Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Auswertung PCR Übersicht Nachweise mittels PCR Lfd.-Nr. Nachweis von: Elektrophorese/Photometrie/ Luminometrie/ Fragmentanalyse/Sequenzierung/ Restriktionsanalyse 1. Beta-Globin 267 bp (zum Nachweis der DNAQualität) 2. 3. B-Lymphome - (Immunglobulin-SchwerkettenRearrangement) mit dem Primer Fr2A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 240 und 280 bp - mit dem Primer Fr3A: Bande oder Schmier im Bereich zwischen 60 und 160 bp Borrelien Pos. bei Cp-Wert unter 40 Real-time-PCR (Flagellin-Gen-Sequenz von B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, B. valaisiana)) 4. BRAF (real-time-PCR AMP) Pos. bei Cp-Werten unter 37 (Nachweis von Mutation V600 im BRAF-Gen auf Chromosom 7) 5. 6. Chlamydien (cryptic plasmid von Chlamydia trachomatis) 241 bp c-KIT Ex 9, 11, 13, 17, 18: ca. 120 – 200 bp Sequenzierung Sequenzierung zum Mutationsnachweis - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren (Nachweis von Mutationen Exon 9,11,13,17,18) 7. 8. CMV Real time-PCR (Tib Molbiol) Pos. bei Cp unter 37 (Fragment des Glykoprotein B Genes) Optimal bei Cp zwischen 18 und 35 Darmparasiten Giardia lamblia: Filter465/510: Ktr Cp25+/-1 Entam. hist.: Filter 533/610: Ktr. Cp 26+/-1 Cryptosp.parv.: Filter 618/660: Ktr. Cp 27+/-1 Real-time-PCR von RIDA Gene von r-biopharm (Nachweis von Giardia lamblia, entamoeba histolytica, Cryptosporidium parvum, Dientamoeba fragilis) 04.13/rev. 11 Dientam. frag.: Filter 533/580: Schmelzkurve: Peak bei 85°C +/-1°C Auswert_PCR 1 Seite 1 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Auswertung PCR 9. EBV 1. real-time-PCR (TibMolbiol) 2. Nested PCR 1. pos. Bei Cp bis 37 (Bam HI W-Fragment) 1. Lauf: 400 bp 2.: 2. Lauf: 249 bp 10. E. coli VT1: 130 bp (Verotoxine, enteroinvasive E. coli, hitzelabiles und hitzestabiles Toxin) VT2: 285 bp VT2v: 385 bp - zur Abgrenzung von VT2-Vatianten kann das Amplifikat von VT2 einer Restriktionsanalyse unterworfen werden (siehe Anhang S. 5) EIEC: 424 bp LT: 708 bp ST: 182 bp 11. EGFR (Exon 18 – 21 auf Chr. 7) 1. real-time-PCR (AMP) 2. Sequenzeirung 1. Pos. bei Cp zwischen 20 und 37 2.Sequenzierung Zum Mutationsnachweis 12. Endopredict (Sividon) Der Cp-Wert von RPL37A des QC-Streifens sollte unter 24 liegen RT-qPCR, Gen-Expression Prognose Mamma-CA 13. Entamoeba histolytica und dispar Real-time-PCR: Pos. bei Cp bis 40 (18S rRNA-Gen) 14. GNAS1 Amplifikatlänge: je ca. 372 bp (Nachweis von Wildtyp und Mutationen am Codon 210 am GNAS1-Gen [Guanine-nucleotidebinding protein] bei polyostotischer und monoostotischer fibröser Dysplasie) WT-1: WT-2: gnasCys/R201C gnasGly/R201G gnasHis/R201H 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 2 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Auswertung PCR 15. Hämochromatose C282Y: 164 bp, (Nachweis von Mutation C282Y – Cystein zu Tyrosin – und H63D – Histidin zu Asparaginsäure – am HFEGen, einem zur MHC Klasse I gehörenden Protein) Restriktion mit SnaBI: 164 bp (Wildtyp) 72 bp und 92 bp (Mutation) H63D: 161 bp Restriktion mit