Molekularbiologischer und kultureller Nachweis von Mycobacterium

“Molekularbiologischer und kultureller Nachweis von
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP)
aus Rinderkot”
Korinna Bulander,
Bulander, H. Schö
Schönenbrü
nenbrücher,
cher, A. Abdulmawjood und M. Bülte
Institut für Tierä
Tierärztliche Nahrungsmittelkunde,
Nahrungsmittelkunde, JustusJustus-LiebigLiebig-Universitä
Universität Gieß
Gießen,
Frankfurter Straß
Straße 92, 35392 Gieß
Gießen
Zusammenfassung
Ergebnisse
Um Paratuberkulose-Prävalenzdaten zu erhalten, ist die Entwicklung eines schnellen und zuverlässigen molekularbasierten Nachweisverfahrens für Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) nötig.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Validierung eines im
Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde entwickelten
Real-Time PCR-Verfahrens (SCHÖNENBRÜCHER et al.,
2006) zum Nachweis von MAP aus Rinderkot.
Die molekularbiologische und kulturelle Untersuchung von 50
Rinderkotproben zeigte, dass die entwickelte TaqMan® RealTime PCR, kombiniert mit einem modifizierten und weiterentwickelten DNA-Extraktionsverfahren einen zuverlässigen
Erregernachweis aus der Matrix Rinderkot ermöglicht.
Von den 50 Rinderkotproben erwiesen sich 29 Proben
mikroskopisch, kulturell und molekularbiologisch als negativ.
Unter den 21 kulturell positiven Kotproben konnten 18
Proben auch mit der Real-Time PCR bestätigt werden. In
dem Kollektiv befanden sich 5 Tiere, die den Erreger nur in
geringen Konzentrationen ausschieden. Davon konnten erst
nach Modifizierung des DNA-Extraktionsverfahren zwei der
Tiere auch molekularbiologisch positiv detektiert werden. Bei
einem der drei übrigen Tiere, stellte sich in der Sektion
heraus, dass das Tier nicht an der Paratuberkulose erkrankt
war, sondern den Erreger offensichtlich nur passagiert hatte.
Die mikroskopische Untersuchung ergab bei 12 von 21
positiven Proben ebenfalls ein positives Ergebnis. Entsprechende Ergebnisse sind bildlich in einem Säulendiagramm
(Abb. 9) dargestellt.
Von 20 Tupferproben aus Jauchegruben und Dunglagerplätzen verschiedener hessischer Milchrinderbeständen erwiesen sich 15 Proben mikroskopisch, kulturell und molekularbiologisch als negativ und 5 Proben entsprechend als
positiv.
Abb.1: Rind mit klinischer
Paratuberkulose
Abb. 2: Ziehl-NeelsenFärbung von infiziertem
Darmgewebe
Klinik und
Pathologie der
Paratuberkulose
Abb. 3: hirnwindungsartig
verdickte Darmwand
Abb. 4: verdickte Darmschlingen
Einleitung
Die Paratuberkulose ist eine weltweit verbreitete, bislang
unheilbare Erkrankung bei Wiederkäuern, die immer tödlich
verläuft und insbesondere in Milchrinderbeständen, zu erheblichen finanziellen Verlusten führt. Der finanzielle Schaden ist
dabei auf die reduzierte Milchleistung (70-700 kg/Jahr), eine
verminderte Fertilität, erhöhte Anfälligkeit gegenüber anderen
Erkrankungen, sowie damit verbundenen tierärztlichen Behandlungskosten zurückzuführen.
