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Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Sapida Safdari Geboren am: 12.12.1983 in Kabul angefertigt am: Institut für klinische Immunologie, Universität Leipzig in Zusammenarbeit mit dem Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie, Leipzig Betreuer: Prof. Dr. med. Frank Emmrich Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 23.09.2014 Für meinen Vater Anwar Inhaltsverzeichnis BIBLIOGRAFISCHE BESCHREIBUNG ............................................................................. I ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................. II TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................................... III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................... IV 1. EINLEITUNG....................................................................................................................... 1 1.1. DER SCHLAGANFALL ........................................................................................................ 1 1.2. STAMMZELLEN ................................................................................................................. 9 1.3. ADIPOSE TISSUE DERIVED CELLS (ADC) ....................................................................... 13 1.4. STAIR-KRITERIEN ......................................................................................................... 14 1.5. FRAGESTELLUNG DER DISSERTATION ............................................................................. 15 2. MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................... 17 2.1. MATERIALLISTE .............................................................................................................. 17 2.2. STUDIENDESIGN .............................................................................................................. 20 2.3. EIN- UND AUSSCHLUSSKRITERIEN .................................................................................. 21 2.4. VERSUCHSABLAUF.......................................................................................................... 22 2.5. VERSUCHSTIERE ............................................................................................................. 22 2.6. FETTGEWEBSENTNAHME................................................................................................. 23 2.7. ISOLATION ...................................................................................................................... 23 2.8. SCHLAGANFALL .............................................................................................................. 27 2.9. TRANSPLANTATION ........................................................................................................ 29 2.10.VERHALTENSTESTS ....................................................................................................... 30 2.11. MAGNETRESONANZTOMOGRAPHIE ............................................................................... 33 2.12. TÖTUNG UND PERFUSION .............................................................................................. 36 2.13. STATISTIK ..................................................................................................................... 36 3. ERGEBNISSE..................................................................................................................... 37 3.1. PILOTVERSUCH DER ZELLISOLIERUNG ............................................................................ 37 3.2. AUSSCHLUSSKRITERIEN UND AUSWIRKUNGEN AUF DIE VERSUCHSTIERZAHL ................ 39 3.3. ERGEBNISSE DES EXPERIMENTELLEN SCHLAGANFALLES ................................................ 40 3.4. ZELLISOLIERUNG ............................................................................................................ 41 3.5. ERGEBNIS DER TRANSPLANTATION................................................................................. 42 3.6. ERGEBNISSE DER VERHALTENSTESTS ............................................................................. 43 3.7. ERGEBNISSE DER MRT-MESSUNGEN .............................................................................. 46 4. DISKUSSION ..................................................................................................................... 49 4.1. METHODENDISKUSSION .................................................................................................. 49 4.2. THERAPEUTISCHE WIRKSAMKEIT VON ADC .................................................................. 53 4.3. STUDIENQUALITÄT ......................................................................................................... 57 4.4. BEANTWORTUNG DER FRAGEN AN DIE ARBEIT ............................................................... 58 4.5. AUSBLICK ....................................................................................................................... 59 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... VI LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................... VIII ERKLÄRUNG AUF DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT ............. XIII LEBENSLAUF ....................................................................................................................XIV DANKSAGUNGEN .............................................................................................................XVI Bibliografische Beschreibung Safdari, Sapida Syngene Transplantation regenerativer Fettgewebszellen nach experimentellem Schlaganfall in der spontanhypertensiven Ratte. Universität Leipzig, Dissertation zur Erlangung des Titels Doktor der Medizin 60 Seiten, 123 Literaturverweise, 19 Abbildungen, 14 Tabellen Der Schlaganfall gehört weltweit zu den häufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache von Langzeitbehinderungen im Erwachsenenalter. Die derzeitige Behandlung des Apoplex besteht aus der Lysetherapie mit Alteplase. Diese ist jedoch nur zeitlich beschränkt einsetzbar und birgt Risiken. Neue Behandlungsansätze zur Heilung des Schlaganfalles, wie zum Bespiel medikamentöse Neuroprotektiva oder Zelltherapien, zeigten vielversprechende Ergebnisse in diversen, präklinischen Studien. Dennoch konnte sich bisher keines dieser Therapieverfahren in der Klinik durchsetzen. Die vorliegende Studie überprüft die Wirksamkeit einer heterogenen Zellpopulation aus dem Fettgewebe spontanhypertensiver Ratten nach syngener Transplantation. Aufgrund der einfachen Zellgewinnung stellt das Fettgewebe eine neue, vielsprechende Alternative für die Schlaganfalltherapie dar. In der aktuellen Studie wurden 64 spontanhypertensive Ratten in den Versuch eingeschlossen, von denen 32 Tiere einem experimentell ausgelösten Schlaganfall durch Okklusion der mittleren Zerebralarterie unterzogen worden sind. Zur funktionellen Überwachung neurologischer Defizite wurden verschiedene Verhaltenstests durchgeführt und die Tiere in einem Zeitraum von 86 Tagen beobachtet. Als bildgebende Diagnostik wurde die Magnetresonanztomographie eingesetzt. Sowohl in den Verhaltenstests als auch im MRT zeigte die heterogene Fettgewebspopulation keinen therapeutischen Effekt. Die Arbeit diskutiert mögliche Ursachen dieses Ergebnisses und geht dabei auf wesentliche pathophysiologische Aspekte des Schlaganfalls, auf die angewandte Methodik, sowie die Zellpopulation an sich detailliert ein. I Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Pathophysiologische Vorgänge nach einem Schlaganfall .................................... 3 Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der pathophysiologischen Vorgänge nach einem Apoplex .... 6 Abbildung 3: Prinzip einer Stammzelle ................................................................................... 10 Abbildung 4: Pluripotente Stammzelle..................................................................................... 11 Abbildung 5: Versuchsablauf ................................................................................................... 22 Abbildung 6: CFU-F-Kolonie .................................................................................................. 26 Abbildung 7: Prinzip der MCAO ............................................................................................. 29 Abbildung 8: Der Ladder Rung mit einer SHR ........................................................................ 33 Abbildung 9: MRT-Untersuchungen ........................................................................................ 34 Abbildung 10: Auswertung der MRT-Befunde ........................................................................ 35 Abbildung 11: Ergebnisse der Zellzahl und Zellvitalität im Pilotversuch ............................... 37 Abbildung 12: CFU-F Anteil im Pilotversuch für n=10 .......................................................... 38 Abbildung 13: Ergebnisse der ersten FACS- Analysen für n=10 ............................................ 39 Abbildung 14: Anteil der untersuchten Oberflächenmarker im Hauptversuch für n=3 ........... 42 Abbildung 15: Ergebnisse des Beamwalks .............................................................................. 44 Abbildung 16: Ergebnisse des mNSS....................................................................................... 45 Abbildung 17: Ergebnisse des Ladder Rung-Tests .................................................................. 46 Abbildung 18: Infarktorganisation im Zeitverlauf ................................................................... 47 Abbildung 19: Hirnödem (eSOE) und das ödem-korrigierte Läsionsvolumen (eVLäsion) ........ 47 II Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Ergebnisse der Interstroke-Studie aus dem Jahr 2010 ............................................... 1 Tabelle 2: Bisher eingesetzte Stammzellpopulationen ............................................................. 13 Tabelle 3: Übersicht der Materialien ........................................................................................ 17 Tabelle 4: Oberflächenmarker .................................................................................................. 26 Tabelle 5: Beamwalk-Test Kategorien ..................................................................................... 30 Tabelle 6: Auswertungskriterien des mNSS ............................................................................. 31 Tabelle 7: Auswertungskriterien des Foot Fault Score ............................................................ 32 Tabelle 8: Auswertungskriterien des Forepaw Digit Score ...................................................... 33 Tabelle 9: Ergebnisse der FACS-Analysen im Pilotversuch .................................................... 38 Tabelle 10: Ausschlusskriterien für den Versuch ..................................................................... 39 Tabelle 11: Zusammenfassung der physiologischen Parameter während der OP .................... 40 Tabelle 12: Ergebnisse der Zellzählung bei der Isolierung im Hauptversuch .......................... 41 Tabelle 13: Transplantationsdosis ............................................................................................ 42 Tabelle 14: Infarktvolumina der Kontroll- und Therapietiere in mm³ ..................................... 47 III Abkürzungsverzeichnis ° °C Grad Grad Celsius ADC ADRC ASC AUC Adipose Tissue-Derived Cells Adipose Tissue-Derived Stem and Regenerative Cells Adult Stem Cells Area under the curve BM MNC BSA Bone Marrow Derived Mononuclear Cells Bovines Serumalbumin CBF CD CFU-F cm cm² CO2 Cerebral Blood Flow Cluster of Differentiation Colony Forming Units for Fibroblasts Zentimeter Quadratzentimeter Kohlenstoffdioxid DMEM DWI Dulbecco’s Modified Eagle Medium diffusionsgewichtete Sequenz im MRT EEG engl. ESC Elektroenzephalografie englische Bezeichnung Embryonic Stem Cells FACS FKS FSC Fluorescence Activated Cell Sorting Fetales Kälberserum Fetal Stem Cells G-CSF g xg Granulocyte-Colony Stimulating Factor Gramm mittlere Erdschwerebeschleunigung HGF HUCB MNC Hepatocyte Growth Factor Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells i.v. iPSC IGF1 IL-1/-6 intravenous induced Pluripotent Stem Cells Insulin-like Growth Factor 1 Interleukin 1/6 KG kg Körpergewicht Kilogramm MMP MCAO min ml mm Matrixmetalloproteasen Middle Cerebral Artery Occlusion Minute Milliliter Millimeter IV mm³ µm mNSS MRT MSC MW Kubikmillimeter Mikrometer modified Neurological Severity Score Magnetresonanztomographie Mesenchymal Stromal Cells Mittelwert P PAR PBS PLA cells Pilotversuch population attributable risk Phosphate Buffered Saline Processed Lipoaspirate Cells rt-PA recombinant tissue-Plasminogen Activator s SHR STAIR Sekunden spontanhypertensive Ratten Stroke Treatment Academic and Industry Roundtable T Tx T2 TNFα Tesla Transplantation Bildgebungsmodus im MRT Tumornekrosefaktor α V VEGF Vergleich aus anderen Rattenstämmen/Vorversuche Vascular Endothelial Growth Factor V Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 1. Einleitung 1.1. Der Schlaganfall 1.1.1 Ursache und Risikofaktoren des Schlaganfalls Der Schlaganfall gehört zu den weltweit häufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache für dauerhafte Behinderung im Erwachsenenalter. Die Inzidenz des Schlaganfalles nimmt mit höherem Lebensalter zu. Schätzungsweise 25% der über 85-jährigen erleiden einen ischämischen Insult. In 85% der Fälle wird die Ischämie durch eine Unterversorgung des Gehirns mit Blut hervorgerufen (1-3) . In 15% der Fälle tritt eine zerebrale Blutung auf (4) . Als Ursachen des ischämischen Schlaganfalls gelten zerebrale Makro- und Mikroangiopathien sowie kardiale und hämodynamische Erkrankungen. Der wichtigste Faktor ist hierbei die Arteriosklerose der hirnversorgenden Gefäße. Sie führt durch die Ausbildung von Plaques zu Stenosen und Okklusionen. Hierbei ist meistens die Karotisgabel betroffen (4) . Die Thrombembolie ist eine weitere Ursache des zerebrovaskulären Verschlusses. Sie kann unter anderem kardialen Ursprungs sein. Kardiale Hirnembolien treten häufig im Rahmen von Herzrhythmusstörungen oder Herzvitien auf. Weiterhin kann sich ein Schlaganfall als Komplikation von entzündlichen Erkrankungen, Autoimmunprozessen, wie zum Beispiel entzündlichen Darmerkrankungen, Vaskulitiden, Rheumatoider Arthritis oder einem Antiphospholipidsyndrom manifestieren (3) . Zu den Risikofaktoren des Schlaganfalls zählen unter anderem die arterielle Hypertonie, der Diabetes mellitus, das Rauchen und die abdominelle Adipositas. Die „Interstroke“-Studie aus dem Jahr 2010 erkannte folgende Hauptrisiken für einen Schlaganfall und ermittelte das attributable Risiko (engl. population attributable risk, PAR) der Bevölkerung in allen untersuchten Ländern (siehe Tabelle 1) (5): Tabelle 1: Ergebnisse der Interstroke-Studie aus dem Jahr 2010 Risikofaktor PAR Hypertension 34,6 % Rauchen 18,9 % mangelnde physische Aktivität 28,5 % Diabetes mellitus 5,0 % Alkohol 3,8 % psychosozialer Stress 4,6 % 1 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 1: Ergebnisse der Interstroke-Studie aus dem Jahr 2010 (Fortsetzung) Depression 5,2 % kardiale Ursachen 6,7 % Die Interstroke- Studie ist eine internationale, multizentrische Fall- Kontroll- Studie. Sie untersuchte in 22 Ländern weltweit die Risikofaktoren des Schlaganfalls und ermittelte durch das attributable Risiko (PAR) den Prozentsatz, um den die Schlaganfallsgefahr durch das Ausschalten des entsprechenden Risikofaktors sinken würde. 1.1.2 Pathophysiologie des Schlaganfalls Zur Aufrechterhaltung seiner Funktionen ist das Gehirn auf die ständige Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen angewiesen Gehirns dar (6) . Glukose stellt dabei die Hauptenergiequelle des (7) . Durch die kaum vorhandenen Reserven an energiereichen Substraten im Gehirn ist dieses besonders empfindlich gegenüber Beeinträchtigungen der Blut- und damit der Sauer- und Nährstoffversorgung. Die Minderperfusion einzelner Hirnareale oder gar eine komplette Unterbrechung der Blutzufuhr dieser Gebiete führt dann über eine komplexe Kette pathophysiologischer Vorgänge zu einer rapiden Schädigung der Gehirnsubstanz und zur konsekutiven Nekrose des Hirnparenchyms mit Störung der Bluthirnschranke (6; 8; 9). Das Ausmaß der Schädigung beim Schlaganfall variiert sehr stark und hängt vor allem vom Grad der Mangelversorgung in den betroffenen Arealen ab. Dabei wird generell zwischen zwei pathophysiologisch relevanten Arealen unterschieden, dem Infarktkern und dem angrenzenden Gebiet, das als Penumbra bezeichnet wird. Im Hirninfarktkern wird das Gewebe durch die Zellnekrose irreversibel geschädigt. Dieses Zentrum wird von der Penumbra, einem noch vitalen Gewebe, umgeben, das zwar hypoxisch verändert ist, jedoch eine Restdurchblutung aufweist. Die Penumbra stellt hierbei kein anatomisches Hirnareal dar. Sie ist ein pathophysiologisches Konstrukt, welches über eine kollaterale Arterienversorgung transient versorgt wird und damit vorübergehend intakt bleibt. Dabei beträgt der Schwellenwert des zerebralen Blutflusses (engl. cerebral blood flow, CBF), ab dem es zu einer Hirnschädigung kommt, 20ml x 100g-1 x min-1 (10) . Die zentralen pathophysiologischen Vorgänge nach einem Schlaganfall sollen im Folgenden detailliert beschrieben werden. 