Inhaltsverzeichnis
Werbung
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ......................................................................................................................................................I Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................................ VI 1 Einleitung .......................................................................................... Error! Bookmark not defined. 1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.4 1.5 1.6 Adenoviren ...................................................................... Error! Bookmark not defined. Das E1A-Gen und die Funktionen seiner Genprodukte ...... Error! Bookmark not defined. Die Promotorregion des Ad12 E1A Gens ................ Error! Bookmark not defined. Die distale Promoterregion ........................................ Error! Bookmark not defined. Die proximale Promotorregion ................................. Error! Bookmark not defined. Ad12 E1A Autoregulation............................................. Error! Bookmark not defined. Der Zellzyklus .................................................................. Error! Bookmark not defined. Die E2F-Transkriptionsfaktoren und ihr Einfluß auf den Zellzyklus ..............Error! Bookmark not defined. Zielsetzung der Arbeit .................................................. Error! Bookmark not defined. 2 Material Error! Bookmark not defined. 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13 2.14 Bakterienstämme ........................................................... Error! Bookmark not defined. Hefestämme .................................................................... Error! Bookmark not defined. Zellinien............................................................................. Error! Bookmark not defined. Vektoren und Konstrukte ............................................ Error! Bookmark not defined. cDNA-Banken, cDNA-Filter und deren assoziierte Klone .. Error! Bookmark not defined. Lösungen und Puffer .................................................... Error! Bookmark not defined. Nährmedien..................................................................... Error! Bookmark not defined. Medien und Seren zur Zellkultivierung ................... Error! Bookmark not defined. Molekulargewichtsstandards (DNA/RNA/Protein) ............... Error! Bookmark not defined. Enzyme und Proteine ................................................... Error! Bookmark not defined. Antikörper ........................................................................ Error! Bookmark not defined. Kits ...................................................................................... Error! Bookmark not defined. Radiochemikalien ........................................................... Error! Bookmark not defined. Verbrauchsmaterialien und Filme ............................. Error! Bookmark not defined. I Inhaltsverzeichnis 2.15 2.16 2.17 Chemikalien ..................................................................... Error! Bookmark not defined. Geräte ................................................................................ Error! Bookmark not defined. Oligonukleotide .............................................................. Error! Bookmark not defined. 3 Methoden ......................................................................................... Error! Bookmark not defined. 3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.3 3.3.1 3.3.1.1 3.3.1.2 3.3.1.3 3.3.1.4 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.3.7 3.3.8 3.3.9 3.3.10 Zellkultur ........................................................................... Error! Bookmark not defined. Kultivierung ...................................................................... Error! Bookmark not defined. Zellzahlbestimmung ..................................................... Error! Bookmark not defined. Herstellung und Transformation kompetenter E. coli-Bakterien ..................Error! Bookmark not defined. Kompetente E. coli-Bakterien zur Elektroporation ............... Error! Bookmark not defined. Kompetente E. coli-Bakterien nach der CaCl2-Methode .... Error! Bookmark not defined. Kompetente E. coli-Bakterien nach der RbCl-Methode...... Error! Bookmark not defined. Transformation chemisch kompetenter E. coli-Bakterien .. Error! Bookmark not defined. Transformation kompetenter E. coli-Bakterien durch Elektroporation .......Error! Bookmark not defined. Arbeiten mit DNA .......................................................... Error! Bookmark not defined. Aufreinigung von Plasmid-DNA aus E. coli-Bakterien......... Error! Bookmark not defined. Plasmid-Mini-Präparation mittels kommerzieller Kits ......... Error! Bookmark not defined. Plasmid-Mini-Präparation ........................................... Error! Bookmark not defined. Plasmid-Maxi-Präparation mittes kommerzieller Kits ......... Error! Bookmark not defined. Plasmid-Maxi-Präparation nach der CsCl Methode ........... Error! Bookmark not defined. Glycerindauerkulturen .................................................. Error! Bookmark not defined. Agarose-Gelelektrophorese ....................................... Error! Bookmark not defined. Konzentrationsbestimmung von DNA-LösungenError! Bookmark not defined. Schneiden von DNA mit Restriktionsendonukleasen .......... Error! Bookmark not defined. Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose .......... Error! Bookmark not defined. Auffüllen von 5’ überhängenden DNA-Enden ..... Error! Bookmark not defined. Dephosphorylierung von geschnittener Vektor-DNA ........ Error! Bookmark not defined. Ligation von DNA-Fragmenten ................................. Error! Bookmark not defined. Phenol/Chloroform-Extraktion von Plasmid-DNA ............... Error! Bookmark not defined. II Inhaltsverzeichnis 3.3.11 3.3.12 3.3.12.1 3.3.12.2 3.3.12.3 3.3.12.4 3.3.12.5 3.3.12.6 3.3.13 3.3.14 3.3.15 3.3.16 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.4.5 3.4.6 3.4.6.1 3.4.6.2 3.4.7 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 3.5.6.1 3.5.6.2 3.5.6.3 3.5.7 3.5.8 3.5.8.1 TA-Klonierung................................................................. Error! Bookmark not defined. PCR-Techniken ............................................................... Error! Bookmark not defined. Standard-PCR ................................................................. Error! Bookmark not defined. Touch-down-PCR .......................................................... Error! Bookmark not defined. PCR langer DNA-Fragmente ...................................... Error! Bookmark not defined. RT-PCR .............................................................................. Error! Bookmark not defined. 5' RACE-PCR ................................................................... Error! Bookmark not defined. Aufreinigung von PCR-ampifizierter DNA ............. Error! Bookmark not defined. DNA-Sequenzierung .................................................... Error! Bookmark not defined. Herstellung doppelsträngiger Oligonukleotide ... Error! Bookmark not defined. Radioaktive 3' Endmarkierung von doppelsträngigen Oligonukleotiden ..Error! Bookmark not defined. Radioaktive Markierung von DNA-Sonden ........... Error! Bookmark not defined. Arbeiten mit RNA........................................................... Error! Bookmark not defined. Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen .... Error! Bookmark not defined. RNA Isolierung mittels kommerzieller Kits ............. Error! Bookmark not defined. RNA-Konzentrationsbestimmung ............................ Error! Bookmark not defined. Formaldehyd-Agarosegelektrophorese.................. Error! Bookmark not defined. Färben/Entfärben von Formaldehyd-Agarosegelen ............ Error! Bookmark not defined. Northern-Blot .................................................................. Error! Bookmark not defined. Übertragung von RNA auf eine Nylonmembran . Error! Bookmark not defined. Hybridisierung ................................................................ Error! Bookmark not defined. MTN-Blot (Multiple Tissue Northernblot) .............. Error! Bookmark not defined. Proteinchemisches Arbeiten ....................................... Error! Bookmark not defined. Proteinkonzentrationsbestimmung wäßriger Lösungen nach Bradford ....Error! Bookmark not defined. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............ Error! Bookmark not defined. Coomassie-Färbung ...................................................... Error! Bookmark not defined. Silberfärbung................................................................... Error! Bookmark not defined. Fluorographie.................................................................. Error! Bookmark not defined. Expression und Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen . Error! Bookmark not defined. Expression der GST-Fusionsproteine ....................... Error! Bookmark not defined. Elution der GST-Fusionsproteine .............................. Error! Bookmark not defined. Abspaltung des GST-Parts von GST-Fusionsproteinen ...... Error! Bookmark not defined. Zellkernextrakte .............................................................. Error! Bookmark not defined. Zellextrakte ...................................................................... Error! Bookmark not defined. Zellextrakte unter denaturierenden Bedingungen ............... Error! Bookmark not defined. III Inhaltsverzeichnis 3.5.8.2 3.5.9 3.5.10 3.5.10.1 3.5.10.2 3.5.11 3.5.12 3.5.13 3.5.13.1 3.5.13.2 3.6 3.6.1 3.6.1.1 3.6.1.2 3.6.1.3 3.6.2 3.6.2.1 3.6.2.2 3.6.2.3 3.6.2.4 3.6.2.5 3.6.2.6 3.6.3 Zellextrakte unter nativen Bedingungen ................ Error! Bookmark not defined. Western-Blot (nach Harlow und Lane, 1988)......... Error! Bookmark not defined. Transiente Transfektion von Säugerzellen ............. Error! Bookmark not defined. Transiente Transfektion von Säugerzellen mittels Elektoporation ...............Error! Bookmark not defined. Transiente Transfektion von Säugerzellen mittels nicht-liposomaler Lipide Error! Bookmark not defined. In vitro Transkriptions/Translations-System .......... Error! Bookmark not defined. Gel-Retardations-Analysen (Bandshiftexperimente)............ Error! Bookmark not defined. Radioaktive Immunpräzipitation ............................ Error! Bookmark not defined.3 Radioaktive Markierung der Zellen .......................... Error! Bookmark not defined. Präzipitation..................................................................... Error! Bookmark not defined. Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken ............. Error! Bookmark not defined. Durchmusterung einer Phagenbank........................ Error! Bookmark not defined. Ermittlung des Phagentiters ....................................... Error! Bookmark not defined. Filterabzüge ..................................................................... Error! Bookmark not defined. Hybridisierung ................................................................ Error! Bookmark not defined. Hefe-„One-Hybrid“ System ........................................ Error! Bookmark not defined. Herstellung der kompetenten Zellen ...................... Error! Bookmark not defined. Transformation der kompetenten Hefezellen ..... Error! Bookmark not defined. ß-Galaktosidase Filter-Assay ...................................... Error! Bookmark not defined. Titerbestimmung und Amplifikation der MATCHMAKER cDNA-Bank........Error! Bookmark not defined. Transformation der cDNA-Bibliothek in den Reporterhefestamm ..............Error! Bookmark not defined. Präparation der Plasmid-DNA aus Hefezellen ..... Error! Bookmark not defined. Hybridisierung eines cDNA-Filters (High Density Filter Library) ....................Error! Bookmark not defined. 4 Ergebnisse......................................................................................... Error! Bookmark not defined. 4.1 Hefe-"One-Hybrid" System ........................................ Error! Bookmark not defined. 4.1.1 Generierung verschiedener Reportergenhefestämme ....... Error! Bookmark not defined. 4.1.2 Überprüfung der Reportergenbasalexpression .... Error! Bookmark not defined. 4.1.3 Durchmusterung einer humanen HeLa MATCHMAKER cDNA-Bank..........Error! Bookmark not defined. 4.1.4 Retransformation der positiven Klone in den Reporterhefestamm .............Error! Bookmark not defined. 4.1.5 Sequenzierung und Homologievergleich .............. Error! Bookmark not defined. 4.2 Bindung an die DNA-Zielsequenz ............................ Error! Bookmark not defined. 4.2.1 Hefemutationstest ......................................................... Error! Bookmark not defined. IV Inhaltsverzeichnis 4.2.2 Verifizierung der Klon 23/E2FII-Bindung in einem hefeunabhängigen System mittels Bandshiftanalysen. ........................................... Error! Bookmark not defined. 4.3 Northern-Blot-Analysen .............................................. Error! Bookmark not defined. 4.3.1 Multiple Tissue Northern-Blot ................................... Error! Bookmark not defined. 4.3.2 Northern-Blot-Analysen verschiedener mRNAs aus Tumorzellinien...........Error! Bookmark not defined. 4.4 Vollängensuche .............................................................. Error! Bookmark not defined. 4.4.1 Durchmusterung einer humanen HeLa cDNA-Bibliothek.. Error! Bookmark not defined. 4.4.2 Überlappende EST-Sequenzen ................................. Error! Bookmark not defined. 4.4.3 Durchmusterung einer gruppierten HeLa cDNA Bank ....... Error! Bookmark not defined. 4.4.4 Verifizierung des putativen Stopcodons ................ Error! Bookmark not defined. 4.4.5 Erste und zweite 5' RACE-PCR................................... Error! Bookmark not defined. 4.4.6 Durchmusterung einer vollängenangereicherten cDNA-Bibliothek mittels DNA-Filterhybridisierung ............................................ Error! Bookmark not defined. 4.4.7 Vierte und fünfte 5’ RACE-PCR.................................. Error! Bookmark not defined. 4.4.8 Sequenzverifizierung mittels RT-PCR ...................... Error! Bookmark not defined. 4.4.9 cDNA-Vollängensequenz Klon 23 ............................ Error! Bookmark not defined. 4.5 Sequenzanalyse und Homologievergleich ............ Error! Bookmark not defined. 4.5.1 Translatierte und untranslatierte Bereiche in der Vollängen-cDNA ............Error! Bookmark not defined. 4.5.2 Homologie zu einem huntingtin-bindenden Protein .......... Error! Bookmark not defined. 4.5.3 WW/WWP-Domäne...................................................... Error! Bookmark not defined. 4.5.4 SET-Domäne ................................................................... Error! Bookmark not defined. 4.5.5 Tyrosinkinase Phosphorylierungssite ....................... Error! Bookmark not defined. 4.5.6 Putative Kernlokalisationssequenz ........................... Error! Bookmark not defined. 4.5.7 Größe und Struktur des translatierten Proteins ... Error! Bookmark not defined. 4.6 Klonierung des translatierten Bereichs der cDNA-Vollängensequenz ......Error! Bookmark not defined. 4.6.1 Klonierung des 5'Endes (nt 410-nt 3245) ............... Error! Bookmark not defined. 4.6.2 Klonierung des 3‘Endes (nt 3240-nt 6592) ............ Error! Bookmark not defined. 4.6.3 Klonierung der Gesamtvollänge ............................... Error! Bookmark not defined. 