10 - ROFLBOA

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Definition Signal und Rauschen
Jede analytische Messung besteht aus


Signal (S) = Träger der erwünschten Information
Rauschen („Noise“, N) = Träger unerwünschter Informationen
Rauschen:
→ Rauschpegel (noise level) limitiert für viele Messungen deren Empfindlichkeit.
Rauschen = Differenz des gemessenen und des idealisierten (messtechnisch nicht
zugänglichen) Signals.
→ Rauschen kann die Aussagekraft von Daten (Signalen) beeinträchtigen.
→ meist durch die Standardabweichung s des Signals charakterisiert
→ angegeben wird Signal/Rausch-Verhältnis um ein Verfahren zu charakterisieren
S/N = Mittelwert/Standardabweichung = xquer/s
Da xquer/s = 1/RSD → S/N = 1/RSD
10.1 Ursachen von Rauschen (Quellen)
2 unterschiedliche Sorten von Rauschen
a) chemisches Rauschen
aufgrund unkontrollierbarer chemischer Faktoren (z.B.: Schwankung der
Luftfeuchtigkeit, des pH-Wertes, Verunreinigungen, Zersetzung von Chemikalien etc)
b) instrumentelles Rauschen
verursacht durch alle (elektrischen/elektronischen) Komponenten des Messsystem, z.B.
Lichtquelle, Detektor, Messumwandler, Signalverarbeitung, Signalausgabe.
 Thermisches Rauschen (thermal noise)
 Schrotrauschen (shot noise)
 Flackerrauschen (flicker noise)
 Umgebungsrauschen (environmental noise)
Chemisches Rauschen:
Sehr verbreitet in Chromatographie und Spektroskopie
Instrumentelles Rauschen:
 Thermisches Rauschen (Johnson-Rauschen)
Ursache: Bewegungen von Elektronen in leitenden Materialien.
je höher die Temperatur, desto größer das Rauschen
Elektronenbewegung zufällig und ungerichtet → Elektronen zwar verschoben, aber im
Zeitmittel kein Stromfluss beobachtbar
verschwindet nur im absoluten Nullpunkt der Temperatur
Beschreibbar als Urms = √(4kTR∆f)
[Rauschspannung im Frequenzintervall ∆f]

Schrotrauschen
Ursache: Bewegung von Elektronen über eine Potentialbarriere (Grenzfläche), z.B. in
Halbleitern, Photozellen, Vakuumröhren etc.
Mechanismus: Gesamtstromfluss setzt sich aus Bewegung einzelner Ladungsträger
1
zusammen. Jeder Ladungsträger für sich überquert Barriere → statistischer Prozess
→ gewisse Schwankungen des Stromflusses auch auf makroskopischer Ebene
beobachtbar
gemittelter Rauschstrom beschreibbar als Irms = √(2Ie∆f) [e…Elementarladung]

Funkelrauschen, Flackerrauschen
Ursache: nicht eindeutig erklärbar; tritt ubiquitär auf (vielleicht durch Fehlstellen in
Halbleitern oder kosmische Strahlung)
Charakteristika:
Intensität nimmt mit 1/f ab: Irms = ∞1/f
sehr wichtig bei sehr kleinen Gleichstromfrequenzen,
praktisch unbedeutend bei f > 1 kHz
reduzierbar durch Schirmung oder Lock-in-Verstärker

Umgebungsrauschen
Ursache: Umgebung sendet elektromagnetische Wellen aus oder erzeugt
elektrische/magnetische Felder
Charakteristika:
Frequenzabhängig, je kleiner f, desto größer Rauschen
„ruhige“ Bereiche vorhanden, werden messtechnisch genutz
Ursachen kaum eliminierbar, Reduktion durch geeignete
Messtechnik (Lock-in-Verstärker)
10.2 Verbesserung des SNR (3 ausgewählte detailiert)
a)
b)
Hardware-Maßnahmen (instrumentell)
Software-Maßnahmen
Hardware-Maßnahmen:


Erdung und Abschirmung
gegen Umgebungsrauschen, wichtig bei hochohmigen Messgeräten (sehr geringer
Strom fließt), z.B. pH-Elektrode
Differenzverstärker
Messsignal minus Referenzsignal, dann
Verstärkung
da beide Signale in Phase sein sollten →
wesentlich weniger Rauschen im
Differenzsignal
2

Analog-Filter
Tiefpassfilter: Eliminierung von hochfrequentem Rauschen aus (konstantem oder nur
langsam sich ändernden) Signal
Hochpassfilter: Eliminierung von nierderfrequentem Rauschen (z.B. Drift, FlackerRauschen) aus einem (sich schnell änderndem Signal)
Realisierung in Form von RC-Schaltkreisen
Aus dem Skriptum nicht zuordnungsbar:

Modulation

Chopping

Lock-In Verstärker
Software-Maßnahmen

Coaddition
Verbesserung des Signal/RauschVerhältnisses durch Coaddition und
Mittelung von einzelnen
Datensätzen (Spektren)
digital oder analog
Da S ∞ n, aber N ∞ √n, resultiert
daraus: S/N = n ∙ S/√n ∙ N = √n
(S/N)
Mit der Scanzahl erhöht sich das
absolute Rauschen, aber nicht in
demselben Maße wie das Signal
→ Verbesserung von S/N
3

