c - Unifr

Enzymatische Katalyse
U. Albrecht BC1
1. Katalysmechanismen
2. Lysozym
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3. Serin Proteasen
4. Drug Design
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Enzyme erhöhen Reaktionsgeschwindigkeit um mehrere Grössenordungen.
Sie arbeiten unter milden Bedingungen und sind hochspezifisch.
Die katalytischen Mechanismen sind identisch mit chemischen Katalysatoren.
Dskussion: Grundlagen der enzymatischen Katalyse
Prinzip der chemischen Reaktionsmechanismen
Diskussion einiger Beispiele: Lysozym, Serin Proteasen, HIV-1
Protease.
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1. Katalysemechanismen
Katalyse erhöht die Geschwindigkeit mit der eine Reaktion dem Gleichgewicht
zustrebt.
2 Eigenschaften die Enzyme zu wirksamen Katalysatoren macht:
1) spezifische Substratbindung
2) optimale Anordnung
Klassifikation von Katalysemechanismen: 1) Säure-Base Katalyse
2) Kovalente Katalyse
3) Metallionen Katalyse
4) Elektrostatische Katalyse
5) Nachbargruppen und Orientierungseffekte
6) Bevorzugte Bindung des Übergangszustandskomplexes
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A. Säure-Base Katalyse
Keto-Enol tautomerisierung
Unkatalysiert (langsam)
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säurekatalysiert
basekatalysiert
Wenn beide katalysen gleichzeitig -> Säure-Base katalysierte Reaktion
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Mutarotation wird von Säuren und Basen katalysiert
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Mutarotationsgeschwindigkeit nimmt mit den Konzentrationen von allgemeinen
Säuren und Basen zu.
In Benzol (polar) -> tautomerisiert nicht
In Phenol (schwache Säure) -> tautomerisiert
Pyridin (schwache Base) -> tautomerisiert
Hat basische und saure Gruppen
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RNaseA Reaktion ist ein Beispiel für die allgemeine
Säure-Base Katalyse
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Ribonuclease A (RNase A) = Verdauungsenzym das
RNA hydrolysiert und
in ihre NucleotidBausteine zerlegt.
The pH dependence of V′max/K′M in
the RNase A–catalyzed hydrolysis
of cytidine-2′,3′ -cyclic phosphate.
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Histidine 12 -> zuerst
Säure dann Base
Histidine 119 -> zuerst
Base dann Säure
The bovine pancreatic RNase A–catalyzed hydrolysis
of RNA is a two-step process with the intermediate
formation of a 2′,3′ -cyclic nucleotide.
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B. Kovalente Katalyse
Es wird vorübergehend eine
kovalente Bindung zwischen
Katalysator und Substrat
gebildet
Nicht katalysiert
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Katalysiert durch
primäre Amine
The decarboxylation of acetoacetate.
Nucleophile und elektrophile Schritte.
AS-Ketten und Coenzyme können
als kovalente Katalysatoren
Fungieren
(His, Cys, Asp, Ser, ThiaminpyroPhosphat, Pyridoxalphosphat)
C. Metallionen-Katalyse
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2 Klassen von Metallionen Enzymen: -) Metalloenzyme: enthalten festgebundene Metallionen, meist Übergansmetallionen, Fe, Cu, Zn,
Mn und Co ionen.
-) Metallionen-aktivierte Enzyme: binden schwache
Metallionen aus Lösung, Alkali- und Erdalkalimetalle, Na, K, Mg oder Ca ionen.
Auf 3 Arten am katalytischen Prozess beteiligt:
1. Bindung an Substrat um dies für die Reaktion in eine geeignete Konformation zu bringen.
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2. Reversible Änderung ihres Oxidationszustandes vermitteln Redoxreaktionen.
3. Elektrostatischer Ausgleich negativer Ladungen und damit Stabilisierung und Abschirmung
Im Folgenden vor allem 3. Aspekt.
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Metall-Ionen fördern die Katalyse durch Ladungsstabilisierung
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Metall-Ionen sind wirksamere Katalysatoren
als Protonen, da sie bei neutralen pH-Werten
In hohen Konzentrationen vorliegen und
Ladungen >+1 haben können.
Metall-Ionen unterstützen die nucleophile Katalyse durch
Erhöhen des Ionisierungsgrades des Wassers
U. Albrecht BC1
Metall-Ionen wirken in wassriger Lösung sauer, da koordinierende Wassermoleküle leicht
Protonen abgeben.
