Immunhistochemischer Nachweis von Chlamydophila psittaci in drei

Ruhr-Universität Bochum
PD Dr. med. Dirk Theegarten
Dienstort: Universitätsklinikum Essen
Institut für Pathologie und Neuropathologie
Immunhistochemischer Nachweis von Chlamydophila psittaci
in drei verschiedenen Emphysemformen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
Der Ruhr-Universität-Bochum
Vorgelegt von
Tobias Bexten
aus Bottrop
2006
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Priv.-Doz. Dr. med. D. Theegarten
Koreferent: Prof. Dr. J. Guzman y Rotaeche
Tag der mündlichen Prüfung: 25.01.2007
Abstract
Problem: Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine der weltweit häufigsten
Erkrankungen. Bakterielle und virale Infektionen spielen in der Pathogenese der COPD, zumindest bei
der Exazerbation, eine bedeutende Rolle.
Das Lungenemphysem (E.) ist mit einer chronischen Inflammation assoziiert und eine Komponente der
COPD. Immunhistochemische Untersuchungen von Lungengewebe sowie serologische und PCRUntersuchungen konnten Chlamydophila pneumoniae (C. pneumoniae) bei COPD-Patienten
nachweisen. Im Kontrast hierzu wurde in einer dieser Arbeit vorangegangenen Untersuchung mit Hilfe
der PCR Chlamydophila psittaci (C. psittaci)-DNA nachgewiesen. C. psittaci besitzt die Fähigkeit im
Wirtsorganismus zu persistieren und so chronische Infektionen hervorzurufen. Als Reservoir sind eine
Vielzahl von Haus und Nutztieren bekannt.
Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die Verteilung von C. psittaci bei Patienten mit einem
Non-Non Alpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem, einem Alpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem sowie
einem großbullösen Emphysem zu vergleichen und hinsichtlich der pathogenetischen Relevanz zu
untersuchen.
Methode: Operativ gewonnenes, Formaldehyd-fixiertes, in Paraffin eingebettetes Lungengewebe von
12 Patienten mit einem Alpha1-Antitrypsinmangel-E. (A1ATM-E.), 47 Patienten mit einem NonAlpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem und 16 Patienten mit einem großbullösen E. (GB. E.) wurde mit
einem Maus-anti-C. psittaci-Antikörper untersucht. Unverändertes Lungengewebe diente bei der
Färbung als Negativkontrolle. Alle markierten Makrophagen, Pneumozyten Typ 2, bronchiolären
Epithelzellen und Lymphozyten wurden in fünf Gesichtsfeldern ausgezählt. Weiterhin wurden bei
einigen ausgewählten Fällen C. psittaci-Antigene sowie chlamydiales LPS fluoreszenzmarkiert und mit
einer Palette weiterer Antikörper in den verschiedenen Zielzellen mittels der konventionellen
Fluoreszenzmikroskopie als auch der Konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM) lokalisiert.
Ergebnisse: In der Immunhistochemie waren 100% des Non-A1ATM-E. und großbullösen E. und
83,33% des A1ATM-E. für C. psittaci-Antigene positiv. Die Detektionsraten waren in den
bronchiolären Epithelzellen am höchsten. Sie betrugen 54,04% beim Alpha1-Antitrypsinmangel-E.,
68,87% beim Non-A1ATM-E. und 71,54% beim großbullösen E. Etwas niedrigere Nachweisraten
fanden sich in Makrophagen (64,95% bis 66,04%) und Pneumozyten Typ 2 (55,74% bis 70,03%).
Lymphozyten zeigten die geringste Markierungsrate.
In der Fluoreszenzmarkierung wurden C. psittaci-Antigene im apikalen Bereich von bronchiolären
Epithelzellen sowie perinukleär in Pneumozyten Typ 2 dargestellt. Hierbei wies der LPS-Antikörper
eine diffus im Zellplasma verteilte Antigenbindung auf, während der C. psittaci-Antikörper deutlich
abgrenzbare Einschlüsse darstellt. Des Weiteren wurden C. psittaci-Antigen positive Makrophagen in
der Transmigration durch das Bronchialepithel gezeigt. Perivaskuläre Infiltrationen von teils C. psittaciAntigen positiv markierten Lymphozyten sind in enger Nachbarschaft zu stark C. psittaci-Antigenpositiv markierten Pneumozyten Typ 2 zu finden.
Diskussion: C. psittaci-Antigene konnten in unterschiedlichen Zelltypen nachgewiesen werden. Hierbei
sind bei den verschiedenen Emphysemformen in unterschiedlichen Zellen variierende Detektionsraten
zu finden. Gleichzeitig wurde in der Immunofluorenszenz ein morphologischer Bezug zum
Entzüdnungsprozess dargestellt. Diese Daten stellen einen Hinweis auf die pathogenetische Relevanz
der C. psittaci-Infektion und gleichzeitig Ansätze zur Erklärung der verschiedenen Formen des
Emphysems dar.
Für die genauere Einordnung der Rolle der C. psittaci-Infektion in der Pathogenese des Emphysems
bedarf es jedoch noch weiterer Untersuchungen, besonders mit verschiedenen Tiermodellen und
humanen Zelllinien.
meinen Eltern
und
meinen Schwestern
gewidmet
1.
Einleitung
1
2.
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung
2
2.1
Definition
2
2.2
Vorkommen
3
2.3
Symptome und Risikofaktoren
4
2.4
Stadieneinteilung
6
2.5
Chronische Bronchitis
6
2.6
Exazerbationen
7
2.7
Immunantwort
8
2.8
Das Lungenemphysem
9
2.8.1
Morphologische Klassifikation
9
2.8.2
Pathogenetische Klassifikation
10
2.8.3
Klinische Klassifikation
11
2.9
Molekularbiologische Aspekte der Pathogenese
des Emphysems
11
2.10
Das Alpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem
14
3.
Chlamydien
15
3.1
Allgemeine Aspekte
15
3.1.1
Erstbeschreibung
15
3.1.2
Taxonomie
16
3.1.3
Der Vermehrungszyklus
17
3.1.4
Molekularbiologische Aspekte
19
3.1.4.1
Aufnahme in die Wirtszelle
19
3.1.4.2
Fusion mit Lysosomen
19
3.1.4.3
Die Rolle der Membranproteine
20
I
3.1.4.4
Enzymausstattung der Chlamydien
21
3.1.4.5
Zelllyse
22
3.1.4.6
Persistenz
23
3.1.4.7
Apoptose der Wirtszelle
24
3.1.4.8
Die Rolle der Zytokine
24
3.1.4.9
Heat Shock Protein 60
25
3.1.5
Leukozyten
25
3.1.6
Makrophagen
26
3.2
Chlamydien als Krankheitserreger
26
3.2.1
Chlamydien bei Tieren und zoonotische Aspekte
26
3.2.1.1
Vögel
26
3.2.1.2
Haus- und Nutztiere
27
3.2.2
Chlamydieninfektionen und Erkrankungen des Menschen
28
3.2.2.1
Chlamydia trachomatis
28
3.2.2.2
Chlamydophila pneumoniae
28
3.2.2.3
Chlamydophila psittaci
29
3.2.2.4
Chlamydien bei COPD-Patienten
30
3.3
Diagnostische Verfahren
31
3.3.1
Kultureller Nachweis
31
3.3.2
Mikroskopische Nachweismethoden
32
3.3.3
Antigennachweismethoden
32
3.3.4
Antikörpernachweis
32
3.3.5
Molekularbiologische Methoden
33
II
4.
Material und Methoden
34
4.1
Material
34
4.1.1
Gewebematerial
34
4.1.2
Operationsverfahren
34
4.1.2.1
Lungen-Volumen-Reduktions-Chirurgie
34
4.1.2.2
Bullektomie
35
4.1.3
Einbettung und Fixierung
35
4.1.4
Kohorteneinteilung
36
4.1.5
Negativkontrollen
36
4.2
Methoden
36
4.2.1
Immunhistochemische Methoden
36
4.2.2
Immunofluoreszenzmethoden
39
4.2.3
Verwendete Antikörper
41
4.2.4
Durchführung der Färbung
42
4.2.5
Etablierung der Färbemethoden
47
4.2.5.1
Etablierung der Immunhistochemischen Färbemethode
47
4.2.5.2
Etablierung der Immunofluoreszenz-Methode
52
4.2.6
Validierung des Antikörpers
53
4.2.7
Mikroskopische Verfahren
53
4.2.7.1
Durchlichtmikroskopie
53
4.2.7.2
Fluoreszenzmikroskopie
54
4.2.7.3
Konfokale Laser-Raster-Mikroskopie
55
4.2.8
Auswertung
56
III
5.
Ergebnisse
57
5.1
Validierung des Primärantikörpers
57
5.2
Licht- und Immunofluoreszenzmikroskopie
59
5.2.1
Beschreibung der einzelnen Zielzellen
59
5.2.1.1
Bronchioläre Epithelzellen
59
5.2.1.2
Pneumozyten Typ 2
63
5.2.1.3
Makrophagen/Monozyten
65
5.2.1.4
Lymphozyten
72
5.2.2
Vergleich der verschiedenen Emphysemtypen
76
5.2.2.1
Großbullöses Emphysem
76
5.2.2.2
Non A1ATM-Emphysem
78
5.2.2.3
A1ATM-Emphysem
80
5.2.2.4
Negativkontrollen
81
5.3
Statistische Auswertung
83
6.
Diskussion
89
6.1
Pathogenetische Relevanz
89
6.2
Validität des Primärantikörpers
93
6.3
Wie korrelieren die einzelnen Methoden
miteinander?
94
6.4
Ausblick
95
7.
Zusammenfassung
97
8.
Literaturverzeichnis
99
9.
Danksagung
122
10.
Lebenslauf
123
IV
Abkürzungsverzeichnis:
A1AT
A1ATM
A1ATM-E.
Ag
Ak
ATS
bullöses E.
CAP
CLE
CLSM
ConA
COPD
E.
EBs
ELISA
ERS
FEV1
FITC
GAG
GOLD
GB. E.
HPF
IBs
ICAM
IF
IFN
IHC
IL
KBR
LEA
LTB4
LVR
MCP
MOMP
PGI
PLE
PNM
POMPS
RBs
SEM
SOD
Stdev
TBS
TEM
TNF-alpha
Alpha1-Antitrypsin
Alpha1-Antitrypsinmangel
Alpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem
Antigen
Antikörper
American Thoracic Society
bullöses Emphysem
Ambulant erworbene Pneumonie
Zentrilobuläres Emphysem
Konfokale Laser-Raster-Mikroskopie
Concanavalin A
chronisch obstruktive Lungenerkrankung
Lungenemphysem
Elementarkörperchen
Enzyme-linked immunosorbent assay
European Respiratory Society
Einsekundenkapazität
Fluoresceinisothiocyanat
Glycosaminoglycan
Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease
großbullöses Emphysem
High Power Field
Intermediate Bodys
Interzelluläres-Adhäsions-Molekül
Immunofluoreszenz
Interferon
Immunhistochemie
Interleukin
Komplementbindungsreaktion
Lycopersicon esculentum-Agglutinin
Leukotrien B4
Lungen-Volumen-Reduktion
Monocyten-chemotaktisches Protein
Major Outer Membrane Proteine
Prostacyclin
Panazinäres Emphysem
Polymorphonukleäre Neutrophile
Polymorphic Outer Membrane Proteines
Retikularkörperchen
Rasterelektronenmikroskopie
Superoxid-Dismutase
Standardabweichung
Tris gepufferte Salzlösung
Transmissionselektronenmikroskopie
Tumor Nekrose Faktor-alpha
Hinweis: Die Abbildungen 4, 5, 11 und 12 wurden mit Hilfe von Microsoft®
PowerPoint X und Microsoft® Word X for mac erstellt.
V
1. Einleitung:
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine der weltweit häufigsten
Erkrankungen [1]. Ihr werden sowohl respiratorische, als auch systemische Effekte
zugeschrieben [154, 155]. Bakterielle und virale Infektionen spielen in der
Pathogenese der COPD, zumindest bei der Exazerbation, eine bedeutende Rolle [1].
Das Lungenemphysem (E.) ist mit einer chronischen Inflammation assoziiert und eine
Komponente der COPD [2]. Immunhistochemische Untersuchungen von
Lungengewebe sowie serologische und PCR-Untersuchungen konnten Chlamydophila
pneumoniae (C. pneumoniae) bei COPD-Patienten nachweisen [3, 4]. Im Kontrast
hierzu wurde in einer dieser Arbeit vorangegangenen Studie in der PCR nur in dem
Lungengewebe eines COPD Patienten C. pneumoniae gefunden [5]. Rasterelektronenmikroskopische (SEM) und transmissionselektronen-mikroskopische (TEM)
Untersuchungen zeigten jedoch in der gleichen Kohorte hohe Detektionsraten von
„spherical bodies“ welche die Beteiligung einer anderen Chlamydien-Spezies nahe
legten [6]. Weitere Untersuchungen konnten mit Hilfe der PCR Chlamydophila
psittaci (C. psittaci)-DNA nachweisen. Hier zeigte sich eine Detektionsrate von 29%
beim Alpha1-Antitrypsin-Mangel-Emphysem (A1ATM) bzw. 66,7% beim NonAlpha1-Antitrypsin-Mangel-Emphysem (Non-A1ATM) [5]. Auch wurden in gewissen
Fällen C. psittaci als Ursache für Community Acquired Pneumonia (CAP) dargestellt
[7].
C. psittaci besitzt die Fähigkeit im Wirtsorganismus zu persistieren und so chronische
Infektionen hervorzurufen [8]. Sie werden durch Aerosolbildung über den
respiratorischen Trakt auf den Menschen übertragen, wobei als Reservoir mittlerweile
eine Vielzahl verschiedener Haus- und Nutztiere bekannt sind [9].
Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um die Verteilung von C. psittaci bei
Patienten mit einem Non-A1ATM-Emphysem, einem A1ATM-Emphysem sowie
einem großbullösen Emphysem (GB. E.) zu vergleichen und hinsichtlich der
pathogenetischen Relevanz zu untersuchen.
1
2. Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung
2.1 Definition
In einem Konsensus der American Thoracic Society (ATS) und European Respiratory
Society (ERS) wird die COPD als ein vermeidbarer und behandelbarer
Krankheitsstatus mit einer nicht voll reversiblen Reduktion des Atemflusses
charakterisiert. Die Atemflussbegrenzung ist sowohl progressiv, als auch assoziiert mit
einer abnormalen Entzündungsreaktion auf verschiedene Noxen, jedoch in erster Linie
dem inhalativen Zigarettenkonsum [2]. Dieser Definition entspricht auch die der
“Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD)” [10].
Zuvor definierte die ATS die COPD als eine Atemflussminderung in Abhängigkeit
von chronischer Bronchitis oder einem Emphysem, verbunden mit einer
Atemwegshyperraktivität und möglicher partieller Reversibilität.
Die ERS hingegen legte den Schwerpunkt auf die Reduktion des maximalen
Ausatemflusses, welche langsam progressiv und meist irreversibel ist [11].
Nach der deutschen Atemwegsliga umfasst der Begriff COPD eine Symptomatik und
funktionelle Beeinträchtigung der Lunge, die charakterisiert ist durch eine
Kombination aus chronischem Husten, gesteigerter Sputumproduktion, Atemnot,
Atemwegsobstruktion, und eingeschränktem Gasaustausch [12].
Die COPD ist abzugrenzen von ebenfalls irreversiblen Atemfluss-begrenzenden
Krankheiten wie Bronchiektasien und zystischer Fibrose.
Im Gegensatz zur COPD ist Asthma durch eine Reversibilität der
Atemflussbegrenzung charakterisiert. Auf Grund der hohen Prävalenz beider
Krankheiten liegt nach Ansicht einiger Autoren recht häufig eine Koexistenz vor,
welche durch Atemflussbegrenzung, ein gutes Ansprechen auf Bronchodilatatoren,
jedoch ohne das Erreichen eines normalen Atemflusses charakterisiert ist [2].
2
2.2 Vorkommen
Die COPD ist eine der am weitesten verbreiteten Ursachen für Morbidität und
Mortalität. 1990 war sie weltweit die sechsthäufigste zum Tode führende Krankheit.
Gegenwärtig ist sie weltweit die vierthäufigste Todesursache und man nimmt an, dass
sie zum Jahre 2020 durch die sich wandelnde Altersstruktur und den unvermindert
anhaltenden Tabakkonsum die dritthäufigste Todesursache sein wird [13, 14].
Für Deutschland liegen keine validen Angaben zur Prävalenz der COPD vor. Man
schätzt jedoch die Prävalenz der chronischen Bronchitis in der deutschen
Erwachsenenbevölkerung auf 10-15% und geht davon aus, dass bei etwa 14% der
Erwachsenen mit einer Einschränkung der Lungenfunktion zu rechnen ist [12].
Es bestehen unterschiedliche Aussagen zur globalen Prävalenz.
Die WHO beschreibt eine weltweite Prävalenz von 0.8%. Für Männer liegt sie im
Vergleich zu Frauen etwas höher (0,93 vs. 0,73). Bezogen auf unterschiedliche Länder
wird die Prävalenz COPD-Erkrankter zwischen <1% und 18% angegeben. Andere
Reporte sprechen von einer globalen Prävalenz von bis zu 6% [15]. In Spanien liegt sie
bei 9% der zwischen 40 und 79 Jährigen, wobei angenommen wird, dass lediglich 22%
der COPD-Patienten diagnostiziert werden [16]. Studien aus Kanada besagen, dass die
Mortalitätsrate im kommenden Jahrzehnt bei Frauen um das 3fache steigen wird,
während sie bei Männern nur um etwa 30% steigen wird. Hierfür wird das
Rauchverhalten der Frauen verantwortlich gemacht [17].
Auch zu berücksichtigen sind variierende Untersuchungsmethoden. So gab es 14
Studien die auf Symptom-Fragebögen zum chronischen Husten basierten. Bei diesen
wurde chronischer Husten als produktiver Husten während der meisten Tage einer
Woche für ≥3 Monate pro Jahr über ≥2 Jahre definiert. 11 Studien basierten auf
Ergebnissen der Spirometrie, obgleich nur drei dieser Studien Reversibilität der
Obstruktion (Asthma) als Ausschlusskriterium einbezogen haben. Die größten
Variationen sowie höchsten Raten der COPD zeigten die Studien, welche
symptombasierte Diagnosen einschlossen [15].