BclI: 94 bp und 67 bp ( Wildtyp) 161 bp (Mutation) 16. Helicobacter pylori real-time-PCR (23S rRNA-Gen) sicher pos. bei Cp unter 40 17. Herpes-1 u. 2 Real-time-PCR (Nachweis des Glykoprotein D (gD)-Genes von HSV-1 und des Glykoprotein G (gG)-Genes von HSV-2) sicher pos. bei Cp unter 40 18. Herpes zoster Real-time-PCR sicher pos. bei Cp unter 40 (Nachweis Polymerase-Gens von Varizella zoster)) 19. HPV nach LCD Array 3.5 C von Chipron (Primer MY09/11 und Mix 125) Hybridisierung nach PCR 20. HPV (L1-Region, Mit dem Chipron-Test werden folgende HPVTypen nachgewiesen: 6,11,16,18,31,33,35,39,42,44,45,51,52,53,54,56,5 8,59,61,62,66,67,68,70,72,73,81,82,83,84,90,91 Ca. 450 bp (MY09/11) Ca. 150 bp (GP5+/6+9 Primer MY09/11 und Primer GP5+/6+)). 04.13/rev. 11 Sequenzierung zur Differenzierung der verschiedenen HPV-Typen Auswert_PCR 1 Seite 3 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Auswertung PCR 21. HPV 16, 18 oder 33 1.Lauf: 307 bp (als nested PCR, E6 ORF) 2. Lauf: HPV 16: 124 bp HPV 18: 188 bp HPV 33: 145 bp 22. HPV Haut 480 bp L1 ORF, Consensus PCR für viele (ggf. Sequenzierung) Haut-HPV´s) 23. Hypermethylierung des MGMT-Promotors (Gliome) Methylierung und quantitative real-time-PCR (Promotor-Hypermethylierung der O6-Methylguanine-DNAMethyltransferase) 24. IDH1-Mutationen (Gliome) Cp sollte unter 40 liegen, Anteil der methylierten DNA sollte über 1% liegen. Sequenzierung (129 bp) (Codon 132, Chromosom 2) 25. JC-Virus Real-Time-PCR: (Large T-Antigen) Pos. bei Cp unter 40 26. Kaposi-Sarkome (HHV-8) (nested PCR für ORF26 des humanen Herpes-Virus 8) 1.Lauf (KS-1 u. KS-2): 233 bp 2. Lauf (WH-1 u. WH-2): ca. 180 bp 27. k-ras-Mutations-Nachweis 1. real-time-PCR (AMP) 1. Real-time-PCR: (Codon 12, 13 und 61 vom Exon 1 Pos. bei Cp zwischen 15 und 32 k-ras-Gen) 2. Nested PCR 2. Nested PCR: (Codon 12/13 von Exon 1 k-rasGen) 1. Lauf: 179 bp 2. Lauf: 114 bp Sense- und Antisense-Strang sequenzieren 28. Leishmania ssp. 116 bp (Nachweis konservierte Region der Minicircle kDNA) Sequenzierung 29. Listeria monocytogenes und Listeria sp. 04.13/rev. 11 Listeria-genus-spezifisches Gen; PCR und Hybridisierung auf einem Teststreifen (blau = pos.) Auswert_PCR 1 Seite 4 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Rezepturhandbuch Auswertung PCR 30. Mikrosatellitenanalyse (Screening HNPCC) Institut für Pathologie, Hannover Zentrum 1.Satz Primer: BAT26: 80 – 100 bp (Mononucleotid Repeat) BAT40 : 80 – 100 bp (Mononucleotid Repeat) MfD15 (D17S250): ca. 150 bp (DinucleotidRepeat) D2S123: 197 – 227 bp (Dinucleotid-repeat) APC: 96 – 122 bp (Dinucleotid-Repeat) 2. Satz Primer: Bat25: ca. 90 bp (Mononucleotid-Repeat) D10S197: 161 – 173 bp (Dinucleotid-Repeat) D18S58: 144 – 160 bp (Dinucleotid-Repeat) D18S69: ca. 110 bp (Dinucleotid-Repeat) MYCL1: 140 – 209 bp (Tetranucleotid-Repeat) - Amplifikate jeweils von „Normal“ (Blut- ) und Tumor- Probe gepaart vergleichen 31. Mykobakterien-Nachweis nach Chipron LCD MYCO-Direkt 1.7 a) Nachweis von M. tuberculosis-Komplex IS6110: 123 bp (Nachweise von M. tuberculosis b) Nachweis