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BIOCHIMIE DU SANG 1. Métabolisme de l’érythrocyte Hémoglobine 2. Production et élimination d’éléments cellulaires 3. Metabolisme et Transport du Fe 4. Composants du Plasma (structure & fonction) 1. Myoglobin U.Albrecht BC1 A. Struktur von Myoglobin Strukturaufklärung des Pottwal-Myoglobins wurde 1959 von John Kendrew gemacht. Später wurde die Struktur verschiedener Spezies und auch von Hb Mutationen durchgeführt. Das Hämoglobin wurde zum besterforschten Protein überhaupt. Myoglobin aus 8 Helices (A-H). ellipsoid Helices zwischen 7 und 26 AS lang meistens α-Helices Enden der Helices A, C, E und G bilden 310-Helix Bezeichnung von Resten: B5 = 5. AS in B-Helix (N-term nach C-term) FG3= 3. AS im Interhelicalen Segment zw. F u. G NA = nicht helicales aminoterminales Segment HC= nicht helicales carboxyterminales Segment Manchmal auch kombinierte Bezeichnung Glu EF6(83)= Glu 83 im interhelicalen Segment EF 6. AS. 1 Die Hämgruppe Sauerstoff-Bindungskurve von Myoglobin Sättigungsgrad von Myoglobin Partialdruck Umgebung 2 U.Albrecht BC1 Funktion des Hämoglobins Sauerstoff wird zur Energiegewinnung gebraucht. In kleinen Organismen gelangt O2 durch Diffusion zum Gewebe. In grossen Organismen (Schichtdicke der Gewebe >1mm) aktiver Transport nötig (Löslichkeit des O2 zu niederig). Sauerstoff bindende Proteine haben sich entwickelt. Hämoglobin = Hb (Fe mit Häm), Hämocyanin (Cu haltig), Hämerythrin (Fe haltig, ohne Häm). Fische der Antarktis einzige Vertebraten ohne Hämoglobin. O2 ist bei -1.9°C ausreichend löslich, deshalb haben diese Fische farbloses Blut. Myoglobin = Mb in Muskel erleichtert O2 transport in arbeitendem Muskel und dient in Wassersäugern als O2 Speicher. Häm Häm His Rest Mb und jede der 4 Untereinheiten von Hb enthalten nicht kovalent gebundenes Häm, das auch in Cytochromen vor- kommt. Oxygenierung ändert Elektonenkonfiguration von Häm-Fe(II) Farbwechsel des Blutes von dunkel purpur (venöses Blut) zu leuchtend rot (arterielles Blut). CO, NO, H2S binden besser als O2 Toxizität Oxidation von Fe(II) zu Fe(III) Methämoglobin (MetHb) Metmyoglobin (MetMb). Keine Bindung von O2, H2O sättigt Fe(III) ab braune Farbe von trockenem Blut In Erythrocyten reduziert Methämoglobinreduktase Fe(III) zu Fe(II). Struktur von Hämoglobin 3 Globinketten sind auf 2 verschiedenen Chromosomen codiert α β β α Globine während der Embryogenese 4 Poumons O2 CO2 HCO3NHCOOFe Fe Fe Fe O2 O2 Fe Fe Fe Fe O2 O2 NHCOO- O2 CO2 Les autres formes de l’hémoglobine Méthémoglobine Fe++ 2 O2 Oxyhémoglobine +C -C CO O + O O2 -O Fe+++ Hémoglobine Fe++ Carboxyhémoglobine Fe++ 5 U.Albrecht BC1 β1 α2 Nicht identische UE im Hb aus- geprägte Wechselwirkungen α1-β1 Kontakt 35 AS α1-β2 Kontakt nur 19 AS αβ-Heterodimere -> hydrophobe WW Homodimere -> keine WW da durch Flüssigkeit gefüllten Kanal getrennt α1 β2 Unterschiedliche Quartärstruktur von Desoxy- und Oxy- Hämoglobin Desoxy-Form = T-Zustand β1 α2 β2 α1 U.Albrecht BC1 Oxy-Form = R-Zustand α2 t-Zustand Tertiärstruktur β2 UE