Rationale und rationelle EBV-Diagnostik im Leistungssport
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Aus der Abteilung Virologie des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Rationale und rationelle EBV-Diagnostik im Leistungssport: Evaluation von serologischen Quer- und Längsschnittdaten bei Ausdauerathleten und Kontrollpersonen INAUGURAL–DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br. Vorgelegt 2004 von Torben Pottgießer geboren in Hattingen (Ruhr) Dekan Prof. Dr. Christoph Peters 1. Gutachter Prof. Dr. Georg Bauer 2. Gutachter Prof. Dr. Hans-Hermann Dickhuth Jahr der Promotion 2006 Meinen Eltern und meinem Bruder Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung............................................................................................................................. 1 1.1 2 1.1.1 Epidemiologie und Übertragung ........................................................................... 1 1.1.2 Epstein-Barr Virus Lebenszyklus ......................................................................... 2 1.1.3 Klinisches Bild ...................................................................................................... 3 1.1.4 Differentialdiagnostik ........................................................................................... 4 1.2 Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik................................................... 4 1.3 Bedeutung der EBV-Infektion im Sport........................................................................ 7 1.4 Zielsetzung der Arbeit................................................................................................... 8 Material und Methoden.................................................................................................... 10 2.1 Material ....................................................................................................................... 10 2.1.1 Seren.................................................................................................................... 10 2.1.2 Testkit Lineassay................................................................................................. 11 2.1.3 Immunfluoreszenzverfahren ............................................................................... 11 2.1.4 Geräte .................................................................................................................. 12 2.2 3 Das Epstein-Barr Virus ................................................................................................. 1 Methoden .................................................................................................................... 12 2.2.1 EBV-IgG-Lineassay ............................................................................................ 12 2.2.2 Aviditätsbestimmung im Lineassay .................................................................... 18 2.2.3 Scantechnik, quantitative Bestimmung der Bandenintensität ............................. 21 2.2.4 Immunfluoreszenztechnik ................................................................................... 25 2.2.5 Longitudinalstudie............................................................................................... 27 2.2.6 Statistik und EDV ............................................................................................... 28 Ergebnisse .......................................................................................................................... 30 3.1 Querschnittstudie ........................................................................................................ 30 3.1.1 Probanden-Charakteristika .................................................................................. 30 3.1.2 EBV-IgG-Line-Assay ......................................................................................... 31 3.1.3 Immunfluoreszenztechnikverfahren (IFT) .......................................................... 54 3.1.4 Einzelfallbeschreibung und Scanmethodik ......................................................... 63 3.2 Longitudinalstudie....................................................................................................... 72 3.2.1 Probanden-Charakteristika .................................................................................. 72 4 3.2.2 EBV-IgG-Lineassay ............................................................................................ 73 3.2.3 Aviditätsbestimmung .......................................................................................... 79 3.2.4 Vergleich der beiden Gruppen ............................................................................ 82 Diskussion .......................................................................................................................... 88 4.1 Methoden Vergleich.................................................................................................... 88 4.1.1 Quantitative Scanmethodik ................................................................................. 92 4.2 Vergleich Athleten und Normalpersonen.................................................................... 94 4.3 Longitudinalstudie....................................................................................................... 96 4.4 Ausblick .................................................................................................................... 100 5 Zusammenfassung........................................................................................................... 102 6 Literaturverzeichnis........................................................................................................ 103 7 Danksagung ..................................................................................................................... 112 8 Lebenslauf........................................................................................................................ 113 1 Einleitung 1.1 Das Epstein-Barr Virus 1.1.1 Epidemiologie und Übertragung Das Epstein-Barr Virus hat sich neben dem Mensch über Millionen von Jahren co-entwickelt und sich während dieser Zeit äußerst an den menschlichen Organismus angepasst, so dass es heute einen der effektivsten Parasiten darstellt (82). Durch M. Epstein, B.G. Achong und Y. Barr wurden 1964 in kultivierten Burkitt-Lymphom-Zelllinien virusähnliche Partikel elektronenmikroskopisch nachgewiesen (22), die von dem Ehepaar Henle als neues Virus erkannt und nach ihren Entdeckern als Epstein-Barr Virus bezeichnet wurden. Im Laufe der Zeit wurde eine Serokonversion von spezifischen Antikörpern gegen das Epstein-Barr Virus bei solchen Personen festgestellt, die an dem Krankheitsbild „Infektiöse Mononukleose“ erkrankt waren. Damit wurde der Zusammenhang zwischen EBV-Infektionen und Infektiöser Mononukleose hergestellt. Außerdem wurde herausgefunden, dass über 90% der Erwachsenen Bevölkerung seropositiv sind (53;90), also spezifische Antikörper gegen das Epstein-Barr Virus besitzen. Das Virus gehört zu der Gruppe der Herpesviren (HHV-4) und hat, wie andere Herpesviren, latente und produktive (lytische) Phasen im Lebenszyklus, die zum einen das Virus lebenslang im menschlichen Organismus bestehen lassen und zum anderen die Virus-Produktion und Weiterverteilung beeinflussen. So kommt es zu einer latenten Infektion von B-Lymphozyten (4;116) und Virusproduktion in den Speichel (91;125). Das Epstein-Barr Virus verursacht das klinische Bild der Infektiösen Mononukleose und wird auch mit malignen Tumoren assoziiert. Die Primärinfektion erfolgt in den meisten Fällen asymptomatisch im Kindesalter (28), das Virus wird häufig zwischen Familienmitgliedern durch Speichel übertragen (30;44). Einen zweiten Erkrankungsgipfel klinisch manifester Infektionen erfolgt im jungen Erwachsenenalter (6). In dem Alter der Adoleszenz entwickelt sich eine manifeste „Infektiöse Mononukleose“ in 50-74% der Fälle (47;90;104). Man geht im Allgemeinen davon aus, dass sich solche Personen, die in ihrer Kindheit nicht mit dem Virus in Berührung gekommen sind, durch Küssen infizieren. Daher wird die Infektiöse Mononukleose im englischen auch als „kissing disease“ bezeichnet. Grundsätzlich ist eine Neuinfektion in jedem Alter möglich, doch im 1 Einleitung - Das Epstein-Barr Virus 2 lebenszeitlichen Verlauf immer unwahrscheinlicher. Bei einer Neuinfektion im höheren Lebensalter werden häufig schwerere Verläufe des klinischen Bildes beobachtet. In manchen Studien wird neben dem klassischen Übertragungsweg, auch eine Infektion durch sexuellen Kontakt diskutiert, da EBV in männlichen und weiblichen genitalen Sekreten festgestellt wurde (19;59;109). Ebenso wurden Infektionen nach Transfusion von größeren Frischblutvolumina beschrieben (1;36). 1.1.2 Epstein-Barr Virus Lebenszyklus Der für das Epstein-Barr Virus bekannte Tropismus für B-Zellen und Epithelien spielt im Lebenszyklus eine wichtige Rolle. Im Allgemeinen sind die Konzentrationen von EBV im Speichel gering, so dass bei einer Neuinfektion eine Amplifikation des Virus erst erfolgen muss, um Persistenz in den B-Zellen zu erreichen. Bei einer primären Infektion könnte also initial eine lytische Phase mit Replikation in Tonsillarepithelien mit nachfolgender Infektion der benachbarten B-Zellen erfolgen (12;26). Andererseits könnte auch eine direkte Infektion von BZellen in Lymphepithelien des Waldeyer`schen Rachenrings stattfinden, wo Kryptenstrukturen direkten Zugang zu lymphatischen Gewebe und B-Zellen erlauben könnten (27;97). Durch Expression der viralen Gene könnte es so zu einer Amplifikation der virusinfizierten Zellen bis zur Latenz kommen, noch bevor Immunabwehrmechanismen greifen (82). In der lytischen (produktiven) Phase kommt es zunächst zu einer Aktivierung der „immediate early-Proteine“, die als Transaktivatoren den Ablauf der lytischen Phase regulieren, indem sie die Expression der „delayed early-“ und späten Proteine aktivieren. Diese auch kurz als „early antigens“ (EAs) bezeichneten Proteine katalysieren verschiedene Schritte des Nukleinsäurestoffwechsels und sind bei DNA-Synthese und Genomvermehrung aktiv. Die Genprodukte der späten Gene sind Strukturproteine und werden auch als „viral capsid antigens“ (VCA) bezeichnet. Die Latenz des Virus scheint durch physiologische B-Zell Antigen-Aktivierungsabläufe erreicht und aufrecht gehalten zu werden (5). In einfachen B-Zellen werden zunächst unter dem Einfluss von „EBV nuclear antigen“ 2 (EBNA-2) alle viralen Gene exprimiert und die Zellen proliferieren. Nach anschließend verminderter EBNA-2-Aktivität umgehen neu infizierte BZellen Apoptose durch Expression der EBV „latenten Membranproteine“ (LMP) 1 und 2a, da LMP1 ein CD40-Homolog ist und LMP2a B-Zellrezeptorbindung vortäuscht, so dass nur nichtinfizierte B-Zellen über die Moleküle CD40 und den B-Zellrezeptor Apoptose unterlaufen (13;37;65;117;127). Über zytotoxische T-Zellen, T-Supressorzellen und natürliche Killerzellen werden die infizierten B-Zellen effizient auf 1/100 000 B-Zellen zurückgedrängt, welche lebenslang persistieren (23;68;102). 1 Einleitung - Das Epstein-Barr Virus 3 Nach der Primärinfektion werden nur wenige Gene exprimiert, darunter LMP2a und die Gruppe der EBNA-Gene. Besonders EBNA-1 ist für die Aufrechterhaltung des immortalisierten Zustands wichtig, da es z.B. die Bindung von viraler DNA an zelluläre Chromosomen vermittelt, und so die gleichmäßige Verteilung der DNA in Tochterzellen erreicht (126). Schließlich muss das Virus aus der Latenz reaktivieren und in den lytischen Zyklus treten, um andere Personen zu infizieren. Wenn diese Reaktivierung stattfindet, werden verschiedene lytische Proteine exprimiert, die aktiv Immunabwehrmechanismen hemmen können, z.B. ein Interleukin-10-Homolog (88) und andere Proteine, die die Ausschüttung von Zytokinen und Interferon beeinträchtigen (17;89). Auch ein Bcl2-Homolog (BHRF1) kann das Überleben der Zellen durch Hemmung der Apoptose verlängern (51). Besonders das BZLF-1-Protein ist ein Schlüsselprotein bei dem Umschalten vom latenten in den produktiven Infektionszyklus (18;64;87). Jedoch wird bei gesunden infizierten Personen ein Gleichgewicht zwischen Virus und Mensch erreicht, so dass das Virus persistiert und sich nur in geringem Maße vermehrt. 1.1.3 Klinisches Bild Bei Infektionen in jungem Alter kommt es selten zu symptomatischen Infektionen, in der Adoleszenz und jungem Erwachsenenalter in etwa 50-74% der Fälle (47;90;104). Das klinische Bild einer akuten EBV-Infektion ist dabei sehr variabel und zeigt überlappende Symptome mit anderen Erkrankungen (14;16). Bei dem als Infektiöse Mononukleose und Pfeiffer’sches Drüsenfieber bekannten Krankheitsbild kommt es nach einer Inkubationszeit von 4 bis 7 Wochen (57) zu klassischen Symptomen wie fieberhafte Angina tonsillaris, Pharyngitis, Lymphadenopathie und Splenomegalie (bis 50% der Fälle (106)). Bei Kindern kann eine respiratorische Symptomatik im Vordergrund stehen. Seltene neurologische Symptome stellen eine besondere diagnostische Herausforderung dar. Als Folge der polyklonalen BZellstimulation können Autoantikörper auftreten, die die Grundlage für hämolytische Anämie, Neutropenie und Thrombozytopenie bilden. Während der EBV-Primärinfektion kommt es zu einer vorübergehenden Suppression der zellulären Immunantwort (84;96) und dadurch gelegentlich zu einer Reaktivierung anderer persistierender Herpesviren wie dem VarizellaZoster-Virus (63). Im Blutbild zeigt sich häufig eine mäßige Leukozytose mit mononukleären Zellen (Monozytose). Dies kann als eine absolute Lymphozytose (73) und atypische Lymphozytose (atypische Lymphozyten >10% der Gesamtleukozyten) (15) beobachtet werden. Auch eine milde Hepatitis mit Erhöhung der Transaminasen ist möglich. Ebenso können Hauterscheinungen wie Erytheme und Urtikaria imponieren, Exantheme werden besonders in Zusammenhang mit der Gabe von Ampicillin und Amoxicillin gesehen (98). 1 Einleitung - Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik 4 Als Komplikationen sind Milzruptur (2;25;83;103), Atemwegsobstruktion (15;83) und selten chronische Verlaufsformen (66;111) beobachtet worden. Eine besondere Rolle spielt die EBVInfektion bei immuninkompetenten Patienten, bei denen im allgemeinen ein komplizierter, schwerwiegender Verlauf beobachtet wird und Reaktivierungen auftreten können (102). Neben dem klassischen und vermeintlich harmlosen Krankheitsbild der Infektiösen Mononukleose kann das Virus auch mit verschiedenen Malignomen assoziiert werden. Zu den klassischen Tumoren zählen dabei das Burkitt-Lymphom und das Nasopharynxcarcinom (69;128). Außerdem soll das Virus bei der Entstehung des Hodgkin-Lymphom (56;122), Leimyosarkomen (70;86) sowie Tumoren anderer Organe (82) beteiligt sein. 1.1.4 Differentialdiagnostik Gerade wegen dieser Variabilität des klinischen Bildes kommt der Differentialdiagnostik eine große Bedeutung zu. Da sich die Symptome zudem mit denen anderer Krankheitsbilder überlappen, sind vor allem folgende Krankheiten auszuschließen. Die Lymphadenopathie ist in ihrer Genese von einer Infektion mit Röteln-, Mumps- und Zytomegalieviren, einer HIVInfektion, Toxoplasmose, Brucellose, Leptospirose und Hodgkin-Lymphomen abzugrenzen. In Hinblick auf die erhöhten Transaminasen müssen Infektionen mit Hepatitisviren abgegrenzt werden. Gewöhnliche Streptokokkenangina und andere respiratorische Erreger können für die respiratorische Symptomatik ursächlich sein, es ergeben sich Verwechslungsmöglichkeiten durch im Sport nicht seltene, durch Rhino-, Adeno- oder RS-Viren ausgelöste obere Atemwegserkrankungen (URTI). Schließlich kann das auffällige Blutbild bei der Infektiösen Mononukleose an eine Leukämie denken lassen. 1.2 Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik Aufgrund der variablen und sich überlappenden Symptome einer EBV-Infektion kommt der adäquaten und aussagekräftigen Serologie eine große Bedeutung zu. Grundsätzlich soll durch die Serologie eine eindeutige Zuordnung eines Falles zu einer der Kategorien „seronegativ“, „akute Infektion“, oder „länger zurückliegende Infektion“ erfolgen. In der Vergangenheit wurde eine akute Infektion durch den Nachweis von heterophilen IgMAntikörpern bestätigt. Diese Antikörper richten sich nicht gegen virale Epitope, sondern entstehen vielmehr durch das „immunologische Chaos“, das durch eine akute EBV-Infektion der B-Lymphozyten ausgelöst wird. Der ursprünglich verwendete Paul-Bunnell-Davidsohn Test wurde durch Monospot Tests ersetzt. Sie basieren als Schnelltests auf der Agglutination von Latex-Partikeln mit den eventuell vorhandenen heterophilen Antikörpern im Serum des 1 Einleitung - Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik 5 Patienten. Diese neueren Tests haben nach Linderholm et al. Sensitivitäten von 70-92% und Spezifitäten von 96-100% (76). In einer anderen Studie wurden falsch-positive Raten von 0-4% respektive 10% gefunden (118). Die Bildung dieser heterophilen Antikörper kann verzögert sein, dann muss der Test im Verlauf wiederholt werden. Außerdem liefern diese Tests nicht immer eindeutige Ergebnisse, da 10-15% der Erwachsenen mit Infektiöser Mononukleose keine heterophilen Antikörper bilden (24;29;106), und diese bei Kindern sogar ganz fehlen können (112). Auch andere Krankheiten und Viren, wie HIV, Lymphome, Lupus erythematodes, Röteln, Parvovirus, die dazu teilweise Mononukleose-ähnliche Symptome auslösen, können manchmal die Bildung von heterophilen Antikörpern verursachen (52;58;120). Auch heute werden diese Tests dennoch benutzt. Neben den beschriebenen Problemen verweigern sie auch eine Aussage über die Existenz von spezifischen Antikörpern gegen EBV. Schon früh wurden Tests auf spezifische Antikörper gegen EBV-Antigene entwickelt. Als klassische Methode gilt die Immunfluoreszenztechnik, mit der die meisten Erfahrungen gewonnen und wesentliche serologische Reaktionsmuster erarbeitet wurden (55). Die Sensitivität und Spezifität wurde durch Anwendung der spezifischen Tests verbessert, doch brachten auch diese Verfahren keine gänzlich eindeutigen Ergebnisse. Diese klassische EBV Serologie basiert auf der Detektion der IgG- und IgM- Antworten mithilfe der indirekten Immunfluoreszenz (IFT) gegen VCA (viral capsid antigen), EA (early antigens) und Antikörper gegen EBNA-1 und EBNA-2 (Epstein-Barr virus nuclear antigens) (74;105). Dabei ist VCA-IgG der klassische Marker für Seropositivität und bleibt lebenslang nachweisbar. VCA-IgM ist bei akuter EBV-Infektion in etwa 80 % der Fälle gleichzeitig mit VCA-IgG nachweisbar, selten eilt es VCA-IgG voraus oder tritt verspätet auf (8;105). Durch Rheumafaktor kann es zu falsch positiven VCA-IgM Ergebnissen kommen (54). VCA-IgM ist bei 20 % der akuten Infektionen nicht nachweisbar. Andererseits kann dieser Marker in einigen Fällen lange persistieren oder infolge von Wiederaufnahme des Virus in den lytischen Zyklus auftreten. Damit erlaubt weder der positive Nachweis noch das Fehlen von VCA-IgM eine eindeutige Diagnose. Da Anti-EBNA2-Antikörper auch bei frischen Infektionen nachgewiesen werden können , ist es wichtig, dass ein serologischer Test zwischen Antikörpern gegen EBNA-1 und EBNA-2 diskriminieren kann (105). Anti-EBNA-1 fehlt regelmäßig in den ersten Wochen nach Krankheitsbeginn und stellt somit den sichersten Marker für eine abgelaufene Infektionen dar (75). Allerdings wird Anti-EBNA-1 von 5-10% der gesunden Personen nicht gebildet (8), oder kann unter massiver Immunsuppression sekundär negativ werden (119). Negatives Anti-EBNA1 bedingt durch Nichtbildung oder sekundären Verlust kann bei gleichzeitig positivem Anti- 1 Einleitung - Aufgabenfeld und Entwicklung der EBV Diagnostik 6 VCA-IgG eine akute Infektion vortäuschen. Diese mögliche falsch-positive Diagnose einer akuten EBV-Infektion stellt das größte Problem der EBV-Serologie dar. Dies gilt für Athleten genauso wie für die Allgemeinbevölkerung. Zusätzlich wird die Immunfluoreszenztechnik durch das mögliche Auftreten von antizellulären Bestandteilen der Seren erschwert, die keine Auswertung und Diagnose erlauben. Die für die Immunfluoreszenztechnik aufgezeigten Probleme (fehlendes Anti-EBNA-1; AntiEBNA-1-Verlust; untypische IgM-Antwort) treten auch bei der heute häufigen Verwendung von Enzymimmunoassays auf, die auf denselben Teststrategien beruhen. Neuartige serologische Tests mit dem Immunoblot-Verfahren haben den bisherigen Goldstandard der EBV-Serologie abgelöst (8), da sie die oben beschriebenen Schwierigkeiten der bisherigen Diagnostik lösen konnten. Besonders die Entdeckung eines zweiten späten Markers, dem p-18-IgG, konnte die Probleme der Anti-EBNA-1-Diagnostik im wesentlichen kompensieren (8), (Hansen C, Bauer G, 2000, unveröffentlicht). Dieser Marker geht nicht wie Anti-EBNA-1 unter Immunsuppression verloren und ist auch bei fehlender Anti-EBNA-1Bildung in 98% der seropositiven Personen vorhanden. Außerdem erwies sich die Anti-EBNA1 Erkennung im Blot 100-200fach sensitiver als in der antikomplementären Immunfluoreszenz (Maier A, Bauer G, 2000, unveröffentlicht). Eine Weiterentwicklung des Immunoblots stellt die Lineassay-Technik mit rekombinanten, hochgereinigten Antigenen dar. Sie erlaubt eine beliebige Anordnung der Antigene auf dem Teststreifen, die z.B. nach Verlauf der Serokonversion geordnet werden können und deren Banden immer eine exakt definierte Größe besitzen. Durch Verwendung der rekombinanten Antigene können auch solche Fälle mit antizellularer Aktivität gelöst werden, da es zu keinen Hintergrundreaktionen kommt. Nach Bauer (8) kann der EBV-IgG-Lineassay aufgrund der Vorteile gegenüber der Immunfluoreszenztechnik als neuer Goldstandard in der EBV-Serologie bezeichnet werden. Die EBV-Diagnostik wurde schon früh durch die Aviditätsbestimmung der vorhandenen Antikörper ergänzt. Bei der Aviditätsbestimmung handelt es sich um zusätzliches diagnostisches Verfahren zur Unterscheidung von frischen und abgelaufenen Infektionen, sowie zur eindeutigen Diagnosestellung von selteneren aberranten serologischen Konstellationen. Die Avidität ist als Teilbereich der Affinität zu betrachten, der sich nur auf die Stabilität der Antigen-Antikörper-Komplexe bezieht und auch als „funktionelle Affinität“ beschrieben wurde (7). Für eine Vielzahl von viralen Erregern wurde ein standardisiertes Testsystem der Avidität etabliert (z.B. für Rubella 50;62;71;72;108;114;115;121). Virus, CMV, HHV-6, HIV, VZV) (10;48- 1 Einleitung - Bedeutung der EBV-Infektion im Sport 7 Historisch hat sich die Aviditätsbestimmung aus der Beobachtung von inkonsistenten IgMAntworten entwickelt, als man ein zusätzliches Verfahren zur sicheren Unterscheidung von frischen und abgelaufenen Infektionen gesucht hat. Eine Anwendung findet sowohl in ELISATestsystemen als auch in der Immunfluoreszenztechnik statt. Das Prinzip stützt sich in der EBV-Serologie auf die positive Selektion von B-Zell Klonen, die höher affine IgG-Moleküle gegen das Antigen bilden und gegenüber niedrig affinen IgG-Antikörpern überlegen sind (77). Diese Reifungskinetik findet während jeder humoralen Immunantwort statt, variiert aber beispielsweise leicht von Patient zu Patient (34). Eine hohe Avidität spricht demnach für eine länger zurückliegende, eine geringe Avidität dagegen für eine frische oder sehr kürzliche Infektion. Auch für die EBV-Diagnostik wurde die Aviditätsbestimmung etabliert und kann für das Lineassay-Verfahren als diagnostisches Hilfsmittel herangezogen werden (3;8;119;123). 1.3 Bedeutung der EBV-Infektion im Sport Bisher hat gerade im Sport die unterschiedliche EBV-Diagnostik für Verunsicherung bei Athleten, Trainern und betreuenden Ärzten gesorgt, da gängige serologische Methoden nicht in jedem Fall ein eindeutiges Ergebnis liefern, weil sie nur den klassischen, nicht aber den aberranten serologischen Konstellationen Rechnung tragen. Das nicht seltene Fehlen der späten Anti-EBNA-1-Antikörper (5-10% der Fälle (8)) hat zur Diagnose von frischen oder persistierenden klinischen Infektionen geführt, auch wenn die Infektion länger zurückliegend ist. Gerade dieser Umstand hat für Athleten eine besondere Relevanz, da nachfolgend häufig Trainingsunterbrechung und Verzicht auf Wettkämpfe gefordert wird. Deswegen ist die sichere Unterscheidung von frischen und länger zurückliegenden Infektion für Athleten so wichtig. Besteht wirklich eine sich klinisch manifestierende frische Infektion, ist der Athlet im Vergleich zur Normalbevölkerung besonders betroffen, da der als eher langwierig beschriebene Krankheitsverlauf und der Wiederbeginn von leichtem Training nach frühestens 21 Tagen (46;83) die sportliche Laufbahn stark einschränken können. Für den behandelnden Sportarzt ist bei akuter EBV-Infektion vor allem die Frage interessant, wann das Training und Wettkämpfe ohne erhöhtes Risiko wieder aufgenommen werden können. Diese Entscheidungen setzen aber immer die gesicherte Diagnose einer akuten EBV-Infektion voraus, da bei anderen Krankheitsbildern verschiedene Therapieoptionen möglich sind, andere Komplikationen erwartet werden und ein Wiederbeginn meistens früher möglich ist. In Einzelfällen soll bei schweren Symptomen und Komplikationen viel länger ausgesetzt werden, von 3 Monaten (2) bis sogar 6 Monaten, die 1978 von Rutkow gefordert wurden (103). Heute wird dagegen in Abhängigkeit der Symptome, des Blutbildes und der Milzgröße eine Wiederaufnahme der sportlichen Aktivität nach 3-4 Wochen empfohlen (46;83). Besonders in Kontaktsportarten ist 1 Einleitung - Zielsetzung der Arbeit 8 die zwar seltene, aber mögliche Komplikation von Milzrissen (2;25;83;103) die vorherrschende Gefahr, die genauso atraumatisch und spontan auftreten kann. Es existieren anekdotenhafte Berichte über gehäufte EBV-Infektionen bei Athleten (67;107), die wie von Klassen et al. beschrieben auch als klinische Reaktivierungen imponiert haben (67). Aufgrund der sportlichen Aktivität wurde ebenfalls die Gefahr einer klinischen Reaktivierung oder verlängerter Dauer der akuten Erkrankung beschrieben, besonders wenn vorschnell nach akuter Infektion die sportliche Aktivität wieder aufgenommen wird (81). Gleeson et al. stellen fest, dass es bei intensiv trainierenden Athleten zu einer signifikanten Ausscheidung von EBVDNA im Speichel kommt und sehen einen signifikanten Zusammenhang von positivem EBVSerologiestatus und dem Auftreten von oberen Atemwegssymptomen (URTI) (43). Zudem erscheinen auch in der nicht-fachlichen Literatur immer wieder anekdotenhafte Berichte über EBV und Pfeiffer’sches Drüsenfieber, was als Erklärung für alle möglichen Geschehnisse herangezogen wird, wie z.B. hoher Blutdruck und jegliche unerklärliche Leistungsschwäche, selbst bei solchen Patienten, bei denen aufgrund des Alters über 30 Jahren eine frische Infektion sehr selten ist. In einem Fall soll die durch das EBV verursachte, andauernde Leistungsschwäche Grund gewesen sein, EPO-Doping anzuwenden, um wieder einen Leistungszuwachs zu bekommen (www.radsportnews.com, 10.08.04). Greenslade beschreibt einen typischen Fall einer fälschlich angenommenen EBV-Infektion, die aufgrund von EBVSerologie als länger zurückliegende EBV-Infektion identifiziert wurde und als „herkömmliche“ virale Infektion keine besondere Nachsorge oder Pause erfordert hat (45). In einem weiteren Fall wurde einem Athleten die Wiederaufnahme von Training untersagt, weil sich nach einer akuten Infektion keine Anti-EBNA-1-Antikörper nachweisen ließen (www.radsportnews.com, 06.05.02). Erst ein Test mit dem IgG-Lineassay bestätigte aufgrund des positiven Markers Antip18 eine länger zurückliegende Infektion. Nach all diesen Berichten würde man für ein Athletenkollektiv auch in irgendeiner Form besondere Ergebnisse erwarten. Es sind bisher keine großen Studien vorhanden, die Daten präsentieren, dass stark trainierte Athleten mehr oder weniger anfällig für EBV-Infektionen sind. Unklar bleibt auch, ob die bei Athleten bekannte transiente Immunsuppression (9;33;43;92-94;100;101;110) zu einer Änderung des EBV-Serologiestatus führen kann. 1.4 Zielsetzung der Arbeit Mit dieser Arbeit soll vor allem das Ziel verfolgt werden, die Prävalenz der möglichen Antikörperkonstellationen bei Athleten zu bestimmen und so einen Eindruck über das Ausmaß von EBV-Infektionen einer großen Athletenpopulation zu erhalten. Eventuelle Unterschiede zu 1 Einleitung - Zielsetzung der Arbeit 9 altersgematchten Normalpersonen sollen gleichzeitig festgestellt werden. Die serologischen Tests sollen anhand der klassischen Immunfluoreszenztechnik und dem Lineassay durchgeführt werden, um parallel die zuverlässigere Methode zu definieren und auf ihre Anwendbarkeit bei Athleten zu testen. Die Diagnostik soll bei unklaren Fällen oder aberranten Konstellationen durch die Aviditätsbestimmung ergänzt werden, um dieses zusätzliche diagnostische Verfahren auch für die Athletenpopulation zu etablieren. Durch die Verwendung einer neuen Scanmethodik zur quantitativen Auswertung des Lineassays soll herausgefunden werden, ob sich diese an einem großen Kollektiv gut anwenden lässt und Vorteile gegenüber der herkömmlichen semiquantitativen Auswertung bestehen. Mit der Durchführung der Longitudinalstudie soll das Ziel verfolgt werden, die Verläufe von Antikörperkonzentrationen bei höchst belasteten Ausdauerathleten zu studieren. Dabei soll wie in der Querschnittstudie und der Analyse der EBV-Prävalenz das Athletenkollektiv mit Normalpersonen verglichen werden und beobachtet werden, ob Konstellationen auftreten, die die Diagnostik besonders erschweren und ob ein Unterschied im Antikörperverlauf zwischen beiden Gruppen besteht. Durch die Beobachtung der Aviditätskinetik soll ein Eindruck über die Reifung von Antigen-Antikörper-Komplexen im Verlauf erlangt werden. In Hinblick auf die bei Athleten gefundenen EBV-Reaktivierungen soll mit dieser Studie untersucht werden, ob eine solche Reaktivierung auch serologisch nachweisbar ist oder besondere serologische Antikörperkonstellationen nach sich zieht. Beide Studienteile haben zusammenfassend das Ziel herauszufinden, ob EBV-Infektionen bei Athleten eine besondere Rolle zukommt und die Verunsicherung bei betreuendem Personal und Athleten gerechtfertigt ist. Abschließend wäre es für zukünftige EBV-Serologie im Leistungssport sinnvoll, ein eindeutiges Testprocedere zur sicheren Diagnostik festzulegen, das als allgemeine Empfehlung helfen soll, Fehldiagnosen zu vermeiden. 