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U. Albrecht BC1
Voet Biochemistry 3e
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
1. Überblick
2. Stoffwechselquellen
für Acetyl-Coenzym A
3. Enzyme des CitronensäureCyclus
4. Regulation des Citronensäure-Cyclus
5. Amphibole Natur des
Citronensäure-Cyclus
U. Albrecht BC1
1. Überblick
Der Citronensäure-Cyclus kommt in Eukaryonten und Prokaryonten vor.
Wird auch Tricarbonsäure-Cyclus (TCA-Cyclus) oder Krebs-Cyclus genannt.
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Die Acetylgruppe eines Acetyl-CoA-Moleküls wird zu 2 Molekülen
CO2 oxidiert und die Energie wird gespeichert um später ATP zu
Erzeugen.
Reaktionen
8 Enzyme -> es entstehen:
2 CO2
3 NADH -> in oxidative Phosph.
1 FADH2-> „
„
„
1 GTP
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Tertiärer Alkohol -> schwer
oxidierbar
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Oxalacetat wird regeneriert -> unendliche
Zahl von Acetylgruppen
Kann mit einem
Oxalacetat
Oxidiert werden.
Sekundärer
Alkohol ->
leichter oxidierb.
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2. Stoffwechselquellen für Acetyl-Coenzym A
Thioester
KohlenhydratFettsäurenAminosäurenabbau
Energiereiche Bindung
Amidbindung
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Vitamin
Chemische Struktur von Acetyl-Coenzym A
A. Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex
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Pyruvat Vorstufe von Acetyl-CoA. Multienzymkomplex Pyruvate decarboxylase multienzym
Complex (PDC) katalysiert.
Multienzymkomplex= nicht kovalent assoziierte Enzyme die 2 or mehr sequentielle Reaktionen
katalysieren.
Komplex in E. coli beschrieben.
PDC Enzyme:
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Pyruvate dehydrogenase (E1)
Dihydrolipoyl transacetylase (E2)
Dihydrolipoyl dehydrogenase (E3)
intact complex
“core” complex
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Structural organization of the E. coli PDC.
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E2 core
24 subunits
E1
E3
Combined 60 subunit
complex
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Comparison of the X-ray structures of the dihydrolipoyl transacetylase (E2) cores of PDCs
The cubic Azobacter vinelandii
E2 core.
The dodecahedral
B. stearothermophilus E2 core.
Gram-negative Bakterien
Gram-positive Bakterien und
Eukaryontische Mitochondrien (20 E2
trimere, 30 E1 tetramere, 12 E3 dimere
Mitochondrien von Gram-Positiven ? Mit. Haben aber doppelmembran Wie gram-negative.->
Sequenzvergleiche Ricketsia prowazekii (typhus) -> gram neg. aber dodecahedral
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Multienzymkomlexe sind katalytisch effizient
1. Enzymatische Reaktionsraten sind limitiert durch die Frequenz
mit der das Substrat mit dem Enzym kollidiert.
In einem Multienzymkomplex wird die Diffusion zwischen den
aktiven Zentren minimiert -> Ratenverbesserung
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2. Kanalisierung metabolischer Zwischenprodukte wird möglich ->
Verringerung von Nebenreaktionen.
3. Reaktionen können koordiniert kontrolliert werden.
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Acetyl-CoA Bildung geschieht in 5 Schritten
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Pyruvate + CoA + NAD+ -> acetyl-CoA + CO2 + NADH
The five reactions of the PDC.
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The Coenzymes and Prosthetic Groups of Pyruvate Dehydrogenase.
Reaktion 1
Reaktion 2
Reaktion 4
Reaktion 3
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wrong goes
to reaction 2
Reaktion 5
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Struktur von Lipoamid
Der Lipolysyl-Arm befördert die Zwischenprodukte von einer Untereinheit des Enzyms zur nächsten
Wie werden Zwischenprodukte von einem Enzym zum nächsten
weitergegeben?
Liposylyl-Arm wie eine Liane -> schwingt von E1 nach E3
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E2 Lianen schwingen auch gegeneinander -> gegenseitige Acetylierung
-> Jede E1 UE kann
nehrere E2 UE
acetylieren
und jede E3 UE
kann mehrere
E2 reoxidieren.
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Die Struktur von E2 der PDC
Domain structure of the dihydrolipoyl transacetylase (E2) subunit of the PDC.
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Coenzym A
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lipoamid
X-Ray structure of a trimer of A. vinelandii dihydrolipoyl transacetylase (E2)
catalytic domains.
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Lys Seitenkette zu welcher die Lipoylgruppe gebunden wird ist in einem type
1 β turn.
The NMR structure of the A. vinelandii dihydrolipoyl transacetylase (E2)
lipoyl domain.