Boxcar-Filterung

Digitale Filter

Rekursive Filter

Fourier Filterung
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7.1
Grundlagen der Elektrophorese
Trennung von elektrisch geladenen Teilchen (in einer Lösung) aufgrund von
unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld.
→ sehr wichtige Trennmethode, aber keine chromatographische
→ wirkende elektrische Kraft im Feld
Fe = zi ∙ e0 ∙ E
zi…Ladungszahl der Komponente i
e0…Elementarladung [C]
E…elektrische Feldstärke [V/cm]
→ in einem viskosen, wässrigen Medium wirkt Reibungskraft FR entgegen
→ Geschwindigkeit einer Komponente:
η ...Viskosität der Lösung [Pa.s]
vi ...Wanderungsgeschwindigkeit der Komponente i
[cm/s]
r ...hydrodynamischer Radius des hydratisierten
Ions (≠ Ionenadius)
→ Stoffkonstante für Komponente i, elektrophoretische Mobilität
→ Nur Trennung geladener Analyten, beruht auf Unterschieden der Molekülgröße und
Ladung
→ daher keine chromatographische Trennung, da keine Verteilung zwischen einer mobilen
und stationären Phase
7.2
Realisierung von Elektrophorese
Zahlreiche verschiedene Formen
 Absteigend auf einem Filterpapier oder Gel, oder
 Flachbett-Anordnung (Gel oder Papier)
 oder in Kapillare
 Kopplung mit anderen Trennmechanismen möglich
Prinzip:
 Probe wird auf Trägermaterial aufgebracht (Papier-, Gelelektrophorese) oder in
Kapillare injiziert (Kapillarelektrophorese [CE])
 Anlegen einer hohen Spannung (20 – 50 kV in der CE)
 Kationen → Kathode, Anionen → Anode
 Wegen unterschiedlicher Mobilität → Auftrennung
 Neutralteilchen nicht aufgetrennt
 Verwendung von Pufferlösungen (konstanter pH, Elektrolyt)
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Träger-Elektrophorese




Verwendung eines Trägermaterials (Celluloseacetat; Papier) zur Trennung von
Proteinen
Wanderungsgeschwindigkeit v.a abhängig von der Ladung der Moleküle
Trennung
- Auftrennung auf Trägermaterial
- Anfärbung der Substanzflecken
(z.B. mit Amidoschwarz)
- Entfärben (Entfernen des
Farbstoffüberschusses)
- Transparent machen des Trägers
- Densitometrisch vermessen (UVScanner)
Einsatzbereich vorwiegend in
biochemischer und klinischer Analyse
Gel-Elektrophorese







Gel (z.B. Agarose; Polyacrylamid-Gele: PAGE) ist Träger- und Trennphase
Trennung nach Ladung und auch Molekülgröße (Siebeffekt)
Porosität der Gele steuerbar durch Konzentrationen der eingesetzten Stoffe
Röhrchen- und Flachbettform
Problem:
Überlagung der Trennung nach Größe und Ladung
→ Ladung wird oft durch Zusatz von Tensiden abgeschirmt
Gleichzeitig viele Analysen möglich (bis zu 60), Auftragung der Proben ebenfalls
Entwicklung und Detektion: Proteine nach Auftrennung in Färbebändern fixiert und
gefärbt, anschließend überschüssiger Farbstoff in Entfärbebändern entfernt
Ergebnis: transparente Folie mit Blau gefärbten Proteinen
Kapillar-Elektrophorese
Instrumentierung:
 Hochspannungsversorgung bis 30 kV
 Meist unbeschichtete Quarz-(Fused-silica)-Kapillaren, auch Teflon
Innendurchmesser 10 – 100 µm, Länge 20 – 100 cm
 UV/Vis-Detektoren (on column detection)
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
Joule’sche Wärme entsteht → kleine Kapillardurchmesser führen Wärme besser ab
Elektroosmose
→ elektroosmotischer Fluss
 Viele Materialien bilden elektrochemische Doppelschicht bei Kontakt mit
Elektrolytlösung
 Kapillareinnenseite negativ → Flüssigkeitssäule positiv
 Elektroosmose tritt auf, wenn elektrisches Feld an flüssiges Elektrolytsystem angelegt
 Flüssigkeitssäule bewegt sich zu Kathode, Fließprofil kastenförmig
Kapillar-(Zonen-)Elektrophorese



Trennung aufgrund von Mobilitätsunterschieden
Gleiche Pufferreservoiren (Grundelektrolyt)
→ bestimmt Leitfähigkeit und pH in Kapillare aufgrund hoher Konzentration
Trennungsoptimierung durch pH-Änderung (Pufferzusammensetzung)
Beeinflussung des Dissoziationsgrad der Analyten/starke Mobilitätsänderung am pK
des Analyten
Charakteristika:
 Peakverbreiterung nur durch longitudinale Diffusion
 Scharfe Anfangszone bei Probenaufgabe wichtig (ca. 1 nL)
 Anwendung speziell in biochemischer und klinischer Analytik (Aminosäuren, Proteine,
Nukleinsäuren)
Vorteile (gegenüber klassischer Gelelektrophorese):
7


