Serumtests. Vortrag Professor Matthias Ebert

Bluttests - Alternativen zu Stuhltests ?
Matthias P. Ebert
II. Medizinische Klinik und
Roman-Herzog-Krebszentrum
Klinikum rechts der Isar
TU München
Darmkrebsdiagnostik
 Molekulare Stuhltests
 Molekulare Bluttests
Adenom - Karzinom - Sequenz
Nachweis
möglich ?
Knudson’s Doppel Hit Hypothese
Normal
Tumor
Normal
sporadisch
Mutation
Tumor
hereditär
Methylierung
Ebert M and Opitz O, Gastroenterology 2009
Methyl
Methyl
Methyl
Zwei Hauptkomponenten des
epigenetischen Codes
DNA Methylierung
Histonmodifikationen
Histone
aus Qiu, Nature 2006; 441, 143-145
DNA Methylierung und Karzinogenese
DNA Methylierung und Karzinogenese
DNMT
Exon
Exon
Exon
Normal
Exon
Exon
Exon
Tumor
DNMT
Unmethyliertes Cytosin
Methyliertes Cytosin
aus Munten, Am J Pathol 2009
Mutation
Methylierung
Darmkrebsdiagnostik
 Molekulare Stuhltests
 Molekulare Bluttests
Tumor DNA im Blut
●
Tumor DNA ins Blut abgegeben mit
DNA Konzentrationen z.T. < 5 pg/ml
(weniger 2 Genomkopien)
●
Gesunde „Hintergrund“ DNA im Blut
bei etwa 10 ng/ml
Widschwendter M, Clin Cancer Res 2006
Nachweis von Methylierung im Plasma
C. Lofton-Day, Clin Chem 2008
•Fall-Kontroll-Studien: Sept9
Septin9 Test
Design
Patient
Stage
Training/Testing Study
2008
(n = 269)
CE Study 2009
(n = 257)
PRESEPT Study 2010
(n = 1511)
All Studies
case control
case control
prospective
accumulate
d
positive/
tested
% positive
positive/
tested
% positive
positive/
tested
% positive
% positive
I
19 / 41
46
25 / 44
57
8 / 22
36
49
II
60 / 78
77
19 / 22
86
8 / 14
57
76
III
47 / 61
77
17 / 28
61
7 / 12
58
70
IV
7/7
100
8/9
89
4/5
80
90
All
133 / 187
71
69 / 103
67
27/ 53
51
67
Controls
29 / 327
9 (91)
17 / 155
11 (89)
126/1458
9 (91)
9 (91)
Prospective clinical validation of an assay for
methylated Septin 9 DNA in human plasma as a
colorectal cancer screening tool in average risk men
and women 50 years and older
Timothy R. Church, Michael Wandell, Catherine Lofton-Day, Steven J. Mongin,
Brent A. Blumenstein, John I. Allen, Thomas Roesch, Neal Osborn, Dale
Snover, Robert Day, and David F. Ransohoff for the PRESEPT Clinical Study
Steering Committee, Investigators, and Study Team
•PRESEPT: Patienten
•
Anzahl der Studienzentren:
Zentren Deutschland:
Zentren USA:
32
10
22
•
Patienten eingeschlossen:
Ausgeschlossene Patienten (z.B.
7,929
Diagnose unvollständig, Koloskopie
inkomplett, Blutprobe nicht verwendbar):
Zustimmung zurückgezogen:
Diagnose: anderes Malignom:
813
9
6
Verfügbar für molekulare Analyse:
7,107
•
KRK identifiziert:
53
•
Mehr als 2/3 der 53 KRK in frühen Stadien (I und II) und viele
Stadium I Karzinome waren pT1 Tumoren
PRESEPT Studie: Ergebnisse
PRESEPT
100
91
90
– Hohe Rate von frühen
Tumorstadien (ScreeningPopulation)
– Geringe Gesamtzahl von
Tumoren (grosses
Konfidenzintervall)
80
%
70
60
51
50
40
n = 53
n = 1458
30
Sensitivity
• Spezifität 91%
• Sensitivität 51%
Specificity
•Comparison of PRESEPT and Previous Case Control Study Results
Septin9 Test
Design
Patient
Stage
Training/Testing Study
2008
(n = 269)
CE Study 2009
(n = 257)
PRESEPT Study 2010
(n = 1511)
All Studies
case control
case control
prospective
accumulate
d
positive/
tested
% positive
positive/
tested
% positive
positive/
tested
% positive
% positive
I
19 / 41
46
25 / 44
57
8 / 22
36
49
II
60 / 78
77
19 / 22
86
8 / 14
57
76
III
47 / 61
77
17 / 28
61
7 / 12
58
70
IV
7/7
100
8/9
89
4/5
80
90
All
133 / 187
71
69 / 103
67
27/ 53
51
67
Controls
29 / 327
9 (91)
17 / 155
11 (89)
126/1458
9 (91)
9 (91)
PRESEPT Studie:
Schlussfolgerung
•
mSEPT9
Biomarker im Rahmen einer prospektiven Studie erfolgreich validiert
Sensitivität
Spezifität
PRESEPT
(2-PCR replicate)
51% [37.7% – 64.2%]
91% [89.9 – 92.8]
PRESEPT
(3-PCR replicate)
67% [53.8% – 78.8%]
88% [86.8% - 90.1%]
• >50% Sensitivität (entspricht Vorgaben der Amerikanischen Krebsgesellschaft)
• >85-90% Spezifität
Neue Strategie ?