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Bindungstellen für E1 und E3
The NMR structure of the peripheral subunit-binding domain from B.
stearothermophilus E2.
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E1
E2
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E2 catalytic domain
- E1 binding d.
E3
Electron microscopy–based
images of the bovine kidney
pyruvate dehydrogenase
complex at ~35 Å resolution.
Arsenverbindungen sind giftig weil sie Lipoamid maskieren
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Arsenverbindungen sind toxisch da
sie kovalente Verbindungen mit
Sulfhydrylgruppen eingehen können.
-> Inaktivierung lipoamidhaltiger Enzyme
Pyruvat-Dehydrogenase
α-Ketoglutarat-Dehydrogenase
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-> Unterbrechung der Atmung
Organische Arsenvergiftungen toxischer für Mikroorganismen als für den Menschen
-> zu Beginn des 20. Jahrhunderts Syphilis-Behandlung und TrypanosomenBehandlung
-> = erste Antibiotika, aber schwere Nebenwirkungen.
Anektote Napoleon: Arsen in Haar -> Vergiftet? - grüne Tapeten mit Pigment KupferArsenat (CuHAsO4) .-> in feuchtheissem Klima -> Pilze konvertieren dies zu Trimethyl
Arsin ((CH3)3As) welches flüchtig und sehr giftig ist.
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Die Struktur von E1
Neben PDC noch andere sehr ähnliche Multienzymkomplexe:
α-Ketoglutarat dehydrogenase Komplex (Reaktion 4 im Citrat Zyklus)
Verzweigte Ketten α-ketosäure dehydrogenase Komplex (degradation von Ile, Leu und Val)
Alle in Familie von 2-Ketosäure Dehydrogenase mit gleichem E3 enzym und spezifischen E1 und E2
Struktur jedoch bei allen ähnlich.
α-Untereinheiten
β-Untereineheiten
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TPP cofaktoren an Bindungsstelle von Untereinheiten.
X-Ray structure of E1 from P. putida branched-chain α-keto acid
dehydrogenase. (a) The α2β2 heterotetrameric protein.
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X-Ray structure of E1 from P. putida branched-chain α-keto acid
dehydrogenase. (b) A surface diagram of the active site region.
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B. Mechanismus der Dihydrolipoyl Dehydrogenaase (E3)
2 electron acceptor sites:
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Fad and disulfid bond
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Röntgenstruktur von Dihydrolipoamid Dehydrogenase
2 Subunits
Interface Domäne
Zentral Domäne
NAD+
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FAD
NAD+ Bindungsdomäne
FAD Bindungsdomäne
X-Ray structure of dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) from P. putida in
complex with FAD and NAD+. (a) The homodimeric enzyme.
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X-Ray structure of dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) from P. putida in
complex with FAD and NAD+. (b) The enzyme’s active site region.
Katalytischer Reaktionszyklus der Dihydrolipoyl Dehydrogenase
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2
substrates
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Charge
Transfer
complex
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Charge Transfer Complex
FAD
S
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NAD+
The complex of the flavin ring, the nicotinamide ring, and
the side chain of Cys 63 observed in the X-ray structure of
human erythrocyte glutathione reductase (very similar to
Dihydrolipoyl dehydrogenase).
The reaction transferring an electron pair from dihydrolipoyl
dehydrogenase’s redox-active disulfide in its reduced form to the
enzyme’s bound flavin ring.
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C. Kontrolle der Pyruvat-Dehydrogenase
A) Kontrolle durch Produktinhibition
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PDC reguliert den Eintritt von aus Kohlenhydraten stammenden Acetyleinheiten
In Citronesäure Cyclus.
E1 irreversibler Schritt -> genaue Regulation da sonst keine anderen Wege zur
Synthese von Acetyl-CoA in Säugern.
Produkt Inhibition: NADH und Acetyl-CoA treiben die reversiblen Reaktionen E2 und
E3.
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B) Kontrolle durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung
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Phospohatase und Kinase
Phospohorylierung eines
Ser Restes in E1
3. Enzyme des Citronensäure-Cyclus
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A. Citrat-Synthase
Kondensation von Acetyl-CoA mit Oxalacetat. -> Induced Fit Enzym, sequenzieller Mechanism.
Oxalacetat bindet zuerst -> Konformationsänderung -> Aectyl-CoA bindet.
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Oxalacetat
Bindungsstelle
Conformational changes in citrate
synthase. (a) Space-filling drawing
showing citrate synthase in the open
conformation.
Conformational changes in citrate
synthase. (b) Space-filling drawing
showing citrate synthase in the closed,
substrate-binding conformation.
Mechanismus und Stereochemie der Citrat-Synthase Reaktion
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Aldol-Claisen-Esterkondensation in 3 Schritten
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B. Aconitase
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Aconitase katalysiert die reversible Isomerisierung von Citrat und Isocitrat mit cis-Aconitat als
Zwischenprodukt.