2 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 1.1.2.1 Exzitotoxizität Am Beginn der ischämischen Kaskade steht die Exzitotoxizität. Durch ein Energiedefizit nach einem Apoplex depolarisieren die Neurone und Gliazellen im Infarktgebiet. Dies führt zu einer Freisetzung von Neurotransmittern in den Extrazellularraum (siehe Abbildung 1) Hierbei spielt die Freisetzung von Glutamat eine zentrale Rolle (6) . (11) . Durch Aktivierung spezifischer Glutamatrezeptoren steigen der intrazelluläre Kalzium- und Natriumgehalt. Kalium wird in den extrazellulären Raum freigesetzt. Konsekutiv entstehen im Intrazellularraum Ödeme durch Einstrom von Wasser. Das Hirnödem bei einem Schlaganfall ist damit die Folge dieser Elektrolytverschiebung im Infarktgebiet. Kalzium weiterhin ist ein wichtiger Kofaktor verschiedener Proteasen, Lipasen und Endonukleasen. Diese Enzyme zerstören die Zellbestandteile; dies führt schließlich zu Nekrosen (2). Abbildung 1: Pathophysiologische Vorgänge nach einem Schlaganfall Durch das Energiedefizit nach einem Schlaganfall depolarisieren Neurone und setzen insbesondere Glutamat in den Extrazellularraum frei. Dadurch steigen der intrazelluläre Natrium- und Kalziumgehalt, was durch den Einstrom von Wasser das postapoplektische Hirnödem zur Folge hat (Exitotoxizität). Das Kalzium fördert die Bildung von Sauerstoffradikalen (oxidativer Stress), welche wiederum DNA- Schäden (Apoptose) und Entzündungsreaktionen hervorrufen (Inflammation). Bildquelle modifiziert nach Dirnagl et al. (8). 1.1.2.2 Oxidativer Stress Eine weitere Folge der Ischämie und auch der intrazellulär erhöhten Kalziumkonzentration ist die vermehrte Bildung von reaktiven Sauerstoffverbindungen (2; 6; 12) . Neben Wasserstoffperoxid gehören dazu freie Radikale wie Superoxidanion- und Hydroxyl-Radikale (2; 6) . Diese Prozesse tragen zur Destruktion von Neuronen im Infarktareal bei (13) . Besonders sensitiv gegenüber oxidativen Stress reagieren die Mitochondrien. Bei Schädigung der Mitochondrienmembran werden in den betroffenen Neuronen proapoptotische Moleküle wie Cytochrom c freigesetzt (2; 14; 15). 3 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 1.1.2.3 Apoptose Die Mitochondrien spielen ebenfalls eine zentrale Rolle in der Initiierung des postischämischen apoptotischen Zelltods. Apoptose tritt erst Stunden bis Tage nach der Ischämie ein (siehe Abbildung 2). Sie findet, im Gegensatz zum nekrotischen Zellverfall im Infarktkern, hauptsächlich in der Penumbra statt (6). Die Apoptose kann sowohl intrinsisch als auch extrinsisch initiiert werden. Bei der intrinsischen Aktivierung werden über eine veränderte Stoffwechselsituation in den Zellen (beispielsweise die Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes, die Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies oder ein erhöhter Glutamatspiegel) die Mitochondrien geschädigt. Die extrinsische Aktivierung hingegen erfolgt über spezielle Rezeptoren, den sogenannten Todesrezeptoren, die zur Klasse der Tumornekrosefaktor (TNF) alpha-Rezeptoren gehören. Die Endstrecke beider Aktivierungswege sind intrazelluläre Kaspasen (6), welche Komponenten des Zytoskeletts und des Zellkerns spalten. 1.1.2.4 Inflammation Das Infarktgeschehen wird von einer Entzündung begleitet. Die postischämische Entzündung ist durch das vermehrte Auftreten von Zytokinen und Einwandern von Entzündungszellen charakterisiert (11) . Analog zur Initiierung der Apoptose wird die Entzündung einige Stunden nach dem Schlaganfall manifest (siehe Abbildung 2). Die Adhäsion der Leukozyten an die endotheliale Zellwand und ihre Migration aus dem Blut ins Hirnparenchym ist für die Entstehung und Unterhaltung der Entzündung entscheidend (6). Zellen des Immunsystems wie neutrophile Granylozyten, Monozyten, Makrophagen, dentritische Zellen Lymphozyten wandern in die Entzündungsherde ein und werden hier aktiviert und T- (3; 6; 15) . Die vorrangige Aufgabe dieser Immunzellen besteht darin, geschädigtes Zellmaterial zu erkennen und zu beseitigen sowie regenerative Prozesse zu initiieren. Jedoch können Immunzellen auch in primär nicht-ischämischem Gewebe schädigend wirken und somit das Infarktgeschehen verstärken. In Versuchen mit Mäusen und Ratten bewirkte die Blockade der Interaktion von Leukozyten mit der Zellwand eine Reduktion der Infarktgröße (16; 17) . Mikroglia und Astrozyten werden ebenfalls in der Entzündungsphase aktiviert. Sie fördern über eine weitere Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und Zytokinen die Zellzerstörung und Inflammation (18; 19). 4 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 1.1.2.5 Bluthirnschranke Die Bluthirnschranke wird nach einem Schlaganfall im betroffenen Gebiet massiv geschädigt und verliert ihre Barrierefunktion. (20) . Dies beruht auf einer Schädigung der Basallamina durch Matrixmetalloproteasen (MMP). Es resultiert eine vermehrte Einwanderung von Leukozyten in diese Areale und die Förderung der Ödembildung (2). 1.1.2.6 Endogene Neuroprotektion Nach einem Schlaganfall werden jedoch nicht nur neurodestruktive Kaskaden aktiviert, sondern ebenso protektive Prozesse wie beispielsweise die Reduktion der Apoptose eingeleitet. Diese natürliche Neuroprotektion zielt auf die Erhaltung von Zellen und Gewebestrukturen ab, die noch nicht komplett zerstört sind. Diese sind insbesondere in der Penumbra von Relevanz (6). Die Folgen der oben beschriebenen pathophysiologischen Prozesse nach einem Schlaganfall sind vielfach. Sie beeinflussen das Infarktvolumen, die Ausbildung und das Ausmaß des Hirnödems sowie den funktionellen Zustand des Patienten nach dem Infarkt. Weiterhin kann der Apoplex die Patienten immunologisch schwächen und die Infektionsgefahr erhöhen. Umgekehrt hängen der Verlauf und das Ergebnis des Schlaganfalls sehr stark vom Immunstatus des Patienten ab. Der Immunstatus ist von hoher Relevanz für das neurologische Outcome des Patienten nach einem Hirninfarkt (19). Insgesamt bietet das Wissen über die Pathophysiologie des Schlaganfalles diverse Ansatzpunkte für seine Therapie. Neuroprotektiva beispielsweise greifen an unterschiedlichen Stellen der pathophysiologischen Kaskade ein. 5 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf der pathophysiologischen Vorgänge nach einem Apoplex Das Wissen über den zeitabhängigen Verlauf der pathophysiologischen Vorgänge nach einem Schlaganfall bietet neue Ansatzmöglichkeiten für Therapien. Je nachdem, welches Ereignis beeinflusst werden soll, kann die Therapie auf die jeweilige Zeit abgestimmt werden. Bildquelle modifiziert nach Dirnagl et al. (8). 1.1.3 Diagnostik des akuten zerebralen Ischämie Akute zerebrovaskuläre Erkrankungen äußern sich je nach Lokalisation und Ausmaß sehr unterschiedlich. Die klinischen Symptome einer akuten zerebralen Ischämie können beinahe unauffällig sein oder bis hin zu schweren Bewusstseinsstörungen reichen (21) . Insgesamt gibt die Klinik des akuten Schlaganfalls einen unzureichenden Aufschluss über dessen genaue Ursache (21) . Folglich werden zur Diagnostik des Schlaganfalls neben der Anamnese und der klinischen Untersuchung apparative Möglichkeiten hinzugezogen. Hierzu zählen vor allem die zerebrale Bildgebung mittels der Computertomographie (CT) und der Magnetresonanztomographie (MRT). Das CT und das MRT sind sensitive Methoden zum Nachweis akuter Ischämien und zum Ausschluss von Blutungen (22) MRT-Untersuchung gegenüber der CT- Untersuchung als überlegen . Hier erweist sich die (23; 24) . Das CT erfolgt vorrangig bei Patienten, die innerhalb des 4,5-Stunden-Fensters nach dem Auftreten der neurologischen Ausfälle diagnostiziert werden (10; 21) und es erfolgt hauptsächlich zum Ausschluss einer Blutung. Ab dem zweiten Tag erscheint dann der Apoplex im CT als eine hypodense Läsion. Verstrichene Furchen und Basalganglien, sowie das hyperdense Mediazeichen weisen ebenso auf einen Verschluss des Hirngefäßes hin (21) . Mit dem MRT wird der Infarkt jedoch viel früher und zuverlässiger diagnostiziert. Die diffusionsgewichteten Sequenzen (DWI) des MRTs können Veränderungen eines akuten ischämischen Ereignisses frühzeitig erfassen (24) . Mit dem Einsatz der perfusionsgewichteten Sequenzen können außerdem weitere Infarktzonen identifiziert werden 6 (25) . Die Magnetresonanztomographie Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. zeigt bessere Ergebnisse bei nicht eindeutiger klinischer Symptomatik und wenn differentialdiagnostisch auch alternative Ursachen der klinischen Symptomatik in Betracht gezogen werden müssen. Zudem wird sie bevorzugt bei Ereignissen, die drei bis sechs Stunden nach Symptombeginn auftreten, eingesetzt (21). Je nach Fragestellung und Form der zerebrovaskulären Ereignisse gibt es weitere Diagnostikmöglichkeiten. aufschlussreiche Die Informationen nicht-invasive über das CT- posteriore oder MR-Angiographie Strömungsgebiet. Sie gibt erfasst Basilaristhrombosen oder -embolien und kann ebenfalls die Ausdehnung der akuten Ischämie ermitteln (21; 23). 1.1.4 Bisherige Therapie des Schlaganfalls Umfangreiche Studien ergaben, dass für die Diagnose und die Therapie des Schlaganfalles die Betreuung des Patienten auf einer Stroke Unit mit entscheidenden Vorteilen verbunden ist. Daher sollte der Patient bereits bei Verdacht auf eine akute Ischämie auf eine Stroke Unit transportiert werden. Ein optimales Management des Patienten mit intensivem Monitoring des neurologischen Status, der Kreislaufparameter und der Laborparameter werden hier gewährleistet. Weiterhin steht ein interdisziplinäres Team aus Neurologen, Logopäden und Physiotherapeuten zur intensiven Betreuung und Frührehabilitation zur Verfügung. Dies verbessert das Outcome (26), während Komplikationen seltener auftreten und die Letalität sinkt (27) . Das erste Ziel der Therapie eines akuten Schlaganfalls besteht in der Stabilisierung des Kreislaufs. Hierfür werden Vitalparameter wie Herzfrequenz, Blutdruck und Sauerstoffsättigung des Patienten regelmäßig gemessen und ihm Sauerstoff und Flüssigkeit gegeben (21) . Eine erhöhte Körpertemperatur ist bei einem Schlaganfall mit einer Vergrößerung des Infarktareals und einer Verschlechterung der Prognose verbunden. Daher sollte die Körpertemperatur des Patienten unter 37,5°C gesenkt werden (21). Die kausale Behandlung eines ischämischen Hirninfarktes besteht aus der Lysetherapie. Es werden Fibrinolytika wie Alteplase (engl. recombinant tissue-Plasminogen Activator, rt-PA) eingesetzt. Ihr Ziel ist die Wiedereröffnung des verschlossenen Gefäßes und damit die Reperfusion eines schlecht durchbluteten Hirngebietes. Somit sollen Zonen reversiblen Schadens zumindest vorübergehend konserviert und eine Ausweitung des Infarktkerns vermieden werden (25) . Innerhalb von 4,5 Stunden nach Symptombeginn führt die Lysetherapie zu einer signifikanten Verbesserung des Outcomes 7 (28) . Von dieser Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Behandlungsmöglichkeit profitieren jedoch nur 6-15% der Schlaganfallspatienten (29). Erstens erreichen zunächst nur 25% der Patienten das Krankenhaus innerhalb des therapeutisch relevanten Zeitfensters (30) . Zweitens stellt die Gefahr einer sekundären Blutung eine Kontraindikation für bestimmte Patientengruppen dar, so dass sie ebenfalls nicht von der Lysetherapie profitieren können (21) . Insgesamt erhält nur ein kleiner Teil der Schlaganfallspatienten eine adäquate Therapie. Somit besteht ein enormer Bedarf an der Erforschung weiterer Therapieoptionen zur Behandlung des akuten Schlaganfalls, insbesondere solchen, die jenseits des 4,5h-Zeitfensters einsetzbar sind und/oder weniger Kontraindikationen unterliegen. 1.1.5 Experimentelle Ansätze zur Schlaganfalltherapie In den letzten Jahren gelang es, durch intensive Forschung ein erheblich verbessertes Verständnis der Pathophysiologie des Schlaganfalls zu erreichen. Trotz Erfolge gelang es aber nicht, neue, kausal wirksame Behandlungsmethoden einzuführen (31) . Es sind deshalb neue Behandlungsansätze erforderlich, die verminderte Risiken aufweisen und Patienten in unterschiedlichen Krankheitsstadien erfassen. Das Wissen über die Pathophysiologie des Schlaganfalls bietet zahlreiche Ansatzmöglichkeiten für Therapien (32) . Die wesentlichen experimentell-therapeutischen Ansätze sollen im Folgenden kurz beschrieben werden. 1.1.5.1 Neuroprotektiva Neuroprotektiva gehören zur Gruppe experimenteller Therapeutika. Sie setzen an unterschiedlichen Punkten der pathophysiologischen Vorgänge des Schlaganfalls an und versuchen der Zerstörung des Hirnparenchyms durch Verhinderung des individuellen Zelltods entgegenzuwirken. Während Thrombolytika den Blutfluss wiederherstellen, versuchen Neuroprotektiva, die Nervenzellen zu erhalten sind Kalziumkanalblocker, (1) . Beispiele für neuroprotektive Substanzen Glutamat-Antagonisten, Antioxidantien und entzündungshemmende Medikamente (1; 33; 34). Trotz ihrer Wirksamkeit in tierexperimentellen Studien konnten Neuroprotektiva aber keine klinischen Erfolge erzielen (1; 33) . Als prominentes Beispiel kann der Radikalfänger NXY-059 dienen. Seine Wirkung konnte in experimentellen Studien nachgewiesen werden. Nach anfänglich ermutigenden Befunden in der klinischen Phase II konnten die Ergebnisse in einer multizentrischen Effektivitätsstudie der Phase III aber nicht reproduziert werden (35). 8 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 1.1.5.2 Hypothermie Hypothermie ist eine weitere Möglichkeit, das Gehirn vor der Ischämie zu schützen. Erniedrigte Körpertemperaturen hemmen nicht nur die Entzündungsvorgänge im Gehirn, sondern sollen durch eine Drosselung des Stoffwechsels auch dem schnellen Verbrauch noch vorhandener energiereicher Substrate im Gehirn entgegenwirken. Die milde Hypothermie ist ein experimentell etabliertes Verfahren und wird in vielen Zentren zum Schutz von zerebralen Läsionen, insbesondere nach Kreislaufversagen eingesetzt (36). 1.1.5.3 Zelltherapien Zell- und stammzellbasierte Therapien stellen relativ neuartige Behandlungsansätze dar, mit denen versucht wird, zusätzliche Behandlungsoptionen nach dem Schlaganfall zu eröffnen (31) . Dies trifft insbesondere auf subakute und chronische Phasen der zerebralen Ischämie zu. 1.2. Stammzellen Stammzellen sind Zellen, die sich in verschiedene Zellen oder Gewebe differenzieren können (37) . Sie sind potentiell in der Lage, sich in reife Zellen aller drei Keimblätter, also auch Neurone und Gliazellen, zu differenzieren (siehe Abbildung 3). Dies eröffnet theoretisch kausale Behandlungsmöglichkeiten, insbesondere für solche degenerativen Erkrankungen, die bisher nur symptomatisch therapiert werden konnten. Neben primär neurodegenerativen Erkrankungen wie der Parkinson’schen oder der Huntington’schen Erkrankung zählen dazu auch Erkrankungen mit einem komplexeren Pathomechanismus, wie etwa ischämische oder traumatische Schädigungen des Gehirns. Daher wurde bei der Behandlung durch Stammzellen oder stammzellhaltigen Zellpopulationen ursprünglich versucht, verlorengegangene Neurone zu ersetzen. Diese Strategie war allerdings nicht erfolgreich (38) . Nachdem keine ernstzunehmenden Beweise für den Erfolg echter Zellersatztherapien nach Schlaganfall gesammelt werden konnten, rückte später der alternative Ansatz in den Vordergrund, das beschränkte, hirneigene Regenerationsvermögen mittels Stammzellen zu unterstützen und idealerweise zu erhöhen (36) . Wachstumsfaktoren wie der vaskulär- endotheliale Wachstumsfaktor (engl. Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) oder der Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktor (engl. Granulocyte-Colony Stimulating Factor, G-CSF), die von Stammzellen sezerniert werden, können die endogenen Reparaturvorgänge 9 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. des Gehirns unterstützen und somit eine funktionelle Erholung beschleunigen, verstärken oder unter bestimmten Umständen gar erst herbeiführen (39; 40) . Weiterhin können durch Unterstützung endogener Stammzellen die Angiogenese, Neurogenese und Synaptogenese gefördert werden und somit verlorengegangene Strukturen ersetzt werden (41). Abbildung 3: Prinzip einer Stammzelle Stammzellen sind Zellen, die durch eine unbegrenzte Teilungsfähigkeit charakterisiert sind. Sie können sich prinzipiell in nahezu alle Zelltypen oder Gewebearten differenzieren. Stammzellen können aus Embryonen, aus Feten oder aus ausdifferenziertem Gewebe, wie z.B. Knochenmark, gewonnen und in vitro kultiviert werden. Bildquelle: Twomey (42). 1.2.1 Klassifikationen der Stammzellen Stammzellen werden in totipotente, pluripotente, multipotente oder unipotente Zellen eingeteilt. Während totipotente Stammzellen sich theoretisch bis zu kompletten Organismen entwickeln können, ist das Potential pluripotenter und multipotenter Stammzellen auf die Differenzierung zu Zelltypen der drei Keimblätter bzw. auf nur wenigen Zelltypen beschränkt (siehe Abbildung 4). Unipotente Stammzellen hingegen bringen nur einen Zelltyp hervor. Stammzellen können aus Embryonen, Föten, aber auch adulten Organismen gewonnen werden. Demnach erfolgt eine weitere Einteilung in embryonale und nicht-embryonale Stammzellen. Nicht-embryonale Zellen beinhalten weiterhin fetale und adulte Stammzellen. Im Fokus regenerativer Therapien stehen vor allem die embryonalen (engl. Embryonic Stem Cells, ESC) und adulten Stammzellen (engl. Adult Stem Cells, ASC) (43). 