Molekularer Nachweis von Adenomen
Gewebe
tissue factor pathway inhibitor 2
Cancer Res 2009
ALX4 Methylierung im Adenom
Ebert et al, Gastroenterology 2006
ALX4 Methylierung beim KRK: Plasma
100
p<0.0001
80
x102 pg/ml
60
5
4
AUC=0.839
40
3
20
2
0
20
40
60
80
100
1
Sensitivität
Spezifität
0.03 pg/ml
90%
53.3%
41.4 pg/ml
83%
70%
0
Normal
Cancer
(n=30)
(n=30)
Ebert et al, Gastroenterology 2006
ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome
 Polypen: n=49
– > 1cm Polyp mit aIEN n=7
• Tubulovillöses Adenom-2
• Tubulares Adenom-5
– > 1 cm Adenom, ohne aIEN n=9
– < 1 cm Adenom, ohne aIEN n=17
– < 1 cm Adenom, mit aIEN-3
(alle tubulovillös)
– Hyperplastische Polypen n=13
• <1 cm-11
• >1 cm-2
 CRC: n=5
– Stadium I-4
– Stadium III-1
 Negativ: n=22
ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome
Polypen
Zahl der
Proben
SEPT9 2/3
ALX4 2/3
SEPT9 or
ALX4 2/3
SEPT9 +
ALX4 3/6
#
%
#
%
#
%
#
%
> oder = 1 cm
18
3
17
10
55
13$,*
72
12*
67
< 1 cm
31
3
10
13
42
13*
42
12*
39
Hyperplastisch
13
1
8
6
46
6x
46
4x
31
Tubuläres oder
tubulovillöses
Adenom-alle
Grössen
36
5
14
17
47
20§
55
20*
55
Tubuläres oder
tubulovillöses
Adenom, > 1cm
16
3
19
8
50
11§
69
11*
69
Tubuläres oder
tubulovillöses,
>1cm + aIEN
7
1
14
4
57
6§
86
6*
86
Normale
Kontrollen
22
1
4.5
4
18
4
18
2
9
Tanzer et al, Plos One 2010
ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome
Polypen
Zahl der
Proben
SEPT9 2/3
ALX4 2/3
SEPT9 or
ALX4 2/3
SEPT9 +
ALX4 3/6
#
%
#
%
#
%
#
%
> oder = 1 cm
18
3
17
10
55
13$,*
72
12*
67
< 1 cm
31
3
10
13
42
13*
42
12*
39
Hyperplastisch
13
1
8
6
46
6x
46
4x
31
Tubuläres oder
tubulovillöses
Adenom-alle
Grössen
36
5
14
17
47
20§
55
20*
55
Tubuläres oder
tubulovillöses
Adenom, > 1cm
16
3
19
8
50
11§
69
11*
69
Tubuläres oder
tubulovillöses,
>1cm + aIEN
7
1
14
4
57
6§
86
6*
86
Normale
Kontrollen
22
1
4.5
4
18
4
18
2
9
EPITEK - Projekt
Fragestellung
Erlaubt die Bestimmung von epigenetischen
Markern im Blut die Prädiktion von Vorläuferläsionen des
kolorektalen Karzinoms ?
EPITEK – Studie
(Epigenetischer Screening-Test für Kolorektale Adenome)
2000 Vorsorgekoloskopien
mMARKER
Adenome
EPITEK
Epigenomics
Biomarkeridentifizierung
Assay Entwicklung
Marker
Prof. M. Ebert/TUM
Probenaufarbeitung und
-Sammlung
Assays
Study Office
Proben
KVB
Koordination
Gastro-Partner
Dokumentation Befunde
Daten
3 Phasen der EPITEK Studie
Marker
Selektion
20
Marker
EPITEK
Studie
Studie
I
3-4
Marker
2 Marker
2 Marker
2000
Gewebe
300
Blut
40
nach
Darmspiegelung
2009
2010
vor
Darmspiegelung
2011
www.myepitek.de
Bluttests als potente Alternativen zu Stuhltests ?
 Der molekulare Nachweis genetischer und epigenetischer
Veränderungen im Stuhl und Blut ist geeignet
Kolonkarzinome nachzuweisen
 Die meisten Veränderungen wurden bislang in kleinen und
retrospektive Serien untersucht
 Erstmalig Validierung eines Tests in einer prospektiven
Studie (Sept9)
 Wissenschaftliche Studien befassen sich zukünftig mit der
nichtinvasiven Detektion von Vorläuferläsionen (EPITEK)