Oxygenierung verengt Kanal β1 α1 r-Zustand Tertiärstruktur UE DesoxyHb Kristall zerplatzt an der Luft α1-β2 Kontakt nur 19 AS dagegen α1-β1 Kontakt 35 AS -> stärkerer Kontakt unverändert d.h. Veränderung entlang α1-β2 Kontakt -> Verdrehung von α1-β1 Dimer um ca. 15° gegen α2-β2 Dimer 6 B. Sauerstoffbindung zu Hämoglobin Hämoglobin bindet O2 kooperativ. Die Hill-Gleichung beschreibt die sigmoidale O2- Bindungskurve von Hämoglobin. n [S] Ys = K + [S] n Ys = Sättigungsgrad K = Dissoziationskonstante (p50) S = Ligandkonz., hier pO2 n = Hill-Koeffizient n=1 nicht kooperative Bindung wie in Myoglobin n>1 pos. kooperativ wie in Hämoglobin n<1 neg. kooperativ 2.8 hyperbolische Bindungskurve mit demselben p50 wie Hb 7 3. Kooperativität A. Mechanismen der Kooperativität in Hämoglobin Einwandern von Fe(II) in Porphyrin- Ebene löst T-> R Transformation aus t-Zustand Fe(II) 60 pm aus Porph. Ebene.-> pyramidale durchgebogen O2-Bindung ändert Elektr.konfig. von Fe -> Fe-N porph.-Bindung kontrahiert -> Fe in Phorphyrinebene und O2 Bindung F-Helix muss Lage verändern, damit HisF8 dem Porphyrinring nicht zu nahe kommt. Dadurch wird Fe- O2-Bindung stabilisiert. Versetzen von 3 Seitenketten. Äquivalenter Satz von H-Brücken. Wie ein Schalter, nur 2 Zustände. 8 U.Albrecht BC1 Die Kooperativität der Sauerstoffbindung an Hämoglobin ergibt sich aus dem T -> R Übergang Bindung von Sauerstoff erfordert eng abgestimmte Molekülbewegungen: 1) Fe(II) gleitet nur in Porphyrinringebene wenn gleichzeitig sich die räumliche Orientierung vom proximalen His sich ändert. 2) Das proximale His ist fest mit Nachbarn verbunden -> Neuorientierung nur möglich wenn sich F-Helix über Porphyrinebene bewegt. 3) F-Helix kann sich nur dann bewegen wenn α1-β2 und α2-β1 Kontakte sich um eine Windung verschieben 4) Die Unbeweglichkeit der α1-β1 und α2-β2 Kontakte erzwingt die Konformationänderung in 3) -> Untereinheiten oder Dimere können Konformation nicht unabhängig voneinander ändern. Da nur 2 stabile α1-β2 (bzw. α2-β1) Kontakte möglich -> Quartärstruktur von Hb nur in 2 Zustandsformen Was heisst Kooperativität? 1. UE bindet O2 muss aber in t-Zustand verharren da andere UE ohne O2 im t-Zustand. Je mehr O2 gebunden desto höher O2 Affinität da UE im r-Zustand. T-Zustand durch Ionenbindungen stabilisiert, brechen auf bei Übergang zu R-Zustand R-Zustand durch Bindung von Sauerstoff stabilisiert. Warum T-Zustand aber stabiler als R-Zustand? C-terminale AS sind im R-Zustand flexibel im TZustand aber nicht, sie sind über Ionenbrücken stabilisiert. Zwischen α1-β1 bzw. α2-β2 deprotoniert bei Bohr effekt Netzwerk von ionischen WW und H-Brücken am Carboxy- ende der α und β Untereinheiten. Alle diese Bindungen werden beim T-> R Übergang geöffnet 9 U.Albrecht BC1 Kohlendioxidtransport und Bohr-Effekt Hb transportiert neben O2 auch CO2 im Blut. O2 Bindung (physiolog. pH) Konformationsänderung von Hb (nicht aber Mb). Acidität von Hb erhöht sich und Protonen werden freigesetzt. Wenn diese Protonen durch erhöhen des pH abge- fangen werden Erhöhung der O2 