Zellen, Sf21)
 Pflanzenzellen (Karottenzelllinie)
 Hybridoma-Zelllinien (transformierte Zelle eines B-Zell-Tumors mit Maus-B-Zelle
fusioniert)
 Transgene Tiere (Ziege)
 Transgene Pflanzen (Mais, Tabak)
B)
Vergleich der Expressionssysteme
Geschwindigk
eit
Kosten
Glykosylierung
Faltung
Gesetzliche
Bestimmunge
n
Am
schlechtesten
Transgene
Tiere
Tiere
Bakterien
Bakterien
Tiere
Am besten
Transgene
Pflanzen
Säugetierzelle
n
Hefezellen
Hefezellen
Pflanzen
Säugetierzelle
n
Pflanzen
Insektenzellen
Hefezellen
Bakterien
Insektenzellen
Hefezellen
Bakterien
Pflanzen
Pflanzen
Insektenzellen
Insektenzellen
Insektenzellen
Hefezellen
Tiere
Tiere
Bakterien
Säugetierzelle
Säugetierzelle
Säugetierzelle
2)
A)
Auxotrophiemarker:
Korrigieren Mutationen in Genen des Wirtsgenoms, die für essentielle
Stoffwechselprozesse wichtig sind.
Ist ein rezessiver Selektionsmarker (= Gene, deren Produkte genetische Defekte in
Mutanten komplementieren).
Bspw. Trp1:
Sekretionssignal:
Ist eine Peptidsequenz, die mit dem gewünschten Peptid fusioniert ist und es zu
speziellen Kompartimenten dirigiert bzw. es schließlich ins Medium sezernieren (ER 
Golgi  sekretorischer Weg) lässt.
Bspw. phoA-Gen (Alkalische Phosphatase)
Promotor:
DNA-Abschnitt eines Gens, an dem RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren binden
und die Transkription initiieren
Bspw. PHO5 (Saure Phosphatase, Transkription bei Phosphatmangel)
Tags:
Ist eine Aminosäuresequenz, die als molekulares Etikett dient und
Aufreinigungsvorgänge vereinfacht.
Bspw. His-Tag
Reportergen:
Ein Gen, dessen Produkt leicht detektierbar und quantifizierbar ist.
Bspw. Chloramphenicol-Acetyltransferase, bakterielle beta-Galactosidase
B)
Shuttle Vektor:
Vektor, der außer in Bakterien auch in einem anderen Organismus benutzt werden
kann.
Neukombination, Amplifikation und Selektion von Genen in E. coli
Expression des Gens in einem anderen Wirtssystem.
Bestandteile:
 Origin of replication für E. coli
 Selektionsmarker für E. coli
 Promotor und Terminator für Selektionsmarker/Auxotrophiemarker für anderen
Wirt
C)
Durch regulierbare Promotoren lässt sich eine Genexpression zum unerwünschten
Zeitpunkt verhindern. Toxische oder nichttoxische Genprodukte von wirtsfremden
Genen können Wachstum der Zellen hemmen, da diese vom Wirt erkannt werden.
Deshalb induziert man die Genexpression erst am Ende der log-Phase, sodass kein
starkes Wachsen der Zellpopulation zu erwarten ist und eine Wachstumshemmung
nicht ins Gewicht fällt.
Beispiel:
Durch das Lac-Operon lässt sich die Expression eines darin eingebauten Gens steuern.
An den Operator kann ein Repressor, der in Gegenwart von Glucose gebildet wird,
binden, die Transkription inhibieren und somit negativ regulieren. Durch Zugabe eines
Induktors (IPTG) verändert Repressor seine Konformation, kann nicht mehr binden und
der lac-Promotor wird frei, wodurch die Transkription ablaufen kann.
Bei Abwesenheit von Glucose steigt intrazell. cAMP-Konz. an. cAMP bindet an CRP
(cAMP-Rezeptor-Protein), wodurch 2 CRP-Moleküle oberhalb des lac-Promotors
binden. Dies erhöht die Affinität der RNA-Polymerase zum lac-Promotor, was die
Transkriptionseffizienz steigert. Dies ist eine positive Regulation.
Man gibt so viel Glucose dazu, dass sie kurz vor dem Ende der log-Phase verbraucht ist.
Dann wird auch IPTG zugegeben.
3)
DNase I:
- In CHO-Zellen
- Schneidet die DNA in kürzere Fragmente
- Wird bei Mukoviszidose eingesetzt
-
-
Durch gestörte mucoziliäre Clearance (aufgrund hochviskösen Schleims)
entstehen häufig Infektion. Dadurch wandern Leukozyten (vorwiegend
Neutrophile) ein, die mit der Zeit zerfallen. Dabei wird DNA freigesetzt, die den
Schleim visköser macht
DNaseI führt zu kürzerer DNA und geringerer Viskosität
Wird als Aerosol appliziert
Omalizumab
- In CHO-Zellen
- Humanisierter monoklonaler Antikörper
- Bindet Effektordomäne von IgE-Antikörpern
- Wird bei schwerem, persistierendem Asthma eingesetzt, wenn die
Standardtherapie versagt
- Bindet die Effektordomäne von IgE-Antikörpern, sodass die Antikörper nicht
mehr am IgE-Rezeptor auf Mastzellen binden können. Dadurch wird die
Degranulation vermindert und Rezeptordichte herabreguliert
Muromomab
- Monoklonaler Antikörper
- Murin; auch in Mauszellen produziert
- Wird zur Behandlung einer steroidresistenten akuten Abstoßung von allogenen
Organtransplantationen eingesetzt
- Bindet CD3-Komplexe auf T-Zellen, wodurch die Signaltransduktion von über den
T-Zellrezeptor inhibiert wird. Der Komplex wird vom Immunsystem als fremd
erkannt und T-Zellen dadurch eliminiert.