Im Rahmen des National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III)
wurden auf der Basis von Spirometrie und Fragebögen in den Vereinigten Staaten von
Amerika zwischen 1988 und 1994 mehr als 16000 Bürger auf das Vorliegen von
COPD untersucht. Nach den damaligen Kriterien der ATS lag dabei die Rate an COPD
3
erkrankter Erwachsener in den USA bei 2,9%. Wendet man die damalige GOLD- und
ERS-Definition der COPD auf die Ergebnisse der Lungenfunktionsprüfungen an, so
läge die Rate in der USA bereits bei 14,3 bzw. 13,9%. Von diesen haben 1,4% eine
FEV1 von unter 50% [11,18] .
Im Jahre 2000 war die COPD in den USA für etwa 8 Millionen Arztbesuche, 1.5
Millionen Notfalleinsätze, 726000 Hospitalisationen und 119000 Tote verantwortlich.
Sie verursachte 1993 einen Kostenaufwand von 23,9 Milliarden Dollar [11].
In Deutschland lagen die Daten 1996 bei 2,7 Mio. Krankenhaustagen, etwa 25 Mio.
Arbeitsunfähigkeitstagen und einem Aufwand von etwa 4,5 Milliarden Euro direkter
und 3,94 Milliarden indirekter Kosten [12].
2.3 Symptome und Risikofaktoren
Chronischer Husten, Giemen, Dyspnoe und Auswurf sind einheitlich zu findende
Symptome und weisen auf die nach der ATS der COPD zu Grunde liegenden
chronischen Bronchitis, Bronchiolitis, dem Emphysem oder einer Untergruppe von
Patienten mit Asthma hin [11]. Als Hauptrisikofaktoren gelten der inhalative
Tabakkonsum, aber auch der Gebrauch von Biomasse als Brennstoff. Das Kochen mit
Feuerholz erhöht das Risiko zur Entstehung einer COPD um das Drei- bis Vierfache,
was vor allem in Entwicklungsländern für die Prävalenz der COPD eine Rolle spielt
[15]. Die COPD beginnt mit einer Abnahme der Einsekundenkapazität (FEV1) bei
stabiler bis leicht verminderter Vitalkapazität. Die Abnahme der FEV1 liegt zwischen
60-100ml bei Nichtrauchern und 80-150ml bei Rauchern pro Jahr, wobei die
Progredienz auch von Alter, Geschlecht und allgemeiner Gesundheit abhängt [19].
Als genotypischer Faktor ist ein hochgradiger Alpha1-Antitrypsinmangel (A1ATM)
verantwortlich für das Entstehen einer COPD. Die Prävalenz einer schweren Form des
A1ATM wird mit einem auf 1600 Neugeborenen angegeben. Das Auftreten der ersten
Symtome liegt gemittelt zwischen dem 32. und 41. Lebensjahr [20].
Für die Rolle weiterer monogenetischer Faktoren gibt es keine eindeutigen Ergebnisse.
Jedoch zeigen erstgradig Verwandte von COPD-Patienten eine erhöhte Rate an
Atemwegsobstruktionen, wodurch die These weiterer genetischer Faktoren in der
Genese der COPD unterstützt wird [21].
4
Der Mangel an Alpha1-Antichymotrypsin als Proteinase-Inhibitor wird ebenfalls als
Faktoren diskutiert ohne dass man bisher zu einem einheitlichen Bild gekommen
ist [22, 21].
Der Tumor Nekrose Faktor-alpha (TNF-alpha) ist ein proinflammatorisches Zytokin.
Eine Mutation in der Promotorregion des TNF-alpha-Gen (TNF G-308 A) wurde als
möglicher Faktor untersucht. In einer japanischen Studie in der 106 Patienten mit einer
FEV1 <80% mit Lungen-gesunden-Blutdonoren verglichen wurden, wiesen die COPDPatienten eine signifikant höhere Rate an TNF G-308 A-Mutation auf [23]. Andere
Studien mit kaukasischen COPD-Patienten konnten die Mutation des TNF G-308 AGens nicht bestätigen [21] wohl aber eine TNF A-489 G-Mutation [24].
Basierend auf den Daten von 26392 Menschen aus Dänemark mit einem Follow-up
über 12 Jahre wurden Faktoren wie Ausbildungsniveau, Einkommen, Lebenssituation
(alleinstehend) und Beschäftigung auf das Mortalitätsrisiko der COPD untersucht.
Es zeigte sich ein signifikanter Unterschied der Mortalitätsrate zwischen
verschiedenen Ausbildungsniveaus, sowohl bei Männern als auch bei Frauen.
Das Risiko lag zweifach höher bei einem Bildungsstand von <8 Jahren im Vergleich
zu >11 Jahren Ausbildung. Dies galt jedoch nur bei Personen, die später als 1920
geboren waren, da bei älteren Generationen die Erwachsenenbildung eine zu große
Rolle spielte. Weitere Studien machten die Aussage, dass es bei Männern signifikante
Zusammenhänge zwischen Arbeitverhältnis und Mortalität gibt, nicht jedoch bei
Frauen. Als Erklärung hierfür betrachtet man die berufsbedingte Exposition mit
Stäuben und Gasen.
Die Rolle der Zentralheizung sowie der Lebensraum, der pro Person zur Verfügung
steht, zeigten keine deutlichen Unterschiede in der Prävalenz der COPD, werden
jedoch als Indikator für andere soziale Verhältnisse in Verbindung mit der
Sterblichkeitsrate an COPD gebracht [25].
5
2.4 Stadieneinteilung
Die GOLD-Kriterien zur Klassifikation der COPD sehen auf die FEV1 des Patienten
bezugnehmend eine Einteilung in vier Stadien vor. Im Stadium 1 ist FEV1 ≤ 80% des
Normwertes, Stadium 2 zeigt ein Absinken auf <80% bis >50%, Stadium 3 auf <50%
aber >30% und Stadium 4 auf <30% des Normwertes [11].
2.5 Chronische Bronchitis
Die chronische Bronchitis ist definiert als das Auftreten von produktivem Husten über
einen Zeitraum von je 3 Monaten in zwei aufeinanderfolgenden Jahren [11].
Histopathologisch findet man bei der chronischen Bronchitis eine Hypertrophie der
peribronchialen Drüsen [26].
Zu unterscheiden sind die drei Formen der chronischen Bronchitis. (i) Die chronisch
katarrhalische Bronchitis, bei der es zu einer Becherzellhyperplasie kommt. Die
Schleimbildung überfordert die ziliäre Clearance, wodurch es zu einer Stase des
Schleims und folgend zu einer Keimbesiedlung kommen kann. Die Mukosa ist
ödematös. Ebenfalls kann eine Hypertrophie der Bronchialmuskulatur vorliegen.
Die (ii) chronisch fibrosierende Bronchitis zeichnet sich neben Dyskrinie und erhöhter
Schleimbildung durch die zunehmende Fibrose des subepithelialen Bindegewebes mit
narbiger Schrumpfung aus. Bei der (iii) chronisch fibrosierenden Bronchitis mit
Schleimhautumbau besteht eine Reduktion des Zilienbesatzes mit Compoundzilien und
Plattenepithelmetaplasie [170].
Um Untersuchungsmaterial zu gewinnen, bestehen neben dem induzierten Sputum
noch zwei weitere Möglichkeiten, nämlich die bronchoalveoläre Lavage und die
Biopsie.
Obgleich bei dem so verglichenen Material auf verschiedene Kompartimente
zurückgegriffen wird, und zwar bei der Lavage weitestgehend auf die Alveolen, bei
der transbronchialen Biopsie jedoch auf die größeren Luftwege, besteht zwischen den
einzelnen Kompartimenten eine hohe Korrelation in der Häufigkeit der Eosinophilen.
Diese Korrelation besteht für Lymphozyten nicht [26].
Neuere experimentelle Studien beschäftigen sich mit dem Einfluss des Tabakrauches
auf die Entstehung einer chronischen Bronchitis. So kann bei Meerschweinchen
6
gezeigt werden, dass schon 6 Stunden nach einer Tabakrauchexposition fünffach
erhöhte Neutrophilenzahlen im Bronchialepithelium der Tiere vorliegen [28].
Bosken et al. konnten allerdings keine Unterschiede zwischen der Anzahl Neutrophiler
bei Rauchern mit COPD versus Nichtrauchern mit COPD in Biopsiematerial zeigen
[29]. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass Zigarettenrauch durch
Lungenfibroblasten auf Neutrophile und Monozyten chemotaktisch wirkt [30].
2.6 Exazerbation
Eine Exazerbation liegt dann vor, wenn es zum Auftreten oder zur Verstärkung der
Dyspnoe kommt, wenn die Produktivität von Sputum steigt und dieser purulent ist,
sowie andere allgemeine Symptome wie Fieber, Schnupfen, Halsschmerzen und
Kopfschmerzen vorliegen [17].
Während einer akuten Exazerbation finden sich im induzierten Sputum vermehrt
Lymphozyten, Eosinophile sowie Neutrophile, wohingegen die Anzahl der
Makrophagen/Monozyten konstant bleibt [27]. Rohde et al. zeigten weiterhin bei 85
Patienten mit akuter COPD-Exazerbation verminderte FEV1-Werte gegenüber 42
COPD-Patienten ohne akuter Exazerbation [31].
Ätiologisch wird die Exazerbation der COPD als eine komplexe Interaktion zwischen
der Patientenlunge, Bakterien, Viren sowie anderen Umweltfaktoren angesehen. Diese
verstärken die proinflammatorischen gegenüber den antiinflammatorischen
Komponenten. Regelmäßige Exazerbationen sind hierbei mit einer schnelleren
Progression der Krankheit assoziiert [32].
Meistens sind Exazerbationen der COPD erregerbedingt.
Häufig hierbei vorkommende Erreger sind Haemophilus influenzae, Moraxella
katharralis und Streptokokkus pneumoniae sowie Haemophilus parainfluenzae,
Chlamydien und Mycoplasma pneumoniae [16, 33]. Häufig gefundene Viren sind
Picornavirus, Influenza A-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus, Parainfluenza 3-Virus
sowie Influenza B-Virus [31].
Das Auftreten verschiedener Erreger hängt jedoch auch von der Immunität des
Patienten gegen bestimmte Erreger ab. So kann es durch bereits durchgemachte
Exazerbationen zu einer Verschiebung mit einem seltener vorkommenden Keim
kommen [16].
7
Auch können bei Gesunden Viren gefunden werden, ohne dass diese mit Symptomen
assoziiert sein müssen.
2.7 Immunantwort
Es wird angenommen, dass bei der COPD Adhäsionsmoleküle wie E-Selectin und
ICAM-1 in den Endothelien der Gefäße vermehrt vorkommen, die chemotaktisch über
IL-8 und LTB4 auf Neutrophile wirken [34, 35]. Die Bindung der Neutrophilen an
diesen Rezeptoren bewirkt eine Degranulation von Neutrophilenelastase sowie
Cathepsin G, Proteinase 3 und Matrixmetalloproteinasen, die für die
Gewebezerstörung mitverantwortlich gemacht werden [34].
Weiterhin führt Rauchexposition zu einer Irritation und inflammatorischen Reaktion,
welche durch Substanz P stimuliert wird. In diesem Prozess sind neben Neutrophilen
auch Makrophagen/Monozyten involviert. Diese werden über das von CD4+ TLymphozyten gebildete IFN-gamma aktiviert. Die aktivierten Makrophagen
sezernieren Zytokine (IL-12), welche ein positives Feedback an die CD4+ TLymphozyten geben und die T-Zellen so zur Differenzierung in Zytotoxische TLymphozyten stimulieren. Weiterhin werden von aktivierten T-Lymphozyten Zytokine
(IL-2, IL-4, IL-5 und IFN-gamma) sezerniert, die die Vasodilatation und Permeabilität
der Gefäße über NO und PGI2 begünstigen.
Über Zytokine wird die Expressionsrate der Adhäsionsmoleküle erhöht, sowie IL-8
von den Endothelien ausgeschüttet, welches die Extravasation der Leukozyten
begünstigt [26]. Auch werden Makrophagen/Monozyten durch Lipopolysaccharid
(LPS), oft Bestandteil der Zellwand gramnegativer Bakterien, zur Freisetzung von IL-6
und Monozyten-chemotaktisches Protein-1 (MCP-1) angeregt [36].
Hogg et al. konnten im Lungengewebe von 159 Patienten in Abhängigkeit vom
Schweregrad der COPD ein vermehrtes Vorkommen von polymorphonukleären
Neutrophilen (PNM), Makrophagen/Monozyten, CD4+T-Zellen, CD8+T-Zellen sowie
Lymphozytenfollikeln nachweisen [37].
8
2.8 Das Lungenemphysem
Das Lungenemphysem wurde erstmals 1959 vom Ciba Guest Symposium und 1962
vom ATS Symposium als eine abnormale, permanente Vergrößerung des Luftraumes,
distal der Bronchioli terminaliis definiert [38]. Diese Definition wurde 1985 erweitert
durch eine mit der Vergrößerung des Luftraumes einhergehende Destruktion der
Alveolarwände ohne offensichtliche Fibrose [39].
2.8.1 Morphologische Klassifikation
Anhand der morphologischen Verteilung der Veränderungen werden drei verschiedene
Typen unterschieden [40].
Das (i) zentrilobuläre Emphysem (CLE) ist das Ergebniss einer Dilatation und
Destruktion der respiratorischen Bronchiolen. Man findet es vermehrt in den oberen
Lungenlappen.
Das (ii) panazinäre Emphysem (PLE) ist Folge einer Destruktion sowohl der
respiratorischen Bronchiolen als auch der Alveolargänge und Alveoli.
Es ist eher in den unteren Lungenlappen angesiedelt und die typische Form des
A1ATM-E. Eventuelle Mischformen mit dem CLE sind durch zusätzliches
Zigarettenrauchen bedingt.
Weitere Emphysemformen sind das (iii) distal azinäre Emphysem oder bullöse
Emphysem, welches eher subpleural angesiedelt ist und häufig mit einem
Spontanpneumothorax assoziiert wird. Es lässt sich in ein bullöses Emphysem
(bullöses E.) mit Bullae im Durchmesser ≥1cm aber <3 cm und ein großbullöses
Emphysem (GB. E.) mit Bullae >3cm unterteilen [130].
Seltener beobachtet sind unilaterale Emphyseme, die als Komplikation einer schweren
Infektion mit Rubella oder Adenoviren in der Kindheit vorkommen [40, 131].
9
Abb. 1: Schema der Emphysementstehung. Oben: Zentrilobuläres Emphysem;
Unten: Panazinäres Emphysem [152].
2.8.2 Pathogenetische Klassifikation
Pathogenetisch können Emphyseme in ein primäres und sekundäres Emphysem
eingeteilt werden.
Das primäre E. entspricht einer Erkrankung bei der ein Mechanismus oder Defekt
bekannt ist, welcher direkt zur Parenchymschädigung führt. Bekanntestes Beispiel ist
der Alpha1-Antitrypsinmangel.
Bei dem sekundären E. werden je nach zugrunde liegendem Mechanismus drei Formen
unterschieden:
10
1. Das bronchostenotische (obstruktive) E., bei welchem es poststenotisch zu einer
Überblähung auf dem Boden einer aktiven, chronischen oder abgelaufenen
Entzündung kommt.
2. Das destruktiv-bronchiolitische E. welches vornehmlich bei Rauchern auftritt und
infolge einer
Ausbreitung der Entzündungsreaktion auf die terminalen und
respiratorischen Bronchiolen mit einhergehender Wandschwäche entsteht.
3. Bei dem Narbenemphysem liegt eine Strukturstörung vor, welche meist durch
Staubeinschlüsse oder posttuberkulöse Vernarbungen mit Zugwirkung auf das
umgebende Alveolargewebe zustande kommt.
2.8.3 Klinische Klassifikation
Klinisch unterscheidet man das generalisierte Emphysem, welches meist als A1ATME. oder als zentrilobuläres E. des Rauchers vorliegt, vom lokalisiertem Emphysem in
Form eines bullösen (Blasen > 1cm) bzw. GB. E. (Blasen >3 cm) vorliegt.
2.9 Molekularbiologische Aspekte der Pathogenese des Lungenemphysems
Für den Umbau des Lungengerüstes sind die Oxidantien/Antioxidantien- wie auch die
Proteinase/Antiproteinase-Balance von entscheidender Bedeutung [40].
Dies besagt, dass ein Übergewicht von Oxidantien gegenüber Antioxidantien bzw.
Proteinasen gegenüber den Antiproteinasen für die Destruktion der extrazellulären
Matrix verantwortlich ist [41].
Oxidantien sind hoch reaktive Moleküle, welche eine oder mehr Elektronenlücken
aufweisen. Die größte Quelle hierfür sind aktivierte Makrophagen sowie
Zigarettenrauch. Oxidantien sind in der Lage die Strukturen und Prozesse einer Zelle
so zu stören, dass diese apoptotisch wird. Auch können sie extrazelluläre Moleküle wie
das A1AT inaktivieren.
Antioxidantien sind entweder enzymatisch wirksam, wie die Superoxid-Dismutase
(SOD) bzw. Glutathion-Dismutase/Reduktase, oder kleine nicht-enzymatische
11
Antioxidantien, wie Vitamin E, A, C und Glutathion. Diese liegen in hohen
Konzentrationen im epithelialen Schleim der Lunge (epithelial lining fluid) vor [42].
Es konnte anhand von transgenetischen Mausmodellen gezeigt werden, dass humanes
SOD einen protektiven Charakter gegenüber Rauchexposition und der Entstehung
eines Lungenemphysems hat [43].
Proteinasen sind assoziiert mit dem physiologischen und pathologischen Umbau des
Lungengewebes und sind als Gruppe in der Lage alle Komponenten der extrazellulären
Matrix abzubauen [44]. Bei Rauchern mit einem Emphysem ist in der
bronchoalveolären Lavage eine höhere Konzentration an neutrophilen-spezifischen
Proteinasen zu finden, welche bei der Destruktion des Lungengewebes von großer
Bedeutung sind [40]. Ausgenommen dem A1ATM-E., bei dem eine ausgeprägte
Überaktivität der Neutrophilenelastase vorliegt, werden bei Non-A1ATMEmphysemen neben der Neutrophilenelastase verschiedene andere Metalloproteinasen
als Schlüsselenzyme angesehen [44].