Bislang existiert kein methodisch ausgereiftes Überwachungssystem für MAP in Milchrinderbeständen. Der derzeit als
“golden standard” geltende kulturelle Nachweis des Erregers
ist aufgrund der langen Anzuchtdauer bei gleichzeitig hohen
Kosten und der Kontaminationsgefahr der Medien problematisch.
www.shafran.net/crohn/MAP200Wis.jpg;
©Prof. Mike Collins an der „Microbiology
School of Veterinary Medicine“
University of Wisconsin
Diskussion
Abb. 5: elektronenmikroskopisches Bild von MAP
Abb. 6: Ziehl-NeelsenFärbung von infiziertem
Rinderkot
Ziehl-Neelsen-Färbung
von Rinderdarmgewege
kulturelle
Diagnostik
Abb. 7: kulturelle Anzucht
von MAP auf HEYM
Abb. 8: Schimmelpilzbefall
auf HEYM
Material und Methoden
Probenmaterial:
In eigenen Untersuchungen wurden 50 Rinderkotproben
sowohl mikroskopisch, als auch molekularbiologisch mit dem
im Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde entwickelten
TaqMan® Real-Time PCR-Verfahren für die spezifischen
Marker F57 und ISMav2 untersucht. Im Anschluß wurden die
Ergebnisse der Untersuchungen mit denen der kulturellen
Anzucht verglichen.
Die 50 Rinderkotproben stammen von klinisch verdächtigen
und/oder milch- bzw. blutserologisch voruntersuchten Milchrindern verschiedener hessischer Betriebe und wurden
freundlicherweise von der Klinik für Wiederkäuer und
Schweine der Justus-Liebig-Universität in Gießen und von
dem Landesbetrieb Hessisches Landeslabor (LHL) in Gießen
zur Verfügung gestellt.
Weiterhin wurden 20 Tupferproben aus Jauchegruben und
Dunglagerplätzen aus 20 verschiedenen hessischen Milchrinderbeständen mit bekanntem Paratuberkulosestatus entnommen und ebenfalls molekularbiologisch sowie kulturell
untersucht. Auch die Tupferproben wurden über das LHL
bezogen.
Mikroskopische Untersuchung:
Ein erbsengroßes Stück Kot wurde direkt auf einem Objektträger dünn ausgestrichen und mittels Ziehl-Neelsen-Färbung
auf das Vorkommen von säurefesten Stäbchen untersucht.
Kulturelle Anzucht:
Die kulturelle Anzucht von MAP erfolgte auf Herrold’s Egg
Yolk-Schrägnährmedium (HEYM, Fa. Becton Dickinson®) mit
dem Zusatz von Mycobactin J (NIELSEN et al., 2004). Um
eine kulturelle Anzucht für einen Zeitraum von 12-16 Wochen
zu ermöglichen, wurden die Kotproben mit 0,75%iger HPCLösung (Hexadecylpyridiniumchlorid) dekontaminiert, da
sonst die Gefahr einer Kontamination der Medien durch
Begleitkeime bestand.
Molekularbiologischer Nachweis des Erregers:
Für den DNA-Nachweis des Erregers wurde das im Institut
für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde entwickelte TaqMan®
Real-Time PCR-Verfahren (SCHÖNENBRÜCHER et al.,
2006) für die spezifischen Marker F57 und ISMav2 von MAP
verwendet. Die DNA-Isolation erfolgte über zwei modifizierte
Extraktionsverfahren basierend auf dem QIAamp® DNA Stool
Mini Kit der Firma Qiagen.
Die Untersuchungen werden durch das Ministerium für Wissenschaft
und Kunst des Landes Hessen im Rahmen des
Forschungsschwerpunktes „Mensch-Ernährung-Umwelt“ gefördert.
35
30
Anzahl der Tiere
29
29
29
kulturelle Anzucht
Real-Time PCR
Ziehl-Neelsen-Färbung
25
21
20
18
15
12
10
9
5
3
0
0
0
0
0
negative Tiere
positive Tiere
falsch negative Tiere
falsch positive Tiere
Abb. 9: Ergebnis-Diagramm der 50 untersuchten Rinderkotproben;
zu beachten ist, dass ein molekularbiologisch falsch negativ detektiertes Rind
den Erreger nur passagiert hatte.