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Seren Im Rahmen der jährlichen sportmedizinischen Routineuntersuchung wurde bei Athleten der aktuell in Freiburg betreuten Disziplingruppen Biathlon, Skilanglauf, Nordische Kombination, Rad Straße, Rad Bahn und Mountainbike jeweils eine zusätzliche Blutprobe entnommen. Alle Athleten waren zum Zeitpunkt ihrer körperlichen Untersuchung und der Blutentnahme gesund und Mitglied im Landes- oder Bundeskader des zuständigen Sportfachverbandes. Um anschließend aus der Blutprobe das Serum zu erhalten, wurde die Probe für 15 min bei 4200 rpm zentrifugiert (Beckman CL-GPR Centrifuge). Die so gewonnenen 202 Seren der Gruppe „Athleten“ der Querschnitt-Studie wurden bis zu ihrer Verwendung bei –20°C eingefroren. Die Seren der Kontrollgruppe stammen von Medizinstudenten des 5. und 6. Semesters, deren obligatorische Eingangsblutabnahmen für das virologische Praktikum im Sommersemester 2001 in gleicher Weise wie die Proben oben genannter Athleten verarbeitet wurden. Aus dem Kollektiv aller Studenten (n=270) wurden nach Befragung Probanden ausgeschlossen, die mehr als 8 Stunden Sport pro Woche treiben, rauchen oder die Einwilligung zur zusätzlichen Untersuchung ihrer Seren verweigerten, so dass danach die Kontrollgruppe 200 Probanden umfasste. Für das Athleten-Kollektiv der Longitudinal-Studie wurden bei 15 Bundeskader-Athleten der Disziplin Biathlon zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Saison insgesamt je 4-6 Seren gewonnen. Diese wurden ebenfalls zentrifugiert und bis zum Zeitpunkt der serologischen Untersuchung eingefroren. Die Kontrollgruppe der Longitudinal-Studie setzt sich aus 12 Studenten zusammen, die zu den im Intervall circa 4-6wöchigen Blutabnahmen in die Klinik bestellt wurden. Die Blutproben konnten so direkt weiter verarbeitet werden und wurden ebenfalls bis zum Zeitpunkt ihrer Verwendung bei –20°C eingefroren. 2 Material und Methoden - Material 2.1.2 11 Testkit Lineassay In den Untersuchungen wurde der recomLine-IgG-Assay der Firma Mikrogen GmbH, Martinsried verwendet. Dieser Lineassay wird in Packungen geliefert, deren Reagenzien für 50 Bestimmungen reichen. Jeder Reagenziensatz enthält: ¾ Zwei Röhrchen mit insgesamt 50 durchnummerierten Teststreifen, die mit Testantigenen beschichtet sind ¾ Wasch- / Verdünnungspuffer – Konzentrat (100ml, zehnfach konzentriert, enthält Phosphat-Puffer, NaCl, KCl, Tween-20, 0,1% MIT, 0,2% Oxypyrion) ¾ Magermilchpulver (1x5g) ¾ Anti-human-IgG-Konjugat (12ml, zehnfach konzentriert) ¾ TMB Substratlösung, enthält 0,008% Kathon (2x 45ml) ¾ Gebrauchsinformation ¾ Auswertungsbögen Zusätzlich benötigt werden: ¾ Deionisiertes Wasser zum Verdünnen des Waschpuffers ¾ Absaugesystem mit Auffanggefäß für infektiöse Lösungen ¾ Schüttler (mit Longitudinal-Ausrichtung, 8-15 Bewegungen pro Minute) ¾ Pipetten, Mikropipetten für 2-10µl, 20µl und 2ml ¾ Messzylinder für 100 und 500ml ¾ Plastikpinzette zum Hantieren der Streifen ¾ Evtl. Hubpipette mit Glasflasche zum schnellen Aliquotieren des Waschpuffers ¾ Inkubationsschalen ¾ Optional kann die Abarbeitung des Lineassays auch maschinell erfolgen: Blot Automat „Matec Apollo“, „Tecan ProfiBlot II N“ 2.1.3 Immunfluoreszenzverfahren Zur Verwendung kamen hauseigene Burkitt-Lymphom-Zelllinien (Abteilung Virologie, Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Universität Freiburg), welche das EBV-Genom 2 Material und Methoden - Methoden 12 tragen. Bei dem verwendeten Testkit handelt es sich um Objektträger, auf welche eine P3HR-1Zellsuspension aufgebracht wurde. Die Zellen auf den Objektträgern wurden mit kaltem Aceton fixiert und permeabilisiert. Notwendige Seren: ¾ Negativkontrolle (1:40 vorverdünntes Serum eines EBV-negativen Blutspenders) ¾ Positivkontrolle (1:40 vorverdünntes Serum eines EBV-positiven Blutspenders) ¾ Zu testendes Serum (1:40 verdünnen) Folgende weitere Reagenzien werden benötigt: ¾ Pufferlösung zur Verdünnung des zu testenden Serums ¾ Waschlösung ¾ vorverdünnter Fluorescein-markierter Zweitantikörper: Ziege-anti-human-IgG ¾ Einbettmedium Elvanol 2.1.4 Geräte Zur Abarbeitung der Proben wurden zwei Geräte verwendet: „Matec Apollo“ Automat mit integriertem Scansystem zur quantitativen Erfassung der Antikörperkonzentrationen und „Tecan ProfiBlot II N Automat“ zur reinen Abarbeitung der Proben ohne Scanmöglichkeit. Die Scanauswertung der mit dem „Tecan“ bestimmten Lineassay-Streifen erfolgte mit einem herkömmlichen Scanner in München und einer speziell von der Firma Mikrogen entwickelten Software. 2.2 Methoden 2.2.1 EBV-IgG-Lineassay Zur Verwendung kam der recomLine EBV IgG der Mikrogen GmbH, Martinsried. Dieser Immunoassay verwendet rekombinant in E. coli produzierte Antigene gegen IgG Antikörper, die nach Aufreinigung auf die Teststreifen in gewünschter Reihenfolge aufgesprüht und fixiert werden. Er gilt als neuer Goldstandard in der EBV-Serologie (8). Als Testantigene dienen zwei Komponenten der Early Antigens (EAs: p54; p138) und des Viruskapsid Komplexes (VCAs: p23; p18), sowie ein nukleäres Antigen (EBNA-1 (p72)) und Immediate Early Antigen (BZLF-1). BZLF-1 wurde speziell für diese Studie aufgetragen und befindet sich nicht auf kommerziell erhältlichen Teststreifen. 2 Material und Methoden - Methoden 13 Das Probenmaterial kann Serum oder Plasma sein, hier wurde das durch 15minütige Zentrifugation (4200 rpm) gewonnene Serum verwendet. Die Verwendung von lipämischen, hämolysierten oder trüben Proben kann einen dunklen Hintergrund auf den Teststreifen ergeben. Diese Proben können zu verfälschten Ergebnissen führen und sollten daher nicht verwendet werden. Hitzeinaktivierte Proben können ebenso zu erhöhten HintergrundReaktionen führen. Eine mikrobielle Kontamination der Proben ist unbedingt zu vermeiden, genauso wie wiederholtes Auftauen und Einfrieren der Proben. A. Testvorbereitung Vor Testbeginn sind alle Bestandteile für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur zu bringen. Die nicht benötigten Streifen verbleiben im Röhrchen und werden bei 2-8°C gelagert. Für die Serum- und Konjugatverdünnung sowie die Waschschritte wird Waschpuffer benötigt. Vor dem Verdünnen ist das Volumen des Waschpuffers in Abhängigkeit der Anzahl der gewünschten Teststreifen zu bestimmen. Bei 50 Ansätzen werden 1000ml gebrauchsfertiger Waschpuffer benötigt. Das Waschpufferkonzentrat wird mit Magermilchpulver (1g auf 20ml Konzentrat) versetzt und im Anschluss mit deionisiertem Wasser 1:10 verdünnt. Nicht benötigter Waschpuffer kann bis zu 4 Wochen bei 4°C aufbewahrt werden. Die IgGKonjugatlösung ist unmittelbar vor dem Test herzustellen. Dazu wird ein Teil des IgGKonjugat-Konzentrats mit 9 Teilen des Waschpuffers verdünnt (1+9). Die Substratlösung ist bereits gebrauchsfertig. B. Testdurchführung In jeder Vertiefung der Inkubationsschale findet ein Test statt, dazu werden 2ml des gebrauchsfertigen Waschpuffers in jede Wanne pipettiert. Jeweils ein Teststreifen wird anschließend mit nach oben zeigender Streifennummerierung mit Hilfe einer Pinzette in die Vertiefungen gelegt, so dass der gesamte Streifen mit Flüssigkeit benetzt ist. Nun werden je Inkubationsansatz 20µl der unverdünnten Probe in die Vertiefung pipettiert. Die abgedeckte Inkubationsschale wird unter leichtem Schütteln für 1 Stunde inkubiert. Die in der Probe vorhandenen Antikörper können in dieser Zeit an die auf dem Streifen fixierten Antigene binden. Die Inkubationslösung wird nun aus den einzelnen Vertiefungen abgesaugt und im Anschluss werden diese insgesamt drei Mal mit 2ml Waschpuffer je Vertiefung im je 5minütigen Waschschritt gewaschen. Nun werden in jede Inkubationswanne 2ml der vorbereiteten IgG-Konjugatlösung gegeben und unter erneuter Abdeckung und Schütteln für 45 min inkubiert. So kann die Konjugatlösung (2. 2 Material und Methoden - Methoden 14 Antikörper, Anti-human-IgG) an die IgG Antigen-Antikörper Komplexe der ersten Inkubation binden (siehe Abbildung 1). Die Konjugatlösungen werden nach der Inkubation wieder abgesaugt. Die Teststreifen werden dann nach obigem Schema dreimal mit 2ml Waschpuffer gewaschen. Bei der nun folgenden dritten Inkubation werden je Vertiefung 1,5 ml der fertigen Substratlösung pipettiert und unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Substratlösung macht die Antigen-Antikörper-Komplexe mit dem 2. Antikörper sichtbar (siehe Abbildung 1). Sobald die Cutoff-Kontrollbande zu sehen ist (standardisiert nach 10min) wird die Inkubationslösung abgesaugt und drei Mal mit deionisiertem Wasser nachgespült. Die Streifen werden nun mit einer Pinzette aus den Vertiefungen genommen und zum Trocknen für ca. 2 Stunden auf saugfähiges Papier gelegt. Alternativ können die Streifen auch in den Inkubationswannen belassen und zum Trocknen in einen Wärmeraum gelegt werden. Es ist darauf zu achten, dass die vor dem Test für die zu testenden Serumproben festgelegten Streifennummern eindeutig bleiben. Nach dem Trocknen können die Streifen auf die Auswertungsbögen aufgeklebt und protokolliert werden. Abbildung 1: Schematischer Aufbau des EBV-Lineassay: Im Serum vorhandene Antikörper binden an die auf dem Teststreifen fixierten EBV-Antigene und werden durch die Substratmarkierung eines sekundären Antikörpers als Banden sichtbar gemacht (hier ist exemplarisch eine länger zurückliegende Infektion abgebildet). C. Testauswertung Die Identifizierung der Banden erfolgt über die den Testkits beigelegten spezifischen Kontrollstreifen. Eine Auswertung der Streifen ist dann möglich, wenn folgende Kriterien 2 Material und Methoden - Methoden 15 erfüllt sind. Neben der Reaktionskontrollbande sollte die Konjugat-Kontrollbande (z.B. für das IgG Konjugat) eine deutliche dunkle Färbung zeigen. Außerdem sollte die „Cutoff-Bande“ eine schwache, aber sichtbare Färbung aufweisen. Die Bewertung der Bandenintensität erfolgt in Relation zur Cutoff-Bande anhand Tabelle 1 und ist exemplarisch in Abbildung 2 dargestellt: Tabelle 1: Bewertung der Bandenintensität in Relation zur Cutoff-Bande Banden in Relation zur Cutoff Bande Negativ Intensität - schwächere Intensität (+) gleiche Intensität + leicht stärkere Intensität ++ stärkere Intensität +++ sehr starke Intensität ++++ Sobald auf den Streifen mindestens eine Bande der Intensität „+“ zu sehen ist, kann ein Serum als EBV-reaktiv bezeichnet werden. Ein negatives Ergebnis liegt vor, falls keine Banden oder isolierte Banden der Intensität „(+)“ sichtbar sind. Abbildung 2: exemplarische Bewertung der Bandenintensität in Relation zur Cutoff-Bande D. Testinterpretation Der EBV-Status ist meist durch Antikörper-Reaktivitäten gegen verschiedene Schlüsselantigene und das Auftreten von typischen Antigen-Bandenkonstellationen gekennzeichnet. Diese EBV 2 Material und Methoden - Methoden 16 Antigene und ihre Bedeutung bei der Bestimmung des EBV-Status sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Bedeutung der EBV-Antigene Antigen Name Klassifizierung Beurteilung des EBV-Status EBNA-1 (p72) Epstein-Barr nukleäres Antigen IgG-Titer fehlt regelmäßig bei Frischinfektionen, Marker für abgelaufene Infektionen p18 Virus Capsid Antigen IgG-Titer fehlt regelmäßig bei Frischinfektionen, Marker für abgelaufene Infektionen, auch bei Fehlen von EBNA-1 sehr häufig positiv p23 Virus Capsid Antigen Oft schon zu Beginn einer Infektion nachweisbar, bei abgelaufenen Infektionen sehr oft positiv p138 EA: Early Antigen IgG-Titer bei frischen Infektionen sehr häufig nachweisbar, schwache Titer bei abgelaufenen Infektionen möglich p54 EA: Early Antigen IgG-Titer bei frischen Infektionen sehr häufig nachweisbar, schwache Titer bei abgelaufenen Infektionen möglich BZLF-1 Immediate Early Antigen Bei Frischinfektionen nachweisbar, bei Immunsuppression stark erhöht vorhanden, sonst unspez. Seropositivitätsmarker Die Interpretation der serologischen Konstellationen der verschiedenen Antigene erlaubt dann eine Kategorisierung des EBV-Status. Grundsätzlich lässt sich der Serostatus in negativ, frisch (akut) und abgelaufen (länger zurückliegend) einteilen. ¾ Negativ: Seren werden als negativ bewertet, die keine oder deutlich schwächere Antikörperbanden als die Cutoff Bande bieten. ¾ Frisch: Bei Erstinfektionen (akut) sind die späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Antip18 noch negativ, Anti-p23, Anti-BZLF-1 und frühe Antikörper (Anti-p138, Anti-p54) sind einzeln oder in jeder möglichen Kombination nachweisbar. ¾ Abgelaufen (länger zurückliegend): Bei abgelaufenen, länger zurückliegenden Infektionen (ca. ab 3 Wochen nach Erstinfektion) bietet sich das Bild der positiven späten Marker Anti-EBNA-1 und Anti-p18 in Kombination mit positiver p23 Bande. Frühe Antikörper sind in einigen Fällen noch nachweisbar. 2 Material und Methoden - Methoden 17 Abbildung 3: exemplarische Beispiele der Lineassay Ergebnisse: Bandenkonstellation der häufigsten Serotypen (inklusive der aberrant zurückliegenden Infektion ohne Anti-p72-IgG (Anti-EBNA1-IgG) In Abbildung 3 sind die häufigsten Lineassay Ergebnisse mit den entsprechenden Bandenkonstellationen exemplarisch illustriert. In der Realität existiert eine hohe Variabilität der Antikörperbandenintensität und die dargestellten Fälle können in anderer Konstellation imponieren. Zur genaueren Analyse lassen sich weitere serologische Gruppen und Subgruppen voneinander abgrenzen, die aber in der Routinediagnostik teilweise nicht als besonderer Serostatus hervorgehoben werden und entsprechend selten vorkommen. Für diese Studie wurde diese Einteilung jedoch ergänzend verwendet: ¾ Unklar: Es erscheinen mehrere sehr schwache Banden der Intensität (+) oder parallel eine isolierte Bande der Intensität + und andere Banden sind negativ. Es könnte sich um eine Kontamination des Serums oder des Testansatzes handeln, eine gleichzeitige Wiederholung mit demselben Serum und ein Test eines Folgeserums nach ein bis zwei Wochen sollte durchgeführt werden. 2 Material und Methoden - Methoden 18 ¾ Kürzlich abgelaufen: Der späte Antikörper Anti-p18 kann neben den frühen Antikörpern schon vorhanden sein, Anti-EBNA-1 ist meist negativ, selten sehr schwach positiv. Kürzlich schließt etwa einen Zeitraum von mehreren Monaten ein. Auch hier ist eine Kontrolleinsendung nach 2-4 Wochen empfohlen. Länger zurückliegende Infektionen mit aberranter Antikörperkonstellation: ¾ Abgelaufen ohne Anti-EBNA-1-Bildung: Der späte Antikörper Anti-EBNA-1 (p72) ist nicht vorhanden, aber Anti-p18 ist nachweisbar, häufig in Kombination mit einer Anti-p23 Bande. Frühe Antikörper sind in einigen Fällen noch nachweisbar. ¾ Abgelaufen mit schwacher Anti-EBNA-1-Bildung: Der späte Antikörper AntiEBNA-1 ist vorhanden, aber nur sehr schwach ((+)) nachweisbar. Die Banden Anti-p18 und Anti-p23 sind nachweisbar, frühe Antikörper in einigen Fällen noch vorhanden. ¾ Abgelaufen ohne Anti-p18: Anti-EBNA-1 ist positiv, Anti-p18 fehlt oder ist sehr schwach bei dieser Antikörper Konstellation. Die Anti-p23 Bande ist häufig positiv, frühe Antikörper können in einigen Fällen nachweisbar sein. ¾ Weitere abgelaufene Konstellationen: Sehr selten sind entweder Anti-EBNA-1 und Anti-p18 gemeinsam nicht nachweisbar (1/1000), oder Anti-EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 gemeinsam nicht vorhanden (1/5000), obwohl es sich um abgelaufene, länger zurückliegende EBV-Infektionen handelt. Ein negatives Ergebnis des Lineassay schließt die Möglichkeit einer EBV-Infektion nicht aus. Wenn die Serumprobe sehr früh nach erfolgter Infektion gewonnen wurde, sind evtl. noch keine nachweisbaren Antikörper gegen EBV-Antigene gebildet worden. 2.2.2 Aviditätsbestimmung im Lineassay Zur eindeutigen Diagnosestellung von seltenen aberranten serologischen Konstellationen und bei der Abgrenzung von akuten, kürzlich zurückliegenden und länger zurückliegenden Fällen wird die für die EBV-Diagnostik etablierte Methode (3;8;119;123) der Aviditätsbestimmung durchgeführt. Dazu wird parallel ein zweiter Testansatz des Lineassay je Serum benötigt und zunächst so verfahren, wie unter 2.2.1B beschrieben. Nach der ersten Inkubation werden die Seren für drei Minuten mit 2 ml einer 7 molaren Harnstofflösung inkubiert (Waschpuffer mit Harnstoff), wodurch sich niedrig-avide Antikörper durch die denaturierenden Eigenschaften aus ihren Bindungen lösen und nachfolgend durch die Waschschritte und das Absaugen entfernt werden. Hoch-avide Antikörper lassen sich dagegen nicht mehr aus ihren Bindungen verdrängen. Nach 2 Material und Methoden - Methoden 19 diesem Inkubationsschritt mit 7M Harnstoff wird die normale Abfolge des Lineassays fortgesetzt. Das Verhältnis zwischen der Intensität der Antikörper des normalen Ansatzes und der Antikörper des Aviditätsansatzes (Harnstoff) wird als Aviditätsindex bezeichnet. Um zwischen geringer und hoher Avidität zu unterscheiden, muss ein „Aviditäts-Cutoff“ festgelegt werden. Für die in dieser Studie verwendete Scantechnik wurde für die IgG-Antikörper gegen EBNA-1 und p18 ein Index von 0,4, für p23-IgG von 0,5 als Cutoff zwischen gering- und hochavide festgelegt. Diese Indices wurden durch arbeitsgruppeninterne Vorexperimente festgelegt und sind in Abbildung 4 abgebildet. Abbildung 4: Festlegung der Aviditätsindices durch arbeitsgruppeninterne Vorexperimente mit Seren von länger zurückliegenden und akuten Infektionen (für Anti-EBNA-1 und Anti-p18 wurde ein Index von 0,4, für Anti-p23 ein Index von 0,5 als Cutoff zwischen gering- und hoch-avide festgelegt) Die verschiedenen Serodiagnosen des Lineassays sind mit den typischen Aviditätsbefunden in Abbildung 5 exemplarisch dargestellt. In dieser Studie wurde die Aviditätsbestimmung besonders für die Unterscheidung von kürzlich zurückliegenden und länger zurückliegenden Infektionen bei negativer Anti-EBNA-1-Antwort herangezogen. Dabei gelten solche Infektionen als kürzlich zurückliegend, die eine geringe Avidität des Anti-p18-IgG aufweisen, wenn Anti-p18-IgG überhaupt schon positiv ist. Demgegenüber wird bei den länger zurückliegenden Infektionen ein positives hoch-avides Anti-p18-IgG gefordert. Außerdem werden zusätzlich selbst solche Fälle noch als kürzlich befundet, die zwar schon den späten Antikörper Anti-EBNA-1-IgG aufweisen, für den aber eine geringe Avidität gefunden wird. Der Antikörper Anti-p23-IgG ist bei den kürzlich zurückliegenden Infektionen meist niedrigavide, kann aber auch schon stärker gereift und damit hoch-avide sein (Index größer 0,5). Die 2 Material und Methoden - Methoden 20 Avidität von Anti-p23-IgG wurde nicht als Unterscheidungsmerkmal von kürzlich und länger zurückliegenden Infektionen herangezogen. Ein frische EBV-Infektion zeichnet sich durch eine geringe Avidität der nachweisbaren Antikörper aus, einzelne Antikörper wie die des EA-Komplexes können im Einzelfall schon stärker gereift und hoch-avide sein. Abbildung 5: exemplarische Beispiele der Lineassay Bandenkonstellation bei Aviditätsmessung der häufigsten Serotypen, besonders eignet sich die Aviditätsbestimmung zur Unterscheidung von akut frischen, kürzlichen und länger zurückliegenden EBV-Infektionen Die Aviditätsbestimmung der als unklar definierten Fälle war aufgrund der schwachen Antikörper Intensitäten nur eingeschränkt möglich und wurde nicht als diagnoseweisend verwendet. Nicht für alle primär im Lineassay getesteten Seren wurde auch ein Aviditätstest durchgeführt. Sowohl bei dem Kollektiv der Athleten als auch bei dem der Normalpersonen wurden alle Fälle nach dem ersten Durchgang analysiert und dann einige Fälle ausgewählt, die entweder uneindeutig frisch oder zurückliegend waren, oder so selten, dass eine Aviditätsbestimmung zusätzlichen Aufschluss über den Serostatus geben sollte. Für einige klassisch zurückliegende Fälle wurde die Avidität ebenfalls bestimmt, um methodische Fehler auszuschließen und die Theorie von hoch-aviden Antikörpern bei länger zurückliegenden Infektionen zu bestätigen. 2 Material und Methoden - Methoden 21 Für solche Athleten, die auch zum Kollektiv der Longitudinalstudie gehören, wurde für die Querschnittstudie der in der Longitudinalstudie erhobene Aviditätsbefund des ersten Serums verwendet. 2.2.3 Scantechnik, quantitative Bestimmung der Bandenintensität Durch die Scantechnik lassen sich die auf den Teststreifen vorhandenen Antikörper-Banden quantitativ erfassen. Zwei unterschiedliche Methoden wurden zur Datenerhebung angewendet. Die größte Anzahl der Lineassays wurde mit dem Gerät „Apollo“ gescannt, welches in einem ersten Schritt die automatische Abarbeitung der Proben übernimmt, und in einem zweiten Schritt die entwickelten Banden mit einer integrierten Kamera fotografiert. Mit einem Windows-kompatiblen Betriebsprogramm des „Apollo-Automaten“ werden die Amplitude und das Integral der optischen Dichte der Antikörper-Banden erfasst und gespeichert. Bei der anderen verwendeten Methode handelt es sich um einen herkömmlichen kommerziell erhältlichen Scanner, der die auf einem Papierbogen aufgeklebten entwickelten Teststreifen scannt. Die so erhaltenen Bilder werden mit einer eigens der Firma Mikrogen programmierten Software ausgewertet und ebenfalls werden Amplitude und Integral der optischen Dichte der Antikörper-Banden aufgezeichnet. A. Vergleich und Validierung der Scanmethodik „Apollo“ vs. „München“ In Abbildung 6 ist ersichtlich, dass zwischen den beiden Verfahren ein linearer Zusammenhang besteht, aber offensichtlich andere Werte gemessen werden. Der Unterschied zwischen beiden Methoden scheint durch einen Skalierungsfaktor korrigierbar. Insbesondere dann, wenn Banden im intensiveren Bereich lagen, wurde die Amplitude der Bande mit dem Scansystem „München“ höher bewertet. Der Vergleich der beiden Methoden mit dem Bland-Altman Test (11) hat bestätigt, dass beide Methoden nicht die gleichen Werte messen, besonders dann nicht, wenn die vorhandenen Banden sehr intensiv sind. Die Werte sind so zwar nicht direkt vergleichbar, dennoch erlaubt jede Methode durch den Scan ein realistisches Abbild der Bandenintensität, eben mit unterschiedlicher Skalierung der gemessenen Amplitude. Es wurde bewusst darauf geachtet, dass für Vergleiche, beispielsweise der Kollektive, immer nur eine Scanmethode verwendet wurde. Ebenso wurden beide für die Aviditätsbestimmung notwendigen Scans eines Serums jeweils nur mit einem Scansystem durchgeführt. 2 Material und Methoden - Methoden 22 Abbildung 6: Korrelation der Scansysteme „Apollo“ versus „München“ für Antikörper-Amplituden von AntiEBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 (je 50 Fälle): die Messsysteme liefern unterschiedliche Werte der Amplituden, scheinen aber durch einen Skalierungsfakor korrelierend beschreibbar. Zur Verdeutlichung der gerade im intensiven Bereich höher erfassten Banden im Scan „München“ ist zusätzlich die folgende Abbildung 7 aufgeführt. Abbildung 7: Beziehung zwischen Amplitudenwert „Apollo“ und Amplitudenwert „München“ für die Antikörper gegen EBNA-1, p18 und p23 (je 50 Fälle wurden als Referenz mit beiden Scanmethoden erfasst) 2 Material und Methoden - Methoden 23 Mit der Scantechnik in München wurden Bandenamplituden bis 400 ermittelt, mit dem „Apollo“ Gerät bis 180. In solchen Abbildungen, die Scanergebnisse darstellen, findet sich dadurch eine unterschiedliche Skalierung der Ordinate, abhängig davon, mit welchem Scansystem der Teststreifen erfasst wurde. Bei der München-Methode mussten einige Scan-Werte korrigiert werden, da sie nicht den auf den Teststreifen abgebildeten Antikörper-Banden entsprachen, und entweder viel zu hohe oder zu niedrige Werte anzeigten. Es war nicht rekonstruierbar, ob es sich um einen Scanfehler oder eine Fehldokumentation gehandelt hat. Diese Fehlbestimmungen wurden dann anhand des Originalbefundes und in Abhängigkeit der Intensität der anderen gescannten Banden desselben Antikörpers angepasst, z.B. durch Mittelwertbildung aus dem vorangehenden und nachfolgenden Antikörper, je nachdem, welche Intensität mit dem Auge gefunden wurde. Außerdem wurden die Werte <10 mancher Testreihen nicht als positiv erfasst und als „Null“ bezeichnet, da diese Werte als „Hintergrundrauschen“ imponierten und auf dem Teststreifen nicht als korrelierende Bande gefunden wurden. B. Anwendung in Querschnittstudie Im Querschnitt-Teil wurden alle Fälle beider Kollektive mit dem Apollo Blotautomaten sowohl abgearbeitet als auch im Anschluss direkt gescannt. So wurde gewährleistet, dass die bei der statistischen Analyse (Vergleich der beiden Gruppen mit dem Mann-Whitney Test) betrachteten Scanwerte alle mit derselben Methode gewonnen wurden und vergleichbar waren. Die jeweils ersten Durchgänge der Aviditätsbestimmung wurden ebenfalls mit „Apollo“ durchgeführt. Nur die zusätzlich im zweiten Durchgang bestimmten Aviditäten wurden mit dem Tecan Blotautomaten abgearbeitet und manuell in München gescannt. Diese Werte wurden nicht gemeinsam analysiert. C. Anwendung in Longitudinalstudie Die Methodik des Scanverfahrens bietet gerade für die Auswertung der Antikörper-Verläufe in der Longitudinalstudie neue Möglichkeiten zur genauen Beobachtung. Durch den Scan der Bandenintensität können auch geringe Unterschiede erfasst und quantifiziert werden. Die herkömmliche Beurteilung der Bandenintensität wie in Tabelle 1 dargestellt erlaubt nur eine kategorisierende Auswertung. Deshalb wurden alle Antikörpertiterverläufe durch die Scanmethodik quantifiziert und auch die Aviditätsbestimmungen anhand des Scans durchgeführt. Alle vorhandenen Lineassays der Longitudinal Studie wurden ausschließlich mit dem Blot Automaten „Tecan“ abgearbeitet und in München gescannt und waren somit auch statistisch auswertbar. 