Das Alkaloid Thienodolin wurde 1993 von Kanbe et al

Abschlussbericht zum Max-Buchner-Forschungsstiftungs-Stipendium zum Thema
„Untersuchungen zur Biosynthese des Pflanzenwachstumsregulators Thienodolin aus
Streptomyces albogriseolus MJ286-76F7“ (FKZ 2790)
Das Alkaloid Thienodolin wurde 1993 von Kanbe et al. aus Streptomyces albogriseolus
MJ286-76F7 in einem Screening nach das Pflanzenwachstum stimulierenden Metaboliten
isoliert (Kanbe et al., 1993a). Die Aufklärung der Struktur mittels spektroskopischer und
Röntgenstrukturanalyse ergab, dass es sich um 6-Chlor-8H-thien[2,3-b]indol-2-carboxamid
(Abb. 1) handelt (Kanbe et al. 1993b). Engqvist et al. (2004) publizierten die Synthese von
Thienodolin, dessen in der 5-Position chlorierten und des unchlorierten Analogons ausgehend
von den entsprechenden Oxindolen in drei Schritten.
Cl
N
H
S
C
O
NH2
Thienodolin
N
H
C OH
N HC
H2 O
Tryptophan
Abb. 1: Chemische Strukturen von Thienodolin und des postulierten Vorläufermoleküls
Tryptophan
Im Gegensatz zur chemischen Synthese lagen zu Beginn unsere Arbeiten keine Daten über die
Biosynthese von Thienodolin vor. Allerdings legt die chemische Struktur des Moleküls
Tryptophan als Vorläufermolekül nahe.
Ausgangspunk für unsere Arbeiten war die Klonierung eines Tryptophan-6-Halogenasegens
aus dem Thienodolin-Produzenten, das auf einem 4,5 kb großen Plasmid isoliert werden
konnte (Seibold et al., 2006). Dieses Gen diente als Sonde für das Screening einer
Cosmidgenbank des Thienodolin-Produzenten. Aus dieser Cosmidgenbank konnten einige
Cosmid-Klone isoliert werden, die das Halogenasegen enthielten. Die Sequenzierung der zum
Halogenasegen benachbarten DNA-Sequenzen führte zur Identifizierung des potentiellen
Biosynthesegen-Clusters für Thienodolin. Dieses Cluster besteht nach unseren Daten aus den
Genen
für
folgende
Enzyme:
Methylthioadenine-Synthetase,
Amidotransferase,
Dehydrogenase/Reductase
Cytochrom-P450-Enzym,
kurzkettiger
Säuren,
2-
FAD-
abhängige Oxidase, Tryptophan-6-Halogenase, Flavin-Reduktase, Aminotransferase und für
zwei Enzyme mit unbekannter Funktion (Abb. 2). Aufbauend auf diesen Ergebnissen konnte
die Funktion einzelnen Enzyme in der Thienodolin-Biosynthese analysiert werden.
K
0k
b
1k
b
L
2k
b
X
3k
b
D
4k
b
B
5k
b
C
6k
b
M E
7k
b
8k
b
Y
9k
b
O
10k
b
thiK – Zwei-Komponenten-System Sensor Kinase
thiL – Zwei Komponenten-System Responseregulator
thiX – unbekannteFunktion
thiD – Amidotransferase
thiB – DNA-Bindeprotein
thiC – Cytochrom P-450
thiM – 2-Methylthioadenine-Synthetase
thiE – Short-chain Dehydrogenase/Reduktase
H
11k
b
12k
b
F
N
13k
b
14k
b
A
15k
b
R
16k
b
17k
b
thiY – unbekannte Funktion
thiO – FAD-abhängige Oxidase
thiH – Tryptophan 6-Halogenase
thiF – Flavin-Reduktase
thiN – Aminotransferase
thiA – Ionen Antiporter
thiR – transkriptionaler Regulator
Abb. 2: Vorschlag für das Thienodolin-Biosynthesgen-Cluster
Hierfür wurden einzelnen Gene nach dem in Abb. 2 gezeigten Prinzip durch Einbringen einer
Antibiotikaresistenz-Kassette inaktiviert, ohne dass dabei die Funktion benachbarter Gene
betroffen ist. Nach Einbringen der Plasmide mit dem zerstörten Gen in den ThienodolinProduzenten wurde die Integration in das Genom erzwungen, wodurch es zu einem „single
cross-over“ oder zu dem erwünschten „double cross-over“ kam.
tsr
Chromosom
1
2
13
33
33
1
1
3
Vektor mit Thiostreptonresistenz
und durch die Apramycin-Kassette
zerstörtem Gen
15
apra
2
1
4
1
5
1
6
1
7
Chromosom
12
13
apra
15
16
17
Tsrs apraR
Abb. 2: Prinzip der Zerstörung der einzelnen Gene zur Analyse ihrer Funktion in der
Thienodolin-Biosynthese.
Begonnen wurden diese Untersuchungen mit dem Gen für die Amidotransferase, von der
vermutet wurde, dass sie den letzten Schritt in der Biosynthese katalysiert. Die Extrakte des
Kulturmediums und der Zellen der erhaltenen „double cross-over“ Klone wurden mittels
HPLC, HPLC-UV und HPLC-MS untersucht und mit denen des Wildtyp-Stamms verglichen.
Dabei zeigte es sich, dass diese Klone kein Thienodolin mehr bildeten. Dafür konnte ein
neuer Peak in den HPLC-Chromatogrammen detektiert werden (Abb. 3), dessen UVSpektrum Ähnlichkeiten zum UV-Spektrum von Thienodolin zeigte (Abb. 4).
