Ausarbeitung Matthias Ehrhardt Elektrophorese speziell

Ausarbeitung Matthias Ehrhardt
Elektrophorese speziell Gelelektrophorese
Gliederung:
Seite 2 : Elektrophorese allg. , Gelelektrophorese
Seite 3 : Durchführung Gelelektrophorese
Seite 4 : SDS Page
Seite 5 – 7 : kontinuierliche/- diskontinuierliche Page
Seite 8: Gelelektrophorese im Isas
Seite 9 : 2D-Page Beispiel
Elektrophorese
- allg. Wanderung geladener Teilchen z.b DNA, RNA und Proteinen im elektrischen Feld
- Trägerfrei oder auf geeigneten Träger
- Mobilität von geladenen Teilchen (Kraft im elektrischen Feld) proportional zur
Gesamtladung Q und Feldstärke E
-F=Q*E
- Stokische Gleichung beschreibt die Reibung
- F = 6π r η v für kugelförmige Teilchen
- Mobilität also abhängig von Größe Form des Moleküls und Viskosität des Medium
- elektrophoretische Trennung stets in Puffersystemen da unterschiedliche pH –Werter
unterschiedliche Dissoziationsgrade vorweisen Æ stehen stets in großer Abhängigkeit zur
Beweglichkeit
- Detektion der Einzelfraktionen sind verschiedene Anfärbereaktionen gebräuchlich
Gel-Elektrophorese
-generell Träger wie Cellulose oder Celluloseacetatbasis beeinflussen im geringen Maße die
Trennung
- Bei Gel-Elektrophorese, Siebeffekt der auf das Trägermaterial zurückzuführen ist Æ Hohe
Trennschärfe wird erreicht durch gezielte Polymerisation un Quervernetzung Æ GelPräparationen an gewählten Trennvorgang anpassen
- größerer Teilchenradius wirkt sich stärker hemmend auf die Wanderungsgeschwindigkeit
aus, als nur durch die Viskosität allein zu erwarten wäre
- bei elektrophoretischen Auftrennung spielen 3 Eigenschaften der Proteine eine Rolle
Größe: Moleküle wandern wegen des höheren Wiederstandes langsamer durch das Gel
Überstruktur(Faltung): kompakt gefaltete Moleküle mogeln sich schneller durch die engen
Poren als lange Proteinfäden oder zusammengesetzte Moleküle
Ladung: Moleküle mit einer negativen Nettoladung wandern zur Anode(+), Moleküle mit
einer positiven Ladung zur Kathode(-)
Durchführung:
- Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgeführt
- es entsteht Wärme.
- muss abgeführt werden, um optimale Bedingungen zu gewährleisten
- um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, in gekühlten Apparaturen bei konstanten
Temperaturen durchführen
SDS-Page
Gelelektrophorese im Isas
- Mark12 als Standard
- Ablauf : unbekannte Probe mit Proteinen kommt rein Æ Qualifizierung von Proteinen
- Gelelektrophorese SDS-PAGE wird genutzt um Proteine anfangs nach Größe zutrennen
- Problem: Hierbei findet nur eine Eingliederung nach der Größe statt
- Qualitativ sind noch keine Aussagen zutreffen
- Um isomere Proteine zu trennen zu 2d Gelelektrophorese
- Weiterer positiver Effekt beim Gel, Salze sowie andere unerwünschte Detergenzien und
störende Puffersysteme werden beseitigt
- Gel wirkt als großes Molekularsieb
Mark12
Silber angefärbt
-
Coomassie gefärbt
Gele danach mit Skalpell zerschnitten und gewünschte Streifen nach standard operation
protokol für HPLC vorbereitet
-
Hierbei werden die Gelstreifen gewaschen reduziert und alkyliert da bei der SDS-Page
nich zu 100% alle Proteine entfaltet worden sind
Nach der HPLC können dann Qualitative Aussagen getroffen werden über Proteine in der
Probe
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