4.7 In vitro Translation und Expressionsversuch der Vollängensequenz ...........Error! Bookmark not defined. 4.7.1 Expression des VL23-HA-Konstruktes in Säugerzellen ....... Error! Bookmark not defined. 4.7.2 In vitro Translation des VL23-HA-Plasmids ........... Error! Bookmark not defined. 4.7.3 Umklonierung der Vollängensequenz in alternative ExpressionsvektorenError! Bookmark not defined. 4.7.4 In vitro Translation mit anschließender Western-Blot-Analyse Error! Bookmark not defined. V Inhaltsverzeichnis 4.7.5 4.7.6 Transfektion 3XHA23VL in Säugerzellen ................ Error! Bookmark not defined. Immunpräzipitation des exprimierten Proteins .... Error! Bookmark not defined. 5 Diskussion ......................................................................................... Error! Bookmark not defined. 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.1 defined. 5.5.2 5.5.3 5.5.4 5.5.5 5.6 5.7 Identifizierung eines E2FII-bindenden Proteins mit Hilfe des Hefe-„One-Hybrid“-Systems ...................................... Error! Bookmark not defined. Verifizierung der Bindung an die E2FII-Zielsequenz ........... Error! Bookmark not defined. Northern-Blot-Analysen .............................................. Error! Bookmark not defined. Vollängensuche .............................................................. Error! Bookmark not defined. Sequenzanalyse und Homologievergleich ............ Error! Bookmark not defined. Homologie zu einem huntingtin-bindenden Protein .......... Error! Bookmark not WW/WWP Domäne ...................................................... Error! Bookmark not defined. SET-Domäne ................................................................... Error! Bookmark not defined. Die Tyrosinkinasierungssite ........................................ Error! Bookmark not defined. ...... Zusammenfassung des Homologievergleichs und seine Bedeutung für die funktionellen Eigenschaften von Klon 23 ............... Error! Bookmark not defined. Klonierung der cDNA-Vollängensequenz in Expressionsvektoren und deren Expressionsversuch........................................................ Error! Bookmark not defined. Ausblick ............................................................................. Error! Bookmark not defined. 6 Zusammenfassung ......................................................................... Error! Bookmark not defined. 7 Literaturverzeichnis ........................................................................ Error! Bookmark not defined. 8 Publikationen ................................................................................... Error! Bookmark not defined. 9 Lebenslauf ........................................................................................ Error! Bookmark not defined. 10 Erklärungen .................................................................................... Error! Bookmark not defined. Danksagungen VI Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 3AT 3-Aminotriazol aa Aminosäure(n) Ac Acetat Ad Adenovirus AD Aktivierungsdomäne APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosin-5‘Triphosphat bp Basenpaare Bq Bequerel; 1 Bq= 1 Zerfall/Sekunde BSA Rinderserumalbumin CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase cDNA komplementäre DNA CMV Cytomegalievirus cpm counts per minute; Impulse (radioaktiver Zerfall) pro Minute CR conserved region; konservierte Region Da Dalton dCTP Desoxycytosintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DHFR Dihydrofolat-Reduktase DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DO „drop out“ dNTPs Desoxynukleotidtriphosphat DTT Dithiothreitol E1A/E1B early region 1A/1B (frühe Region 1A/1B) E. coli EDTA Escherichia coli Ethylendiamin-N‘,N‘,N‘,N‘,-tetraessigsäure FCS fötales Kälberserum g Erdbeschleunigung VII Abkürzungsverzeichnis GST Gluthation-S-Transferase HD Huntington’s Disease/ huntingtin HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N‘-2-ethansulfonsäure His Histidin IPTG Isopropyl--D-thiogalaktosid kb Kilo-Basenpaare kDa Kilo-Dalton LB Luria Broth Leu Leucin M molar Min Minute MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure mRNA Boten-RNA NCBI National Center for Biotechnologie Information (USA) nt Nucleotid OD optische Dichte PA Polyacrylamid PAC P1 Artificial Chromosome PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) PEG Polyethylenglykol pfu plaque-forming units PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid pRB Retinoblastom-Protein RNase Ribonuklease rpm „rounds per minute“- Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur RT-PCR Reverse Transkription-PCR RZPD Ressourcen Zentrum/Primär Datenbank S Svedbergkonstante SB Super Broth SD „synthetic drop out“ Medium VIII Abkürzungsverzeichnis SDS Natriumdodecylsulfat sek Sekunde(n) SV40 Simian Virus 40 TEMED N,N,N‘,N‘,-Tetramethylethylendiamin Tm Schmelztemperatur Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan U Units; Einheiten üN über Nacht UTR untranslatierter Bereich UV ultraviolettes Licht V Volt v/v volume/volume Vol. Volumen w/v weight/volume X-Gal 5-Bromo-4-Chlor-3-inodyl--D-galaktosid IX