2 Material und Methoden - Methoden D. 24 Vergleich Scanmethode vs. „++“-Bestimmung Um die ordinale Beurteilung des Lineassays durch die Ablesung mit dem Auge („++“) anhand der cutoff-Bande mit der quantitativen Scanmethodik zu vergleichen, ist in Abbildung 8 bis Abbildung 11 jeweils der der Ablesung mit dem Auge entsprechende Scanbefund dargestellt. Abbildung 8: Vergleich Scan-Auge EBNA-1 Abbildung 9: Vergleich Scan-Auge p18 Abbildung 10: Vergleich Scan-Auge p23 Abbildung 11: Vergleich Scan-Auge BZLF-1 Es ist zu erkennen, dass auch die semiquantitative Ablesung mit dem Auge eine gute Einteilung der Banden in verschiedene Intensitäten erlaubt. Ebenfalls ist offensichtlich, dass es in den „+“ Klassen zu Überschneidungen kommt und so teilweise eine Bande abgelesen wird, die auch 2 Material und Methoden - Methoden 25 höher respektive niedriger hätte klassifiziert werden können. Selbst für scheinbar negative Banden wurde mit der Scanmethodik eine Amplitude ermittelt, die sich aber als „Hintergrundrauschen“ interpretieren lässt (Amplitude ca. 0-10) und bei der Auswertung entsprechend berücksichtigt werden sollte. 2.2.4 A. Immunfluoreszenztechnik Testprinzip Bei diesem Testverfahren werden Zellen, die virale Proteine exprimieren, entweder direkt auf Glasplättchen kultiviert oder als Suspension auf Glas aufgetropft. Anschließend werden sie fixiert und ihre Membranen so permeabilisiert, dass zugefügte Antikörper leicht ins Zellinnere eindringen können. Dies kann z.B. sehr einfach durch eine Behandlung der Zellen mit Aceton erreicht werden. Befinden sich nun im zu untersuchenden Serum Antikörper mit Bindungsaffinität für das fragliche virale Protein, so werden diese Antikörper durch den nachfolgenden Waschprozess nicht entfernt, sondern bleiben am viralen Antigen haften. Die gebundenen Antikörper können in einem zweiten Arbeitsschritt mithilfe von Zweitantikörpern, die einen Fluoreszenz-Marker tragen und gegen die konstanten Regionen der schweren Kette des humanen IgG-Moleküls gerichtet sind, sichtbar gemacht werden. Solche Zweitantikörper werden durch Immunisierung eines Kaninchens oder einer Ziege mit gereinigtem humanem IgG erzeugt und sind kommerziell erhältlich. Die verwendete Burkitt-Lymphom-Zellinie P3HR-1 zeigt ein charakteristisches Expressionsmuster der viralen Antigene. So exprimieren alle Zellen das Kernantigen EBNA-1 (EBV-nuclear-antigen), aber kein EBNA-2. Weiter exprimieren etwa 5-10% der Zellen nachweisbare Mengen der Kapsidantigene VCA. B. Testdurchführung Zur Verringerung des Hintergrundsignals sollte das eigene Serum 1:40 verdünnt eingesetzt werden (15 µl Serum mit werden mit 585 µl Puffer gemischt). Die Positiv- und Negativkontrollen werden ebenfalls 1:40 verdünnt. Auf die Bereiche 1 - 3 des Objektträgers mit den fixierten Zellen werden folgende Proben aufgetropft (siehe Abbildung 12): ¾ 40 µl positives Kontrollserum ¾ 40 µl negatives Kontrollserum ¾ 40 µl verdünntes eigenes Serum 2 Material und Methoden - Methoden 26 Abbildung 12: schematische Darstellung des Objektträgers der Immunfluoreszenztechnik Zur Inkubation wird der Objektträger für 45- 60 min bei Raumtemperatur in feuchter Kammer stehen gelassen. Anschließend werden die aufgetropften Seren mithilfe von Waschlösung (PBS) aus einer Plastikpipette weggewaschen. Dann wird der Objektträger für 5 min in eine Küvette mit Waschlösung gestellt. Der Waschvorgang in der Küvette wird mit frischer Waschlösung zwei Mal wiederholt. Überschüssige Waschlösung sollte vom Objektträger abtropfen, vollständiges Eintrocknen aber verhindert werden. Auf die drei zellbedeckten Bereiche des Objektträgers werden je 40 µl Zweitantikörper aufgetropft und dann wird erneut für 45- 60 min bei Raumtemperatur in feuchter Kammer inkubiert. Im nächsten Waschgang werden die Zweitantikörper mit PBS-Waschlösung sorgfältig entfernt. Wie im ersten Waschschritt wird der Objektträger für 5 min in Küvette mit Waschlösung (PBS) gestellt und das Vorgehen mit frischer Waschlösung (PBS) zwei Mal wiederholt. Wieder sollte überschüssige Waschlösung vom Objektträger abtropfen und vollständiges Eintrocknen verhindert werden. Abschließend werden auf die benutzten Bereiche des Objektträgers je ein Tropfen Elvanol-Lösung gegeben und ein Deckglas aufgelegt, ohne Luftblasen einzuschließen. C. Testauswertung Die drei zellbedeckten Bereiche des Objektträgers werden unter dem Fluoreszenz-Mikroskop betrachtet. EBV-VCA-Antikörper positive Seren zeigen ebenso wie EBNA-1-Antikörper positive Seren eine charakteristische Färbung der Zellen. Das Ablesen dieser spezifischen Fluoreszenz verlangt eine große Erfahrung des Ablesenden, um Hintergrund- und unspezifische Reaktionen richtig deuten zu können. Gewisse Seren enthalten Antikörper, welche gegen Bestandteile der Wirtszelle gerichtet sind. Solche Seren fallen durch eine hohe Hintergrund-Fluoreszenz auf. Die sichere Unterscheidung zwischen Hintergrund und spezifischem Signal ist nur durch einen Vergleich von Zellen 2 Material und Methoden - Methoden 27 möglich, welche sich in der Expression des kritischen viralen Antigens unterscheiden. Dabei ist wichtig, dass die zu vergleichenden Zellen absolut identischen Färbe- und Waschbedingungen ausgesetzt waren. Dies ist in der Praxis am einfachsten dadurch zu bewerkstelligen, dass die verwendete Zellkultur sowohl Virusantigen-exprimierende Zellen als auch nicht-exprimierende Zellen enthält, wie die verwendete P3HR-1-Zelllinie. D. Testinterpretation Die Hintergrund-Fluoreszenz durch Störfaktoren im Serum ist bei manchen Seren so groß, dass für Anti-EBNA-1 oder VCA-IgM keine eindeutige Aussage getroffen werden konnte. Diese Seren wurden als antizellular bezeichnet. Die in dieser Studie in der Immunfluoreszenztechnik verwendeten Antigene erlauben die in Tabelle 3 dargestellte Interpretation des Serostatus: Tabelle 3: Interpretation der IFT-Antikörper und Befunderhebung anhand der in der IFT verwendeten Testantigene Antikörper-Konstellation Interpretation des EBV-Status VCA-IgG negativ negativ EBNA-1 negativ VCA-IgG positiv akute Infektion möglich EBNA-1 negativ VCA-IgG positiv länger zurückliegende Infektion EBNA-1 positiv/grenzwertig VCA-IgG oder EBNA-1 keine Aussage möglich Antizellular (BJAB positiv) 2.2.5 Longitudinalstudie Das erste Serum jedes Athleten (T1) wurde bereits im Rahmen der Querschnitt-Studie getestet und ausgewertet. In der Longitudinalstudie wurde bewusst nicht auf dieses Ergebnis zurückgegriffen und das Serum wurde neben den Folgeseren nochmals mit einer neuen Charge des Lineassay getestet und befundet. Die Seren der Normalpersonen wurden in der Longitudinalstudie mit der gleichen LineassayCharge wie die der Athleten getestet. Diese Probanden gehörten nicht zum Kollektiv der im Querschnitt untersuchten Normalpersonen. Um beide Kollektive vergleichen zu können, wurden die Blutabnahmen nach unten folgendem Schema in Tabelle 4 zu je 6 Zeitpunkten zusammengefasst: 2 Material und Methoden - Methoden 28 Tabelle 4: Einteilung der zu vergleichenden Zeitpunkte nach erfolgter Blutabnahme Abnahme Athleten Zeitpunkt Datum (Anzahl) Datum (Anzahl) T1 29.01.2001 (6x) 19.11.2001 (1x) 29.03.2001 (1x) 22./23.11.2001 (5x) 25.04.2001 (1x) 26.11.2001 (2x) 15./16.05.2001 (5x) T2 N Normalpersonen 13 18.09.2001 N Bemerkung Abnahme der Athleten teilweise nach der Saison 8 20.12.2001 (5x) 07.01.2002 (1x) 11 14.01.2001 (2x) T3 T4 T5 11.10.2001 bis 23.10.2001 29.11.2001 bis 03.12.2001 12.02.2002 9 4 15./16.04.2002 (5x) 13 22./23.04.2002 (2x) 19.01.2002 7 10.06.2002 (6x) 12 17.06.2002 (2x) T6 8 8 16.07.2002 03.04.2002 (5x) Vorolympische Abnahme bei Athleten Olympische Winterspiele in Salt Lake City: 08.-24.02.2002 18.04.2001 (1x) alle Abnahmen der Athleten nach Olympia und nach der Wintersaison 22.04.2001 (3x) 29.04.2001 (2x) 15.05.2002 (2x) 15.06.2002 (1x) 14 8 Die Kategorisierung in verschiedene Zeitpunkte ist wichtig, um entsprechende statistische Tests und vergleichende Abbildungen verwenden zu können. Die jahreszeitlichen Abnahmedaten stimmen nicht unbedingt überein, die Seren der Normalpersonen wurden kalendarisch später gewonnen. Wichtig ist der ungefähr gleiche Zeitraum zwischen den Abnahmen, der je zwischen 4-8 Wochen liegt, ausgenommen die erste Abnahme der Athleten, die am Ende der vorangehenden Saison durchgeführt wurde. Da die Normalpersonen als „Nicht-Athleten“ ausgesucht wurden, ist die Beziehung der Abnahme zur Jahreszeit und dem jeweiligen Trainingszustand anders als bei den Athleten unerheblich. Nicht alle Probanden konnten zu allen Zeitpunkten einbestellt werden, so dass bei manchen Zeitpunkten weniger Seren gewonnen werden konnten, was bei der Analyse entsprechend zu berücksichtigen ist. 2.2.6 Statistik und EDV Die Administration der Daten erfolgte mit „Microsoft Excel 2000" (Version 9.0.2812), die statistische Auswertung mit dem Programm „SPSS for Windows“ (Version 11.5.0). Die graphische Aufarbeitung der Daten wurde teilweise mit Excel, teilweise mit SPSS durchgeführt. Weitere Abbildungen wurden mit „Microsoft PowerPoint 2000“ erstellt. 2 Material und Methoden - Methoden 29 Der Chi-Quadrat Test wurde verwendet, um Athleten und Normalpersonen auf signifikante Unterschiede in Bezug auf die Serodiagnosen der Lineassay-Tests und IFT-Tests zu untersuchen. Mit Fisher’s Exact Test wurde zusätzlich der Unterschied zwischen einer Diagnose weniger Probanden und den Diagnosen aller anderen Probanden beurteilt. Mit dem MannWhitney Test wurden die gemessenen Antikörper-Amplituden der Scanmethodik beider Kollektive verglichen, um eventuelle signifikante Differenzen herauszuarbeiten. Für die Darstellung der deskriptiven Maße wurden Boxplots verwendet. In der Longitudinalstudie wurde der Verlauf der Antikörperkonzentrationen beider Gruppen mittels univariater Varianzanalyse untersucht, um die Kollektive auf signifikante Unterschiede zu prüfen. Die repeated-measurement-Methode konnte nicht zuverlässig angewendet werden, da die Kollektive je Zeitpunkt zu klein waren und nicht alle Probanden zu allen Zeitpunkten erfasst wurden. Außerdem wurde der T-Test für unverbundene Stichproben angewendet, um herauszufinden, ob für einen Antikörper-Amplitudenmittelwert zwischen Beobachtungsbeginn (T1) und Beobachtungsende (T6) ein Unterschied bestanden hat, unabhängig vom Verlauf zwischen den Messzeitpunkten. 3 Ergebnisse 3.1 Querschnittstudie Mit der Querschnittstudie sollte vor allem untersucht werden, mit welcher Prävalenz verschiedene EBV-spezifische serologische Konstellationen in den Kollektiven der Athleten und Normalpersonen vorliegen. Dazu wurden die Gruppen je mit dem Lineassay-Testverfahren als auch mit der Immunfluoreszenztechnik untersucht. Damit konnte gleichzeitig ein Methodenvergleich zwischen diesen Testverfahren erfolgen. Besonders interessierte dabei, mit welcher Häufigkeit aberrante Konstellationen bei länger zurückliegenden Infektionen auftreten. Darüber hinaus hat die Fragestellung interessiert, ob sich die Athleten von einem altersgruppenähnlichen Kollektiv von Normalpersonen in Bezug auf ihren EBV-Status oder diagnostische Schwierigkeiten unterscheiden würden. Dazu wurden die Gruppen in beiden Testsystemen miteinander verglichen. Abschließend sollte das Scanverfahren erstmals ermöglichen, exemplarische Einzelfälle verschiedener Serotypen quantitativ inklusive des Aviditätsbefundes zu beschreiben und damit Besonderheiten der EBV-Serologie herauszuarbeiten. 3.1.1 Probanden-Charakteristika Es wurden insgesamt 402 Probanden in der Querschnittstudie getestet, die sich, wie nachfolgend beschrieben, auf zwei Kollektive verteilten. A. Athleten Das Athleten Kollektiv setzte sich aus 76 (37,6%) weiblichen und 126 (62,4%) männlichen Probanden zusammen. Die insgesamt 202 Athleten waren durchschnittlich 19 Jahre alt (SD 4). B. Normalpersonen Im Normalpersonen Kollektiv wurden 123 (61,5%) weibliche und 77 (38,5%) männliche Probanden getestet. Die insgesamt 200 Probanden waren durchschnittlich 23 Jahre alt (SD 1). 3 Ergebnisse - Querschnittstudie C. 31 Vergleich Durchschnittlich waren die Athleten 4 Jahre jünger als die Normalpersonen, besaßen aber mit SD 4 gegenüber SD 1 eine größere Standardabweichung. Die beiden Kollektive wurden unabhängig vom Geschlecht der Testpersonen ausgewertet. 3.1.2 EBV-IgG-Line-Assay Mit Hilfe des Lineassay sollten mehrere Fragestellungen untersucht werden. Um einen Eindruck über die Prävalenz und die Variabilität der serologischen Antwort gegen EBV-Antigene zu gewinnen, wurden in einem ersten Schritt alle 202 Seren des Athleten Kollektivs und alle 200 Seren des Normalpersonen Kollektivs einmal auf IgG gegen EBV-Antigene getestet und sowohl klassisch, d.h. anhand der cutoff-Bande, als auch mit dem Scansystem ausgewertet. Zunächst sollte die Zusammensetzung der Kollektive in Bezug auf die Konstellation der verschiedenen Serodiagnosen bestimmt werden. Die Variabilität der serologischen Antwort sollte durch die Darstellung aller Einzelfälle in tabellarischer Form deutlich werden. Anschließend wurde der EBV-Status beider Kollektive miteinander verglichen, um eventuelle Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu untersuchen und die Diagnostik erschwerende Konstellationen zu erkennen. Durch die Scanmethodik wurde das Vorkommen der verschiedenen Antikörper in einem letzten Schritt in quantitativer Weise detailliert analysiert, um gezielt nach Unterschieden zwischen Athleten und Normalpersonen in der Variation einzelner Antikörper zu suchen. A. Athleten Zunächst sind die Befunde des Lineassay-Verfahrens der Athleten in ihrer absoluten Häufigkeit und ihrem prozentualen Anteil in Tabelle 5 und Tabelle 6 dargestellt. Die in Tabelle 5 zusammengefasst als seropositiv bezeichneten Fälle sind in Tabelle 6 in detaillierte Serodiagnosen aufgeschlüsselt. Tabelle 5: Lineassay Befund Übersicht, Einteilung nach Seropositivität Lineassay Befund Athleten Anzahl % seronegativ (weniger als +) 35 17,3 unklar 6 3,0 seropositiv (ab einer + Bande) 161 79,7 Summe 202 100,0 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 32 Tabelle 6: Lineassay Befund Detailansicht Lineassay Befund Athleten Anzahl % negativ 35 17,3 unklar 6 3,0 frisch 1 0,5 kürzlich abgelaufen 11 5,4 länger zurückliegend (abgelaufen) 122 60,4 abgelaufen ohne Anti-EBNA-1 9 4,5 abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1 15 7,4 abgelaufen ohne (schwaches) Anti-p18 3 1,5 202 100,0 Summe (die „seropositiv“ Befunde sind in detaillierte Serodiagnosen aufgeschlüsselt: unklar (grenzwertig positive Banden, Avidität schwer beurteilbar, nicht sicher positiv, evtl. Kontamination), frisch (keine späten Antikörper, Antikörper gegen EAs positiv, meist gering avide), kürzlich abgelaufen (gering avide späte Antikörper, meist nur Anti-p18, Anti-p23 meist gering avide), länger zurückliegend (beide späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Anti-p18 und Anti-p23 deutlich positiv und hoch avide, EAs in Einzelfällen positiv) Neben dem erwartet hohen Anteil an klassisch zurückliegenden Infektionen fielen auch die verschiedenen Typen von zurückliegenden Fällen mit aberranter Konstellation auf. Insgesamt wurde bei 11,9% der Fälle kein bzw. nur ein sehr schwaches Anti-EBNA-1 gefunden. Ohne die Bestimmung eines zweiten späten Markers wie Anti-p18 hätten diese Fälle nicht eindeutig als zurückliegend bestimmt werden und gar als vermeintlich kürzliche Infektionen gelten können. Die Unterscheidung dieser von den 5,4% kürzlichen Fällen erfolgte durch den Nachweis von hoch-aviden Anti-p18- und Anti-p23-Antikörpern. Demgegenüber wurde nur bei 1,5% der Fälle eine zurückliegende Infektion ohne positives Anti-p18 gefunden. Bei diesen Fällen war AntiEBNA-1 positiv und die Antikörper hoch-avide, so dass deren Status als zurückliegend ohne Anti-p18 befundet wurde. Durch die Kombination der beiden späten Marker Anti-EBNA-1 und Anti-p18 und der Aviditätsbestimmung konnten auch die selteneren aberranten Konstellationen sicher als zurückliegend befundet werden. Um die Variationsbreite der serologischen Antwort zu erfassen, wurden alle Fälle einzeln betrachtet und teilweise durch die Aviditätsbestimmung zusätzlich differenziert. Dazu wurden grundsätzlich die drei Kategorien seropositiv, unklar und seronegativ unterschieden. Insbesondere konnte so auch die Variationsbreite der Antikörperkonstellation innerhalb einer Serogruppe beobachtet werden. In Tabelle 7 sind die seropositiven Fälle der Athleten einzeln aufgeführt. Die Daten sind nach der Intensität des Anti-EBNA-1-Antikörpers geordnet. Außerdem ist die Avidität der Antikörper Anti-EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 für die gesondert getesteten Fälle zur besseren Differenzierung des Serostatus dargestellt. Die Aviditätsbestimmung wurde besonders 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 33 zur Unterscheidung von kürzlich abgelaufenen und länger zurückliegenden aberranten Infektionsstadien herangezogen, aber auch einige klassisch zurückliegende Fälle mit positivem Anti-EBNA-1 und Anti-p18 wurden zur Überprüfung der erwarteten hohen Avidität bestimmt. Tabelle 7: Ergebnisse des Lineassay (nur seropositive) der Athleten: nach Intensität des Anti-EBNA-1Antikörpers geordnet, („abgelaufen“ entspricht länger zurückliegend), die Spalte Avidität zeigt die Avidität der jeweiligen Antigen-Antikörper Komplexe Nr. Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 Beurteilung p18 p23 - 95 - - - - ++ - - - - frisch 98 - ++ +++ (+) + ++++ + - gering 156 - ++ ++ - - ++ - - gering gering kürzlich abgelaufen 51 - ++ ++ - - - - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 72 - ++ + - - + - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 94 - ++ +++ - + + - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 149 - ++ ++ (+) ++ +++ (+) - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 158 - ++ + - - ++ - - hoch gering abgelaufen ohne EBNA-1 186 - ++ + - - (+) - - hoch gering abgelaufen ohne EBNA-1 6 - +++ + - - - - - hoch gering abgelaufen ohne EBNA-1 108 - ++++ ++++ - (+) +++ (+) - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 164 - ++++ ++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 hoch kürzlich abgelaufen 7 (+) (+) ++++ - +++ ++ - - - hoch kürzlich abgelaufen 16 (+) (+) ++ - - ++++ + hoch - gering kürzlich abgelaufen 36 (+) (+) +++ - - (+) - - - gering kürzlich abgelaufen 25 (+) ++ +++ - - + - - gering hoch kürzlich abgelaufen 128 (+) ++ ++ (+) - +++ (+) - gering gering kürzlich abgelaufen 21 (+) ++ +++ - (+) ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 54 (+) ++ +++ - - (+) - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 65 (+) ++ ++ - (+) (+) - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 86 (+) ++ +++ (+) - ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 107 (+) ++ (+) - - - - - hoch - abgelaufen, schwaches EBNA-1 171 (+) ++ (+) (+) - ++ - - hoch - abgelaufen, schwaches EBNA-1 177 (+) ++ +++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 10 (+) +++ ++ - (+) + - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 19 (+) +++ ++ - (+) ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 26 (+) +++ ++ - (+) ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 34 (+) +++ +++ - (+) + - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 46 (+) +++ ++ - + ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 120 (+) +++ +++ - - + - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 146 (+) +++ +++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 35 (+) ++++ +++ - - +++ (+) - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 39 + + ++ - - + - hoch (gering) hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 34 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 hoch Beurteilung p18 p23 hoch hoch abgelaufen 1 + ++ +++ - - + - 4 + ++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 22 + ++ ++ - - +++ (+) abgelaufen 29 + ++ +++ - - ++ - abgelaufen 75 + ++ +++ - - ++ - 182 + ++ ++ - - (+) - abgelaufen 184 + ++ ++ + ++ + - abgelaufen 2 + +++ +++ - - - - 3 + +++ +++ - - (+) - abgelaufen 96 + +++ +++ ++ + +++ (+) abgelaufen 132 + +++ ++++ - - +++ (+) abgelaufen 173 + +++ ++++ - + ++ - abgelaufen 176 + +++ ++ - - (+) - abgelaufen 201 + +++ ++++ (+) - ++++ + abgelaufen 155 + ++++ ++ - - ++ - abgelaufen 169 + ++++ ++++ - - - - hoch 74 + ++ ++ - - - - gering gering gering kürzlich abgelaufen 99 + ++ +++ - + +++ (+) gering gering gering kürzlich abgelaufen 198 + ++ ++ - - ++ - (hoch) gering gering kürzlich abgelaufen 199 + ++ + - - - - gering gering gering kürzlich abgelaufen 5 ++ + + - - +++ (+) abgelaufen 8 ++ + ++ - (+) (+) - abgelaufen 14 ++ + + (+) (+) ++ - abgelaufen 37 ++ + +++ - - - - abgelaufen 49 ++ + ++ - - ++ - abgelaufen 91 ++ + ++++ (+) + ++ - abgelaufen 56 ++ ++ +++ - - ++ - abgelaufen 58 ++ ++ +++ (+) (+) (+) - abgelaufen 79 ++ ++ +++ (+) - ++ - abgelaufen 87 ++ ++ ++++ - (+) ++ - abgelaufen 106 ++ ++ ++ - - ++ - abgelaufen 110 ++ ++ +++ - (+) + - abgelaufen 116 ++ ++ ++ - - ++++ + abgelaufen 142 ++ ++ ++ - - + - 143 ++ ++ +++ - - + - abgelaufen 168 ++ ++ ++ - - ++ - abgelaufen 24 ++ +++ + - + + - abgelaufen 28 ++ +++ ++ - - ++ - 38 ++ +++ ++ - - - - abgelaufen 40 ++ +++ + - - + - abgelaufen hoch hoch hoch hoch hoch hoch hoch hoch hoch hoch abgelaufen hoch abgelaufen hoch abgelaufen hoch abgelaufen hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 35 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 52 ++ +++ ++ - - - - abgelaufen 69 ++ +++ ++ - - (+) - abgelaufen 89 ++ +++ - - (+) - - abgelaufen 93 ++ +++ ++ + ++++ +++ (+) abgelaufen 102 ++ +++ ++ - + + - 112 ++ +++ +++ - - ++ - abgelaufen 115 ++ +++ +++ - (+) ++ - abgelaufen 139 ++ +++ +++ - (+) + - 147 ++ +++ +++ - - - - abgelaufen 178 ++ +++ + - - + - abgelaufen 185 ++ +++ + - (+) ++ - abgelaufen 17 ++ ++++ +++ - - +++ 42 ++ ++++ +++ - - + - abgelaufen 67 ++ ++++ +++ - - ++ - abgelaufen 77 ++ ++++ +++ - (+) ++++ + abgelaufen 20 +++ + + - (+) + - abgelaufen 32 +++ + ++ - - - - abgelaufen 160 +++ + +++ - - (+) - abgelaufen 162 +++ + ++ - - ++ - abgelaufen 33 +++ ++ ++ - - - - abgelaufen 50 +++ ++ +++ - (+) (+) - abgelaufen 53 +++ ++ +++ - - ++ - abgelaufen 64 +++ ++ + - - - - abgelaufen 82 +++ ++ (+) - - + - abgelaufen 84 +++ ++ + - - (+) - abgelaufen 138 +++ ++ ++ - + ++ - abgelaufen 170 +++ ++ + - - + - abgelaufen 179 +++ ++ +++ - - ++ - abgelaufen 41 +++ +++ +++ - +++ ++ - abgelaufen 85 +++ +++ +++ - - - - abgelaufen 114 +++ +++ +++ - (+) ++++ + abgelaufen 117 +++ +++ +++ - - ++++ + abgelaufen 122 +++ +++ +++ (+) (+) ++ - abgelaufen 123 +++ +++ +++ - (+) + - abgelaufen 133 +++ +++ ++ - - +++ (+) abgelaufen 134 +++ +++ +++ (+) (+) ++ - abgelaufen 135 +++ +++ ++ - - + - abgelaufen 140 +++ +++ +++ (+) - ++++ + abgelaufen 181 +++ +++ ++++ - - + - abgelaufen 196 +++ +++ + - - (+) - abgelaufen hoch hoch hoch hoch gering abgelaufen hoch abgelaufen abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 36 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 11 +++ ++++ ++++ - - + - abgelaufen 18 +++ ++++ + - + + - abgelaufen 27 +++ ++++ +++ - - + - abgelaufen 43 +++ ++++ +++ - - ++++ + abgelaufen 48 +++ ++++ +++ (+) (+) ++ - abgelaufen 83 +++ ++++ +++ - - ++++ + abgelaufen 126 +++ ++++ ++++ - - + - abgelaufen 129 +++ ++++ ++ - - (+) - abgelaufen 144 +++ ++++ ++++ - - ++ - abgelaufen 159 +++ ++++ +++ - (+) +++ (+) abgelaufen 167 +++ ++++ ++ - - + - abgelaufen 189 +++ ++++ +++ + ++++ +++ (+) abgelaufen 192 +++ ++++ +++ - (+) ++ - abgelaufen 61 +++ - ++++ - - + - 92 ++++ + ++ - - + - abgelaufen 180 ++++ + ++ - - ++ - abgelaufen 13 ++++ ++ +++ - - + - abgelaufen 88 ++++ ++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 100 ++++ ++ ++++ - - (+) - abgelaufen 174 ++++ ++ ++ (+) - ++++ + abgelaufen 202 ++++ ++ ++++ - - ++ - abgelaufen 30 ++++ +++ +++ (+) +++ ++++ + abgelaufen 57 ++++ +++ + - - (+) - abgelaufen 63 ++++ +++ ++ - (+) + - 70 ++++ +++ +++ - - - - 78 ++++ +++ + - - ++++ + 101 ++++ +++ ++ - - ++ - abgelaufen 109 ++++ +++ + (+) (+) - - abgelaufen 113 ++++ +++ ++++ - - ++++ + abgelaufen 119 ++++ +++ + (+) (+) + - abgelaufen 131 ++++ +++ +++ - (+) (+) - 137 ++++ +++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 148 ++++ +++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 163 ++++ +++ + - - + - abgelaufen 172 ++++ +++ ++ - ++ +++ (+) abgelaufen 175 ++++ +++ +++ - - + - abgelaufen 187 ++++ +++ +++ (+) - + - abgelaufen 197 ++++ +++ (+) (+) (+) (+) - abgelaufen 44 ++++ ++++ ++++ - (+) ++ - abgelaufen 68 ++++ ++++ ++ - (+) + - abgelaufen hoch hoch - hoch hoch abgelaufen ohne p18 hoch abgelaufen abgelaufen hoch hoch hoch hoch gering abgelaufen hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 97 37 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 ++++ ++++ +++ (+) - ++ - abgelaufen 103 ++++ ++++ ++++ - - - - abgelaufen 111 ++++ ++++ ++++ - (+) ++++ + abgelaufen 124 ++++ ++++ ++++ (+) + (+) - abgelaufen 130 ++++ ++++ ++++ - - ++ - abgelaufen 141 ++++ ++++ ++++ - - (+) - abgelaufen 151 ++++ - ++ - + ++++ + hoch - hoch abgelaufen ohne p18 191 ++++ (+) ++ - - +++ (+) hoch - hoch abgelaufen ohne p18 Vor allem zwei Aspekte fielen bei der Betrachtung der Antikörperkonstellation aller Probanden auf. Zum einen waren die späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Anti-p18 bei allen zurückliegenden Fällen erwartungsgemäß konstant nachweisbar. Selbst bei den aberranten Fällen, bei denen entweder Anti-EBNA-1 oder Anti-p18 nicht oder nur sehr schwach nachweisbar war, war der jeweils andere späte Antikörper vorhanden und hoch-avide. Zum anderen fiel demgegenüber die hohe Variabilität der frühen Antikörper Anti-p138 und Anti-p54 auf. Zumeist konnten keine oder nur sehr schwache frühe Antikörper nachgewiesen werden, dennoch gab es auch eindeutig zurückliegende Fälle, die stark positive frühe Antikörper aufwiesen. Dann war vor allem Anti-p54 positiv, wie z.B. bei Fall Nr. 30, 41, 172 und 189. Bei Fall Nr. 93 war neben dem stark positiven Anti-p54 auch Anti-p138 nachweisbar. Stark intensive Banden gegen Anti-p138 wurden im Kollektiv nicht gefunden. Antikörper gegen das p23-Antigen waren bei fast allen seropositiven Fällen in allen Intensitäten deutlich nachweisbar. Mit Fall Nr. 89 wurde eine zurückliegende Infektion ohne p23-Antikörper Bildung gefunden. Ebenso nicht vorhanden bzw. schwach war die Anti-p23-Bande bei Fall Nr. 82, 197 und den aberrant zurückliegenden Fällen („abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1“) Nr. 107 und Nr. 171. In den meisten Fällen wurden auch Antikörper gegen das auf den kommerziellen Lineassays nicht erhältliche Antigen BZLF-1 positiv gefunden. Bei manchen war die Antikörper-Antwort stärker positiv, so dass die 1:16 Verdünnung des Antigens ebenfalls eine positive Bande auf dem Teststreifen erkennen lies. Auch bei den kürzlich zurückliegenden Fällen wurden positive Anti-BZLF-1-Antikörper gefunden, so dass das Vorhandensein von Anti-BZLF-1 keinen Rückschluss auf das Infektionsstadium zugelassen hat und Antikörper gegen BZLF-1 als unspezifische Seropositivitätsmarker betrachtet wurden. Die stark intensiven Banden gegen BZLF-1, wie sie bei Immunsuppressiven beschrieben wurden (Benning D, Bauer G, 2002, unveröffentlicht), wurden bei den Athleten nicht gefunden. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 38 Außerdem konnte beobachtet werden, dass es klassisch zurückliegende hoch-avide Infektionen mit nur einfach positivem Anti-EBNA-1 und zweifach positivem Anti-p18 (z.B. Nr. 22) gibt, aber auch solche mit besonders intensiven Anti-EBNA-1- und Anti-p18-Antworten (z.B. Nr. 68). Aus der Intensität der Antikörperbanden als solche, also der Konzentration der Antikörper, konnte somit nicht auf den Infektionszeitpunkt rückgeschlossen werden. Tabelle 8 listet die Lineassay Ergebnisse der unklaren Fälle auf. In der Spalte Avidität ist die Avidität der Antikörper gegen EBNA-1, p18 und p23 dargestellt, jedoch war sie bei den schwachen Antikörper-Intensitäten nur eingeschränkt messbar und damit nicht so diagnoseweisend wie bei stärkeren Antikörper-Intensitäten. Tabelle 8: unklare Ergebnisse des Lineassay des Athletenkollektivs, die Spalte Avidität zeigt die Avidität der jeweiligen Antigen-Antikörper Komplexe (bei diesem Serostatus eingeschränkt messbar) Nr. Antigen Lineassay EBNA-1 p18 p23 p138 p54 Avidität BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung Wiederholung p23 47 (+) - (+) - + (+) - hoch - hoch unklar unklar 154 (+) - (+) - + + - hoch - hoch unklar unklar 55 - (+) (+) - (+) (+) - - gering gering unklar nicht sicher frisch 66 (+) - (+) - (+) (+) - hoch - gering unklar nicht sicher positiv 104 (+) - (+) - + (+) - gering - gering unklar nicht sicher positiv 190 + - (+) - (+) (+) - gering - gering unklar nicht sicher positiv Die beobachteten grenzwertigen Banden („(+)“) sind intensiver als solche bei den negativ klassifizierten Fällen (siehe unten), aber noch immer schwächer als die Cutoff-Bande. Zusätzlich wurden einfach positive („+“) Antikörper gefunden, die die gleiche Intensität wie die Cutoff-Bande hatten, z.B. bei Nr. 47, 104, 154 und 190. Dennoch hat sich für diese Fälle keine eindeutige Diagnose stellen lassen, da sowohl die Konstellation der vorhandenen Antikörper als auch die Intensität der gefundenen Banden für eine klare Diagnose nicht ausreichten. Um Verunreinigungen des Testansatzes als Fehler auszuschließen, wurden diese Fälle ein zweites Mal im Lineassay inklusive der Aviditätsbestimmung getestet. Auch dieses Vorgehen konnte keine eindeutige Serodiagnose liefern. Bei Fall Nr. 55 könnte es sich um eine serologisch frische Infektion gehandelt haben, da sich Anti-p18 und Anti-p23 durch Harnstoff wieder ablösen ließen, und so eine geringe Avidität hatten. Vorsichtig beurteilt galt der Fall als unklar bzw. nicht sicher frisch, ein Folgeserum hätte Klarheit schaffen können. Auch bei den Fällen Nr. 66, 104 und 190 war die Avidität teilweise gering, das eventuell schon positive Anti-EBNA-1 spricht aber gegen eine frische Infektion, bei der auch deutlich intensivere Antikörper gegen die Early antigens p138 und p54 erwartet worden wären. Letztlich sind diese Fälle als nicht sicher positiv und somit „unklar“ zu bezeichnen. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 39 Auffällig war das sehr ähnliche Muster der vorhandenen Antikörper, das bei den in Tabelle 8 gezeigten Fällen mit Ausnahme von Nr. 55 gefunden wurde. Auch bei den Normalpersonen wurden sehr ähnliche Muster gefunden und als „unklar“ beschrieben. (siehe Tabelle 12). Auf den Teststreifen der negativen Fälle konnten meistens keine Antikörper-Banden festgestellt werden. Bei Betrachtung dieser nicht in Tabellen dargestellten Fälle fiel auf, dass in manchen Seren (in 7 von 35 Seren) grenzwertig positive Antikörper nachweisbar waren. Diese Banden waren jedoch deutlich schwächer als die cutoff-Bande und gelten nach dem Testprinzip als negativ und nicht sicher EBV-reaktiv. Bei diesen wenigen grenzwertig positiven Banden könnte es sich um Verunreinigungen des Serums oder des Testansatzes oder um unspezifische Reaktionen von anderen im Serum enthaltenen Antikörpern gegen die vorhandenen Antigene gehandelt haben. B. Normalpersonen Die 200 Normalpersonen wurden wie die Athleten zunächst alle im Lineassay getestet, um Prävalenz und Inzidenz des EBV-Status sowie das Ausmaß der serologischen Variabilität beschreiben zu können. Die Befunde des Lineassay-Verfahrens sind in ihrer absoluten Häufigkeit und ihrem prozentualen Anteil in Tabelle 9 und Tabelle 10 dargestellt. Die in Tabelle 9 zusammengefasst als seropositiv bezeichneten Fälle sind in Tabelle 10 in detaillierte Serodiagnosen aufgeschlüsselt. Tabelle 9: Lineassay Befund Übersicht Lineassay Befund Normalpersonen Anzahl % seronegativ (weniger als +) 31 15,5 unklar 4 2,0 seropositiv (ab einer + Bande) 165 82,5 Summe 200 100,0 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 40 Tabelle 10: Lineassay Befund Detailansicht Lineassay Befund Normalpersonen Anzahl % negativ 31 15,5 unklar 4 2,0 frisch 1 0,5 kürzlich abgelaufen 1 0,5 135 67,5 abgelaufen ohne Anti-EBNA-1 7 3,5 abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1 15 7,5 abgelaufen ohne (schwaches) Anti-p18 6 3,0 200 100,0 länger zurückliegend (abgelaufen) Summe (die „seropositiv“ Befunde sind in detaillierte Serodiagnosen aufgeschlüsselt: unklar (grenzwertig positive Banden, Avidität schwer beurteilbar, nicht sicher positiv, evtl. Kontamination), frisch (keine späten Antikörper, Antikörper gegen EAs positiv, meist gering avide), kürzlich abgelaufen (gering avide späte Antikörper, meist nur Anti-p18, Anti-p23 meist gering avide), länger zurückliegend (beide späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Anti-p18 und Anti-p23 deutlich positiv und hoch avide, EAs in Einzelfällen positiv) Auch bei diesem Kollektiv fielen neben dem erwartet hohen Anteil an klassisch zurückliegenden Infektionen die verschiedenen Typen von zurückliegenden Fällen mit aberranter Konstellation auf. Insgesamt wurde bei 11% der Fälle kein bzw. nur ein sehr schwaches Anti-EBNA-1 gefunden. Es wurde hier abweichend von den Athleten nur ein kürzlich abgelaufener Fall gefunden (0,5%), der durch ein gering avides Anti-p18 und Anti-p23 von den zurückliegenden Fällen mit schwachem Anti-EBNA-1 unterschieden werden konnte. Demgegenüber wurde bei 3,0% der Fälle eine zurückliegende Infektion ohne positives Anti-p18 festgestellt. Bei diesen Fällen war Anti-EBNA-1 positiv und die Antikörper hoch avide, so dass deren Status als zurückliegend (abgelaufen) ohne Anti-p18 bestimmt wurde. Auch bei den Normalpersonen konnten aufgrund der Kombination der beiden späten Marker Anti-EBNA-1 und Anti-p18 aberrante Konstellationen sicher als zurückliegend befundet werden. Bei diesem Kollektiv wurden ebenfalls alle Fälle einzeln betrachtet und teilweise durch die Aviditätsbestimmung zusätzlich differenziert, um die Variationsbreite der serologischen Antwort zu erfassen. In den folgenden zwei Tabellen sind außer den seronegativen Fällen die Ergebnisse aller im Lineassay getesteten Fälle dargestellt, geordnet nach den Kategorien seropositiv und unklar. In Tabelle 11 sind die Lineassay-Ergebnisse der seropositiven Fälle für das Kollektiv der Normalpersonen einzeln aufgeführt. Die Daten sind nach der Intensität des EBNA-1Antikörpers geordnet. Außerdem ist die Avidität der Antikörper Anti-EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 für die gesondert getesteten Fälle zur besseren Differenzierung des Serostatus dargestellt. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 41 Tabelle 11: Ergebnisse des Lineassay (nur seropositive) der Normalpersonen: nach Intensität des AntiEBNA-1-Antikörpers geordnet, („abgelaufen“ entspricht länger zurückliegend), die Spalte Avidität zeigt die Avidität der jeweiligen Antigen-Antikörper Komplexe Nr. Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 167 - (+) (+) - ++ (+) - - - - 51 - ++ + - ++ - - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 92 - ++ +++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 68 - +++ + - - (+) - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 103 - +++ ++ - - (+) - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 123 - +++ ++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 193 - +++ +++ - - (+) - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 31 - ++++ +++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 12 (+) ++ ++ (+) - + - - 6 (+) ++ +++ (+) - (+) - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 37 (+) ++ +++ ++ + ++++ + - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 66 (+) ++ ++ - - + - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 102 (+) ++ + - - - - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 111 (+) ++ +++ - - + - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 126 (+) ++ (+) - + + - - hoch 162 (+) ++ ++ - - + - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 89 (+) +++ +++ (+) (+) +++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 114 (+) +++ +++ - - +++ (+) - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 141 (+) +++ +++ - (+) +++ (+) - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 157 (+) +++ ++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 182 (+) +++ ++++ ++ ++ ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 189 (+) +++ ++++ - - ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 196 (+) +++ +++ - (+) ++ - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 5 (+) ++++ +++ - - (+) - - hoch hoch abgelaufen, schwaches EBNA-1 73 + (+) (+) - (+) ++ - hoch - - abgelaufen 184 + (+) + - + + - hoch - hoch abgelaufen 13 + + + - - (+) - hoch hoch hoch abgelaufen 54 + + ++ - - - - hoch hoch hoch abgelaufen 78 + + ++ + (+) (+) - hoch gering hoch abgelaufen 58 + + ++ - - ++ - hoch gering hoch abgelaufen 11 + ++ + - (+) ++ - abgelaufen 16 + ++ + - - - - abgelaufen 27 + ++ +++ - - + - 38 + ++ ++ - - + - abgelaufen 50 + ++ + - - (+) - abgelaufen 57 + ++ ++ - - + - (hoch) hoch gering abgelaufen 72 + ++ + - (+) (+) - hoch hoch hoch abgelaufen 90 + ++ ++ - - - - hoch hoch hoch abgelaufen hoch frisch gering gering kürzlich abgelaufen hoch (hoch) abgelaufen, schwaches EBNA-1 hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 42 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 144 + ++ +++ + + ++++ + hoch hoch hoch abgelaufen 147 + ++ +++ - (+) +++ (+) hoch hoch hoch abgelaufen 183 + ++ + - (+) ++ - abgelaufen 60 + +++ (+) - - - - abgelaufen 105 + +++ ++ - - + - hoch hoch 149 + +++ ++++ - - (+) - hoch hoch hoch abgelaufen 169 + +++ +++ - (+) + - gering hoch hoch abgelaufen 39 + ++++ +++ - - +++ (+) gering hoch 108 + ++++ +++ - - (+) - abgelaufen 152 + ++++ ++++ - +++ +++ (+) abgelaufen 168 + ++++ ++++ - - ++ - abgelaufen 131 ++ + + - - + - hoch hoch 166 ++ + + - - - - hoch hoch 33 ++ + ++ (+) ++ ++ - abgelaufen 61 ++ + (+) - - + - abgelaufen 79 ++ + ++ - (+) ++ - 109 ++ + + - - (+) - 15 ++ ++ +++ (+) ++ ++ - 24 ++ ++ ++ - (+) (+) - abgelaufen 35 ++ ++ +++ - - + - abgelaufen 45 ++ ++ +++ - - - - abgelaufen 59 ++ ++ ++ - - - - abgelaufen 70 ++ ++ +++ - - + - abgelaufen 82 ++ ++ +++ - - + - abgelaufen 85 ++ ++ + - + (+) - abgelaufen 88 ++ ++ +++ (+) + +++ - abgelaufen 93 ++ ++ ++ - - ++++ + abgelaufen 101 ++ ++ +++ - - - - abgelaufen 107 ++ ++ (+) - - - - abgelaufen 150 ++ ++ + (+) - (+) - abgelaufen 151 ++ ++ +++ - - + (+) abgelaufen 156 ++ ++ + (+) - (+) - abgelaufen 174 ++ ++ ++ - - - - abgelaufen 195 ++ ++ ++ - (+) + - abgelaufen 17 ++ +++ +++ - ++ +++ (+) abgelaufen 23 ++ +++ ++ - - (+) - abgelaufen 41 ++ +++ +++ - - ++ - abgelaufen 43 ++ +++ ++ - - ++ - abgelaufen 46 ++ +++ ++ - +++ + - abgelaufen 49 ++ +++ ++ - - +++ (+) abgelaufen hoch gering gering abgelaufen gering abgelaufen hoch abgelaufen gering abgelaufen hoch abgelaufen abgelaufen hoch hoch hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 43 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 67 ++ +++ ++ - - (+) - abgelaufen 75 ++ +++ +++ (+) + +++ (+) abgelaufen 76 ++ +++ +++ - - + - abgelaufen 87 ++ +++ +++ - - ++ - abgelaufen 96 ++ +++ ++ - - (+) - abgelaufen 99 ++ +++ ++++ (+) (+) ++++ + abgelaufen 120 ++ +++ +++ - (+) (+) - abgelaufen 125 ++ +++ ++++ (+) + +++ (+) abgelaufen 127 ++ +++ +++ - - + - abgelaufen 128 ++ +++ ++++ - + (+) - abgelaufen 129 ++ +++ - - - - - abgelaufen 134 ++ +++ + - (+) + - abgelaufen 185 ++ +++ +++ (+) (+) ++ - 186 ++ +++ ++ - - (+) - abgelaufen 18 ++ ++++ + - - - - abgelaufen 135 ++ ++++ +++ - (+) ++ (+) abgelaufen 86 ++ (+) ++ (+) - + - hoch - gering abgelaufen ohne p18 124 ++ (+) ++ (+) - ++ - hoch - (gering) abgelaufen ohne p18 198 ++ (+) - - - - - hoch - 138 +++ + ++ - - (+) - hoch hoch hoch hoch hoch - abgelaufen abgelaufen ohne p18 gering abgelaufen 160 +++ + ++ - (+) (+) - abgelaufen 1 +++ ++ + - - (+) - abgelaufen 3 +++ ++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 4 +++ ++ + - - + - abgelaufen 21 +++ ++ ++ - - (+) - 98 +++ ++ ++ - (+) ++ - abgelaufen 100 +++ ++ ++ (+) (+) ++ - abgelaufen 121 +++ ++ + - - ++ - abgelaufen 139 +++ ++ + - - ++ - abgelaufen 140 +++ ++ +++ (+) - + - abgelaufen 142 +++ ++ ++ - - ++ - abgelaufen 153 +++ ++ +++ - - - - abgelaufen 159 +++ ++ + - ++ (+) - abgelaufen 14 +++ +++ +++ (+) ++ + - hoch hoch hoch abgelaufen 22 +++ +++ +++ (+) - + - hoch hoch hoch abgelaufen 34 +++ +++ +++ (+) (+) ++ - abgelaufen 62 +++ +++ + - ++ + - abgelaufen 74 +++ +++ + - - - - abgelaufen 77 +++ +++ +++ (+) - ++ - abgelaufen 83 +++ +++ +++ (+) (+) + - abgelaufen hoch hoch hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 44 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 84 +++ +++ +++ - - - - abgelaufen 94 +++ +++ ++ - + ++ - abgelaufen 104 +++ +++ ++ - - (+) - abgelaufen 113 +++ +++ ++ (+) - (+) - abgelaufen 119 +++ +++ ++++ - - +++ (+) abgelaufen 122 +++ +++ +++ (+) (+) +++ (+) abgelaufen 130 +++ +++ (+) - - (+) - abgelaufen 137 +++ +++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 145 +++ +++ ++ - - - - abgelaufen 175 +++ +++ ++ (+) - (+) - abgelaufen 176 +++ +++ +++ - - ++ - abgelaufen 177 +++ +++ ++++ (+) - +++ - abgelaufen 178 +++ +++ ++ (+) - ++ - 187 +++ +++ +++ - +++ ++ - abgelaufen 188 +++ +++ +++ - (+) ++ - abgelaufen 194 +++ +++ +++ (+) - ++ - abgelaufen 7 +++ ++++ ++ - (+) (+) - abgelaufen 30 +++ ++++ ++ - - (+) - abgelaufen 112 +++ ++++ +++ (+) - (+) - abgelaufen 133 +++ ++++ +++ - - ++ - abgelaufen 164 +++ ++++ +++ - - (+) - abgelaufen 172 +++ ++++ ++ ++ + ++ - abgelaufen 179 +++ ++++ +++ - - + - 181 +++ ++++ +++ - - + - 191 +++ ++++ ++++ - - +++ 32 +++ (+) ++ (+) (+) + 48 ++++ + ++++ + +++ 69 ++++ ++ +++ - 118 ++++ ++ +++ 136 ++++ ++ 201 ++++ 9 hoch hoch hoch hoch hoch hoch abgelaufen abgelaufen abgelaufen hoch hoch hoch abgelaufen - hoch - hoch abgelaufen ohne p18 +++ (+) hoch hoch hoch abgelaufen - + - abgelaufen (+) (+) - - abgelaufen +++ - (+) +++ (+) abgelaufen ++ +++ - - + - ++++ +++ +++ (+) - + - abgelaufen 26 ++++ +++ +++ (+) ++ + - abgelaufen 44 ++++ +++ (+) - (+) + - abgelaufen 56 ++++ +++ + - - ++ - abgelaufen 64 ++++ +++ +++ - (+) +++ (+) abgelaufen 158 ++++ +++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 173 ++++ +++ ++ - - +++ (+) abgelaufen 192 ++++ +++ (+) (+) ++ ++ - hoch hoch 197 ++++ +++ +++ (+) + ++++ + hoch hoch hoch hoch hoch abgelaufen (hoch) abgelaufen hoch abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie Nr. 45 Antigen Lineassay EBNA-1 p 18 p 23 p 138 Avidität p 54 BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 Beurteilung p23 80 ++++ ++++ ++++ - - ++ - abgelaufen 81 ++++ ++++ +++ - + + - abgelaufen 161 ++++ ++++ +++ - (+) ++ - abgelaufen 171 ++++ ++++ +++ - - ++ - abgelaufen 180 ++++ ++++ ++++ - - (+) - hoch hoch hoch abgelaufen 10 ++++ - ++ - +++ (+) - hoch - hoch abgelaufen ohne p18 115 ++++ (+) - - +++ - - abgelaufen ohne p18 Auch bei dem Kollektiv der Normalpersonen wird bei der Betrachtung der Einzelfälle die Variationsbreite der Antikörperintensitäten der unterschiedlichen Infektionstypen deutlich. Wie bei den Athleten fiel vor allem die hohe Konstanz der späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Anti-p18 gegenüber der in der Intensität variierenden „Early antigens“ Anti-p138 und Anti-p54 auf. Anti-p138-Antikörper wurden bei den Normalpersonen etwas häufiger in einer stärkeren Intensität gefunden als bei den Athleten. Meistens war auch bei den Normalpersonen Anti-p54 positiv, intensivere Banden waren beispielsweise bei Fall Nr. 10, 46, 115, 152 und 187 vorhanden. Bei Fall Nr. 48 waren beide EAs gleichzeitig positiv bei schwachem Anti-EBNA-1, aber hoch-avidem Anti-p18, so dass der Fall trotzdem als eine länger zurückliegende Infektion bestimmt wurde. Bei den Normalpersonen gibt es ebenso klassisch zurückliegende Infektionen mit sehr schwach nachzuweisenden Antikörpern, die aber eine hohe Avidität besitzen, wie z.B. Nr. 13. Es gibt aber auch solche mit besonders intensivem Anti-EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 wie Nr. 180 und ebenfalls hoher Avidität der Antikörper. Mit Fall Nr. 115 wurde eine zurückliegende Infektion ohne p23-Antikörper und grenzwertig positiver Anti-p18-Bande gefunden. Weitere Beispiele für fehlendes, bzw. schwach vorhandenes Anti-p23 waren Fall Nr. 44, 60, 61, 107, 129, 130 und 192. Anti-p23-Antikörper waren sonst bei fast allen seropositiven Fällen deutlich nachweisbar. Meistens war Anti-BZLF-1 auch bei den Normalpersonen in höheren Konzentrationen zu finden, besonders intensiv bei den Fällen Nr. 37, 93, 99, 144 und 197, bei denen auch die 1:16 Verdünnung positiv war. Grob vergleichend ergab sich kein Unterschied zu dem Athletenkollektiv und Anti-BZLF-1-Antikörper galten auch hier vielmehr als unspezifische Seropositivitätsmarker. Es gab auch bei den Normalpersonen keinen Anhalt für besonders intensive Anti-BZLF-1-Antworten und somit keinen Unterschied zu den Athleten. Tabelle 12 führt die Lineassay Ergebnisse der unklaren Fälle auf. In der Spalte Avidität ist die Avidität der Antikörper gegen EBNA-1, p18 und p23 dargestellt, jedoch war sie bei den 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 46 schwachen Antikörper-Intensitäten nur eingeschränkt messbar und nicht so diagnoseweisend wie bei stärkeren Antikörper-Intensitäten. Tabelle 12: unklare Ergebnisse des Lineassay des Normalpersonenkollektivs. Die Spalte Avidität zeigt die Avidität der jeweiligen Antigen-Antikörper Komplexe (bei diesem Serostatus eingeschränkt messbar) Nr. Antigen Lineassay EBNA-1 p18 p23 p138 p54 Avidität BZLF-1 B(1:16) EBNA-1 p18 106 + - (+) - + (+) - hoch - 154 (+) - (+) - + (+) - hoch - 155 (+) - (+) - + (+) - hoch 170 (+) - (+) - + (+) - hoch Beurteilung Wiederholung p23 hoch unklar - unklar unklar unklar - hoch unklar unklar - hoch unklar unklar Im Gegensatz zu den negativen Fällen wurden bei diesen Seren einfach positive Banden v.a. gegen p54 vorgefunden. Außerdem waren wieder Anti-EBNA-1, Anti-p23 und Anti-BZLF-1 in grenzwertiger Konzentration nachweisbar. Die hohe Avidität der Anti-EBNA-1 und Anti-p23 Antikörper spricht gegen eine frische Infektion. Auffällig war auch, dass die Verteilung der vorhandenen Antikörper dem Athleten Kollektiv sehr stark ähnelte (siehe Tabelle 8) und aufgrund der gefundenen Konstellation und der grenzwertig positiven Banden auch hier keine eindeutige Serodiagnose erfolgen konnte. Bei den als negativ bewerteten Fällen wurden meistens keine Antikörper-Banden nachgewiesen. Doch genau wie bei den Athleten waren auch bei den Normalpersonen wenige grenzwertig positive Antikörper-Banden auffindbar, die oft nur ganz schwach und mit bloßem Auge kaum erkennbar auf den Teststreifen vorhanden waren. Demnach waren auch diese Banden alle deutlich schwächer als die cutoff-Bande und somit als negativ und als Variation von negativen Infektionsstadien feststellbar. Hier könnte es sich ebenfalls um Verunreinigungen des Serums oder des Testansatzes oder um unspezifische Reaktionen von anderen im Serum enthaltenen Antikörpern gegen die vorhandenen Antigene gehandelt haben. Weitere exemplarische Einzelfälle der unterschiedlichen Serumkonstellationen beider Kollektive sind mit Hilfe von Ergebnissen der Scanmethodik und der Aviditätsbestimmung unter 3.1.4 auf Seite 63 beschrieben. Außerdem werden einige besondere Einzelfälle erneut beschrieben und graphisch dargestellt. C. Vergleich der Lineassay-Befunde beider Kollektive Um zu prüfen, ob zwischen den beiden Kollektiven in der Häufigkeit der vorkommenden Serodiagnosen ein signifikanter Unterschied besteht, wurde zuerst der Chi-Quadrat Test auf die detaillierte Aufschlüsselung aller Serodiagnosen angewendet. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 47 In Tabelle 13 sind die Befunde des Lineassays für beide Gruppen in detaillierter Form gemeinsam dargestellt. Bei dem Vergleich aller Befundhäufigkeiten dieser Tabelle mit dem Chi-Quadrat Test ergibt sich zwischen den beiden Gruppen Athleten und Normalpersonen kein signifikanter Unterschied (p=0,144). Tabelle 13: Häufigkeiten der Lineassay-Befunde der Gruppen Athleten und Normalpersonen Befund Lineassay Normalpersonen Athleten Summe Negativ 31 35 66 Unklar 4 6 10 Frisch 1 1 2 kürzlich abgelaufen 1 11 12 135 122 257 abgelaufen ohne Anti-EBNA-1 7 9 16 abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1 15 15 30 abgelaufen ohne (schwaches) Anti-p18 6 3 9 200 202 402 länger zurückliegend Summe Bei der Analyse der Standardisierten Residuen in SPSS findet sich ein Hinweis auf den größten Unterschied zwischen den Gruppen in der Häufigkeit des Befundes „kürzlich abgelaufen“. Um gesondert diesen Befund mit allen anderen Befunden der beiden Kollektive zu vergleichen, wurde Fisher’s Exact Tests für diese Konstellation (siehe Tabelle 14) angewendet. Die Kollektive unterscheiden sich dann signifikant voneinander (p=0,006). Tabelle 14: Lineassay-Befund „kürzlich abgelaufen“ der Gruppen Athleten und Normalpersonen Befund Lineassay andere Befunde kürzlich abgelaufen Summe Normalpersonen Athleten Summe 199 191 390 1 11 12 200 202 402 Im Gesamtvergleich der detaillierten Häufigkeitstabellen mit dem Chi-Quadrat Test (siehe Tabelle 13) reichte dieser Unterschied für einen signifikanten Unterschied jedoch nicht aus (p=0,144). Um Aussagen über die Prävalenz und Inzidenz von EBV-Infektionen nach klassischer Einteilung machen und vergleichen zu können, wurden die in Tabelle 13 dargestellten Befunde zu den klassischen Diagnosen negativ, unklar, frisch (inklusive kürzlich, also innerhalb 2 Monate) und länger zurückliegend (inklusive aberrant abgelaufen) in Tabelle 15 zusammengefasst. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 48 Tabelle 15: Vergleich der klassischen Diagnosen zwischen Normalpersonen und Athleten, kürzlich abgelaufene Infektionen wurden als frisch, aberrant abgelaufene als länger zurückliegend bewertet. Befund Lineassay Normalpersonen % Athleten % Summe negativ 31 15,5 35 17,3 66 Unklar 4 2,0 6 3,0 10 frisch (inkl. kürzlich) 2 1,0 12 5,9 14 zurückliegend (inkl. aberrant abgelaufen) 163 81,5 149 73,8 312 Summe 200 100,0 202 100,0 402 Vergleicht man die Häufigkeiten dieser klassischen Diagnosen, fällt auf, dass die Normalpersonen einen höheren prozentualen Anteil an länger zurückliegenden Infektionen aufweisen. Bei den Athleten wurde dagegen eine höhere Anzahl an frischen bzw. kürzlich zurückliegenden Infektionen festgestellt (siehe auch Tabelle 13 und Tabelle 14). Der Anteil von negativen Seren war bei beiden Gruppen in etwa gleich, auch die Anzahl derer mit unklarem Serostatus. Bei der Anwendung des Chi-Quadrat Testes auf die Häufigkeiten der klassisch eingeteilten Diagnosen ergibt sich ein schwach signifikanter Unterschied (p=0,038) zwischen den beiden Kollektiven im Gegensatz zu den in Tabelle 13 aufgeführten, nicht signifikant unterschiedlichen detaillierten Befundhäufigkeiten. Auch bei der klassischen Zusammenstellung fällt bei der Betrachtung der Standardisierten Residuen in SPSS auf, dass der größte Unterschied in dem Befund „frisch (inkl. kürzlich)“ besteht, der für den Unterschied ursächlich gewesen sein könnte. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei der detaillierten Aufstellung der Befunde zwischen beiden Kollektiven kein signifikanter Unterschied bestanden hat (p=0,144). Bei der Zusammenstellung von klassischen Diagnosen waren beide Gruppen schwach signifikant unterschiedlich (p=0,038), am ehesten durch die unterschiedliche Häufigkeit „frisch (inkl. kürzlich abgelaufen)“ bedingt, deren Anteil bei klassischer Anordnung mehr Gewicht bekommt. Besonders auffällig wurde der Unterschied dann, wenn die Diagnose „kürzlich abgelaufen“ gegen alle anderen, zu einer Kategorie summierten, Befunde mit Fisher’s Exact Test getestet wird (p=0,006) (Tabelle 14). Würde die Diagnose „kürzlich abgelaufen“ in Tabelle 15 unter die „abgelaufenen“ Infektionen summiert werden, ergäbe sich kein signifikanter Unterschied (p=0,877) und bei beiden Gruppen wäre der Anteil der frischen und zurückliegenden Infektionen fast gleich. In Abbildung 13 sind ergänzend die prozentualen Anteile der Befunde der Lineassay Diagnostik je Gruppe als geschichtete Säulen abgebildet, (die Serotypen „abgelaufen ohne Anti-EBNA-1, 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 49 abgelaufen (schwaches Anti-EBNA-1) und abgelaufen ohne (schwaches) Anti-p18“ sind unter „aberrant abgelaufen“ zusammengefasst). Abbildung 13: Anteil der Infektionsstadien in den untersuchten Gruppen, die Serotypen „abgelaufen ohne Anti-EBNA-1, abgelaufen (schwaches Anti-EBNA-1) und abgelaufen ohne (schwaches) Antip18“ sind unter „aberrant abgelaufen“ zusammengefasst) Diese Abbildung verdeutlicht noch einmal die Ergebnisse des Vergleichs der Häufigkeiten der verschiedenen Lineassay-Serodiagnosen. Im Wesentlichen wurden bei beiden Kollektiven dieselben Häufigkeiten der verschiedenen Serodiagnosen festgestellt. Der größte Unterschied bestand im Vorkommen des Serostatus „kürzlich abgelaufen“, der bei den Athleten in größerer Anzahl gefunden wurde. Demgegenüber war der Anteil des Serostatus „länger zurückliegend“ bei den Normalpersonen größer. D. Vergleich der Kollektive anhand der mit der Lineassay-Scanmethodik ermittelten Antikörper-Amplituden Die Lineassay-Scanmethodik hat durch die quantitative Erfassung der Antikörper-Amplituden eine sehr detaillierte Analyse der Variation einzelner Antikörper beider Kollektive ermöglicht. Im vorherigen Abschnitt wurden die Kollektive hinsichtlich des Vorkommens verschiedener Serodiagnosen geprüft. Um die Verteilung der gemessenen Amplituden beider Gruppen für jeden Antikörper getrennt zu untersuchen, wurden je Gruppe nur die seropositiven Fälle für einen Vergleich herangezogen. Bei den Athleten erfüllten dieses Kriterium 161 Testpersonen, bei den Normalpersonen 165 Testpersonen (siehe auch Tabelle 5 und Tabelle 9). Die Antikörper wurden hier einzeln betrachtet und auf Verschiedenheit ihrer Verteilung bei beiden Gruppen geprüft. Der MannWhitney Test wurde für jeden Antikörper verwendet, um die Verteilung der AntikörperAmplituden auf signifikante Unterschiede zwischen Athleten und Normalpersonen zu 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 50 untersuchen. Die mit dem Mann-Whitney Test ermittelten Signifikanzniveaus sind neben den deskriptiven Werten der Scanmethodik in Tabelle 16 ersichtlich. Tabelle 16: deskriptiver Report der seropositiven Fälle beider Kollektive (Scan mit Apollo Blotautomat) und durch den Mann-Whitney-Test ermittelte Signifikanzniveaus zum Vergleich der Amplitudenverteilung jedes Antikörpers der untersuchten Kollektive Gruppe Amplitude (nur seropositive) Antikörper gegen EBNA-1 p 18 p 23 p 138 p 54 BZLF-1 B(1:16) Normalpersonen Minimum 0 10 5 0 0 0 0 (n=165) Maximum 190 172 168 85 123 135 18 Median 80 101 86 3 6 43 6 Mean 80 98 83 6 16 48 6 Std. Abweichung 48 42 38 11 26 37 4 Athleten Minimum 2 3 2 0 0 0 0 (n=161) Maximum 172 178 155 57 143 157 44 Median 77 101 86 3 5 45 6 Mean 76 94 81 4 13 51 7 Std. Abweichung 49 41 37 8 23 38 5 0,378 0,267 0,724 0,007 0,250 0,562 0,907 p-Wert Es fällt auf, dass sich die Verteilung der Amplitudenmesswerte jedes Antikörpers bis auf den p138-Antikörper (p=0,007) nicht signifikant unterscheidet. Betrachtet man p138 genauer, fällt auf, dass der Durchschnitt der gemessenen Amplitude mit 4 bei den Athleten und 6 bei den Normalpersonen zwar im gleichen Bereich lag und die Standardabweichung für beide Kollektive mit 8 bei den Athleten und 11 bei den Normalpersonen ähnlich war. Insgesamt wurden bei den Normalpersonen aber höhere Amplituden gemessen und zudem noch größere Extreme der Werte gefunden. Im Vergleich zu den hohen Amplituden der intensiven Banden von Anti-EBNA-1, Anti-p18, Anti-p23 und Anti-BZLF-1 lagen die gemessenen Antikörper-Amplituden gegen p138 und p54 (Early antigens) bei beiden Kollektiven in einem sehr niedrigen Bereich, bei 297 von insgesamt 326 seropositiven Probanden beider Gruppen (91%) war Anti-p138 und bei 231 von 326 Probanden (71%) war Anti-p54 nicht nachweisbar (Kriterium Scanamplitude <10). Die hohe Konstanz der späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Anti-p18 gegenüber den variabel auftretenden frühen Antikörpern Anti-p138 und Anti-p54 wurde auch bei der Betrachtung der Einzelfälle in den Abschnitten 3.1.2 A und 3.1.2 B beschrieben. Die Verteilung mit den stärksten Antikörperamplituden wurde bei beiden Gruppen für den p18-Antikörper gefunden. Insgesamt lag bei beiden Kollektiven eine fast analoge Verteilung der Scanamplituden für alle Antikörper vor, so war z.B. die kleinste gemessene Amplitude für alle Antikörper fast Null und die maximal erfassten Werte waren ebenfalls ähnlich. Der Median, die 25. und 75. Perzentile 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 51 sowie die Lage von Extremwerten sind in Abbildung 14 bis Abbildung 19 mittels BoxplotGraphen dargestellt, welche die sehr ähnliche Verteilung der Antikörperamplitudenwerte beider Gruppen darstellen. Abbildung 14: Boxplot der EBNA-1 Antikörper Abbildung 15: Boxplot der p18-Antikörper (dargestellt ist je der Median als schwarzer Balken in grauer Box, die durch die 25. und 75. Perzentile begrenzt wird; die Balken beschreiben die kleinsten/größten Werte, die keine Extremwerte waren; „Kreise“ (o) beschreiben Werte, die mehr als 1,5 Box-Längen, „Sternchen“ (*), die mehr als 3 Box-Längen von 75. Perzentile entfernt liegen) Abbildung 16: Boxplot der p23-Antikörper Abbildung 17: Boxplot der p138-Antikörper (dargestellt ist je der Median als schwarzer Balken in grauer Box, die durch die 25. und 75. Perzentile begrenzt wird; die Balken beschreiben die kleinsten/größten Werte, die keine Extremwerte waren; „Kreise“ (o) beschreiben Werte, die mehr als 1,5 Box-Längen, „Sternchen“ (*), die mehr als 3 Box-Längen von 75. Perzentile entfernt liegen) 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 52 Abbildung 18: Boxplot der p54-Antikörper Abbildung 19: Boxplot der BZLF-1-Antikörper (dargestellt ist je der Median als schwarzer Balken in grauer Box, die durch die 25. und 75. Perzentile begrenzt wird; die Balken beschreiben die kleinsten/größten Werte, die keine Extremwerte waren; „Kreise“ (o) beschreiben Werte, die mehr als 1,5 Box-Längen, „Sternchen“ (*), die mehr als 3 Box-Längen von 75. Perzentile entfernt liegen) Besonders zeigen die Boxplots die ähnliche Verteilung der Antikörper-Amplituden für den EBNA-1-Antikörper (p=0,378), p18-Antikörper (p=0,276), p23-Antikörper (p=0,724) und BZLF-1-Antikörper (p=0,562). In Abbildung 17 ist die unterschiedliche Lage der Extreme und signifikant unterschiedliche Verteilung der Amplitudenwerte der p138-Antikörper zu erkennen (P=0,007). Auch die Werte der p54-Antikörper in Abbildung 18 weisen eine Streuung mit Extremen auf, sind jedoch in ihrer Gesamtverteilung und Lage der deskriptiven Maße wie Durchschnitt, Standardabweichung, Median und den Perzentilen sehr ähnlich und nicht signifikant verschieden (p=0,250). In Abbildung 20 und Abbildung 21 ist die Verteilung der Antikörper-Amplituden für beide Kollektive auf andere Weise dargestellt. In dieser Illustration ist in der Übersicht ebenfalls erkennbar, dass sich die Gruppen in Bezug auf das durch die Amplitudenmessung gebildete Muster nicht wesentlich unterscheiden. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 53 Abbildung 20: (Athleten), Abbildung 21 (Normalpersonen): die sichtbaren Muster bilden sich aus den Amplitudenwerten und sind nach den verschiedenen Antikörpern und der Größe der Amplitudenwerte geordnet, so stellt jede Säule 161 (Athleten) bzw. 165 (Normalpersonen) nach Intensität der Bande geordnete seropositive Fälle dar Die unter 3.1.2 C beschriebene ähnliche Häufigkeitsverteilung der Lineassay-Serodiagnosen hat sich durch die Auswertung der Lineassay-Scanmethodik bestätigt. Beide Kollektive haben sich hinsichtlich ihrer quantitativen Verteilung der Antikörper-Antworten ausgenommen Anti-p138 nicht signifikant unterschieden. Die unterschiedliche Häufigkeit des Serostatus „kürzlich abgelaufen“ ließ sich nicht mit der signifikant unterschiedlichen Verteilung der Anti-p138Amplituden in Zusammenhang bringen. Die bei den „kürzlich abgelaufenen“ Fällen meist fehlende Anti-EBNA-1-Antwort hat nicht zu einem signifikanten Unterschied in der Verteilung der Anti-EBNA-1-Antikörper geführt. Athleten und Normalpersonen haben sich somit in den Ergebnissen der Lineassay-Diagnostik nicht wesentlich unterschieden. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 3.1.3 54 Immunfluoreszenztechnikverfahren (IFT) Anhand der Immunfluoreszenztechnik, dem früheren Goldstandard der EBV-Serologie, sollte ein Methodenvergleich mit dem Lineassaytest erfolgen. Dazu wurden alle 202 Athleten-Seren und 200 Normalpersonen-Seren zusätzlich mit der Immunfluoreszenztechnik auf Anti-VCA-IgG und Anti-EBNA-1 getestet. Um einen eventuellen Unterschied zwischen beiden Testmethoden zu belegen und die dann effizientere Testmethode zu benennen, wurden Übereinstimmungen der serologischen Aussage aber auch die Diagnostik erschwerende Konstellationen besonders berücksichtigt und zwischen beiden Testsystemen verglichen. Außerdem sollte geprüft werden, ob die IFT-Diagnostik bei beiden Kollektiven dieselbe diagnostische Anforderung besitzt oder ob die IFT bei einer Gruppe bezüglich des Ergebnisses eindeutigere Aussagen erlaubt. Dazu wurden die Ergebnisse der Athleten mit denen der Normalpersonen verglichen. A. Athleten In Tabelle 17 und Tabelle 18 sind die Ergebnisse des IFT Verfahren als Übersicht und in detaillierter Form ersichtlich, dabei wurden in Tabelle 18 die seropositiven Befunde in die möglichen Konstellationen der IFT-Diagnostik aufgeschlüsselt. Tabelle 17: IFT-Befund, Übersicht IFT Befund Athleten Anzahl % seronegativ 36 17,8 antizellular 7 3,5 seropositiv 159 78,7 Summe 202 100,0 Tabelle 18: IFT-Befund, Detailansicht, die „seropositiv“ und „antizellular“ Befunde sind in detaillierte Serodiagnosen aufgeschlüsselt IFT Befund Athleten Anzahl % negativ 36 17,8 EBNA antizellular / BJAB + 3 1,5 VCA antizellular 4 2,0 VCA + / EBNA + 138 68,3 VCA + / EBNA +/- 2 1,0 VCA + / EBNA - 19 9,4 Summe 202 100,0 Die 36 im IFT-Befund negativen Fälle haben im Lineassay teilweise zu einer anderen Diagnose geführt. Fünf der in der IFT negativen Fälle wurden im Lineassay als „unklar“ befundet, also 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 55 nicht sicher positiv und somit im weitesten Sinne kongruent mit den IFT-Ergebnissen. Doch waren diese Fälle im Lineassay immerhin so auffällig, dass sie nicht als klassisch negative Seren zugeordnet wurden und eine eigene Gruppe bildeten (siehe Tabelle 8). Übereinstimmend mit dem IFT-Befund waren 31 Fälle des Lineassay ebenfalls negativ. Insgesamt wurden im Lineassay ohne Berücksichtigung der „unklaren“ Seren 35 negative Fälle gefunden. Die vier im Lineassay zusätzlich als negativ bestimmten Fälle wurden mit der Immunfluoreszenztechnik in drei Fällen als antizellular (Nr. 15, 121, 152 in Tabelle 20) und einmal als seropositiv (Nr. 80 in Tabelle 19) getestet. Bei diesem Fall könnte es sich um eine sehr frische Infektion handeln, die im Lineassay noch negativ ist. Aber möglicherweise auch um einen Messfehler, eine Testwiederholung dieses Serums wurde nur für den Lineassay durchgeführt und ergab zweimalig ein negatives Ergebnis. In Bezug auf die Diagnose der Seronegativität gab es demnach abweichende Ergebnisse bei beiden Testsystemen, doch die Serumkonstellationen konnten im Lineassay differenzierter bestimmt werden und alle seronegativen Fälle wurden durch den Lineassay richtig befundet. Zusätzlich wurden in der IFT unbestimmbare, antizellulare Fälle durch den Lineassay als richtig-negativ erkannt (siehe Tabelle 20), so dass der Lineassay zur Erkennung von Seronegativen besser geeignet war. Es wurden 138 „VCA + / EBNA +“ Fälle gefunden, die im IFT-Verfahren als klassisch abgelaufene, also länger zurückliegende Fälle gelten. Dementsprechend wurden im Lineassay 122 klassisch abgelaufene Serotypen gefunden. Einige der zurückliegenden Infektionen wurden durch das Immunfluoreszenzverfahren fehlbestimmt bzw. konnten im Lineassay genauer differenziert werden und teilen sich auf die verschiedenen Untergruppen von länger zurückliegenden Infektionen auf. Einige der in der IFT als „klassisch abgelaufen" (länger zurückliegend) bezeichneten Fälle wurden im Lineassay als „kürzlich abgelaufen“ bestimmt, da Anti-EBNA-1 kaum vorhanden und die Avidität von Anti-p18 noch nicht weit gereift war. Um besonders die Fähigkeit der wichtigen Abgrenzung von akuten und abgelaufenen Infektionen für beide Testsysteme zu vergleichen, werden im folgenden die in der IFT als vermeintlich frische Infektionen beurteilten Fälle, aufgrund des Fehlens des späten Markers Anti-EBNA-1, den entsprechenden Lineassay Ergebnissen gegenübergestellt. Diese 21 „VCA + / EBNA -“ und „VCA + / EBNA+/-“ Fälle wurden zur serologischen Differentialdiagnose mit den Lineassay Ergebnissen in Tabelle 19 verglichen. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 56 Tabelle 19: Vergleich der IFT-Befunde "VCA + / EBNA - (+/-)" mit entsprechenden Lineassay-Befunden des Athleten Kollektivs, die Avidität der p18- und p23-Antikörper im Lineassay ist ebenfalls dargestellt IFT Lineassay Antikörper Avidität LA Nr. VCA-IgG EBNA-1 EBNA-1 p 18 p 23 p 138 p 54 BZLF-1 B(1:16) p18 p23 Beurteilung Lineassay 80 + - - - - - - - - - - negativ 55 + - - (+) (+) - (+) (+) - - - unklar 99 + - + ++ +++ - + +++ (+) gering gering kürzlich abgelaufen 128 + - (+) ++ ++ (+) - +++ (+) gering gering kürzlich abgelaufen 156 + - - ++ ++ - - ++ - gering gering kürzlich abgelaufen 98 + - - ++ +++ (+) + ++++ + gering hoch kürzlich abgelaufen 7 + - (+) (+) ++++ - +++ ++ - - hoch kürzlich abgelaufen 6 + - - +++ + - - - - hoch gering abgelaufen ohne EBNA-1 51 + - - ++ ++ - - - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 72 + - - ++ + - - + - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 94 + - - ++ +++ - + + - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 108 + - - ++++ ++++ - +++ (+) hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 149 + - - ++ ++ (+) ++ +++ (+) hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 158 + - - ++ + - - ++ - hoch gering abgelaufen ohne EBNA-1 186 + - - ++ + - - (+) - hoch gering abgelaufen ohne EBNA-1 19 + - (+) +++ ++ - (+) ++ - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 65 + - (+) ++ ++ - (+) (+) - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 107 + - (+) ++ (+) - - - - hoch 177 + - (+) ++ +++ - - ++ - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 35 + +/- (+) ++++ +++ - - +++ (+) hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 46 + +/- (+) +++ - + ++ - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 ++ - abg., schwaches EBNA-1 Im Lineassay war bei den meisten dieser Fälle ebenfalls kein klar positives Anti-EBNA-1 nachweisbar und sie stimmten so mit den IFT-Befunden überein. Fünf der „VCA + / EBNA -“ und „VCA + / EBNA+/-“ Fälle wurden im Lineassay als „kürzlich abgelaufen“ bestimmt, die so als richtige Übereinstimmung zwischen IFT-Befund und Lineassay-Befund zugetroffen haben. Bei diesen Probanden waren keine „späten“ Anti-EBNA-1-Antikörper vorhanden, und sie wiesen eine niedrige Avidität der p18- und p23-Antikörper auf, was für eine kürzlich zurückliegende Infektion sprach. Im weiteren zeitlichen Verlauf könnten sie Anti-EBNA-1Antikörper entwickeln, aber als aberrant abgelaufene („abgelaufen ohne EBNA-1 / schwaches EBNA-1“) Infektionen ebenso kein Anti-EBNA-1 vorweisen und somit durch das Immunfluoreszenzverfahren fehlbestimmt werden. Vierzehn dieser in der IFT insgesamt 21 vermeintlich frischen Fälle wurden im Lineassay jedoch als aberrant abgelaufene Infektionen bestimmt („abgelaufen ohne EBNA-1 / schwaches EBNA-1“). Bei diesen Konstellationen konnte durch den Lineassay über den Nachweis von 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 57 p18-Antikörpern und deren hohe Avidität, als auch der meist hohen Avidität der p23Antikörper, die Infektion als zurückliegend befundet werden. Mit der Immunfluoreszenztechnik war eine solche Differenzierung nicht möglich und die Fehldiagnose einer frischen oder kürzlich zurückliegenden Infektion unvermeidlich. Der Lineassay hat wieder die eindeutigere Diagnose aufgrund des zweiten späten Markers Anti-p18 erlaubt. Ein Fall wurde als falsch-positiver IFT-Befund gefunden, der im Lineassay negativ war (Nr. 80), ein weiterer Fall wurde im Lineassay als nicht sicher positiv und damit unklar gefunden (Nr. 55) (siehe Tabelle 19). Die primär mit der IFT nicht auswertbaren Fälle mit antizellularen Bestandteilen im Serum wurden in Tabelle 20 den korrespondierenden Lineassay-Befunden gegenübergestellt, um zu überprüfen, ob die Lineassay-Methode bei solchen antizellulären Seren eine eindeutige Diagnose zulässt. Tabelle 20: Vergleich der antizellulären IFT-Befunde mit entsprechenden Lineassay-Befunden des Athleten Kollektivs IFT Lineassay Nr. VCA-IgG EBNA-1 BJAB EBNA-1 Beurteilung Lineassay p 18 p 23 p 138 p 54 BZLF-1 B(1:16) 121 - az + - - - - - - - negativ 15 az - - - - - - - - - negativ 152 az - - - - - - - - - negativ 95 az - - - - - - ++ - - frisch 4 az + - + ++ +++ - - +++ (+) abgelaufen 84 + az + +++ ++ + - - (+) - abgelaufen 140 + az + +++ +++ +++ (+) - ++++ + abgelaufen Die antizellulären Seren konnten im Lineassay sowohl als negativ, frisch und auch abgelaufen klassifiziert werden und waren so eindeutig beurteilbar. Einzig Nr. 4 hätte aufgrund des positiven Anti-EBNA-1 auch bei antizellulärem VCA-IgG mit der IFT als abgelaufene Infektion erkannt werden können. Besonders bei positivem VCA-IgG und antizellulärem Anti-EBNA-1 konnte mit der Immunfluoreszenztechnik nicht zwischen frischer und abgelaufener Infektion unterschieden werden. Durch das Lineassay-Verfahren ließen sich bei Nr. 84 und 140 je „3+“ Anti-EBNA-1-Banden nachweisen und die Fälle als „klassisch abgelaufen“ klassifizieren. In allen EBV-Status-Kategorien seronegativ, antizellular und seropositiv war der Lineassay mit der Kombination verschiedener Antigene und der einfacheren Anwendung des Aviditätstests der Immunfluoreszenztechnik überlegen. Mit den unklaren Infektionen im Lineassay blieb eine diagnostische Unsicherheit, dennoch könnte durch Folgeseren meistens Klarheit geschafft werden. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie B. 58 Normalpersonen In Tabelle 21 und Tabelle 22 sind die Befunde des IFT Verfahren als Übersicht und in detaillierter Form ersichtlich, dabei wurden in Tabelle 22 die seropositiven Befunde in die möglichen Konstellationen der IFT-Diagnostik aufgeschlüsselt. Tabelle 21: IFT-Befund, Übersicht IFT Befund Normalpersonen Anzahl % seronegativ 32 16,0 antizellular 16 8,0 seropositiv 152 76,0 Summe 200 100,0 Tabelle 22: IFT-Befund, Detailansicht, die „seropositiv“ Befunde sind in detaillierte Serodiagnosen aufgeschlüsselt IFT Befund Normalpersonen Anzahl % negativ 32 16,0 EBNA antizellular / BJAB + 14 7,0 VCA antizellular 2 1,0 VCA + / EBNA + 129 64,5 VCA + / EBNA +/- 4 2,0 VCA + / EBNA - 19 9,5 Summe 200 100,0 Die 32 im IFT-Befund negativen Fälle haben im Lineassay teilweise zu einer anderen Diagnose geführt. Drei der im IFT negativen Fälle wurden im Lineassay als „unklar“ befundet, also nicht sicher positiv und somit im weitesten Sinne kongruent mit den IFT-Ergebnissen, doch war wie bei den Athleten eine Zuordnung in eine eigene Gruppe „unklar“ möglich. Insgesamt wurden im Lineassay 31 negative Fälle gefunden. Übereinstimmend mit dem IFT-Befund waren 29 Fälle des Lineassay negativ. Die zwei im Lineassay zusätzlich als negativ bestimmten Fälle wurden mit der Immunfluoreszenztechnik in beiden Fällen als antizellular (Nr.132 und 199 in Tabelle 24) getestet. Auch bei den Normalpersonen war der Lineassay zur Erkennung von Seronegativen besser geeignet. Es wurden 129 „VCA + / EBNA +“ Fälle gefunden, die mit der Immunfluoreszenztechnik als klassisch abgelaufene, also länger zurückliegende Fälle gelten. Dementsprechend wurden im Lineassay 135 klassisch abgelaufene Serotypen gefunden. Einige der zurückliegenden Infektionen wurden demnach durch das Immunfluoreszenzverfahren nicht als solche erkannt bzw. konnten aufgrund der Antizellularität mancher Seren nicht klassifiziert werden. Bei weiteren Seren, die im Lineassay als „klassisch zurückliegend“ gewertet wurden, ließ sich im 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 59 Lineassay eindeutig ein Anti-EBNA-1 finden, während im IFT keine Anti-EBNA-1-Antwort festgestellt werden konnte. Der Lineassay schien Anti-EBNA-1-Antikörper sensitiver nachzuweisen und klassisch zurückliegende Infektionen von aberranten bzw. kürzlichen Infektionen deutlicher zu unterscheiden. Auch bei den Normalpersonen war es wichtig, akute und abgelaufene Infektionen voneinander abzugrenzen. Im Folgenden werden die in der IFT als vermeintlich frische Infektionen beurteilten Fälle aufgrund des Fehlens des späten Markers Anti-EBNA-1 den entsprechenden Lineassay-Ergebnissen gegenübergestellt. Die 23 Fälle „VCA + / EBNA -“ und „VCA + / EBNA+/-“ lassen sich zur serologischen Differentialdiagnose im Lineassay, wie in Tabelle 23 gezeigt, aufschlüsseln. Tabelle 23: Vergleich der IFT-Befunde "VCA + / EBNA - (+/-)" mit entsprechenden Lineassay-Befunden des Normalpersonen Kollektivs IFT Lineassay Antikörper Avidität LA Nr. VCA-IgG EBNA-1 EBNA-1 p 18 p 23 p 138 p 54 BZLF-1 B(1:16) p18 Beurteilung Lineassay p23 170 + - (+) - (+) - + (+) - unklar 167 + - - (+) (+) - ++ (+) - frisch 51 + - - ++ + - ++ - - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 193 + - - +++ +++ - - (+) - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 6 + - (+) ++ +++ - (+) - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 66 + - (+) ++ ++ - - + - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 162 + - (+) ++ ++ - - + - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 157 + - (+) +++ ++ - - ++ - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 5 + - (+) ++++ +++ - - (+) - hoch hoch abg., schwaches EBNA-1 13 + - + + + - - (+) - hoch hoch abgelaufen 78 + - + + ++ + (+) (+) - gering hoch abgelaufen 57 + - + ++ ++ - - + - hoch gering abgelaufen 144 + - + ++ +++ + + ++++ + hoch hoch abgelaufen 147 + - + ++ +++ - (+) +++ (+) hoch hoch abgelaufen 149 + - + +++ ++++ - - (+) - hoch hoch abgelaufen 169 + - + +++ +++ - (+) + - hoch hoch abgelaufen 39 + - + ++++ +++ - - +++ (+) 24 + - ++ ++ ++ - (+) (+) - abgelaufen 150 + - ++ ++ + (+) - (+) - abgelaufen 12 + +/- (+) ++ ++ (+) - + - 92 + +/- - ++ +++ - - ++ - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 103 + +/- - +++ ++ - - (+) - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 123 + +/- - +++ ++ - - ++ - hoch hoch abgelaufen ohne EBNA-1 hoch gering abgelaufen gering gering kürzlich abgelaufen 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 60 In Bezug auf die Positivität der EBNA-1-Antikörper weisen im Gegensatz zu den übereinstimmenden Befunden der IFT und des Lineassay beim Athleten-Kollektiv, bei den Normalpersonen zehn Seren ein deutlich positives Anti-EBNA-1 im Lineassay auf, bei negativem Anti-EBNA-1-Titer in der IFT. Bei den Athleten wurde für den Lineassay keine größere Sensitivität bei der Detektion von Anti-EBNA-1-Antikörper festgestellt. Die mit der Immunfluoreszenztechnik als vermeintlich „frisch“ identifizierten Fälle bieten im Lineassay ein differenzierteres Bild. Unter diesen Fällen wurden im Lineassay zehn Seren als aberrant abgelaufene Infektionen bestimmt, bei denen keine oder nur schwache Anti-EBNA-1 Antikörper nachweisbar waren („abgelaufen“ ohne (mit schwachem) Anti-EBNA-1). Bei diesen Konstellationen konnte mit Hilfe des Lineassay ebenso wie bei den Athleten über den Nachweis von p18-Antikörpern und deren hohe Avidität, als auch der hohen Avidität der p23-Antikörper, die Infektion als zurückliegend befundet werden. Als richtige Übereinstimmung zwischen IFT- und Lineassay-Befund wurde ein Fall als frisch (Nr. 167) und ein Fall (Nr. 12) als kürzlich zurückliegend klassifiziert, bei denen noch keine Anti-EBNA-1-Bildung nachzuweisen ist. Ein weiterer Fall wurde im Lineassay als nicht sicher positiv und damit unklar gefunden (Nr.170) (siehe Tabelle 23). Die primär mit der IFT nicht auswertbaren Fälle mit antizellularen Bestandteilen im Serum („EBNA az / BJAB +“, „VCA az“) wurden in Tabelle 24 den korrespondierenden LineassayBefunden gegenübergestellt, um zu überprüfen, ob die Lineassay-Methode auch bei den Normalpersonen bei solchen antizellulären Seren eine eindeutige Diagnose zulässt. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 61 Tabelle 24: Vergleich der antizellulären IFT-Befunde mit entsprechenden Lineassay-Befunden des Normalpersonen Kollektivs IFT Lineassay Nr. VCA-IgG EBNA-1 BJAB EBNA-1 Beurteilung Lineassay p 18 p 23 p 138 p 54 BZLF-1 B(1:16) 199 az - - - - - - (+) - - negativ 132 az - - - - - - - - - negativ 31 + az + - ++++ +++ - - ++ - abgelaufen ohne EBNA-1 196 + az + (+) +++ +++ - (+) ++ - abgelaufen ohne EBNA-1 124 + az + ++ (+) ++ (+) - ++ - abgelaufen ohne p18 184 + az + + (+) + - + + - abgelaufen 108 + az + + ++++ +++ - - (+) - abgelaufen 152 + az + + ++++ ++++ - +++ +++ (+) abgelaufen 185 + az + ++ +++ +++ (+) (+) ++ - abgelaufen 75 + az + ++ +++ +++ (+) + +++ (+) abgelaufen 18 + az + ++ ++++ + - - - - abgelaufen 22 + az + +++ +++ +++ (+) - + - abgelaufen 175 + az + +++ +++ ++ (+) - (+) - abgelaufen 188 + az + +++ +++ +++ - (+) ++ - abgelaufen 191 + az + +++ ++++ ++++ - - +++ 192 + az + ++++ +++ (+) ++ ++ (+) abgelaufen - abgelaufen Diese antizellulären Seren konnten im Lineassay sowohl als negativ, aberrant abgelaufen („abgelaufen ohne Anti-EBNA-1, abgelaufen ohne (schwaches) Anti-p18“) und auch klassisch abgelaufen (länger zurückliegend) klassifiziert werden. Ebenso wie bei den Athleten kann gerade bei positivem VCA-IgG und antizellulärem Anti-EBNA-1 mit der Immunfluoreszenztechnik nicht zwischen frischer und abgelaufener Infektion unterschieden werden. Hinter den Fällen Nr. 199 und Nr. 132 (Tabelle 24) hätte sich demnach bei positivem Anti-VCA-IgG eine frische, aber auch aberrant abgelaufene Infektion ohne Anti-EBNA-1Bildung verbergen können, im Lineassay wurden sie als negativ befundet. Auch bei den Normalpersonen war der Lineassay in allen EBV-Status-Kategorien seronegativ, antizellular und seropositiv mit der Kombination verschiedener Antigene und der einfacheren Anwendung des Aviditätstests der Immunfluoreszenztechnik überlegen. Bei den Athleten existierte eine geringere Diskrepanz zwischen positivem Anti-EBNA-1 im Linessay gegenüber dem negativen Anti-EBNA-1 in der Immunfluoreszenztechnik. Es gab in keinem Kollektiv Fälle, die die IFT-Diagnostik besonders erschwert haben. C. Vergleich der IFT-Befunde beider Kollektive Um zu prüfen, ob zwischen den beiden Kollektiven in der Häufigkeit der vorkommenden IFTBefunde ein signifikanter Unterschied besteht, wurde zuerst der Chi-Quadrat Test auf die 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 62 absoluten Häufigkeiten in Tabelle 25 angewendet. Gleichzeitig sollte herausgefunden werden, ob sich die beiden Gruppen so voneinander unterscheiden, dass gerade die Immunfluoreszenztechnik die EBV-Diagnostik erschweren könnte. Bei der Anwendung des Chi-Quadrat Tests auf das in Tabelle 25 ersichtliche Gesamtbild der IFT-Befundhäufigkeiten beider Kollektive ergibt sich kein signifikanter Unterschied (p=0,110). Tabelle 25: Häufigkeiten der IFT-Befunde der Gruppen Athleten und Normalpersonen und prozentuale Anteile der IFT-Befunde Befund Immunfluoreszenztechnik Normalpersonen % Athleten % Summe negativ 32 16,0 36 17,8 68 EBNA-1 antizellular / BJAB + 14 7,0 3 1,5 17 VCA antizellular 2 1,0 4 2,0 6 VCA + /EBNA + 129 64,5 138 68,3 267 VCA + / EBNA +/- 4 2,0 2 1,0 6 VCA + / EBNA - 19 9,5 19 9,4 38 Summe 200 100,0 202 100,0 402 Der größte Unterschied zwischen beiden Gruppen besteht in der Anzahl des Befundes „EBNA1 antizellular/ BJAB +“, der bei den Normalpersonen in 7,0 % und bei den Athleten bei 1,5% der Fälle gefunden wurde. Insgesamt wurden bei den Normalpersonen (8%) mehr antizelluläre Seren als bei den Athleten (3,5%) gefunden, die nicht eindeutig bestimmbar waren. Die mit der IFT Diagnostik ebenfalls mehrdeutig bestimmten Fälle „VCA + / EBNA -“ und „VCA + / EBNA +/-“ kommen bei beiden Gruppen in etwa gleicher Häufigkeit vor, bei den Athleten zusammen 10,4 % der seropositiven Fälle, bei den Normalpersonen 11,5%, so dass die Diagnostik bei den Athleten im Vergleich zu der Kontrollgruppe nicht erschwert zu sein scheint. Das Risiko, länger zurückliegende Infektionen ohne Anti-EBNA-1-Bildung mit der IFT als frische Infektionen zu deuten, bestand bei beiden Kollektiven im gleichen Maße. Klassisch zurückliegende Infektionen mit dem IFT-Befund „VCA + /EBNA +“ wurden je Gruppe in etwa gleicher Häufigkeit gefunden. Im Detail war durch den Lineassay bei Athleten und Normalpersonen eine genauere Differenzierung der Fälle in gleicher Weise möglich (siehe oben unter 3.1.3 A und B). In Abbildung 22 sind die IFT-Befunde ergänzend in ihrem prozentualen Anteil als geschichtete Säulen dargestellt. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 63 Abbildung 22: Anteil der IFT-Befunde der untersuchten Gruppen Das Immunfluoreszenztechnik-Verfahren hat gezeigt, dass sich Athleten und Normalpersonen in Bezug auf den EBV-Status sehr gleichen und kein signifikanter Unterschied der IFT-Befunde zwischen beiden Gruppen besteht. Durch fehlendes Anti-EBNA-1 wird die IFT-Diagnostik jeweils uneindeutig. 3.1.4 Einzelfallbeschreibung und Scanmethodik Um die bisher nur nach altem Muster betrachtete Variation der Antikörper-Intensitäten auch mit der Scanmethodik zu quantifizieren, werden im folgenden exemplarische Einzelfälle der verschiedenen Serogruppen systematisch aufgeführt. Die zusätzlich gemessene Avidität dieser Fälle ist im selben Diagramm dargestellt. Durch die Aviditätsmessung konnte eine weitere Differenzierung bei vielen Fällen erst vorgenommen werden, besonders wurde sie zur Unterscheidung von „kürzlich abgelaufenen“ und „länger zurückliegenden, aberranten (p18 abgelaufenen (kein/schwaches Anti-EBNA-1))“ Infektionen herangezogen. Zudem werden andere seltene und besondere Serumkonstellationen beider Kollektive beschrieben, die eine diagnostische Herausforderung dargestellt haben. Durch messtechnische Differenzen und Testkinetikunterschiede kann die Bandenintensität des mit Harnstoff behandelten Teststreifen (z.B. wie in Abbildung 23 die EBNA-1- und BZLF-1Antikörper bei Fall 1) gegenüber dem Primärbefund bei hohen Aviditäten auch leicht erhöht sein. Ebenso sind minimal sichtbare Banden mancher Antikörper-Klassen als durch den Scan erfasstes „Hintergrundrauschen“ der Teststreifen zu verstehen. In den folgenden Abbildungen stellen die weißen Säulen den Primärbefund, die schwarzen Säulen den Aviditätsbefund der jeweiligen Antikörper dar (mit Harnstoff behandelt). 3 Ergebnisse - Querschnittstudie A. 64 Klassisch zurückliegende Infektionen Bei den zurückliegenden Infektionen kann die Intensität der Antikörper wie in den Fällen der Abbildung 23 variieren, doch die Anti-EBNA-1- und Anti-p18-Antikörper sind immer vorhanden und haben eine hohe Avidität. Abbildung 23: Scanergebnis klassisch zurückliegender Infektionen beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1-3 Scan „Apollo“, Fall 4 Scan „München“) Fall 1 hat sich durch positives und hoch-avides Anti-EBNA-1, Anti-p18 und Anti-p23 ausgezeichnet. Auch Anti-BZLF-1 war positiv und hoch-avide, wurde aber so nicht zwingend bei allen klassisch zurückliegenden Infektionen gefunden. Die frühen Antikörper gegen p138 und p54 waren in der Regel wie bei den Fällen 1, 2 und 4 negativ bzw. unter dem Cutoff, seltener wie bei Fall 3 wurden sie auch positiv gefunden. In wenigen Fällen war die Anti-p23 Avidität gering. Der Aviditätsindex ist dann kleiner als 0,50, also das Verhältnis von Primärbefund und Aviditätsbefund, wie in Abbildung 23 bei Fall 4 für Anti-p23 ersichtlich ist (Aviditätsindex 0,32). Bei diesem Beispiel war die Bandenintensität von Anti-EBNA-1 im Vergleich zu Fall 1 zwar etwas schwächer, aber hoch-avide. Auch bei Fall 2 war die Intensität der Anti-EBNA-1 Bande etwas geringer, dennoch wie Anti-p18 hochavide. Der Aviditätsindex der Anti-p23-Bande betrug hier 0,49 und wäre damit als grenzwertig 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 65 zwischen niedrig- und hoch-avide zu bezeichnen. Dies soll verdeutlichen, dass bei klassisch zurückliegenden Infektionen eine variierende Avidität der Anti-p23-Antikörper gefunden wurde. B. Abgelaufene Infektionen ohne bzw. mit schwachem Anti-p18 aber hochavidem Anti-EBNA-1 Bei wenigen Testpersonen beider Gruppen konnte der zweite späte Antikörper Anti-p18 nicht oder nur sehr schwach nachgewiesen werden (Athleten 1,5% der Fälle, Normalpersonen 3,0% der Fälle). Der Ausschluss einer akuten Infektion erfolgte dann über einen positiven, hochaviden Anti-EBNA-1 Titer und positiven, zumeist hoch-aviden Anti-p23 Titer. Abbildung 24 zeigt exemplarisch verschiedene Konstellationen dieses Serotyps. Abbildung 24: Scanergebnis von Infektionen ohne bzw. mit schwachem Anti-p18 aber hoch-avidem AntiEBNA-1 beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1-3 Scan „Apollo“, Fall 4 Scan „München“) Neben der stark positiven, hoch-aviden Anti-EBNA-1-Bande war bei Fall 1 auch eine starke Intensität der hoch-aviden Anti-BZLF-1-Bande zu erkennen. Bei Fall 2 fiel die stark positive, hoch-avide Anti-p54-Bande auf, dessen Positivität sonst hauptsächlich bei frischen Infektionen erwartet wird. Bei Fall 3 waren ebenfalls Anti-p54-Antikörper vorhanden, diese waren aber 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 66 niedrig avide. Es wurden also auch bei den Sonderformen der zurückliegenden Infektionen Antikörper gegen frühe Antigene (p138, p54) gefunden, die jedoch in der Avidität stark unterschiedlich waren. Fall 4 soll verdeutlichen, dass auch bei dem Serotyp „abgelaufen ohne bzw. mit schwachem Anti-p18“ eher niedrig-avide Anti-p23-Antikörper nachweisbar waren (Aviditätsindex 0,42). Die hoch-avide Anti-EBNA-1-Bande hat hier die länger zurückliegende Infektion bestätigt. C. Abgelaufene Infektionen ohne bzw. mit schwachem Anti-EBNA-1 aber hochavidem Anti-p18 Abbildung 25 zeigt Beispiele für diesen Serotyp, bei dem kein oder nur ein sehr schwaches Anti-EBNA-1 nachgewiesen werden konnte, aber über ein positives, hoch-avides Anti-p18 und Anti-p23 eine frische oder kürzliche Infektion ausgeschlossen wurde (Athleten 11,9%, Normalpersonen 11,0%). Frühe Antikörper gegen p138 und p54 können wie bei allen zurückliegenden Infektionen vorhanden sein, meist in schwacher Intensität und mit unterschiedlicher, nicht aussagekräftiger Avidität. Abbildung 25: Scanergebnis von Infektionen ohne bzw. mit schwachem Anti-EBNA-1 aber hoch-avidem Anti-p18 beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1,2,4 Scan „Apollo“, Fall 3 Scan „München“) 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 67 Fall 1 und Fall 3 zeigen stellvertretend für andere Fälle dieses Infektionstyps, dass keine Antikörper gegen EBNA-1 nachgewiesen werden konnten. Der zweite späte Antikörper Antip18 war dennoch positiv und hoch-avide und hat die Serodiagnose einer länger zurückliegenden Infektion erlaubt. Bei „kürzlich zurückliegenden“ Infektionen wäre Anti-p18 niedrig-avide und so Anhaltspunkt für eine noch stattfindende Reifung der Antigen-Antikörper-Komplexe gewesen. Die hoch-aviden Anti-p18-Antikörper sind auch in Fall 2 und 4 erkennbar, hier wurden allerdings geringe Titer von Anti-EBNA-1-Antikörpern festgestellt. Ähnlich allen grundsätzlich zurückliegenden Infektionen, sind die Antikörper gegen das p23Antigen hoch avide, wurden selten aber, wie bei Fall 3, als niedrig-avide bestimmt (Aviditätsindex 0,20). Fall 2 zeigt erneut beispielhaft, dass auch bei zurückliegenden, aberranten Infektionen Antikörper gegen die „Early antigens“ (p138, p54) vorhanden und hoch avide sein können. D. Kürzlich abgelaufene Infektionen Auch bei diesem in Abbildung 26 ersichtlichen Infektionsstatus konnte kein Anti-EBNA-1 nachgewiesen werden, doch haben sich solche Seren gegenüber dem Serostatus „abgelaufen ohne bzw. mit schwachem Anti-EBNA-1“ durch ein zwar positives, aber niedrig-avides Antip18 unterschieden. Auch Anti-p23 war positiv und meist noch niedrig avide, selten schon in der Reifung vorangeschritten und dann hoch-avide. Bei der Mehrzahl dieser Fällen kann davon ausgegangen werden, dass die Bildung von Antikörpern gegen EBNA-1 noch aussteht. Bei Nichtbildung von Anti-EBNA-1 würde im weiteren zeitlichen Verlauf zumindest die Avidität der Antikörper gegen p18 und p23 ansteigen, und so bei Testung eines Folgeserums zur Serodiagnose „abgelaufen ohne bzw. mit schwachem Anti-EBNA-1“ führen. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 68 Abbildung 26: Scanergebnis „kürzlich abgelaufener“ Infektionen beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1 Scan „Apollo“, Fall 2-4 Scan „München“) Exemplarisch haben die Fälle 1 und 2 gezeigt, dass Antikörper gegen EBNA-1 nicht existent waren und die anderen vorhandenen Antikörper eine geringe Avidität hatten. Auch Antikörper gegen frühe Antigene wurden teilweise nachgewiesen, waren bei Fall 1 aber niedrig-avide. Mit Fall 3 ist ein Beispiel hoch-avider Anti-p23 Antikörper abgebildet, dagegen waren die schon existenten Antikörper gegen EBNA-1 und p18 noch niedrig-avide und der Status wurde als „kürzlich abgelaufen“ bezeichnet. Eine isolierte, niedrig-avide Anti-p23-Bande, wie bei Fall 4, hätte für ein akutes Geschehen sprechen können. Da aber die späten Antikörper schon grenzwertig positiv und hoch-avide waren, dürfte es sich eher um eine kürzlich zurückliegende, aber sicher keine ganz frische Infektion gehandelt haben. Der erneute Test eines Folgeserums könnte in einem solchen Fall Klarheit schaffen. E. Frische Infektionen Ein Titer später Antikörper gegen Antigene wie EBNA-1 und p18 wird bei den wirklich frischen Infektionen gewöhnlich nicht beobachtet. Erst im weiteren Verlauf (mehrere Wochen) 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 69 erfolgt für diese eine Serokonversion, dann sind sie aber noch wenig gereift und niedrig-avide wie unter D beschrieben und die Infektion würde als kürzlich abgelaufen gelten. Abbildung 27: Scanergebnis „frischer“ Infektionen beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1 und 2 Scan „Apollo“) Bei beiden in Abbildung 27 dargestellten Fällen waren eindeutig nur Antikörper gegen das frühe Antigen p54 vorhanden. Diese Antikörper ließen sich bei Fall 1 durch Harnstoff wieder völlig aus der Antigen-Antikörper-Bindung lösen, bei Fall 2 teilweise, die Reifung der Antikörper gegen p54 war schon etwas vorangeschritten (Aviditätsindex 0,39). Bei beiden Fällen aber war die Anti-p54 Avidität als gering zu bezeichnen. Außerdem sind bei Fall 2 die grenzwertig positiven Konzentrationen von Anti-EBNA-1-, Anti-p18- und Anti-p23Antikörpern sichtbar, die sich alle durch Harnstoff wieder vom Teststreifen ablösen lassen und damit als niedrig-avide gelten, so dass beide Fälle als akute EBV-Neuinfektionen gedeutet wurden. Die Probanden waren allerdings klinisch gesund. F. Andere besondere Serumkonstellationen In Abbildung 28 sind weitere Einzelfälle der beiden Gruppen Athleten und Normalpersonen dargestellt, die zu den obigen Gruppen von Infektionstypen gehören, aber eine besondere Konstellation oder Kinetik gezeigt haben. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 70 Abbildung 28: Scanergebnis besonderer Konstellationen beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1-2 Scan „Apollo“, Fall 3-4 Scan „München“) Interessant war Fall Nr. 1, der aufgrund der Negativität beider später Marker, aber hoch-avidem Anti-p23 als „kürzlich abgelaufen“ klassifiziert wurde, bei dem man die Bildung zumindest eines späten Antikörpers noch erwarten würde. Es könnte sich aber auch eine länger zurückliegende Infektion ohne Bildung beider später Marker Anti-EBNA-1 und Anti-p18 handeln. Dieses Beispiel war sicher ein Grenzfall und mit einem Folgeserum in einem Abstand von etwa zwei Wochen hätte eine genauere Zuordnung getroffen werden können. Ebenso auffällig war Fall Nr. 2 mit fast isoliertem Anti-p18. Anti-EBNA-1- und Anti-p23Antikörper waren hier nur grenzwertig nachweisbar. Durch das hoch-avide Anti-p18 ließ sich dieser Fall jedoch trotzdem eindeutig der Gruppe „abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1“ zuordnen. Bei Fall 3 hat es sich um eine Infektion mit insgesamt schwächeren Antikörper-Antworten gehandelt. Anti-p18 und Anti-p23 waren grenzwertig nachweisbar, Anti-BZLF-1 dagegen deutlich positiv und hoch-avide. Anti-EBNA-1 war ebenfalls sicher positiv und hoch-avide, so dass eine frische oder kürzliche Infektion ausgeschlossen und dieser Fall als „länger zurückliegend“ befundet wurde. 3 Ergebnisse - Querschnittstudie 71 Schließlich wurde bei Fall 4 die seltene Beobachtung von fast isoliert positiven, hoch-aviden Anti-EBNA-1-Antikörpern gemacht. Anti-p18 war bei einer Cutoff-Amplitude von etwa 50 grenzwertig positiv. Daher wurde dieser Fall der Gruppe „abgelaufen ohne bzw. mit schwachem Anti-p18“ zugeordnet. Auch die sonst bei zurückliegenden Infektionen sehr häufig positiven Anti-p23 Antikörper waren bei diesem Fall nicht nachweisbar. G. Unklare Konstellationen Bei wenigen Fällen beider Kollektive konnte durch den Lineassay Test keine klare Aussage über den Serostatus getroffen werden, da mehrere Antikörper mit grenzwertig oder vereinzelten schwachpositiven Banden in untypischer Konstellation gefunden wurden. In Abbildung 29 sind exemplarische Beispiele dieser Fälle aufgeführt. Abbildung 29: Scanergebnis unklarer Konstellationen beider Kollektive mit gemessener Amplitude der Bandenintensität (schwarze Säulen), (Fall 1,2,4 Scan „Apollo“, Fall 3 Scan „München“) Bei Fall 1 bis Fall 3 fallen die grenzwertig positiven Antikörper-Banden auf (Cutoff-Amplitude ca. bei 50, bei Fall 3 ca. 80), meistens gegen die Antigene EBNA-1, p23 und p54. Anti-p54 war bei Fall 1 und Fall 2 etwas intensiver. Anti-p18 und Anti-p138 waren, wenn überhaupt, nur sehr schwach und gering-avide vorhanden. Bei Fall 4 könnte es sich um eine frische Infektion 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 72 gehandelt haben, auch aufgrund der geringen Avidität der vorhandenen Antikörpern. Jedoch hätte erst ein Folgeserum Klarheit schaffen können, in dieser Konstellation hat es sich aufgrund der nur grenzwertig positiven Antikörper nicht sicher um eine frische Infektion gehandelt. Die Kombination von späten und frühen Antikörpern mit hoher Avidität, aber geringer Intensität, meist unterhalb des Cutoff, ließ bei diesen Fällen keine eindeutige Beurteilung des Lineassay zu. Somit sind die meisten dieser Fälle als „nicht sicher positiv“ und damit „unklar“ beschrieben worden. Dazu passt, dass einige dieser Fälle im IFT Verfahren als seronegativ befundet wurden. Dies würde darauf hindeuten, dass in seltenen Fällen auch im Lineassay unspezifische Hintergrundreaktionen die diagnostische Aussage verwehren können, z.B. durch Kontamination des Serums oder des Testansatzes, wenn das Serum eigentlich EBV-negativ ist. 3.2 Longitudinalstudie Die Longitudinalstudie wurde durchgeführt, um die Verläufe von Antikörper-Titern studieren zu können. Verschiedene Aspekte sollten besondere Beachtung finden. So hat die Fragestellung interessiert, ob im Verlauf Schwankungen der Antikörper-Konzentrationen auftreten würden, die die Diagnostik erschweren und gar zu anderen Serodiagnosen führen könnten. Außerdem sollte die Kinetik der Avidität beobachtet werden, die als Maß für die Reifung von AntigenAntikörper-Komplexen im Verlauf besondere Wichtigkeit erlangen könnte. Schließlich galt es, anhand des Vergleichs von Athleten mit Normalpersonen festzustellen, ob sich eventuelle Konzentrationsschwankungen besonders mit sportlicher Höchstbelastung in Verbindung bringen lassen oder ob der Verlauf der Antikörper-Antworten bei Athleten im Gegensatz zu Normalpersonen nicht bzw. gleichsinnig verändert ist. Das Wiederauftreten von EA-Antikörpern wird bei Athleten manchmal als Zeichen einer „Reaktivierung“ verstanden, die sich auch klinisch äußern kann (67). Daher sollte besonders die Kinetik von Antikörpern gegen die EAs (p138, p54) beobachtet werden. Dazu wurden bis zu sechs Seren (bis zu sechs Blutabnahme-Zeitpunkte) je Proband beider Gruppen mit dem Lineassay getestet, für die meisten seropositiven Fälle wurde zusätzlich die Avidität bestimmt. 3.2.1 Probanden-Charakteristika Es wurden insgesamt 27 Probanden in der Longitudinalstudie getestet, die sich, wie nachfolgend beschrieben, auf zwei Kollektive verteilten. 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie A. 73 Athleten Es wurden insgesamt 15 Athleten mit einem Durchschnittsalter von 27 Jahren (SD 3) getestet. Sieben der Probanden waren weiblich, acht männlich. B. Normalpersonen Zum Normalpersonen Kollektiv gehörten 12 Probanden mit einem Durchschnittsalter von 23 Jahren (SD 1), eine Probandin war weiblich gegenüber elf männlichen Personen. Ein Fall (Lfd. Nr. 504) musste aufgrund von persistierenden uneinheitlichen Ergebnissen der zeitlich aufeinander folgenden Seren nach dreimaliger Wiederholung des Lineassay-Tests komplett von dem Kollektiv ausgeschlossen werden. Bei einem weiteren Fall musste das dritte Serum der Serie ausgeschlossen werden, da es auch nach mehrfacher Wiederholung ein negatives Ergebnis lieferte, die restlichen Seren dieses Verlaufes aber positiv und kongruent in der Konstellation der vorhanden Antikörper waren. 3.2.2 A. EBV-IgG-Lineassay Athleten Der Lineassay-Test der 15 Athleten führte zu den in Tabelle 26 ersichtlichen Serodiagnosen. Diese Erstdiagnosen wurden aufgrund des jeweiligen Ergebnisses des zeitlich ersten Serums gemacht, im weiteren Verlauf wurde bei keinem der Probanden eine grundsätzliche Änderung der Erstdiagnose festgestellt. Tabelle 26: Lineassay Befund Detailansicht, die“ Befunde sind in Subgruppen aufgeschlüsselt Lineassay Befund Athleten Anzahl % negativ 1 6,7 länger zurückliegend (abgelaufen) 10 66,7 abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1 3 20,0 abgelaufen ohne (schwaches) Anti-p18 1 6,7 Summe 15 100,0 Neben einem negativen wurden 14 seropositive Fälle gefunden. Der größte Anteil entfiel auf die klassisch zurückliegenden Infektionen mit beiden positiven Antikörpern Anti-EBNA-1 und Anti-p18. Bei drei Fällen war Anti-EBNA-1 nur schwach vorhanden, bei einem Fall war Antip18 nicht nachweisbar. Kürzlich abgelaufene oder unklare Fälle wurden nicht beobachtet. Ausschließlich die seropositiven Fälle wurden bei dem Vergleich der beiden Kollektive in der Analyse unter 3.2.4 berücksichtigt. Die durch die Scanmethodik ermittelten Amplituden jedes Antikörpers sind für alle seropositiven Fälle der Athleten in den folgenden Abbildungen dargestellt. Dabei wurde die 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 74 Abszisse bewusst chronologisch gewählt, um den zeitlichen Abstand zwischen den Abnahmen zu verdeutlichen. Abbildung 30: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 2 Abbildung 31: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 24 Abbildung 32: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 32 Abbildung 33: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 46 Abbildung 34: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 52 Abbildung 35: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 54 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 75 Abbildung 36: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 61 Abbildung 37: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 63 Abbildung 38: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 78 Abbildung 39: Verlauf der AK-Amplituden, Nr. 142 Abbildung 40: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 162 Abbildung 41: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 169 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 76 Abbildung 42: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr.177 Abbildung 43: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 178 Bei der Betrachtung dieser Einzelfälle fiel auf, dass es im zeitlichen Verlauf zu keinen wesentlichen Schwankungen der Antikörper-Konzentrationen gekommen ist. Bereits vorhandene Antikörper waren während des gesamten Messzeitraum eindeutig nachweisbar. Es kamen keine neuen Antikörper-Antworten im zeitlichen Verlauf dazu, bis auf drei Ausnahmen, die alle wie Fall Nr. 24 (Anti-p138), 54 (Anti-BZLF-1) und 63 (Anti-p138, Anti-p54) auch Fehlerfassungen der, wenn überhaupt vorhandenen, schwachen Originalbanden bedeuten könnten. In manchen Fällen kam es zu einem messbarem Anstieg der Antikörper-Konzentration, z.B. bei Fall Nr. 24, 32, 52 und 142. Dieser Anstieg erfolgte gleichsinnig für alle vorhandenen Antikörper und war auch mit bloßem Auge erkennbar. Durch die Scanmethodik konnte diese Kinetik in oben dargestellter Weise quantifiziert werden. Bei anderen Fällen wie z.B. Nr., 2, 63 und 177 wurden leichte Schwankungen der Bandenintensitäten gefunden, die jedoch insgesamt zu keinem deutlichen Anstieg der Antikörperkonzentration geführt haben. Bei keinem der Fälle hat die Änderung der Konzentration zu einer Änderung des Serostatus bzw. der Erstdiagnose geführt. Interessant war auch, dass vorhandene frühe Antikörper wie z.B. Anti-p54 bei Fall Nr. 24 und 46 (je Anti-p54) über die Zeit konstant vorhanden waren und keine wesentlichen Schwankungen erkennen ließen. Bei Fall Nr. 63 wurden die frühen Antikörper Anti-p138 und Anti-p54 im Scan des zeitlich ersten Serums negativ und erst im zweiten Serum grenzwertig positiv festgestellt, obwohl sie bereits beim Test des ersten Serum auf dem Originalstreifen schwach zu erkennen waren. Die Intensität dieser schwach-positiven Banden lag aber in der Höhe des „Hintergrundrauschens“ und wurde daher nicht korrekt erfasst. Die späten Antikörper wurden schon beim ersten Serum stark positiv gefunden, so dass es sich trotzdem um eine eindeutig zurückliegende Infektion gehandelt hat. 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie B. 77 Normalpersonen Der Lineassay-Test der 11 Normalpersonen führte zu den in Tabelle 27 ersichtlichen Serodiagnosen. Tabelle 27: Lineassay Befund Detailansicht, die „seropositiv“ Befunde sind in Subgruppen aufgeschlüsselt Lineassay Befund Normalpersonen Anzahl % negativ 3 27,3 länger zurückliegend (abgelaufen) 7 63,6 abgelaufen, schwaches Anti-EBNA-1 1 9,1 Summe 11 100,0 Der Anteil der seronegativen Probanden war bei den Normalpersonen mit drei negativen gegenüber acht seropositiven Probanden etwas höher als bei den Athleten. Von den acht seropositiven Seren wiesen sieben das klassische Serummuster mit beiden positiven Antikörpern Anti-EBNA-1 und Anti-p18 sowie positivem Anti-p23 auf. Ein Fall hatte nur ein schwaches Anti-EBNA-1, eine akute oder kürzliche Infektion wurde aber aufgrund eines hochaviden Anti-p18 und Anti-p23 ausgeschlossen. Auch bei den Normalpersonen wurden in der Longitudinalstudie keine kürzlich zurückliegenden, akuten oder unklaren Infektionen festgestellt. Ebenso wenig wie bei den Athleten kam es im Verlauf zu einer grundsätzlichen Änderung der Serodiagnose. Zum Vergleich mit den Athleten unter 3.2.4 wurden nur die seropositiven Fälle herangezogen. Die durch die Scanmethodik ermittelten Amplituden jedes Antikörpers sind zunächst für alle seropositiven Fälle der Normalpersonen in den folgenden Abbildungen dargestellt. Dabei wurde die Abszisse wieder chronologisch gewählt, um den zeitlichen Abstand zwischen den Abnahmen zu verdeutlichen. Abbildung 44: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 501 Abbildung 45: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 505 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 78 Abbildung 46: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 506 Abbildung 47: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 510 Abbildung 48: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 511 Abbildung 49: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 512 Abbildung 50: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 514 Abbildung 51: Verlauf der Ak-Amplituden, Nr. 515 Die Antikörper-Banden der Normalpersonen erscheinen im Verlauf konstanter als die der Athleten, leichte Schwankungen der Bandenintensitäten wurden ebenfalls gefunden. Der bei den Athleten in manchen Fällen deutlicher messbare Anstieg der Antikörper-Konzentrationen 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 79 war bei den Normalpersonen im zeitlichen Verlauf nicht nachweisbar. Lediglich in Abbildung 44 bei Fall Nr. 501 ist eine leichte Intensitätszunahme der Antikörperbanden erkennbar. Bei drei Fällen der Normalpersonen (Nr. 501, 510, 515) konnten grenzwertige, niedrig-avide Anti-p138-Antikörper konstant nachgewiesen werden, die jedoch in ihrer Intensität leicht unter dem Cutoff gemessen wurden, mit bloßem Auge aber schwach erkennbar waren. Antikörper gegen p54 wurden bei den Normalpersonen nicht nachgewiesen. 3.2.3 Aviditätsbestimmung Um den zeitlichen Verlauf der Avidität verfolgen zu können, sind in Abbildung 52 bis Abbildung 56 exemplarisch Einzelfälle beider Kollektive mit Aviditätsbestimmung der gefundenen Antikörper-Konstellationen dargestellt. In beiden Gruppen wurden weitere Aviditätsbestimmungen durchgeführt, auf deren Abbildung an dieser Stelle verzichtet wurde, da alle wesentlichen Muster durch die folgenden Diagramme präsentiert sind. Für jeden Antikörper sind die Säulen chronologisch nach dem Abnahmezeitpunkt geordnet (die erste Säule einer Antikörper-Klasse entspricht der ersten Säule der nächsten Antikörper-Klasse, usw.). Abbildung 52: Athleten Nr. 24: Befund „länger zurückliegend“, zeitlicher Verlauf der Avidität jedes Antikörpers, (weiße Säulen entsprechen Primärbefund, schwarze Säulen dem Aviditätsbefund) In Abbildung 52 ist ein klassisch zurückliegender Fall der Athleten mit deutlicher Positivität und hoher Avidität der späten Antikörper Anti-EBNA-1 und Anti-p18 sichtbar. Ebenfalls waren hoch-avide Antikörper gegen Anti-p23 und Anti-BZLF-1 vorhanden. Bei T6, also der Abnahme am 15.05.2002, war eine Intensivierung der Amplitude des Primär- als auch Aviditätsbefundes nachweisbar. Außerdem waren bei diesem Fall, wie auch bei anderen der Longitudinalstudie, schwach positive, gering-avide frühe Antikörper nachweisbar, hier gegen das p54-Antigen. 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 80 Abbildung 53: Normalpersonen Nr. 514: Befund „länger zurückliegend“, zeitlicher Verlauf der Avidität jedes Antikörpers, (weiße Säulen entsprechen Primärbefund, schwarze Säulen dem Aviditätsbefund) In Abbildung 53 ist mit Fall Nr. 514 der Normalpersonen ein weiteres klassisches Beispiel für eine länger zurückliegende Infektion aufgeführt. Besonders auffällig war die sehr konstante Intensität der Antikörper-Banden Anti-EBNA-1, Anti-p18, Anti-p23 und Anti-BZLF-1 als auch die konstanten entsprechenden Avidität-Banden. Die Avidität der Antikörper gegen p23 war aufgrund des Index von 0,42 bis 0,55 an der Grenze zwischen niedrig- und hoch-avide einzustufen. Im zeitlichen Verlauf hat hier keine Reifung von Anti-p23 stattgefunden, sonst wäre die Avidität-Bande im Verlauf intensiver geworden und hätte zu einem höheren Aviditätsindex geführt. Abbildung 54: Athleten Nr. 46, Befund „abgelaufen mit schwachem Anti-EBNA-1“, zeitlicher Verlauf der Avidität jedes Antikörpers, (weiße Säulen entsprechen Primärbefund, schwarze Säulen dem Aviditätsbefund) 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 81 Bei Fall Nr. 46 der Athleten in Abbildung 54 waren wieder Antikörper gegen die späten Antigene EBNA-1 und p18 nachweisbar, jedoch war die Intensität der Anti-EBNA-1Antikörper sehr gering und schwächer als die Cutoff-Amplitude (ca. 90). Der sichere Ausschluss einer Frischinfektion erfolgte über das hoch-avide Anti-p18 und Anti-p23. Außerdem waren hoch avide Anti-BZLF-1-Antikörper und schwach positive, niedrig-avide Anti-p54-Antikörper vorhanden. Der Fall wurde als „abgelaufen mit schwachem Anti-EBNA1“ befundet. Die Avidität hat sich im Verlauf nicht wesentlich geändert und wies keine Schwankungen auf. Abbildung 55: Normalpersonen Nr. 515, Befund „abgelaufen ohne Anti-EBNA-1“, zeitlicher Verlauf der Avidität jedes Antikörpers, (weiße Säulen entsprechen Primärbefund, schwarze Säulen dem Aviditätsbefund) In Abbildung 55 ist der Verlauf der Avidität bei Fall Nr. 515 der Normalpersonen mit der Serodiagnose „abgelaufen ohne Anti-EBNA-1“ ersichtlich. Antikörper gegen EBNA-1 wurden nur grenzwertig positiv und gering-avide gefunden, d.h. sie waren durch Harnstoff Behandlung wieder völlig vom Teststreifen ablösbar. Die Beurteilung als aberrant zurückliegende Infektion wurde durch das positive, hoch-avide Anti-p18 und Anti-p23 bestätigt. Bei diesem Fall waren ebenfalls schwach positive und gering-avide Antikörper gegen BZLF-1 nachweisbar. Über den Beobachtungszeitraum ist auch hier keine wesentliche Änderung der Antikörper-Konzentration und deren Avidität aufgetreten. Die Avidität-Banden von Anti-p138 waren nur sehr schwach auf dem Teststreifen vorhanden und wurden deshalb nicht immer als positiv erfasst. 