Die Möglichkeit mit gentechnischen Methoden die Expression verschiedener Gene zu
unterdrücken bzw. zu stimulieren, hat Tiermodelle hervorgebracht, in denen man
einzelne endogene Faktoren, wie den Ausfall von Enzymen als Einflussfaktor auf die
Ausprägung eines Emphysems beurteilen kann [45]. Bei Mäusemutanten, die MMP-12
(Makrophagenelastase) nicht exprimieren können, wurde festgestellt, dass sie sich
auch nach langzeitiger Exposition mit Zigarettenrauch normal entwickeln.
Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass MMPs in der Lage sind Alpha1-Antitrypsin
abzubauen und MMP-8 (Neutrophilen-Elastase) Gewebsinhibitoren zu destruieren [45,
46, 47].
Alveolarepithelzellen exprimieren Metalloproteinase-1 (MMP-1)-mRNA. MMP-1
wiederum weisst eine hohe Kollagenaseaktivität auf.
Neutrophile exprimieren sowohl MMP-8 (Neutrophilenkollagenase) als auch MMP-9
(Gelatinase B) und speichern diese in Granula. Nach ihrer Differenzierung im
Knochenmark sind sie nicht mehr in der Lage MMPs zu exprimieren. Die von ihnen in
Granula gespeicherten MMPs spielen jedoch eine Rolle in der Destruktion der
Alveolarsepten [40]. Die Freisetzung der MMPs geschieht entweder durch ineffiziente
Apoptose der Neutrophilen oder durch die Unfähigkeit der Makrophagen die Lunge
von toten Neutrophilen zu befreien. Makrophagen wiederum sezernieren MMP-12
(Elastase), MMP-1 (Kollagenase) und MMP-9 (GelatinaseB) [48].
12
Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Expression von MMP-9- und MMP-1mRNA in Makrophagen von COPD-Patienten erhöht ist. MMP-12-mRNA ist in
Makrophagen von Nichtrauchern gerade noch detektierbar, bei Rauchern und COPDPatienten jedoch erhöht [49].
Die Gelatinasen MMP-2 und MMP-9 werden verantwortlich gemacht für die
Destruktion von Type-4 Kollagen und Elastin [48]. Meerschweinchen, die mit
Zigarettenrauch
exponiert
wurden,
zeigen
Kollagenase-mRNA
in
Alveolarmakrophagen, Alveolareptihelzellen und interstitiellen Zellen, wie
Fibroblasten [26].
Im Bezug auf Entzündungszellen werden in Lungenresektionspräparaten von
Emphysempatienten eine um das etwa 10fach erhöhte Anzahl von Neutrophilen,
Makrophagen, T-Lymphozyten sowie Eosinophilen gefunden. Die Anzahl jeder dieser
gefundener Entzündungszellentypen korreliert hierbei mit dem Grad des Emphysems.
Es wird jedoch kein dominierender Zelltyp gefunden [46].
Bei Meerschweinchen korreliert die Tabakrauchinhalation mit einem Enhancement an
Neutrophilen, CD4+T-Zellen und Makrophagen, wobei eine Koinfektion mit
Adenoviren die emphysematöse Lungen-Destruktion potenzierte und das Auftreten
von Makrophagen, Neutrophilen und CD8+ Zellen erhöht [50].
Tiermodelle sind weiterhin die intrapulmonale Instillation von Porcine Pancreatic
Elastase (PPE), Papain sowie menschlicher Neutrophilen-Elastase, die im Tierversuch
ein Emphysem induzieren können. [45].
Als wichtigstes Substrat, dessen Destruktion zu einem Emphysem führt, wird bisher
Elastin angenommen.
Kollagene, die einen hohen Anteil der extrazellulären Matrix ausmachen, wurden erst
in Verbindung mit der Erforschung der Metalloproteinasen in Diskussion gebracht.
Sicherlich spielen auch sie, wie auch alle anderen Bestandteile der extrazellulären
Matrix in die Degeneration des Lungengewebes eine wichtige Rolle [40]. Mit einer
Überexpression von humanem MMP-1 in Makrophagen von transgenen Mäusen
konnte jedoch gezeigt werden, dass eine Destruktion des Kollagens, ohne dass Elastin
betroffen ist, auch zu einem Emphysem führen kann [51].
13
2.10 Alpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem
Der Alpha1-Antitrypsinmangel (A1ATM) ist eine autosomal heriditär Hypo-alpha1Antitrypsinämie, der schon oft in jungem Alter mit einem Lungenemphysem
einhergeht [52]. Histologisch liegt das Emphysem meist in der Form eines panazinären
Emphysems vor [53].
Ein A1ATM findet sich bei etwa 1-2% von COPD-Patienten. Da auch bei
ausgeprägtem A1ATM zwischen einzelnen Patienten große Unterschiede in der
Ausprägung des Emphysems bestehen, liegt es nahe, dass weitere Einflüsse wie andere
Modifikatorgene sowie Umweltfaktoren eine Rolle spielen [54].
Das Alpha1-Antitrypsin-Gen ist sehr polymorph. Insgesamt werden 123 “singlenukleotide-Polymorphism” unterschieden (Stand Juli 2003). Das Alpha1-Antitrypsin
(A1AT) wird von der Allelgruppe M exprimiert, wobei bei A1AT-heterozygoten
Trägern die Allelgruppen MS und MZ (MS>MZ) vorliegen. Eine Hypo-alpha1Antitrypsinämie liegt bei denen vor, die eine SS-, SZ- oder ZZ-Allelgruppe besitzen
[19]. Als weitere Allelgruppe gibt es Q0-Träger bei denen kein A1AT im Serum
messbar ist [54].
Der Serumspiegel des A1AT bei ZZ-Trägern liegt bei 16%, bei MZ-Genotyp bei 60%
im Vergleich zu 100% bei MM-Genotyp [19]. Während es bei homozygoten ZZ- oder
SS- bzw. SZ-Trägern zu einem frühen Auftreten der COPD kommt, liegt die Rate um
6% bei MZ-heterozygoten vs. 1% bei MM-homozygoten Patienten [21].
Insgesamt werden in erster Linie 16 verschiedene Mutationen unterschieden, die in
unterschiedlichem Maße neben der Lunge auch andere Organe wie die Leber betreffen
[54].
Weltweit liegt die Prävalenz bei mindestens 116 Millionen heterozygoten Trägern, und
3,4 Millionen SS- oder ZZ-Allel-Homozygoten. Die weitaus höchste Prävalenz ist in
Europa (1,7 Millionen Homozygote) zu finden [19, 54]. Hier liegen die höchsten Raten
vom ZZ-Typ in Skandinavien, während der SS-Typ besonders in Schweden und
Finnland innerhalb Europas am seltesten vorkommt [54].
A1AT inhibiert die Proteasen der neutrophilen Granulozyten, wobei besonders die
Elastase zum Pathomechanismus des Lungenemphysems beiträgt [19].
14
Kommt es zu einer Destruktion des Lungengewebes, reagieren Makrophagen mit der
Ausschüttung eines Leukotriens (LTB4), welches wiederum chemotaktisch auf
Neutrophile wirkt. Diese wirken dann erneut destruktiv auf das Lungengewebe .
Die höchste Expression des A1AT-Gen findet in den Hepatozyten statt, in denen es zu
einer Anreicherung bei fehlerhaft gefaltetem A1AT kommt. Eine solche Anreicherung
im endoplasmatischen Retikulum der Hepatozyten kann für die Entstehung der
Hepatitis und Zirrhose besonders bei Kindern verantwortlich sein, wobei etwa 12-15%
der ZZ-Genträger eine Leberzirrhose entwickeln [55].
Weiterhin zeigten andere Untersucher, dass auch Asthma eine höhere Prävalenz bei
Patienten mit A1ATM hat als bei Patienten mit einer nicht A1ATM-assoziierten
COPD [53].
3.
Chlamydien
3.1
Allgemeine Aspekte
3.1.1 Erstbeschreibung
Eine Beschreibung von durch Chlamydien bedingten Augenerkrankungen, die heute
als Trachom bekannt sind, findet sich schon in alten chinesischen und ägyptischen
Schriften. Eine Erstbeschreibung des Erregers gelang durch Halberstaedter und von
Prowazek 1907 in Java, welche dort unter der Leitung von A. Neisser aus Breslau die
Gonorrhoe erforschten. Sie beschrieben die Übertragung des Trachom vom Menschen
auf Orang-Utans. In mit Giemsa gefärbten konjunktivalen Epithelzellen fanden sie
intrazytoplasmatische Vakuolen gefüllt mit kleinen Partikeln, heute bekannt als
chlamydiale Einschlusskörperchen und chlamydiale Elementarkörperchen [56, 57].
15
3.1.2 Taxonomie
Die bis 1999 gebräuchliche taxonomische Klassifikation kannte vier Spezies, und zwar
Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumonia, Chlamydia trachomatis und Chlamydia
pecorum. Da diese auf eingeschränkten phänotypischen, morphologischen und
genetischen Kenntnissen beruhte, wurde sie 1999 von Everett et al. revidiert [56].
Bereits 1986 haben jedoch schon Cho-Chou Kuo et al. eine Erregerform beschrieben,
die nach den ersten zwei Isolaten TWAR genannt wurden. Morphologisch und
immunologisch wurde diese Reihe damals Chlamydia psittaci zugeordnet. Sie wurden
von Patienten mit akuten respiratorischen Infektionen isoliert und so als wichtiges
respiratorisches Pathogen beschrieben [58, 59].
Heute wird TWAR als Biovar Chlamydophila pneumoniae zugeordnet und als
Pathogen bei akuter und chronischer Bronchitis, COPD, Otitis media sowie als
mögliches Pathogen bei Morbus Alzheimer und weiteren Erkrankungen beschrieben
[57]. D ie Arteriosklerose wird als ultrachronisch persistierende Infektion der Gefäße
durch C. pneumoniae beschrieben. Diese Infektion soll den primären Mechanismus in
der Pathogenese der Arteriosklerose darstellen [171].
In einer Studie wurden die 16S-rRNA und 23S-rRNA Sequenzen aller bekannten
Gruppen, mit Inbezugnahme morphologischer Kriterien verglichen.
Die Gattung Chlamydiales wurde auf der Basis von >80% 16S-rRNA und oder >80%
23S-rRNA Übereinstimmung unterteilt [57]. Später wurde noch eine vierte
hinzugefügt [60]. Zu unterscheiden waren gram-negative Chlamydiaceae, gramnegative Simcaniaceae, Waddliaceae und Parachlamydiacae mit unterschiedlicher
Gramfärbung [57, 60].
Die Familie Chlamydiaceae wird in zwei Genera geteilt, nämlich (i) Non-ChlamydiaTrachomatis-l Like Chlamydophila und (ii) Chlamydia. Die größte Gemeinsamkeit des
Genus Chlamydia ist die Fähigkeit Glykogen zu produzieren.
Chlamydia trachomatis besitzt 18 Serovare, die in den Biovaren Lymphogranuloma
venerum und Trachoma zusammengefasst sind.
Chlamydophila-Spezies produzieren kein Glykogen. Ihre Unterteilung wurde an Hand
unterschiedlicher genetischer Merkmale der ribosomalen Startersequenz durchgeführt.
Chlamydophila psittaci (C. psittaci) hat acht zu unterscheidende Serovare mit
unterschiedlicher biologischer Relevanz. Chlamydiophila pneumoniae (C.
16
pneumoniae) besitzt drei bekannte Biovare, nämlich Biovar Koala, Biovar Equine und
Biovar TWAR [57].
Abb. 2: Taxonomie nach Everett et al. (1999).
3.1.3 Der Vermehrungszyklus
Sir Samuel Bedson beobachtete bereits 1934 bei der Psittakose die morphologische
Veränderung von Chlamydien während des Vermehrungszyklus. Jedoch sprach er
noch von einem großen Virus [61].
Chlamydien sind obligat intrazelluläre Erreger. Ihr Vermehrungszyklus weist im
Wesentlichen zwei Formen auf, zum einen die Elementarkörperchen (EBs) mit einem
Durchmesser von etwa 300nm, zum anderen die größeren Retikularkörperchen (RBs)
mit einem Durchmesser von bis zu 1000nm.
Die EBs stellen die infektiöse Form dar. Acht Stunden nach der Aufnahme in einer
Vakuole der Wirtszelle haben sie sich zu RBs reorganisiert, welche die nicht-infektiöse
vermehrungsfähige Form ist.
Nach weiteren 8-12 Stunden finden sich in der Vakuole 4-16 Retikularkörperchen, die
sich anschließend zu Elementarkörperchen organisieren und daraufhin durch Zelllyse
freigesetzt werden [62].
17
EBs
Wirtszelle
Transformation von
EBs zu RBs
Einschlusskörperchen
RBs
Transformation
von RBs zu EBs
Zelllyse
Abb. 3: Vermehrungszyklus von Chlamydien. (Beschreibung siehe Text). [56].
Das EB besitzt eine starre Zellwand mit Disulfid-Kreuzvernetzungen des Major Outer
Membrane Protein (MOMP), Cystein-reicher Proteine, des 60kDa Hüllenprotein und
des 12kDa Outer Membrane Lipoprotein (OMP) [63, 64]. Die Zellwand der EBs ist
hydrophob, gram-negativ und besitzt keine Peptidoglykane [65].
Das RB ist größer, metabolisch aktiv und synthetisiert DNA, RNA und Proteine. Es ist
sehr labil und obligat intrazellulär [66].
Die DNA liegt in RBs in dekondensierter Form vor, was in diesem Stadium bedeutend
für die Transkription ist [67, 68].
Als weitere Form sind aberrante pleomorphe RBs beschrieben, welche zuerst in
infizierten Fibroblasten und Makrophagen bei einer Synovitis gezeigt wurden und als
persistierende Form der Chlamydieninfektion angesehen werden [8].
18
3.1.4 Molekularbiologische Aspekte
3.1.4.1 Aufnahme in die Wirtszelle
Da die Zellmembran der EBs bei einem pH von 7, ebenso wie die der Wirtszellen
negativ geladen ist, stellt die Initialisierung der Aufnahme eine große Hürde dar [65].
Für den initialen Kontakt spielen elektrostatische Bindungen mit Heparansulfat
ähnlichen Glycosaminoglycanen (GAG) auf der Oberfläche der EBs eine große Rolle
[69, 70]. Auf der Oberfläche von Chlamydia trachomatis werden weiterhin 18 und 32
kDa Bindungsproteine zu Oberflächenproteinen des Wirts gefunden, welche eine
mögliche Rolle bei dem initialen Kontakt spielen [71].
Für die Aufnahme der Chlamydien werden in erster Linie zwei Theorien diskutiert.
Die erste unterstützt eine Mikrofilament-abhängige Phagozytose, die zweite eine
Rezeptor-abhängige Endozytose. Andere Untersucher gehen davon aus, dass je nach
Spezies der eine oder andere Weg eine größere Rolle spielt [56]. Für die Aufnahme
von C. psittaci wird weiterhin eine Mikrofilament-unabhängige Pinozytose diskutiert
[72]. Eine neuere Studie zeigt jedoch, dass C. psittaci sowohl Mikrofilament-abhängig
als auch -unabhängig aufgenommen werden kann, jedoch meist Mikrofilamente bzw.
Mikrotubuli in die Internalisierung einbezogen sind [73].
3.1.4.2 Fusion mit Lysosomen
Der Mechanismus der dazu führt, daß lediglich ein kleiner Teil der in Phagosomen
eingeschlossener EBs eine Fusion mit Lysosomen eingeht wird bisher noch nicht
vollständig verstanden. Durch Hitze vorbehandelte Chlamydien zeigen unmittelbar
nach Aufname in die Wirtszellphagosomen eine Fusion mit Lysosomen. Vitale
Chlamydien schaffen über die Membran der Endosomen eine Voraussetzung, um eine
Fusion mit Lysosomen zu vermeiden [65]. Eine Proteinsynthese von Seiten der
Chlamydien ist hierfür nicht notwendig. Zwei Mechanismen werden angenommen. (i)
In einer frühen Phase kommt es zu einer sehr eingeschränkten Interaktion zwischen
Endosomen und Lysosomen. Diese wird durch intrinsische Eigenschaften der EBs
moderiert. (ii) Später kommt es zu einer aktiven Modifikation der
19
Endosomenmembran, welche Bindungseigenschaften zu Transportvesikeln, nicht aber
zu Lysosomen aufweist [74].
3.1.4.3 Die Rolle der Membranproteine
Nach der Aufnahme der EBs in die Wirtszelle ist eine Reduktion der Disulfidbrücken
zu sehen, welche zu einer erhöhten Fluidität und einer erhöhten Porinaktivität der
Zellmembran führt [75]. Eine exogene Reduktion der Disulfidbrücken reicht jedoch
nicht aus, um die Differenzierung von EBs zu RBs zu triggern. Es konnte jedoch unter
exogener Reduktion eine erhöhte Porinaktivität der MOMP gezeigt werden. In
Anwesenheit reduzierender Agenzien sind EBs weniger infektiös, was suggeriert, dass
oxidierte Disulfidbindungen für eine Infektion möglicherweise nötig sind [76]. Welche
Mechanismen in vivo zu einer Reduktion der Disulfidbindungen führen, ist jedoch
weiterhin unklar.
Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten Stunde nach der Infektion bei C.
psittaci die MOMPs zu Monomeren reduziert werden. Dies geschieht in einem
Prozess, der eine Chlamydienprotein-Synthese benötigt, unabhängig von einer
Wirtszellenprotein-Synthese. Auch die Cystein-reichen Proteine scheinen nach
Aufnahme der EBs eine partielle Reduktion aufzuweisen, jedoch wird zu keinem
Zeitpunkt nach der Infektion eine monomere Form gefunden [68].
Nach 12 Stunden ist die Reorganisation der EBs zu RBs abgeschlossen und es beginnt
die Synthese monomerer MOMPs, die in die äußere Membran inseriert werden.
Gefolgt wird dieser Prozess von einer binären Teilung der RBs. 20 Stunden nach der
Infektion werden Cystein-reiche Proteine als Disulfid-kreuzvernetzte Komplexe in der
äußeren Membran der RBs gefunden. Zu diesem Zeitpunkt beginnt die Reorganisation
zu EBs. Auch im späten Stadium des Entwicklungszyklus (44 bis 48 h) liegen die
MOMPs noch immer in monomerer Form in der äußeren Membran der intrazellulären
Chlamydien vor.
Erst nach der Lyse der Wirtszelle werden diese über Disulfidbindungen wahrscheinlich
durch eine Oxidantien enthaltende Umgebung wieder vernetzt [67, 68].