1.2.2 Arten von Stammzellen Embryonale Stammzellen sind pluripotent und können durch Expansion und Differenzierung im Grunde in jede menschliche Zelle differenzieren. Ihre beinahe unbegrenzte Teilungsfähigkeit ermöglicht eine Kultivierung und Expansion in vitro. Somit bilden sie eine ideale Grundlage für die regenerative Medizin (37). ESC werden jedoch aus der 10 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Zellmasse der Blastozyten gewonnen, was eine experimentelle Arbeit mit Embryonen und deren Zerstörung voraussetzt. Damit stehen ihrem Einsatz erhebliche ethische Aspekte entgegen. Zudem bergen sie das Risiko einer Tumorentstehung (44) , so dass ihre Anwendung bislang auf den experimentellen Bereich beschränkt bleibt. Fetale Stammzellen (engl. Fetal Stem Cells, FSC) stehen äquivalent zu den embryonalen Stammzellen unter ethischer Kritik (45) . Neben diesen Bedenken können FSC zudem nicht autolog transplantiert werden. Dies hat eine lebenslange Immunsuppression der ohnehin schon körperlich eingeschränkten Patienten zur Folge. Aufgrund der genannten Probleme und der Tatsache, dass nur geringe Mengen an Zellen aus dem Fetus gewonnen werden können, stellt sich der therapeutische Einsatz von fetalen Stammzellen ebenfalls als limitierend dar (46). Abbildung 4: Pluripotente Stammzelle Die in vivo befruchtete Eizelle kann sich in alle Gewebearten bis hin zum kompletten Organismus differenzieren. In der weiteren Reifung entwickelt sie sich über das 8-Zellen-Stadium in die Blastozyste. Diese enthält in ihrer inneren Zellmasse pluripotente Stammzellen. Diese Zellart kann sich zu Zellen aller drei Keimblätter ausdifferenzieren. Ihre Kultivierung ist in vitro möglich, wodurch sie eine ideale Therapiequelle darstellt. Bildquelle modifiziert nach Cambridge Information Group (47). Adulte Stammzellen können aus dem Knochenmark, aus dem Nabelschnurblut, aus der Plazenta oder aus Fettzellen gewonnen werden (48). Daher sind sie ethisch weniger bedenklich als ESC. Ihr eigentlicher Vorteil besteht aus medizinischer Sicht in der relativ guten Verfügbarkeit und der Möglichkeit der autologen Transplantation (eine Ausnahme stellen induzierte pluripotente Stammzellen dar, die im nächsten Absatz kurz erläutert werden). Im 11 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Rahmen experimenteller Anwendungen werden ASC vorwiegend als hämatopoetische und mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark und Nabelschnurblut gewonnen, sind aber auch in fast allen Geweben und Organen inklusive des Gehirns anzutreffen (49). Die Transplantation humaner hämatopoetischer Stammzellen ist eine in der Klinik bereits seit Jahrzehnten etablierte Methode zur Behandlung von Erkrankungen des blutbildenden Systems. In der Schlaganfallsforschung führen mononukleäre Populationen des humanen Nabelschnurbluts (engl. Human Umbilical Cord Blood Mononuclear Cells, HUCB MNC) oder des Knochenmarks (engl. Bone Marrow Mononuclear Cells, BM MNC) nach systemischer Gabe zu einer schnelleren Erholung von Versuchstieren nach einem experimentellen Schlaganfall (50) . Bereits 2001 konnte von Chen und Kollegen gezeigt werden, dass HUCB MNC nach Okklusion der mittleren Zerebralarterie (engl. Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO) die neurologischen Defizite in Wistar-Ratten abmilderten (51) . Die Zellen zeigten darüber hinaus immunmodulatorische und zytoproliferative Effekte (52; 53) . Vergleichbare Effekte wurden bei BM MNC beschrieben. Sie förderten ebenfalls die neurologische Genesung, insbesondere durch eine erhöhte Angiogenese und eine verbesserte Neurogenese (54). Nachteile adulter Stammzellen ergeben sich beispielsweise aus dem Alterungsprozess der aus Knochenmark gewonnenen Zellen. Diese weisen ein noch höheres Risiko auf mit Viren befallen zu sein (55) . Stammzellen aus dem Nabelschnurblut unterliegen zwar nicht diesen Problemen, ihre Ausbeute ist jedoch vergleichsweise gering, so dass große Mengen an Nabelschnurblut erforderlich sind, um eine ausreichende Menge an Stammzellen zu gewinnen. Weitere Nachteile der adulten Stammzellen sind im Kapitel 1.2. aufgeführt. Induzierte pluripotente Stammzellen (engl. induced Pluripotent Stem Cells, iPSC). Unlängst gelang es japanischen Forschern, aus adulten Körperzellen Stammzellen zu generieren, die in ihrer Morphologie und ihren Wachstumseigenschaften den ESC sehr ähneln. Mittels der Einbringung sogenannter Pluripotenzfaktoren (Oct4, Sox, Nanog, cMyc, Klf4) programmierten sie somatische Zellen in pluripotente Stammzellen um (56) . iPSC sind analog den embryonalen Stammzellen pluripotent und können in unterschiedliche Zelltypen, z.B. in Neurone differenziert werden (57). Da diese Zellen aus adulten Körperzellen gewonnen werden können, vermeidet der Einsatz von iPSC wesentliche ethische Kritikpunkte, die den Einsatz von ESC und FSC limitieren. Außerdem können iPSC autolog erzeugt und transplantiert werden, was ebenfalls einen enormen Vorteil darstellt. Durch die analogen 12 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Wachstumseigenschaften zu ESC bergen iPSC jedoch ebenfalls die Gefahr der Tumorentstehung (58) . Somit bleiben auch ihre Einsatzmöglichkeiten zunächst auf den experimentellen Bereich beschränkt. 1.2.3 Übersicht über bisher präklinisch eingesetzte Stammzellpopulationen Die bisher experimentell eingesetzten Stammzellpopulationen in präklinischen Schlaganfallexperimenten werden in der Tabelle 2 zusammengefasst (50): Tabelle 2: Bisher eingesetzte Stammzellpopulationen Zelltypen Transplantationsweg Wirkung Embryonale und fetale Zellen embryonale Stammzellen intrazerebral + fetale Stammzellen intravenös, intrazerebral + neuronale Stammzellen intrazerebral + Knochenmarksstromazellen intravenös, intrazerebral + periphere hämatopoetische Zellen intravenös, intrazerebral + mononukleäre Knochenmarkszellen intrazerebral, intravenös + humane olfaktorische Zellen intrazerebral + Stammzellen aus dem Fettgewebe intravenös, intrazerebral + Adulte Zellen 1.3. Adipose Tissue Derived Cells (ADC) Trotz ihrer potentiell therapeutischen Wirksamkeit weisen die oben genannten adulten Zellquellen jeweils bestimmte Einschränkungen auf, die einen klinischen Einsatz beeinträchtigen könnten. Zellentnahmen aus dem Knochenmark sind schmerzhaft und bedürfen häufig einer lokalen oder systemischen Anästhesie, die für den hochakut gefährdeten Schlaganfallpatienten ein zusätzliches Risiko darstellen kann. Aufgrund ihrer zusätzlich geringen Zellausbeute müsste möglicherweise eine mehrmalige Entnahme erfolgen, um eine therapeutisch angemessene Anzahl an Zellen zu gewinnen. Dies stellt, neben ökonomischen Bedenken, eine erhöhte Kontaminationsgefahr für die entnommenen Zellen und den Patienten dar. In Angesicht dieser Umstände ist die Suche nach einer alternativen Stammzellquelle sinnvoll (59; 60) . Im Jahr 2001 beschrieben Zuk et al. eine alternative stammzellartige 13 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Zellpopulation, die aus dem Fettgewebe gewonnen werden kann. Diese Zellen (engl. Processed Lipoaspirate Cells, PLA cells) weisen, vergleichbar mit den mesenchymalen Stammzellen (engl. Mesenchymal Stromal Cells, MSC), ein ausgeprägtes Differenzierungspotential auf. Sie können sich zu Adipo-, Chondro- und Myozyten, sowie zu Endothel- und Epithelzellen differenzieren (59; 61) . Im Gegensatz zu den MSC kann diese stammzellartige Zellpopulation aus dem Fettgewebe jedoch deutlich einfacher und in größerer Menge gewonnen werden (60). ADC sind der mononukleäre Bestandteil des Fettgewebes. Sie sind eine heterogene Mischung aus Endothelzellen, glatten Muskelzellen und einer mesenchymalen Stammzellpopulation (62). ADC ähneln phänotypisch und zellbiologisch MSC. Sie exprimieren die Oberflächenmarker CD44, CD90 und CD105 und verfügen über eine multilineare Differenzierungsfähigkeit. Zudem sezernieren ADC eine Reihe von parakrinen Faktoren, die anti-apoptotisch und proangiogen wirken (62) . ADC können in hohen Mengen minimalinvasiv gewonnen werden. Frisch isolierte ADC wurden bereits in tierexperimentellen Studien zur Behandlung des Myokardinfarktes und der renalen Ischämie erfolgreich eingesetzt (62-64) . In der experimentellen Herzinfarkttherapie zeigten ADC eine Differenzierungsfähigkeit zu Myozyten und verbesserten die Ejektionsfraktion des Herzens (40) . Weiterhin weisen ADC eine Reihe von Eigenschaften auf, die sie für den Einsatz nach dem Schlaganfall besonders geeignet erscheinen lassen. Fett steht zunächst bei den meisten Patienten in ausreichender Menge zur Verfügung. Die Stammzellen aus dem Fett können mit Hilfe von Isolationstechniken gewonnen werden. Dazu existieren bereits mobile und Good Manufacturing Practice (GMP)-konforme Geräte für den klinischen Einsatz (65). Im Vergleich zu MSC, bei denen zur Isolierung und Kultivierung unter Umständen Wochen benötigt werden, können ADC weiterhin innerhalb eines klinisch relevanten Zeitfensters von Stunden eingesetzt werden (62). 1.4. STAIR-Kriterien Neuroprotektiva und Zelltherapie stellen eine neue Möglichkeit der akuten Schlaganfalltherapie dar. Trotz präklinischer Erfolge konnten bislang keine neuroprotektiven Behandlungsansätze in der Klinik etabliert werden (33) . Obwohl das Testen von Medikamenten in der präklinischen Phase sehr wichtig für ihre Wirkung ist, gab es ursprünglich keine Leitlinien zur Durchführung präklinischer Studien (66). Ende der 90er Jahre wurden erstmals Richtlinien zur adäquaten Durchführung präklinischer Studien publiziert. 14 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Die sogenannte „Stroke Therapy Academic and Industry Roundtable” (STAIR) bestand aus klinisch tätigen Ärzten, Naturwissenschaftlern und Vertretern der Industrie (1). Er erstellte eine Reihe von Empfehlungen zur verbesserten präklinischen Untersuchung neuroprotektiver Medikamente für den akuten ischämischen Schlaganfall auf. Gleichzeitig gab er Klinikern Empfehlungen zur besseren Beurteilung von präklinischen Daten die STAIR-Gruppe neue Möglichkeiten zur Besserung (66) . Insgesamt diskutierte und Entwicklung neuer Schlaganfalltherapieansätze (67). Folgende Richtlinien zur Durchführung präklinischer Studien wurden veröffentlicht: Messung physiologischer Variablen, wie z.B. Blutdruck und Puls Randomisieren der Versuchstiere in die Versuchsgruppe Verblindete Durchführung und Auswertung des Versuches Messung des Infarktvolumens Funktionelle Tests in Kurz- und Langzeitbewertung Untersuchung von Kleinnagern mit permanenter und transienter MCAO Veröffentlichung in Zeitschriften mit Gutachtersystemen Trotz der allgemeinen Anerkennung dieser Richtlinien wurden sie in den präklinischen Experimenten nicht konsequent umgesetzt und verfolgt. Dies führte zu einer Aktualisierung der STAIR-Kriterien. Die neuen Empfehlungen übernahmen die ursprünglichen Vorschläge und fügten weitere Ansätze hinzu (68): Eliminierung des Randomisierungs- und Beurteilungsbias A priori definierte Ein- und Auschlusskriterien Durchführung einer vorherigen Abschätzung der erforderliche Stichprobengröße Offenlegung potentieller Interessenskonflikte Verwendung alter, prämorbider und weiblicher Tiere Verwendung klinisch relevanter Biomarker 1.5. Fragestellung der Dissertation In dieser Studie sollte die Wirksamkeit von ADC in einem präklinischen Schlaganfallmodell untersucht werden. Die verwendete Tierart, die spontanhypertensive Ratte (SHR), simulierte die Risikofaktoren arterieller Hypertonus, Hypercholesterämie und Hyperglyceridämie. Der Versuchsaufbau erlaubte die Therapie mit syngenen Fettgewebszellen, die aus derselben Inzuchtkolonie gewonnen werden können (siehe Kapitel 2.5.). Ein deutlicher Schwerpunkt der Studie lag in der Auswahl eines klinisch relevanten therapeutischen Zeitfensters von 24 15 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Stunden und einer gering invasiven Applikationsmethode. Um den translationalen Wert der Studie zu erhöhen, wurden möglichst viele Qualitätsempfehlungen der STAIR-Kommission umgesetzt. Folgende Fragen sollten in diesem Versuch beantwortet werden: 1. Kann die heterogene Stammzellpopulation reproduzierbar aus dem Fettgewebe von SHR gewonnen werden? 2. Enthält diese Zellpopulation Stammzellen? 3. Können diese isolierten Zellen sicher in SHR transplantiert werden? 4. Kann durch die syngene Transplantation von ADC 24 Stunden nach einem experimentellen Schlaganfall eine therapeutische Wirksamkeit ermittelt werden? Bei der folgenden Studie handelte es sich um ein Auftragsforschungsprojekt mit Cytori Therapeutics Inc.. Diese stellten zwar einige Arbeitsmaterialien bereit, hatten jedoch keinen Einfluss auf das Versuchsdesign, auf die Versuchsdurchführung, Datenauswertung und Interpretation. 16 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2. Material und Methoden 2.1. Materialliste Tabelle 3: Übersicht der Materialien Produkt Hersteller / Herkunft Stadt / Land Geräte und Software Adobe Premiere Elements 7 Adobe Systems Corp. San Jose, CA, USA Arbeitsbank Clean Air Techniek B.V. Woerden, Niederlande Atemsensor Philips Electronics N.V. Eindhoven, Niederlande Beamwalk, Durchmesser, 14 mm, Eigenfertigung Länge: 1 m Bildbearbeitungssoftware GIMP GIMP Team Heidelberg, Deutschland Bildbearbeitungssoftware Image J National Institut of Health Bethesda, MD, USA Blutdruckmessgerät, NIBP AD Instruments GmbH Spechbach, Deutschland Controller for rats Cardio-Cap-II-System Datex Ohmeda Inc. Madison, WI, USA Durchflusszytometer, Becton Dickinson AG Franklin Lakes, NJ, USA FACS-Software, CellQuest, Becton Dickinson AG Franklin Lakes, NJ, USA Hirnoberflächentemperatursonde, AD Instruments GmbH Spechbach, Deutschland FACSCalibur Needle Microprobe Thermocouple Inkubationsschrank, Forma Thermo Electron Corp. Waltham, MA, USA Scientific Kryostat, CM3050, Leica Mikrosystems GmbH Ladder-Rung Wetzlar, Deutschland Eigenfertigung Verhaltenstestapparatur) Lagerungsbox, Styropor Eigenfertigung Magnetresonanztomograph (1,5 T), Philips Electronics N.V. Hamburg, Deutschland Gyroscan Intera Mikropipette, 10 μl, 100 μl, 1000 Eppendorf AG Hamburg, Deutschland μl, Mikroskop Nikon Eclipse Ti, Nikon Instruments B.V. 17 Europe Badhoevedorp, Niederlande Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 3: Übersicht der Materialien (Fortsetzung) Mikroskop-Software, NIS- Nikon Instruments Europe Badhoevedorp, Niederlande Elements B.V. NucleoCounter IUL-Instrumente GmbH Königswinter, Deutschland Operationsmikroskop OP MI 1-fr Carl Zeiss AG Jena, Deutschland Rektalsonde AD Instruments GmbH Spechbach, Deutschland Ringspule Philips Electronics N.V. Hamburg, Deutschland Schüttelinkubator, – Heidolph Laborbedarf GmbH Schwabach, Deutschland Taumler Schüttler „Polymax 1040“ & Co. KG SigmaPlot 12.0 Systat Software GmbH Erkrath, Deutschland Sony Handycam Sony Inc. Tokyo, Japan Stereotaktischer Rahmen für TSE Systems GmbH Bad Homburg, Deutschland Kleintiere Stoppuhr Medizinisch-Experimentelles Universität Leipzig Zentrum Thermokauter Fine Science Tools GmbH Thermometer und Thermoregulator AD Instruments GmbH Homeothermic Controller Heidelberg, Deutschland Spechbach, Deutschland and Plate Tierwaage für Kleintiere Harvard Apparatus GmbH March, Deutschland Zahnarztbohrer K9 KaVo GmbH Leitkirch i.A., Deutschland Zentrifuge Rotina 48 R Hetich GmbH & Co. KG Tuttlingen, Deutschland Verbrauchsmaterialien 6er Wellplatte Greiner Bio-One GmbH Solingen, Deutschland Aluminiumfolie Carl Roth GmbH & Co. KG Karlsruhe, Deutschland Betaisadona Lsg. St. Georg Krankenhaus Leipzig, Deutschland Braunülen MT-G3.3/G14, B. B. Braun Melsungen AG Melsungen, Deutschland Deckgläschen Fein-Optik GmbH Bad Blankenburg, Deutschland Einmalspritzen 10/20 ml, VWR International GmbH Darmstadt, Deutschland Filterspitzen, 10 μl, 100 μl, 1000 μl Greiner Bio-One GmbH Solingen, Deutschland Kanülen, Gelb, 20 G Rakers Medizinbedarf Bad Lippspringe, Deutschland Objektträger „Superfrost Plus“ Microm AG Volketswil, Schweiz Pasteurpipette Glas 150/230 mm VWR International GmbH Darmstadt, Deutschland Petrischalen 100 mm² Greiner Bio-One GmbH Solingen, Deutschland 18 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 3: Übersicht der Materialien (Fortsetzung) Reaktionsgefäße, 0,2 ml, 0,5 ml, Greiner Bio-One GmbH Solingen, Deutschland 1,5 ml Spitzen für elektrische Pipette, 5 Sarstedt AG & Co. Nürnbrecht, Deutschland ml, 10 ml, 20 ml Spritze für Perfusionspumpe, 50 ml Becton Dickinson AG Franklin Lakes, NJ, USA Spritzenvorsatzfilter Leipzig, Deutschland Dr. Ilona Schubert Laborfachhandel Zellfilter 40/100 μm BD Biosciences GmbH Heidelberg, Deutschland Zentrifugenröhrchen, 50 ml Greiner Bio-One GmbH Solingen, Deutschland Reagenzien und Medikamente 10 x PBS Biochrom AG Berlin, Deutschland 2-Methylbutan AppliChem GmbH Darmstadt, Deutschland Anti-CD31-PE, Antikörper BD Biosciences GmbH Heidelberg, Deutschland Anti-CD45-FITC, Antikörper BD Biosciences GmbH Heidelberg, Deutschland Anti-CD73-PE, Antikörper BD Biosciences GmbH Heidelberg, Deutschland Atropiumsulfat St. Georg Krankenhaus Leipzig, Deutschland BSA (Bovines Serum Albumin) Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland Celase-2 Lösung Cytori Therapeutics, Inc. San Diego, USA Fetales Kälber-Serum (FKS), PAA Laboratories GmbH Marburg, Deutschland hitzeinaktiviert Formalinlösung 37% AppliChem GmbH Darmstadt, Deutschland Glukoselösung B. Braun Melsungen AG Melsungen, Deutschland Hämatoxylin 2 x Mayers Merck KGaA Darmstadt, Deutschland Isofluran (Forene, 250 ml) Abbott GmbH & Co. KG Wiesbaden-Delkenheim, Deutschland Ketaminhydrochlorid St. Georg Klinikum Leipzig, Deutschland Kollagenase I Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland Metamizol-Na (Novaminsulfon®) Ratiopharm GmbH Ulm, Deutschland Natriumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland PBS / Ca + Mg Biochrom AG Berlin, Deutschland Penicillin-Streptomycin PAA Laboratories GmbH Marburg, Deutschland Sucrose Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland VE-Wasser Leipzig, Deutschland 19 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 3: Übersicht der Materialien (Fortsetzung) Xylazinhydrochlorid (Rompun) Chirurgie Vet. med. Leipzig, Deutschland Zellmedium, DMEM/Ham’s F-12 PAA Laboratories GmbH Marburg, Deutschland mit LGlutamine Chirurgische Instrumente Einmalskalpelle Cutfix Kleintier-Schermaschine Carl ROTH GmbH & Co. KG Favorita B. Braun Melsungen AG Karlsruhe, Deutschland Melsungen, Deutschland II GT 104 Mayo Schere, gebogen, 15cm FINE SCIENCE TOOLS Heidelberg, Deutschland SCIENCE TOOLS Heidelberg, Deutschland SCIENCE TOOLS Heidelberg, Deutschland SCIENCE TOOLS Heidelberg, Deutschland GmbH Metzenbaum Präzisionsschere, FINE gebogen, 13 cm GmbH Metzenbaum Schere gebogen 14,5 FINE cm GmbH Standard Pattern Pinzette, gebogen FINE 13cm GmbH Tiermaterialien Alleinfuttermittel R-Z Extr. Kasten aus Plexiglas ssniff Spezialdiäten GmbH (CO2- TSE Systems GmbH Soest, Deutschland Bad Homburg, Deutschland Euthanasie / Isofluran-Narkose) Kleintierguillotine World Precision Instruments Berlin, Deutschland Germany GmbH Spontan Hypertensive Ratten, Charles River WIGA GmbH Sulzfeld, Deutschland männlich 2.2. Studiendesign Die vorliegende Studie wurde nach den wesentlichen Empfehlungen für präklinische Studien des Schlaganfalls gemäß den Empfehlungen des STAIR-Komitees konzipiert und umgesetzt. Diese wurden im Kapitel 1.4. bereits näher erläutert. Insbesondere kamen in dieser Studie folgende Kriterien zur Anwendung: 20 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. a priori Berechnung der Versuchstierzahl sowie der Ein- und Ausschlusskriterien Verblindung bei der Durchführung und Auswertung der Verhaltenstests, MRTAuswertung und Transplantation Randomisieren der Versuchstiere Verwendung komorbider Versuchstiere Transplantation in einem klinisch relevanten Zeitfenster Langzeituntersuchung der funktionellen und bildmorphologischen Endpunkte Messung physiologischer Variablen (wie z.B. Blutdruck und Puls) Temperaturmessung während der Induktion der Ischämie Messung des Infarktvolumens Die Transplantation erfolgte 24 Stunden nach dem Schlaganfall. Die Gesamtuntersuchungszeit betrug 86 Tage. 2.3. Ein- und Ausschlusskriterien Zur Reduktion von Heterogenität in der Versuchstierpopulation wurden Ein- und Ausschlusskriterien festgelegt, um Tiere vom Versuch auszuschließen, bei denen es durch Komplikationen wie z.B. Teilinfarkt zu Interferenzen mit dem Versuchsablauf und damit zur Verzerrung von Ergebnissen kommen konnte. Diese wurden vor den Experimenten definiert und beinhalteten: am Tag der primären Datenerhebung eine Beamwalk Kategorie <1 (siehe Kapitel 2.10.1) während des MCAO eine zentrale Temperatur von >37°C im MRT kein Nachweis eines infarktypischen T2-Signals kein vollständiger kortikaler Infarkt nach MCAO im MRT („Teilinfarkt“) sichtbare parenchymatöse Einblutungen Therapie erfolgte außerhalb von 24±3 Stunden nach MCAO Im weiteren Verlauf des Experiments galt eine Gewichtsreduktion von mehr als 15% als ein weiteres Ausschlusskriterium. 21 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.4. Versuchsablauf Der zeitliche Versuchsablauf der aktuellen Studie wird in Abbildung 5 schematisch dargestellt: Abbildung 5: Versuchsablauf Die Tiere wurden zwei Wochen lang auf die Verhaltenstests vorbereitet. Es folgte die OP und die anschließende Transplantation der ADC (Tx). Bis zur Tötung wurden regelmäßig Verhaltenstests und MRT-Untersuchungen durchgeführt. Zwei Wochen vor dem experimentell induzierten Schlaganfall begann die Vorbereitung der Versuchstiere auf die Verhaltenstests. Hierbei standen das Erlernen des Laufens auf dem Beamwalk (siehe Kapitel 2.10.1) und die gleichzeitige Gewöhnung der Versuchstiere an den Experimentator im Vordergrund. Einen Tag vor der Operation wurden die Ausgangsdaten für den Versuch erhoben (sogenannte Baseline). Zellisolation und Zelltransplantation fanden an Tag 1 nach dem Schlaganfall statt (siehe Kapitel 2.7. und 2.9.). Bis zur Tötung am 86. Tag wurden gemäß Abbildung 5 Verhaltenstests und MRT-Untersuchungen vorgenommen (siehe Kapitel 2.10. und 2.11.). 2.5. Versuchstiere Die Tierexperimente wurden nach § 8 Abs.1 des Tierschutzgesetzes genehmigt (TVV 18/07) und nach den Tierschutzvorgaben des Regierungsbezirks Leipzig durchgeführt. Als Versuchstiere wurden 64 männliche, spontanhypertensive Ratten (69) verwendet. Sie entstammen einer Inzuchtkolonie, die von Okamoto an der Kyoto School of Medicine entwickelt wurde. Charakteristisch für SHR sind neben einem Hypertonus eine Hyperinsulinämie, Hyperglykämie, eine Glukoseintoleranz, sowie ein erhöhter Wert an freien Fettsäuren (70) . Damit wird das Risikoprofil eines menschlichen Schlaganfallpatienten simuliert. Zusätzlich zeichnen sich SHR durch eine herabgesetzte Autoregulation des (71) zerebrovaskulären Systems Hauptstromgebieten aus und eine reduzierte Kollateralisierung in den zerebralen (72) . Diese Faktoren begünstigen eine stabile Reproduzierbarkeit im 22 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Schlaganfallmodell (73) . Die Verwendung von Inzuchttieren erlaubt aufgrund des identischen genetischen Hintergrunds eine syngene Transplantation von Zellen. Die Versuchstiere wurden folgenden Experimentbereichen zugeteilt: Etablierung der Zellisolation n=10, Spendertiere im Versuch n=9, Empfängertiere im Versuch n=32 (Wirksamkeitsprüfung) (siehe Kapitel 3.2. Tabelle 9). Weitere 13 Tiere wurden aufgrund von Ausschlusskriterien aus den Versuchen entfernt (siehe Kapitel 3.2.). Die Haltung der Tiere erfolgte in Räumen mit künstlichem TagNacht-Rhythmus, sowie konstanten Temperatur (23°C)-und Luftfeuchtigkeitsbedingungen. Es befanden sich jeweils fünf Ratten in einem Käfig. An den ersten drei postoperativen Tagen erfolgte eine Haltung in Einzelkäfigen, um eine Manipulation der Wunden durch Käfiggenossen zu verhindern und eine gleichmäßige, effektive Schmerztherapie (siehe Kapitel 2.8.) zu gewährleisten. Während des gesamten Experiments erhielten die Versuchstiere ein Alleinfuttermittel ad libitum. 2.6. Fettgewebsentnahme Die Fettgewebsentnahme erfolgte an einer unmittelbar zuvor mit Kohlenstoffdioxid getöteten SHR. Nach Feststellung des Todes erfolgte die Rasur im gesamten Brust-, Bauch- und Inguinalbereich. Es folgte eine dreifache Desinfizierung des Thorax und des Abdomens, mit abwechselnd betadine- und alkoholgetränkten, sterilen Tupfer. Anschließend wurde die Ratte in Rückenlage auf ein steriles OP-Tuch gelegt. Der erste Schnitt erfolgte senkrecht von der Brust bis zur Leiste. Der zweite Schnitt verlief horizontal, in der Höhe des mittleren Thorax. Durch die Trennung der Haut von der Muskelschicht wurde das subkutane Fett freigelegt. Nach Darstellung des Fettgewebes wurden die inguinalen Lymphknoten identifiziert und entfernt. Schließlich wurde das Fett von der Haut präpariert und in einer sterilen Vehikellösung (engl. Phosphate Buffered Saline, PBS) auf Eis gelegt. 2.7. Isolation 2.7.1 Pilotversuch Zellisolation Die Isolierung eines heterogenen Zellgemisches aus dem Fettgewebe ist eine bekannte Methode. Sie wurde bereits bei der Wirksamkeitsprüfung von Fettgewebszellen nach einem Myokardinfarkt eingesetzt (62). Das Ziel des Pilotversuches der aktuellen Studie bestand in der Etablierung dieser Zellisolationsmethode im eigenen Labor und im Sinne eines Trainings, um 23 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. die spätere, reibungslose Durchführung des Hauptversuchs zu gewährleisten. Außerdem sollte die Reproduzierbarkeit der Methode bei SHR überprüft werden, da die Verfahrensweise bisher nur an anderen Rattenstämmen beschrieben wurde. Als Vergleich wurden unpublizierte Ergebnisse aus der eigenen Arbeitsgruppe mit Sprangue-Dawley-Ratten hinzugezogen. Für den Pilotversuch wurde das Fett von zehn SHR mit einem Gewicht von circa 250g verwendet. Nach der oben beschriebenen Fettgewebsentnahme erfolgte die Dokumentation der Stammzellfrequenz, der Zellvitalität und der Gesamtzellzahl. Die Stammzelldichte wurde mit Hilfe der Colony-Forming-Units for Fibroblasts (CFU-F) bestimmt (siehe Kapitel 2.7.4). Die Zellvitalität und Zellzahl wurden mittels eines automatisierten Zellsystems (Nucleocounter) ermittelt. Die folgenden Abschnitte erklären die genauen Schritte der Zellisolierung und Quantifizierung. Insgesamt konnten im Pilotversuch die reproduzierbare Gewinnung von ADC, sowie ihre quantitative und qualitative Reproduzierbarkeit durch mehrere Versuchsdurchläufe gewährleistet werden (siehe Kapitel 3.1.). 2.7.2 Durchführung der Zellisolation Die Isolierung regenerativer Zellen aus dem Fettgewebe erfolgte in mehreren Schritten. Außer dem Gewebeverdau mit Kollagenase und der Zentrifugation fanden alle weiteren Isolationsschritte in einer sterilen Zellkulturwerkbank (laminar flow box) statt. Nach der Gewebsentnahme (siehe Kapitel 2.6.) wurde das Fett auf eine trockene Petrischale überführt. Die Zerkleinerung des Fettgewebes erfolgte manuell mittels einer Schere bis zur Bildung einer homogenen, glänzend rosafarbigen Masse. Dieser Vorgang wird als „Mincing“ bezeichnet und ist eine standardisierte Methode. Der anschließende Gewebeverdau erfolgte auf einem Schüttler mit dem Enzym Kollagenase (0,9mg/dl). In einem 50ml Reaktionsgefäß wurde das Fettgemisch mit der 5-fachen Menge Kollagenase 30min bei 37°C Temperatur inkubiert. Nach einer initial zu geringen Zellausbeute in den ersten Isolationsvorgängen wurde das Protokoll auf eine Kollagenase-Inkubationszeit von 60min umgestellt. Anschließend wurde das gewonnene Zellgemisch 5min bei 600x g zentrifugiert, gefolgt von der vorsichtigen Absaugung des Überstandes. Danach wurde die Kollagenasen-Digestion durch die Zugabe von 5ml Bovines Serumalbumin (BSA, 0,5%) beendet. Die zweite Zentrifugation erfolgte bei 400x g. Nach erneuter Absaugung des Überstandes wurden wiederholt 5ml BSA ins Zellgemisch gegeben und anschließend mit PBS resuspendiert. Es folgte die dritte Zentrifugation, ebenfalls bei 400x g. Das Zellgemisch wurde mit 25ml 24 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Celase-2-Lösung für zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte die vierte und letzte Zentrifugation, sowie die anschließende Resuspension mit PBS. Die Zelllösung wurde unter Verwendung eines 100µm Zellfilter in ein anderes Reaktionsgefäß überführt. Diese Lösung wurde wiederum durch einen 40µm Zellfilter erneut filtriert. Die Zellen in der Lösung konnten nun mittels des Nucleocounters gezählt werden. Ein Teil des Zellgemisches wurde für die Durchflusszytometrie (engl. Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS) verwendet. Ein anderer Teil konnte zur CFU-F-Bestimmung weitergeleitet werden. 2.7.3 Durchflusszytometrie 2.7.3.1 Prinzip Die Durchflusszytometrie ist ein Messverfahren Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen zur quantitativen Analyse von (74) . Das Prinzip dieser Untersuchung basiert auf der Detektion von Streueigenschaften (Vorwärts-Seitwärtsstreuung) und Fluoreszenzeigenschaften von einzelnen Zellen. Hierbei wird die Bindung von fluoreszenten Antikörpern an spezifische Antigene genutzt. Damit dienen die Fluoreszenzeigenschaften der Zellen zur Bestimmung ihrer Zusammensetzung. Das Messverfahren verwendet eine Kapillare, um die suspendierten Zellen anzusaugen. Diese passieren über hydrodynamische Fokussierung einzeln einen Laserstrahl (75) . Die Lichtstreuung wird dabei für die relative Bestimmung von Größen- und Granularitätseigenschaften verwendet. Eine genauere Aussage liefern aber die Fluoreszenzeigenschaften der Zellen, insbesondere nach einer spezifischen Markierung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Die Durchflusszytometrie erfolgte durch Claudia Pösel/ Arbeitsgruppe Neuroreparatur, Fraunhofer IZI. 2.7.3.2 Durchführung Um eine Aussage über die Reproduzierbarkeit der Zellisolation zu machen, wurde bei der durchflusszytometrischen Untersuchung der aktuellen Studie die prozentuale Zusammensetzung der ADC bestimmt. Analog der Studie von Feng (64) über die Wirkung der Adipose Tissue-Derived Stem and Regenerative Cells (ADRC) bei akutem Nierenversagen wurden im vorliegenden Experiment die Antigene CD45+ für leukozytäre Zellen (CD45+ CD31- und CD73-), CD73+ für nicht- leukozytäre Zellen (CD73+, CD45- und CD31-) und 25 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. CD31+ für endotheliale Zellen (CD31+,CD45- und CD73-) als Marker verwendet (64) . Die Zellen konnten über die fluoreszenzmarkierten Antikörper Anti-CD45-FITC und die Antikörper Anti-CD31-PE und Anti-CD73-PE nachgewiesen werden (siehe Tabelle 4). Tabelle 4: Oberflächenmarker Antigen Antikörper Markierung CD45+, CD31- und CD73- Anti-CD45 Fluoresceinisothiocyanat (FITC) CD73+, CD45- und CD31- Anti-CD73 Phycoerythrin (PE) CD31+, CD45- und CD73- Anti-CD31 Phycoerythrin (PE) Für jede Analyse wurden jeweils 5x105 Zellen in die Antiköperlösung überführt. Es folgte eine 20-minütige Inkubation der Zellsuspension bei Dunkelheit und 4°C. Die Zelllösung wurde anschließend bei 400x g zentrifugiert und jeweils fünf Minuten zweimal mit Fetalem Kälberserum (FKS) gewaschen und somit von ungebundenen Antikörpern befreit. 2.7.4 Colony-Forming-Units Fibroblasts 2.7.4.1 Prinzip Zur weiteren Charakterisierung der ADC wurden die Colony-Forming-Unit for Fibroblasts in der prozessierten Zellmischung bestimmt (siehe Abbildung 6). Diese Methode wurde bereits 1980 von Castro-Malaspina und Kollegen beschrieben (77) und dient der Feststellung der Stamm- und Vorläuferzellfrequenz in einer definierten Menge heterogener Zellen. Abbildung 6: CFU-F-Kolonie Darstellung einer CFU-F-Kolonie. Im vorliegenden Experiment wurden nur Kolonien berücksichtigt, die eine Zellzahl über 50 Zellen aufwiesen Bildquelle: Chatterjee et al. (76). 26 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.7.4.2 Durchführung Im vorliegenden Experiment wurden die ADC in zwei 6-er Well-Platten kultiviert. Mit einer Zellkonzentration von 500 Zellen/cm² und 100 Zellen/cm² wurden die Zellen in die entsprechenden Zellreihen ausgesät. Die Wells enthielten das Vollmedium Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM), welches mit HamsF12, 10% FKS und 1% Penicillin/ Streptomycin ergänzt wurde. Nach dem Aussäen der Zellen erfolgte eine 14-tägige Inkubation bei 37°C Temperatur und 5% CO2. Das Medium wurde nach einer Woche gewechselt und die Konfluenz der Zellen alle drei bis fünf Tage geprüft. Nach 14 Tagen wurde das Medium abgesaugt und die Zellen mit einer 37%igen Formalinlösung fixiert. Die Färbung erfolgte mittels Hämatoxylin. Für die Koloniezählung wurde ein Invertmikroskop verwendet. Es wurden ausschließlich Wells berücksichtigt, in denen eine hohe Zellzahl (mehr als 50 Zellen pro Kolonie) beobachtet wurden. Die Berechnung der CFU-F-Frequenz erfolgte durch die Bestimmung des Mittelwertes von vier Wells: Dabei wurden jeweils zwei Wells mit den höchsten und zwei mit den niedrigsten Kolonienzahlen einbezogen: 4 Wells (2 mit höchster und 2 mit niedrigster Koloniezahl) x 100/ 100 bzw. 500 Zellen/cm². CFU-F Frequenz (%) = Mittelwert CFU-F pro Wellplatte Zellaussaat (100 bzw. 500) 2.8. Schlaganfall Der experimentelle Schlaganfall erfolgte bei allen Versuchstieren durch die permanente Okklusion der mittleren Zerebralarterie (engl. permanent middle cerebral artery occlusion, MCAO). Tamura et al. beschrieben im Jahr 1981 erstmals diese Methode (78). Sie wurde fünf Jahre später durch Bederson et al. weiterentwickelt (79). Zunächst erfolgte die Narkotisierung der Versuchstiere. Hierfür wurden die Ratten präoperativ mit einem intraperitoneal applizierten Gemisch aus Xylazinhydrochlorid 15mg/kg Körpergewicht (KG), Atropinsulfat 0,1mg/kg KG und Ketaminhydrochlorid 100mg/kg KG betäubt. Eine ausreichende Narkosetiefe wurde durch das Ausbleiben des Kornealreflexes und der Reaktion auf einen starken Schmerzreiz sichergestellt. Danach wurde der Kopf der Ratte zwischen rechtem Auge und rechtem Ohr rasiert. Anschließend wurde das Tier auf eine Wärmeplatte gelegt und an eine in Längsachse drehbare Kopfhalterung eingespannt, um eine optimale Lagerung für die OP zu gewährleisten. Eine Augensalbe schützte die Augen vor 27 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Austrocknung. Der Hautschnitt erfolgte durch eine L-förmige Inzision oberhalb des rechten Auges. Danach wurde der Kopf der Ratte um 30° vom Operateur wegrotiert und der kaudale Hautlappen nach ventral geklappt. Dabei wurde die Fixation des Rattenkopfes durch einen Schnauzenhalter gewährleistet. Alle weiteren Schritte erfolgten unter Nutzung eines OP MI 1fr Operationsmikroskops. Es folgte die Durchtrennung des Musculus temporalis und die Entfernung von Teilen des Jochbogens. Hiermit war Platz für die subtemporale Kraniotomie mittels eines K9 Zahnarztbohrers geschaffen. Die Fossa temporalis wurde durch die Ausdünnung des Temporalknochens und Eröffnung der Dura mater dargestellt siehe Abbildung 7 A). Danach konnte die Arteria cerebri media mit einem Haken aus 0,22mm dickem Stahldraht circa 0,5mm angehoben und vom Gewebe gelöst werden (siehe Abbildung 7 B). Der Draht war an einem stereotaktischen Rahmen befestigt. Schließlich wurde die Arteria cerebri media durch einen Thermokauter hitzekoaguliert (siehe Abbildung 7 C). Aufgrund charakteristischer anatomischer Strukturen wie reproduzierbar anzutreffenden zerebralen Venen, konnte eine vergleichbare Höhe des Gefäßverschlusses erzeugt und somit eine gut reproduzierbare Infarktgröße, einhergehend mit typischen Ausfallerscheinungen, induziert werden. Die Fixierung des Musculus temporalis an der Linea temporalis mit der anschließenden Hautnaht mittels einem resorbierbarem 6-0 Faden beendete die Operation. Während des gesamten Eingriffs erfolgte ein physiologisches Monitoring der Tiere. Hierzu wurden die Temperatur, der systolische Blutdruck, der Puls und die Sauerstoffsättigung gemessen. Der Blutdruck wurde über ein Cuff-System, welches an der Schwanzvene angebracht war, detektiert. Die Temperaturmessung erfolgte mittels einer rückkopplungsgesteuerten Rektalsonde und diente der Kontrolle der Wärmeplatte. Die Platte hielt eine Körpertemperatur von 37,5°C aufrecht. Die Temperatur wurde zusätzlich zentral über eine spezielle Thermosonde im Musculus temporalis gemessen und kontrolliert. Die Überwachung der Pulsfrequenz und der kapillaren Sauerstoffsättigung wurde durch das Cardio-Cap-II-System gewährleistet. Die Messungen der physiologischen Parameter erfolgten bei Beginn der OP, vor Auslösung des Schlaganfalls und zu Beginn der Wundversorgung. Nach der Operation wurden die Tiere zur Erholung und zum Aufwachen in Einzelkäfige überführt. Zur postoperativen Schmerzlinderung und Flüssigkeitskompensation erhielten sie 0,4ml einer Mischung aus Natriumchlorid und Glucose per os. Diese wurde drei Tage lang durch 0,2ml Metamizol und 0,2ml Glukose auf 40ml Wasser weitergeführt. Die operative Auslösung des Schlaganfalls erfolgte durch Daniel Wagner/ Arbeitsgruppe Neuroreparatur, Fraunhofer IZI. 28 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 7: Prinzip der MCAO Bild A zeigt die mittlere Zerebralarterie, die durch das Öffnen der Fossa temporalis zur Darstellung kommt. In Bild B wird die Arterie mit einem Haken aus Stahldraht angehoben und vom Gewebe gelöst. Mittels eines Thermokauters wird die Arterie schließlich verschlossen und somit der Infarkt ausgelöst, Bild C. Bildquelle: Wagner (80). 