ELISA-3-Punkte

Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung…………………………………………………………………………………………..2
2. Versuchsaufbau und –durchführung…………………………………………………………....2
3. Auswertung……………………………………………………………………………………….. 3
4. Interpretation………………………………………………………………………………………5
5. Anhang……………………………………………………………………………………………. 7
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1. Einleitung
Der Versuch diente dazu, Rinder-Serumalbumin (BSA) – ein Proteinantigen –
immunochemisch nachzuweisen und die Antikörper-Antigen-Affinität zu bestimmen. Dazu
wurde ein einfacher ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) durchgeführt und eine
Verdünnungsreihe des antigenspezifischen Immunglobulin hergestellt. Um Kreuzreaktionen
des Anti-BSA-Antikörpers auszuschließen wurde Humanes Serumalbumin (HSA) verwendet.
Es erfolgte eine durch Alkalische Phosphatase katalysierte chromogene Nachweisreaktion.
Anschließend wurden die Konzentrationen des gebildeten, farblichen Produktes nach einer
Endpunktbestimmung spektral-photometrisch gemessen und durch graphische Verfahren
analysiert.
2. Versuchsaufbau und -durchführung
Für den Enzym-gekoppelten Immunsorbenstest wurde eine Lösung von 10 mg/ml BSA und
HSA in PBS hergestellt. Dazu löste man jeweils 100 mg BSA und HSA in 10 ml PBS. Die
Pufferlösung PBST 0,1 lag schon vorbereitet vor.
Zu Beginn des Versuchs wurden die Spalten 1-3 der Mikrotiterplatte mit je 50µl der BSALösung und die Spalten 4-6 mit 50µl der HSA-Lösung befüllt. Die restlichen Spalten (7-9 und
10-12) wurden nach demselben Schema von der Nachbarsgruppe befüllt. Nach dem
Pipettieren wurde für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach folgte ein Waschvorgang, bei dem die Mikrotiterplatte ausgeklopft und alle
Vertiefungen mit PBST 0,1 ausgewaschen wurden. Verbleibende Reste der Pufferlösung
wurden ebenfalls ausgeklopft.
In die Vertiefungen der Reihen B bis H wurden dann jeweils 50µl PBST 0,1 pipettiert. Die
Vertiefungen der Reihe A wurden mit je 50µl einer 1:500 Verdünnung des monoklonalen
Anti-BSA-Antikörpers in PBST 0,1 befüllt. Ebenso wurde Reihe B mit einer 1:500 Anti-BSAAntikörper-Verdünnung versehen, sodass eine 1:2-Verdünnung entstand. Ausgehend von
dieser Verdünnung wurde eine Verdünnungsreihe erstellt, indem jeweils 50µl einer
Vertiefung in die Darunterliegende pipettiert und mit dem bereits vorhandenen Puffer
durchmischt wurden. Die Verdünnungsreihe wurde bis einschließlich Reihe H erstellt, wobei
aus deren Vertiefungen je 50µl entnommen und weggeschüttet wurden. Anschließend wurde
wieder für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach einem weiteren Waschvorgang wurden 50µl einer 1:10000-Verdünnung des Anti-Maus
IgG-Alkalische Phosphatase-Konjugates in PBST 0,1 (die Verdünnung wurde von dem
Betreuer vorgelegt) in alle Vertiefungen pipettiert und für 45 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert.
Bevor schließlich 50µl einer Lösung von 0,5 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in AP-Puffer pro
Vertiefung pipettiert wurden, musste die Mikrotiterplatte ein letztes Mal gewaschen werden.
Diesmal jedoch zweimal mit PBST 0,1 und zweimal mit PBS, wobei zwischen jedem
Auswaschschritt die Mikrotiterplatte wie gewohnt ausgeklopft wurde.
Die Produktbildung in den Wells konnte dann nach 5, 10 und 15 Minuten im ELISAPhotometer bei einer Wellenlänge von 415 nm gemessen und die Absorptionsänderungen
anschließend ausgewertet werden.