von M. genus komplex, atyp. Mykobakterien c) Nachweis von mittels Multiplex-PCR) M. avium/intracellulare (MAI) M. kansasii M. xenopi M. abscessus M. gordonae M. peregrinum M. szulgai M. haemophilum M. xenopi M. marium/ulcerans M. simiae M. smegmatis 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 5 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Auswertung PCR 32. Mykobakterien b) Nachweis von M. tuberculosis-Komplex IS6110: 123 bp (Nachweise von M. tuberculosis komplex und atyp. Evt. zusätzlich Sequenzierung bei Vorhandensein Mykobakterien) eines Amplifikates Hybridisierung nach PCR c) Multiplex-PCR für M. gordonae (221 bp), M kansasii (292 bp) und M. fortuitum (144 bp) = Set A d) Multiplex-PCR für M. avium (216 bp), M. malmoense (236 bp) und weitere atypische Mykobakterien (16 SrRNA) ( 147 bp) = Set B 33. Mykobakterien (65 kDa-Antigen) 1. Lauf: 310 oder 231 bp 2. Lauf: 133 bp - zum Nachweis der Mykobakterien-Art dient eine Restriktionsanalyse (siehe Anhang S. 5) 34. Mykobakterien BCG (Nachweis Spacer-Region 33-34 der Direct Repeat Region) 99bp + 172 bp: M. bovis BCG 99bp: M. bovis, M. africanum I Keine Bande: M. tuberculosis, M. africanum II 35. Oligodendrogliome (Nachweis on 1p- und 19qDeletionen) Primer: D1S468, D1S508, D1S489, D1S200, D1S514; D1S507, D1S199, D1S2734, D1S211, D1S2696: D19S210, D19S219, D19S596, D19S1182, D19S412, D19S572 36. Parvovirus B19 1. Lauf: 241 bp (NS1-Gen) 2. Lauf: 217 bp - zum Spezifitätsnachweis ggf. sequenzieren 37. SV-40 (Nachweis des der retinoblastoma (Rb-) pocket binding domain des SV-40Virus Sicher positiv bei Cp unter 40 (real-time-PCR) 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 6 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Auswertung PCR 38. „Nested PCR“ (Nachweis der Gamma-RezeptorFamilien V 1 - 11 nach Lorenzen et al. 1994): T-Lymphome (Gamma-Rezeptor) 1. Lauf: 260 bp 2.Lauf: Bande oder Schmier im Bereich von 120 bp „Mix PCR“ (Nachweis der Gamma-RezeptorFamilien V 2 – 5, V 8 – 9, V 10 – 12 nach Trainor et al. 1991): Bande oder Schmier im Bereich von 170 – 230 bp 28. 29. Toxoplasma gondii 162 bp (Nachweis eines multicopy genomic fragmentes [529 bp DNA repetitive Region]) - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Tropheryma whipplei Positiv bei Cp unter 40 (Nachweis Morbus whipple mittels real-time-PCR) 30. Yersinia enterocolitica (16 SrRNA) 210 bp - zum Spezifitätsnachweis sequenzieren Erläuterungen: Bei der Beschreibung „1. Lauf“ und „2. Lauf“ handelt es sich jeweils um eine nested PCR, wobei der „2. Lauf“ der auszuwertende ist. 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 7 von 8 Priv.- Doz. Dr. med. Radner, * Dr. med. Kupsch Dr. med. Schreiber, Dr. med. Beschow, Dr. med. Richter-Sadocco Auswertung PCR Institut für Pathologie, Hannover Zentrum Rezepturhandbuch Anhang Restriktionsanalyse für E. coli und Mykobakterien: Erstellt: Dr. K. Henneicke Geprüft: Dr. med. Schreiber Freigegeben: Dr. med. Schreiber Datum / Unterschrift Datum / Unterschrift Datum / Unterschrift 04.13/rev. 11 Auswert_PCR 1 Seite 8 von 8