2.9. Transplantation Die Zelltransplantation erfolgte 24 Stunden nach Auslösung der MCAO. Eine zeitliche Überoder Unterschreitung des Transplantationszeitpunktes um drei Stunden wurde a priori als tolerabel eingeschätzt. Eine Behandlung außerhalb dieses Zeitfensters stellte sich als Ausschlusskriterium dar (siehe Kapitel 2.3.). Die Tiere wurden nach dem Schlaganfall zufällig der Therapie- und Kontrollgruppe zugeordnet. Die Transplantation erfolgte ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit, das heißt die Vorbereitung des Transplantats wurde durch eine dritte Person durchgeführt und die Applikation ohne Kenntnis des Spritzeninhaltes vollzogen. Die Ratten wurden vor der Transplantation mit Isofluran inhalativ narkotisiert. Das Transplantat wurde dann in eine Schwanzvene injiziert. Kriterien einer erfolgreichen Transplantation waren ein leichter Vorschub des Katheters in die Vene, widerstandsfreies Injizieren der Lösung und Blutaustritt bei Entfernung der Kanüle. Die Transplantatdosis betrug 4x106 Zellen pro kg KG in einem Volumen von 1ml. Die Applikationsgeschwindigkeit betrug circa 1ml/min (manuelle Injektion). Den Kontrolltieren wurde systemisch 1ml PBS appliziert. Die Vorbereitung des Transplantats wurde von Claudia Pösel durchgeführt und die Transplantation erfolgte durch Daniel Wagner, Arbeitsgruppe Neuroreparatur, Fraunhofer IZI. 29 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.10.Verhaltenstests Die Versuchstiere wurden zur Quantifizierung und Qualifizierung motorischer und sensorischer Defizite nach Auslösung des Schlaganfalles Verhaltenstests unterzogen. Diese beinhalteten den Beamwalk-Test, den Ladder Rung-Test und den Modified Neurological Severity Score (mNSS). Die Untersuchungen wurden aufgrund der Nachtaktivität der Ratten am Abend durchgeführt. Ausgangswerte der Verhaltenstests (Baseline) wurden einen Tag vor dem Schlaganfall erhoben. Die postoperativen Untersuchungen dienten der Entwicklungsbeobachtung der Ratten. Auch hier hatte der Untersucher keine Kenntnis über die Gruppenzugehörigkeit der Tiere. 2.10.1 Beamwalk-Test Im Beamwalk-Test nach Feeney und Hamm (81) (82) mussten die Versuchstiere einen Stahlstab von 100cm Länge und 14mm Durchmesser überqueren. Dieser war in einem Meter Höhe horizontal montiert. Am Ende der Stange befand sich der Heimatkäfig mit bekannten Käfiggenossen. Er diente der Ratte als endogene Motivation, schnellstmöglich die Stange zu überqueren. Auf den Startpunkt der Beamwalk-Stange leuchtete eine OP-Lampe. Sie führte als negativer Motivator ebenfalls zum Bestreben, den vertrauten Heimatkäfig zu erreichen. Die Zeit zur Überwindung der Strecke diente als Testkriterium. Zur statistischen Auswertung (siehe Kapitel 2.13.) der Ergebnisse wurde diese Zeit in Kategorien eingeteilt (siehe Tabelle 5): Tabelle 5: Beamwalk-Test Kategorien Zeit in Sekunden Kategorie 0-5 0 5-10 1 10-15 2 15-20 3 > 20 4 Fallen 5 Da der Beamwalk eine hohe Anforderung an die motorische Geschicklichkeit der Ratten stellte, wurde vor den Versuchen eine Trainingszeit von zwei Wochen absolviert, in der diese das Laufen auf dem Balken erlernten. Die Versuche erfolgten jede Woche bis zum 85. Tag. 30 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.10.2 Modified Neurological Severity Score Der mNSS evaluiert sensorische und motorische Veränderungen sowie Reflexmuster beim Kleinnager. Hohe Werte zeigen einen schweren neurologischen Defekt und niedrige Werte ein leichtes Defizit an (51) . Eine alternative Auswertestrategie des Beamwalk ist ein Teil des mNSS. Der mNSS-Test erfolgte zeitgleich mit dem Beamwalk-Test. Tabelle 6 fasst die Auswertungskriterien und Punktevergabe des Tests zusammen. Tabelle 6: Auswertungskriterien des mNSS Motorische Tests Heben und Halten der Ratte am Schwanz Flexion der Vorderpfote 1 Flexion der Hinterpfote 1 Abweichen des Kopfes >10° in der Vertikalachse innerhalb 30s 1 Freies Laufen Normales Laufen 0 Unvermögen, gerade zu laufen 1 Kreisen zur paretischen Seite 2 Fallen zur paretischen Seite 3 Beamwalk-Test Sichere Haltung 0 Ergreifen der Balkenseite 1 Klammern und Herunterhängen einer Extremität 2 Klammern und Herunterhängen zweier Extremitäten 3 Herunterfallen innerhalb 40s 4 Herunterfallen innerhalb 20s 5 Herunterfallen ohne Halteversuch 6 Sensorische Tests Stelltest (Drücken der Hinterpfoten auf die Tischkante zur Stimulation des Muskeltonus) 1 Propriozeptiver Test (Reaktion auf Schmerzreiz) 1 Reflexe Kornealreflex 1 Schreckreflex 1 Pinnareflex 1 Krämpfe, Myoklonien 1 Maximale Punktzahl 18 31 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.10.3 Ladder Rung-Test Der Ladder Rung-Test wurde erstmals von Metz und Wishaw beschrieben (83) . Die Ladder Rung-Testapparatur besteht aus einer 100cm langen horizontalen Leiter mit Sprossen in einem definierten Abstand, die von den Ratten überquert werden mussten (siehe Abbildung 8). Die Abfolge der Sprossen wurde bei jedem Versuchstag variiert, um eine Konditionierung der Tiere zu verhindern. Leiter und Sprossen werden von Plexiglas umgeben, um eine Seitabweichung der Versuchstiere während des Laufs zu verhindern. Am Ende der Versuchsstrecke befand sich der Heimatkäfig. Der Lauf wurde durch eine Videokamera aufgenommen. Durch ein Punktesystem wurden die sensorischen und motorischen Defizite der Versuchstiere ermittelt. Als Auswertungskriterien galten die Laufzeit-, sowie Art und Anzahl der Schrittfehler. Es wurden alle vier Pfoten separat bewertet. Die Auswertung erfolgte später auf dem Computer durch den Foot Fault Score (siehe Tabelle 7). Die Versuche erfolgten an den Tagen 2, 15, 29, 57 und 85 post operationem. Tabelle 7: Auswertungskriterien des Foot Fault Score Komplette Verfehlung der Sprosse, ohne jegliche Berührung der Sprosse 0 Ratte platziert den Fuß auf der Sprosse, rutsch aber tief ab, sobald sie das Gewicht auf den Fuß verlagert 1 Ratte platziert den Fuß auf der Sprosse und rutscht nur leicht ab, sobald sie das Gewicht auf den Fuß verlagert. Der Lauf wird nicht unterbrochen und die Ratte fällt nicht 2 Ratte stellt den Fuß zuerst auf die Sprosse, entscheidet sich aber für eine andere Sprosse, bevor sie das Gewicht auf den Fuß verlagert 3 Fuß zielt auf eine Sprosse, wird aber dann auf eine andere gesetzt, bevor er die ursprüngliche Sprosse berührt oder die Stellung des Fußes auf der Sprosse wird korrigiert 4 Die Sprosse wird nur mit den Zehen oder Ferse, bzw. mit dem Handgelenk berührt 5 Die Sprosse wird mit der Fußsohle, bzw. Handfläche komplett berührt und umgriffen 6 Der Forepaw Digit Score (siehe Tabelle 8) bewertete den kontralateralen Vorderfuß, der beim Foot Fault Score mit sechs Punkten bewertet wurde. 32 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 8: Auswertungskriterien des Forepaw Digit Score Zehe steht in einem 90° Winkel zur Sprosse 0 Zehe umschließt teilweise die Sprosse 1 Zehe umschließt komplett die Sprosse 2 Abbildung 8: Der Ladder Rung mit einer SHR Der Ladder Rung-Test wird auf Video aufgenommen, um die Pfoten der Versuchstiere wiederholt und präzise analysieren zu können. Dabei wird insbesondere das Umgreifen der Sprossen durch den Foot Fault Score bewertet. Bildquelle: Wagner (84). 2.11. Magnetresonanztomographie Die magnetresonanztomografischen Aufnahmen des Rattenhirns gewährleisteten eine Darstellung des Infarktes in vivo und die genaue Lokalisation der Läsion. Sie erfolgten in T2Wichtung, in der das ischämische Gebiet hyperdens erscheint. Pro Gehirn wurden 20 Schnitte in einem Abstand von 1mm aufgenommen. Die Aufnahmerichtung erfolgte von rostral nach kaudal. Die MRT- Messungen fanden in der Klinik für Diagnostische und Interventionelle Radiologie an der Universität Leipzig statt. Sie wurden jeweils zur Evaluierung des initialen Infarktvolumens, einen Tag nach dem Schlaganfall und zur weiteren Verlaufsbeobachtung am 8., 29. und 85. Versuchstag durchgeführt. Alle im Versuch eingeschlossen Tiere wurden untersucht. 2.11.1 MRT- Durchführung Es wurde ein klinisches 1,5 Tesla-System der Marke Philips mit einer Ringspule von 47 mm Durchmesser verwendet. Die Ratten wurden vor Beginn der Untersuchung mit einem Gemisch aus Atropin, Ketamin und Xylazin wie beschrieben anästhesiert (siehe Kapitel 2.8.). Das betäubte Tier wurde anschließend auf einem aus Styropor gefertigten Podest gelagert (siehe Abbildung 9). Das erlaubte die Positionierung der Ratte nahe des Zentrums des 33 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. statischen Magnetfeldes des MRT- Scanners. Der Kopf der Ratte wurde dabei im Lumen der 47mm-Spule platziert. Zudem registrierte ein spezieller Sensor die Atmung, was der Überwachung der Narkosetiefe diente. Die Untersuchung der Tiere erfolgte unter Nutzung der T2-Sequenzen zur anatomischen Darstellung des Gehirns, des Infarkts und der Seitenventrikel. Abbildung 9: MRT-Untersuchungen Nach der Narkotisierung der Ratten wurden die Tiere auf einem Podest aus Styropor gelagert. Der Kopf wurde auf eine 47 mm-Spule platziert. Danach wurden koronare Schnittbilder des Gehirns an einem 1,5 Tesla Tomographen angefertigt. Bildquelle: Boltze (85). 2.11.2 Auswertung der MRT-Daten Die MRT- Auswertung erfolgte digital unter der Verwendung der Bildauswertungssoftware Image J. Zur Bestimmung des Infarktvolumens und der Hirnatrophie wurde eine Reihe von Strukturen auf einem zweidimensionalen Hirnschnitt ausgemessen und dann zu einem dreidimensionalen Volumen hochgerechnet. Die entsprechenden Strukturen beinhalteten beide Hemisphären, die beiden Seitenventrikel und den Infarkt (siehe Abbildung 10). In allen T2-gewichteten Bildern wurde die Fläche der genannten Strukturen bestimmt. Im Rahmen der Infarktorganisation war ein Gewebeverlust der vom Apoplex betroffenen Seite zu beobachten. Damit ging eine erhebliche Ausweitung der ipsilateralen Seitenventrikel einher. Dadurch konnte es zu einem nicht abgrenzbaren Übergang zwischen den hyperintensen Seitenventrikel und dem ebenfalls hyperintensen Infarktareal kommen. Zur Kompensation dieses Problems wurde rechnerisch die Flächendifferenz des ipsi- und kontralateralen Seitenventrikels mit dem ermittelbaren Infarktareal addiert. Die ermittelten Infarktflächen konnten durch eine Integralfunktion anhand bekannter Größen wie der Schichtdicke (1mm) und dem Schnittbildabstand (1 mm) zu einem Infarktvolumen extrapoliert werden. 34 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Die Formel lautete: VLäsion = L + ViV – VcV Analog wurde auf der kontralateralen Seite verfahren. Die Quantifizierung des Hirnödems (engl. space occupying effect of the edema, eSOE) und die Berechnung des ödemkorrigierten, hemispheriellen Läsionsvolumens (engl. uncompressed volume of contralateral hemisphere, eVLäsion) erfolgten nach der Formel von Gerriets (86): VcH – ViH + VLäsion eVLäsion = x 100 VcH eSOE = ucVcH - eVLäsion VLäsion = absolutes Läsionsvolumen L = unkorrigiertes Läsionsvolumen VcV / ViV = Ventrikelfläche, kontra- / ipsilateral VcH / ViH = Volumen der kontra-/ ipsilateralen Hemisphäre (hemisphere volume, contra- / ipsilateral) eVLäsion = korrigiertes Läsionsvolumen (edema-corrected lesion volume [% of hemisphere]) ucVcH = unkorrigiertes Läsionsvolumen (uncompressed volume of contralateral hemisphere) eSOE = Hirnödem (space occupying effect of the edema) VcV ViV L VcH ViH 35 Abbildung 10: Auswertung der MRT-Befunde Zur Bestimmung des Infarktareals wurden das absolute Läsionsvolumen VLäsion, das korrigierte Läsionsvolumen eVLäsion und das Hirnödem eSOE berechnet. Bildquelle modifiziert nach (86). Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 2.12. Tötung und Perfusion Die Tötung der Versuchstiere erfolgte am 86. Tag post operationem. Zunächst wurden die Ratten in einer abgedichteten Kammer durch Kohlenstoffdioxid getötet und im Anschluss auf dem Rücken auf eine Styroporplatte aufgespannt. Es folgte die Eröffnung der Brustwand und die Darstellung des Herzens. Dieses wurde am Apex im Bereich des linken Ventrikels mit einer Kanüle punktiert. Mit Hilfe einer Perfusionspumpe erfolgte die Spülung des großen Kreislaufs zunächst mit 200ml PBS und dann mit 250ml 4% Formalinlösung. Ein Schnitt am rechten Herzohr ermöglichte den Abfluss der Flüssigkeit. Im Anschluss wurde die Schädelkapsel eröffnet und das Gehirn vorsichtig entnommen. Die Fixierung der Gehirne erfolgte über Nacht in 4%-iger Formalinlösung bei 4°C Temperatur. Zur anschließenden Vitrifizierung wurden sie jeweils für je 24 Stunden in 10%iger, 20%iger und schließlich 30%iger Sucrose gelagert. Die Einfrierung erfolgte in 2Methylen-Butan bei -65°C. Danach wurden die Gehirne in Alumimiumfolie verpackt und bei -80°C gelagert. 2.13. Statistik Statistische Auswertungen wurden mit dem Programm SigmaPlot (Version 12.0) durchgeführt. Die physiologischen Daten des operativen Eingriffs (Körpertemperatur, Herzfrequenz, Blutdruck) wurden jeweils mit einem zweiseitigen t-Test verglichen. Seriell erhobene Verhaltensdaten wurden zu individuellen Flächen unter der Kurve (engl. area under the curve, AUC) summiert und mit einem zweiseitigen t-Test verglichen. Das mittels Magnetresonanztomographie bestimmte Läsionsvolumen und Hirnödem wurde jeweils mit einer Zwei-Weg-Varianzanalyse mit Messwertwiederholung (engl. repeated measures twoway, ANOVA) analysiert. Mittelwertunterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p≤0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben und graphisch dargestellt. Die CFU-FFrequenz wurde mittels eines Box-Plots dargestellt. 36 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3. Ergebnisse 3.1. Pilotversuch der Zellisolierung Ziel des Pilotversuchs war es, ein Isolationsprotokoll zu entwickeln, das die reproduzierbare Isolation einer heterogenen Zellpopulation (ADC) aus dem Fettgewebe von SH-Ratten ermöglicht. Die Untersuchung der Zellisolierung beinhaltete die Zellzählung, CFU-FBestimmung und eine FACS- Analyse. Die Zellzählung ergab einen Mittelwert von 1,3x106 Zellen pro ml mit einer mittleren Vitalität von 86,9%±4,6%. Während die Vitalität im Verlauf des gesamten Pilotversuchs konstante Werte aufwies, ergab die Zellzahl eine signifikante Erhöhung mit der Verlängerung der Inkubationszeit der Kollagenase (p<0,01). Abbildung 11 zeigt Zellzahl- und Vitalität der zehn Pilotversuche. Abbildung 11: Ergebnisse der Zellzahl und Zellvitalität im Pilotversuch Die Zellvitalität lag im Verlauf der Studie konstant bei 80%. Die Zellzahl konnte mit der Protokollanpassung (siehe Kapitel 2.7.2) erhöht werden. Insgesamt konnten im Pilotversuch reproduzierbare Werte bezüglich Zellzahl- und Vitalität erzielt werden. Die CFU-F-Untersuchung diente der Ermittlung des Vorläuferzellanteils in den ADC. Im Mittel lag der Anteil bei 0,23% ± 0,09% (siehe Abbildung 12). 37 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 12: CFU-F Anteil im Pilotversuch für n=10 Die CFU-F Analyse ergab einen durchschnittlichen Progenitoranteil von 0,23%. Mittels der FACS-Analyse wurden die Reproduzierbarkeit der Isolationsmethode beurteilt und die gewonnen Zellen charakterisiert. Zur Gewährleistung der Homogenität der heterogenen ADC-Zellpopulation wurde der Anteil der einzelnen Oberflächenmarker nach einem internen Protokoll bestimmt. Hierbei wurde keine bestimmte Zielpopulation definiert. Die Werte galten nur als ein internes Qualitätskriterium zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Isolationsschritte. Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse des Pilotversuchs (P). Als Vergleich wurden Vorergebnisse aus anderen Rattenstämmen (V) hinzugezogen (Sprague-Dawley-Ratten, unpublizierte Ergebnisse aus der eigenen Arbeitsgruppe 2006). Tabelle 9: Ergebnisse der FACS-Analysen im Pilotversuch CD31+ /CD45- CD73+/CD45- CD73-/CD45+ CD45+/CD31- P V P V P V P V Mittelwert 10% 11% 42% 55% 12% 15% 23% 33% Standardabweichung 5% 3% 8% 1% 4% 4% 4% 6% Im Pilotversuch wurden ähnlich den Vergleichsversuchen eine Mehrheit an CD73+ Zellen ermittelt. Die intern festgelegten Richtungswerte für die CD45+ und CD31+ Zellzusammensetzung konnten ebenso umgesetzt werden. Abbildung 13 verdeutlicht den Vergleich zwischen den Ergebnissen des Pilotversuches mit den Ergebnissen aus Experimenten mit anderen Rattenstämmen (siehe Kapitel 2.7.1). 