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Fluorocitrat hemmt Aconitase
Fluoroacetat sehr giftig (LD50 bei Ratten=
0.2 mg/kg Körpergewicht)
Kommt in Blättern bestimmter Pflanzen
Aus Afrika, Australien und Südamerika vor.
Selbst keine toxische Wirkkung wird aber
In den Zellen umgewandelt zu Fluorocitrat.
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Dies hemmt Aconitase spezifisch und
Inhibiert den Citrat transport durch die
Mitochondrienmembran.
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C. NAD+ -abhängige Isocitrat-Dehydrogenase
Isocitrat-Dehydrogenase katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Isocitrat zu α-Ketoglutarat,
Wobei erstmalig im Citronensäure-Cyclus CO2 und NADH gebildet wird.
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In Säugern 2 verschiedene Formen: 1) Citronensäure-Cyclus Enzym in Mitocheondrien, NAD+ als
Coenzym.
2) in Mitochondrien und Cytosol, NADP+ als Coenzym.
= sek. Alkohol
= Keton
Konnte noch nicht bewiesen werden
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D. α-Ketoglutarat-Dehydrogenase
α-Ketoglutarat-Dehydrogenase katalysiert
die oxidative Decarboxylierung einer
α-Ketocarbonsäure, wodurch das zweite
CO2 und das zweite NADH des CitronenSäure-Cyclus grei werden.
Reaktion ähnlich der von Pyruvat-Dehydrogenase-Multienzymkomplex.
3 Untereinheiten:
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α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E1)
Dihydrolipoyl-Transsuccinylase (E2)
Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E3)
E3 ist identisch mit E3 von PDC.
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E. Succinyl-CoA-Synthase
Hydrolysiert die energiereiche Verbindung Succinyl-CoA unter Kopplung an die Synthese eines
Energiereichen Nucleosidtriphospphates.
In Säugern -> GTP, in Pflanzen ATP.
Beachte: Enzymnahmen können auch die Rückreaktionen benennen (wie hier).
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Durch Succinyl-CoA-Synthase katalysierte Reaktionen:
Bildung eines succinyl phosphates, ein “high-energy” mixed anhydride.
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Formation of phosphoryl–His, a “high-energy” intermediate.
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Transfer of the phosphoryl group to GDP, forming GTP.
GTP Bildung äquivalent zu ATP Bildung da ineinander umwandelbar.
GTP + ADP
GDP + ATP freie Enthalpie = 0
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F. Succinat-Dehydrogenase
Dehydrierung von Succinat zu Fumarat
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Enzym gehemmt durch Malonat (ein C
atom weniger als Succinat).
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FAD ist kovalent an die Succinat-Dehydrogenase gebunden
Normalerweise FAD nicht kovalent in Enzymen Gebunden
Aber in Succinat dehydrogenase schon -> Problem:Wie wird
FADH2 reoxidiert damit Enzym wieder funktionieren kann?
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Das Enzym wird über die Elektronentransportkette reoxidiert.
Einziges and innere Mitochondrienmembran gebundenes
Enzym des Citronensäure-Cyclus
-> Auch als Complex II der Oxidationskette bekannt.
Reoxidiert durch Coenzym Q
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G. Fumarase
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Es ist nicht klar ob der
Mechanismus über ein
Carbanion oder einen
Carbokation ÜbergangsZustand geht.
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H. Malat-Dehydrogenase
Regeneration von Oxalacetat
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4. Regulation des Citronensäure-Cyclus
Diese Enzyme
arbeiten weit weg
vom Gleichgewichtszustand unter
natürlichen
Bedingungen ->
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Diese Enzyme bestimmen Geschw.
des Citratzyklus
->
Kontrollpunkte
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Regulation durch:
1) Verfügbarkeit der Substrate
2) Produkthemmung
3) Hemmung durch Zwischenprodukte
Da Sauerstoffverbrauch, NADH Reoxidation und ATP-Produktion eng
miteinander gekopplet sind, muss der
Citronensäure-Cyclus über Rückkopplungsmechanismen, die seine
NADH-Produktion auf den EnergiverBrauch abstimmen, reguliert werden.
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Wichtigste Regulatoren:
-) Acetyl-CoA, Oxalacetat, NADH
+) ADP, Ca2+
Keine komplizierte Regulation über
Hormone (vrgl. Glykogenabbau), da
Keine Speicherstoffe gebildet werden.
Produkte kurzfristig direkt an Atmung
gekoppelt.
5. Amphibole Natur des Citronensäure-Cyclus
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1. Glucose-Biosynthese
2. Lipid-Biosynthese
3. Aminosäure-Biosynthese
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4. Porphyrin-Biosynthese
5. Oxidation von Aminosäuren