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 82 Abbildung 56: zeitlicher Verlauf der Avidität jedes Antikörpers – „abgelaufen ohne Anti-p18“, zeitlicher Verlauf der Avidität jedes Antikörpers, (weiße Säulen entsprechen Primärbefund, schwarze Säulen dem Aviditätsbefund) Abbildung 56 zeigt den selteneren Typ eines nicht vorhandenen Anti-p18-Antikörper bei länger zurückliegender Infektion. (Serodiagnose „abgelaufen ohne Anti-p18“) Der Ausschluss einer Frischinfektion erfolgte über das hoch-avide Anti-EBNA-1 und Anti-p23. Antikörper gegen BZLF-1 waren schwach positiv und insgesamt gering-avide. Bei diesem Fall war ebenfalls ersichtlich, dass über einen Zeitraum von ca. einem Jahr keinen wesentlichen Schwankungen der Antikörper-Konzentration oder der Avidität stattfinden. Auch die Avidität war über den zeitlichen Verlauf im Allgemeinen konstant. Als Trend konnten minimale Schwankungen im Verlauf hin zur größeren Intensität der Aviditätsbanden bei manchen Fällen gemessen werden, also eine „Reifungszunahme“ der Avidität der AntigenAntikörper-Komplexe. 3.2.4 Vergleich der beiden Gruppen Um die beiden Kollektive in ihrer Gesamtheit zu vergleichen, wurden die Einzelfälle je Gruppe durch Mittelwertbildung der Antikörper-Amplituden je Zeitpunkt zusammengefasst. So sollte sichtbar werden, ob es im zeitlichen Verlauf Effekte der Antikörperkonzentrationen gibt, die für alle getesteten Athleten oder Normalpersonen spezifisch sind und bei zukünftiger Diagnostik zu berücksichtigen wären. 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 83 Im Vergleich zu den Normalpersonen war das Merkmal Geschlecht bei den Athleten homogener verteilt als bei den Normalpersonen, jedoch wurde es nicht als Variable in die Auswertung einbezogen. Das Kollektiv der Athleten war mit 27 (SD 3) Jahren im Durchschnitt älter als die Normalpersonen (23 Jahre, SD 1) und wies eine größere Streuung des Alters auf. In der nachfolgenden Tabelle 28 sind die Mittelwerte der Antikörperamplituden je Zeitpunkt für beide Kollektive dargestellt. Bei jedem Messzeitpunkt wurden unterschiedlich viele Probanden erfasst, nicht jeder Proband wurde an allen sechs Zeitpunkten getestet. Tabelle 28: zeitlicher Verlauf (T1-T6) der Antikörperamplituden-Mittelwerte, Athleten (ATH) und Normalpersonen (NP) im Vergleich (nur seropositive Fälle) Antikörper Mittelwert der Antikörper-Amplitude je Zeitpunkt gegen T1 T2 T3 T4 T5 T6 ATH NP ATH NP ATH NP ATH NP ATH NP ATH NP EBNA-1 173 192 161 190 176 153 173 191 169 188 211 189 p18 159 214 170 217 165 201 191 232 189 215 196 215 p23 219 161 181 170 189 167 217 193 240 181 246 178 p138 0 14 3 13 0 10 3 16 0 15 6 11 p54 7 0 11 0 0 0 9 0 8 0 11 0 BZLF-1 78 89 57 92 71 112 81 96 73 91 105 76 n je Zeitpunkt 13 8 11 8 9 4 13 7 12 8 14 8 Insgesamt wurden bei den Athleten (ATH) 14 seropositive Fälle im Verlauf analysiert, alle gemeinsam wurden jedoch nur bei Zeitpunkt T6 erfasst. Bei den Normalpersonen (NP) wurden insgesamt 8 seropositive Probanden getestet, alle wurden zu T1, T2, T5 und T6 erfasst. Zur Veranschaulichung der Antikörperkonzentration-Verläufe sind in den folgenden Abbildungen, für jeden Antikörper getrennt, die beiden Kollektive anhand der Antikörperamplituden-Mittelwerte und der zugehörigen 95% Konfidenzintervalle einander gegenübergestellt. 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 84 Abbildung 57: Anti-EBNA-1 95% Konfidenzintervalle Abbildung 58: Anti-p18 95% Konfidenzintervalle Abbildung 59: Anti-p23 95% Konfidenzintervalle Abbildung 60: Anti-p138 95% Konfidenzintervalle Abbildung 61: Anti-p54 95% Konfidenzintervalle Abbildung 62: Anti-BZLF-1 Konfidenzintervalle 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 85 Für das Kollektiv der Normalpersonen ist insgesamt auffällig, dass bei T3 ein großes Konfidenzintervall besteht. Der bei T3 errechnete Mittelwert entspricht nicht unbedingt dem realistischen Abbild des Gesamtkollektivs, da zu diesem Zeitpunkt T3 nur 4 Probanden getestet wurden, die zufällig geringere Konzentrationen z.B. von Anti-EBNA-1 aufwiesen und so zu einer scheinbaren Veränderung des Verlaufs geführt haben, bei Anti-EBNA-1 zu einem scheinbar geringeren Durchschnittswert. Bei den Normalpersonen wurde bei keinem der Probanden positive Anti-p54 Banden gefunden, so dass auch der Verlauf der Mittelwerte Null war. Bei den Athleten wurden zu Zeitpunkt T3 im Gegensatz zu beispielsweise T4 nur neun Probanden getestet. Für die Konzentrationen von Anti-p138 und Anti-p54 ergab sich so ein Mittelwert von 0, weil zu diesem Zeitpunkt T3 gerade die für diese Antikörper positiven Probanden nicht gemessen wurden. Auch bei den anderen Antikörpern wurden deshalb zum Zeitpunkt T3 niedrigere Mittelwerte gefunden. Zusätzlich wurde dieser Effekt auch für die Antip138-Antikörper zu T1 und T5 beobachtet. Anhand der Skalierung der Ordinaten ist zu erkennen, dass für die „Early antigens“ im Durchschnitt nur geringe Amplituden von Anti-p138 und Anti-p54 gemessen wurden, die aber über die Zeit konstant nachweisbar waren. Dagegen wurden bei beiden Gruppen höhere Antikörperkonzentrationen gegen Anti-EBNA-1, Anti-p18, Anti-p23 und Anti-BZLF-1 festgestellt, die zudem größere Schwankungen des Mittelwerts erkennen ließen, aber teilweise auch von der Anzahl der erfassten Probanden abhängig waren. Für die Athleten wurden im Vergleich zu den Normalpersonen etwa gleich hohe Anti-EBNA-1-, niedrigere Anti-p18-, leicht höhere Anti-p23- und etwa gleich hohe Anti-BZLF-1- Titer festgestellt. Zur Evaluation, ob zwischen den Kollektiven hinsichtlich des Verlaufes der AmplitudenMittelwerte ein statistisch messbarer signifikanter Unterschied besteht, wäre die „repeated measurements“ Methode in SPSS sinnvoll gewesen, jedoch gab es bei beiden Kollektiven nur 34 Probanden, die an allen Testzeitpunkten erfasst wurden. So wären die Kollektive zu klein gewesen, um die Methode entsprechend anwenden zu können. Stattdessen wurden die Abnahmezeitpunkte kategorisiert und die Daten mit univariater Varianzanalyse ausgewertet. Alle Antikörper wurden dabei getrennt voneinander betrachtet. Die Fragestellungen waren im Einzelnen: ¾ Besteht zwischen den Kollektiven ein Unterschied im Niveau der AmplitudenMittelwerte unabhängig von der Zeit? 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie ¾ Besteht zwischen den 86 Kollektiven ein Unterschied im Verlauf der Antikörperkonzentration-Mittelwerte? In Tabelle 29 sind die Signifikanzniveaus der beiden Fragen ersichtlich. Tabelle 29: Ergebnisse der Analyse der Amplituden-Mittelwerte Amplituden-Mittelwert Unterschied in Signifikanz je Antikörper gegen EBNA-1 p18 p23 p138 p54 BZLF-1 Kollektiv (unabh. Zeit) 0,757 0,004 0,018 0,000 0,009 0,294 Kollektiv*Zeit (Verlauf) 0,955 0,939 0,807 0,981 0,948 0,954 Es fällt auf, dass sich die Kollektive nur in Hinblick auf die Intensität (unabhängig von der Zeit) mancher Amplitudenmittelwerte signifikant unterscheiden (Anti-p18, Anti-p23, Anti-p138 und Anti-p54). Die Mittelwerte der Anti-EBNA-1- und Anti-BZLF-1-Antikörper unterschieden sich in ihrer Intensität nicht signifikant voneinander. Es findet sich kein signifikanter Unterschied in Hinsicht auf eine Änderung der Antikörperintensität im zeitlichen Verlauf. Um herauszufinden, ob in Bezug auf Veränderungen der Antikörper-Amplitudenmittelwerte von T1 (Beobachtungsbeginn) zu T6 (Beobachtungsende) zwischen Athleten und Normalpersonen ein Unterschied bestanden hat, also unabhängig vom Verlauf zwischen den Messzeitpunkten, wurde der T-Test für unverbundene Stichproben angewendet. Die Signifikanzniveaus dieser Fragestellung sind in Tabelle 30 ersichtlich. Tabelle 30: Unterschied zwischen T1 und T6 im Vergleich der Kollektive: Signifikanzniveaus Antikörper p-Wert EBNA-1 0,026 p18 0,026 p23 0,422 p138 0,093 p54 0,100 BZLF-1 0,003 Bis auf die Anti-p23- und Anti-p54-Antikörper wurden für das Kollektiv der Athleten bei den anderen Antikörpern zum Zeitpunkt T6 (Beobachtungsende) gegenüber Zeitpunkt T1 (Beobachtungsbeginn) signifikant verschiedene Amplitudenmittelwerte gefunden. Der Verlauf der Amplituden zwischen T1 und T6 blieb bei dieser Auswertung unberücksichtigt. Die Athleten haben im Vergleich zu den Normalpersonen zum Zeitpunkt T6 ein signifikant höheres Anti-EBNA-1, Anti-p18, Anti-p138 und Anti-BZLF-1 als zu Zeitpunkt T1, d.h. eine Entwicklung hin zu einer höheren Konzentration hat stattgefunden. Im Wesentlichen waren sowohl die Antikörperkonzentrationen als auch die Avidität der Antikörper im zeitlichen Verlauf konstant. Es traten messbare Schwankungen auf, die jedoch 3 Ergebnisse - Longitudinalstudie 87 nicht zu einer Änderung des Serostatus oder zusätzlichen Komplexität der Diagnostik geführt haben. Zwischen Athleten und Normalpersonen gab es keinen signifikanten Unterschied im Verlauf der einzelnen Antikörper-Intensitäten, lediglich wurde für die absolute Konzentration von Anti-p18, Anti-p23, Anti-p138 und Anti-p54 ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen gefunden, die sich über die Zeit jedoch nicht signifikant verändert hat. 4 Diskussion Das primäre Ziel der Arbeit war, ein großes Kollektiv von Ausdauerathleten hinsichtlich der Prävalenz verschiedener EBV-spezifischer serologischer Konstellationen zu untersuchen und diese mit einem Kollektiv von Normalpersonen zu vergleichen. Darüber hinaus sollte herausgefunden werden, ob EBV-Infektionen bei Athleten eine besondere Rolle spielen und die Verunsicherung bei Athleten und betreuendem Personal gerechtfertigt ist. Des Weiteren war es Ziel der Arbeit festzustellen, ob die für Athleten formulierten EBV-Reaktivierungen auch serologisch nachweisbar sind oder besondere serologische Antikörperkonstellationen nach sich ziehen. Durch die Analyse der verschiedenen verwendeten Testmethoden sollte ebenfalls untersucht werden, ob sich der Lineassay bei dem Athleten-Kollektiv zur EBV-Diagnostik anwenden lässt oder ob sich gegenüber Normalpersonen diagnostische Schwierigkeiten ergeben. Außerdem konnte anhand beider Kollektive der als Goldstandard der EBV-Diagnostik beschriebene Lineassay (8) erneut auf seine aussagekräftige Anwendbarkeit gegenüber der Immunfluoreszenztechnik-Diagnostik geprüft werden. Im Folgenden werden zunächst die Ergebnisse diskutiert, die sich aus dem Vergleich von Lineassay-Verfahren und Immunfluoreszenztechnik ergeben. Ebenso soll versucht werden, die erstmals an einem großen Kollektiv angewendete Scanmethodik zu evaluieren. Anschließend erfolgt die Diskussion der Ergebnisse der verschiedenen Kollektive und die Klärung der Frage, ob sich Athleten von Normalpersonen in der Prävalenz verschiedener Infektionsstadien unterscheiden. Durch die Durchführung der Longitudinal-Studie können erstmals auch serologische Ergebnisse des Lineassay im zeitlichen Verlauf beurteilt und hilfreiche Rückschlüsse auf tägliche Diagnostik und die Kinetik verschiedener Marker gemacht werden, besonders durch die Scantechnik lassen sich die Antikörper-Konzentrationen genauer quantitativ beschreiben. Anschließend soll ein Algorithmus zum Ablauf einer eindeutigen EBVSerologie als praktische Empfehlung präsentiert werden, der besonders im Sport zur eindeutigen Bestimmung des EBV-Serologiestatus herangezogen werden kann. 4.1 Methoden Vergleich Die Hauptaufgabe verlässlicher EBV-Serologie besteht in der eindeutigen Diagnose und Unterscheidung von akuten und abgelaufenen Infektionen. Für bisherige Teststrategien, die auf der Detektion von VCA-IgM, VCA-IgG, EA-IgG und EBNA-1-IgG beruhen, wurden in der 4 Diskussion 89 Literatur (8) vor allem folgenden Probleme beschrieben: - fehlendes VCA-IgM in 20% der Fälle, - Anti-EBNA-1 Verlust durch Immunsuppression oder „Nicht-Bildner“ (5%) und dadurch Vortäuschen einer Frischinfektion, - antizellulare Reaktivität in manchen Seren erlaubt keine serologische Aussage. Mit der klassischen Immunfluoreszenztechnik und anderen Verfahren, die auf denselben Testantigenen beruhen, kann demnach nicht in allen Fällen eine sichere Unterscheidung von akuten und abgelaufenen Fällen getroffen werden. Demgegenüber gilt der IgG-Lineassay mit einem zweiten späten Marker, dem p18-Antigen, als Testverfahren, das die Probleme der IFT-Diagnostik lösen kann (8). Aufgrund der Inkonsistenz der VCA-IgM-Antwort bei EBV-Infektionen (8;105), wurde in diese Studie, sowohl bei der IFT als auch beim Lineassay, auf einen IgM-Test verzichtet. Der erneute Vergleich der beiden Methoden in dieser Studie zeigt, dass die in der IFT als akute oder persistierende Infektionen fehlbestimmten Fälle (negatives Anti-EBNA-1 durch fehlende Bildung oder sekundären Verlust (8;119)) mit dem Lineassay unter Verwendung des zweiten späten Markers p18-IgG sicher bestimmt werden können. Einerseits wird in der IFT ein zurückliegender Fall bei fehlendem Anti-EBNA-1 irrtümlich als frisch angenommen, doch als Fehldiagnose beim Lineassay durch den Marker p18-IgG verhindert. Diese Fälle können bei alleiniger Anwendung der IFT für große Verunsicherungen bei Athleten, Trainern und betreuenden Ärzten sorgen, da der Anschein von akuten oder persistierenden Infektionen besteht. Bisher wurde jedoch ein Fehlen von Anti-EBNA-1 von bis zu 6% im Lineassay beschrieben (8), auch bei klinisch unauffälligen, gesunden Personen, die als frische oder persistierende EBV-Infektion mit der IFT fehlgedeutet würden. Die Auswertung der vorliegenden Ergebnisse zeigt ein absolutes Fehlen von Anti-EBNA-1 von 9,5% aller mit der IFT getesteten Fälle. Im Lineassay wurden insgesamt nur 4,7% ohne EBNA-1-Antikörper gefunden. Analog dazu gibt es bei dem Lineassay eine größere Gruppe von Fällen, bei denen ein schwaches Anti-EBNA-1 festgestellt wurde. Der Lineassay scheint also gegenüber der IFT auch sensitiver in Hinblick auf den Nachweis von EBNA-1-Antikörpern zu sein, so wie schon Untersuchungen von Maier A. und Bauer G. (2000, unveröffentlicht) gezeigt haben. Gleichzeitig wird durch die präsentierten Daten die besondere Rolle des p18-Antigens als zweitem späten Marker neben Anti-EBNA-1 bestätigt. Insgesamt kann bei den 326 seropositiven Probanden beider Kollektive nur bei 2,7% kein Anti-p18 nachgewiesen werden. Diese 2,7% der Fälle wurden als länger zurückliegende Infektionen bestimmt, bestätigt durch ein positives Anti-EBNA-1, das wie Anti-p23 hoch-avide ist. Bei den restlichen länger zurückliegenden Fällen war Anti-p18 immer positiv und hoch-avide, wenn die Avidität bestimmt wurde. Die Fälle mit negativem Anti-p18 sind in der Immunfluoreszenztechnik nicht besonders aufgefallen und konnten aufgrund dem positiven Anti-EBNA-1 als länger 4 Diskussion 90 zurückliegend bestimmt werden. Kürzlich zurückliegende Infektionen zeigten nur teilweise ein positives Anti-p18, welches dann aber niedrig-avide war. Nicht nachweisbar waren p18Antikörper bei den beiden frischen Infektionen. Diese Ergebnisse entsprechen jenen anderer Mitarbeiter dieser Arbeitsgruppe, die kein fehlendes, aber schwach positives Anti-p18 in 1,7% der länger zurückliegenden Fälle gefunden haben (Hansen C., Bauer G.; Hällfritzsch P., Bauer G., beide unveröffentlicht). Die Aviditätsbestimmung wurde bereits für viele Testsysteme als Methode zur Unterscheidung von frischen und zurückliegenden Infektionen beschrieben (10;48- 50;62;71;72;108;114;115;121). Hier wird erneut gezeigt, dass sich die Avidität auch mit dem EBV-Lineassay gut bestimmen lässt, so wie es für die EBV-Diagnostik bereits gesondert veröffentlicht wurde (3;8;119;123). Gerade bei dem Vorliegen von aberranten serologischen Konstellationen ist die Aviditätsbestimmung als serologische Zusatzoption sinnvoll und vereinfacht besonders die im Sport wichtige Unterscheidung von frischem und abgelaufenem EBV-Serologiestatus. Neben dem Nachweis von p18-Antikörpern auf der einen Seite, kann durch die Aviditätsbestimmung auf der anderen Seite mehr Sicherheit erlangt werden, da bei fehlenden EBNA-1-Antikörpern p18-IgG und p23-IgG hoch-avide sind und damit eine zurückliegende Infektion erkannt werden kann. Wären diese Antikörper niedrig-avide, würde es sich um eine kürzlich zurückliegende Infektion handeln, aber sicher nicht um eine ganz frische. Die gefundenen akuten Infektionen zeigten in beiden Fällen niedrig-avide Antikörper gegen das p54-Antigen. In 37 von 326 seropositiven Fällen (11,3%) konnte mit Hilfe der Aviditätsbestimmung eine länger zurückliegende aberrante (entweder negatives Anti-EBNA-1 oder fehlendes Anti-p18) von einer kürzlichen Infektion differenziert werden. Dem Ziel, eindeutig zwischen akuten und abgelaufenen Infektionen zu unterscheiden, ist man durch die Kombination zweier später Marker und der Möglichkeit von Aviditätsbestimmungen mit dem IgG-Lineassay ein großes Stück näher gekommen. Durch die systematische Einbindung der Aviditätsmessung kann bei aberranten und komplizierten Konstellationen eine erhöhte Sicherheit der serologischen Aussage und sogar eine grobe zeitliche Einordnung des Infektionszeitpunktes erfolgen. Gerade bei dem Übergang von akuten über kürzlich zurückliegenden bis länger zurückliegenden Fällen ist die Eingrenzung sinnvoll. Eine Aussage bei einer länger zurückliegenden Infektion ist dahingehend schwierig, ob die Erstinfektion z.B. im Kindesalter oder jungem Erwachsenenalter erfolgt ist. Sicher ist dieser Zeitpunkt einer länger zurückliegenden Infektion aber mehrere Monate her, doch die genaue Einordnung nicht möglich. 4 Diskussion 91 Interessant ist das variable Auftreten von Antikörpern gegen die „Early antigens“ (EAs) p138 und p54, die gemeinsam oder alleine bei insgesamt 53 der 324 zurückliegenden Infektionen (16,4%) beider Kollektive eindeutig positiv gefunden wurden. Die Positivität war jedoch stark variierend und insgesamt selten, wenn man sie mit dem konstanten Auftreten von Antikörpern gegen EBNA-1 und p18 vergleicht, von denen bei allen zurückliegenden Fällen mindestens einer positiv war. Beide späten Antikörper wurden gleichzeitig positiv in 79,3% aller zurückliegenden Fälle gefunden. Da die Anti-EAs bei gesunden, symptomfreien Patienten nachgewiesen wurden, können diese sicher nicht als Zeichen einer klinischen Reaktivierung gesehen werden, sondern eher als mögliche persistierende frühe EBV-Marker, deren Bedeutung bei länger zurückliegenden Infektionen unklar ist. Besonders aus diesem Grund kann das Auftreten von Antikörpern gegen die EAs zu Fehldiagnosen führen und die Diagnose einer chronisch aktiven EBV-Infektion sollte kritisch gestellt werden. Gegenüber der IFT kann die aufgrund von hoher lokaler Antigenkonzentration höhere Sensitivität des Lineassays als Grund für die in erhöhter Anzahl nachgewiesenen Anti-EAs angeführt werden. Gerade die für den Sport nicht unwichtige Bedeutung dieser Anti-EAs wird im Abschnitt 4.3 im Rahmen der Longitudinalstudie ausführlicher diskutiert. Aus dieser Studie lassen sich weitere Erkenntnisse über die Bedeutung des Markers Anti-BZLF1 (ZEBRA) gewinnen. In verschiedenen Studien (21;60;61;85;113;124) wurde dieser Marker mit dem ELISA-Testsystem als krankheitsspezifischer Marker bei Nasopharynxcarcinom-, bei HIV-positiven-, bei Burkitt-Lymphom-Patienten, bei Patienten mit M. Hodgkin und bei Patienten mit frischer EBV-Infektion angesehen. Bei gesunden Kontrollgruppen konnte nur in vereinzelten Fällen (0-3%) Anti-BZLF-1 nachgewiesen werden. Die Daten dieser Studie zeigen dagegen, dass es sicher eher um einen Seropositivitätsmarker handelt, der bei kürzlich abgelaufenen, aber auch länger zurückliegenden Infektionen bei gesunden Personen nachweisbar ist. So waren Anti-BZLF-1-Antikörper bei 226 von 326 seropositiven, klinisch gesunden Probanden mindestens mit der Bandenintensität „+“ nachweisbar (69,3%), davon wurden 217 Fälle (96,1%) als länger zurückliegend befundet, inklusive der aberranten Konstellationen mit fehlendem spätem Antikörper Anti-EBNA-1 oder Anti-p18. Die neun verbleibenden Fälle mit positivem Anti-BZLF-1 wurden als „kürzlich abgelaufen“ eingeordnet. Dies ist als Hinweis zu sehen, dass der Marker auch schon zu frühen Zeitpunkten der Infektion positiv sein kann. Die Diskrepanz zwischen ELISA- und IgG-Lineassay-Verfahren lässt sich teilweise anhand der höheren Sensitivität des EBV-IgG-Lineassays erklären, die durch die Verwendung von sehr hohen lokalen Antigen-Konzentrationen im Test bedingt sein könnte. Gegenüber der Immunfluoreszenztechnik besitzt der Lineassay weiterhin den Vorteil, dass es keine Fälle gibt, die sich aufgrund antizellularer Bestandteile nicht bestimmen lassen, da 4 Diskussion 92 gelelektrophoretisch gereinigte Antigene verwendet werden. Doch auch im Lineassay wurden wenige Fälle gefunden, die nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Verschiedene Ursachen lassen sich für diese „unklaren“ Fälle des Lineassay diskutieren, die bis auf zwei Ausnahmen (je ein positives VCA-IgG) in der IFT alle seronegativ waren. Prinzipiell ist eine Kontamination des Serums möglich, die zu einer Kreuzreaktion mit den auf den Teststreifen gebundenen Antigenen führt. Ebenso ist ein „Spillover“ bei der Abarbeitung der Proben möglich, so dass es durch fremde Serumanteile zu grenzwertig positiven Banden bei einem eigentlich negativen Serum kommt. Es wurde versucht, diesen methodischen Fehler durch mehrfaches Wiederholen als Ursache auszuschließen, doch das Antikörpermuster hat sich durch die Wiederholung nicht geändert, was gegen die „Spillover“ Hypothese spricht. Ebenso könnten diese Probanden ganz kürzlich infiziert worden sein und die gefundenen Antikörper-Antworten sind noch sehr schwach. Dagegen spricht aber die bei einigen Fällen gefundene hohe Avidität. Letztere könnte auch als Hinweis auf länger zurückliegende Infektionen gedeutet werden, die, wie in diesen Fällen, durch sehr schwache Antikörper Reaktionen auffallen. In der Praxis wäre der Test eines Folgeserums sinnvoll gewesen, um eine Kontamination des Serums auszuschließen oder eine eventuell stattfindende Reifung der Antikörper abzuwarten. Eine eindeutige Diagnose hätte dann eher abgeleitet werden können. Insgesamt ist der Anteil der als unklar bestimmten Proben im Lineassay mit 2,5% geringer als Anteil der antizellularen Konstellationen in der IFT (5,7%). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen eine eindeutige Überlegenheit des EBV-IgG-Lineassays gegenüber der Immunfluoreszenztechnik, und der beschriebene „Goldstandard“ (8) wurde erneut durch über 400 getestete Fälle bestätigt. Die Anwendung dieses Tests auf ein Kollektiv von Athleten verschiedener Ausdauersportarten hat keine besonderen Probleme bei der Durchführung oder Auswertung aufgezeigt. Bis auf die insgesamt 2,5% unklaren Fälle konnte der Serostatus aller Probanden, genau wie bei den Normalpersonen, eindeutig bestimmt werden. Außerdem liefert der IgG-Lineassay im Vergleich zur aufwendigeren IFT-Methode schon bei einem einzigen Test eine eindeutige serologische Diagnose. Damit wird die wesentlich größere Aussagekraft des Lineassays mit einer gleichzeitigen, zeitgemäßen Kostendämpfung auf rund 50% gekoppelt. In der Routinediagnostik der Sportmedizin sollte daher der IgG-Lineassay zur Anwendung kommen, bei komplizierten Fällen zusätzlich durch die Aviditätsbestimmung ergänzt werden. Es empfiehlt sich die Beachtung eines klar definierten Algorithmus zur EBVIgG-Lineassay Diagnostik, der in Absatz 4.4 beschrieben wird. 4.1.1 Quantitative Scanmethodik Durch die klassische Auswertung des Lineassays sind nur kategorisierende und semiquantitative Aussagen über die Konzentration von Antikörpern möglich (von - bis ++++). Für die 4 Diskussion 93 Routinediagnostik ist ein solches Verfahren sicherlich ausreichend. Jedoch bei besonderen Fragestellungen, zur Verlaufsbeobachtung der Antikörper-Konzentrationen und zur Aviditätsbestimmung ist eine quantitative Methode eher vorteilhaft. Zudem erfordert die Auswertung nach klassischer Methode immer das Ablesen der entwickelten Banden in Relation zur Cutoff-Bande durch eine geübte Person. Automatisiert kann nach der Abarbeitung auch die Auswertung durch das Scanverfahren ohne personellen Anteil erfolgen. Die automatisierte Auswertung bietet gleichzeitig neue Ansätze zur EDV-Anbindung. Die Scantechnik wurde als Methode beschrieben, die eine präzise Quantifizierung und Definition der Antikörper-Konzentrationen des EBV-Blotassays zulässt (8). Im Gegensatz zum beschriebenen EBV-Blot werden bei dem EBV-IgG-Lineassay die Antigene auf die Teststreifen aufgesprüht und haben damit eine sehr klare Trennschärfe, so dass sich ein Scan geradezu anbietet. Beide verwendeten Scan-Verfahren („Apollo“ und „München“, siehe Absatz 2.2.3) zeigen eine gute Anwendbarkeit, jedoch eine unterschiedliche Skalierung der Einheiten. Nur der Apollo-Automat hat eine vollkommen selbstständige Auswertung erlaubt, doch muss die Anbindung an herkömmliche Computerprogramme noch optimiert werden, besonders den Datenexport betreffend. Die Methode „München“ mit einem manuellen Scan auf einem herkömmlichen Scanner und anschließender Auswertung durch spezielle Software erfordert einen größeren Arbeitsaufwand, bietet dann aber ebenfalls quantitative AntikörperKonzentrationen. Die elektronische Datenerfassung könnte dahingehend verbessert werden, dass eine direkte Befundung anhand der vorhandenen Antikörper-Banden erfolgt. Auch eine grafische Aufarbeitung eines Ergebnisbogens mit spezieller Gruppierung der Antikörper nach Reihenfolge der Serokonversion und optionaler farblicher Hinterlegung der Marker in grün, rot und blau, je nach Infektionszeitpunkt, wäre denkbar. Durch Messung der optischen Dichte der Banden können auch Konzentrationsunterschiede zwischen verschiedenen Fällen bestimmt werden, vor allem ist so eine intraindividuelle Verlaufsbeobachtung der Antikörper-Konzentrationen möglich, die in der Longitudinal-Studie Anwendung gefunden hat (siehe Absatz 4.3). Auch statistisch ergeben sich neue Wege der Analyse, da so eine stetige, der Konzentration der Antikörper proportionale Variable vorliegt. Dieser Möglichkeit hat besonders dazu beigetragen, objektiv zwischen beiden Kollektiven anhand gemessener Durchschnittsamplituden der verschiedenen Antikörper zu unterscheiden. Gerade auch für die Aviditätsbestimmung erscheint die Scanmethodik sehr hilfreich. Es können genaue Indices zur Unterscheidung von niedrig- und hoch-aviden Antikörpern festgelegt 4 Diskussion 94 werden, die helfen, frische bzw. kürzliche von länger zurückliegenden Infektionen zu differenzieren. In dieser Studie wurde erstmalig eine große Fallzahl (N=402 plus 177 Aviditätsbestimmungen) mit der quantitativen Methode ausgewertet. Das Integral der Kurve, die die optische Dichte der Antikörper-Bande beschreibt, ist der Amplitude der Kurve proportional, und muss nicht als Variable zur Auswertung hinzugenommen werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Scanmethodik auch für den EBV-IgG-Lineassay ein geeignetes Verfahren ist, präzise Aussagen über die tatsächliche Konzentration der Antikörper zu machen. Gerade vor dem Hintergrund von Verlaufsbeobachtungen immunsuppressiver Erkrankungen, wie z.B. bei HIV-positiven- und Nasopharynxcarcinom-Patienten, könnte die präzise Quantifizierung der Antikörper-Konzentrationen Auskunft über das Ausmaß der Immunsuppression geben. Jedoch ist es in solchen Fällen schwierig, den Zeitpunkt der beginnenden Immunsuppression zu definieren. Ebenso könnten in Zukunft neue Erkenntnisse über den genauen quantitativen Verlauf der Antikörper chronologisch von frischen zu länger zurückliegenden Infektionen gewonnen werden, wenn Neuinfektionen engmaschig durch serologische Kontrollen über einen Zeitraum von etwa einem Jahr protokolliert werden. Durch direktes Scannen von entwickelten Teststreifen wird die Auswertung des EBV-IgGLineassays wesentlich vereinfacht und quantitativ objektiviert. Diese Methode ist damit gerade zur Verlaufsbeobachtung von Antikörper-Konzentrationen und Aviditätsbestimmung empfehlenswert. 