20
Als weitere Membranproteine werden Polymorphic Outer Membrane Proteins
(POMPS) 24 und 48 Stunden nach der Infektion in EBs von C. psittaci gefunden, nicht
jedoch in sich teilenden RBs, was vermuten lässt, dass diese keine entscheidende Rolle
beim Wachstum und Teilung der RBs spielen [77]. Bei Chlamydia trachomatis wurde
die Synthese des MOMP und des 60kD Cystein-reichen Proteins 18 Stunden nach der
Infektion detektiert. Es zeigt sich, dass nur 10% des nach 48h synthetisierten MOMPs
zwischen der 12h und 24h nach der Infektion synthetisiert wurden. Von diesen 10%
der MOMPs liegen 90% in einer nicht-kreuzvernetzten Form vor. Etwa 70% des
MOMPs werden in dem Zeitraum der schnellen Replikation, also etwa zwischen 24
und 36 Stunden nach der Infektion synthetisiert. Nur etwa 1% der 60kD Cysteinreichen Proteine wurden bis 24h nach der Infektion und keine nachweisbare Menge an
12kD Cystein-reichen Protein synthetisiert. Dies stellt einen Kontrast zu C. psittaci
dar, bei der schon 24h nach der Infektion eine erhebliche Menge dieser Proteine bereits
synthetisiert war.
So stellt die Zeit und Menge synthetisierter Proteine ein Unterscheidungskriterium der
verschiedenen Spezies dar. Auch für die Disulfidbrückenbindungen der MOMPs,
welche bei C. psittaci eher nach der Zelllyse zu finden sind, wird bei Chamydia
trachomatis eine bereits intrazellulär enzymkatalysierte Bindung diskutiert [78].
Im Übergang von RBs zu EBs gibt es als frühe und späte Übergangsformen so
genannte early and late intermediate bodys (IBs). Die frühen IBs scheinen noch zur
Teilung im Stande zu sein. Die späten IBs weisen kraterförmige Strukturen auf, die als
Porine diskutiert werden und in diesem Stadium für die Kondensation eine Rolle
spielen könnten [79].
3.1.4.4 Enzymausstattung der Chlamydien
Obgleich alle Elemente zur Glykolyse, Zellatmung und Pentosesynthese in
Chlamydien identifiziert wurden, sind entsprechende Enzyme nicht in genügender
Menge vorhanden.
So benötigen Chlamydien ATP von ihrer Wirtszelle, wozu sie mit einer ATP-ADPTranslokase ausgestattet sind [80]. Es konnte beobachtet werden, dass die Glykogenund Glutamatkonzentration, induziert durch eine Chlamydieninfektion, in den
Wirtszellen um das 2-3 fache, mit einem Gipfel um 24h nach der Infektion steigt. Auf
21
der Zelloberfläche von mit C. psittaci infizierten HeLa-Zellen wird weiterhin eine
erhöhte Dichte von GLUT-1-Glukosetransportern gefunden. Auch die ATPKonzentration steigt in den infizierten HeLa-Zellen über das Normalniveau [81].
Des Weiteren sind Chlamydien in der Lage eine Fusion der Endosomen, in denen sie
sich befinden, mit anderen EBs-haltigen Endosomen zu initiieren. Dies ist jedoch nur
innerhalb der eigenen Spezies möglich [82]. Sie nutzen eine von ihnen initiiertes FAktin- und Clathrinakkumulation als Gerüst, um in den perinukleären Bereich zu
gelangen. Es wird beobachtet, daß aus einem einzigen großen RB eine Vielzahl kleiner
RBs entstehen kann. Dies geschieht in einer geschützten Nische umgeben von
Einschlussmembranen, welche wahrscheinlich den Proteinfluss zwischen RBs und
Wirtszelle regulieren und mit der wachsenden Mikrokolonie von Chlamydien-RBs
mitwachsen muss [83].
Hierbei werden Sphingomyeline der exozytischen Vesikeln der trans-Golgi-Apparate
ebenso wie Phosphatidylinositol, Phosphatidylcholin und Cholesterol auf die inneren
Einschlussmembranen und weiter auf die angelagerten EBs übertragen [84, 85].
3.1.4.5 Zelllyse
Die unmittelbare Zelllyse durch eine Chlamydieninfektion hängt von der Anzahl EBs,
die durch eine Zelle aufgenommen oder freigesetzt werden ab.
Jede Aufnahme scheint eine Läsion in der äußeren Zellmembran zu hinterlassen, die
bei entsprechender Anzahl zu einem Ionenverlust der Zelle und so zum Tod der Zelle
führt [65].
Morphologisch zeigt sich an Peritonealmakrophagen von Mäusen, die mit C. psittaciEBs beimpft wurden, eine Internalisation innerhalb der ersten 20-40 min. nach der
Inokulation mit darauf folgender Differenzierung zu RBs. Eine sehr hohe Ratio
zwischen Makrophagen und EBs von <1:100 führt jedoch binnen 2 Stunden zum
Zelltod [86].
Weiterhin gibt es in der Chlamydienmembran Lipopolysaccharide, welche große
Übereinstimmungen mit Endotoxinen anderer gramnegativer Bakterien aufweisen.
Diese werden als Ursache für den Tod von Mäusen in einem Experiment von 1944
angesehen, welchen große Mengen von C. trachomatis infundiert wurden und die
daraufhin innerhalb weniger Stunden starben [65].
22
Für die Freisetztung der EBs am Ende des Vermehrungszyklus sind mindestens drei
Möglichkeiten beschrieben: (i) Das Zerreißen der infizierten Zelle, (ii) eine Expulsion
(iii) sowie eine Extrusion großer EB haltiger Pseudopoden [65].
3.1.4.6 Persistenz
Chlamydien besitzen die Fähigkeit in der Zelle zu persistieren.
In vitro nutzt man Antibiotika wie Ampicillin oder Mangel-Nährmedien um eine
Persistenz zu erzeugen [8, 87]. Andere in vitro-Modelle zeigen Parallelen zu in vivoMechanismen. So kann eine Persistenz durch IFN-gamma und IFN-alpha induziert
werden. IFN-gamma führt zu einem Tryptophanmangel welcher, äquivalent zu
insuffizienten Nährböden, zu einer Proteinmangel-induzierten Persistenz führt. In vivo
scheint eben diese Regulation des Tryptophan eine wichtige Rolle zu spielen [8].
In vitro kultivierte humane Monozyten, die mit C. trachomatis infiziert wurden zeigen
eine persistente, nicht produktive Infektion. Die anschließend mit Tryptophan sowie
Antikörpern gegen IFN-gamma, IFN-alpha sowie TNF inkubierten infizierten
Monozyten weisen auch weiterhin eine persistierende Infektion auf. Dies zeigt, daß die
bekannten Wachstumsinhibitoren keinen Einfluss auf die Persistenz in Monozyten
haben [88].
Auch eine Infektion der Chlamydien durch Phagen könnte eine Rolle im Übergang zur
Persistenz spielen. Hierbei zeigen die RBs große Ähnlichkeit zu “aberrant Bodies”
welche in Zellkultur-Modellen im Stadium der Persistenz gesehen werden [8,89].
Interessanterweise waren signifikant mehr Patienten mit einem Aortenaneurysma für
C. pneumoniae und Chlamydienphagen positiv als für C. pneumoniae alleine [90].
Weiterhin können Chlamydien die Freisetzung von Zytochrom c aus Mitochondrien
inhibieren und über verschiedene Faktoren die Transkription von antiapoptotischen
Genen aktivieren [82].
TEM-Beobachtungen zeigen atypische pleomorphe RBs. Als Persistenzmarker wird je
nach Chlamydienspezies eine Up- bzw. Down-Regulation des MOMP beobachtet [8].
23
3.1.4.7 Apoptose der Wirtszelle
HeLa-Zellen, die mit 17 verschiedenen Chlamydienserovaren infiziert werden, zeigen
eine niedrige Apoptoserate. Ihre Zellteilungsrate bleibt unverändert. Infizierte Zellen
können während des gesamten Zyklus der Chlamydien DNA synthetisieren und in eine
Mitose übergehen.
Chlamydieninfizierte HeLa-Zellen weisen eine signifikante antiapoptotische Aktivität
auf, was für den Vermehrungszyklus der Chlamydien eine wichtige Grundlage zu sein
scheint [91]. Je nach Spezies, und ob ein produktiver infektiöser Zyklus bzw. ein nichtproduktiver Zyklus vorliegt, inhibieren die Chlamydien Apoptose oder induzieren
diese.
Es gibt zwei Wege der Apoptoseinduktion, einen extrinsischen und einen intrinsischen
Weg. Extrinsische Initiation geschieht über Oberflächenrezeptoren für TNF-alpha, Fas
und andere Proteine, die über eine Trimerisation in eine Aktivierung einer
Kaspasenkaskade münden [92]. Es konnte weiterhin gezeigt werden das CADD
(Chlamydia protein associating with death domains), ein Protein das im C.
trachomatis-Genom codiert ist, den Zelltod von HeLa-Zellen triggert. CADD wirkt
über die Oberflächenrezeptoren für TNF-alpha und beinflusst so die Kaspasenkaskade
[93].
Intrinsisch kommt es zu einer Freisetzung von Zytochrom c aus den Mitochondrien.
Über die Kaspasenkaskade und unter Mitbeteiligung der Mitochondrien kommt es zu
einer Aktivierung von Nukleasen, Kaspase-aktivierter DNAsen und so zu einer DNAFragmentierung, die im Zelltod endet [92].
3.1.4.8 Die Rolle der Zytokine
Epithelzellen reagieren auf eine Infektion mit Chlamydien mit einer erhöhten
Expressionsrate von Chemokinen wie IL-8 und Zytokinen wie GM-CSF, IL-1alpha
sowie IL-6. Einige dieser Zytokine wirken chemotaktisch und aktivierend auf
Neutrophile, Monozyten und T-Lymphozyten und fördern die Freisetzung weiterer
inflammatorischer Zytokine durch Makrophagen [93].
24
Chlamydien-LPS kann weiterhin die Sekretion proinflamatorischer Zytokine durch
Makrophagen stimulieren [94]. Die Freisetzung dieser Zytokine geschieht jedoch im
Vergleich zu anderen Bakterieninfektionen erst in verzögertem Abstand zur Invasion,
mit einem Höhepunkt um 48 Stunden nach der Infektion [93]. Die Freisetztung von IL1alpha geschieht durch Lyse infizierter Zellen oder durch Sekretion im frühen Stadium
nach der Infektion. Chlamydien stimulieren wiederum die Sekretion von IL-8.
Die so begonnene Rekrutierung inflammatorischer Zellen kann bei Persistenz der
Erreger zu Fibrosierung und Gewebsverletzung führen [93].
3.1.4.9 Heat Shock Protein 60 (HSP 60)
Unter bestimmten Umständen, wie z.B. in einem artheriosklerotischen Atheroma,
sekretieren aktivierte T-Zellen IFN-alpha. IFN-alpha wird zu den Persistenzfördernden Mediatoren gezählt.
Persistierende Chlamydieninfektionen weisen eine erhöhte Produktion an
chlamydialem HSP 60 auf. Diesem werden verschiedene Aufgaben zugesprochen. So
werden Makrophagen zur Sekretion von TNF-alpha und Matrix-degradierender
Metalloproteinasen stimuliert [94].
Auch wird diskutiert, daß HSP 60 eine protektive Wirkung bei stressinduzierter
Fehlfaltung von Proteinen hat, sowie chronische Entzündungen induzieren soll, bei
denen auch eine Autoimmunantwort auf HSP 60 eine Rolle spielen könnte [95].
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei einer C. pneumoniae-Besiedelung der
Gefäße eine erhöhte Anzahl an glatten Muskelzellen zu finden war. Die Anzahl der
Muskelzellen korreliert hierbei mit der Expression von HSP 60 [96].
3.1.5 Leukozyten
Chlamydien wirken über den Komplementfaktor C5a chemotaktisch auf neutrophile
Leukozyten, unabhängig von der Anwesenheit von Antikörpern. Neutrophile
Leukozyten wiederum sind so kurzlebig, dass Chlamydien in ihnen nicht genügend
Zeit haben würden, um ihren Zyklus zu beenden.
25
Deswegen können nur Chlamydien, welche sich zum Zeitpunkt des Zelltodes der
Wirtszelle noch nicht vom EB zum RB organisiert haben in einen neuen
Vermehrungszyklus eintreten. Im anderen Fall besteht die Möglichkeit, dass die
absterbende Wirtszelle von Makrophagen phagozytiert wird und die EBs auf diese
Weise eine neue Wirtzelle erhalten [97].
3.1.6 Makrophagen
Die Differenzierungsrate von Monozyten der humanen THP-1 Zelllinie zu
Makrophagen zeigt einen deutlichen Anstieg bei der Infektion mit C. pneumoniae.
Auch die Phagozytoseaktivitat steigt an. Dies wird jedoch nur unter Beimpfung mit
vitalen Chlamydien und nicht bei reiner Antigenexposition beobachtet. Die Expression
von ICAM-1, ein Adhäsionsmolekül von Endothelzellen, das für die Migration der
Zellen eine bedeutende Rolle spielt, war sowohl bei aktiver Infektion als auch bei
Antigenexposition erhöht [102].
3.2 Chlamydien als Krankheiterreger
3.2.1 Chlamydienerkrankungen bei Tieren und zoonotische Aspekte:
3.2.1.1 Vögel
Die Psittakose wurde erstmals als “Pneumotyphus” beschrieben und stellt als
“Papageienkrankheit” die Chlamydienerkrankung der Psittacidae (Papageien) dar [9].
Als Erreger ist C. psittaci in allen Vogelpopulationen weit verbreitet, bei denen eher
chronische Infektionen bzw. Persistenzen auftreten. In Serum von Wildtauben wird in
33,3 - 85,1% ein positiver C. psittaci-Antikörpertiter gemessen, bei Fasanen in 31,5 40,4% der untersuchten Tiere.
Der C. psittaci-spezifische IgG-Titer variiert dabei in Abhängigkeit von der Jahreszeit
mit einem Gipfel im Frühling [99]. In Kroatien wurde ein erhöhter Serumtiter in
95,6% der untersuchten Tauben gefunden, jedoch waren nur 12,2% der Tauben sowohl
Antikörper- als auch Antigen-positiv [161]. C. psittaci wurde weiterhin im Fäzes von
26
Tauben mit Hilfe der PCR in verschiedenen Regionen Japans in 22,2% sowie in
Amsterdam in insgesamt 7,9% nachgewiesen [163, 162]. Insgesamt ist C. psittaci das
am weitesten verbreitete zoonotische Pathogen bei Tauben [164]. Die Symptome der
Erkrankung bei Vögeln sind: reduzierter Allgemeinzustand und Ernährungszustand,
ein makulopapulöses Exanthem, eine fibrinös-eitrige Serositis, Splenitis, Sacculitis,
Enteritis, interstitielle Nephritis und Hepatitis.
3.2.1.2 Haus- und Nutztiere
Bei 26,9% von 27 Hauskatzen, bei denen ein typisches Bild der Konjunktivitis vorlag,
wurde in Abstrichpräparaten C. psittaci (nach heutiger Taxonomie C. felis zuzuordnen)
nachgewiesen [101]. Hierbei konnte auch gelegentlich eine Übertragung auf den
Menschen beobachtet werden.
Bei Schafen und anderen Haussäugetieren ist Chlamydophila abortus verantwortlich
für Aborte und Reproduktionsstörungen. Auch bekannt, besonders bei jungen Schafen,
ist die Polyarthritis und Konjunktivitis verursacht durch Chlamydophila pecorum.
Bei Rinderbeständen werden C. psittaci und C. pecorum als Krankheitserreger vieler
Krankheiten wie z.B. Infektionen des Respirations- und Urogenitaltraktes beobachtet
[9]. Auch bei einer Kohorte von 51 Kälbern wurde in 53% C. psittaci oder C. pecorum
mittels der PCR nachgewiesen [102]. Einer möglichen zoonotischen Potenz dieser
Infektionen wird nachgegangen. Bei Schweinen sind Infektionen durch C. trachomatis,
C.
pecorum und C. psittaci bekannt und mit Aborten, Arthritiden und
Genitalerkrankungen assoziiert. Auch hier bedarf der Zoonosecharater der C. psittaciInfektion weiterer Abklärung [9].
C. pneumoniae wurde bisher bei Koalas, Pferden und Fröschen nachgewiesen [9],
wobei der in in Australien lebenden Fröschen nachgewiesene Serovar dem des Koalas
identisch ist [103]. Auch in Reptilien wie Schlangen und Chamäleons wurde C.
pneumoniae gefunden und es konnte gezeigt werden, dass das MOMP-Gen dem des
menschlichen respiratorischen Serovars sehr ähnlich oder gleich ist [104].
27
3.2.2 Chlamydieninfektionen und Erkrankungen des Menschen
3.2.2.1 Chlamydia trachomatis
Das Trachom war die am frühesten entdeckte, von Chlamydien (genauer: Chlamydia
trachomatis (C. trachomatis)) induzierte Krankheit beim Menschen, von der aktuell
etwa 500 Millionen Menschen betroffen sind. Obwohl sie behandelbar ist, ist sie
dennoch eine der häufigsten Ursachen für vermeidbare Blindheit.
Andere Serovare von C. trachomatis sind verantwortlich für Urethritis, Zervizitis,
Pelvic Inflammatory Disease (PID), ektopische Schwangerschaften und tuberale
Infertilität.
In den USA wurden 1995 etwa 50000 Frauen infertil, als Folge einer
Chlamydieninfektion [105]. Auch bei Arthritiden wird eine Inflammation der
Synovialis in Verbindung mit wahrscheinlich persistenter C. trachomatis Infektion
gebracht. Zirkulierende Monozyten sollen hierbei als Träger dienen.
Weitere Studien wiesen aber auch C. pneumoniae-DNA in der Synovialis nach [106].
Neonatale C. trachomatis-Infektionen können ebenfalls zu einer Konjunktivitis sowie
zur atypischen C. trachomatis-Pneumonie des Neugeborenen führen [107] .
3.2.2.2 Chlamydophila pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae (C. pneumoniae) ist ein weit verbreitetes Pathogen und
wird mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht.
Zum Einen ist es ein eindeutig respiratorischer Erreger bei der Pharyngitis, Bronchitis
und der Pneumonie, zum Anderen wird er mit Atherosklerose, Erythema nodosum,
Reitersyndrom und Sarkoidose assoziiert [108, 56].
