Antibiotika

Versuch 18
Mittwoch
Melanie Thompson
C. B.
Gruppe 2
Mikrobiologisches und Genetisches Praktikum
Sommersemester 2006
Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main
Versuch 18: Antibiotika
Einleitung
Antibiotika sind von Mikroorganismen (Bakterien, Pilze) produzierte, chemische Substanzen,
die das Wachstum anderer Mikroorganismen einschränken oder diese sogar abtöten können.
Da Bakterien und Pilze häufig dieselben ökologischen Nischen besiedeln, dient die Bildung
von Antibiotika als Wettbewerbsvorteil gegenüber dem/den Konkurrenten.
Obwohl Antibiotika nachhaltige Eingriffe in den prokaryotischen Stoffwechsel vornehmen
können, haben sie nur selten einen nachhaltigen Einfluss auf den eukaryotischen
Stoffwechsel, da Antibiotika zumeist an Orten wirken, die Eukaryoten nicht, oder nicht in
gleicher Art und Weise besitzen (bspw. unterschiedliche ribosomale Untereinheiten bei
Eukaryoten/Prokaryoten), weshalb diese chemischen Verbindungen als Medikamente im
Kampf gegen Infektionen genutzt werden.
Antibiotika können unterschiedliche Wirkorte und damit verschiedene Auswirkungen auf den
prokaryotischen Organismus haben, dies sind z.B. Einwirkungen auf:

die Zellwandsynthese (Penicillin z.B.)

die Cytoplasmamembran (z.B. Polymyxine, Daptomycin)

die DNA-Synthese (z.B. Ciprofloxacin, Novobiocin)

die RNA-Elongation (z.B. Actinomycin)

die RNA-Polymerase (z.B. Rifampin, Streptovaracine)

die Proteinsynthese, darunter:
o Blockierung der Bindung der Aminoacyl-tRNA an die A-Stelle des Ribosoms
(Tetracyclin)
o Verhinderung des Übergangs vom Initiations- in den Elongationszustand des
Ribosoms, Verursachen von Fehlcodierungen (Streptomycin)
o Blockierung der Peptidyl-Transferase-Reaktion am Ribosom
(Chloramphenicol)
o Blockade der Translokationsreaktion am Ribosom (Erythromycin)
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Gruppe 2
o Blockieren der Initiation der RNA-Synthese durch Binden an RNAPolymerase (Rifamycin)