(NH3)5Co3+(H2O)
(NH3)5Co3+(OH-) + H+
Potentes Nucleophil
Gutes beispiel für dieses Phänomen ist die Carboanhydrase: CO2 + H2O
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Zn2+
3 His Seitenketten
HCO3- + H+
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‚in‘ conformation
X-Ray structures of human carbonic
anhydrase. (b) The active site showing the
proton shuttle.
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His 64 in ‚out‘
conformation
X-Ray structures of human carbonic
anhydrase. (a) Its active site in complex with
bicarbonate ion.
Metall-Ionen fördern Reaktionen durch Ladungsabschirmung
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Ladungsabschrimung bei Kinasen
Nucleophile Gruppen des Enzyms
Greift dieses P and und nicht andere
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D. Elektrostatische Katalyse
Die Bindung eines Substrates and das aktive Zentrum findet in Abwesenheit von
Wasser statt.
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E. Katalyse durch Nachbargruppen und Orientierungseffekte
Hohe Effizienz von Enzymen erreicht durch richtige räumliche Anordnung der
Reaktanden. -> Nähe und Orientierung wichtig.
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Intermolekulare Reaktion
Intramolekulare Reaktion
Gleiche Reaktion aber Umsetzungsrate
Viel schneller.
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Orientierung der Reaktanden und fixieren deren relativer Bewegungsfreiheit
kann zu Ratensteigerung beitragen
The geometry of an SN2 reaction.
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Relative Rates of Anhydride Formation for Esters Possessing Different
Degrees of Motional Freedom in the Reaction Above.
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Reaction coordinate diagrams for a hypothetical enzymatically catalyzed
reaction (single substrate - blue; corresponding uncatalyzed reaction red).
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2. Lysozym
Lysozym zerstört bakterielle Zellwände
NAM= N-Acetylmuraminsäure
NAG= N-Acetylglucosamin
Spaltung der glykosidischen ß(1-4) Bindung
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Lysozym in Sekreten und Zellen -> Bacteriocid in Kombination mit anderen Substanzen->
Beseitigung von Zellwänden.
The alternating NAG–NAM polysaccharide component of bacterial cell
walls.
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14.6 kD
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In Substratbindungstasche
Primary structure of HEW lysozyme
(Hühnereiweiss).
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X-Ray structure of HEW lysozyme.
Spalte übers ganze
Enzym
Spaltstelle
Katalytische
Reste
Nichtreduzierendes
Ende
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Disulfidbrücken
Substrat
(a) The polypeptide chain is shown with a bound (NAG)6 substrate (green).
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Identifiziert durch Mutagenese
X-Ray structure of HEW lysozyme. (b) A
ribbon diagram of lysozyme highlighting
the protein’s secondary structure.
X-Ray structure of HEW lysozyme. (c) A
computer-generated model showing the
protein’s molecular envelope (purple) and
Cα backbone (blue).
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(Wechselzahl)
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schneller
Rates of HEW Lysozyme-Catalyzed Hydrolysis of Selected
Oligosaccharide Substrate Analogs.
D-Ring sterisch im Konflikt mit Glu 57 und Trp 108->
Verdrehung -> Seitenguppe aus Äquatorialer in Axiale
Position-> H-Brücke
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H-Brückenbildung
durch axialen
Seitenrest
Chair and half-chair conformations.
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NAG3
bindet
hier
aber keine
Spaltung
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Phillips-Mechanismus
Asp neg. geladen (unprotoniert)
da zwischen
pH 6 und 8 enzym aktiv.
1 Brückensauerstoffatom wird
protoniert.
In polarem
Bereich
2 D-Ring Oxonium Ion wird duch die
Nähe der Carboxygruppe des Asp52
und durch die enzyminduzierte
Verzerrung des D-Ringes stabilisiert.
2
Säure-Base
Katalysator
3 Ist E-Ring abdissoziert verbindet sich
OH- eines Wassers mit dem Oxonium
Ion, während das H+ das Glu35
reprotoniert.
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1
Acetal OR‘
OR‘+
H-C-O-R‘‘ + H+
3
H-C-O-R‘‘
R
RH
OR‘
H2O
R‘‘OH
H-C-OH
R‘
In unpolarem
Bereich -> protoniert
R
H+
Halbacetal
+
R‘
O
+
C
H
O
C
R
H
Oxonium Ion
R
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The D-ring oxonium ion (carbocation) intermediate in
the Phillips mechanism is stabilized by resonance.
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Lactone inhibitor von Lysozym -> in gleicher Konformation wie
Oxonium Ion -> blockiert enzym an D-Ring Bindungstelle
Figure 15-16 The δ-lactone analog of (NAG)4.
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Nichtkovalenter
Komplex
Kovalentes intermediat
via Asp 52
The HEW lysozyme covalent intermediate.
