Inhaltsverzeichnis

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Inhaltsverzeichnis
I
Abkürzungen
V
1.
Einleitung
1
1.1
Adenovirus-Wirtszell-Modellsystem
1
1.2
Adenoviren
2
1.2.1
Die produktive Infektion
3
1.2.2
Die abortive Infektion
5
1.3
Struktur und Proteine der E1A-Region des onkogenen Serotyps Ad12
6
1.4
Kontrolle der Genexpression durch E1A-Proteine
7
1.5
Chromatinstruktur und Regulation der Genexpression
11
1.6
Histonacetylierung
13
1.7
Energie-abhängige Änderungen der Chromatinstruktur
15
1.8
Interaktion der E1A-Proteine mit den Chromatin-remodellierenden
Faktoren
18
1.9
Zielsetzung
19
2.
Material
20
2.1
Chemikalien
20
2.2
Enzyme
21
2.3
Antikörper
22
2.4
Nukleinsäuren
22
2.5
Oligonukleotide
23
2.6
Molekulargewichtstandards
23
2.7
Verwendete Vektoren
24
I
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2.7.1
Reporterplasmide
24
2.7.2
Expressionsplasmide
24
2.8
Medien, Reagenzien und Materialien für die Zellkultur
25
2.9
Filme, Filter, Membranen und besondere Verbrauchsmaterialien
25
2.10
Spezielle Laborgeräte
26
2.11
Kits und spezielle Reagenzien
26
2.12
Radiochemikalien
27
2.13
Puffer und Lösungen
27
2.14
Bakterienstämme
31
2.15
Zelllinien
31
3.
Methoden
3.1
Allgemeine Methoden
32
3.2
Zellkultur
32
3.3
Transfektion eukaryontischer Zellen
33
3.3.1
Lipofektion
33
3.3.2
Elektroporation
33
3.4
Isolierung von Plasmid-DNA
34
3.5
Aufreinigung und Klonierung von Nukleinsäuren
34
3.6
Identifizierung Insert-positiver Bakterienklone mittels PCR (PCRScreening)
34
3.7
Transformation von Bakterien
35
3.7.1
Präparation kompetenter E. coli Bakterien
35
3.7.2
Transformation kompetenter E. coli Bakterien
35
3.8
DNA-Quantifizierung
35
3.9
Proteinbestimmung nach Bradford
35
3.10
Bestimmung der CAT-Aktivität in Zellextrakten
36
32
II
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3.11
Herstellung von Gesamtzell-Proteinextrakten
36
3.12
Präparation von Kernextrakt
37
3.13
Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen
37
3.14
In vitro Transkriptions/Translations-System
38
3.15
Analyse von Proteinen
39
3.15.1
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
39
3.15.2
Western-Blotting (Harlow und Lane, 1988)
39
3.15.3
Fluorographie
40
3.16
GST-Fusionsprotein-Interaktionsanalysen
40
3.17
Immunpräzipitation
41
3.18
DNA-Protein-Interaktionsanalysen
42
3.18.1
Chromatin-Immunpräzipitation
42
4.
Ergebnisse
4.1
Der E2Ad12-Promotor als Modellsystem
44
4.2
ATP-abhängige Chromatin-remodellierende Faktoren sind an der
Aktivierung des E2Ad12-Promotors beteiligt
46
Die Aktivierung des E2Ad12-Promotors durch das E1A12S-Protein und
hBRG1 ist abhängig vom N-Terminus und der CR1-Domäne des
adenoviralen Proteins
50
Das E1A12S-Protein bindet in Abhängigkeit des N-Terminus und der CR1Domäne an hBRG1 in vitro
51
Die Interaktion von hBRG1 mit dem E1A12S-Protein ist abhängig von der
HC- und der ATPase-Domäne des hBRG1-Proteins
53
Die E1A12S/hBRG1-vermittelte Aktivierung des E2Ad12-Promotors wird
durch die Expression von hBRG1-Proteinmutanten inhibiert
55
Die ATPase-Untereinheit BRG1 der hSWI/SNF-Komplexe interagiert mit
dem E1A12S-Protein in vivo
57
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
44
III
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4.8
hBRG1 ist an der PKA-vermittelten Aktivierung des E2Ad12-Promotors
beteiligt
60
Die ATPase-Untereinheiten BRG1 und BRM der hSWI/SNF-Komplexe
tragen zu der PKA-vermittelten Aktivierung des E2Ad12-Promotors in
hBRG1- und hBRM-defizienten Zelllinien bei
62
4.10
hBRG1 assoziiert an den E2Ad12-Promotor in vivo
64
4.11
Die Histondeacetylase-1 inhibiert die hBRG1-vemittelte Aktivierung des
E2Ad12-Promotors
69
4.9
4.12
Die Assoziierung von hBRG1 an den E2Ad12-Promotor wird durch die
Aktivität des CBP-Inhibitors Roscovitine und die Histondeacetylase-1
inhibiert
72
5.
Diskussion
5.1
Die ATPase-Untereinheit BRG1 der hSWI/SNF-Komplexe interagiert mit
dem E1A12S-Protein
76
Regulation der Genexpression durch das E1A12S-Protein und hSWI/SNFKomplexe
79
Der hSWI/SNF-abhängige
Promotors
83
5.2
5.3
75
Aktivierungsmechanismus
des
E2Ad12-
6.
Zusammenfassung
91
7.
Literaturverzeichnis
93
8.
Publikationen
109
9.
Lebenslauf
110
10.
Erklärungen
111
IV