Abb. 10: Real-Time
Cycler
Schwellenwert
PCR-Diagnostik
Abb. 11: Real-Time PCR-Lauf
positiver Rinderkotproben
Da eine Beteiligung von MAP am Krankheitsgeschehen des
Morbus Crohn nicht auszuschließen ist (CHIODINI, 1998;
BULL et al., 2003; NASER et al., 2004, BÜLTE et al., 2005),
dieser Erreger in Tierbeständen weit verbreitet ist und
insbesondere Lebensmittel tierischen Ursprungs (HAMMER
und KNAPPSTEIN, 1998) als Vektoren in Verdacht stehen,
ist die Etablierung eines zuverlässigen und schnellen Verfahrens zum frühzeitigen Nachweis des Erregers in Milchrinderbeständen von entscheidender Bedeutung. Sensitivität
und Sezifität eines PCR-Verfahrens sind bezogen auf die
Matrix Rinderkot in großem Maße von einem geeigneten
DNA-Extraktionsverfahren abhängig. Dieses sollte nicht nur
eine optimierte DNA-Isolation gewährleisten, sondern auch
in der Lage sein, die Vielzahl an PCR-Inhibitoren, die in der
Matrix Rinderkot enthalten sind, zu neutralisieren. Die
Weiterentwicklung eines bereits bestehenden Extraktionsverfahrens basierend auf dem QIAamp® Stool Mini Kit der
Firma Qiagen ermöglichte eine verbesserte Detektion von
geringradig ausscheidenden Rindern. Die bei den Untersuchungen gewonnenen Erkenntnisse dienen als Grundlage
einer nachfolgenden Weiterentwicklung und Perfektionierung
der molekularbasierten Methodik, was die Untersuchung
weiterer Rinderkotproben erforderlich macht. Derartige
Untersuchungen sind in Bearbeitung, aber noch nicht abgeschlossen.
Die Untersuchungen der Tupferproben aus Rindergülle
sollten eine mögliche Korrelation des Durchseuchungsgrades
eines Bestandes mit MAP durch den Ergebnisvergleich mit
Einzeltieruntersuchungen aufzeigen und somit zu einer
erheblichen Vereinfachung und finanziellen Entlastung der
Paratuberkulosediagnostik beitragen. Aufgrund des Ergebnisvergleiches, wäre eine größere Anzahl an MAP-positiven
Betrieben zu erwarten gewesen. Die entstandenen Ergebnisdifferenzen sind vermutlich auf den hemmenden Effekt des
Rinderurins in der untersuchten Gülle zurück zu führen. Die
Überlebenszeit von MAP in Rinderkot kann bis zu 270 Tagen
betragen (LARSEN, 1956). Die Autoren stellten jedoch fest,
dass in Rindergülle, die zu 90 % aus Rinderurin und zu 10 %
aus Rinderkot bestand, die Überlebensdauer von MAP auf 30
Tage reduziert wurde. Zusätzlich gestaltete sich die kulturelle
Anzucht der Tupferproben aufgrund einer hohen Anzahl an
Schimmelpilzsporen und anderen Begleitkeimen problematisch. Die bislang gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass
Untersuchungen weiterer Tupferproben aus Rindergülle erforderlich sind.
Literaturverzeichnis:
Schwellenwert
1. BÜLTE, M., SCHÖNENBRÜCHER, H., ABDULMAWJOOD, A. (2005): From farm to forkMycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) as zoonotic agent? Berl. Münch. Tierärztl.
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G., PICKUP, R., HERMON-TAYLOR, J. (2003): Detection and verification of Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis in fresh ileocolonic mucosal biopsy specimens from individuals with and
without Crohn’s disease. J. Clin. Microbiol. 41, 2915-2923
3. CHIODINI, R. J. (1989): Crohn’s disease and the mycobacterioses: a review and comparison of two
diseases entities. Clin. Microbiol. Rev. 2, 90-117
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paratuberculosis. Am. Vet. Res. 17, 549-551
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avium subspecies paratuberculosis from the blood of patients with Crohn’s disease. Lancet. 364,
1039-1044
7. NIELSEN, S. S., KOLOMOS, B., CHRISTOFFERSEN, A. B. (2004): Comparison of contamination and
growth of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. J. Appl. Microbiol. 96, 149-153
8. SCHÖNENBRÜCHER, H., ABDULMAWJOOD, A., BÜLTE, M. (2006): Entwicklung und Validierung
eines Real Time-PCR-Verfahrens zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis.
Fleischwirtsch. 9, 123-125
Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde der Justus-Liebig Universität Giessen
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