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3. Serin Proteasen
Haben Ser-Rest im aktiven Zentrum
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Chymotrypsin, Trypsin und Elastase= Verdauungsenzyme, die von Acinuszellen des
Pankreas sezerniert werden.
Sie katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen.
A Selection of Serine Proteases.
U. Albrecht BC1
A. Kinetik und katalytische Gruppen
Geschätzte
Anfangskonz.
Esterhydrolyse als kinetisches Modell
2 Phasen: schnelles binden Substrat und langsames dissoziieren von Acetat.
Chymotripsin arbeitet als
Esterase und als Protease
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Unten Esterase Mech.
Time course of p-nitrophenylacetate hydrolysis as
catalyzed by two different concentrations of
chymotrypsin.
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Annahme: 2 stufiger Prozess -> Chymotrypsin folgt einem
Ping-Pong-Bi-Bi-Mechansimus
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Ser 195
Identifizierung der katalytischen Reste
Markierungsexperimente: Reaktion von Serin mit DIPF -> iireversible Inaktivierung
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DIPF als Hemmstoff für Enzyme entdeckt
Weil als Phosphoverbindung stark neuroToxisch -> inaktiviert Acetylcholinesterase
Botenstoff an Synapsen -> muss schnell
Degradiert werden sonst neurolog. Störungen.
DIPF militärisch als Nervengas gebraucht.
U. Albrecht BC1
His 57
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TPCK bindet kovalent
Reaction of TPCK with chymotrypsin to alkylate His 57.
B. Stuktur von Trypsin
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Chymotrypsin, Trypsin und Elastase
haben alle ähnlich Stuktur
Werden als Propeptide
synthetisiert z.B.
Chymotrypsiongen
Peptidkette
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Asp, His, Ser = katalyt.
Triade
Elastase sehr klein ->
Schneidet nach kleinen
Ungeladnene AS. Viele
Davon in Elastin (elast. Protein des
Bindegewebes).
X-Ray structure of bovine trypsin.
(a) A drawing of the enzyme in
complex.
Spez.
Bindungstasche
Trypsin: Arg-Lys
Chtryp:
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U. Albrecht BC1
X-Ray structure of bovine trypsin. (b)
A ribbon diagram of trypsin.
X-Ray structure of bovine trypsin. (c) A
drawing showing the surface of trypsin
(blue) superimposed on its polypeptide
backbone (purple).
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Die katalytische Triade von Chymotrypsin
The active site residues of chymotrypsin.
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Evolutionäre Beziehungen zwischen Serinproteasen
Chymotrypsin, Trypsin, Elastase ->
Sehr ähnliche Struktur. -> aus Genduplikation eines Vorläufers entstanden.
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Protease A aus Streptomyces griseus->
Prokaryont auch sehr ähnlich -> UrTrypsin hat sich vor der Trennung von
Eukaryonten von prokaryonten ereignet.
Aber: Strukturell nicht verwandte
Proteasen wie Subtilisin etc. ->
Auch convergente Evolution.
Relative positions of the active site residues in
subtilisin, chymotrypsin, serine carboxypeptidase II,
and ClpP protease.
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C. Katalytischer Mechanismus
U. Albrecht BC1
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Das tetrahydrale Zwischenprodukt kann als Komplex mit
Trypsin Inhibitor dargestellt werden.
Trypsin–BPTI complex. (a) The Xray structure shown as a cutaway
surface drawing indicating how
trypsin (red) binds BPTI (green).
U. Albrecht BC1
Trypsin–BPTI complex. (b)
Trypsin Ser 195, the active
Ser, is in closer-than-van der
Waals contact with the
carbonyl carbon of BPTI’s
scissile peptide.
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Serinproteasen binden bevorzugt den Überganszustand
Transition state stabilization in the
serine proteases. (a) The Michaelis
complex.
Transition state stabilization in the
serine proteases. (b) The
tetrahedral intermediate.
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Wasser attackiert das Acyl- Enzym
X-Ray structures of porcine pancreatic
elastase in complex with the
heptapeptide BCM7 (YPFVEPI). (a)
The complex at pH 5.
(b) The complex at pH 9.
U. Albrecht BC1
E. Zymogene
Inaktive Vorläufer = Zymogene
Dies ist nötig da sonst Enzyme schon aktiv an Syntheseort -> Pankreatitis
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Serinproteasen werden autokatalytisch aktiviert
Activation of trypsinogen to form trypsin.
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Activation of chymotrypsinogen by proteolytic cleavage.