Serologisch wurden erhöhte IgG-Titer gegen C. pneumoniae in Assoziation mit
kardiovaskulären Erkrankungen (KHK) gefunden [108, 157]. Hierbei besteht eine
allgemein hohe Durchseuchung bei Erwachsenen [156]. 20-70% aller Erwachsenen
weisen eine Seropositivität für C. pneumoniae auf mit Hinweis auf eine bestehende
oder bereits durchgemachte Infektion [100].
PCR, immunhistochemische Färbungen, sowie elektronenmikroskopische
Untersuchungen bestätigten eine Anwesenheit von C. pneumoniae in
28
atherosklerotischen Läsionen. W. Stille hat die Arteriosklerose als ultrachronische
Chlamydieninfektion eingeordnet, welches sicher eine Extremposition darstellt [171].
Ein kausaler Zusammenhang wurde zumindest bisher noch nicht vollständig erklärt
[108], wobei Antibiotika-Interventionsstudien sowie weitere serologische Studien eher
kontroverse Ergebnisse erbrachten [109].
Die artherosklerotischen Läsionen zeigen konstant pathologische Veränderungen. Sie
entsprechen denen, wie sie auch bei chronischen chlamydialen Granulomata zu sehen
sind [110]. Bei einer Patientin mit idiopathischem pulmonalem Bluthochdruck wurde
ultrastrukturell, in der Immunhistochemie sowie der PCR C. pneumoniae in den
Gefäßwänden der Pulmonalarterien nachgewiesen [111]. Zusammenfassend scheint
jedoch C. pneumoniae ein Trigger bzw. ein Faktor bei der Akzeleration als weniger ein
monokausales Agenz zu sein.
3.2.2.3 Chlamydophila psittaci
Ein Ausbruch der Psittakose, eine durch Chlamydophila psittaci (C. psittaci)
verursachte atypische Lungenentzündung wurde zum ersten Mal 1879 in der Schweiz
durch von Ritter beschrieben. Sie stellt eine zoonotische Krankheit dar, die von Vögeln
übertragen wird.
Die Seroprävalenz von C. psittaci beim Menschen liegt regional unterschiedlich bei 014% der Normalbevölkerung [159]. Der klinische Verlauf ist sehr variabel. Er kann
milde influenzaartige Symptome hervorrufen, geht jedoch meist nach 7 bis 14 Tagen
in ein Stadium mit systemischer Manifestation, einer Pneumonie mit hohem Fieber,
trockenem Husten, Kopfschmerzen und Myalgien, in seltenen Fällen auch einer
reaktiven Athritis und Konjunktivitis bis hin zur Myocarditis über. [158, 166].
Neuerdings wird eine C. psittaci-Infektion auch im Zusammenhang mit verschiedenen
Lymphomformen diskutiert [159]. Die Erkrankungshäufigkeit des Menschen liegt bei
1-2 pro Jahr auf 1 Millionen Einwohner. Sie sind in der Regel gut antibiotisch
behandelbar, was jedoch entscheidend von der frühzeitigen Diagnose abhängig ist [9].
Gelegentlich kommt es zu Krankheitsausbrüchen auf Geflügelfarmen sowie bei
Taubenzüchtern, bei denen die Inhalation von getrocknetem Faecesstaub wesentlich zu
sein scheint [99]. Von Ausbrüchen der Krankheit wurde jedoch auch bei Kontakt mit
Gänsen und Enten berichtet [100]. Im Zeitraum von 1941 bis 2004 wurden weiltweit
29
von 176 Übertragungen von Tauben auf den Menschen berichtet, wobei davon
auszugehen ist, dass viele Fälle nicht als solche publiziert wurden bzw. nicht
diagnostiziert wurden [164]. Dem “Centre for Disease Control” (CDC) USA wurden in
einem Zeitraum von 10 Jahren von 813 Psittakosen beim Menschen berichtet, wobei
43% der Fälle entweder Vogelzüchter oder Besitzer von Hausvögeln waren [165].
Während im 19 Jhd. und zu Beginn des 20 Jhd. die Mortalität der Psittakose bei bis zu
40% lag, war der Krankheitsverlauf der Ornithose weit milder ausgeprägt.
Die Begriffe der Psittakose und Ornithose sind jedoch eher historisch gewachsen.
Jedoch sind auch heute hoch virulente von weniger virulenten Stämmen zu
unterscheiden [9].
Die Erregernachweis beim Menschen ist bei einem Hinweis auf eine akute Infektion
jedoch meldepflichtig [166].
3.2.2.4 Chlamydieninfektionen bei COPD-Patienten
Chlamydieninfektionen sind bekannt als Trigger akuter Exazerbationen der
chronischen Bronchitis, ihre Rolle in der Pathogenese und Progredienz der COPD ist
jedoch noch unklar [112]. Chronische Chlamydieninfektionen werden als Faktor in der
Pathogenese des Emphysems diskutiert [5, 6].
Es wurden persistierende C. pneumoniae-Infektionen bei COPD-Patienten serologisch,
mittels PCR des Sputums sowie Sputum-IgA-Tests nachgewiesen.
Hierbei zeigten sich eine eindeutig höhere Durchseuchung bei Patienten mit COPD
gegenüber lungengesunden Patienten. Auch korrelierte die Durchseuchung mit dem
Schweregrad der COPD [114]. In einer weiteren Studie wurde C. pneumoniae-DNA in
Sputum und/oder mononukleären peripheren Blutzellen von klinisch stabilen COPDPatienten in 27% dargestellt. Hierbei korrelierte die Prävalenz mit dem Rauchverhalten
der Patienten [112].
Es zeigte sich ebenfalls, dass bei älteren COPD-Patienten (mittleres Alter von 69,8
Jahren) besonders IgG- und IgA-Antikörper gegen C. pneumoniae als Ausdruck einer
chronischen Infektion gemessen wurden, während IgM-Titer nur bei wenigen
Patienten anwesend waren [115].
Blasi et al. konnten für die chronische Bronchitis eine signifikante Korrelation
zwischen C.
pneumoniae-Antikörpertiter und dem Schweregrad der
30
Lungenfunktionstörung, gemessen in FEV1 (Einsekundenkapazität) darstellen. Die
Anzahl akuter COPD-Exazerbationen im Verlauf von 2 Jahren stieg mit der
Anwesentheit einer C. pneumoniae-Infektion [4].
Hierbei zeigten sich in 83,7% bei akuter Exazerbation erhöhte IgG-Titer gegen C.
pneumoniae, ohne das IgM-Antikörper nachweisbar waren [116]. Wu et al. konnten
immunhistochemisch in allen Lungengeweben von COPD-Patienten C. pneumoniae
nachweisen, während dies bei lungengesunden Patienten nur in 44% möglich war [3].
Im Gegensatz zu diesen Studien konnten Theegarten et al. beim Emphysem und auch
im induzierten Sputum von COPD-Patienten mit der PCR C. psittaci nachweisen [5,
138]. Ultrastrukturell zeigten sich Chlamydien in Kontakt mit Kollagensträngen, auf
der Oberfläche von alveolären und bronchiolären Epithelien sowie in Makrophagen
und Pneumozyten Typ 2 [6].
In der Pathogenese des Asthma scheint C. pneumoniae ebenfalls eine Rolle zu spielen
[118, 119]. So stieg bei wiederholten Asthmaexazerbationen der C. pneumoniae
spezifische IgA-Titer stark an [120]. Bei chronischem Asthma bestand ein erhöhter
IgG-Titer gegen C. pneumoniae [119, 121]. Jedoch zeigte eine placebokontrollierte
Interventionsstudie mit Roxithromycin keinen Effekt [122]. Zusammenfassend
scheinen besonders die persistierenden Chlamydieninfektionen ein Faktor für den
klinischen Verlauf der COPD zu sein, ihre pathogenetische Rolle ist Bestandteil
weiterer Untersuchungen.
3.3 Diagnostische Verfahren
3.3.1 Kultureller Nachweis
Der
kulturelle
Nachweis
von
Chlamydien
ist
Goldstandard
in
der
Chlamydiendiagnostik.
Allein über diese Methode lassen sich lebensfähige Keime nachweisen. Zur
Anwendung kommen geeignete Zelllinien, wie BGM (Buffalo Green Monkey Cells),
McCoy- bzw. HeLa-Linien und auch das bebrütete Hühnerei.
Verschiedene Chlamydienstämme sind hierbei jedoch sehr unterschiedlich schwer
anzüchtbar, so dass Befunde manchmal erst nach zwei bis sechs Wochen vorliegen [9].
Hierbei ist die Erfolgsquote abhängig von der Erregerzahl und schwankt erheblich.
31
3.3.2 Mikroskopische Nachweismethoden
C. trachomatis-EBs sind im Kulturmedium mit Iodine anfärbbar [56]. In der GiemsaFärbung
lassen
sich
in
Ausstrichpräparaten
von
Patienten
mit
Einschlusskonjunktividen intrazytoplasmatische Einschlüsse von C. trachomatis
finden [123]. Eine klassische Färbemethode in der Veterinärmedizin ist die GimenezFärbung [175] . Eine weitere einfache Färbemethode stellt auch die DNA-Markierung
mit 4’,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) dar, in welcher fluoreszenzmikroskopisch
intrazelluläre Einschlüsse zu erkennen sind [151].
3.3.3 Antigen Nachweismethoden
Immunofluoreszenz und Immunhistochemie sind Markierungsmethoden die recht
einfach durchzuführen sind, sich jedoch unterschiedlich in der Spezifität und
Sensitivität verhalten [9]. Meist werden hier LPS oder MOMPs markiert.
Die verwendeten monoklonalen bzw. polyklonalen Antikörper und Antiseren gegen
Chlamydien weisen häufig jedoch eine Kreuzreaktivität mit gram-negativen Bakterien
auf, so dass eine genaue Prüfung der Sensitivität als auch der Spezifität notwendig ist
[9]. Beim Antigennachweis von C. trachomatis im Vergleich zum kulturellen
Nachweis liegt die Spezifität bei 95% und die Sensitivität bei 50-100% [123].
3.3.4 Antikörpernachweis
Diese kommen meist in der klinischen Diagnostik zum Einsatz und stellen
serologische Methoden dar.
Der Antigen-ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ist eine Methode, bei
welchem chlamydiale Antigene an eine Festphase gebunden werden.
Sind Antikörper gegen diese Antigene im Serum vorhanden, so bildet sich an der
Festphase ein Komplex, der mit einem Sekundärantikörper markiert werden kann.
Die Komplementbindungsreaktion (KBR) stellt eine Möglichkeit dar, den
Komplementverbrauch gegen chlamydiale Antigen-Antikörper-Komplexe im Serum
quantitativ zu bestimmen.
32
Mikroimmunofluoreszenstests erlauben als zuverlässigstes Verfahren an gereinigte
Elementarkörperchen einen speziesspezifischen Antikörpernachweis und ermöglichen
des weiteren einzelne Titrationsstufen.
3.3.5 Molekularbiologische Methoden
Dies ist eine hoch spezifische und sensible Nachweismethode für Erreger-DNA oder RNA, welcher auf Nukleinsäureamplifikation wie der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) beruht.
Neben hoher Spezifität und Sensitivität zeichnet dieser Test sich auch durch
Schnelligkeit (ein Arbeitstag) aus [9]. In einem Vergleich von PCR, ELISA und Kultur
zeigte die PCR eine Sensitivität von 94.4% und damit eine 20,5 Prozentpunkte höhere
Sensitivität gegenüber der Kultur [124].
Eine weitere Methode zur Detektion und Identifizierung verschiedener
Chlamydienspezies stellt die Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung (FISH) dar. Diese
macht Gebrauch von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden die gegen spezifische
Nukleinsäuresequenzen gerichtet sind. Poppert et al. konstruierten und evaluierten
hierbei verschiedene Sets aus gegen 16S-rRNA gerichteten Oligonukleotiden zur
spezifischen Detektion von C. pneumonia, C. psittaci, C. trachomatis und den anderen
Vertretern der Gruppe der Chlamydiales [125].
Mygind et al. wiesen quantitativ eine gute Korrelation zwischen der PCR und der IHC
bei Formalin-fixierten experimentell infizierten Mäusen nach, indem sie die
zytoplasmatischen Einschlüsse in der IHC quantifizierten und mit der Menge an
Kopien der DNA in der PCR verglichen [126]. Hierbei handelte es sich jedoch um
akute Infektionen. Andere Untersucher berichten jedoch von schlechten Korrelationen
zwischen der PCR und der IHC und vermuten als mögliche Ursache hierfür den Effekt
von Formalin auf das Untersuchungsmaterial. Auch die Dauer der Infektion scheint
hierbei eine Rolle zu spielen. Während bei einer akuten Infektion Chlamydien-DNA in
der PCR problemlos nachgewiesen werden kann ist dies problematisch bei chronisch
persistierenden Infektionen. In diesem Fall zeigen Antigenmarkierungen eine höhere
Sensitivität [126].
33
4. Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Gewebematerial
Alle humanen Gewebeproben stammen aus dem Einsendungsmaterial des Institutes für
Pathologie der Ruhr-Universität Bochum im Zeitraum zwischen 1995 bis 2000.
Dabei handelt es sich um Lungengewebe von Patienten, die aufgrund einer
fortgeschrittenen Emphysemerkrankung in der Ruhrlandklinik, Essen-Heidhausen,
operiert wurden.
Zur Validierung der Antikörper stand experimentell mit C. pneumoniae infiziertes
humanes tumorfreies Lungengewebe aus Lobektomien oder Pneumektomien von
Patienten zur Verfügung, die wegen eines Lungenkarzinoms operiert wurden.
4.1.2 Operationsverfahren
4.1.2.1 Lungen-Volumen-Reduktions-Chirurgie
Lungen-Volumen-Reduktions-Chirurgie (LVR) stellt eine bilaterale Resektion von
zuvor mit hochauflösender Computertomographie (HRCT) und Perfusionsventilationsscintigraphie definierten Lungenarealen dar.
Auswahlkriterien umfassen eine Hyperinflation, dargestellt durch inspiratorische und
expiratorische HRCTs, ein fortgeschrittenes Emphysem und FEV1 >1,2 l oder ein
Erwartungswert von zwischen des FEV1 von 20-35%, eine totale Lungenkapazität von
>120% sowie ein Residualvolumen von >250%. Weitere Kriterien sind ausgeprägte
Dyspnoe, keine Besserung trotz optimaler Medikation und eine Abstinenz vom
Rauchen mit Rehabilitationspotential. Weisen Patienten diese Kriterien auf, profitieren
sie von einer solchen Operation in Form einer persistent verbesserten Lungenfunktion,
sowie bei präoperativ noch hohem FEV1 >30% von einer höheren Lebenserwartung
[127].
Obgleich zunächst A1ATM-Patienten in das OP-Programm mit eingeschlossen waren,
ergab sich jedoch für diese Gruppe kein langfristiges Benefit. So zeigte sich in den
34
Lungenfunktionstests für die A1ATM-Patienten nach der Operation zwar eine
signifikante Verbesserung, jedoch erreichten sie nach einem Zeitraum von 6-12
Monaten wieder ihre Ursprungswerte [128].
4.1.2.2 Bullektomie
Die Bullektomie ist ein Operationsverfahren bei dem die groß-bullösen
Emphysemareale der Lunge mit Bullae >3cm im Durchmesser reseziert werden.
Indikationen hierfür sind, dass (i) mehr als ein Drittel einer Lungenseite betroffen ist,
(ii) daß der Patient ein Rehabilitationspotential aufweist, (iii) daß die Lunge eine
normale Diffusionskapazität besitzt und (iv) dass die Lungenfunktion trotz optimaler
medikamentöser Therapie stark eingeschränkt ist. Ausgeschlossen sind solche
Patienten, die ein FEV1 <35% haben, sowie eine chronische Bronchitis, pulmonale
Hypertension oder andere schwerwiegende Krankheiten aufweisen [129].
4.1.3 Einbettung und Fixierung
Alle Operationsgewebe, ausgenommen das experimentell infizierte Lungengewebe
(sog. lebende Lungen), wurden in 4%iger phosphatgepufferter Formaldehydlösung
über mindestens 6 Stunden fixiert und in zehn Schritten von je 20 Minuten dehydriert.
Dies geschah mittels einer aufsteigenden Konzentrationsreihe von Alkohol (35%,
50%, 70%, 95%, 100%) und abschließendem zweimal 30-minütigem Bad in Xylol.
Anschließend wurden die Blöcke in Paraffinwachs (Tissuewax™, Medite GmbH,
Burgdorf, Deutschland) eingebettet. Das experimentell mit C. pneumoniae infizierte
Lungengewebe wurde in 3% Paraformaldehydlösung fixiert und nach gleichem
Verfahren wie die anderen Operationsgewebe dehydriert und eingebettet.Von allen
Gewebematerialien wurden mit einem Mikrotom (Microm GmbH, Walldorf,
Deutschland) 3-5 µm dicke Schnitte angefertigt und auf hochgereinigten Objektträgern
(SuperFrost®, Glaswerk Menzel, Braunschweig, Deutschland) aufgezogen.
35
4.1.4 Kohorteneinteilung
Es wurden drei Gruppen definiert, das (i) Alpha1-Antitrypsinmangel-Emphysem
(A1ATM-E.; n=12), das (ii) Non-A1ATM-Emphysem (Non-A1ATM-E.; n=47) und
(iii) das großbullöse Emphysem (GB. E.; n=15) .
4.1.5 Negativkontrollen
Als Negativkontrollen (n=10) diente Eingangsmaterial des Institutes für Pathologie der
Ruhr-Universität Bochum im Zeitraum zwischen 1999 und 2001 von Patienten, bei
denen auf Grund eines Chondrohamartoms eine Keilresektion in der Ruhrlandklinik,
Essen-Heidhausen, durchgeführt wurde. Hierbei handelt es sich um einen soliden
abgekapselten gutartigen Tumor, der meist als peripherer Rundherd imponiert [130].
Die Patienten waren Nichtraucher und das Gewebe zeigte keine Bronchiolitis.
Die Resektate wurden, ebenso wie das Untersuchungsmaterial aus den LVRs, in 4%
phosphatgepufferte Formalinlösung fixiert, dehydriert und in Paraffinwachs
eingebettet.
PCR- und TEM-Untersuchungen waren bei diesem Gewebe negativ für Chlamydien
ausgefallen.
