Wann und wie?

ZIELGERICHTETE MOLEKULARE DIAGNOSTIK
Wann und wie?
Es gibt prädiktive, prognostische und diagnostische Indikationen für
molekularpathologische Tests, die für jede Tumorentität und deren histologische
Subtypen in den Kontext der klinischen Daten gestellt werden müssen.
m Zuge der individualisierten, zielgerichteten
onkologischen Therapie hat die Molekularpathologie („companion diagnostics“) rasant an Bedeutung gewonnen (1–3). Hierbei werden therapeutisch beeinflussbare Zielstrukturen und/oder mögliche Resistenzfaktoren in Tumorzellen bestimmt.
Die Voraussetzungen und Besonderheiten der Molekularpathologie sind:
● Indikationsstellung unter Berücksichtigung der
histopathologischen Klassifikation,
● Auswahl des geeigneten Tumorareals,
● Auswahl des geeigneten Nachweisverfahrens,
● morphologisch-kontrollierte Präparation für die
molekularpathologischen Tests und
● Befundung und Interpretation der molekularpathologischen Ergebnisse in Synopse mit klinisch-pathologischen Daten und Integration einer Therapieempfehlung.
Prädiktive molekularpathologische Tests sind
vor allem für epitheliale Neoplasien etabliert und
nehmen im Zuge der individualisierten, zielgerichteten onkologischen Therapie einen immer größeren Stellenwert in der klinischen Pathologie ein.
Prognostische molekularpathologische Tests
sind ebenfalls vor allem für epitheliale Neoplasien
bedeutsam. Einige Entitäten wie kolorektale Karzi-
I
TABELLE 1
Ausgewählte Methoden der Molekularpathologie
8
Veränderung
Methoden
Dauer
Expression, Expressionsausfall, Überexpression
Semi-quantitative Immunhistochemie (IHC)
1 Tag
Translokation
In-situ-Hybridisierung
2–4
● Chromogene in-situ-Hybridisierung (CISH) Tage
● Fluoreszenz in-situ-Hybridisierung (FISH)
nome oder jüngst Magenkarzinome werden aufgrund spezifischer Genveränderungen in sogenannte molekulare Subgruppen unterteilt (4), die prognostisch wichtig sind. Bei den kolorektalen Karzinomen ist zusätzlich zur morphologischen Graduierung bei bestimmten Konstellationen ein molekulares Grading über die molekularpathologische Untersuchung der Mikrosatelliten zur Abschätzung
der Prognose nach der aktuellen S3-Leitlinie notwendig.
Diagnostische molekularpathologische Tests,
die spezifische molekulare Merkmale von Tumorentitäten messen, sind zur Klassifikation von mesenchymalen und hämatologischen Neoplasien inzwischen zentraler Bestandteil der pathologischen
Diagnostik.
Alle molekularpathologischen Tests sind am
Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebe
(Standard Gewebe Prozessierung in der klinischen
Pathologie) des Patienten möglich. Einschränkend
kann durch die zunehmend minimalinvasiven Techniken allein die verfügbare Gewebemenge sein.
Die Untersuchung zirkulierender Tumorzellen beziehungsweise zellfreier DNA im Rahmen einer
„Flüssigbiopsie“ (liquid biopsy) kann dies gegebenenfalls zukünftig unterstützen. Eine zuverlässige
Aussage ist hierbei aber nur in Zusammenschau mit
morphologisch basierten molekularpathologischen
Tests gesichert (5).
Im Folgenden werden die prädiktiven molekularpathologischen Tests für ausgewählte Neoplasien besprochen:
Lungenkarzinome
Punktmutationen,
Sequenzierung
komplexe Mutationen,
● Sanger Sequenzierung
einzelne Gene,
● targeted Next Generation Sequencing
Gen Panels, große Gene
(tNGS)
ohne feste Hotspots
5–7
Tage
einzelne Mutationen,
Hotspots
Polymerase Chain Reaction
● PCR
● digitale PCR
1 Tag
Mikrosatelliteninstabilität
Mikrosatelliten-(MSI-)Analyse
5–7
Tage
In der IPASS-Studie wurde gezeigt, dass Adenokarzinome der Lunge mit aktivierenden Mutationen in
EGFR (membranständige Rezeptorproteinkinase)
ein deutlich besseres Ansprechen gegenüber einer
Therapie mit spezifischen Tyrosinkinaseinhibitoren
(zum Beispiel Gefitinib) zeigen als gegenüber der
bis dato Standardchemotherapie. Seither wird die
EGFR-Mutationsanalyse von allen primär Chemotherapie bedürftigen Patienten in der Biopsie diagnostizierten nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen beziehungsweise am Operationspräparat diagnostizierten nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen
mit adenoider Differenzierungskomponente empfohlen (6–9).