Abciximab
- In Säugetier-Zellkulturen
- Ist das Fab-Fragment eines chimären murin-humanen AK des IgG-Typs gegen den
Glycoprotein-Rezeptor GPIIb/IIIa
- Anwendung bei Koronarintervention (Stent-Implantation, Ballondilatation) und
instabiler Angina pectoris
- enthaltener Teil der konstanten Domäne ist human, variable AK-Region ist murin
- Bindung an GPIIb/IIIa verhindert, dass aktivierte Thrombozyten sich
miteinander verbinden, wodurch keine Thrombozytenaggregation stattfindet. Es
wird eine Thrombosebildung verhindert
Somatotropin (= hGH = Somatropin)
- In E. coli
- Ist das menschliche Wachstumshormon
- Wird bei Mangel an GH im Kindesalter eingesetzt, die durch Gendefekte
hervorgerufen werden
- Induziert in Leber über GHR die Bildung von IGF (Insulin-like growth Faktoren),
die das Wachstum von Muskeln, Organen und Knochen stimulieren. Es wirkt
auch direkt auf den Fett, Eiweiß- und Zuckerstoffwechsel, wobei freie Fettsäuren
gebildet werden, die die Ausschüttung von GH aus der Hypophyse hemmen. IGFs
und GH inhibieren die Ausschüttung des Wachstumshormon-Releasingfaktors im
Hypothalamus.
Erythropoetin
-
-
In CHO-Zellen (Glycosylierung für HWZ entscheidend)
Ist ein Glycoprotein, das die Proliferation von Vorläuferzellen und die
Differenzierung zu Erythrozyten stimuliert
Wird bei renaler Anämie (durch chronische Niereninsuffizienz eingesetzt) oder
bei Tumoren, Lymphomen und Infektionen eingesetzt, bei denen BFU-E und CFUE durch hohe Konz. von Zytokinen gehemmt werden
o Wird nicht bei Anämien eingesetzt, die aufgrund von VitB12-, Folsäure-,
Eisenmangel entstehen
Gelangt ins Knochenmark und wirkt dort auf burst forming units der
Erythropoese (BFU-E) und CFU-E (colony) sowie erythroide Vorläuferzellen und
stimuliert die Erythropoese, wodurch die Erythrozytenzahl steigt und die O2Versorgung verbessert wird. EPO bindet an seinen Rezeptor (ist eine RTK), bevor
der JAK/STAT-Signalweg und die MAPK-Kaskade angestoßen wird. Dies führt zu
Zellproliferation und Genexpression.
Interferon alpha
- In E. coli (Glycosylierung trägt nicht zu Wirkung bei)
- Ist ein Interferon des Typs I; Glycosyliertes Protein, dessen Glycosylierung nicht
zur Wirkung beiträgt
- Wird bei chronischer Hepatitis B, Hepatitis C, Haarzell-Leukämie, KarposiSarkom eingesetzt
- Wirkt antiproliferativ, antiviral, immunmodulatorisch. Aktiviert INF Typ 1Rezeptor, der über JAK/STAT-Signalweg Translation von mRNA hemmt, die
Degradation von mRNA fördert und Virusreplikation verhindert.
Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA)
- In CHO (andere Produkte auch in E. coli)
- Ist eine Protease, die Plasminogen in Plasmin umwandelt
- Wird zur Fibrinolyse beim akuten Herzinfarkt, bei akuter massiver
Lungenembolie und bei akutem ischämischen Schlaganfall eingesetzt
- Ist als ternärer Komplex aus Fibrin und Plasminogen aktiv und wandelt
Plasminogen zu Plasmin um, das wiederum das Fibrin im Fibrinnetz zu
Fibrinpeptiden spaltet und somit die Auflösung von Blutgerinnseln (Fibrinolyse)
bewerkstelligt.
Zusatz:
Klonierungsvektor Bestandteile:
 Ori für E. coli
 Selektionsmarker für E. coli
 MCS
 Häufig Reportergen (beta-Galactosidase)
Expressionsvektor Bestandteile:
 Starker Promotor
 MCS hinter Promotor
 Terminatorsequenz
 Repressor/Induktor-System zur Regulation der Transkription/des Promotors
 Translationskontrolleinheiten (prokar. Shine-Dalgarno-Sequenz, Startcodon,
Stoppcodon)
 Auxotrophiemarker mit Promotor und Terminator für Wirt
 Evtl. ori für Wirt
 Evtl Selektionsmarker für E. coli
 Evtl. ori für E. coli