E. coli

Fraktionierung
Aufreinigung des Grün Fluoreszierenden
Proteins (GFP) aus einem E.-coli-Lysat
durch Säulenchromatographie
1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie
Aufgabe 1: Prüfen Sie ihr Tube mit
dem E.-coli-Lysat im
UV-Feld auf
Fluoreszenz.
Notieren Sie ihre Beobachtungen!
1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie
1.1
Zentrifugieren Sie das Zelllysat 10 min.
bei 13000 rpm.
TE-Puffer
Überstand
1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie
1.2
Schütteln Sie die Säule um das Säulenmaterial zu durchmischen.
1.3
Warten Sie etwa 2 min. bis sich das
Säulenmaterial abgesetzt hat.
1.4
Öffnen Sie die Chromatographiesäule zunächst oben, dann unten.
1. Vorbereitungen zur Chromatographie
1.5
Lassen Sie die Flüssigkeit in der
Säule vollständig heraustropfen.
1.6
Pipettieren Sie 2 ml Ausgleichspuffer
(AP) an der Wand entlang in die
Säule.
1.7
Lassen Sie den Ausgleichspuffer bis
zur 1 ml-Markierung durch die Säule
laufen.
1.8
Verschließen Sie die Säule.
(Unten gelben Verschluss benutzen!)
1. Vorbereitungen zur Säulenchromatographie
1.9
Entnehmen Sie Ihr Tube aus der Zentrifuge.
Aufgabe 2: Prüfen Sie Ihr Tube mit dem zentrifugierten
E. coli-Lysat im UV-Feld auf Fluoreszenz
ohne das Pellet aufzuwirbeln!
Notieren Sie Ihre Beobachtung!
1.10 Pipettieren Sie in Ihr gelbes Tube, das
250 µl Bindepuffer (BP) enthält, 250 µl
Überstand des Bakterienlysats.
2. Durchführung der Säulenchromatographie
2.1
Nummerieren Sie Ihre Sammelröhrchen.
2.2
Öffnen Sie die Chromatographiesäule und lassen Sie die Säule
leer laufen.
2.3
Stecken Sie die Säule auf
Sammelröhrchen 1 um.
2. Durchführung der Säulenchromatographie
2.4
Pipettieren Sie 250 µl des verdünnten Bakterienlysats aus dem
gelben Tube BP an der
Wand entlang in die Säule.
Legen Sie beim Einpipettieren die Spitze
der Pipette an den oberen Rand der
Säule an.
2.5
Lassen Sie die Säule leer laufen.
2. Durchführung der Säulenchromatographie
Aufgabe 3: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule im UVFeld auf GFPFluoreszenz.
Notieren Sie ihre Beobachtungen!
2. Durchführung der Säulenchromatographie
2.6
Stecken Sie die Säule auf
Sammelröhrchen 2 um.
2.7
Pipettieren Sie 250 µl Waschpuffer (WP) an der Wand
entlang in die Säule.
2. Durchführung der Säulenchromatographie
Aufgabe 4: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule im UVFeld auf GFPFluoreszenz.
Notieren Sie ihre Beobachtungen!
2. Durchführung der Säulenchromatographie
2.8
Stecken Sie die Säule um auf das Sammelröhrchen 3.
2.9
Pipettieren Sie 750 µl Elutionspuffer (EL) in die Säule.
Hinweis: Unter Beobachtung der Elution im
UV-Feld kann GFP in hoher
Konzentration fraktioniert werden,
indem die Säule, sobald GFP
austropft, auf ein neues Sammelröhrchen umgesteckt wird.
2. Durchführung der Säulenchromatographie
Aufgabe 5: Prüfen Sie Ihre Chromatographiesäule während
der Elution im UV-Feld
auf GFP-Fluoreszenz.
Notieren Sie ihre Beobachtungen!
Aufbewahrung der Fraktionen bis
zur Reinheitsprüfung
Die Fraktionen in den Sammelröhrchen
werden in entsprechend beschriftete Tubes
umgefüllt und bis zur Reinheitsprüfung
mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei
–18°C aufbewahrt.
3. Reinigung und Aufbewahrung
der Chromatographiesäulen
Reinigung:
Die Säule wird mit 2 ml 70%-tigem Ethanol
nachgespült.
Aufbewahrung:
Die Säule wird mit 2 ml 20%-tigem Ethanol
versetzt und kann so bei Raumtemperatur
aufbewahrt werden.