Perspektiven der Onkologie 1/2016 | Deutsches Ärzteblatt
Zahlreiche zusätzliche potenzielle therapeutische Zielstrukturen sind mittlerweile beschrieben
worden: Gentranslokationen in ALK, ROS1 und
RET, die für ein gutes Ansprechen gegenüber einer
Therapie mit einem ALK/MET/ROS1-Inhibitor
(zum Beispiel Crizotinib) sprechen; aktivierende
Mutationen in ERBB2 („HER2“), die in prä-/klinischen Studien prädiktiv für eine Therapie mit
ERBB2-Inhibitoren sind; sowie Mutationen in
GRAFIK
Workflow pathologische Diagnostik bei Lungenkarzinomen
BRAF, die laut Einzelfallberichten sensitivierend
für ein Ansprechen auf BRAF-Inhibitoren (zum
Beispiel Vemurafenib) sind (10).
Für KRAS- und bestimmte EGFR-Mutationen
(zum Beispiel T790M) ist ein schlechtes Ansprechen gegenüber EGFR-Inhibitoren beschrieben.
Gerade die T790M-Mutation tritt häufig als sogenannte Resistenzmutation unter Therapie mit
EGFR-Inhibitoren auf. Die molekularpathologische
Untersuchung von aktuellem Tumorgewebe (zum
Beispiel aus neu aufgetretenen Metastasen oder gegebenenfalls auch aus einer „liquid biopsy“) sollte
daher im Vordergrund stehen. Die oben genannten
Genveränderungen der einzelnen Zielstrukturen
treten je nach histologischem Subtyp des Lungenkarzinoms in unterschiedlicher Häufigkeit auf (Tabelle 2).
Auch gibt es Hinweise, dass die Expression von
PDL1 (programmed cell death protein-1) auf den
Tumorzellen mit einem über Immunzellen vermittelten Ansprechen auf PD-1 gerichtete Inhibitoren
korreliert (11).
Eines der neuesten therapierbaren Veränderungen in Lungenkarzinomen sind die MET-Exon14-Mutationen in Adenokarzinomen, die in einer
aktuellen Studie sehr gut auf MET-Inhibitoren angesprochen haben (12).
Adenokarzinome von Magen und
gastroösophagealem Übergang
Workflow der prädiktiven molekularpathologischen Tests
am Beispiel des Lungenkarzinoms Aus Formalin-fixiertem, in
Paraffin-eingebettetem (FFPE-)Gewebe werden Serienschnitte
(Anzahl variiert nach Gewebemenge) für die molekularpathologischen Tests angefertigt. Die Analysen beinhalten die Histologie
zur Sicherung der Diagnose (H&E-Färbung) inklusive des histologischen Subtyps (Immunhistochemie; IHC), ggf. der PDL1-Expression (IHC), die In-situ-Hybridisierungen (CISH/FISH) für die Analyse
von Translokationen sowie die Sequenzierung mittels tNGS für die
Analyse eines Gen Panels (modifiziert nach 1.)
10
Durch die europäische Arzneimittelbehörde
(EMA) ist auf der Basis der TOGA-Studiendaten
Trastuzumab für die Therapie des metastasierten
Adenokarzinoms des Magens und des ösophagogastralen Übergangs zugelassen. Voraussetzung ist
der Nachweis einer HER2-Überexpression mittels immunhistochemischer Färbungen beziehungsweise bei indifferentem Testergebnis der
Nachweis einer HER2-Amplifikation über In-situHybridisierung (ISH) – entweder mittels Chromogen (CISH) oder mittels Fluoreszenz (FISH). Für
die Beurteilung der immunhistochemischen Färbergebnisse von HER2 im Magen ist ein eigenes
Scoring-System etabliert. Ein positives Testergebnis ist in etwa 20 Prozent der Magenkarzinome zu
erwarten, wobei vor allem die besser differenzierten beziehungsweise die des intestinalen Subtyps
(31,8 versus 6,1 Prozent beim diffusen Subtyp) positiv sind. Ein positives HER2-Testergebnis (entsprechend einem Score 3 nach Rüschoff et al.)
oder der Nachweis einer HER2-Amplifikation ist
prädiktiv für ein gutes Ansprechen auf Trastuzumab.