U. Albrecht BC1
4. Drug design
Pharmakologisch wirksame Substanzen am Anfang des 20.
Jahrhunderts:
-) Digitalis -> Herz Stimulans
-) Quinine -> Malaria Behandlung (von Chinchona Baum)
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-) Quecksilber -> Syphilis (Behandlung of schlimmer als Krankheit)
Die meisten heutigen wirksamen Substanzen in den letzten 3 oder 4
Jahrzehnten entdeckt (antidepressants, antipsychotics,
entzüdnungshemmer,
Immunsuppressoren, anaesthetica)
U. Albrecht BC1
A. Techniken zur Identifizierung von neuen Pharmaka
Die meisten Pharmaka wirken über Bindung an einen Rezeptor.
Der Rezeptor kann ein Membrantransporter oder ein Singnaltransduktionsgekoppelter Rezeptor sein.
Wenn die Bindung die Funktion des Rezeptors beeinträchtigt wird die
Substanz als ein Agonist bezeichnet.
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Wenn die Bindung blockiert wird nicht aber die Funktion des Rezeptors ->
Antagonist.
Synthethische und natürliche Substanzen werden im Grossmasstab
‚gescreent‘, zuerst in vitro über Bakterien oder Zellkulturen -> wirksame
Substanzen werden dann in Tieren getestet.
U. Albrecht BC1
Wirksame Substanz wird als Lead Compound bezeichent.
KD < 1µM -> Substant muss hohe Affinität haben -> kleine Dosen,
Wenig unspezifische Bindungen -> weniger Nebeneffekte.
Messgrössen für die Beschreibung einer wirksamen Substanz:
IC50 = inhibitor concentration bei welcher das Enzym 50% der Maximalaktivität hat.
ED50 = effektive dosis bei welcher die Substanz einen therapeutischen
Effekt in 50% der Testsamples hat.
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TD50 = mittlere toxische dosis welche einen toxischen Effekt in Tieren
hat.
LD50 = mittlere lethale dosis welche 50% des Testsamples tötet.
Therapeutischer Index = TD50/ ED50 -> sollte möglichst gross sein.
Pharmakodynamics= Biochemical and pharmacological effects and
mechanism of a drug.
Catepsin K ist ein Drug Target für Osteoporose
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Osteoporose
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Synthetisieren organische
Matrix -> Mineralisierung
Cathepsin isoliert von OsteoClastoma Zellen.
Solubilisieren mineralsierte
Matrix über proteolytische
Enzyme -> Cathepsin
Mutation in Cathepsin -> brüchige Knochen ->
Cathepsin ist drug target für Behandlung von
Osteporose.
U. Albrecht BC1
SARs and QSARs are useful tools for drug discovery
SARs = structure activity relationships -> which group is
important for the drugs function ? -> improvement
of a lead compound.
5 -10 related compounds are typically synthesized
to generate a useful drug.
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QSARs = quantitative structure activtiy relationships.
mathematical relationship between biological
activity and physicochemical properties.
Structure based drug design
Von Proteinstruktur ausgehendes rationales design des Wirkstoffes
-> in den Wenigsten Fällen da Proteinstruktur nicht bekannt ist.
U. Albrecht BC1
Kombinatorsiche Chemie und Hochdurchsatz Screening
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Trial and error an einem in vitro reporter system um lead compounds
zu bekommen.
The combinatorial synthesis of arylidene diamides.
U. Albrecht BC1
B. Einführung in die Pharmakologie
In vitro Entwicklung einer Substanz erster Schritt. Danach die Frage, wie wird
Die Substanz zum Wirkungsort gebracht (delivery) und was sind die Nebeneffekte?
Pharmakokinetik ist ein vielfältiges Phänomen
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Orale Einnahme eines Medikaments am einfachsten -> Verschiedene Barrieren
1) Substanz muss chemisch stabil sein um den sauren pH 1 im Magen zu überleben
2) muss vom Gastrointestinaltrakt absorbiert werden um ins Blut zu gelangen
3) geringe affinität zu anderen Substanzen (Lipide, Albumin)
4) muss derivatisierung in Leber überleben, da der intestinale Blutstrom direkt in die
Leber führt welche die Funktion hat Xenobiotika (fremde Substanzen) zu neutralisieren
5) keine schnelle Ausscheidung durch die Nieren
6) muss von Kapillaren zu Zielgewebe gelangen können
7) wenn fürs Hirn -> Blut-Hirn Schranke muss überwunden werden
8) wenn für einen intracellulären Rezeptor -> passieren der Plasmamembran
Wie eine Substanz mit diesen Anforderungen zurechtkommt wird als
Phamakokinetik bezeichnet -> Biologische Verfügbarkeit einer Substanz hängt von
Verabreichter Dosis und der Pharmakokinetik ab.