den Folsäure-Metabolismus (z.B. Trimethroprim, Sulfonamide)
Wobei die hier genannten Antibiotika, die Einwirkungen auf die Proteinsynthese haben
bakteriostatisch wirken, d.h. die Bakterien werden nicht abgetötet, sie wachsen nur nicht
weiter.
Wird die Zufuhr des Antibiotikums eingestellt, können die Bakterien ihr Wachstum wieder
aufnehmen.
Die Effektivität eines Antibiotikums hängt nicht zuletzt davon ab, in welchen
Konzentrationen es verabreicht wird, dabei unterscheidet man zwei Fälle:
o Die niedrigste Konzentration eines Antibiotikums in einer Verdünnungsreihe, die
gerade noch ausreicht um das Wachstum eines Mikroorganismus einzuschränken
bezeichnet man als MIC – minimum inhibitory concentration.
o Als MBC – minimum bactericidal concentration - bezeichnet man die niedrigste
Konzentration eines Antibiotikums in einer Verdünnungsreihe, die einen Organismus
gerade noch abtötet.
Natürlich versuchen Bakterien sich der Antibiotika zu erwehren, dies bspw. durch die
Übertragung von Resistenzgenen durch Transfektion oder Konjugation auf andere
Organismen der gleichen, aber auch einer anderen Art!
Resistenzen entstehen zunächst meist über spontane Mutationen in einem Organismus.
Diese Mutationen begünstigen bei Antibiotika-Gabe selektiv das Überleben/die Vermehrung
resistenter Stämme, die unter normalen Bedingungen nur eine kleine Sub-Population in einer
großen Masse von Mikroorganismen darstellen würden.
Gängige Resistenz-Mechanismen sind dabei:
o die Inaktivierung des Antibiotikums
o die verringerte Aufnahme des Antibiotikums
o Veränderung der Angriffs-Stelle des Antibiotikums im eigenen Organismus
o Einführung alternativer Stoffwechsel-Reaktionen auf das Antibiotikum.
Resistenzen stellen in der Medizin ein großes Problem dar, da sie sich unglaublich schnell
ausbreiten und einzelne Stämme sogar multiple-Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika
vorweisen können.
Die Wirkung von Antibiotika auf Mikroorganismen soll in den weiteren Versuchsteilen auf
verschiedenste Art untersucht werden.
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Gruppe 2
Versuchsteil 18A: Wirkungsspektrum
In diesem Versuchsteil soll die Wirkung von Antibiotika qualitativ bestimmt werden.
Das verwendete Antibiotikum ist Streptomycin, welches Anfang der 40er Jahre durch S.
Waksman entdeckt und als erstes wirksames Mittel gegen Tuberkulose eingesetzt wurde.
Streptomycin wird durch den Mikroorganismus Streptomyces griseus produziert, bindet an die
30S Untereinheit bakterieller Ribosomen und hemmt damit die Proteinsynthese.
Untersucht werden soll die unterschiedliche Wirkung von Streptomycin auf verschiedene
Mikroorganismen.
Material und Methoden
Siehe Skript.
Auswertung
Untersucht werden sollte die Wirkung von Streptomycin auf die Mikroorganismen:
o Escherichia coli
o Micrococcus luteus
o Bacillus subtilis
o Serratia marcescens
o Pseudomonas fluorescens
o Saccharomyces cerevisiae
Die Abstände vom Filterpapierstreifen bis zum nicht mehr gehemmten Bakterienrasen wurden
gemessen und auffällige Beobachtungen aufgeschrieben.
Der Abstand zwischen dem Filterpapier und dem verbleibenden farblos, trüben E. coli-Rasen
betrug 1cm.
Bei M. luteus betrug der Abstand vom Filterpapier bis zur nicht-gehemmten Kolonie 9mm,
wobei dieser Abstand in diesem Fall nicht leicht zu erkennen war, da zu viel BakterienMaterial ausgestrichen wurde und die gelbe Färbung von M. luteus das Erkennen des
gehemmten Bereiches nicht vereinfachte.
Der Abstand Filterpapierstreifen zu B. subtilis betrug 1cm, die Kolonie war und blieb farblos.
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Gruppe 2
Da der Ausstrich von S. marcescens bei dieser Gruppe (2) nur ungenau zu erkennen war,
diente die Versuchsdurchführung von Gruppe 5 als Beobachtungsgrundlade.
Bei S. marcescens konnte die interessante Beobachtung gemacht werden, dass die Kolonie im
Abstand von 9mm vollkommen gehemmt war, danach farblose Kolonien zu erkennen waren
und die ursprüngliche rosa/rot-Färbung der Kolonie erst wieder ab einem Abstand von 1,4cm
zu erkennen war.
Da Streptomycin ein bakteriostatisches Antibiotikum ist, welches seine Wirkung u.a. dadurch
entfaltet, dass es ein die ribosomalen Untereinheiten der Bakterien bindet, könnte die
Entfärbung der Kolonie darauf zurückzuführen sein, dass durch die Hemmung auch das
Pigment, welches für die Rotfärbung verantwortlich ist, nicht gebildet wird.
Da Bakterien jedoch nicht sterben, sondern nur im Wachstum gehemmt werden verlieren sie
ihre rote Farbe nach einiger Zeit aufgrund des gewöhnlichen zellulären Abbaus, es wird aber