-2-
3. Auswertung
Für die Auswertung der Absorptionsänderungen und die damit verbundene graphische
Auslegung der Messwerte, wurden die Daten nach 15 Minuten Reaktionszeit verwendet
(siehe Anhang 1: Absorbance Report), da man davon ausging, dass die Reaktion zu diesem
Zeitpunkt einem Gleichgewicht am nächsten lag bzw. ihn bereits erreicht haben könnte.
Unter Einsatz dieser Absorptionswerte wurde eine Tabelle sowohl für den Nachweis von
Rinder- also auch von humanem Serumalbumin erstellt, die den gemittelten Absorptionswert
enthält, sowie die jeweiligen Konzentrationen des Anti-BSA-Antikörpers und die
dazugehörigen Verdünnungsschritte.
A
B
C
D
E
F
G
H
Verdünnung
AntikörperKonzentration
[mg/ml]
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
1:32000
1:64000
8 x 10-3
4 x 10-3
2 x 10-3
1 x 10-3
5 x 10-4
2,5 x 10-4
1,25 x 10-4
6,25 x 10-5
Absorptionswerte
für BSA bei 415 nm
1
0,280
0,283
0,230
0,174
0,149
0,120
0,104
0,087
2
0,372
0,352
0,241
0,202
0,158
0,117
0,112
0,080
3
0,383
0,343
0,237
0,199
0,142
0,120
0,107
0,086
Mittelwert
0,345
0,326
0,236
0,192
0,150
0,119
0,108
0,084
Tabelle 1: Absorptionswerte des gelben Reaktionsproduktes p-Nitrophenolat-Anion nach 15 Minuten
Reaktionszeit und bei einer Wellenlänge von 415 nm. Über die Absorptionsänderung kann indirekt die Bildung
des BSA/Anti-BSA-Antikörper-Komplexes verfolgt werden.
A
B
C
D
E
F
G
H
Verdünnung
AntikörperKonzentration
[mg/ml]
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
1:32000
1:64000
8 x 10-3
4 x 10-3
2 x 10-3
1 x 10-3
5 x 10-4
2,5 x 10-4
1,25 x 10-4
6,25 x 10-5
Absorptionswerte
für HSA bei 415 nm
1
0,078
0,108
0,078
0,086
0,078
0,079
0,083
0,070
2
0,078
0,096
0,080
0,079
0,082
0,077
0,080
0,073
3
0,075
0,098
0,083
0,242
0,082
0,086
0,080
0,072
Mittelwert
0,077
0,101
0,080
0,136
0,081
0,081
0,081
0,072
Tabelle 2:. Absorptionswerte von p-Nitrophenolat-Anion nach 15 Minuten Reaktionszeit und bei einer Wellenlänge
von 415 nm. Aufgrund der geringen Absorptionsänderungen und der vernachlässigbar kleinen Werte ging man
von keiner Kreuzreaktion des Anti-BSA-Antikörpers mit HSA aus. Der Ausreißerwert 0,242 wurde hierbei als nicht
repräsentativ bewertet.
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Der Antikörpergehalt in der Stammlösung betrug 4 mg/ml. Die einzelnen Anti-BSAAntikörper-Konzentrationen ließen sich aus den jeweiligen Verdünnungen berechnen. Als
repräsentativen Wert für die Auftragung der Absorptionsänderung gegen die AntikörperKonzentration wurde der Mittelwert dieser Daten verwendet. Um die graphische Darstellung
(siehe Anhang 2 und 3: Antikörper-Antigen-Affinität für Anti-BSA-Antikörper mit BSA und
HSA als Antigen) anschaulicher zu gestalten, wurden die Messwerte der höchsten
Verdünnungsstufe gleich Null gesetzt, da die Antikörper-Konzentration hier so gering ist,
sodass es praktisch zu keiner Produktbildung kommen konnte. Um die Graphen nicht zu
verfälschen, mussten diese Werte von den Übrigen abgezogen werden. Folgende
Mittelwerte waren das Ergebnis:
A
B
C
D
E
F
G
H
Verdünnung
AntikörperKonzentration
[mg/ml]
Mittelwert
BSA
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
1:32000
1:64000
8 x 10-3
4 x 10-3
2 x 10-3
1 x 10-3
5 x 10-4
2,5 x 10-4
1,25 x 10-4
6,25 x 10-5
0,261
0,242
0,152
0,108
0,066
0,035
0,024
0,000
Tabelle 3: Korrigierte Mittelwerte der Absorptionsdaten für BSA
nach 15 Minuten Reaktionszeit und bei 415 nm.