4.2 Vergleich Athleten und Normalpersonen Die Analyse der hier verwendeten Testmethoden in Absatz 4.1 zeigt, dass mit dem EBV-IgGLineassay eindeutige Aussagen über den Serostatus von Athleten, wie für das Kontrollkollektiv der Normalpersonen, getroffen werden können, auch wenn aberrante Konstellationen vorliegen, wie z.B. fehlendes Anti-EBNA-1. Besondere Anforderungen an die Durchführung der Lineassay-Diagnostik bei einem Athletenkollektiv bestehen dabei nicht. Die wichtige Unterscheidung von frischen bzw. kürzlichen und länger zurückliegenden Infektionen kann in fraglichen Fällen durch die Aviditätsbestimmung verbessernd ergänzt werden. Durch diese eindeutige serologische Methode können Athleten und Normalpersonen hinsichtlich der EBVPrävalenz und ihrem Serologiestatus gut verglichen werden, um eventuelle Unterschiede zwischen beiden Kollektiven festzustellen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich beide Gruppen bei detaillierter Aufstellung der Befunde nicht signifikant unterscheiden. Somit ist nicht von einer besonderen Häufung von EBV-Infektionen 4 Diskussion 95 oder erhöhter Prävalenz aberranter Infektionstypen bei Athleten auszugehen, da auch je Kollektiv nur zwei serologisch frische Infektionen gefunden wurden. Besonders der bei herkömmlicher IFT-Diagnostik zu Fehldiagnosen führende Typ von Anti-EBNA-1-Negativität wurde bei beiden Kollektiven in etwa gleicher Häufigkeit gefunden (4,5% Athleten vs. 3,5% Normalpersonen), genauso wie die wenigen, zunächst uneindeutigen Fälle des Serostatus „unklar“ (3,0% Athleten vs. 2,0% Normalpersonen). Dies ist als weiterer Hinweis dafür zu werten, dass die Diagnostik des Athletenkollektivs nicht erschwert ist. Analog dazu wurde in einer Studie von Fricker et al. herausgefunden, dass die Inzidenz von URTI bei Athleten (Schwimmern) nicht höher ist als in der allgemeinen australischen Bevölkerung (31). Das Auftreten von URTI wird im Sport teilweise in Zusammenhang mit EBV-Infektionen gesehen (43). Der bei Athleten höhere Anteil an „kürzlich zurückliegenden“ Infektionen (5,4% vs. 0,5%) ist am ehesten durch das leicht geringere Durchschnittsalter (19 Jahre Athleten vs. 23 Jahren Normalpersonen) zu erklären, da gerade im Wechsel zur Adoleszenz häufig eine Serokonversion erfolgt (15). Bei einem späteren Serumabnahmezeitpunkt von etwa einem halben Jahr, wären die kürzlichen als länger zurückliegende Fälle der Athleten diagnostiziert worden, da die charakteristische Aviditätsreifung und Entwicklung von weiteren Antikörpern, wie Anti-EBNA-1, stattgefunden hätte. Bis zu einem Alter von 30 Jahren sind etwa 80-90% (53) der westlichen Bevölkerung mit EBV infiziert. Die hier beschriebene Prävalenzen von 79,7% der Athleten gegenüber 82,5% der Normalpersonen entsprechen diesen publizierten Werten, als auch einer für Athleten beschriebenen Prävalenz von 79% (41). Auch die durch die Scanmethodik gewonnenen Ergebnisse lassen keinen wesentlichen Unterschied zwischen Athleten und Normalpersonen erkennen und belegen eine homogene Verteilung der EBV-Antikörperkonzentrationen. Die Verteilung der p138-Amplituden ist einzeln betrachtet zwar signifikant verschieden (p=0,007), doch die bei den Normalpersonen intensiver gemessenen Amplituden des frühen Antikörpers sind der geringeren Anzahl von „kürzlichen Infektionen“ eher widersprüchlich. Es zeigt einmal mehr, dass frühe Antikörper auch bei abgelaufenen, länger zurückliegenden Infektionen nachgewiesen werden können, deren Anteil bei den Normalpersonen ja leicht erhöht gefunden wurde. Besonders erwähnt werden muss die sehr ähnliche Verteilung der Anti-EBNA-1-Amplituden (p=0,378), da EBNA-1Antikörper bei kürzlich zurückliegenden Infektionen, die bei den Athleten häufiger festgestellt wurden, gewöhnlich fehlen. Die unterschiedliche Anzahl der kürzlichen und länger zurückliegenden Infektionen lässt sich mit der Betrachtung der einzelnen Antikörper nicht belegen. 4 Diskussion 96 Mit der Immunfluoreszenztechnik wurde, außer der größeren Anzahl der antizellulären Seren im Athletenkollektiv, ebenfalls kein signifikanter Unterschied zwischen den Kollektiven festgestellt. Die Nachteile der IFT-Diagnostik gegenüber dem Lineassay sind ausführlich in Absatz 4.1 beschrieben, die jedoch für beide Kollektive gleichermaßen gültig sind. 4.3 Longitudinalstudie Diese Studie zeigt erstmals den ca. einjährigen Verlauf von EBV-Antikörperkonzentrationen von Hochleistungssportathleten, die an den olympischen Winterspielen in Salt Lake City 2002 teilgenommen haben. Durch die Verwendung von EBV-Lineassay und Scanmethodik konnten die Antikörperkonzentrationen genauer als bisher quantifiziert werden, so dass auch der Vergleich mit einem Kontrollkollektiv eine neue Detailschärfe bietet. Als wichtigstes Ergebnis bleibt festzuhalten, dass es über einen längeren Beobachtungszeitraum von ca. einem Jahr zu keinen wesentlichen Änderungen oder Schwankungen der Antikörperkonzentrationen sowohl bei den Athleten als auch bei den Normalpersonen gekommen ist. Bei manchen Athleten war ein leichter Anstieg aller jeweils vorhandenen Antikörperkonzentrationen über die Zeit feststellbar, der sich jedoch bei Betrachtung des Gesamtverlaufes nicht signifikant von den Normalpersonen unterschieden hat. Dieser leichte Anstieg hat in keinem der Fälle den Serostatus eines Probanden so verändert, dass die Interpretation der serologischen Befunde in irgendeiner Weise erschwert worden wäre. Auch bei diesen Testpersonen hat der Lineassay in jedem Fall eine eindeutige serologische Aussage erlaubt, die sich zudem im Beobachtungszeitraum nicht geändert hat. Statistisch lässt sich insofern ein Unterschied zwischen beiden Gruppen belegen, wenn man nur Zeitpunkt T1 zu Beginn und T6 bei Beobachtungsende ohne den dazwischenliegenden Verlauf betrachtet. Nur dann haben die Athleten im Vergleich zu den Normalpersonen zum Zeitpunkt T6 ein signifikant höheres Anti-EBNA-1, Anti-p18, Anti-p138 und Anti-BZLF-1 als zu Zeitpunkt T1. Zwar hat sich der Unterschied als signifikant herausgestellt, doch ist es ein Trend, der den Verlauf zwischen T1 und T6 unberücksichtigt lässt. Für diese kinetische Besonderheit könnten mehrere Gründe existieren. Zum einen kann der Anstieg rein zufällig durch die Auswahl der Probanden bedingt sein, da jeweils nur sehr kleine Fallzahlen (15 Athleten vs. 11 Normalpersonen) getestet wurden und bei den Normalpersonen vielleicht gerade solche ausgewählt wurden, die keinen Anstieg zeigen. Zum anderen könnten leichte immunmodulative Prozesse die Bildung von weiteren Antikörpern auslösen. Als weiterer Grund könnte ein allgemeiner Reifungsprozess der Antikörperantwort angeführt werden, der bei den Normalpersonen schon stattgefunden haben könnte. In der Praxis hat dieser Anstieg jedoch 4 Diskussion 97 keine Relevanz, da für diese Fälle aufgrund der eindeutigen Antikörperkonstellation je nur eine Diagnose möglich war, die sich durch den leichten Anstieg nicht geändert hat. Außerdem bietet diese Studie erstmals die Verlaufsbeobachtung der Antikörper-Avidität einer Athletenpopulation, die zudem quantitativ bestimmt wurde. Passend zu der stetigen Konzentration der Antikörper war bei beiden Kollektiven auch die Avidität der Antikörper im Verlauf konstant. Auffällig war, dass in mehreren Fällen bei einer intermediären Avidität eines p23-Antikörpers (Fall Nr. 2,78, 510, 512, 514, 515) keine weitere Reifung beobachtet wurde. Diese Einzelfälle zeigen, dass nicht immer eine hohe Avidität im Verlauf erreicht wird, wie für IgG nach EBV-Primärinfektion beschrieben wurde (3). Eine typische Reifung mit konsekutiver Intensitätssteigerung hätte am ehesten im Verlauf einer, in der Longitudinalstudie nicht vorhandenen, „kürzlich abgelaufenen“ Infektion für die späten Antikörper und Anti-p23 beobachtet werden können. Ebenso wäre eine Aviditätsreifung bei den Antikörpern einer Primärinfektion quantitativ darstellbar gewesen. Hier bieten sich zukünftige Studien an, die genau diesen Verlauf der Antikörper und deren Avidität bei frischen und kürzlichen Infektionen quantitativ beschreiben, besonders auch für Athleten. Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Verlaufsbeobachtung ist in manchen Fällen das Persistieren der Antikörper gegen die frühen Antigene (EAs) p138 und p54. Bisher wurde das Auftreten von Anti-EAs manchmal als Zeichen einer Reaktivierung oder persistierenden Infektion verstanden (67). Besondere Gefahr der Fehldiagnose einer frischen Infektion besteht bei positiven Anti-EAs dann, wenn einer der späten Antikörper negativ ist, obwohl die Infektion länger zurückliegt, so wie EBNA-1-Antikörper bei ca. 5-10% Fälle negativ sein können (8) (Querschnittstudie: 4,5%). Der Lineassay bietet aufgrund der Einbindung des zweiten späten Antigens p18 eine erhöhte Sicherheit in der serologischen Aussage. Dieser konstante Nachweis von EA-Antikörpern (p138- und p54-Antigen) bei gesunden Personen steht in Widerspruch zu den Ergebnissen von Klassen et al. (67), die bei Spielern der Basketball Bundesliga eine Reaktivierung einer EBV-Infektion durch das Auftreten von EAIgG und fakultativ durch VCA-IgM definiert haben. In der Fallstudie wurde beobachtet, dass bei Sistieren der klinischen Beschwerden auch EA-IgG und VCA-IgM wieder negativ gefunden wurden und sich die laborchemische Verlaufskontrolle normalisiert hat. Der Nachweis von frühen Antikörpern (EA-IgG) sollte nach unseren Ergebnissen nicht zwingend als Maß für eine klinische EBV-Reaktivierung angesehen werden, da in der Querschnittstudie auch bei gesunden Personen in 13,2% aller Fälle EAs gefunden wurden. Entweder waren p138- und p54Antikörper gleichzeitig positiv, oder je einzeln, dann haben Antikörper gegen p54 überwogen. Außerdem wurden die Anti-EA-Konzentrationen bei gesunden Personen festgestellt, bei denen 4 Diskussion 98 zum Zeitpunkt der Blutabnahme keine URTI (Upper Respiratory Tract Infections) bekannt waren. Aufgrund der unspezifischen und variablen Symptome einer EBV-Infektion (14;16), sollte selbst bei positiven Anti-EAs differentialdiagnostisch an andere Infektionen gedacht werden, wie Streptokokken- oder Rhino- und Adenoviren-Infektionen. Auch die Empfehlung, dass asymptomatische Athleten oder solche Spieler mit milden Symptomen und einer serologischen EBV-Reaktivierung eine Trainingspause einlegen sollten (67), muss differenziert gesehen werden. Gerade bei asymptomatischen Patienten ist die Anti-EA-Antwort keineswegs eindeutig und eine Trainingspause sollte nicht vorschnell verordnet werden, um die Wettkampfform weiter zu erhalten. Bei milden Symptomen, die sich auch durch andere Infektionen erklären ließen, sollte zum Schutz des Athleten immer eine gründliche Differentialdiagnostik mit klinischer Untersuchung, Laborwertbestimmung und Sonographie der Milz betrieben werden. Bei „herkömmlichen“ viralen Infektionen kann meistens schon viel eher mit dem Training begonnen werden als bei manifesten EBV-Infektionen, bei denen ein Wiederbeginn frühestens nach 21 Tagen empfohlen wird (46;83). Rein serologisch sind diese „non-primary“ EBV-Infektionen vermutlich eher schwer nachzuweisen. Die Rolle von VCA-IgM als Marker für eine frische oder reaktivierte Infektion muss kritisch betrachtet werden, da gezeigt wurde, dass es sich um eine sehr variable Antikörper-Antwort handelt. Weder der positive Nachweis noch das Fehlen von VCA-IgM erlaubt eine eindeutige Diagnose. VCA-IgM ist bei 20 % der akuten Infektionen nicht und in etwa 80 % der Fälle gleichzeitig mit VCA-IgG nachweisbar (105). Selten eilt es VCA-IgG voraus oder tritt verspätet auf (8;105). Andererseits kann dieser Marker in einigen Fällen lange persistieren oder infolge von Wiederaufnahme des Virus in den lytischen Zyklus auftreten. Aus diesen Gründen wurde auf den Nachweis von IgM-Antikörpern in dieser Studie verzichtet. Einen anderen Ansatz zum Nachweis von EBV-Reaktivierungen bei Athleten haben Gleeson et al. gewählt, indem sie EBV-DNA und IgA-Level im Speichel der Probanden (Leistungsschwimmer) bestimmt und herkömmliche Serologie mittels ELISA durchgeführt haben (43). Ergebnisse waren vor allem der Nachweis von latenter Ausschüttung von EBVDNA bei intensiv trainierenden Athleten, und der signifikante Zusammenhang von EBV-DNApositivem Speichel mit oberen Atemwegssymptomen (URS: upper respiartory symptoms) bei seropositiven Athleten. Dennoch wurden URS ebenfalls bei EBV-DNA-negativen, aber seropositiven Probanden nachgewiesen. Es wurde postuliert, dass die bei Athleten auftretende transiente Immunsuppression, erkennbar an geringer IgA-Konzentration im Speichel, über nachfolgende EBV-DNA-Ausschüttung zu dem Auftreten von URS führen kann. EBV-DNA wurde vor dem Ausbruch von URS im Speichel detektiert. Diese sog. EBV-Reaktivierung könne eine potentielle Rolle als Mechanismus im Zusammenhang vom Auftreten von URS und 4 Diskussion 99 intensiver körperlicher Belastung spielen, doch seien auch aufgrund der geringen Probandenanzahl nur spekulative Aussagen zu machen. Als Erklärung für diese Ergebnisse werden die bei Athleten durch körperliche Aktivität induzierten Veränderungen des Immunsystems diskutiert. Eine transiente Suppression von zytotoxischen T-Lymphozyten (33), die die Expansion einer latent EBV-infizierten B-Zell-Population verursachen könnte, wurde vor allem von Gleeson als Ursache diskutiert (43). Eine enge zytotoxische T-Zell-Kontrolle sei notwendig, um die Suppression von EBV infizierten B-Zellen aufrecht zu erhalten (20). Darüber hinaus wurden bei Athleten als transiente Veränderungen des Immunsystems neben einer Lymphopenie (93;94) eine Reduktion der zytotoxischen Aktivität der natürlichen Killerzellen (9;92) und der T-Zell Funktion (32), eine Reduktion der Phagozytenaktivität von Granulozyten (33;99;110) und eine Reduktion der IgA-Konzentration in mukösem Gewebe der oberen Atemwege gefunden (39;40;42;78-80). Auf die Ergebnisse des Lineassay und der Immunfluoreszenztechnik der hier vorliegenden Studie scheinen diese Immunveränderungen keinen wesentlichen Einfluss gehabt zu haben. Zum einen war die EBV-Serologie im Vergleich zu den Normalpersonen nicht erschwert. Zum anderen haben sich beide Kollektive weder im Querschnitt noch im Längsschnitt signifikant voneinander unterschieden. Des Weiteren wurde weder bei Athleten noch bei Normalpersonen eine Übereinstimmung mit den serologischen Bildern von schwer immunsupprimierten Patienten gefunden, z.B. stark positive Anti-BZLF-1-Banden oder Verluste von Anti-EBNA-1Banden (Benning D, Bauer G, Promotion 2002, unveröffentlicht). Man kann davon ausgehen, dass die nach intensiver körperlicher Belastung auftretende transiente Immunsuppression in dem Beobachtungszeitraum der Longitudinalstudie aufgetreten ist. In diesem Wettkampfjahr konnten keine großen Fluktuationen weder der frühen noch der späten Antikörper festgestellt werden, obwohl körperlich sehr verschiedene Phasen mit Höchstleistungen in der Vorbereitungs- und Olympiaphase, aber auch weniger intensiven Abschnitten zu Beginn und Ende der Beobachtung, je nach einer Wettkampfsaison, absolviert wurden. EA-Antikörper wurden wie oben beschrieben sogar während des gesamten Beobachtungszeitraumes konstant festgestellt. Zudem hat auch die durch die OlympiaNominierung und schließlich die Olympia-Wettkämpfe selbst hervorgerufene psychische Belastung nicht zu Änderungen der Lineassay-Diagnose oder zu großen Schwankungen der Antikörperkonzentrationen geführt. Der Einfluss von psychischem Stress auf den Anstieg von EBV-DNA Konzentrationen im Speichel wurde in mehreren Studien festgestellt (38;95). Vielleicht lassen sich die leichten Anstiege der Antikörperkonzentrationen einiger Athleten dieser Studie, nicht der Normalpersonen, als Zeichen für eine Immunsuppression mit 4 Diskussion 100 nachfolgender humoraler Antwort deuten. Diese Ergebnisse erlauben den Schluss, dass vor dem Hintergrund von möglicher transienter Immunsuppression bei Athleten der EBV-IgG-Lineassay eine eindeutige und sichere Diagnose erlaubt. Selbst wenn bei den hier getesteten Athleten eine erhöhte Viruslast im Speichel vorhanden war, hatte dies keine Konsequenz für die LineassayDiagnostik. EBV-DNA Level, d.h. die Viruslast des Speichels, sind in dieser Studie nicht bestimmt worden. In Kombination mit einer größeren Fallzahl von Leistungssportlern als bei Gleeson et al. (43) und der gleichzeitigen Durchführung von einem EBV-IgG-Lineassay mit Aviditätsbestimmung als auch einer serologischen EBV-IgA-Antikörper-Bestimmung und Labortwertbestimmung, wäre eine solche Studie in der Zukunft interessant, um die genauen Zusammenhänge von transienter Immunsuppression, Auftreten von oberen Atemwegssymptomen (URS) und EBVDNA im Speichel zu beleuchten. Schließlich kann auch der EBV-DNA Nachweis uneindeutig sein, denn auch gesunde Personen ohne URS können EBV-DNA positiven Speichel besitzen (von Gleeson et al. nicht beobachtet) (35). Wenn diese Personen erkranken, kann auch eine klassische Rhinovirusinfektion oder ähnliche ursächlich sein, trotzdem ist EBV-DNA im Speichel weiter positiv, ohne direkt für Symptomatik verantwortlich zu sein. Ohne eine größere Anzahl von Dauerausscheidern könnte es gar nicht zu so einer hohen Prävalenz in der Bevölkerung kommen. Es wurde beschrieben, dass EBV-Level bei 60-80% asymptomatischer, EBV-seropositiver Personen intermittierend für mehrere Monate im Speichel festgestellt werden können (15), deren Beziehung von Frequenz, Quantität und Infektiosität der Ausscheidung nicht ganz klar erscheint. 4.4 Ausblick Die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse lassen ein festgelegtes virologisches Arbeitsschema zur eindeutigen Bestimmung des Epstein-Barr Virus Serologiestatus sinnvoll erscheinen. Abbildung 63 verdeutlicht die empfohlene Vorgehensweise bei der Feststellung des EBV-Serologiestatus eines Athleten. Dieses Schema besitzt aufgrund der beschriebenen Ergebnisse auch für Normalpersonen Gültigkeit. Dargestellt ist die gründlichste Vorgehensweise, auf die Aviditätsbestimmung könnte in Einzelfällen verzichtet werden, ist jedoch nicht zu empfehlen. Möglich wäre der Verzicht bei dem alleinigen Auftreten von Antikörpern gegen die frühen Antigene p138 und p54, was für eine akute Infektion spricht. Die Wiederholung und Aviditätsbestimmung bietet aber die größere Sicherheit und bei zusätzlich positivem Anti-p23 kann der Infektionszeitpunkt grob eingegrenzt werden (kürzlich zurückliegende vs. akute Infektion). 4 Diskussion 101 Abbildung 63: Algorithmus der Durchführung und Auswertung des EBV-IgG-Lineassay für Serodiagnose bei Athleten In der Sportmedizin sollte die EBV-Serologie mit dem IgG-Lineassay erfolgen, da dieser eindeutig zwischen Seronegativität, akuter und länger zurückliegender Infektion unterscheiden kann und zugleich ein kostengünstiges Verfahren ist. Im Gegensatz zur bisherigen Serologie mittels IFT und ELISA, können so auch die zur Verunsicherung führenden, falsch-positiv bestimmten Frischinfektionen und andere Fehldiagnosen vermieden werden. In Zukunft könnte durch eine bundesweite Serviceleistung im Rahmen eines EBVReferenzzentrums die Versorgung von Spitzenathleten dahingehend verbessert werden, dass bei fraglichen Infektionen innerhalb von 2-3 Tagen eine eindeutige serologische Aussage getroffen werden kann. So könnte sowohl die Leistungsfähigkeit, als auch die Gesundheitsfürsorge betreffend, ein bedeutender Fortschritt in der Versorgung von Spitzensportlern innerhalb Deutschlands erzielt werden. 5 Zusammenfassung In einer Querschnittsstudie (202 Athleten im Vergleich zu 200 Normalpersonen) wurde der EBV-Serostatus und die Variabilität des EBV-Antikörperprofils mithilfe eines quantifizierbaren Lineassays mit rekombinanten Antigenen und der IFT bestimmt. Die Scanmethodik des Lineassay erlaubte dabei erstmals die quantitative Messung von Antikörperkonzentrationen, so dass besonders die beiden Gruppen statistisch genau verglichen werden konnten. Zwischen den beiden Kollektiven konnte kein wesentlicher signifikanter Unterschied festgestellt werden (p=0,144). Lediglich “kürzlich zurückliegende Fälle“ waren bei den Athleten häufiger als bei den Normalpersonen (5,4% vs. 0,5%). In beiden Kollektiven wurde je nur eine frische Infektion festgestellt. Besonders die häufig zu Fehldiagnosen (akute oder persistierende akute Infektion) führende Antikörper-Konstellation mit negativem Anti-EBNA-1 Befund, trotz abgelaufener Infektion, war bei beiden Kollektiven in gleicher Häufigkeit vorhanden (Athleten 4,5%, Normalpersonen 3,5%). Mit der Immunfluoreszenztechnik wurden sogar in 9,4% der Athleten und 9,5% der Normalpersonen frische Infektionen aufgrund eines negativen Anti-EBNA-1 Befundes vorgetäuscht. Durch den zweiten späten Marker des Lineassay Anti-p18 konnten diese Fälle als länger zurückliegend erkannt werden. Eine Aviditätsbestimmung war in 17,9 % aller zurückliegenden Fälle zur Sicherung der Diagnose und Differenzierung von „kürzlich“ und „länger“ zurückliegenden Infektionen notwendig. Bei seropositiven Personen mit negativem Anti-EBNA-1 sollte daher zukünftig eine LineassaySerologie durchgeführt und durch die Aviditätsbestimmung ergänzt werden, um zwischen wirklich frischen Infektionen und abgelaufenen Infektionen mit aberranter serologischer Konstellation zu unterscheiden. Dieses Vorgehen führt besonders im Sport zu einer eindeutigen Diagnostik und verhindert die Verunsicherung bei Athleten und Trainern. Die Messungen der Antikörperkonzentrationen führten auch zu einer Revision der Beurteilung von Antikörpern gegen EA: diese können auch ohne klinische Symptomatik auftreten und scheinen in keinem Zusammenhang mit einer Virusreaktivierung zu stehen. In einer Longitudinalstudie wurde die in der Querschnittstudie ermittelte hohe Variabilität der serologischen Antwort verschiedener Personen bestätigt und gleichzeitig die Konstanz des serologischen Profils der gleichen Person über einen langen Zeitraum aufgezeigt. Es ergab sich kein Hinweis auf serologische Besonderheiten aufgrund der in der Literatur diskutierten Immunsuppression bei Athleten. 6 Literaturverzeichnis (1) Alfieri C, Tanner J, Carpentier L, Perpete C, Savoie A, Paradis K et al. (1996) Epstein-Barr virus transmission from a blood donor to an organ transplant recipient with recovery of the same virus strain from the recipient's blood and oropharynx. Blood 87(2):812-817. (2) Ali J. (1993) Spontaneous rupture of the spleen in patients with infectious mononucleosis. Can J Surg 36(1):49-52. (3) Andersson A, Vetter V, Kreutzer L, Bauer G. (1994) Avidities of IgG directed against viral capsid antigen or early antigen: useful markers for significant Epstein-Barr virus serology. 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Nature 228(276):1056-1058. 7 Danksagung Mein besonderer Dank gebührt Prof. Dr. Georg Bauer, der mich in vielen Stunden dieses Projektes begleitet hat. Seine umfangreichen Tipps, Denkanstöße und freundschaftliche Art haben mir viel Spaß an der Arbeit gegeben. Über dieses intensive Betreuungsverhältnis habe ich mich sehr gefreut. Ebenso Dank an Dr. Yorck Olaf Schumacher, der mir besonders von sportmedizinischer Seite immer bereitwillig mit Rat zur Seite stand. Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Bernd Wolfarth, der mir zusammen mit Dr. Yorck Olaf Schumacher und Prof. Dr. Georg Bauer das Thema dieser Arbeit überlassen und sich sehr um die Durchführbarkeit der Studie bemüht hat. Dank auch an Prof. Dr. H.-H. Dickhuth, der im Doktorandenseminar der Sportmedizin durch kritische Anmerkungen und Tipps zu verschiedenen Themen neue Sichtweisen bei mir gefördert hat. Für die hilfreichen Erklärungen auf dem Gebiet der statistischen Auswertung möchte ich besonders Frau Gerta Rücker danken. Dieses Projekt wurde vom Bundesinstitut für Sportwissenschaften (BiSp) mit dem Aktenzeichen VF 0407/01/64/2003 gefördert. 8 Lebenslauf Name: Pottgießer Vorname: Torben Geburtsdatum: 12. Februar 1979 Geburtsort: Hattingen (Ruhr) Eltern Heinz Theo Pottgießer Cornelia Thekla Pottgießer, geb. Rakowski Geschwister Lars Pottgießer Familienstand ledig Beruf Seit 07/2006 Assistenzarzt der Medizinischen Universitätsklinik Freiburg, Abteilung für Rehabilitative und Präventive Sportmedizin Studium 05/2006 Abschluss des Studiums und Approbation 05/2006 3. Staatsexamen 04/2005 – 03/2006 Praktisches Jahr mit Stationen „Innere Medizin“ in Tampa, USA (Tampa General Hospital, University of South Florida), „Chirurgie“ Zürich, Schweiz (Stadtspital Triemli, Lehrspital Universität Zürich), Wahlfach „Radiologie“ Freiburg (Universitätsklinikum Freiburg) 04/2005 Stipendiat der Medizinischen Fakultät, Universität Freiburg für ein „Innere Medizin“ Auslandstertial in Tampa, Florida, U.S.A 04/2005 Stipendiat der FreiburgerÄrzteConsulting: PJ-Reisestipendium für das Auslandstertial in Tampa, Florida, U.S.A 03/2005 2. Staatsexamen 11/2004 Kolloquium Dissertation „Rationale Diagnostik im Leistungssport“ 08/2004 Famulatur Charité Campus Benjamin Franklin, Berlin: operative Intensivstation, Fachbereich Anästhesie und rationelle EBV- 04/2004 Famulatur Medizinische Universitätsklinik Freiburg: internistische Notaufnahme 09/2003 Famulatur und Gaststudent am Department Haematology/Oncology des London Health Science Centre der University of Western Ontario, London, Kanada, 4 Wochen 04/2003 Famulatur Lorettokrankenhaus Freiburg: Abteilung Orthopädie 01/2003 Anstellung als wissenschaftliche Hilfskraft: Abteilung Sportmedizin, Medizinische Universitätsklinik Freiburg 08/2002 Beginn der experimentellen Dissertation „Rationale und rationelle EBV-Diagnostik im Leistungssport“ 08/2002 1. Staatsexamen 03/2002 Famulatur Medizinische Universitätsklinik Freiburg: Abteilung Rehabilitative und Präventive Sportmedizin 08/2001 Ärztliche Vorprüfung 03/2000 & 03/2001 Krankenpflegepraktikum Unfallchirurgie am Universitätsklinikum Freiburg 10/1999 Beginn Studium der Humanmedizin an der Albert-LudwigsUniversität, Freiburg im Breisgau Fremdsprachen Englisch: sehr gute Kenntnisse in Wort und Schrift Französisch: Grundkenntnisse Grosses Latinum Zivildienst 09/1998 – 09/1999 OASE, Selbsthilfeund Ruhruniversität Bochum Kommunikationszentrum der Schulbildung 1998 Allgemeine Hochschulreife 04/1997 Teilnahme ROTA Projekt: europäischer Schulaustausch von 6 Ländern mit Aufenthalt in Brügge, Belgien 08/1995 - 06/1996 Gastschüler an der Fort Lupton High School, Colorado, U.S.A. 1989-1998 Gymnasium Waldstrasse, Hattingen 1985-1989 Grundschule Hattingen-Bredenscheid
