Universität Ulm Versuch Respiration

Universität Ulm
Praktikum Stoffwechselphysiologie
WS 2011/2012
Versuch Respiration
Gruppe XY
Betreuer:
Praktikanten:
Versuchstag:
1
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................................................................ 3
1.1 Theoretischer Hintergrund ............................................................................................................ 3
1.1.1 Mitochondrien ........................................................................................................................ 3
1.1.2 Glykolyse................................................................................................................................ 4
1.1.3 Der Citratcyclus ...................................................................................................................... 5
1.1.4 Die Atmungskette ................................................................................................................... 6
1.1.5 Flugmuskulatur von Insekten ................................................................................................. 7
1.1.6 Die Clark-Elektrode................................................................................................................ 8
1.2 Aufgabenstellung des Versuchs .................................................................................................... 9
2. Material und Vorbereitungen .............................................................................................................. 9
2.1 Material ......................................................................................................................................... 9
2.1.1 Chemikalien............................................................................................................................ 9
2.1.2 Probenmaterial........................................................................................................................ 9
2.1.3 Geräte ..................................................................................................................................... 9
2.2 Vorbereitungen ............................................................................................................................ 10
2.2.1 Herstellung der Puffer- und Substratlösungen...................................................................... 10
2.2.2 Vorbereitung der Clark-Elektrode ........................................................................................ 11
3. Durchführung der Versuche .............................................................................................................. 12
3.1 Isolierung der Mitochondrien ...................................................................................................... 12
3.2 O2-Messung mit der Clark-Elektrode .......................................................................................... 13
4. Ergebnisse ......................................................................................................................................... 13
5. Diskussion ......................................................................................................................................... 14
5.1 Isolierung der Mitochondrien ...................................................................................................... 14
5.2 O2-Messung mit der Clark-Elektrode .......................................................................................... 14
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1. Einleitung
1.1 Theoretischer Hintergrund
1.1.1 Mitochondrien
Mitochondrien sind von einer Doppelmembran umgebene Zellorganellen. Umgangssprachlich
werden sie auch als „Energiekraftwerke der Zelle“ bezeichnet, weil ihre Hauptaufgabe die
Synthese von energiereichem ATP (Adenosintriphosphat) ist. ATP ist die „Energiewährung
der Zelle“. Zu finden sind Mitochondrien vor allem in Muskelzellen und Nervenzellen, also in
Geweben, die viel Energie brauchen.
brau
Aufgrund der Doppelmembran, eigener DNA, eigener Ribosomen und auch eigener mRNA
wird davon ausgegangen, dass diese durch Endosymbiose in die Vorläuferzellen gelangten.
Dieser evolutionär bedeutsame Vorgang ist allgemein als Endosymbiontentheorie bekannt.
Der typische Aufbau eines Mitochondriums ist in Abb. 1 gezeigt.
Abb. 1 Aufbau eines Mitochondriums
Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Mitochondrium 19.12.2011
Die Doppelmembran ist gut zu erkennen. Bedeutsam an der inneren Membran sind die
Einstülpungen,
en, auch Cristae genannt, die zu einer deutlichen Oberflächenvergrößerung
führen. Dies ist insofern wichtig, als in der inneren Membran die Proteinkomplexe der
Atmungskette sitzen und dadurch mehr Platz für diese vorhanden sind und somit auch in
größerem Umfang
mfang deren Reaktionen ablaufen können.
können Ebenfalls in der inneren Membran
vorhanden sind ATP-Synthasen,
Synthasen, die aus einem Protonengradienten zwischen dem sauren
Zwischenmembranbereich und der weniger sauren Matrix, dem Raum der von der
Doppelmembran umschlossen wird, ATP synthetisieren können.
3
Die energetische Bedeutsamkeit des Mitochondriums ergibt sich aus den katabolen Prozessen,
die in ihm ablaufen und für den Energiehaushalt der Zelle unverzichtbar sind. Dazu gehören
der Citratcyclus, die Atmungskette und der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex.
Komplex.
1.1.2 Glykolyse
Die Glykolyse findet in einer eukaryotischen Zelle im Cytoplasma statt. Dabei wird Glucose
abgebaut und in mehreren Schritten zu Pyruvat umgesetzt. Dabei entstehen aus einem mol
Glucose netto 2 mol NADH (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid),
(N
Dinukleotid), 2 mol ATP, 2 mol Wasser
und 2 mol Pyruvat. Die genauen Reaktionen sind in Abb. 2 dargestellt.