38 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 13: Ergebnisse der ersten FACSAnalysen für n=10 Das Diagramm zeigt enge Übereinstimmungen in der Expression der einzelnen Marker zwischen dem Pilotversuch und der Vergleichsversuche. Die Ergebnisse im Pilotversuch ergaben reproduzierbare Werte bezüglich Zellzahl-, Vitalitätund Zellzusammensetzung der ADC. Somit konnte das Isolationsprotokoll auf SHR angewendet werden. 3.2. Ausschlusskriterien und Auswirkungen auf die Versuchstierzahl Für die Versuche wurden 45 SHR eingesetzt. Mittels einer a priori durchgeführten Poweranalyse bestand die Zielsetzung des Experiments in der Datenerhebung aus mindestens 30 Ratten. Vier Tiere mussten zu Beginn der Versuche ausgeschlossen werden, da sie die Einschlusskriterien nicht erfüllten (siehe Kapitel 2.3.). Von den verbliebenen 41 Versuchstieren starben vier Tiere nach der Operation und vier während der Narkose im Rahmen der MRT-Untersuchungen. Aufgrund eines erlittenen Teilinfarktes musste eine weitere Ratte aus dem Experiment ausgeschlossen werden. Tabelle 10 fasst die Ausfälle zusammen. Tabelle 10: Ausschlusskriterien für den Versuch Ausschlusskriterium Anzahl der Ratten Beamwalk Kategorie >1 am Tag der Baseline 4 Tod infolge MCAO 4 Tod im Verlauf des Experiments 4 Ausschluss aufgrund eines Teilinfarktes 1 Es konnten insgesamt 32 Tiere in das Experiment eingeschlossen werden. 39 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3.3. Ergebnisse des experimentellen Schlaganfalles Durch das operative Monitoring wurden die physiologischen Parameter überwacht und Werteschwankungen kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert, um eine gleichmäßige Behandlung aller Versuchstiere zu gewährleisten. Somit konnten sowohl der Verlauf der Parameter beobachtet, als auch ein Vergleich zwischen Therapie- und Kontrollgruppe gezogen werden. Die Ergebnisse des Monitorings werden in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11: Zusammenfassung der physiologischen Parameter während der OP Therapiegruppe Kontrollgruppe 37,2±0,3 37,2±0,6 Herzfrequenz 264,9±11,5 258,9±23,5 systolischer Blutdruck 175,6±15,7 170,6±18,2 periphere Temperatur (°C) 37,3±0,2 37,5±0,6 zentrale Temperatur (°C) 38,9±0,6 38,5±2,1 Herzfrequenz 261,5±12,1 257,3±20,8 systolischer Blutdruck 149,6±14,5 146,7±14,2 periphere Temperatur (°C) 37,4±0,1 37,5±0,2 zentrale Temperatur (°C) 39,4±0,9 39,3±0,7 Herzfrequenz 254±12,5 251,1±19,2 145,4±16,3 144,2±15,5 Vor der Operation periphere Temperatur (°C) Vor MCAO Nach MCAO systolischer Blutdruck Die OP-Auswertung ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Therapie- und Kontrollgruppe. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in Temperatur, Blutdruck, Sauerstoffsättigung und Puls sowohl vor der Operation, vor der Induktion des Schlaganfalles, als auch nach dem Schlaganfall zwischen Therapie- und Kontrollgruppe ermittelt. Schwankungen der Werte wurden im Verlauf der Operation nicht festgestellt. 40 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 3.4. Zellisolierung Die Zellisolierung für den Hauptversuch erfolgte an drei Tagen aus 9 SHR. Es wurden nach jeder Zellisolation die CFU-F-Frequenz bestimmt und FACS-Analysen entsprechend dem Pilotversuch durchgeführt. 3.4.1 Zellausbeute Bei der Zellzählung wurden insgesamt 2,4x107 Zellen mit einer Vitalität von 84,7% am 1. Isolationstag, 2,9x107 Zellen mit der Vitalität von 84% am 2. Isolationstag und 2,5x107 Zellen mit 79% Vitalität am 3. Isolationstag gewonnen. Tabelle 12 zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung der gesamten Zellisolierung. Tabelle 12: Ergebnisse der Zellzählung bei der Isolierung im Hauptversuch Gesamtzellzahl Vitalität Mittelwert 2,6x107 82,6% Standardabweichung 0,2x107 3,1% 3.4.2 CFU-F-Frequenz Der Vorläuferzellanteil wurde durch die CFU-F Frequenz ermittelt. Er ergab 0,65±0,1% am 1. Isolationstag, 0,34±0,2% am 2. Isolationstag und 0,24±1% am 3. Isolationstag. Trotz der Frequenzabnahme im Verlauf liegen die Werte im geforderten Bereich. Insgesamt zeigt sich ein durchschnittlicher Wert von 0,41±0,23%. 3.4.3 FACS-Analyse Die qualitative Untersuchung der Zellen erfolgte mittels FACS-Analyse. Das Resultat betrug 4%±0,7% für CD31+/CD45-Oberflächenmarker, 63%±0,8% für CD73+/CD45-, 15%±1,8% für CD73-/CD45+ und 20%±1,9% für CD45+/CD31-Marker (siehe Abbildung 14). Das Zellgemisch konnte gut charakterisiert werden und war zwischen den Präparationen vergleichbar. 41 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 14: Anteil der untersuchten Oberflächenmarker im Hauptversuch für n=3 Entsprechend dem Pilotversuch wurde im Hauptversuch ebenfalls ein vergleichbarer Anteil an Oberflächenmarkern detektiert. 3.5. Ergebnis der Transplantation Die Zelltherapie der SHR erfolgte mit der frisch isolierten, heterogenen Fettgewebspopulation 24 Stunden nach dem Schlaganfall. Die Transplantationsdosis betrug 4x106 Zellen pro kg KG. Die Versuchstiere wurden randomisiert und in eine Kontroll- und eine Therapiegruppe eingeteilt. Hinsichtlich der transplantierten Zellmengen ergaben sich daraus folgende individuelle Werte (siehe Tabelle 13): Tabelle 13: Transplantationsdosis Versuchstier Körpergewicht in g Gesamtmenge 1 274,5 2,20 x 106 2 270,5 2,16 x 106 3 254,0 2,03 x 106 4 288,5 2,30 x 106 5 280,0 2,24 x 106 6 273,0 2,18 x 106 7 287,0 2,30 x 106 8 265,0 2,12 x 106 9 289,0 2,29 x 106 10 282,0 2,25 x 106 11 287,0 2,30 x 106 12 200,0 2,40 x 106 13 297,0 2,37 x 106 42 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Tabelle 13: Transplantationsdosis (Fortsetzung) 14 272,0 2,18 x 106 15 299,0 2,39 x 106 Die Transplantation erfolgte 24 Stunden nach dem Schlaganfall. Die Zellen waren mit 1ml PBS suspendiert. Die Kontrolltiere erhielten eine äquivalente Menge an PBS. Der Experimentator besaß keine Kenntnis über die Gruppenzugehörigkeit der Tiere. Die Transplantation wurde erfolgreich durchgeführt, es kam in keinem Fall zur Verletzung vorher bestimmter Kriterien (siehe Kapitel 2.9.). Die Therapietiere wurden mit der ADCSuspension (1ml) behandelt, während die Kontrollgruppe eine äquivalente Menge an PBS erhielt. 3.6. Ergebnisse der Verhaltenstests 3.6.1 Allgemeiner Verlauf Die Verhaltenstests wurden zur Messung motorischer und sensorischer Defizite durchgeführt (siehe Kapitel 2.10.). In den Gruppen wurde ein stabiles Leistungsniveau durchschnittlich sechs Tage vor Beendigung der Konditionsphase erreicht. Die Konditionsphase dauerte bis zum Tag vor der ersten Datenerhebung. Bei allen Versuchstieren kam es nach der Schlaganfallinduktion zu drastischen Einbrüchen der Leistungen. Im Laufe des Versuches besserten sich die neurologischen Störungen. Die Daten der Verhaltenstests bestätigten diesen Prozess (siehe Abbildungen 15, 16, 17). 3.6.2 Ergebnisse des Beamwalk-Tests Einen Tag nach dem Schlaganfall war eine deutliche Verschlechterung der Laufzeit beider Gruppen zu registrieren. Danach kam es zu einem stetigen Rückgang der Beamwalk Kategorie, im Sinne einer funktionellen Erholung (siehe Abbildung 15). Die Kontrollgruppe erreichte ab dem 7. Tag und die Therapiegruppe ab dem 13. Tag eine stabile Phase. Im weiteren Experiment zeigten sowohl Therapie- als auch Kontrolltiere einen vergleichbaren Verlauf. 43 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 15: Ergebnisse des Beamwalks Es sind die durchschnittlichen Zeiten aller Läufe beider Versuchsgruppen dargestellt. Sowohl Kontroll- als auch Therapietiere weisen einen Tag nach MCAO (= Versuchstag 1) eine deutliche Verschlechterung der Laufzeit auf. Diese bessert sich im Laufe der Versuchstage. Die Abbildung zeigt keinen Unterschied zwischen der Therapie- und Kontrollgruppe (p=0,366). Die statistische Auswertung des Beamwalk-Tests erfolgte nach Summation des seriellen Datensatzes durch Berechnung der Fläche unter der Kurve (siehe Kapitel 2.13.). Ein signifikanter Effekt der Behandlung mit ADC konnte nicht nachgewiesen werden (p=0,366). Die Therapietiere zeigten insgesamt keine schnellere Laufzeit als die Kontrolltiere. 3.6.3 Ergebnisse des mNSS Der mNSS- Score zeigte ein deutliches neurologisches Defizit der Ratten nach Auslösung der MCAO. Im weiteren Verlauf wiesen sowohl Kontroll- als auch Therapietiere eine Reduktion der mNSS-Punkte auf, was, im Einklang mit den Ergebnissen des Beamwalk-Tests, für eine funktionelle Erholung spricht. Eine signifikante Besserung der neurologischen Defizite konnte bei den ADC behandelten Tieren nicht ermittelt werden (p=0,928). Abbildung 16 zeigt den Verlauf und die AUC beider Gruppen. 44 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 16: Ergebnisse des mNSS Präoperativ zeigt kein Versuchstier pathologische Werte. Am Tag 1 nach MCAO zeigen beide Gruppen eine Verschlechterung, die sich im Verlauf des Experimentes vermindert. Beide Graphen zeigen keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen Kontroll- und Therapietieren (p=0,928). 3.6.4 Ergebnisse des Ladder Rung-Tests Die rechtseitige MCAO führte erwartungsgemäß zu Ausfallerscheinungen der kontralateralen Körperhälfte. Da der Verschluss der Arteria cerebri media dexter den Bereich des sensomotorischen Kortex versorgt, auf den der linke Vorderfuß projiziert, bewirkte die MCAO bei den Ratten vor allem sensomotorische Defizite im linken Vorderfuß. Beim Ladder Rung-Test wurden die ipsi- und kontralateralen Fehlerraten sowohl der Vorderals auch der Hinterfüße zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Insbesondere die Fehlerrate des linken Vorderfußes beschrieb die Infarktschädigung. In der statistischen Auswertung wurden die Fehlerraten des kontralateralen, linken Vorderfußes der Kontroll- und Therapiegruppe mit dem t-Test miteinander verglichen (siehe Kapitel 2.13.). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Kontroll- und Therapietieren festgestellt (p=0,84). Abbildung 17 vergleicht die Fehlerrate des linken Vorderfußes beider Gruppen an allen Versuchstagen. 45 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 17: Ergebnisse des Ladder Rung-Tests Die Fehlerraten des kontralateralen Vorderfußes der Kontroll- und Therapiegruppe wurden miteinander verglichen. Kurz nach dem MCAO waren die Fehlerraten beider Gruppen deutlich erhöht. Analog zum Beamwalk-Test und mNSS stellte sich ebenso beim Ladder Rung-Test eine Besserung des motorischen Defizits im Laufe des Experiments dar. Die AUC zeigt keinen Unterschied zwischen Kontroll- und Therapiegruppe (p=0,84). 3.7. Ergebnisse der MRT-Messungen Die Magnetresonanztomographie ermöglichte die in vivo Bestimmung der Infarktvolumina und ihre Veränderungen im zeitlichen Verlauf. 3.7.1 Infarktvolumen im Zeitverlauf Die Folgen des Schlaganfalls sind in den T2-gewichteten MRT- Sequenzen von Kontroll- und Therapiegruppe gut erkennbar. Die zerebrale, kortikal lokalisierte Läsion war durch ein hyperintenses Areal in der rechten Hemisphäre gekennzeichnet. Außerdem konnte eine Verkleinerung des ipsilateralen Seitenventrikels und eine Mittellinienverlagerung beobachtet werden. Der Infarkt wurde an den Tagen 2, 8, 29 und 85 gemessen. Das Volumen betrug einen Tag nach dem Schlaganfall 223,2±47,4mm³ in der Therapiegruppe und 222,7±30,5mm³ in der Kontrollgruppe. Am 8. und 29. Tag post operationem verringerte sich das Infarktvolumen zunehmend (siehe Tabelle 14). Dies kann mit dem Rückgang des Hirnödems erklärt werden. Am 85. Tag konnte in beiden Gruppen eine Zunahme des Infarktvolumens beobachtet werden. Hier verschmolz das Infarktareal mit dem ipsilateralen Seitenventrikel. Dieser war zur Läsion hin verlagert und ausgeweitet. 46 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Abbildung 18: Infarktorganisation im Zeitverlauf Der Infarkt kommt als ein hyperintenses Areal zur Darstellung. Am ersten Tag nach dem Schlaganfall zeigen sich weiterhin eine Mittellinienverlagerung und eine Ödemzone. Diese bilden sich mit der Zeit langsam zurück, wodurch es zu einer Reduktion des Infarktvolumens kommt. Bildquelle: Wagner (87). 3.7.2 Infarktvolumina im Gruppenvergleich In der folgenden Tabelle sind die durchschnittlichen Infarktvolumina der MRTUntersuchungen mit den Standardabweichungen der Kontroll- und Therapiegruppen angegeben. Tabelle 14: Infarktvolumina der Kontroll- und Therapietiere in mm³ Kontrollgruppe Therapiegruppe Tag 2 223,2 ± 47,4 222,7 ± 30,5 Tag 8 127,6 ± 26,5 127,4 ± 33,2 Tag 29 103,8 ± 37,3 107,3 ± 24,5 Tag 85 123,6 ± 45,1 129,2 ± 30,5 Darstellung der Infarktgröße an den Tagen 2, 8, 29 und 85. Die Daten sind als Mittelwerte mit Standardabweichung in mm³ angegeben. Abbildung 19: Hirnödem (eSOE) und das ödem-korrigierte Läsionsvolumen (eVLäsion) Graphische Darstellung des ödem-korrigierten Infarktvolumens (A) und des Hirnödems (B) im Gruppenvergleich. Die Berechnung erfolgte mit der Formel nach Gerriets (siehe Kapitel 2.11.2.). Es 47 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. konnte zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen Kontroll- und Therapiegruppe festgestellt werden. Die statistische Analyse zeigt eine gleichmäßige Verteilung der Infarktvolumina beider Gruppen an allen Messtagen. Das Ausmaß der Verringerung war in den Therapietieren nicht signifikant ausgeprägter als in den Kontrolltieren. Zudem zeigten sowohl das Hirnödem als auch das ödem-korrigierte Infarktvolumen der Tiere keinen Gruppenunterschied. 48 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 4. Diskussion Diese Studie untersuchte die therapeutische Wirksamkeit von frisch isolierten Fettgewebszellen (ADC) nach einem akuten Schlaganfall. ADC wurden bereits in präklinischen Studien zur experimentellen Behandlung des Herzinfarktes oder der Nierenischämie erfolgreich eingesetzt (62) . Die vorliegende Studie ist die erste Untersuchung, die Zellen aus dem Fettgewebe für die akute Schlaganfalltherapie verwendet. Die Isolationsmethode zur Gewinnung der ADC konnte reproduzierbar auf die SHR übertragen werden (siehe Kapitel 3.1.). Syngene ADC konnten 24 Stunden nach dem Schlaganfall transplantiert werden (siehe Kapitel 3.5.). Es wurde auf die Anwendung der empfohlenen Qualitätskriterien geachtet. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass die transplantierten Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht von einer statistisch signifikanten Besserung der neurologischen Defizite oder des Infarktvolumens profitierten. Ein anderer Effekt der Zelltransplantation liegt nicht vor, es handelt sich insgesamt um einen Neutralbefund. 4.1. Methodendiskussion 4.1.1 Tierwahl SHR haben sich als Versuchstiere für die Erforschung diverser Krankheiten, wie z.B. Herzerkrankungen, Hypertonie und Nephropathie, bewährt (62) . SHR werden normotensiv geboren und entwickeln im Verlauf des frühen Erwachsenenalters einen arteriellen Bluthochdruck (88). Zudem weisen sie eine Insulinresistenz und eine Glukoseintoleranz, sowie eine Hyperglykämie und erhöhte Werte für Fettsäuren im Plasma auf (70) . Diese Befundkonstellation gleicht dem Risikoprofil eines Schlaganfallpatienten. Die zerebralen Gefäße der SHR zeigen eine geringere Anastomosierung (89) als die normotensiven Wistar- Kyoto-Ratten, die vorhandenen Anastomosen weisen zudem einen kleineren Durchmesser auf. Im Fall einer Okklusion eines großen Hirngefäßes ist folglich eine alternative Blutversorgung des betroffenen Gewebes durch Kollateralgefäße deutlich reduziert (69) . Diese Eigenschaften der SHR sind unter anderem für das stärker ausgeprägte neurologische Defizit und gut reproduzierbare Infarktgrößen und –modalitäten nach einem experimentellen Schlaganfall verantwortlich (73). SHR sind Inzuchttiere und eignen sich daher für die Simulation einer autologen Therapie durch einen syngenen Transplantationsansatz. Im Vergleich zu normotensiven Ratten, weisen 49 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. SHR zusätzlich ein verändertes Immunsystem auf. SHR zeigen eine gesteigerte Sekretion inflammatorischer Zytokine und entzündliche Infiltrate in der Niere. Dies könnte unter anderem durch eine signifikante Herunterregulierung des ABC (engl. ATP-binding-cassette)Proteins ABCB1verursacht sein (90). Darüber hinaus leiden SHR an einer Thymusatrophie und einem Mangel an T-Lymphozyten (91) . Die Auswirkung dieser immunologischen Veränderungen auf den Heilungsprozess nach einem Schlaganfall oder auf die therapeutische Wirksamkeit von transplantierten Zellen wurde bisher nicht untersucht. Es ist jedoch denkbar, dass der veränderte Immunstatus der Versuchstiere einen Einfluss auf die therapeutische Wirksamkeit von Zellen nach dem Schlaganfall haben könnte. 4.1.2 Verhaltenstests Im vorliegenden Experiment wurden funktionelle Verhaltenstests als primäre Surrogatmarker für die therapeutische Wirksamkeit der ADC verwendet. Sie erlaubten die neurofunktionelle Überwachung der Versuchstiere während des gesamten Experimentss. Die Prüfung sensomotorischer Defizite in adulten Nagern nach zerebralen Läsionen ist seit langem eine etablierte Methode und kann durch eine Vielzahl von Tests umgesetzt werden (92) . In diesem Experiment wurden der Beamwalk-Test, der mNSS und der Ladder Rung-Test durchgeführt. Der Beamwalk-Test ermittelt über die Balanciergeschwindigkeit der Versuchstiere ein Surrogat aus verschiedenen neurologischen Fähigkeiten. Neben dem Gleichgewichtssinn determinieren vor allem sensomotorische Fähigkeiten das Beamwalk-Ergebnis (81; 82; 92). Nach einer permanenten MCAO kommt es, ähnlich wie nach einem Mediainfarkt eines Schlaganfallpatienten, zu einer Hemiparese in der dem Infarkt gegenüberliegenden Körperhälfte (78; 79) . Die Forschungspraxis zeigt, dass dieses neurologische Defizit mit dem Beamwalk-Test verlässlich detektiert werden kann (92). In der vorliegenden Studie zeigten die Tiere nach der Auslösung des experimentellen Schlaganfalls eine deutliche Zunahme der Beamwalk-Kategorien als Ausdruck der neurologischen Schädigung. Die wiederholte Durchführung des Beamwalk-Testes über einen längeren Zeitraum erlaubt darüber hinaus auch die Messung von chronischen Veränderungen und regenerativen Effekten. Ein Nachteil des Beamwalk-Tests ist die Modifizierung des Ergebnisses durch nicht beeinflussbare Faktoren, wie die Interaktion von Untersucher und Versuchstier. Zudem muss berücksichtigt werden, dass bestimmte Veränderungen nach einem Schlaganfall, wie beispielsweise Depressionen, Auswirkungen auf das Laufverhalten der Tiere haben könnten (93). 