Um 1 und 2 zu umgehen -> Injektionen möglich aber nicht praktisch.
U. Albrecht BC1
Pharmakokinetik und Pharmakodynamik müssen optimiert werden
Lipinskis 5 er Regel: Eine Substanz wird schlecht absorbiert oder
permeiert schlecht wenn:
1) seine Masse grösser als 500 D ist.
2) mehr als 5 Wasserstoffbindungsdonoren da sind (Smme aller
OH und NH Gruppen)
3) mehr als 10 Wasserstoffbrücken akzeptoren (Summe der N und O
Atome)
4) wenn die Substanz zu hydrophob ist
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-> nicht zu hydrophil und nicht zu hydrophob.
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Toxizität und Nebenreaktionen eliminieren die meisten Kandidaten
Nach allen in vitro und Tierexperimenten wird die Sicherheit und Effizienz
am Menschen in Klinischen Versuchen durchgeführt.
Phase I: Sicherheit, Dosierung, Verabreichung wird in 20-100 Freiwilligen
gesunden Probanden getestet.
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Phase II: Effizienz wird in 100-500 freiwilligen Patienten getestet.
Nebeneffekte werden verfolgt und die Dosierung optimiert.
Single blind test: die Patienten wissen nicht ob sie Medikament oder
Placebo erhalten.
Phase III: Langzeit Studie über Nebeneffekte an 1000-5000 Patienten.
Statistischer Vergleich zu Kontrollsubstanzen.
Doppelblind Studie: Patient und Arzt wissen nicht wer Medikament
und wer Placebo erhält.
5 von 5000 Kandidaten kommen in Phase I. Von diesen nur 1 als Medikament
40% passieren Phase I, davon 50% Phase II.
Präklinik -> 3 Jahre -> Klinik -> 7-10 Jahre -> teuer ca. 300 Mio Dollar für 1Med
Rückzug mancher Drogen wie
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The Cytochromes P450 Metabolisiert die meisten Medikamente
Gewisse Leute reagieren auf eine Substanz anders als die meisten. Polymorphismen
In Cytochromen -> d.h. andere metabolisierun. Machen Substanzen mehr löslich zur
Ausscheidung. RH +O2 +2H+ + 2e- -> ROH + H2O
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Wenn 2 Substanzen zusammen
Gegeben werden kann die eine die
Detoxifizierungseffizienz von P450
Auf die andere Droge verändern ->
Pharmakokinetisches Profil verändert
Sich. -> eine Harmlise substanz kann in
Kombination mit einer anderen toxisch
werden.
X-Ray structure of cytochrome P450CAM
from Pseudomonas putida showing its
active site region.
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Acetaminophen = Fiebersenker
Therapeutische dosis 1.2g/Tag
für Erwachsenen
Hohe Dosen >10g -> toxisch
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-> Saturierung von Gluthation
-> kann nicht schnell genug
Nachgebildet werden.
The metabolic reactions of acetaminophen
that convert it to its conjugate with
glutathione.
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Figure 15-33 The assembly, budding, and maturation of
HIV-1.
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Figure 15-34a HIV-1 polyproteins. (a) The organization of
the HIV-1 gag and gag–pol polyproteins.
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Figure 15-34b HIV-1 polyproteins. (b) The sequences
flanking the HIV-1 protease cleavage sites (red bonds)
indicated in Part a.
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Figure 15-35 Renin participation in blood pressure
regulation.
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Figure 15-36a X-Ray structure of pepsin. (a) Ribbon
diagram.
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Figure 15-36b X-Ray structure of pepsin. (b) Enlarged view of
the active site Asp residues and their bound water molecule
indicating the lengths (in Å) of possible hydrogen bonds (gray).
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Figure 15-37 Catalytic mechanism of aspartic proteases.
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Figure 15-38a X-Ray structure of HIV-1 protease. (a)
Uncomplexed.
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Figure 15-38b X-Ray structure of HIV-1 protease. (b) In
complex with its inhibitor.
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Figure 15-39 Arrangement of hydrogen bonds between
HIV-1 protease and a modeled substrate.
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Figure 15-40 Comparison of a normal peptide bond to
several groups (red) that are similar to the tetrahedral
intermediate of aspartic proteases.
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Figure 15-41 Some HIV-1 protease inhibitors that are in
clinical use.
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Figure 15-42 Mechanism of carboxypeptidase A.
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Table 15-3
Subsites.
Binding Free Energies of HEW Lysozyme