Bindungskapazität. = Bohr-Effekt Der Bohr-Effekt erleichtert den O2 Transport Aus O2 wird CO2 (gelöst). CO2 wird zu Hydrogencarbonat (langsame Reaktion). Wird in Erythrocyten be- schleunigt von Carboanhydrase). CO2 wird im Blut als Hydrogen- carbonat transportiert (kein ausperlen von CO2 möglich). Gewebe pO2 niedrig Lunge pO2 hoch Einfluss des pH auf die O2-Bindungskurve des Hb arbeitender Muskel pH tiefer mehr O2 wird abgegeben. Rolle von Hb beim Transport von O2 von Lunge zu Gewebe 10 U.Albrecht BC1 Bedeutung von BPG für die O2 - Bindung Gereinigtes Hb hat höhere Affinität zu O2 als Vollblut. Unter anderem ist dafür D-2,3-Bisphosphoglycerat (BPG= 2,3 DPG) verantwortlich. BPG bindet stärker an DesoxyHb als an OxyHb. Es stabilisiert DesoxyHb. Selbe Funktion hat bei Vögeln Inositol hexakisphosphat (IHP) und bei Fischen und Amphibien Adenosintriphosphat (ATP). Modulation O2 Affinität von Hb in Säugern: 1) H + 2) CO2 3) Cl - 4) BPG 11 Ohne BPG wird nur wenig O2 freige- setzt BPG erhöht p50 Wert Einfluss von BPG und CO2 von isoliertem Hb im Vergleich zu Voll- blut 12 Métabolisme du Glucose érythrocytaire Glucose Protection contre les oxydants Glucose 6 Phosphate Voie des pentoses Phosphates Glycolyse anaérobie G6PDH Trioses Phosphates 2 Glutathions réduits (GSH) R-O-OH NADPH NADP+ NADPH +H+ 3 2 R-OH + H20 O2 Glutathion oxydé (GSSG) NAD NADH + H+ Maintien de l’Hème à l’état fonctionnel Fe2+ ADP + P 2,3 Bisphospho glycerat (2,3 BPG) ATP Maintien de la forme biconcave ENERGIE Renouvellement lipides membranaires Pyruvate Pompes cationiques Lactate U.Albrecht BC1 Regulation des Sauerstofftransportes Glykolyse 13 Bindung von BPG an Desoxyhämoglobin BPG senkt Sauerstoffaffinität des Hb verbindet β UE über Salzbrücken und stabilisiert somit T-Form Bei Übergang in R-Form wird BPG herausge- drückt da sich Kanal verengt. Fötales Hb (HbF) hat anstelle von HisH143 ein ungeladenes Serin. BPG kann DesoxyHb nicht stabilisieren im Fötus -> höhere Sauerstoff- affinität. Salz- und H-Brücken U.Albrecht BC1 Bei Höhenanpassung steigt die BPG-Konzentration an Anpassung an Höhe führt zur Vermehrung von Erythrocyten. Nach einem Tag ist bereits der Anstieg von BPG zu beobachten, welches die Erythrocyten nicht verlassen kann. Verminderung der O2 Bindungsaffinintät. Anstieg von BPG auch in Patienten mit Hypoxie, z.B. Anämien, kardiopulmonare Insuffizienz 14 Hypoxie-induzierter Anstieg des Erythorzyten 2,3 BPG Alkalose 15 Fötales Hämoglobin (HbF) hat eine niedrige BPG-Affinität und bindet O2 besser als mütter- liches Hämoglobin (HbA) O2 Versorgung des Fetus wird dadurch erst effizient. Höhenadaption gewährleistet dass Sauerstoffver- sorgung sich nicht vermindert. B. Allosterische Proteine U.Albrecht BC1 Organismen müssen auf Veränderungen in der Umgebung reagieren. Dies erfordert einen hohen Grad von Kontrolle biochemischer Mechanismen. Regulation ist auf jedem Niveau des Organismus möglich: -molekulare Ebene (Reaktionsgeschwindigkeiten, Genexpression) -zelluläre Ebene (Signaltransduktion) -organismische Ebene (Verhalten) Die