50 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Der mNSS setzt sich aus mehreren Teiluntersuchungen zusammen (siehe Kapitel 2.10.2.). Er umfasst sowohl motorische und sensorische Untersuchungen, als auch die Prüfung verschiedener Reflexe (51; 94) . Der mNSS ermöglicht somit die Prüfung verschiedener neurologischer Funktionseinheiten. Diese Methode besitzt forschungsökonomische Vorteile, denn das Verfahren ist einfach durchzuführen und wenig zeitaufwendig. Im aktuellen Versuch konnte mit dem mNS-Score eine Verschlechterung des neurologischen Status der Ratte nach der Induktion des Schlaganfalls nachgewiesen und der Verlauf dieser Defizite beobachtet werden. Der Nachteil dieses Tests ergibt sich daraus, dass am Ende der Untersuchung nur die Gesamtpunktzahl in die Bewertung einfloss. Somit konnten neurologische Defekte aufgrund zerebraler Läsionen in einem Teil der Untersuchung durch gute Leistungen in einem anderen Teil kompensiert und somit verdeckt werden. Zudem erfordert dieser Test erfahrene Experimentatoren. Es bedarf eines geschulten Untersuchers, um die neurologischen Defizite mit dem Test zu diagnostizieren. Beim Ladder Rung-Test muss das Versuchstier über eine horizontale Leiter laufen (siehe Kapitel 2.10.3.). Somit sollen die Laufgeschicklichkeit, die Körperstellung und die Koordination beurteilt werden. Durch die separate Beobachtung aller vier Extremitäten können Asymmetrien in einer der Extremitäten spezifisch erkannt werden. Die Variation der Sprossen vermeidet dabei einen Lerneffekt der Versuchstiere. Somit kann das sensomotorische Defizit frei von möglicherweise überlagernden Lerneffekten erhoben werden. Der Ladder Rung-Test ist sehr sensitiv für die Detektion von motorischen Beeinträchtigungen bei Nagern. Das Laufverhalten dieses Testes entspricht dem gewöhnlichen Laufverhalten der Ratten. Folglich müssen die Tiere für diese Untersuchung nicht vorher trainiert werden (83) . Der Ladder Rung-Test ist jedoch in der Durchführung und Auswertung sehr zeitintensiv. Zudem bedarf es der Schulung des Untersuchers, um den Einsatz der Pfoten sicher zu beurteilen. Dennoch war in dieser Studie der Ladder Rung-Test geeignet, um das neurologische Defizit der Ratten zu detektieren. Die digitale Aufnahme der Untersuchung ermöglichte eine sichere Auswertung der Resultate. Die Ergebnisse konnten auf diese Weise dokumentiert und die Daten gesichert werden. Die Aufnahmen konnten von mehreren Investigatoren ausgewertet werden. Somit erlaubte der Ladder Rung-Test die wiederholte Analyse zur Kompensation von „Inter-observer Effekten“. In der aktuellen Studie wurde mittels der Kombination unterschiedlicher Verhaltenstest versucht, die vielfältigen Ausfälle des Schlaganfalls zu erkennen. Für eine erfolgreiche Evaluierung neurologischer Funktionen ist 51 eine Kombination aus verschiedenen Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Verhaltenstests von großer Bedeutung (54; 94) . So soll versucht werden, das große Spektrum sensomotorischer Ausfälle so gut wie möglich zu erfassen. Insgesamt zeigten alle drei Tests ein neurologisches Defizit nach der Auslösung der MCAO. Zudem konnte keiner dieser Verhaltensversuche eine eindeutige therapeutische Wirkung der ADC ermitteln. 4.1.3 Magnetresonanztomographie Im aktuellen Versuch wurde die MRT als bildgebende Diagnostik in Ergänzung zu den Verhaltenstests zur Untersuchung der Therapieeffizienz der ADC eingesetzt. Die Bildgebung des Schlaganfalls mittels MRT oder CT hat sich mittlerweile als ein wertvolles Verfahren erwiesen. Sie kann sowohl zur initialen Diagnose des Schlaganfalls als auch zur Unterscheidung von Blutung und Ischämie eingesetzt werden (24) . Insbesondere die MRT ist eine leistungsstarke Methode zur nichtinvasiven Beurteilung von ischämischem Hirngewebe. In der Schlaganfallforschung werden die Eigenschaften der MRT und die Möglichkeit der Kontrastmittelgabe genutzt, um zerebrovaskuläre Veränderungen im Gehirn nachzuweisen. Somit können unter anderem der zerebrale Blutfluss, die mikrovaskulären Besonderheiten des Gehirns, sowie das Hirnvolumen beurteilt werden (95) . In präklinischen Studien ermöglicht die MRT die wiederholte Messung von Infarktvolumen, Hirnödem und Hirnatrophie lädierter Versuchstiere. Die Bestimmung des Läsionsvolumens erfolgte bisher häufig post-mortem durch die Verwendung einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TCC)Färbung, was eine Verlaufsbeobachtung ausschließt. Das Hirnödem wird traditionell durch die, ebenfalls post-mortale Bestimmung des hemisphäriellen Wassergehalts bestimmt. Die Verwendung der MRT erlaubt dagegen die wiederholte, nichtinvasive Bestimmung dieser Parameter. Die MRT zeigt sich in der Darstellung der Infarktgröße gleichwertig im Vergleich zu histologischen Methoden (86; 96) . Zudem kann mit der MRT schneller eine Läsionsvolumenbestimmung durchgeführt werden, da die arbeitsaufwendigen Schritte, wie Hirnentnahme, Anfertigen von Hirnschnitten sowie Färbung und Digitalisierung entfallen. Mit den T2-Sequenzen der MRT liegt direkt eine digitalisierte Bildserie mit klarer Demarkation der Läsion vor. Ein weiterer Vorteil der MRT-Messung gegenüber der TTCFärbung ist, dass das Hirngewebe für andere histologische Fragestellungen verwendet werden kann (97) . Zu einem späteren Zeitpunkt nach einem Schlaganfall ist die Ausbildung einer liquorgefüllten Pseudozyste im Gehirn zu beobachten. Flüssigkeitsabsorption der Nekrose im ischämischen Areal Sie entsteht durch die (98) . Dies kann bei histologischer Bestimmung des Infarktvolumens durch Verzerrung und Gewebeverlust zu einer 52 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Fehlbestimmung führen. Im Rahmen einer MRT-Untersuchung tritt dieses Problem nicht auf, weil das Gehirn und die Pseudozyste durch die Schädelkapsel in Form gehalten werden. Der Nachteil der MRT-Untersuchung ergibt sich aus der obligaten Narkose der Versuchstiere bei jeder Messung. Durch jede Narkose steigt das Risiko der anästhetikaassoziierten Mortalität. Zudem sind weitere unerwünschte Effekte der Narkose, wie beispielsweise eine neuroprotektive Wirkung des Ketamins (99) zu bedenken. 4.2. Therapeutische Wirksamkeit von ADC In der vorliegenden Studie hatte die Behandlung der SH-Ratten mit frisch isolierten syngenen Fettgewebszellen (ADC) nach einem akuten Schlaganfall keine Auswirkung auf die untersuchten Endpunkte. Die durchgeführten Verhaltenstests zeigten zwar eine funktionelle Erholung der Tiere nach dem Schlaganfall, und die MRT Untersuchungen ergaben einen Rückgang des Hirnödems. Diese Entwicklungen sind jedoch unabhängig von der Therapie mit ADC aufgetreten und spiegeln somit höchstwahrscheinlich die normalen Anpassungsund Regenerationsprozesse nach einem Schlaganfall wider. Der in dieser Studie erhobene Neutralbefund muss jedoch nicht bedeuten, dass ADC grundsätzlich nicht für die Behandlung des Schlaganfalls geeignet sind. Neben den eingesetzten Methoden (siehe Kapitel 2.10., 2.11.) könnten spezifische Modalitäten des therapeutischen Ansatzes, wie Transplantationsweg und -zeitpunkt, für das neutrale Resultat verantwortlich sein. Die potentiellen therapeutischen Wirkungsmechanismen und wichtige Modalitäten des therapeutischen Regimes sollen daher in den nächsten Abschnitten intensiver diskutiert werden. 4.2.1 Eignung von ADC für die akute Schlaganfallbehandlung ADC wurden bisher erfolgreich in präklinischen Studien zur Behandlung des Herzinfarktes und der Nierenischämie eingesetzt. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Transplantation von ADC nach einem experimentellen Myokardinfarkt zu einer Besserung der Ejektionsfraktion des Herzens führt. Diese funktionelle Verbesserung wurde dabei wahrscheinlich durch eine vermehrte Kapillarisierung des betroffenen Herzmuskelgewebes verursacht (62) . Die Transplantation von ADC nach experimenteller Nierenischämie zeigte ebenfalls signifikante therapeutische Effekte: Sowohl die Mortalität, als auch das Serumkreatinin der transplantierten Tiere war deutlich niedriger als in der Kontrollgruppe (64). 53 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Das Ziel der aktuellen Studie bestand darin, ADC in einem klinisch relevanten Zeitfenster von 24 Stunden nach dem Schlaganfall zur Behandlung des ischämischen Schlaganfalls einzusetzen. Dieses Therapiekonzept wurde bislang erfolgreich mit BM MNC in verschiedenen präklinischen Studien der zerebralen Ischämie umgesetzt (100) . BM MNC konnten in einem Zeitraum von drei Stunden isoliert und wieder transplantiert werden. Das Ergebnis der Zelltherapie mit BM MNC wies eine Reduktion des Infarktvolumens, eine schnellere Erholung der Versuchstiere und die Verringerung von Entzündungszellen auf. Der genaue Wirkungsmechanismus der BM MNC ist jedoch noch weitestgehend unbekannt und wird kontrovers diskutiert (54) . MSC, die in BM MNC enthalten sind, könnten hierbei eine entscheidende Rolle spielen. MSC können unter anderem in Knochen- und Knorpelgewebe, (39) sowie in Fettgewebe, Muskeln und möglicherweise sogar neurale Zellen differenzieren . Weiterhin exprimieren MSC für die Hämatopoese relevante Zytokine und stimulieren körpereigne Reparaturvorgänge wie Angiogenese, Synaptogenese und Neurogenese (13; 39) . In diversen präklinischen Experimenten konnte die therapeutische Wirksamkeit von MSC auf den Heilungsverlauf nach experimentellem Schlaganfall gezeigt werden (13) . Interessanterweise haben verschiedene Untersuchungen ergeben, dass ADC einen bis zu 5000-mal höheren MSC-Anteil aufweisen als BM MNC (60; 101). Basierend auf der Hypothese, dass MSC wichtige Wirkungsvermittler der heterogenen Zellpopulationen BM MNC und ADC sind, wären ADC folglich die geeigneteren Kandidaten für die Behandlung eines Schlaganfalls. Diese Vermutung wird durch eine aktuelle Studie gestützt, die die therapeutische Überlegenheit von MSC aus dem Fettgewebe gegenüber denen aus dem Knochenmark beschreibt (102). Zusätzlich zu den MSC vermittelt die heterogene ADC-Population weitere Effekte, die zu einer Besserung des neurologischen Schadens nach einem Schlaganfall führen könnten. So produzieren ADC verschiedene Zytokine, inklusive VEGF, G-CSF, Hepatocyte Growth Factor (HGF) und das Insuline-like Growth Factor 1 (IGF1) (40) . Diese Faktoren wirken sich günstig auf den Immunprozess nach dem Schlaganfall aus. VEGF ist in der Lage, die Vaskulogenese in Ischämien und Karotisverletzungen zu fördern haben einen neuroprotektiven Effekt (103; 104) . HGF und das IGF1 (105; 106) . G-CSF zeigt in diversen Studien eine Reduzierung des Infarktvolumens, wahrscheinlich durch die Mobilisierung hämatopoetischer Zellen, durch die antiapoptotische und antiinflammatorische Wirkung, sowie die neuronale Differenzierungsfähigkeit (107). 54 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. ADC enthalten weiterhin einen großen Anteil von Gewebsmakrophagen, die den sogenannten anti-entzündlichen M2-Phänotyp aufweisen (108). Diese M2- Makrophagen zeichnen sich unter anderem durch die Sekretion der anti-entzündlichen Zytokine IL-10 und IL-1-RezeptorAntagonisten aus und könnten so einen protektiven Einfluss nach Schlaganfall vermitteln (109). Obwohl sich aus den vorliegenden Befunden zumindest vergleichbare, und teilweise sogar überlegene Eigenschaften der ADC gegenüber den BM MNC ergeben, konnte dennoch in der vorliegenden Studie keine therapeutische Wirksamkeit der ADC nach einem experimentellen Schlaganfall nachgewiesen werden. Möglicherweise müssen spezifische Behandlungsmodalitäten wie Transplantationsroute und Transplantationszeitpunkt modifiziert werden, um die günstigen Eigenschaften der ADC auf den ischämischen Schlaganfall zu übertragen. 4.2.2 Transplantationsroute Therapeutisch wirksame Zellen können über unterschiedliche Routen appliziert werden; zu den am häufigsten verwendeten Methoden gehören die intravenöse und die intraarterielle Transplantation. Im aktuellen Versuch wurde der intravenöse Weg gewählt, da dieser Ansatz in einer möglichen klinischen Anwendung einfach und komplikationsarm durchgeführt werden kann (110) . Die intravenöse Transplantation hat weiterhin den Vorteil, dass die transplantierten Zellen im gesamten Körper wirksam werden können; hierbei spielen insbesondere immunmodulierende Effekte im peripheren Blut und in lymphatischen Organen eine wichtige Rolle (111-113) . Allerdings neigen intravenös transplantierte Zellen dazu, in der Lunge, Leber und Milz „abgefangen“ zu werden (114). Schrepfer et al. (2007) untersuchten die Organverteilung von intravenös transplantierten MSC und konnten zeigen, dass MSC aufgrund ihrer Zellgröße in den Lungenkapillaren abgefangen werden. Somit können intravenös applizierte MSC pulmonale und hämodynamische Veränderungen verursachen (115) . Zudem erreicht nur ein geringer Anteil intravenös applizierter Zellen den Läsionsort. Folglich ist eine erhöhte Transplantationsdosis erforderlich, um diesen Verlust auszugleichen (114) . Dieser First-Pass Effekt könnte also ebenso zu einem unzureichenden Effekt der ADC in der vorliegenden Studie geführt haben. Auf der anderen Seite wird diskutiert, dass der FirstPass-Effekt möglicherweise eher ein Problem kultivierter Zellen ist; die Lungenpassage von frisch isolierten mononukleären Knochenmarkszellen (BM MNC) war fast 30mal höher als die von kultivierten MSC (116) . Obwohl bisher keine Studien zu diesem Thema veröffentlicht wurden, trifft dies möglicherweise auch auf frisch isolierte ADC zu. 55 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Der intraarterielle Transplantationsweg kann im Vergleich zum intravenösen Weg den initialen Filtereffekt durch die Lunge umgehen. Somit können größere Mengen der transplantierten Zellen direkt an den Läsionsort gelangen. Gleichzeitig kann es nach einer arteriellen Transplantation von Zellen zu einer Reduktion des zerebralen Blutflusses mit disseminierten Hirnischämien kommen (114) . Zudem wird möglicherweise das therapeutisch bedeutsame periphere Immunsystem durch eine intraarterielle Transplantation umgangen. Die nach Schlaganfall therapeutisch wirksamen BM MNC wurden bisher sowohl intraarteriell (54; 117) , als auch intravenös (118) transplantiert. Eine eindeutig günstigere Transplantationsroute konnte hierbei jedoch nicht ermittelt werden. Zusammenfassend kann davon ausgegangen werden, dass die Wahl des intravenösen Transplantationsweges für die frisch isolierten ADC keinen wesentlichen Grund für den ausbleibenden Therapieeffekt darstellt. Die in der Zusammensetzung und Zellgröße vergleichbare Zellpopulation der BM MNC wurde kürzlich sogar in einer klinischen Schlaganfallstudie intravenös transplantiert und haben dabei die erforderlichen Kriterien „Safety and Feasibility“ erfüllt (110). 4.2.3 Transplantationszeitpunkt Entsprechend des Leitsatzes „time is brain“ spielt der Beginn einer Therapie eine signifikante Rolle für den weiteren Heilungsverlauf des Schlaganfallpatienten. Das eingeschränkte thrombolytische Zeitfenster von 4,5 Stunden stellt nach wie vor eines der Hauptprobleme der Schlaganfalltherapie dar vorgenommen (119) . Danach wird nur in speziellen Fällen eine Thrombolyse (120) . Dabei besteht immer die Gefahr einer Blutung und stellt somit ein hohes Risiko für den Patienten dar (21) . Einige präklinische Studien zeigten jedoch, dass das Therapiezeitfenster des Schlaganfalls prinzipiell erweitert werden kann. In unterschiedlichen Studien mit BM MNC wurden die Zellen 3-72 Stunden nach MCAO transplantiert und zeigten auch für den spätesten Zeitpunkt eine therapeutische Wirksamkeit (100) . In der vorliegenden Studie wurde der Zeitpunkt 24 Stunden nach dem Schlaganfall als Therapiezeitpunkt gewählt; dieser Zeitpunkt liegt einerseits weit außerhalb des bisher etablierten Therapiezeitfensters von 4,5 Stunden, und würde weiterhin die entsprechenden logistischen Schritte für eine Zelltransplantation, also die Gewebeentnahme und Aufreinigung ermöglichen. Auf der anderen Seite ist der Transplantationszeitpunkt im Vergleich zu den präklinischen BM MNC-Studien (100) vergleichsweise früh gewählt. Die Diskussion über das optimale therapeutische Zeitfenster für Zelltransplantationen ist schwierig, da wesentliche Einflussfaktoren nach wie vor ungeklärt sind: so ist von 56 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. entscheidender Bedeutung, ob die transplantierten Zellen im Organismus persistieren, also eine therapeutische Wirksamkeit ab dem Zeitpunkt der Transplantation vermitteln können. In diesem Fall würde das Paradigma „so früh wie möglich“ gelten, da alle sukzessiv ablaufenden pathophysiologischen Mechanismen adressiert werden könnten. Zeigen die Zellen jedoch nur eine begrenzte Überlebenszeit im Organismus, wie bereits aus verschiedenen BM MNCStudien berichtet wurde (54; 118) , so ist es notwendig, den Transplantationszeitpunkt genau auf den adressierten Wirkungsmechanismus anzupassen. Zu einem ähnlichen Ergebnis kommt auch eine Studie aus dem Bereich der kardialen Ischämie, die das Absterben der transplantierten Zellen an sich als den therapeutischen Effektor beschreibt (121) . Zukünftige Studien sollten also vor allem das Verteilungsmuster der transplantierten ADC und deren Überlebenszeiten untersuchen. Weiterhin würde die genaue Kenntnis der zugrundeliegenden Wirkungsmechanismen die Definition des besten Transplantationszeitraumes erleichtern. In den bisher publizierten Studien zur therapeutischen Wirksamkeit von frisch isolierten ADC in Modellen der renalen und kardialen Ischämie wurden die Zellen innerhalb einer halben Stunde nach Ischämie transplantiert. Möglicherweise ist der in der vorliegenden Studie gewählte Zeitpunkt also zu spät; weitere Schlaganfallstudien wurden daher so geplant, dass die Wirksamkeit von frisch isolierten ADC innerhalb eines kürzeren Zeitfensters untersucht werden konnte (siehe Kapitel 4.5.). 