Auch in Magenkarzinomen wurden mittlerweile
zahlreiche Studien zu potenziellen weiteren neuen
Zielstrukturen veröffentlicht. Einige Zielstrukturen
wie zum Beispiel FGFR2 werden bereits in klinischen Studien untersucht. Die Voraussetzung für eine gegen FGFR2-gerichtete Therapie mit einem Tyrosinkinaseinhibitor ist der molekularpathologische
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TABELLE 2
Zielstrukturen prädiktiver molekularpathologischer Test-ausgewählter* Entitäten
Entität
Gen/Protein/ Veränderung(en)
Test
Medikament(e)/ Bemerkung
Nicht-kleinzellige Lungenkarzinome (NSCLC)
Adenokarzinom***
EGFR
KRAS
ALK
ROS
RET
MET
Punktmutationen und komplexe Mutationen
Punktmutationen
Translokation
Translokation
Translokation
Amplifikation und Mutation
FGFR1
ERBB2
Amplifikation
Punktmutation
BRAF
Punktmutation
EGFR
KRAS
ALK
MET
FGFR1
Punktmutationen und komplexe Mutationen
Punktmutationen
Translokation
Amplifikation
Amplifikation
TKI (z. B. Erlotinib, Gefitinib, Afatinib)
TKI (z. B. Erlotinib, Gefitinib, Afatinib)
ALK/MET/ROS1 Inhibitor (z. B. Crizotinib)
ALK/MET/ROS1 Inhibitor (z. B. Crizotinib)
TKI (z. B. Nintedanib; Phase-III-Studien)
Adenokarzinom des
gastroösophagealen Übergangs/
Magens
HER2
FGFR2
Überexpression oder Amplifikation
Amplifikation
MAK gegen HER2 (z. B. Trastuzumab)
TKI (z. B. Dovitinib; Phase-II-Studie erfolgreich)
Kolorektales Karzinom
KRAS
NRAS
BRAF
MMRProteine
MSI
PIK3CA
Punktmutationen
Punktmutationen
Punktmutationen
Expressionsausfall
MAK gegen EGFR (z. B. Cetuximab, Panitumumab)
MAK gegen EGFR (z. B. Cetuximab, Panitumumab)
Prognostisch
PD-1 Inhibitioren (z. B. Pembrolizumab); Molekulares Grading (siehe oben).
ASS
KIT
PDGFRA
Punktmutationen und komplexe Mutationen
Punktmutationen
TKI (z. B. Imatinib)
TKI (z. B. Imatinib)
HR
Mib-1/Ki67
HER2
PIK3CA
Expression
Expression
Überexpression oder Amplifikation
Punktmutationen
PTEN
Expression
CDK4
Genexpressionstests
Amplifikation
*****
Antihormonelle Therapie
Prognostisch
MAK gegen HER2 (z. B. Trastuzumab)
PIK3CA Inhibitoren (z. B. GDC-0032, BYL719,
GSK2636771)
Expressionsverlust unterstützend für PIK3CA Inhibitoren bei Nachweis einer aktivierenden Mutation in
PIK3CA
CDK4/6 Inhibitoren (z. B. Palbociclib, Aabemaciclib)
Unterstützend für Indikation zur Chemotherapie
Plattenepithelkarzinom
TKI**** (z. B. Erlotinib, Gefitinib, Afatinib)
TKI (z. B. Erlotinib, Gefitinib, Afatinib)
ALK/MET/ROS1 Inhibitor (z. B. Crizotinib)
ALK/MET/ROS1 Inhibitor (z. B. Crizotinib)
MET/RET Inhibitor (z .B. Cabozantinib)
ALK/MET/ROS1 Inhibitor (z. B. Crizotinib)
MET/RET Inhibitor (z. B. Crizotinib, Cabozantinib);
klinische Studie erfolgreich)
TKI (z. B. Nintedanib; Phase-III-Studien erfolgreich)
ERBB2 Inhibitoren (z. B. Lapatinib; präklinische
Studien erfolgreich)
MAK gegen BRAF (z. B. Vemurafenib; in Einzelfallberichten erfolgreich)
Gastrointestinale Tumoren
Gastrointestinaler Stromatumor
(GIST)
Instabilität
Punktmutationen
Gynäkologische Tumoren
Mammakarzinom
High grade seröses Ovarialkarzinom TP53
BRCA1
BRCA2
Punktmutationen
Punktmutationen und komplexe Mutationen
Punktmutationen und komplexe Mutationen
Diagnostisch und prognostisch
PARP Inhibitoren (z. B. Olaparib)
PARP Inhibitoren (z. B. Olaparib)
Melanom
Punktmutationen
Punktmutationen
Punktmutationen
Punktmutationen
Punktmutationen
MAK gegen BRAF (z. B. Vemurafenib)
MEK Inhibitoren (in präklinischen Studien)
KIT Inhibitoren (z. B. Imatinib)
Prognostisch
Prognostisch
BRAF
NRAS
KIT
GNAS
GNAQ
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11
Nachweis einer FGFR2-Amplifikation im Tumorgewebe, die in etwa acht Prozent der Magenkarzinome zu erwarten ist.