4.2 Methoden
4.2.1 Immunhistochemische Methoden
Die Immunhistochemie nutzt spezifische Bindungen von Antikörpern an bestimmte
Antigene bzw. deren Epitope um diese nachzuweisen.
Als Epitop wird eine Aminosäuresequenz von 5-10 Aminosäuren bezeichnet. Gegen
diese Antigenbindungsstellen ist der eingesetzte Antikörper gerichtet.
Es gibt direkte und indirekte immunhistochemische-Methoden. Bei der direkten
Methode werden die Antikörper direkt mit einem Markermolekül gekoppelt. Das
Markermolekül kann entweder ein fluoreszierender Farbstoff oder ein Enzym sein
welches eine Indikatorreaktion durchführt.
36
Bei der indirekten Methode muss es neben dem Primärantikörper noch einen
Sekundärantikörper geben, welcher wiederum entweder ein Markermolekül trägt, oder
einen mit Markermolekülen besetzten dritten Komplex binden kann (Bridge
Antibody).
Der Vorteil der indirekten immunhistochemischen Methode ist die Signalverstärkung
(Amplifikation), die dadurch zustande kommt dass pro Primärbindung nun mehr
Markermoleküle zur Verfügung stehen [131].
Zur
Darstellung
möglicher
Chlamydienantigene
wurden
die
(i) Alkalische-Phosphatase-Methode unter Verwendung des Dako LSAB®+ Kits
(Dako, Hamburg, Deutschland), (ii) Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Methode unter
Verwendung des Zymed® LAB-SA System Histostain®-SP (Peroxidase) Bulk Kits
(San Francisco, USA) sowie (iii) die indirekte Immunofluoreszenzmethode (IF)
eingesetzt.
Zusätzlich wurden noch andere Zellstrukturen in der IF mit (iv) weiteren Antikörpern,
(v) DNA-Farbstoffen oder (vi) Lektinen markiert.
I.
Die Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase Methode (APAAP
Methode): Dako® Fuchsin + Substrat-Chromogen-System
In der APAAP-Methode sind zwei Enzymmoleküle an jeweils einen Antikörper
gebunden. Auf diese Weise zeigt sie eine höhere Sensitivität gegenüber anderen
Testmethoden, da pro Antigeneinheit eine größere Anzahl an Enzymmolekülen zur
Verfügung steht. Bei dieser Methode bindet zunächst der unkonjugierte
Primärantikörper an das Antigen im Gewebe. Anschließend wird ein unkonjugierter
Sekundärantikörper (1), der gegen das Fc-Fragment des Primärantikörpers gerichtet
ist, aufgetragen. Über den einen Fab-Arm wird der Primärantikörper gebunden, der
andere Fab-Arm dient der Anlagerung des Antikörpers aus dem EnzymImmunkomplex. Im dritten Reaktionsschritt werden lösliche Enzym-antiEnzymkomplexe hinzugegeben (2).
Die Reaktion wird mit einer Fuchsin-Chromogen-Reaktion abgeschlossen (3).
37
Alkalische Phosphatase (2)
APAAP-Komplex (2)
Sekundär (= Brücken)
Antikörper (1)
Primärantikörper
Gewebeantigen
Abb. 4: Schematische Darstellung der APAAP-Methode. ( Tobias Bexten 2006)
1. LSAB®+ AP Link Universal biotinylierte Anti-Rabbit-, Anti-Mouse- und AntiGoat-Immunglobuline in PNS
2. LSAB®+ AP Streptavidin AP, Streptavidin konjugiert mit alkalischer
Phosphatase in Tris gepufferter Salzlösung (TBS)
3. Fuchsin + Chromogen in HCL + Aktivierungslösung (nicht in Abb. 4
dargestellt)
II. Die Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Methode (ABC-Methode):
In der Biotin-Streptavidin-Peroxidase-Methode wird die hohe Affinität von
Streptavidin zu Biotin genutzt.
Zunächst bindet wieder der unkonjugierte Primärantikörper an das Gewebeantigen. Als
Sekundärantikörper wird ein biotinylierter Antikörper eingesetzt, der gegen das FcFragment des Primärantikörpers gerichtet ist. Als drittes Reagenz wird ein
Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex aufgetragen, der auf Grund der hohen
38
Affinität von Streptavidin zu Biotin an den biotinylierten sekundären Antikörper
bindet. Die Färbung wird durch eine Chromogen-Peroxid-Reaktion abgeschlossen.
Biotinylierter Sekundärantikörper (1)
Primärantikörper
Antigen
Biotin
Peroxidase (2)
Streptavidin (2)
Abb.5: Schematische Darstellung der ABC-Methode. ( Tobias Bexten 2006)
1. Zymed® LAB-SA System Botinylierter sekundärer Antikörper Goat-Anti(Mouse-, Rabbit-, Guinea Pig- and Rat-) IgG
2. Zymed® LAB-SA System Streptavidin-Peroxidase-Konjugat
4.2.2 Immunofluoreszenzmethode (IF-Methode)
Eine der wichtigsten lichtmikroskopischen Techniken zur Charakterisierung von
zellulären Strukturen (z. B. Zellkern, Lysosomen, Zytoskelett), aber auch zur
Darstellung von zellfremden Antigenen ist die Immunofluoreszenz. Grundlage der
Immunofluoreszenz ist wieder die Bindungseigenschaft eines Primärantikörpers gegen
ein Antigen.
Man unterscheidet die direkte Immunofluoreszenz und die indirekte
Immunofluoreszenz. Bei der direkten Immunofluoreszenz ist der Antikörper, der das
Zielantigen spezifisch erkennt direkt mit einem fluoreszierenden Farbstoff
39
(Fluorochrom) gekoppelt. In der indirekten Immunofluoreszenzmethode bindet zuerst
der Primärantikörper an das Zielantigen und in einem zweiten Schritt wird der
gebildete Antigen-Antikörperkomplex mit einem zweiten, fluorochromgekoppelten
Antikörper detektiert.
Fluorochrome sind Moleküle, die durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt
werden, was bedeutet, dass ihre Elektronen auf ein höheres Energieniveau gehoben
werden. Unter Emission von Licht einer spezifischen Wellenlänge (längerwellig als
die Anregungs-Wellenlänge) gelangen die angeregten Elektronen wieder auf ihr
ursprüngliches Energieniveau zurück. Zwei der am häufigsten verwendeten
Fluoreszenzfarbstoffe sind Fluorescein, das gelb-grünes Licht emittiert, wenn es von
blauem Licht angeregt wird und Rhodamin, das rot fluoresziert, wenn es mit grüngelbem Licht angeregt wird. Dieses emittierte Licht wird in dem
Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Zur Durchführung wurde ein inverses IX-70
(Olympus Europa GmbH, Hamburg, Deutschland) mit entsprechenden
wellenlängenspezifischen Filterblöcken (AHF-Analysentechnik, Tübingen,
Deutschland) eingesetzt.
Lektine sind komplexe Glykoproteine oder Kohlenhydrate, meist pflanzlichen
Ursprungs, die sich spezifisch an selektive Kohlenhydratgruppen von Zelloberflächen
bzw. Zellmembranen binden können. Lektine werden mit Fluorochromen markiert und
können in Kombination mit Immunofluorenzenz-Antikörpern als Doppel/Dreifachmarkierung eingesetzt werden.
40
4.2.3 Verwendete Primärantikörper
In der APAAP-, und ABC Methode verwendete Antikörper:
1.1 Mouse-Anti-Chlamydia psittaci; (Biotrend® Chemikalien GmbH; Köln,
Deutschland)
1.2 Rabbit-Anti-Chlamydia-LPS; (Biodesign international®; Asbach, Deutschland)
1.3 Rabbit-Anti-CK-Pan; (Bio Genex®; San Ramon, USA)
1.4 Mouse-Anti-CK-Pan; (Biocare Medical®; Walnut Creek, USA)
1.5 Rabbit-Anti-Calreticulin; (Sigma®; Deisenhofen, Deutschalnd)
In der Immunofluoreszenz verwendete Primärantikörper und Lektine:
2.1 Mouse-Anti-Chlamydia psittaci; (Biotrend® Chemikalien GmbH; Köln,
Deutschland)
2.2 Rabbit-Anti-Chlamydia-LPS; (Biodesign international®; Asbach, Deutschland)
2.3 Mouse-Anti-CD68; (Dako®; Hamburg, Deutschland)
2.4 Mouse-Anti-Aktin; (Bio Genex®; San Ramon, USA)
2.5 Mouse-Anti-LCA; (Dako®; Hamburg, Deutschland)
2.6 Mouse-Anti-CK-Pan; (Biocare Medical®; Walnut Creek, USA)
2.7 LEA-F-FITC (Lycopersicon esculentum-Agglutinin) (Sigma®; Deisenhofen,
Deutschland)
2.8 ConA-Alexa-488 (grünfluoreszierend) (Canavalia ensiformis ) (Sigma®;
Deisenhofen, Deutschalnd)
Erläuterungen zu den eingesetzten Primärantikörpern:
1.1 und 2.1: Bei dem Mouse-Anti-Chlamydia psittaci-Antikörper handelt es sich
um einen Chlamydia psittaci-spezifischen Ak (Clone 73/0200; IgG2b-Subklasse)
ohne Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydienspezies [laut Datenblatt im ELISA
oder Western Blot getestet]
41
1.2 und 2.2: Bei dem Rabbit-Anti-Chlamydia-LPS-Antikörper handelt es sich um
einen Ak, der gegen Chlamydien-LPS und einige MOMPs reaktiv ist.
Er ist gruppenspezifisch gegen alle Chlamydiacae.
1.3, 1.4 und 2.6: Bei den Mouse- bzw. Rabbit-anti-CK Pan-Antikörpern handelt es
sich um einen Ak (Subklasse IgG1), der gegen das Zytokeratingerüst der
epthelialen Zellen reagiert und insbesondere der Kontrolle für die
Mikrowellenvorbehandlung diente.
1.5: Der Rabbit-Anti-Calreticulin-Antikörper ist ein polyklonaler sensitiver Marker
welcher gegen Calreticulin gerichtet ist. Calreticulin ist ein calciumbindendes
Protein und kommt vornehmlich im endoplasmatischen Retikulum, insbesondere
der Muskelzellen, vor.
Der Antikörper markiert in erster Linie Myozyten und wurde ebenfalls in der APund ABC- als Kontrolle für den Erfolg des Versuches eingesetzt.
2.3: Bei dem Mouse-Anti-CD68-Antikörper handelt es sich um einen Antikörper
(Subklasse IgG1) der gegen humane Makrophagen gerichtet ist.
2.4: Der Mouse-Anti-Aktin-Antikörper ist gegen die Aktinfilamente der glatten
Muskulatur gerichtet.
2.5: Mit dem Mouse-Anti-LCA-Antikörper werden Leukozyten markiert. LCA
steht hierbei für “Leukocyte Common Antigen” (CD 45).
2.7: Bei LEA-F-FITC handelt es sich um ein Lektin, das genutzt wurde, um die
Oberfläche des Alveolarepithel zu markieren [132].
2.8: Das Lektin ConA bindet spezifisch an Mannose und Glucose und wurde
genutzt um Makrophagen zu markieren [133].
4.2.4 Durchführung der Färbungen
1. Entparaffinierung:
Das Entparaffinieren der Präparate ist bei allen verwendeten Methoden in gleicher
Weise durchgeführt worden. Hierbei wurde mit Xylol und einer absteigenden
Konzentrationsreihe von Ethanol gearbeitet.
-1. 50 min. Einstellen der Präparate in Xylol
-2. 10 min. Einstellen der Präparate in 100% Ethanol
42
-3. 10 min. Einstellen der Präparate in 95% Ethanol
-4. 10 min. Einstellen der Präparate in 70% Ethanol
-5. 10 min. Einstellen der Präparate in 50% Ethanol
-6. 10 min. Einstellen der Präparate in 30% Ethanol
-7. 10 min. Einstellen der Präparate in Aqua dest.
-8. 20 min. spülen der Präparate in PBS
Bei dem PBS handelt es sich um eine Phosphat gepufferte-NaCl Lösung (Sigma®;
Deisenhofen, Deutschland)
Vorbehandlung und Färbung der Untersuchungsgewebe nach der ABC-Methode
1. Alle entparaffinierten Präparate wurden zunächst 3 x 5 min. in der Mikrowelle
bei 600 Watt in einem Citratbad (9ml 0,01 M Zitronensäure und 41ml 0,1M
Natriumcitrat auf 500ml mit Aqua dest anfüllen) erhitzt. Hierbei wurde darauf
geachtet, dass die Citratlösung jeweils nur kurz zu sieden begann.
Gegebenenfalls wurde das Erhitzen kurz unterbrochen nicht jedoch verkürzt.
2. Präparate 20 min. abkühlen lassen und 10 min. in PBS spülen.
3. Alle Präparate 20 min. in einer 1,8%-H2O2 Lösung einstellen. Dadurch wird die
endogene Peroxidase der Zellen abgesättigt und so keine unspezifischen
Reaktionen mit dem Endsubstrat ermöglicht.
4. 10 min. spülen in PBS
5. Ansetzen der Blockierungslösung (2% Slim Fast® + Goat-Normalserum in
einer 1 zu 50 Verdünnung in PBS)
6. Umkreisen des Gewebes mit einem Fettstift, anschließend den Objektträger in
einer feuchten Kammer ablegen.
7. Zuvor angesetzte Blockierungslösung aufbringen und 30. min bei RT
inkubieren lassen.
8. 10 min. spülen in PBS
9. erstes Reagenz des Zymed® LAB-SA Systems (10% Non-Immune-GoatSerum) aufbringen und 10 min. inkubieren.
10. Primärantikörper aufbringen (ca. 200µl pro Schnitt) und 60 min. bei 37°C
inkubieren lassen.
43
11. 10 min. spülen in PBS
12. zweites Reagenz des Zymed® LAB-SA System (Biotinylierter sekundärerAntikörper Goat-Anti- (Mouse-, Rabbit-, Guinea Pig- and Rat-) IgG)
13. 10 min. spülen in PBS
14. drittes Reagenz des Zymed® LAB-SA System (Streptavidin-PeroxidaseKonjugat) aufbringen und 10 min. inkubieren lassen.
15. viertes Reagenz des Zymed® LAB-SA System ansetzen (auf 1ml Aqua je ein
Tr. von A (Substratpuffer), B (Chromogenlösung) und C (HydrogenperoxidLösung (kanzerogen))
16. 10 min. spülen in PBS
17. viertes zuvor angesetztes Reagenz des Zymed® LAB-SA System auftragen und
10 min. inkubieren
18. 10 min. spülen in PBS
Abschließend werden alle Präparate mit Hematoxilin Blau (Merck; Darmstadt,
Deutschland) kerngefärbt (ca. 20 sek.), anschließend kräftig gespült (kein direkter
Wasserstrahl) und mit Kaisers Glyceringelatine (Merck; Darmstadt, Deutschland) und
einem Deckglas versiegelt.
Vorbehandlung
und
Färbung
der
Untersuchungsgewebe
nach
der
Immunofluoreszenzmethode
1. Nach Entparaffinisierung und Spülung der Präparate in PBS umkreisen des
Gewebes mit einem Fettstift, anschließend den Objektträger in einer feuchten
Kammer ablegen.
2. Aufbringen der Lektine (1 zu 50 Verdünnung) und Inkubation bei 4°C für 10h
3. 10 min. spülen mit PBS
4. Ansetzen der Blockierungslösung (2% Slim Fast® + Goat-Normalserum in
einer 1 zu 50 Verdünnung in PBS)
5. Blockierungslösung aufbringen und 30 min. bei RT inkubieren lassen
6. 10 min. spülen mit PBS
7. Primärantikörper aufbringen (ca. 200µl pro Schnitt) und 10h bei 4°C
inkubieren lassen
44
8. 10 min. spülen mit PBS
9. Sekundärantikörper 60 min. bei 37°C inkubieren lassen
10. 10 min. spülen mit PBS
Zum Abschluss werden alle Präparate mit DAPI (4`-6-Diamidino-2-Phenylindol)Kernfärbung (Sigma®; Deisenhofen, Deutschland) bei einer Konzentration von 0,11µg/ml PBS für 30 min. bei 37°C gefärbt, mit PBS gespült und mit Kaisers
Glyceringelatine und einem Deckglas versiegelt.
Darstellung und Erläuterung eines Versuchsaufbaus der ABC-Methode sowie der IFMethode
ABC-Methode
Objektträger
Primär Ak (Schritt 9)
Konzentration
1
2
3
4
5
Nur PBS
PBS+Substrat
Strept.+Substrat
Mouse-Anti-CK-Pan
Mouse-Anti-C. psittaci
1 zu 50 in PBS
1 zu 500 in PBS
Mikroskopische Kontrolle des Objektträger 1 stellt sicher, dass keine unspezifischen
Anfärbungen durch gewebeeigene Chromogene enstehen.
Mikroskopische Kontrolle des Objektträger 2 dient der Kontrolle auf ausreichende
Blockierung der endogenen (im Gewebe enthaltenen) Enzyme bzw. zwischen Gewebe
und Substrat durch noch vorhandene endogene Peroxidase.
Mikroskopische Kontrolle des Objektträgers 3 stellt sicher, dass endogenes Biotin
genügend blockiert ist.
Mikroskopische Kontrolle des Objektträgers 4 zeigt, ob die
Mirkrowellenvorbehandlung funktioniert hat.
Objektträger 5 stellt schließlich die Markierung der Chlamydienantigene dar.
45
Immunofluoreszenzmethode
Schnitt
1
2
Primärantikörper
PBS
PBS
Konzentration
3
Ms-Anti-CD68 + Ms-Anti-C. psittaci
1 zu 50 + 1 zu 500
4
Rb-Anti-Aktin + Ms-Anti-C. psittaci
1 zu 50 + 1 zu 500
5
Ms-Anti-LCA + Ms-Anti-C. psittaci
1 zu 50 + 1 zu 500
6
Ms-Anti-CK Pan + Ms-Anti-C.
psittaci
MPA-T + Ms-Anti-C. psittaci
Rb-Anti-C. LPS + Ms-Anti-C.
psittaci
1 zu 50 + 1 zu 500
7
8
1 zu 50 + 1 zu 500
1 zu 500 + 1 zu 500
Sekundärantikörper
Goat-Anti-Ms-IgG2b +
Goat-Anti-Ms-IgG1
Goat-Anti-Ms-IgG2b +
Goat-Anti-Ms-IgG1
Goat-Anti-Rb-Fab2 +
Goat-Anti-Ms-IgG1
Goat-Anti-Ms-IgG2b +
Goat-Anti-Ms-IgG1
Goat-Anti-Ms-IgG2b +
Goat-Anti-Ms-IgG1
Goat-Anti-Ms-IgG2b
Goat-Anti-Ms-IgG2b +
Goat-Anti-Rb
Mikroskopische Kontrolle des Objektträger 1 stellt eine Vergleichsmöglichkeit mit der
Eigenfluoreszenz des Gewebes bzw. formalin-induzierten Fluoreszenz dar.