Abb. 2 Glykolyse
Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Glykolyse 19.12.2011
In einem ersten Schritt wird Glucose durch ATP-Spaltung phosporyliert. Das dabei
entstehende Produkt steht mit Fructose-6-Phosphat
Fructose
(Frau-6-P) im Gleichgewicht. Durch
weitere Phosphorylierung durch ATP entsteht Fuctose-1,6-Bisphosphat
Fuctose
Bisphosphat (Frau-1,6-bP).
(Frau
Dieses
zerfällt in Glycerinaldehyd-3--Phosphat (GAP) und Dihydrocyacetonphosphat
drocyacetonphosphat (DHAP), die
untereinander ebenfalls im Gleichgewicht stehen. In einem nächsten Schritt wird GAP durch
die GAP-Dehydrogenase
Dehydrogenase in 1,3-Biphosphoglycerat
1,3
(1,3-bPG)
bPG) umgesetzt. Dabei entsteht
NADH und es wird anorganisches Phosphat eingebaut. Durch Übertragen beider
Phosphatgruppen auf ATP und Abspalten von Wasser wird über 3-Phospho
3 Phospho-Glycerat (3-PG),
2-Phospho-Glycerat (2-PG)
PG) und Phosphoenolpyruvat (PEP) schließlich Pyruvat (Pyr)
gewonnen.
4
1.1.3 Der Citratcyclus
Das bei der Glykolyse entstehende Pyruvat wird in der Matrix der Mitochondrien durch den
Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex
Komplex mit Coenzym A und NAD+ in NADH+H+, Acetyl-CoA
und CO2 decaboxyliert. Acetyl-CoA
Acetyl CoA kann nun in den Citratcyclus eingeschleust werden.
Dieser ist in Abb. 3 dargestellt.
tellt.
Abb. 3 Citratcyclus
Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Citratzyklus 19.12.2011
Acetyl-CoA
CoA wird hierbei mit Oxalacetat zu Citrat umgesetzt. Dabei wird Coenzym A
abgespalten. Citrat wird dann zu Isocitrat isomerisiert. Durch 2fache Decarboxylierung und
Oxidation entsteht durch Aktivierung mit CoA Succinyl-CoA,
Succinyl CoA, welches wiederum unter GTPGTP
Synthese und Abspalten von CoA zu Succinat reagiert. Dieses wird durch die SuccinatSuccinat
Dehydrogenase, die auch als Komplex II der Atmungskette
Atmungskette bezeichnet wird, zu Fumarat
oxidiert. Die abgegeben Elektronen werden direkt auf die Atmungskette übertragen, deshalb
auch die Bezeichnung Komplex II. Aus Fumarat wird durch Hydratisierung Malat und daraus
in einer weiteren Redoxreaktion Oxalacetat. Damit
Damit ist der Cyclus geschlossen und kann
wieder von vorne beginnen.
Netto entstehen im Citratcyclus aus einem 1 mol Acetyl-CoA 2 mol CO2, 3 mol NADH, 1
mol FADH2 und 1 mol GTP. Aus GTP kann durch Substrakettenphosphorylierung ATP
gewonnen werden. Auf 1 mol Glucose bezogen entstehen jeweils die doppelten Mengen an
Produkten
5
1.1.4 Die Atmungskette
Die aus der Glykolyse und dem Citratcyclus entstandenen Reduktionsäquivalente geben ihre
Elektronen schließlich in eine Elektronentransportkette an der inneren Membran des
Mitochondriums ab. Diese Transportkette, welche auch als Atmungskette bezeichnet wird,
wir
besteht aus mehreren Proteinkomplexen. Dies bestehen gewöhnlich aus FeFe-S-Zentren,
Flavoproteinen und Chinon-Cyclen.
Cyclen. Eine genaue Anordnung der Komplexe ist in Abb. 4
gezeigt.
Abb. 4 Komplexe der Atmungskette
Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Atmungskette
http://de.wikipedia.org/wiki/Atmungskette 19.12.2011
Komplex I wird auch als NADH-Dehydrogenase
NADH Dehydrogenase bezeichnet. Dieser Komplex besteht aus
einem Flavoprotein und einem Fe-S-Protein.
Fe Protein. Dieser Komplex oxidiert NADH zu NAD+ und
gibt 4 Protonen in den Intermembranraum.