meisten Erkrankungen können auf eine Störung der Kontrollmechanismen zurückge- führt werden. Liganden-Bindung kann durch allosterische Wechselwirkungen kontrolliert werden. Hämo- globin ist ein gutes Beispiel für eine solche Regulation die auf kooperativen Wechselwir- kungen beruht. Die Bindung eines Liganden an eine spezifische Koordinationsstelle wird durch das Binden eines anderen Liganden (Effektor oder Modulator) an eine andere Stelle des Proteins beeinflusst. Sind Liganden identisch=homotroper Effekt, unterschiedlich=hetero- troper Effekt. Diese Effekte können sowohl positiv als auch negativ sein. Hämoglobin zeigt positiv homotrope (O2 Bindung) und negativ heterotrope (BPG, CO2, H+, Cl-) Effekte. Allosterische Effekte ergeben sich aus Wechselwirkungen zwischen Untereinheiten oligo- merer Proteine. Diese Effekte sind schwer zu beschreiben -> Modelle Im Folgenden Modelle für die allosterische Regulation der Sauerstoffaffinität in Hb. 16 T Relation structure/fonction R concerté S S S S S S S S S S S S S S S S concerté S S S S S S S S S S Rôles de l’hémoglobine B/ Transport d’autres molécules par l’Hb CO • • • • 1) le monoxyde de carbone (« carboxyHb »): affinité pour l'hème qui est 200-300 fois supérieure par rapport à l'oxygène. déplace la courbe d’affinité de l’Hb pour l’O2 (=> saturable seulement à pO2 très élevée, ca. 120mmHg) déplaçable par un milieu 95%O2/5%CO2 se lie aussi sur myoglobine 17 Rôles de l’hémoglobine B/ Transport d’autres molécules par l’Hb 3) le monoxyde d’azote (NO) molécule vasodilatatrice qui a une forte affinité pour l’Hb, ca. 8000 fois supérieure à celle de l’O2. Le NO augmente l’effet Bohr. O2 O2 O2 O2 NO NO 4 O2 poumon 4 O2 NO XSNO +4 O2 poumon O2 O2 O2 O2 -Cys-NO Page 1013 Häm Biosynthese und Abbau 18 Page 1014 Häm Biosynthese: 1.Schritt = Kondensation von Gly und Succinyl-CoA The origin of the C atoms of succinylCoA as derived from acetate via the citric acid cycle. The mechanism of action of the PLPdependent enzyme δ-aminolevulinate synthase. Page 1016 Schritt 2: Pyrrolring Bildung durch Porphobilinogen Synthase 19 The synthesis of uroporphyrinogen III from PBG as catalyzed by porphobilinogen deaminase and uroporphyrinogen III synthase. Page 1018 acute intermittent porphyria Spontane cyclisierung Nicht symmetrisch Page 1020 Lokalisation der Häm Syntheseschritte in der Zelle Mangel -> Porphyrie -> Kolliken und neurologische Funktionsstörungen -> Urin dunkel 20 Häm Abbau Farbwechsel bei Abheilung von Hämatomen -> sichtbarer Beweis für Häm-Abbau Oxidative Spaltung des Porphyrinrings Hohe Affinität zu Häm 200x mehr als O2 -> Hb Struktur verringert CO affinität Erhöhtes Bilirubin -> Ablagerung in Augen Und Haut -> Gelbsucht -> 1) Erythrocytenabbau schnell 2) Leberdefekt 3) Gallengang verstopft Löslich in Wasser -> Ausgeschieden In Galle Page 1022 lipophil Rot -> über Serumalbumin transportiert im Blut Bei Neugeborenen oft Gelb -> UV Be- Strahlung -> Verwandlung in lösliche Isomere Grösster Teil als Stercobilin ausgeschieden Gelbe Färbung des Urins 21