A
B
C
D
E
F
G
H
Verdünnung
AntikörperKonzentration
[mg/ml]
Mittelwert
HSA
1:500
1:1000
1:2000
1:4000
1:8000
1:16000
1:32000
1:64000
8 x 10-3
4 x 10-3
2 x 10-3
1 x 10-3
5 x 10-4
2,5 x 10-4
1,25 x 10-4
6,25 x 10-5
0,005
0,029
0,008
0,064
0,009
0,009
0,009
0,000
Tabelle 4: Korrigierte Mittelwerte der Absorptionsdaten für HSA
Nach 15 Minuten Reaktionszeit und bei 415 nm.
Mit diesen Mittelwerten wurde sowohl für die Reaktion mit BSA also auch mit HSA eine
Kurve erstellt, die die Absorptionsänderung in Abhängigkeit zur Antikörper-Konzentration
zeigt. Da die Werte für die HSA/Anti-BSA-Antikörper-Affinität sehr schwanken und der
Absorptionswert bei der höchsten Anti-BSA-Antikörper-Konzentration sogar gegen Null geht,
konnte eine Kreuzreaktion des Antikörpers mit humanem Serumalbumin ausgeschlossen
werden.
Die Kurve für die BSA/Anti-BSA-Antikörper-Affinität hingegen zeigt einen hyperbolischen
Verlauf. Weil allerdings einige Messwerte von dieser Form abweichten, wurde eine
Ausgleichskurve erstellt, mit der sich die graphische Bestimmung der Dissoziationskonstante
erleichtern lies.
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Durch eine graphische Auswertung der Absorptionsmessungen konnte nun die
Dissoziationskonstante KD für den BSA/Anti-BSA-Antikörper-Komplex bestimmt werden.
Dabei wird der halbierte Wert des Absorptionsmaximums auf der Ordinate einem definierten
Wert auf der Abszisse zugeordnet. Dieser entspricht dann der Dissoziationskonstante KD
(siehe Anhang 2: Antikörper-Antigen-Affinität für Anti-BSA-Antikörper mit BSA als Antigen).
Amax = 0,261
Amax/2 = 0,131

KD = 1,5 x 10-3 mg/ml
Die apparente Dissoziationskonstante KD für den Komplex aus BSA und Anti-BSA-Antikörper
Alkalische Phosphatase-Konjugat entspricht demnach schätzungsweise einem Wert von
KD = 1,5 x 10-3 mg/ml.
4. Interpretation
Der indirekte, chromogene Nachweis von Rinder-Serumalbumin beruht darauf, dass sich ein
gelbes Reaktionsprodukt bildet, dessen Absorptionsänderung mittels Spektroskopie
gemessen werden kann. Der Reaktionsmechanismus ist folgender: der Anti-BSA-Antikörper
bindet spezifisch an das Antigen, wodurch es zu einem Antigen-Antikörper-Komplex kommt.
Ein auf den antigenspezifischen Antikörper gerichteter Zweitantikörper, der mit einem
Reporterenzym konjugiert ist, bindet an diesen Komplex. Als Reporterenzym dient in diesem
Fall Alkalische Phosphatase. Sie katalysiert die Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat zu pNitrophenolat-Anionen, deren Bildungsgeschwindigkeit bei 415 nm gemessen werden kann.