4.3. Studienqualität In der vorliegenden Studie wurde nach den aktuellen Forschungsempfehlungen des STAIRKomitees gearbeitet (siehe Kapitel 2.2.). Diese sollten die Umsetzung präklinischer Studien in klinische Studien erleichtern (siehe Kapitel 1.4.). Die Einhaltung solcher Kriterien könnte jedoch den ausbleibenden Effekt der ADC erklären. O’Collins et al. stellten im Jahr 2006 in einer Metaanalyse über 1026 Neuroprotektiva einen inversen Zusammenhang zwischen der Realisierung der STAIR-Kriterien und der Therapiewirksamkeit fest. Die Analyse berichtete über eine reduzierte Effektivität präklinischer Experimente bei der Anwendung von Methodenempfehlungen (33). In der Schlaganfallforschung gibt es beispielsweise mehr als 550 Neuroprotektiva, die in Tiermodellen erfolgreich erprobt wurden. Lediglich fünf von diesen 550 Therapien erfüllten die STAIR- Kriterien (68) . Tatsächlich hat sich keiner dieser 550 Wirkstoffe in einer klinischen Studie als wirksam erwiesen. In der tierexperimentellen Forschung der Notfallmedizin wiesen Publikationen ohne Randomisierung und Verblindung dreifach häufiger positive Ergebnisse auf, als Publikationen, die diese Methoden angeben (122). 57 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Ähnliches wurde in einer wissenschaftlichen Arbeit über die Hypothermie bei akutem, ischämischem Schlaganfall gemacht. Hier ergab sich eine inverse Beziehung zwischen der Effektivität der untersuchten Therapie und der Studienqualität. Die gleiche Studie stellte eine Überschätzung des Effekts der Infarktvolumenreduzierung in tierexperimentellen Studien fest, die keine Randomisierung und Verblindung angaben (122) . Ein positiver Effekt der Zelltherapie nach einem akuten Schlaganfall wurde 2010 von Brenneman et al. verzeichnet (siehe Kapitel 4.2.). In dieser Arbeit über die BM MNC wurden jedoch keine Angaben über die Durchführung von Qualitätskriterien gemacht (54) . Insgesamt führt ein hohes Qualitätsniveau bei der Durchführung einer Studie zu einer hohen Prädiktiviät der Ergebnisse dieser Studie. Zudem muss festgehalten werden, dass präklinische Studien mit negativen oder neutralen Ergebnissen eher unveröffentlicht bleiben, als positive klinische Studien. Somit entsteht der Eindruck, dass die meisten präklinischen Studien positive Resultate aufweisen (122) . Die Ergebnisse der vorliegenden Studie unterliegen aufgrund der strengen Anwendung von Qualitätskriterien weniger wahrscheinlich einem Fehler. 4.4. Beantwortung der Fragen an die Arbeit Mit Hilfe der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können die zu Beginn der Dissertation gestellten Fragen eindeutig beantwortet werden. Im Rahmen des Pilotversuchs wurde die Durchführbarkeit der Isolierungsmethode einer heterogenen Zellpopulation aus dem Fettgewebe von SHR untersucht. Sowohl im Vor- als auch im Hauptversuch konnten reproduzierbare Ergebnisse bezüglich Zellquantität und qualität erreicht werden. Folglich wurde gezeigt, dass eine heterogene Zellpopulation erfolgreich aus dem Fettgewebe der Ratten gewonnen werden kann. Die Frage nach dem Stammzellanteil dieser Zellpopulation wurde durch die reproduzierbar positiven Ergebnisse der CFU-Analyse bestätigt. Die CFU-F-Frequenzen wiesen mit Werten aus Untersuchungen mit anderen Rattenstämmen vergleichbare Resultate auf. Im Hauptversuch wurde neben der Durchführbarkeit der Transplantation besonders die Wirksamkeit der ADC überprüft. Durch die komplikationslose Injektion der Zellen konnte bei der Transplantation von einer erfolgreichen Durchführung ausgegangen werden. Die Ergebnisse der Verhaltenstests und der MRT-Untersuchungen zeigten jedoch keine Unterschiede zwischen Kontroll- und Therapietieren. Folglich konnte durch die syngene Transplantation von ADC 24 ± 3 Stunden nach einem experimentellen Schlaganfall keine therapeutische Wirksamkeit erzielt werden. 58 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. 4.5. Ausblick Trotz der vorher beschriebenen, therapeutischen Einflüsse der ADC bei kardialen und renalen Ischämien (siehe Kapitel 1.3.) konnte eine Wirkung der ADC im vorliegenden Experiment nicht nachgewiesen werden. Die aktuelle Studie wurde streng nach den Vorgaben der STAIRKriterien konzipiert und durchgeführt (siehe Kapitel 1.4.). Obwohl diese Versuchsbedingungen für eine erfolgreiche Umsetzung präklinischer Studien in klinische Studien empfohlen werden, liegt eine mögliche Ursache der erzielten Ergebnisse gerade in der strengen Einhaltung dieses Versuchsregimes. In einer intern durchgeführten Folgeuntersuchung wurde die Wirkung der ADC nochmals, jedoch unter anderen Konditionen, getestet. Zwar waren diese Versuche nicht explizit Bestandteil dieser Arbeit, sie erlauben aber einen interessanten Einblick in den möglichen therapeutischen Wirkmechanismus der ADC und sollten daher kurz geschildert werden. Anstelle der MCAO wurde das „three-vessel-occlusion“ Model verwendet (123). Hierbei wird ebenfalls die mittlere Zerebralarterie permanent verschlossen. Gleichzeitig werden beide Hauptschlagadern transient ligiert und durch die Wiederöffnung nach 90 Minuten eine Reperfusion des Gehirns ermöglicht. Des Weiteren wurden nicht mehr prämorbide SHR, sondern gesunde WistarKyoto-Ratten eingesetzt, welche deutlich weniger Kapillarschäden aufweisen und damit eine bessere kollaterale Versorgung des Infarktgebietes erwarten lassen. Die Zelltransplantation der Nachfolgestudie erfolgte bereits 15min nach dem experimentell induzierten Schlaganfall. Im aktuellen Versuch wurde hingegen 24 Stunden nach Apoplex transplantiert (siehe Kapitel 2.9.). Zudem betrug die Transplantationsdosis der Folgeuntersuchungen 16x106 Zellen pro kg KG, während im Hauptversuch eine Dosis von 4x106 Zellen pro kg KG zum Einsatz kam (siehe Kapitel 2.9.). Die Folgestudie unter den so modifizierten Bedingungen führte zwar nicht zur Änderung des Infarktvolumens, molekularbiologische Untersuchungen ergaben jedoch starke immunmodulatorische Wirkungen der ADC. Zudem zeigten funktionelle Tests einen signifikanten Unterschied zwischen Therapie- und Kontrolltieren zugunsten der Therapiegruppe. Die Ursache dieser Positivergebnisse liegt möglicherweise in den geänderten Versuchsbedingungen, die eine bessere Entfaltung des Wirkungsmechanismus der ADC zugelassen haben könnten. Dieser ist bislang noch nicht vollständig geklärt und muss besser verstanden werden, bevor weiterführende klinische Testungen erfolgen. Dies stellt ein breites Forschungsfeld dar und aktuell finden weitere Projekte zur Untersuchung der ADC statt. Es muss allerdings festgehalten werden, dass sowohl der Einsatz junger und gesunder 59 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Versuchstiere, sowie die Gabe des Transplantats bereits 15min nach dem Akutereignis eine rein experimentelle Situation darstellen. Dass ähnlich günstige Rahmenbedingungen in der Klinik auftreten, wird die absolute Ausnahme sein. Zukünftige translationale Forschungsvorhaben sollten sich also auch darauf konzentrieren, welche Bedingungen genau zum besseren Wirken der ADC geführt haben und wie solche Vorteile für den alten und komorbiden Patienten, der erst Stunden nach dem Infarkt die Stroke Unit erreicht, eventuell nutzbar gemacht werden können. 60 Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Zusammenfassung Der Schlaganfall gehört trotz intensiven wissenschaftlichen Bemühungen nach wie vor zu einer der häufigsten Todesursachen und ist die Hauptursache von Langzeitbehinderung weltweit. Es konnte sich bisher kein anderes Therapieverfahren als die Lysetherapie mit Alteplase zur Behandlung des akuten Schlaganfalls im Klinikalltag durchsetzen. Dieses ist jedoch mit einem Therapiezeitfenster von 3-4,5 Stunden nach Symptombeginn nur eingeschränkt einsetzbar und zusätzlich mit dem Risiko einer Blutung verbunden. Folglich erhält nur eine geringe Anzahl der Schlaganfallspatienten überhaupt eine Lysetherapie. Gleichzeitig leidet ein Großteil der Bevölkerung an Risikofaktoren, die für einen Schlaganfall prädisponieren. Somit besteht ein dringender Bedarf an neuen Therapieansätzen zur Behandlung des Schlaganfalls. Neben medikamentösen Neuroprotektiva stellt der Einsatz von Stammzellen oder stammzellhaltigen Populationen einen alternativen Therapieansatz dar. Es gibt die Möglichkeit der Transplantation von embryonalen, fetalen oder adulten Stammzellen. Während embryonale und fetale Stammzellpopulationen ethische Probleme hervorbringen, gehen adulte Stammzellen mit einer hohen Morbiditätsrate einher. Im aktuellen Versuch wurde eine heterogene Stammzellpopulation aus dem Fettgewebe eingesetzt. Das Fettgewebe erweist sich aufgrund seiner einfachen Gewinnung und der hohen Verfügbarkeit als eine optimale alternative Stammzellquelle. Zellpopulationen aus dem Fett wurden bisher in unterschiedlichen präklinischen Studien zur Behandlung des akuten Myokardinfarkts und der Nierenischämische eingesetzt. In der Herzinfarktforschung verbesserten sie die Ejektionsfraktion des Herzens. Bei der akuten Nierenischämie reduzierten sie das Serumkreatinin des Patienten. In der aktuellen Studie wurde eine heterogene Stammzellpopulation aus dem Fettgewebe (ADC) 24 Stunden nach einem experimentell ausgelösten ischämischen Schlaganfall in spontan hypertensive Ratten transplantiert. Die pathologischen Veränderungen der spontan hypertensiven Ratte entsprachen dem Risikoprofil eines Schlaganfallpatienten. Die Tiere wurden vor Versuchsbeginn zufällig in eine Therapie- und eine Kontrollgruppe eingeteilt. Die Therapiegruppe wurde mit dem heterogenen Fettzellgemisch behandelt und die Kontrolltiere erhielten eine Pufferlösung. Der klinische Befund der Tiere wurde mit drei unabhängigen Verhaltenstests kontrolliert. Die Tests dienten sowohl der Aufnahme des neurologischen Ausgangsstatus der Tiere, als auch der Beurteilung der motorischen und sensorischen Defizite VI Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. im zeitlichen Verlauf. Gleichzeitig erfolgten magnetresonanztomographische Untersuchungen als bildgebende Diagnostik zur Evaluierung von Infarktvolumen und von eventueller Einblutung. Die unterschiedlichen Untersuchungen zeigten zwar eine Besserung der neurologischen Defizite einige Zeit nach dem Schlaganfall, es bestand jedoch keine statistische signifikante Differenz zwischen Kontroll- und Therapiegruppe. Die Besserung des neurologischen Status ist daher höchstwahrscheinlich auf einen natürlichen Regenerationsprozess nach dem Schlaganfall zurückzuführen. Dennoch kann nicht mit eindeutiger Sicherheit von einem Therapieversagen der ADC ausgegangen werden. ADC weisen eine Reihe von Eigenschaften auf, die sie für eine Therapie des akuten Schlaganfalls prädisponieren. Sie enthalten, ähnlich wie BM MNC, die bereits erfolgreich in präklinischen Experimenten zur Behandlung des akuten Schlaganfalls eingesetzt wurden, eine hohe Zahl an mesenchymalen Stromazellen (MSC). MSC zeigten in diversen präklinischen Studien eine deutliche therapeutische Wirkung nach einem experimentellen Schlaganfall. Zudem enthält die ADC-Population unterschiedliche Wachstumsfaktoren, die ihrerseits einen heilenden Effekt auf die postentzündliche Reaktion nach dem Schlaganfall ausüben. Folglich könnten andere Aspekte, die im Experiment eine Rolle spielten, ebenso für den ausbleibenden therapeutischen Effekt der ADC verantwortlich sein. Die eingesetzten Versuchstiere beispielsweise könnten durch ihren veränderten Immunstatus einen verzögerten Heilungsprozess nach dem Schlaganfall oder eine reduzierte Wirksamkeit der Zelltherapie hervorgerufen haben. Da der genaue Wirkmechanismus der ADC nicht bekannt ist, kann auch der Transplantationszeitpunkt zu einem Wirkungsverlust der Zellen im Körper geführt haben. Gleichzeitig stellt sich die Frage, ob durch den intravenösen Transplantationsweg die Zellen in verschiedenen Organen abgefangen wurden und somit den Wirkungsort nicht erreichen konnten. Es müssen weitere Versuche erfolgen, um diese Fragen zu beantworten. Insgesamt wurde im vorliegenden Versuch streng nach aktuellen Forschungsempfehlungen gearbeitet. VII Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Literaturverzeichnis 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Green, A.R., Pharmacological approaches to acute ischaemic stroke: reperfusion certainly, neuroprotection possibly. Br J Pharmacol, 2008. 153 Suppl 1: p. S325-38. Woodruff, T.M., et al., Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Mol Neurodegener, 2011. 6(1): p. 11. Macrez, R., et al., Stroke and the immune system: from pathophysiology to new therapeutic strategies. 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Erklärung auf die eigenständige Abfassung der Arbeit Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeit erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorliegenden Dissertation stehen, und dass die vorliegende Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zwecke einer Promotion vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen benannt, die an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Datum Unterschrift XIII Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Lebenslauf Sapida Safdari Geburtsdatum: 12.12.1983 Geburtsort: Kabul/ Afghanistan Familienstand: ledig Adresse: Fritz- Boehle-Straße 3, 60598 Frankfurt am Main Telefon: 0163 36 19 14 3 E-Mail: [email protected] Schulbildung 08/1990 - 07/1992 Grundschule in Moskau, Russland 08/1992 - 07/1995 Hans-Memling-Grundschule, Seligenstadt 08/1995 - 07/1999 Heinrich-Mann-Gymnasium, Dietzenbach 08/1999 - 07/2004 Ricarda-Huch-Gymnasium, Dreieich Abschluss: Allgemeine Hochschulreife Studium 10/2004 - 11/2010 Universität Leipzig Studium der Humanmedizin Abschluss: Ärztliche Prüfung Klinische Ausbildung Famulaturen 07/2007 – 08/2007 Abteilung für Allgemein-, Viszeral- und Orthopädische Chirurgie Hospital zum heiligen Geist, Frankfurt am Main 02/2008 – 04/2008 Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe Mulago Hospital, Kampala/ Uganda 07/2008 – 08/2008 Gemeinschaftspraxis Dres. U. und M. Schönauer Allgemeinärztliche Praxis, Leipzig XIV Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Praktisches Jahr 08/2009 – 10/2009 Abteilung für Innere Medizin Hôpital de Morges, Schweiz 12/2009 – 04/2010 Abteilung für Viszeral- und Unfallchirurgie Ev. Diakonissenkrankenhaus Leipzig 04/2010 – 05/2010 Abteilung für Radiologie University of California San Diego/ USA 05/2010- 07/2010 Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin Universitätsklinikum Leipzig Facharztausbildung 03/2011- 02/2012 Tätigkeit als Ärztin in Weiterbildung in der Radiologie Sächsisches Krankenhaus Altscherbitz, Schkeuditz Ab März 2012 Tätigkeit als Ärztin in Weiterbildung in der Radiologie St. Marienkrankenhaus, Frankfurt am Main Nebentätigkeiten 01/2008 - 01/2009 Abteilung für Rhythmologie im Herzzentrum Leipzig Tätigkeit als studentische Hilfskraft beim „Kompetenznetz Vorhofflimmern“ 07/2008 - 06/2009 Abteilung für Gynäkologie im St. Elisabeth- Krankenhaus Leipzig Tätigkeit als studentische Hilfskraft im OP- Saal Zusatzkenntnisse Sprachen Persisch fließend, Deutsch fließend, Französisch Grundkenntnisse EDV-Kenntnisse Word, Excel, PowerPoint, SigmaPlot XV Englisch fließend, Error! Use the Home tab to apply Überschrift 1 to the text that you want to appear here. Danksagungen Zunächst danke ich Prof. Emmrich und der ganzen AG- Boltze für die Ermöglichung dieser Doktorarbeit. Insbesondere gilt der Dank meinen Betreuern Johannes Boltze und Daniel Wagner, die mit viel Geduld und einer intensiven Betreuung stets an meiner Seite standen. Ohne ihre wiederholte Ermutigung und außerordentlichen Unterstützung hätte ich diese Arbeit nicht beenden können. Meiner guten Freundin Marlene Lorenz danke ich für die großartige Hilfe in allen Arbeitsphasen und Lebenslagen. Ihre Hilfsbereitschaft, Selbstlosigkeit und Fairness bewundere ich sehr und sehe sie als Vorbild für mein eigenes Leben. Ein besonderer Dank gilt meinem guten Freund Maik Zedler, der nie müde wurde mich zu ermutigen und auf dessen bedingungslose Hilfsbereitschaft ich immer zählen konnte und kann. Weiterhin gilt mein Dank meinen Gruppenkollegen Julian Taubert und Alexander Kranz, die bei den Versuchsdurchführungen mir sehr viel geholfen haben. Sandra Schindler danke ich für die sprachliche Unterstützung, ganz zu schweigen von ihrem freundschaftlichen und moralischen Beistand über die Jahre. Meiner Familie danke ich für die unendliche und unerschütterliche Liebe. Ohne sie wäre ich nicht da, wo ich bin. XVI