Mikroskopische Kontrolle des Objektträger 2 soll Sicherheit geben, ob der
Sekundärantikörper bereits im Gewebe unspezifische Bindungen aufweist.
Mikroskopisch zeigt Objektträger 3 eine Doppelmarkierung der Makrophagen als auch
der C. psittaci-Ag. und ermöglicht eine spezifische Auszählung.
Mikroskopische Kontrolle des Objektträger 4 ermöglicht eine Bewertung der
Anwesenheit von C. psittaci-Antigenen in Myozyten.
Mikroskopisch zeigt Objektträger 5 eine Doppelmarkierung der Lymphozyten und C.
psittaci-Ag.
Mikroskopisch zeigt Objektträger 6 markierte Epithelzellen, besonders bronchioläre
Epithelzellen sowie C. psittaci-Ag.
Mikroskopische Kontrolle des Objektträger 7 erlaubt die spezifische Betrachtung von
Pneumozyten Typ 2 und C. psittaci-Ag.
Mit Hilfe mikroskopischer Kontrolle des Objektträger 8 kann eine mögliche
Doppelinfektion gezeigt werden.
46
4.2.5 Etablierung der Färbemethoden
4.2.5.1 Etablierung der immunhistochemischen Färbemethoden
Ziel der Etablierung der immunohistochemischen Färbemethode war es, ein Protokoll
zu entwickeln, das sowohl sensitiv für Chlamydienantigene ist, als auch keine
unspezifischen Reaktionen oder Bindungen zulässt.
In einer ersten Versuchsreihe wurden die Seren der Ursprungstiere der
Primärantikörper darauf getestet, ob in ihnen befindliche Immunglobuline Bindungen
mit Antigenen des humanen Lungengewebes eingehen, welches zu unspezifischen
Markierungen führen könnte. Hierzu wurde die APAAP-Methode genutzt und
gesehen, dass ohne Vorbehandlung das gesamte Präparat unspezifische Markierungen
aufweist.
Abb.6: Lungengewebe einer Chondrohamartomresektion. Die Färbung zeigte eine
unspezifischen Rotfärbung des gesamten Lungengewebes. [APAAP-Methode, MouseNormalserum, 400x]
Um unspezifische Bindungsstellen im Präparat zu blockieren, wurden die Präparate
nach Entparaffinisierung mit bovinem Serumalbumin (BSA) in variierenden
47
Konzentrationen (5 – 50% w/v) sowie variierenden Zeiten (30 und 60 min bei
Raumtemperatur bzw. 10h bei 4°C) vorinkubiert.
Weiterhin kamen für die Blockierung zum Einsatz: Esel-Normal-Serum
(Konzentrationen 1 zu 500 bis 1 zu 10 ; 30min bei Raumtemperatur (RT)) sowie
Trypsin. Hierbei traten jedoch weiterhin ungewollte Markierungen auf.
In einer zweiten Versuchsreihe wurde mit der ABC-Methode gearbeitet. Auch bei
dieser wurden verschiedene Blockierungsmethoden kombiniert sowie verschiedene
Inkubationszeiten und -temperaturen getestet. Schließlich wurden bei einer
Blockierung mit 2% Slim Fast® in PBS mit Ziegen-Normalserum in einer 1 zu 50
Verdünnung in PBS bei 30 min. Inkubationszeit bei RT keine ungewollten Markierung
mehr lichtmikroskopisch erkennbar. Bis zu diesem Punkt wurden alle Versuche mit
Normalseren an Chondrohamartomfällen durchgeführt.
In einer dritten Versuchsreihe wurden die Primärantikörper Mouse-Anti-C. psittaci
bzw. Rabbit-Anti-Chlamydia-LPS in der ABC-Methode ausgetestet. Es wurden die
Protokolle genutzt, die bereits für die Normalseren etabliert waren. Auch hierbei kam
Gewebe von Chondroharmatomfällen zum Einsatz, welches bereits in der PCR und
TEM für Chlamydien negativ war. Ziel dieser Reihe war es sicher zu stellen, dass die
Primärantikörper Mouse-Anti-C. psittaci bzw. Rabbit-Anti-Chlamydia-LPS unter der
etablierten Methode keine falsch positiven Markierungen verursachten. Es traten
keine unspezifischen Markierungen auf (Abb. 9).
48
Abb.7: Lungengewebe einer Chondrohamartomresektion. Zu sehen
sind einzelne Staubablagerungen. [ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x]
Da nun die Primärantikörper in Fällen, die auf Chlamydien in der PCR und der
transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung negativ getestet waren auch
keine Bindungen eingingen, wurden diese nun in einer vierten Versuchsreihe an Fällen
nach gleichem Protokoll ausgetestet, die in der PCR und TEM für Chlamydien positiv
waren. Hierbei traten zunächst keine Markierungen von chlamydialen Einschlüssen
auf. Da die Präparate jedoch mit anderen Methoden für Chlamydien positiv getestet
waren, schien es, dass die Sensitivität des benutzten Protokolls nicht hoch genug war.
49
Um diese zu steigern wurde die Inkubationszeit des Primärantikörpers verlängert ( von
30 auf 60 min. bei RT) sowie die Präparate in der Mikrowelle in einem Citratpuffer zu
3 x 5 min. erhitzt. Die Erhitzung in einem Citratpuffer führte zur Demaskierung der
chlamydialen Antikörperbindungsstellen und führte schließlich zum gewünschten
Erfolg. Gleichzeitig wurde dieses Protokoll nocheinmal an zwei PCR- und TEMnegativen Chondrohamartomfällen getestet, ohne das unspezifische bindungen
auftraten.
Abb.8: Non-A1ATM-E. Anfärbung einiger bronchiolärer Epthelzellen. [ABC-Methode,
Mouse-Anti-C. psittaci, 400x]
50
Unter Verwendung der ABC-Methode wurde ein Antikörper gegen das
Zytokeratingerüst, in erster Linie das der bronchiolären Epithelzellen sowie der
Pneumozyten Typ 2 eingesetzt. Diese Färbung stellt insbesondere eine Möglichkeit dar
zu testen, ob die Demaskierung mit Citratpuffer funktioniert hat, da ohne
Citratpuffervorbehandlung die Zytokeratine mit dem verwendeten Antikörper bei
Formalinfixierung durch Antigenmaskierung nicht anfärbbar wären. Gleichzeitig ist
aber auch bei Anfärbung sichergestellt, dass das Zymed® LAB-SA Kit funktioniert hat.
Abb.9: Non-A1ATM-E. Positivkontrolle für das Funktionieren der Demaskierung sowie der
Sekundärantikörper als auch der Peroxidase-Reaktion. Angefärbt sind hier das
Zytokeratingerüst der bronchiolären Epithelzellen sowie das der Pneumozyten Typ 2.
Weiterhin ist eine feingranuläre rote Markierung in den Erythrozyten zu erkennen, die auf
endogene Peroxidasen zurückzuführen ist. [ABC-Methode, Mouse-Anti-CK pan, 400x]
51
4.2.5.2 Etablierung der Immunofluoreszenz-Methode
Das für die Immunhistochemie etablierte Protokoll wurde auch zur Vorbehandlung der
Präparate für die Immunofluoreszenz angewandt, bei dem sich die Inkubationszeiten
der Primärantikörper als zu kurz erwiesen und neu etabliert werden mussten.
Bei einer Inkubationszeit von 10h bei 4°C führte sie zum gewünschten Erfolg.
3
1
2
Abb. 10: A1ATM-E. Perinukleäre Einschlüsse (1) (rot dargestellt), C. psittaci-Ag. positiv
sind. Weiterhin ist auch erkennbar, dass neben der Hintergrundfluoreszenz (2), die sich
fadenförmig im unteren Bildbereich zum Alveolarlumen gerichtet darstellt, weitaus
feinkörnigere Markierungen in den Makrophagen (3) (s. auch Abb. 31) zu sehen sind. [CLSM,
Mouse-Anti-C. psittaci (rot), 1800x].
52
4.2.6 Validierung des Antikörpers
Der verwendete Primärantikörper ist ein monoklonaler Mouse-Anti-C. psittaci
Antikörper der Firma Biotrend®, Köln. Nach Angaben des Herstellers besitzt er keine
Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydienspezies, insbesondere nicht mit C.
pneumoniae. Dennoch wurde Mouse-Anti-C. psittaci-Ak in der IHC an experimentell
infiziertem Lungengewebe auf seine Spezifität getestet.
Dieses operativ gewonnene Lungengewebe wurde zunächst als so genannte “Lebende
Lunge” mit 37°C warmer Agaroselösung (0,75% Sigma; Deisenhofen, Germany) über
die Bronchien aufgefüllt und nach der Krumdieck-Technik vorbereitet [104].
Entsprechende Schnitte, sog. Precision Cut Lung Slices (PLCS) wurden darauf mit C.
pneumoniae Stamm MUL 250 (freundlicherweise von Prof. Dr. Maass, Institut für
Medizinische Mikrobiologie, MU Lübeck zur Verfügung gestellt) infiziert und nach
12, 20, 40 Stunden in 3% Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Das weitere Vorgehen glich
den Färbungen der anderen Untersuchungsgewebe. Die gefärbten oder markierten
Schnitte wurden daraufhin mikroskopisch beurteilt.
Eine weitere Möglichkeit der Validierung des Primärantikörpers ist es, in der IF das
Existenz von verschiedenen C.-Spezies innerhalb eines Schnittes nachzuweisen. Der
Mouse-Anti-C. psittaci-Ak darf hierbei zumindest in einigen Zellen keine Bindung
eingehen, in denen ein gruppenspezifischer aber speziesunspezifischer Mouse-Anti-C.LPS-Ak jedoch Antigene von anderen Chlamydienspezies nachweist.
4.2.7 Mikroskopische Verfahren
4.2.7.1 Durchlichtmikroskopie
Zur Durchlichtmikroskopie wurde ein Zeiss Axiophot Mikroskop (Carl Zeiss;
Oberkochen, Germany) mit einem “digital imaging system” (Diskus Software;
Königswinter, Germany) eingesetzt
53
4.2.7.2 Fluoreszenzmikroskopie
Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde ein Olympus IX 70 (Olympus; Hamburg,
Germany) Mikroskop eingesetzt.
Wie die heute gebräuchlichen Fluoreszenzmikroskope arbeitet es nach dem Prinzip der
Auflichtmikroskopie. Hierbei wird das Präparat (6) durch das Objektiv (2), welches
gleichzeitig als Kondensor fungiert, beleuchtet.
5.
4.
Lichtquelle
3.
1.
2.
6.
Abb. 11: Funktionsweise der Fluoreszenzmikroskopie
( Tobias Bexten 2006)
Einzelne Filter steuern hierbei, welche Wellenlängen als Anregungslicht eingesetzt
werden und welche emmitiertenWellenlängen zum Okular (5) durchkommen. In dieser
Einstellung transmittiert der erste Filter (1) nur blaues Licht mit einer Wellenlänge
zwischen 450 und 490 nm. Der dichromatische Spiegel (3) reflektiert Licht unter einer
Wellenlänge von 510nm, transmittiert jedoch Licht über 510nm welches von dem
54
Fluorochrom emmitiert wurde. Filter 4 stellt eine Barriere für das Licht dar, das
außerhalb des Wellenlängenbereiches von grünem Licht ist. Die entsprechenden
sinnvollen Filterkombinationen werden in Blöcken zusammengesetzt, die sich mit
einem Revolver austauschen lassen.
4.2.7.3 Konfokale Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM)
Die Laser-Raster-Mikroskopie wurde mit einem BioRad® Radiance 2100 unter
Verwendung der Software Lasersharp 2000 (freundlicher Weise von Prof. Cuvelier,
Abteilung für Pathologie Universität Gent/Belgien zur Verfügung gestellt)
durchgeführt.
Bei der Konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie handelt es sich um ein Verfahren mit
dem eine Auflösung in der Horizontalen (x) und in der Vertikalen (y) von 0.2µm
erreicht wird, sowie in der dritten Raumrichtung (z) von 0.50µm [1]. Da chlamydiale
Elementarkörperchen diese Größe knapp überschreiten (0.3µm) ist eine sehr genaue
Darstellung möglich.
Funktionsweise des CLSM
1955 entwickelte Marvin Minski das erste konfokale Mikroskop mit dem er
biologische Abläufe in ihrer Entstehung darstellen wollte.
Seine Erneuerung im Vergleich zum Auflichtmikroskop war es, zwei Blenden so
einzusetzen, dass er OUT OF FOCUS Strahlen eliminieren konnte (Abb. 1).
Als Lichtquelle werden heute Laser eingesetzt, die als punktförmige Lichtquelle die
Entstehung von Streustrahlung vermindern und dezidierte Anregungswellenlängen zur
Verfügung stellen.
Zum Scannen des Präparates kann der Laserstrahl sowohl auf der XY-Ebene als auch
in Z-Richtung fokussiert werden [135]
Dies erlaubt sowohl eine Darstellung einer einzelnen optischen Sektion in der XYEbene als auch eine Serie optischer Sektionen in Z-Richtung, mit der 3DRekonstruktionen möglich werden.
Es ergeben sich also im Vergleich zur Auflichtmikroskopie Vorteile durch eine bessere
Kontrastierung, verminderte Streustrahlung, isbesonder bei sehr dicken Präparaten,
sowie die Möglichkeit zur 3-Dimensionalen Darstellung [136].
55
Abb. 12: Funktionsweise des CLSM ( Tobias Bexten 2006)
4.2.8 Auswertung
Alle Markierungen wurden nach oben genannten Kriterien durchgeführt und
untersucht um sicherzustellen, dass bei den einzelnen Versuchen keine unspezifischen
Anfärbungen eingetreten sind.
Weiterhin wurden alle Fälle des großbullösen Emphysems, sowie des diffusen
Emphysems, des A1ATM-Emphysems und der Negativkontrollen in der IHC nach der
ABC-Methode gefärbt.
Als C. psittaci-Ag.-positiv wurden solche Fälle angesehen, welche in mindestens zwei
Gesichtsfeldern deutliche intrazelluläre Markierungen aufwiesen. Alle markierten
bronchiolären Epithelzellen, Pneumozyten Typ 2, Lymphozyten und Makrophagen
56
wurden in jeweils 5 Gesichtsfeldern (High Power Fields = HPF) bei einer
Vergrößerung von 400x ausgezählt und der Gesamtzahl des jeweiligen Zelltyps pro
HPF zugeordnet.
Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 11,5 (SPSS Inc.; Chicago, USA) sowie
Microsoft® Excel X for Mac® (Mircrosoft®; Redmond, USA) unter Verwendung des
Mann-Whitney-U-Test sowie des Spearman-Test für mögliche Korrelationen
durchgeführt.
5. Ergebnisse
5.1
Validierung des Primärantikörpers
Lungengewebe, welches unter Anwendung der Krumdieck-Technik mit C .
pneumoniae infiziert wurde, diente zur Validierung des Antikörpers (s. S. 52-53)
[134].
Dieses Gewebe zeigte bereits an uninfizierten Kontrollschnitten eine C. psittaci-Ag.
Markierung. Lichtmikroskopisch war nach 24-stündiger Inkubation eine erhöhte
Anzahl an Zellen C.-Spezies-unspezifisch positiv markiert, während die Anzahl C.
psittaci-Ag. markierter Zellen gleich blieb.
Desweiteren wurde eine Doppelmarkierung in der Immunofluoreszenz vorgenommen,
um mikroskopisch die Spezifität des Antikörpers zu testen. Hierbei zeigte sich eine
allgemein stärkere intrazelluläre Markierung mit C.-LPS und nur partielle
Kolokalisation mit C. psittaci. Die einzelnen Zielzellen zeigten hierbei für C. psittaci
ein inhomogenes Verteilungsmuster mit einzelnen Infektionsherden.
57
3.
2.
1.
1
Abb. 13.1: Non-A1ATM-E. Doppelmarkierung von C. psittaci-Ag. (rot) sowie C.-LPS (grün).
In Zelle 1. sieht man sowohl C. psittaci-Antigenspots (rot) als auch C.-LPS-Antigenspots.
Zellen 2. und 3. weisen deutlich abgrenzbare C.-LPS-Antigenspots auf, welche nicht mit dem
Mouse-Anti-C. psittaci-Ak markiert sind. [CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und RabbitAnti-C.-LPS (grün), 1200x]
58
3
2
3
2
1
Abb. 13.2: Non-A1ATM-E.
1
Abb. 13.3: Non-A1ATM-E.
Entspricht Abb. 38.1 Farbkanäle grün und rot sind getrennt dargestellt, um die Einzelfärbung
besser beurteilen zu können.[CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und Rabbit-Anti-ChlamydiaLPS (grün); 1200x]
5.2 Licht- und Immunofluoreszenzmikroskopie
C. psittaci-Ag. konnten prinzipiell in bronchiolären Epithelzellen, Pneumozyten Typ 2,
Makrophagen/Monozyten sowie Lymphozyten aller Emphysemtypen gefunden
werden. Der Beschreibung der einzelnen Zielzellen folgt dann ein Vergleich der
Emphysemtypen.
5.2.1 Beschreibung der einzelnen Zielzellen
5.2.1.1 Bronchioläre Epithelzellen
In der Durchlichtmikroskopie zeigen sich besonders im apikalen Anteil als auch
perinukleär in bronchiolären Epithelzellen markierte Einschlüsse.
59
Abb. 14: Bronchioläre Epithelzellen beim Non-A1ATM-E. Auffällig ist hier die
perinukleäre sowie apikal intensivere C. psittaci-Ag.-Markierung im Epithelzellzytoplasma.
[ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x mit Detailvergrößerung]
60
Abb. 15: Bronchioläre Epithelzellen beim Non-A1ATM-E. Gut abgrenzbare, intrazelluläre
Ansammlung markierter C. psittaci-Ag. in bronchiolären Epithelzellen. [CLSM, Mouse-AntiC. psittaci (rot), 3600x]
In der Immunofluoreszenz spiegeln sich diese Beobachtungen nur begrenzt wieder,
wobei
besonders bei der Markierung des chlamydialen LPS (grün) eine
gleichmäßigere Verteilung zu sehen ist.