kein neues Pigment nachgeliefert, die Kolonien sind damit farblos.
Der Abstand von P. fluorescens zum Filterpapierstreifen betrug 4mm, die Kolonie war und
blieb farblos.
Der Abstand vom S. cerevisiae – Rasen bis zum Filterpapierstreifen betrug 5mm.
Dies ist ein verwunderliches Ergebnis, da S. cerevisiae zu den Eukaryoten gehört, also
eigentlich andere ribosomale Untereinheiten aufweisen sollte, als die Prokaryoten deren
ribosomale Untereinheiten blockiert werden.
Entweder liegen hier also Mutanten von S. cerevisiae vor, die eine andere ribosomale
Untereinheit besitzen, die durch Streptomycin angegriffen wird, oder S. cerevisiae besitzt an
sich schon ribosomale Untereinheiten, die denen der Bakterien ähneln, wobei hier leider
nichts Näheres gefunden werden konnte.
Am wahrscheinlichsten bleibt jedoch, dass der Ausstrich trotz großer Sorgfalt nicht bis an den
Filterpapierstreifen heranreichte, womit kein durch Antibiotika-Diffusion gehemmter
Wachstumsbereich, sondern einfach nur ein nicht-bewachsener Bereich vorliegen würde.
Die Abstände der wachsenden Mikroorganismen zum Filterpapierstreifen zeigt, wie sensibel
sie auf das enthaltene Antibiotikum Streptomycin bzw. auf die Konzentration dieses
Antibiotikums reagieren.
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Gruppe 2
Mikroorganismen, die einen sehr geringen Abstand aufweisen (bspw. P. fluorescens) zeigen
eine höhere Toleranz gegenüber größeren Konzentrationen von Streptomycin, als
Mikroorganismen, die nur in sehr weitem Abstand zum Streptomycin-getränkten
Filterpapierstreifen wachsen können (bspw. B. subtilis, E. coli).
Da das Antibiotikum durch den Agar diffundiert kann davon ausgegangen werden, dass in
geringem Abstand zum Filterpapierstreifen eine höhere Konzentration herrscht als in
größerem Abstand.
Die größere Toleranz einzelner Mikroorganismen auf das verabreichte Streptomycin könnte
auf sich entwickelnde oder bereits bestehende Resistenzen zurückgeführt werden.
Diese Resistenzen würden bspw. Veränderungen der eigentlich betroffenen ribosomalen
Untereinheit betreffen, zu einer verminderten Aufnahme oder gar zur Inaktivierung des
Antibiotikums führen oder andere Stoffwechselreaktionen auf das Antibiotikum bedeuten.
Versuchsteil 18B: Konzentrationsabhängige Wirkung von Antibiotika
In diesem Versuchsteil soll die Wirkung von Antibiotika auf Mikroorganismen quantitativ
untersucht werden.
Die Wirkung von Antibiotika ist, wie schon erwähnt, konzentrationsabhängig, darum wird in
diesem Versuchsteil die Verdünnungsreihe einer Antibiotika-Stammlösung, enthaltend
2mg/ml Chloramphenicol, hergestellt.
Die vier verschiedenen Konzentrationen werden mit Hilfe von Filterpapierplättchen auf eine
Agar-Platte mit Micrococcus luteus ausgebracht und anhand der entstehenden Hemmhöfe,
deren Größe Konzentrationsabhängig ist, die Konzentration eines Antibiotikums unbekannter
Konzentration berechnet, welches ebenfalls ausplattiert wurde.
Material und Methoden
Siehe Skript.
Auswertung
Die vier Reagenzgläser C1-C4 enthielten zunächst 500l steriles Wasser.
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Gruppe 2
In Reagenzglas C1 wurden anschließend 500l der Antibiotika-Stammlösung gegeben und
die Probe gut durchgemischt.
Anschließend wurden 500l aus Reagenzglas C1 in C2 übertragen, dann 500l von C2 in C3
usw., sodass die Reagenzgläser ausgehend von der Antibiotika-Stammlösung folgende
Verdünnungen enthielten:
o C1: ½ (500l Stammlösung mit ca. 1mg bzw. 1000g Chloramphenicol)
o C2: ¼ (250l Stammlösung mit ca. 0,5mg bzw. 500g Chloramphenicol)
o C3: 1/8 (125l Stammlösung mit ca. 0,25mg bzw. 250g Chloramphenicol)
o C4: 1/16 (62,5l Stammlösung mit ca. 0,125mg bzw. 125g Chloramphenicol)
Es wurde ein Plättchen ausgelegt, welches zur Kontrolle nur Wasser enthielt.
Zwei Plättchen X1 und X2 enthielten zum einen die Antibiotikalösung unbekannter
Konzentration unverdünnt und 1:1 verdünnt.
Nachdem die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert wurden, waren am nächsten Tag deutliche
Hemmhöfe um die einzelnen Plättchen C1-C4 sowie X1 und X2 erkennbar, das Plättchen K
zeigte keinen Hemmhof auf, was anhand der Tatsache, dass das Plättchen K zur Kontrolle nur
Wasser enthielt zu erwarten war.
Die Hemmhöfe zeigten keine glatten Ränder, sondern je näher M. luteus dem Plättchen kam,
desto kleiner wurden die Kolonien, bis irgendwann kein Wachstum mehr stattfand.
Die Hemmhöfe zeigten schon optisch eine stete Verkleinerung auf, die durch anschließendes
Ausmessen der Zone vom Rand des Plättchens bis zur Zone beginnenden Wachstums von M.
luteus bestätigt werden konnte.