Komplex II ist die Succinat-Dehydrogenase
Succinat
hydrogenase des Citratcyclus. Er besteht ebenfalls aus
Flavinnukleotid und Fe-S-Zentren,
Zentren, oxidiert aber FADH2 FAD. Es werden keine Elektronen
in den Intermembranraum gepumpt. Komplex II kann durch Malonat gehemmt werden.
Komplex I und II geben ihre Elektronen
Elektr
beide in den Chinon-Cyclus des Komplex III.
III Dabei
werden 4 Protonen pro oxidiertem NADH in den intermembranraum gegeben. Die Elektronen
werden an Cytochrom C weitergegeben.
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Komplex IV nimmt die Elektronen von Cytochrom c auf, welches damit oxidiert wird und
synthetisiert mit 4 Elektronen an der Matrixseite aus Sauerstoff und 4 Protonen in einer
Redoxreaktion 2 H2O. Dabei werden 4 Elektronen in den Intermembranraum gepumpt.
Der Protonengradient der im Verlauf der Atmungskette entsteht, kann durch eine ATPSynthase in chemische Energie in Form von ATP umgewandelt werden, indem ADP zu ATP
phosphoryliert wird. Dieser Prozess wird auch als Chemiosmose bezeichnet. In der
Atmungskette entstehen pro mol Glucose ca. 26-28 ATP.
1.1.5 Flugmuskulatur von Insekten
Insekten besitzen je nach Größe indirekte oder direkte Flugmuskulatur.
Bei der direkten Flugmuskulatur sitzen die Muskeln direkt am Flügel an und erzeugen durch
Kontraktion
die
Flügelschwingungen.
Die
Kontraktion
erfolgt
über
direkt
über
Motoneuronen. Vorteil dieser Art von Flugmuskulatur ist die Möglichkeit, direkt die
Frequenz und auch die Orientierung der Flügel zu steuern. Ein Nachteil ist, dass die Frequenz
durch die Refraktärzeit begrenzt ist. Ein Beispiel für ein Insekt mit direkter Flugmuskulatur
ist die Libelle.
Bei der indirekten Flugmuskulatur wird die Flügelschwingung nicht direkt durch Kontraktion
eines Muskels hervorgerufen, sondern durch Schwingung des Thorax. Dieser wird durch die
Longitudinal- und die Dorsoventralmuskeln verformt. Die Erregung dieser Muskeln erfolgt
nicht direkt über Aktionspotentiale, sondern durch Dehnungen, welche durch die
Antagonisten erzeugt werden. Aktionspotentiale sind nur ab und zu erforderlich um die
Calciumkonzentration hoch genug zu halten, welche für die Kontraktion des Muskels
erforderlich ist. Der große Vorteil dabei ist, dass die Schlagfrequenz nicht durch die
Refraktärzeiten
nach
den
Aktionspotentialen
begrenzt
ist,
außerdem
hat
es
höchstwahrscheinlich auch einen energetischen Vorteil. Von Nachteil ist, dass Frequenz und
Orientierung der Flügel nicht direkt gesteuert werden können.
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1.1.6 Die Clark-Elektrode
Diese Elektrode besteht aus einer Platin-Kathode und einer Silber-Anode. Diese beiden Pole
sind über eine Elektrolytlösung, z.B. KCl verbunden. Die Elektrolytlösung ist mit einer
Teflonmembran als O2-durchlässige Trennschicht gegenüber der Sauerstoffhaltigen Lösung
im Reaktionsgefäß abgetrennt. Eine Beispiel- Elektrode ist in Abb. 5 gezeigt.
An den Polen laufen folgende Reaktionen ab:
Kathode: O2 + 2 e− + 2 H2O → H2O2 + 2 OH−
H2O2 + 2 e− → 2 OH−
Anode: 4 Ag → 4 Ag+ + 4e−
4 Ag+ + 4Cl− → 4 AgCl (AgCl fällt aus.)
Mit einem Schreiber wird der Strom gemessen, welcher bei ablaufenden Reaktionen fließt.
Dieser ist proportional zum Partialdruck von Sauerstoff. Es kann somit der Sauerstoffgehalt
gemessen werden, wenn dieser zum Beispiel bei einer Mitochondrien haltigen Lösung durch
die an Komplex IV der Atmungskette ablaufende Reaktion durch Zugabe von
Reduktionsäquivalenten verringert wird. Dabei wird Sauerstoff zu Wasser reduziert.