Kolorektale Karzinome
Seit der PRIME- und FIRE3-Studie ist laut
S3-Leitlinie bei metastasierten kolorektalen Karzinomen der Nachweis eines Wildtyps in „Pan-RAS“
– aktuell definiert als KRAS Exons 2, 3, 4 und
NRAS Exons 2, 3, 4 – Voraussetzung für eine Therapie mit EGFR-gerichteten Antikörpern (zum Beispiel Cetuximab, Panitumumab). Der Nachweis einer Mikrosatellitenstabilität ist ein positiver Prädiktor für das Ansprechen gegenüber einer Monotherapie mit 5-Fluoruracil (5-FU), nicht jedoch für
Kombinationstherapien. Zudem scheint eine Mikrosatelliteninstabilität auch mit einem Ansprechen
auf die gegen PD-1 gerichtete Therapie mit dem
Immuncheckpoint-Inhibitor Pembrolizumab verbunden zu sein (14).
Bereits 2012 zeigten Liao X und Kollegen, dass
der Nachweis einer PIK3CA-Mutation prädiktiv für
die adjuvante Therapie mit Acetylsalicylsäure ist
(13).
bei EGFR („Hotspot“ Exons 18–21) – über die gesamte Nukleinsäurensequenz, so dass insgesamt 51
Exone sequenziert werden müssen. Dies kann nur
durch die Technik der massiven Parallelsequenzierung (Next Generation Sequencing) effizient gewährleistet werden.
Fazit
● Es gibt prädiktive, prognostische und diagnos-
●
Mammakarzinome
Nach der aktuellen S3-Leitlinie sollen bereits an
der Stanzbiopsie die Hormonrezeptoren und der
HER2-Status bestimmt werden. Die Proteinexpression von Östrogen- und Progesteronrezeptoren
wird mittels semi-quantitativer Immunhistochemie
bestimmt und ist prädiktiv für eine antihormonelle
Therapie. Die Bestimmung von HER2 mittels immunhistochemischer Färbungen ist die Voraussetzung für die Gabe gegen HER2 gerichtete Antikörper (zum Beispiel Trastuzumab). Bei indifferentem
Testergebnis (entsprechend einem Score 2) wird
zur weiteren Absicherung eine zusätzliche In-situHybridisierung durchgeführt.
Das Scoring für HER2 ist in Mammakarzinomen
dabei unterschiedlich zu oben genannten Untersuchungen beim Magenkarzinom. In zahlreichen klinischen Studien werden weitere zielgerichtete Therapien evaluiert. Hierbei scheinen gegen PIK3CA
gerichtete Antikörper vielversprechend zu sein und
können bei Aktivierung des PIK3CA-AKT-mTorSignalwegs im Rahmen individueller Heilversuche
beantragt werden. Eine Aktivierung des PIK3CAAKT-mTor-Signalwegs liegt bei spezifischer
PIK3CA-Mutation – idealerweise in Kombination
mit einem Expressionsverlust von PTEN – vor
(15).
●
●
●
tische Indikationen für molekularpathologische
Tests, die für jede Tumorentität beziehungsweise
deren histologischen Subtypen spezifisch für den
individuellen Patienten in Kontext der klinischpathologischen Daten gestellt werden müssen.
Klar ist, dass die zielgerichtete molekulare Diagnostik in der klinischen Pathologie damit einen
entscheidenden Beitrag zur Krankenversorgung
des individuellen Patienten leistet.
Aufgabe der Pathologie in der interdisziplinären
onkologischen Krankenversorgung ist es, die je
nach Tumorentität relevanten Zielstrukturen (Tabelle 2) mit den geeigneten, qualitätsgesicherten
Methoden (Tabelle 1) zu untersuchen, die Ergebnisse unter Berücksichtigung der aktuellen Literatur und Studiendaten in einem strukturierten
Befundbericht kritisch in Zusammenschau mit
klinisch-pathologischen Daten zu kommunizieren und im Falle eines prädiktiven Tests eine
Therapieempfehlung abzuleiten.
Eine Herausforderung dabei ist die sich rasant
entwickelnde Publikations- und Studienlandschaft, aus der die klinisch relevante und umsetzbare Datenlage bestimmt werden muss.