Abbildung 1: Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat durch
mesomeriestabilisierten p-Nitrophenolat-Anion (Quelle: Manuskript)
Alkalische
Phosphatase
zum
farbigen
Diese chromogene Nachweisreaktion konnte auch mit dem bloßen Auge verfolgt werden.
Denn die mit BSA erstellte Verdünnungsreihe in der Mikrotiterplatte zeigte schon nach kurzer
Zeit ein gelbes Produkt, dessen Färbung immer intensiver wurde. Daraus lässt sich
schlussfolgern, dass mit zunehmender Reaktionszeit immer mehr Produkt gebildet wurde,
wobei die jeweilige Anti-BSA-Antikörper-Konzentration eine entscheidende Rolle spielte.
Denn die Produktbildung und damit auch die Absorptionswerte nahmen mit höherer
Antikörper-Verdünnung immer mehr ab. Ersichtlich wird dies an den ermessenen
Absorptionswerten (siehe Anhang 1: Absorbance Report).
Hingegen konnte bei der mit HSA erstellten Verdünnungsreihe mit dem bloßen Auge keine
Produktbildung durch Gelbfärbung beobachtet werden. Auch durch spektral-photometrische
Messungen konnte keine Antigen-Antikörper-Affinität des Anti-BSA-Antikörpers zu humanem
Serumalbumin festgestellt werden. Sowohl das Verstreichen der Reaktionszeit als auch die
Abnahme der Antikörper-Konzentration führten zu keiner ersichtlichen Veränderung. Die
Absorptionswerte sind vergleichsweise klein und gleichbleibend.
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Aus diesem Grund kann eine Kreuzreaktion des Anti-BSA-Antikörpers mit humanem
Serumalbumin ausgeschlossen werden.
Zum gleichen Ergebnis gelangt man, wenn man sich die Graphen anschaut. Die
Affinitätskurve für BSA zeigt durch ihre hyperbolische Verlaufsform deutlich die zunehmende
Absorption, und damit die Produktbildung, mit steigender Antikörperkonzentration. Dabei
steigt die Kurve zu Beginn sehr steil an und erreicht bei der höchsten Konzentration von
0,008 mg/ml ein Absorptionsmaximum von 0,261.
Die Kurve für die HSA/Anti-BSA-Antikörper-Affinität zeigt keine besondere Form. Die
Absorptionswerte schwanken bis auf einen Ausreißer (ersichtlich an dem „Peak“ im
Graphen) um den Nullwert herum. Selbst bei der höchsten Antikörperkonzentration wird
lediglich ein Absorptionswert von 0,005 erreicht. Somit können anhand der Verlaufsform des
Graphen ebenfalls Kreuzreaktionen des Antikörpers ausgeschlossen werden.
Antikörper binden mit ihren Antigenbindungsstellen (Paratopen) jeweils an eine bestimmte
Antigenstruktur, das Epitop. Der so entstehende Antigen-Antikörper-Komplex ist in hohem
Grade spezifisch. Diese Eigenschaft der Antikörper macht sich das ELISA-Verfahren zu
nutze und stellt somit eine geeignete Möglichkeit für einen empfindlichen und spezifischen
Nachweis von Protein- und Peptidantigenen.
Allerdings kann es durchaus vorkommen, dass ein anderes Antigen das gleiche bzw. ein
sehr ähnliches Epitop besitzt. In diesem Fall kann der Antikörper mit ein und demselben
Paratop an zwei verschiedene Antigene binden. Dies nennt man Kreuzreaktivität.
BSA und HSA sind verwandte Proteine. Das BSA kommt in Rindern und das HSA im
Menschen vor. Es wäre denkbar, dass es aufgrund ihrer Ähnlichkeit in Aufbau und Struktur
zu einer Kreuzreaktion des Anti-BSA-Antikörpers kommen könnte, was jedoch im Zuge
dieses Protokolls widerlegt wurde.
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