Abb. 5 Eine Clark-Elektrode
Quelle: http://www.h-saur.com/images/dw1.jpg 19.12.2011
8
1.2 Aufgabenstellung des Versuchs
Ziel des Versuches war es, die Wirkung von Succinat, Malonat und NADH auf die
Atmungskette experimentell zu bestimmen. Dazu wurden Mitochondrien in einer
Pufferlösung mit den jeweiligen Testsubstanzen in einer Clark-elektrode versetzt und dann
der Sauerstoffgehalt bestimmt.
2. Material und Vorbereitungen
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
− Dikaliumhydrogenphosphat
− Kaliumdihydrogenphosphat
− Natrium – EDTA
− Saccharose (=Sucrose)
− Demineralisiertes Wasser
− Kalilauge
− Kaliumchlorid
− NADH
− Succinat
− Malonat
2.1.2 Probenmaterial
− 15 eingefrorene Schmeißfliegen
2.1.3 Geräte
− Feinwaage von Sartorius, Typ: BP 121 S
− Waage von Sartorius, Typ PT 610
− Plastikschiffchen
− Spatel
− Erlenmeyerkolben (500 ml)
− Messzylinder (500 ml)
− 2 x Eppendorftubes (1,5 ml)
− pH-Elektrode von pHenomenal, Typ: pH 1000 L
− Präparierbesteck (Schere und Pinzette)
− Petrischalen (Kunststoff)
− 3 x Falcon-Tubes (15 ml)
− Styroporbox für Eis-Wasser-Bad
− Ultraturrax von Janke und Kunkel, Typ: TP 18-10
− Thermomixer von Eppendorf, Typ: Thermomixer 5436
9
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
−
Tropfpipette
Pipetten (100 – 1000 µl) von Eppendorf
Pipettenspitzen
1. Zentrifuge von Eppendorf, Typ: Contrifuge 5804 R
2. Zentrifuge von Sorvall, Typ: RC 5 B Plus
Rührzelle mit Clark – Elektrode von Rank Brothers, Typ: 200 Electronic stirrer
(Reaktionskammer mit Temperiermantel, Magnetrührwerk mit Regler, Schaltblock
mit Batterie als Stromquelle, Elektrode mit Coaxial-Kable zum Schaltblock,
Verbindungskabel zum Schreiber-Schaltblock, Micro-Rührfisch)
Schreiber von Servogor, Typ: 210
Hamiltonspritze
Teflonmembran
Zigarettenpapier
Stativ
Laborboy
2.2 Vorbereitungen
2.2.1 Herstellung der Puffer- und Substratlösungen
Damit die Lösungen die richtige Konzentration besitzen, mussten zuerst die einzelnen
Bestandteile wie in Tabelle 1 angegeben mittels einer passenden Waage eingewogen werden.
Für die kleinen Mengen im Milligrammbereich war die Feinwaage von Nöten. Desweiteren
brauchte man für die Einwaage die Plastikschiffchen, in welche die Stoffe mittels Spatel
hineingefüllt wurden. Nachdem alle Stoffe für den Suspensionspuffer genau abgewogen
waren, füllte man sie in einen Erlenmeyerkolben und gab 250 ml demineralisiertes Wasser,
welches zuvor mit einem Messzylinder abgemessen wurde, hinzu. Die Substratstoffe wurden
direkt in jeweils ein Eppendorftube eingewogen, welches dann mit einer bestimmten Menge
demineralisiertem Wasser mittels einer Pipette versetzt wurde (siehe Tabelle 1). Die
Substratlösungen wurden mit Hilfe des Thermomixers gemischt, währenddessen der
Suspensionspuffer mittels eines Magnetrührers vollständig gelöst wurde. Damit der pH-Wert
des Suspensionpuffers stimmte, mussten noch ein paar Tropfen Kalilauge zugegeben werden,
bis die pH-Elektrode einen Wert von 7,4 anzeigte.
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Tabelle 1: Einwaagen zur Herstellung der Lösungen
Konzentration
Volumen
Einwaage
Tatsächlich
e Einwaage
Tatsächlich
es Volumen
4 mM
250 ml
174,2 mg
174,2 mg
250 ml
1 mM
250 ml
34,0 mg
34,0 mg
250 ml
1 mM
250 ml
93,0 mg
93,0 mg
250 ml
320 mM
250 ml
27,4 g
27,4 g
250 ml
NADH
100 - 500 µM
100 µl
14,2 mg
13,4 mg
94 µl
Succinat
2 – 6 µM
100 µl
54,0 mg
49,1 mg
91 µl
Kaliumchlori
d
1M
100 ml
7,5 g
7,5 g
100 ml
Lösung
Substanz
Suspensionspuff
er
(Gesamtvolume
n: 250 ml)
DikaliumhydrogenPhosphat
KaliumdihydrogenPhosphat
NatriumEDTA
Saccharose
Substratlösung
Substratlösung
Elektrolytlösung
für ClarkElektrode
Die Malonatlösung wurde nicht extra angesetzt, es wurde die Stammlösung (5 M) verwendet.