Hohe Trennstufenzahl, ca. 1000000 pro Meter
Schnelle Trennungen
Nachteil:
 Schwierige Detektion (Detektorvolumen < 0,5 nL)
Isotachophorese
Trennung von elektrisch geladenen Teilchen im elektrischen Feld, aber mit gleicher
Wanderungsgeschwindigkeit
Experimenteller Aufbau:
 Durchführung in Kapillarsäule (0,5-1 mm ID, bis 1 m Länge)
 Säule zu Beginn mit 2 Elektrolyten unterschiedlicher Ionenbeweglichkeit
 Probelösung (0,1 – 50 µl) an der Phasengrenzfläche aufgegeben
 Spannung → Anordnung der Ionen gemäß ihrer Ionenbeweglichkeit in scharfe Zonen
zwischen Leading- und Terminal-electrolyte reservoir
 Wanderungsgeschwindigkeit konstant
 Detektion z.B. über Potetialgradienten-Detektor
Detektion:
Potentialgradienten-Detektor:
Misst den Übergang zwischen zwei Elektrolyten mittels zweier Pt-Elektroden →
Potentialsprung
UV-Absorptionsdetektor: Alternative für UV-absorbierende Substanzen
Charakteristika:
 Probenvolumina 0,1-100 µl, Ionische Lösungen mit pH 2-12
 Erfassungsgrenze: ~10-9…10-10 mol/l
 Reproduzierbarkeit: ~2% RSD
Anwendungen:
Für organische und anorganische Ionen in der
 Biochemie (Proteine, Aminosäuren, Nucleotide,…)
 Pharmaindustrie (Antibiotika, Amine…)
 Lebensmittelindustrie (Zitronensäure, Milchsäure, …)
8.1
Grundlagen und Realisierung der Kapillarelektrophorese
Siehe 7.2m Kapillar-, Kapillar-Zonen-Elektrophorese
Probenaufgabe: Probe wird in Kapillare injiziert
Detektion: UV/Vis Detektoren
UV/Vis – Detektion
→ Messprinzip: Abschwächung eines monochromatischen Lichtstrahls durch selektive
Absorption der Probe im, Strahlengang
→ Konzentration nach Lambert-Beer’schen Gesetz berechenbar
→ Messzelle: optische Weglänge 10 mm, Zellvolumen 8 – 32 µL
→ Messbereich: 190 – ca. 850 nm
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Vergleich Kapillarelektrophorese und Ionenchromatographie
Säule
Analyten
Typische
Probenvolumina
Nachweisgrenze
Typische Trennzeit
Reproduzierbarkeit
Phasen
9.1
Ionenchromatog
raphie
ID: 1-4 mm, L:
10-25 cm
Anorganische
Ionen, kleine
organische
Ionen,
Biomoleküle
(Proteine)
10-50 µl
Kapillarelektroph
orese
ID: 10-100 µm,
L: 20-100 cm
Ionen ohne
Größenlimit,
Proteine
Isotachophorese
(<)< 1µl
0,1 – 50 µl
10-7 - 10-10 mol
5-30 min
3-5% RSD
Stationäre
Phase, mobile
Phase (NaOH
oder NaCO3;
HCl)
bis 10-12 mol
5-15 min
5% RSD
Keine Stationäre
Phase; mobile
Phase (Puffer)
~10-9…10-10 mol/l
5-15 min
~2% RSD
2 Elektrolyte
Spannung wird
angelegt
Spannung wird
angelegt
Wanderungsgesch
windigkeit der
Analyten
unterschiedlich
UV/VisDetektion
Wanderungsgesch
windigkeit der
Analyten konstant
ID: 0,5-1mm, L:
bis 100 cm
Potentialgradiente
n-Detektor
Vergleich Flachbett-Elektrophorese und Kapillarelektrophorese
Realisierung siehe auch 7.2
Flachbettelektrophorese:
braucht einen Träger (Celluloseacetat; Papier; Gel), Detektion über UV-Scanner,
Probenauftragung: viele Proben gleichzeitig.
Nach Auftrennung Substanzflecken angefärbt, nach entfernen des Farbstoffüberschusses wird
Träger transparent gemacht
Siebeffekt bei Gel-Elektrophorese
Anwendung vorwiegend in der biochemischen und klinischen Analytik (Proteine)
Probleme: Überlagung der Trennung nach Größe und Ladung, Abschirmen der Ladung durch
Zusatz von Tensiden
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Kapillarelektrophorese
Kapillare: Quarz-Kapillare…
Probe wird in Kapillare injiziert.
Hochspannung
UV/Vis-Detektion
Vorteile (gegenüber der klassischen Gelelektrophorese): hohe Trennstufenzahl, schnelle
Trennungen
Nachteil: schwierige Detektion
9.2
Skizzen
Siehe auch 7.2
Flachbettelektrophorese
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