Abb. 3: HPLC-Chromatogramm des Extrakts der Kulturmedien des ThieneodolinProduzenten (blau) und der Mutante mit dem zerstörten Amidotransferasegen (rot).
Abb. 4: UV-Spektren von Thienodolin (oben) und des von dem Klons mit dem zerstörten
Amidotransferasegen akkumulierten Metaboliten (unten).
Anhand von HPLC-MS- und 1HNMR-Daten konnte der neu auftretende Metabolit als
Thienodolinsäure (Abb. 4) identifiziert werden. Dies konnte durch chemische Synthese
bestätigt werden.
HO
9
3
4
5
3b
2
3a
8a
Cl
6
7
7a
O
S1
N8
H
Abb. 4: Struktur der Thienodolinsäure, die von der Mutante mit dem inaktivierten
Amidotransferasegen akkumuliert wird.
Es gelang, Thienodolinsäure chemisch zu synthetisierte und in vivo durch einen
Pseudomonas-Stamm der das klonierte Amidotransferasegen exprimiert, zu Thienodlolin
umzusetzen.
Die Umsetzung der Thienodolinsäure zu Thienodolin in vitro gelang auch in zellfreien
Extrakten des rekombinanten Pseudomonas-Stamms, wenn den Extrakten ATP und Glutamin
zugesetzt wurde, wobei Glutamin auch durch Ammoniumionen ersetzt werden konnte (Abb.
5).
Cl
N
H
Gln + ATP
Glu + ADP + Pi
NH2
a)
C C COOH
H
H2
b)
Cl
+
NH4+ + ATP
ADP + Pi+ H
NH2
C C CONH2
H2 H
N
H
Abb. 5: Umsetzung von Thienodolinsäure zu Thienodolin durch die Amidotransferase ThiD
mit Glutamin als Amminogruppendonor (a) oder Ammoniumionen als Aminogruppendonor
(b).
Als weiteres Gen aus dem potentiellen Thienodolingen-Cluster wurde das Gen der
Tryptophan-6-Halogenase ThiH zerstört. Di Analyse der „double cross-over“-Mutante ergab,
das diese nicht mehr in der Lage war, Thienodolin zu synthetisieren. Im Gegensatz zur
Mutante im Amidotransferasegen akkumuliert die Mutante im Tryptophan-6-Halogenasegen
kein Zwischenprodukt. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass die Tryptophan-6-Halogenase
den ersten Schritt in der Thienodolin-Biosynthese katalysiert und dass die Chlorierung in 6Position des Indolrings für den nächsten Schritt in Richtung Thienodolin unbedingt
notwendig ist, da kein unhalogeniertes Thienodolin-Derivat gebildet wird, wie das bei einigen
anderen halogenierten Naturstoffen wie z.B. Tetracyclin oder Vancomycin der Fall ist.
Die in diesem Projekt erhaltenen Ergebnisse legen nahe, dass die Thienodolin-Biosynthese
mit der regioselektiven Chlorierung des Tryptophan in der 6-Position beginnt und der letzte
Schritt in der Biosynthese die Bildung der Säureamidgruppe des Thienodolin durch die
Amidotransferase
ist.
Durch
weitere
Arbeiten
soll
untersucht
werden,
ob
die
Aminotransferase den zweiten Biosyntheseschritt katalysiert und ob das Enzym mit
Ähnlichkeiten zu einer 2-Methylthioadenine-Synthetase an der Einführung des Schefelatoms
beteiligt ist. Aus den bisher erhaltenen Ergebnissen lässt sich die in Abb. 6 gezeigte
Hypothese für den Verlauf der Thienodolin-Biosynthese ableiten.
NADH + H+
NAD+
ThiF
COOH FADH2
NH2
N
H
FAD + H2O
COOH
ThiH
+
O2 + Cl + H
H2O
Cl
Tryptophan
NH2
N
H
6-Chlorotryptophan
ThiN, M, E, Y?
Glu + ADP + Pi
O
Cl
N
H
S
Gln + ATP
ThiD
C
O
NH2
Cl
Thienodolin
N
H
S
C
OH
Thienodolinsäure
Abb. 6: Hypothese für den Thienodolin-Biosyntheseweg. Noch unklar sind die Schritte, die
zwischen 6-Chlortryptophan und der Thienodolinsäure liegen.
Literaturangaben
Engvist, R., A. Javaid, J. Bergman (2004) Synthesis of thienodolin. Eur. J. Org. Chem. 2004,
2589-2592.
Kanbe, K., H. Naganawa, K. T. Nakamura, Y. Okami, T. Takeuchi (1993b) Thienodolin, a
new plant growth-stimulating substance produced by a Streptomycete strain: II. Structure of
thienodolin. Biosci. Biotech. Biochem. 57, 636-637.
Kanbe, K., M. Okamura, S. Hattori, H. Naganawa, M. Hamada, Y. Okami, T. Takeuchi
(1993a) Thienodolin, a new plant growth-stimulating substance produced by a Streptomycete
strain: I. Taxonomy and fermentation of the producing strain, and the isolation and
characterization of thienodolin. Biosci. Biotech. Biochem. 57, 632-635.
Seibold, C. H. Schnerr, J. Rumpf, A. Kunzendorf, C. Hatscher, T. Wage, E. J. Ernyei, C.
Dong, J. H. Naismith, K.-H. van Pée (2006) A flavin-dependent tryptophan 6-halogenase and
its use in modification of pyrrolnitrin biosynthesis. Biocat. Biotrans. 24, 401-408.