2.2.2 Vorbereitung der Clark-Elektrode
Zu Beginn mussten zuerst die Elektroden vollständig mit 1 molarer Kaliumchlorid-Lösung
bedeckt werden. Dies geschah mit Hilfe einer Tropfpipette. Danach wurde über die
Elektroden vorsichtig Zigarettenpapier gelegt, sodass keine Luftblasen entstehen konnten.
Danach gab man über das Zigarettenpapier ein Stück Teflonmembran, sodass sowohl die
Silber- wie auch die Platinelektrode bedeckt waren. Um die Membran zu fixieren, legte man
in die ringförmige Vertiefung der Silberanode einen passenden Gummiring.
War dies erledigt konnte auf die Clark-Elektrode vorsichtig die Rührzelle aufgesetzt werden
und das ganzen auf den Magnetrührer gestellt werden, so wie in der Skizze in Abbildung 6
dargestellt. Das Ganze wurde mit Hilfe des Stativs und des Laborboys fixiert. Die Kühlung
wurde jedoch nicht befüllt, da dies für die kurze Dauer des Versuches kaum einen
Unterschied machte.
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Abb. 6: Skizze Rührzelle mit Clark-Elektrode
(aus dem Skript der Physiologischen Übungen, Stoffwechselphysiologie, Versuch
Respiration, der Universität Ulm)
3. Durchführung der Versuche
3.1 Isolierung der Mitochondrien
Zu Beginn wurden in einer Petrischale 15 eingefrorenen Schmeißfliegen (Protophormia
spec.) mit Hilfe von Pinzette und Schere der Kopf, die Beine, die Flügel und der Rumpf
abgetrennt, sodass nur noch die Thoraces übrig blieben. Diese Brustkörbe wurden dann in ein
Falcon-Tube überführt und der Rest verworfen. Das Falcon-Tube mit den Thoraces musste
ständig in einer Styroporbox mit Eiswasser (ca. 0 °C) kühlgestellt werden.
Nun wurden die Fliegenbrustkörbe mit ca. 5 ml Suspensionspuffer versetzt und mit Hilfe des
Ultraturraxes homogenisiert. Damit keine Überhitzung auftritt, wurde die Homogeniesierung
in drei Schritten mit ca. 10 – 15-sekündigen Abkühlungspausen durchgeführt. Das FalconTube war in den Bearbeitungspausen stets kühl zu lagern (Eis-Wasser-Bad).
War nun die Lösung bestmöglich homogeniesiert, stellt man das Tube mit einem passenden
Gegengewicht für 2 Minuten bei 5 °C und ca. 2000 Umdrehungen pro Minute in die
Eppendorf-Zentrifuge. Der Überstand 1 wurde in ein weiteres Falcon-Tube überführt und das
Semdiment 1 im Eis-Wasser-Bad kühl gestellt. Die Mitochondrien befinden sich nach der 1.
Zentrifugation im Überstand 1. Diese Lösung musste erneut zentrifugiert werden, damit sich
die Mitochondrien absetzten. Dies geschah in einer Sorvall Zentrifuge (Rotor: SS34, dies
entspricht einer Beschleunigung von 11 950 g) durch 10-minütige Zentrifugation bei 10 000
Umdrehungen pro Minute (U/min) ebenfalls bei 5 °C. Nun befinden sich die Mitochondrien
im Sediment 2. Der Überstand 2 wird in ein neues Falcon-Tube überführt und beide Tubes
kühlgestellt.
Das Sediment 2 mit den Mitochondrien musst nun in ca. 5 ml Suspensionspuffer gelöst
werden.
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3.2 O2-Messung mit der Clark-Elektrode
Bei den Messungen mit der Clark-Elektrode wurden jeweils Mischungen von 1,5 ml
Suspensionspuffer und 0,5 ml Mitochondriensuspension für die beiden Versuche verwendet.