Nach Ausmessen der einzelnen Hemmhöfe konnte folgende Tabelle erstellt werden:
lnc [g/ml]
x2 [mm2]
c [g/ml]
x [mm]
C1
6,908
64
1000
8mm
C2
6,251
16
500
4mm
C3
5,521
4
250
2mm
C4
4,828
1
125
1mm
X1
5,68
16
292,95
4mm
X2
5,264
4
193,25
2mm
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Gruppe 2
Da der Versuch unter konstanten Bedingungen durchgeführt wurde, ist das Quadrat der
Hemmzone (x2) dem Logarithmus der Antibiotikakonzentration im Plättchen direkt
proportional.
Wird die Antibiotikakonzentration variiert, kann anschließend x2 (y-Achse) in Abhängigkeit
von ln c0 (x-Achse) aufgetragen werden:
70
60
50
x
2
40
30
20
10
0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
ln c0
Resultat ist eine Gerade, die die x-Achse bei ln cx schneidet, in diesem Fall also 5,14.
Nun kann man anhand dieses Wertes die Antibiotika-Konzentration berechnen, die
mindestens notwendig ist um den Testorganismus am wachsen zu hindern:
ln ck  eck  e5,14  170,72  ck
Damit beträgt die Antibiotika-Konzentration, die mindestens benötigt wird um den
Testorganismus am wachsen zu hindern 170,72g Chloramphenicol in 1ml bzw.
0,170mg/ml.
Versuchsteil 18C: Identifizierung von Antibiotikaproduzenten
Im letzten Versuchsteil soll die Sensibilität von Mikroorganismen auf Antibiotika ausgenutzt
werden, um Antibiotika-produzierende Mikroorganismen zu identifizieren.
Es werden drei Bacillus subtilis-Wildtypstämme auf ihre Fähigkeit untersucht, antibiotisch
wirksame Substanzen zu bilden und damit das Wachstum anderer Mikroorganismen, in
diesem Fall des Testorganismus Micrococcus luteus, zu inhibieren.
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Material und Methoden
Siehe Skript.
Auswertung
Auf eine M. luteus beinhaltende Agar-Platte wurden die drei B. subtilis-Stämme DSMZ 347,
DSMZ 402 und DSMZ 2277 ausgestrichen.
Am darauf folgenden Kurstag war eine Hemmhof-Bildung um alle drei B. subtilis-Stämme zu
erkennen, was darauf schließen lässt, dass alle drei ausgestrichenen Stämme antibiotisch
wirksame Substanzen produzieren, auf die M. luteus unterschiedlich empfindlich reagiert, was
sich anhand der Beobachtungen ausmachen lässt:
Der milchig-weiß erscheinende B. subtilis-Stamm DSMZ 347 zeigt den ausgeprägtesten
Hemmhof, einen durchschnittlich 3mm breiten Rand komplett um die B. subtilis-Kolonie
herum.
Der Rand ist fransig und eindeutig abgegrenzt, was darauf schließen lässt, dass das hier
produzierte Antibiotikum auch in geringer Dosis äußerst toxisch auf M. luteus wirkt und
letzterer damit nur in einem Abstand wachsen kann, in dem kein Antibiotikum mehr zu finden
ist.
Der zweite milchig-weiße B. subtilis-Stamm DSMZ 402 zeigt einen durchschnittlich 2mm
breiten Hemmhof, der jedoch nicht ganz eindeutig abgegrenzt ist, sich kleine M. luteusKolonien also dem Hemmhof bzw. dem fransigen Rand des B. subtilis-Stamm nähern.
Dies lässt darauf schließen, dass das hier produzierte Antibiotikum nur in hoher Dosis, also
direkt am Ursprungsort der B. subtilis-Kolonie toxisch auf M. luteus wirkt, in größerer
Entfernung, also nach einer weiteren Diffusionsstrecke bei Vermindern der Konzentration
eingeschränktes Wachstum also wieder möglich ist.
Der dritte B. subtilis-Stamm DSMZ 2277 weißt eine orange/lachsfarbene Färbung und, im
Gegensatz zu den beiden anderen Stämmen, einen glatten Kolonie-Rand auf.
Auch um diesen Stamm hat es eine Hemmhof-Bildung gegeben, doch ist diese an den
breitesten Stellen höchstens 1mm breit und liegt durchschnittlich eher unter dieser Breite.
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Gruppe 2
Damit ist das hier produzierte Antibiotikum als sehr schwach anzusehen und befähigt B.
subtilis gerade dazu, sich einen minimalen Bereich abzustecken.
Das Antibiotikum entfaltet seine Wirkung also nur direkt in bzw. um die Kolonie, ist aber so
schwach konzentriert, dass es gerade diesen 1mm diffundieren kann und dann keinerlei
wachstumsbegrenzende Wirkung auf M. luteus mehr ausübt.
Literaturhinweis

Praktikumsskript Mikrobiologisches und Genetisches Praktikum der Johann Wolfgang
Goethe-Universität Frankfurt a. M., Sommersemester 2006

Michael T. Madigan, John M. Martinko, Brock – Biology of Microorganisms, 11.
Auflage, Pearson Prentice Hall, United States of America, 2006

Bruce Alberts, Dennis Bray, Karen Hopkin, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin
Raff, Keith Roberts, Peter Walter, Lehrbuch der Molekularen Zellbiologie, 3. Auflage,
Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 2005

Neil A. Campbell, Jane B. Reece, Biologie, 6. Auflage, Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg – Berlin, 2003