Die enge Kooperation und der stete interdisziplinäre Austausch zwischen Pathologen und Klinikern fördert dabei die zielführende, individualisierte, medizinisch notwendige und kosteneffiziente prädiktive Pathologie und onkologische
Behandlung.
Ferner können als Schnittstelle zwischen Forschung, klinischen Studien und klinischer Anwendung molekulare Tumorboards unterstützen,
indem sie die diversen wissenschaftlichen Erkenntnisse kritisch und patientenbezogen bewerten und daraus eine Empfehlung zu individuellen
Heilversuchen oder Studienteilnahmen erarbei▄
ten.
DOI: 10.3238/PersOnko/2016.02.12.02
Dr. med. Lisa Lutz
Dr. rer. nat. Britta Weddeling
Prof. Dr. med. Silke Lassmann
Prof. Dr. med. Martin Werner
Institut für Klinische Pathologie
Universitätsklinikum Freiburg
Ovarialkarzinome
Poly-ADP-Ribose-Polymerase-(PARP-)Inhibitoren
sind seit 2015 als Monotherapie bei Platin-sensitiven Rezidiven eines high grade serösen Ovarialkarzinoms bei Nachweis einer pathogenen BRCA1oder BRCA2-Mutation zugelassen. Die Mutationen
in BRCA1 und BRCA2 verteilen sich – anders als
12
Interessenkonflikt: Die Autorin Lutz hat keine Interessenkonflikte.
@
Literatur im Internet:
www.aerzteblatt.de/lit0616
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Wann und wie?
Es gibt prädiktive, prognostische und diagnostische Indikationen für
molekularpathologische Tests, die für jede Tumorentität und deren histologische Subtypen in
den Kontext der klinischen Daten gestellt werden müssen.
LITERATUR
1. Lassmann S, et al.: Predictive Pathology on routine diagnostics
of solid tumors. Histol Histopathol 2012; 3: 289–96.
2. Masters GA, et al.: Clinical cancer advances 2015: Annual report
on progress against cancer from the American Society of Clinical
Oncology.
3. Gagan J, et al.: Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome Med 2015; 7: 80.
4. Cristescu R, et al.: Molecular analysis of gastric cancer identifies
subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med
2015; 21: 449–56.
5. Dahl E, Lassmann S, et al.: Chancen und Risiken der blutbasierten molekularpathologischen Analytik zirkulierender Tumorzellen
(CTC) und zellfreier DNA (cfDNA) in der personalisierten Krebstherapie. Der Pathologe 2015, 1: 92–7.
6. Leighl NB, et al.: Molecular testing for selection of patients with
lung cancer for epidermal growth factor receptor and anaplastic
lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitors: American Society of
Clinical Oncology endorsement of the College of American Pathologists/International Association for the study of lung cancer/
association for molecular pathology guideline. J Clin Oncol
2014; 32: 3673–9.
7. Rekhtman N, et al.: Molecular testing for selection of patients
with lung cancer for epidermal growth factor receptor and anaplastic lymphoma kinase tyrosine kinase inhibitors: american society of clinical oncology endorsement of the college of american
pathologists/international association for the study of lung cancer/association for molecular pathology guideline. J Oncol Pract
2015; 11: 135–6.
8. Lindeman NI, et al.: Molecular testing guideline for selection of
lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors:
guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for
Molecular Pathology. J Mol Diagn 2013; 15: 415–53.
9. Wiliam D. Travis, et al.: WHO Classification of Tumours of the
th
Lung, Pleura, Thymus and Heart (4 edition). IARC: Lyon 2015.
10. Hyman DM, et al.: Vemurafenib in Multiple Nonmelanoma Cancers with BRAF V600 Mutations. N Engl J Med 2015; 373:
726–36.
11. Topalian SL, et al.: Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 2012; 366: 2443–54.
12. Paik PK, et al.. Response to MET Inhibitors in Patients with Stage
IV Lung Adenocarcinomas Harboring MET Mutations Causing
Exon 14 Skipping. Cancer Discov 2015; 5: 842–9.
13. Liao X, et al.: Aspirin use, tumor PIK3CA mutation, and colorectal-cancer survival. N Engl J Med 2012; 367: 1596–606.
14. Le DT, et al.: PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair
Deficiency. N Engl J Med 2015; 372: 2509–20.
15. Fadoukhair Z, et al.. Evaluation of targeted therapies in advanced
breast cancer: the need for large-scale molecular screening and
transformative clinical trial designs. Oncogene advance online
publication 29 June 2015.
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