Nach dem Befüllen wurde die Elektrode mit einem Stopfen verschlossen und an den x-tSchreiber angeschlossen. Aus Zeitgründen wurde auf eine Kalibrierung desselben verzichtet
und sofort mit den Messungen begonnen. Nach dem Einschalten des Magnetrührers und des
Schreibers wurden die Testsubstanzen mit einer Hamilton-Spritze durch den Kanal des
Stopfens in die Messkammer injiziert.
a) Es wurden 3 µL NADH injiziert. Nach Beendigung des Schreiberausschlags wurden
zusätzlich 5 µL Succinat in die Messkammer eingebracht.
Vor der nächsten Messung wurden Messkammer und Stopfen mit Wasser gereinigt und die
Kammer mit frischem Puffer und neuer Mitochondriensuspension befüllt.
b) Nun wurden 5 µL Succinat eingebracht und kurz darauf 1 µL Malonat zugegeben. Es
folgten nach einiger Zeit zwei Injektionen von jeweils 10 µL Succinat. Zum Schluss
wurden 5 µL NADH injiziert.
4. Ergebnisse
Die original Ergebnisse aus dem x-t-Schreiber sind im Anhang zu finden.
a) Kurz nach der Injektion des NADH begann der Schreiber steil nach links
auszuschlagen, die Sauerstoffkonzentration sank. Das Einbringen des Succinats nach
Ende des Ausschlags führte ebenfalls zu einem Ausschlag, jedoch war dieser weniger
steil als der Vorherige.
b) Wie schon zuvor reagierte der Schreiber auf die Zugabe des Succinats mit einem
Ausschlag, dieser wurde durch die Malonatzugabe schlagartig beendet. Auch bei
mehrmaliger Injektion von Succinat war kein weiterer Ausschlag zu beobachten. Erst
bei Zugabe von NADH begann der Schreiber wieder nach links auszuschlagen.
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5. Diskussion
5.1 Isolierung der Mitochondrien
Bei der Isolierung der Thoraces musste darauf geachtet werden, dass keine Augen mit
untergemischt wurden, da deren Schirmpigmente die Messungen verfälscht hätten. Bei der
ersten Zentrifugation wurden grobe Fliegenbestandteile abgetrennt, bei der zweiten
Zentrifugation wurden die Mitochondrien pelletiert, welche danach wieder resuspendiert
wurden.
5.2 O2-Messung mit der Clark-Elektrode
In
den
Mitochondrien
findet
die
Respiration
einer
Zelle
statt.
Der
terminale
Elektronenakzeptor ist hier Sauerstoff.
Durch die Zugabe verschiedener Substrate und die gleichzeitige Messung der O2Konzentration in der Clark-Elektrode konnte der Einfluss der Substrate auf die Respiration
festgehalten werden. Eine Abnahme der Sauerstoff-Konzentration in der Messkammer, also
ein Ausschlagen des Schreibers nach links, stand für Respirationsaktivität.
a) Das injizierte NADH gab seine Elektronen an die Elektronentransportkette ab. Am Ende
der Kette wurde O2 zu H2O reduziert, die Sauerstoffkonzentration in der Messzelle sank damit
und der Schreiber zeigte einen Ausschlag. Als das NADH verbraucht war erreichte der
Ausschlag ein Plateau. Die darauffolgende Zugabe von Succinat führte ebenso zu einem
Ausschlag, jedoch ging dieser zögerlicher vonstatten als bei NADH. Dies lag daran, dass bei
Succinat ein zusätzlicher Reaktionsschritt bis zur Reduktion des Sauerstoffs nötig war.
b) Beim 2. Versuch sank zuerst ganz normal die Sauerstoffkonzentration als Succinat in die
Messzelle eingespritzt wurde. Sofort nach der Zugabe von Malonat wurde der
Sauerstoffverbrauch gestoppt. Malonat fungierte hier als Inhibitor des Enzyms SuccinatDehydrogenase, dadurch verhinderte es die Umsetzung des Succinats und unterbrach die
Respiration. Auch durch Zugabe von insgesamt 20 µL Succinat konnte der O2-Verbrauch
nicht wieder in Gang gebracht werden. Das Succinat konnte das Malonat also nicht
kompetitiv vom Enzym verdrängen, das Malonat besaß also eine sehr große Affinität zu der
Succinat-Dehydrogenase. Wurde NADH zugegeben so wurde wieder O2 verbraucht. NADH
benötigte die Succinat-Dehydrogenase nicht, deshalb musste es auch nicht erst Malonat
verdrängen um seine Elektronen in die Elektronentransportkette einzuspeisen. Das NADH
wurde nämlich von anderen Enzymen oxidiert.
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