61
Abb. 16: Bronchioläre Epithelzellen beim Non-A1ATM-E. Im Gegensatz zur
Einfachmarkierung (Abb. 13) zeigt sich in der Doppelmarkierung im apikalen Bereich eine
starke Anfärbung für Chlamydia spp. (grün), während die C. psittaci-Markierung (rot) weniger
intensiv ausgeprägt ist. [CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci (rot), Rabbit-Anti-C. LPS (grün),
1200x]
62
5.2.1.2 Pneumozyten Typ 2
Bei den Pneumozyten Typ 2 zeigt sich in der Durchlichtmikroskopie eine eher
homogene Verteilung mit deutlichen intrazellulären Markierungen.
Abb. 17: Pneumozyt Typ 2 beim Non-A1ATM-E. mit perinukleärem “Antigenhof”. [ABCMethode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x mit Detailvergrößerung]
63
Die intrazellulären chlamydialen Antigenmarkierungen in Pneumozyten Typ 2 zeigen
insbesonders in der CLSM eine perinukleäre Akzentuierung. Extrazellulär sind
gelegentlich einzelne C. psittaci-Ag.-Markierung zu sehen. Diese extrazellulären
Markierungen können ebenfalls Elementarkörperchen entsprechen, wie sie bereits in
der Rasterelektonenmikoskopie als sphärische Kügelchen beschrieben wurden (Vgl.
Abb. 18 und 19).
.
Abb. 18: Pneumozyt Typ 2 beim Non-A1ATM-E. Durch die Verwendung des Lektins LEAF (grün) ist die Zelloberfläche eindeutig abgrenzbar. Intrazellulär zeigt sich eine massive
Ansammlung von markierten Einschlusskörperchen, wie sie in erster Linie nur bei
Pneumozyten Typ 2 zu sehen ist. [CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und LEA-F (grün),
4200x]
64
Abb. 19: Pneumozyt Typ 2 mit sphärischen Kügelchen beim fortgeschrittenen E.
[REM, 10.000x] [152]
5.2.1.3 Makrophagen/Monozyten
In Makrophagen zeigen sich eher unregelmäßig angeordnete intrazelluläre C. psittaciAg. positive Körperchen, die im Vergleich zu den Markierungen in Pneumozyten Typ
2 feingranulärer sind.
65
Abb. 20: Non-A1ATM-E. Im erhaltenen Alveolarlumen sind Alveolarmakrophagen zu
erkennen, welche C.psittaci-Ag.- positiv sind. Diese Markierung ist hier weniger klar
perinukleär angeordnet als bei den Pneumozyten Typ 2. Weiterhin zu sehen sind Einblutungen
und Staubablagerungen. [ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x]
66
Abb. 21: Non-A1ATM-E. C. psittaci-Ag.-Markierung (rot) innerhalb der Makrophagen (grün)
mit etwas geringerer Anfärbungsintensität und eher diffuser Anordnung im Vergleich zu
Pneumozyten Typ 2. [CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und Mouse-Anti-CD 68 (grün),
1800x]
67
Abb. 21.1: Non-A1ATM-E.
Abb. 21.2: Non-A1ATM-E.
In Abb. 21.1 zu sehen sind CD68-markierte Makrophagen (grün) mit zum Teil
granulären,
abgrenzbaren
Einschlüssen
(rot)
welche
für
vitale
Chlamydieneinschlusskörperchen sprechen. Zur besseren Beurteilung der
chlamydialen Einschlüsse zeigt Abb. 21.2 das gleiche Bild unter Wegnahme des
Grünkanals. Eine solch intensive Färbung war jedoch nur selten innerhalb der
Makrophagen zu beobachten. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci und Mouse-Anti-CD68,
600x].
68
Abb. 22: GB. E. Die Lektinmarkierung war bei den Makrophagen besonders deutlich, was für
einen hohen Anteil von Glucose und Mannose spricht, C. pittaci-Ag. sind nicht in jedem Fall
in ihrem Erscheinen daran geknüpft. [CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und ConA (grün),
1800x]
69
Abb. 23: A1ATM-E. C. psittaci-Ag. (rot) markierte Makrophagen (grün), die subepithelial
und in der Transmigration durch das bronchioläre Epithel zu sehen sind.Das Epithel weist
ebenfalls C. psittaci-Ag. positive Einschlüsse auf. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und
Mouse-Anti-CD68 (grün), 600x]
70
Abb. 24: A1ATM-E. Serie von Aufnahmen der XY-Ebene in Z-Richtung um 0.5 µm versetzt,
die die morphologische Anordnung der C. psittaci-Ag. positiven Einschlüsse (rot) besonders in
Pneumozyten Typ 2 aber auch in Makrophagen (grün) darstellt. [CLSM, Mouse-Anti-C. psittaci
(rot) und ConA (grün), 4200x]
71
3.2.1.4 Lymphozyten
In den Lymphozyten zeigen sich insgesamt die schwächsten C. psittaciAntigenmarkierungen. Häufig wird beobachtet, dass sich diese in unmittelbarer Nähe
von stark markierten Pneumozyten und Makrophagen sowie perivaskulär befinden.
Abb. 25: Non-A1ATM-E. Perivaskuläre Lymphozyten-Ansammlung mit für C. psittaci-Ag.
positiven Pneumozyten Typ 2 im oberen Anteil des Bildes (↑). Die roten Signale im Bereich
der Gefäßwände sind als unspezifische Eigenfluoreszenz des Gewebes anzunehmen, da sie
morphologisch keine für Chlamydien typischen Einschlüsse aufwiesen. [IF, Mouse-Anti-C.
psittaci (rot) und Mouse-Anti-LCA (grün), 600x]
72
Abb. 26: Non-A1ATM-E. Dichte Lymphozytenansammlung. C. psittaci-Ag. markierte
Einschlüsse in einzelnen Lymphozyten, mit stärkerer Reaktion in Chlamydien-Ag.präsentierenden LCA-negativen Zellen. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci (rot) und Mouse-AntiLCA (grün), 600x mit Detailvergrößerung]
73
⇐

⇒

Abb. 27: Non-A1ATM-E. Entspricht Abb. 26, mit abgeschwächtem Grünkanal. Markierungen
der C. psittaci-Ag. zeigen sich in den Pneumozyten Typ 2 (↑). Bei dieser Darstellung lassen
sich auch Anfärbungen in den Lymphozyten ( ) erkennen. Ebenfalls sind
Antigenmarkierungen in Alveolarmakrophagen (⇑) zu sehen. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci (rot)
und Mouse-Anti-LCA (grün), 600x mit Detailvergrößerung]
74
Abb. 28: GB. E. Aktivierter Lymphfollikel mit Keimzentrum und zirkulärer
Lymphozytenansammlung. C. psittaci-Ag. positiv sind insbesondere Keimzentrumszellen und
einzelne kleine Lymphozyten. [ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x]
75
Es wurden keine C. psittaci-Ag. positiven Einschlüsse in Myozyten gefunden.
Abb. 29.1: GB. E.
Abb. 29.2: GB. E.
Rot- und Grün-Kanal separat. Entsprechend der immunhistochemischen Untersuchung wurden
in den Myozyten keine C. psittaci-Ag. markiert. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci und Mouse-Antismooth-muscle-Aktin, 600x].
5.2.2 Vergleich der verschiedenen Emphysemtypen
5.2.2.1 Großbullöses Emphysem
Beim großbullösen Emphysem finden sich insgesamt die höchsten C. psittaci-Ag.Markierungsraten der einzelnen Zielzellen in der Immunhistochemie.
76
Abb. 30: GB. E. Am oberen Bildrand zu sehen ist ein angeschnittenes Gefäß. C. psittaci-Ag.
positiv sind im wesentlichen Pneumozyten Typ 2. [ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci,
400x].
77
5.2.2.2 Non-A1ATM-E.
In einigen Markierungen der Immunofluoreszenz zeigt sich bei dem Non-A1ATM-E.
eine unerwartet starke Markierung, die eher auf unspezifische Bindungen sowie
Eigenfluoreszenz des Gewebes zurückzuführen ist.
Abb. 31: Non-A1ATM-E. C. psittaci-Ag.-Markierung (rot) mit weitaus zu starker
Fluoreszenz. Im bronchiolären Epithel (grün) sind dennoch abgrenzbare Einschlusskörperchen
zu sehen. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci und Mouse-Anti-CK-Pan, 600x]
78
Abb. 32: Non-A1ATM-E. C. psittaci-Ag. positive Makrophagen mit bräunlichem Pigment
sowie einige markierte Pneumozyten Typ 2. [ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x]
79
5.2.2.3 A1ATM-Emphysem
Beim A1ATM-Emphysem liegen insgesamt die niedrigsten Markierungsraten in den
jeweiligen Zielzellen vor. Auch die Markierungsintensität ist geringer.
Abb. 33: A1ATM-E. Wesentlich schwächere Anfärbungen zeigen die Gewebeproben des
A1ATM-Emphysems. Auf diesem Bild ist lediglich eine leichte perinukleäre Anfärbung in
einigen Pneumozyten Typ 2 zu erkennen. [ABC-Methode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x]
80
Abb. 34: A1ATM-E. Auch in den bronchiolären Epithelzellen zeigen sich nur leichtere
Anfärbungen, die peribronchiolär mit einer Entzündungsreaktion einhergehen. [ABCMethode, Mouse-Anti-C. psittaci, 400x].
5.2.2.4 Negativkontrollen
In der Immunofluoreszenzmarkierung erwiesen sich allerdings einer von zwei
getesteten Fällen für C. psittaci-Ag. positiv, die in der TEM, PCR und
81
Immunhistochemie negativ für C. psittaci waren. Diese Markierungen waren jedoch
auf einzelne Bereiche beschränkt und weniger stark ausgeprägt (Abb. 35).
Abb.
35:
Lungengewebe
einer
Chondrohamartomresektion. PCR, TEM und
immunhistochemisch für C. psittaci negativ getestetes Gewebe, das in der Immunofluoreszenz
vereinzelte Herde von C psittaci-Ag.-Markierungen aufweist. [IF, Mouse-Anti-C. psittaci, 600x]
82
5.3 Statistische Auswertung
Als C. psittaci-Ag.-positiv wurden solche Fälle angesehen, die in mindestens zwei
Gesichtsfeldern deutliche intrazelluläre Markierungen aufwiesen. In der
Immunhistochemie waren alle Fälle des GB. E. sowie des Non-A1ATM-Emphysems
für C. psittaci-Ag. positiv.
In den Fällen des A1ATM-Emphysems war ein C. psittaci-Antigennachweis in zehn
von zwölf (83,3%) der Fälle möglich. C. psittaci-Ag. konnten immunhistochemisch in
den unterschiedlichen Zelltypen nachgewiesen werden. Hierbei waren bei den
verschiedenen Emphysemformen in unterschiedlichen Zellen variierende
Detektionsraten zu finden.
Zunächst wurde das Alter und das Rauchverhalten (in packyears 1Py=1pack/day x
365) der verschiedenen Kohorten untersucht. Hierbei zeigte sich der höchste
Altersdurchschnitt bei der Kontrollgruppe (mean 62.71 ± 8,9 Stdev, p=0.03), gefolgt
von dem Non-A1ATM-E. (mean 58.25 ± 8,1stdev, p=0.013). An dritter Stelle stand
das A1ATM-E. (mean 49.42 ± 10.1stdev) welches keinen signifikanten
Altersunterschied zum GB. E. (mean 47.75, ± 12,6 stdev) aufwies (Tab. 1). Für das
Rauchverhalten wurden höhere Raten bei Patienten mit einem Non-A1ATM-E. (mean
40.8Py, ± 21.51stdev, p<0.00) bzw. mit einem GB. E (mean 31.9Py ± 21,13stdev,
p<0.00) gegenüber Patienten des A1ATM-E. (mean 16.67Py, ± 13.37 stdev) gefunden
(Tab. 2.1; 2.2). Zwischen dem Rauchverhalten der Patienten des GB. E und des NonA1ATM-E. bestand kein signifikanter Unterschied. Weiterhin konnte keine
signifikante Korrelation zwischen dem Alter und Rauchverhalten dargestellt werden.
Tab. 1: Geschlecht angegeben in Anzahl (% von Gesamt), Alter angegeben in mean ± stdev
Kohorten
Kontrollgruppe
A1ATM-E.
Non-A1ATM-E.
GB. E.
Anzahl n
n=14
n=12
n=47
n=16
Männlich
8 (57,1)
8 (66,66)
30 (62,5)
12 (75)
Weiblich
6 (42,9)
4 (33,33)
18 (37,5)
4 (25)
Alter
62,71 ± 8,94
40,42 ± 10,92
58,25 ± 8,11
47.75 ± 12,6
83
Tab. 2.1: Anzahl (% von Gesamt), Py (Packyears) mean ± stdev
Kohorte
Raucher
Nicht-Raucher
Ex-Raucher
Kontrollgruppe
0
14 (100)
0 (0)
A1ATM-E.
8
3 (37,5)
1 (12,5)
Non-A1ATM-E. 30
2 (6,7)
8 (26,7)
GB. E.
11
2 (18,2)
1 (9,1)
Unbekannt
0 (0)
0 (0)
7 (23,3)
2 (18,2)
Py
0
16,67 ± 13,7
40,79 ±21,51
31,93±21,13
Tab. 2.2: Altersverteilung und Unterschiede im Rauchverhalten zwischen Kontrollgruppe (A), A1ATME. (B), Non-A1ATM-E. (C) und GB. E (D)
A
B
C
D
A
B
C
D
Nachfolgend wurden die Summen aller Zielzellen bzw. markierter Zielzellen je Zelltyp
innerhalb der jeweiligen Kohorte gezählt und in fünf High Power Fields (HPF) je Fall
aufgeführt (Tab. 3.1 - 3.4).
Tab. 3.1: Pneumozyten Typ 2 pro Gesichtsfeld (HPF) in allen Patienten einer Kohorte (Durchschnitt
pro Patient, ± stdev)
Kohorten
C. psittaci-Ag. pos.
Zellen
Gesamtzellzahl
Markiert in %
A1ATM-E.
667 (55,58,±46,45)
1825 (152,08.±79,47)
36,55
Non-A1ATM-E.
3589 (74,77,±39,35)
6439 (134,14±63,32)
55,74
GB. E.
860 (53,75±76,75)
1228 (76,75±58,41)
70,03
84
Tab. 3.2: Bronchioläre Epithelzellen pro Gesichtsfeld (HPF) bei allen Patienten einer Kohorte
(Durchschnitt pro Patient, ± stdev)
Kohorten
C. psittaci-Ag. pos.
Zellen
Gesamtzellzahl
Markiert in %
A1ATM-E.
628 (52.33,±82,49)
1162 (96,83.±147,97)
54,04
Non-A1ATM-E.
1420 (29,58,±52,56)
2062 (42,96±72,11)
68,87
GB. E.
807 (50.44±61,88)
1128 (70,5±102,03)
71,54
Tab. 3.3: Makrophagen/Monozyten pro Gesichtsfeld (HPF) bei allen Patienten einer Kohorte
(Durchschnitt pro Patient, ± stdev)
Kohorten
C. psittaci-Ag. pos.
Zellen
Gesamtzellzahl
Markiert in %
A1ATM-E.
53 (4,42,±3,85)
149 (12,42.±8,94)
35,57
Non-A1ATM-E.
404 (8,42,±8,35)
622 (12,96±9,03)
64,95
GB. E.
280 (17,5±15,24)
424 (26,5±19,02)
66,04
Tab. 3.4: Lymphozyten pro Gesichtsfeld (HPF) in allen Patienten einer Kohorte (Durchschnitt pro
Patient, ± stdev)
Kohorten
C. psittaci-Ag. pos.
Zellen
Gesamtzellzahl
Markiert in %
A1ATM-E.
44 (3,66,±8,69)
244 (20,3.±19,2)
18
Non-A1ATM-E.
275 (5,73,±15,1)
1041 (21,69±37,54)
26,42
GB. E.
117 (7,31±10.4)
393 (24,56±48,56)
29,77
Weiterhin wurden verschiedenen Parameter, wie das Rauchverhalten, Alter, Summe
aller Zielzellen vs. markierter Zielzellen innerhalb der jeweiligen Kohorte unter
Verwendung des Mann-Whitney-U-Test sowie des Spearman-Test miteinander
verglichen und mögliche Korrelationen als Streudiagramm dargestellt (Tab. 4.1-4.3).
Die positiven Korrelationen werden jeweils genannt.
A1ATM-E.: Es zeigte sich eine signifikant positive Korrelation zwischen der Summe
markierter Makrophagen und der Summe aller Lymphozyten (r=0,776, p=0,003) (Tab.
4.1).
85
Non-A1ATM-E.: Es zeigten sich eine positive Korrelation zwischen der Summe
markierter Pneumozyten zur Summe aller Makrophagen ( r=0.289, p=0.046) sowie der
Summe aller Lymphozyten zur Summe der C. psittaci-Ag. positiven Makrophagen
(r=0,52, p<0.000), Weiterhin bestand eine schwächer positive Korrelation der Summe
aller Makrophagen zur Summe aller Lymphozyten (r=0,349, p=0.15) (Tab. 4.2).
GB. E.: Beim GB. E. konnte eine positive Korrelation für die Summe markierter
Pneumozyten und die Summe aller Makrophagen (r=0.822, p<0.00) dargestellt
werden, wobei sich ebenfalls eine schwächere Korrelation der Summe aller
Pneumozyten zur Summe aller Makrophagen darstellt (r=0.528, p=0.036). Weiterhin
fand sich im Streudiagramm eine positive Korrelation zwischen der Summe markierter
Lymphozyten zur Summe aller Makrophagen, die jedoch nicht signifikant war
(r=0.478, p=0.61) (Tab. 4.3).
Tab. 4.1: Summe markierter Makrophagen in Korrelation mit der Summe aller Lymphozyten beim
A1ATM-E.
86
Tab. 4.2: Summe der markierten Pneumozyten zur Summe aller Makrophagen (links) sowie die Summe
markierter Makrophagen zur Summe aller Lymphozyten beim Non-A1ATM-E.
Tab. 4.3: Summe markierter Pneumozyten zu der Summe aller Makrophagen (links); Summe markierter
Lymphozyten zur Summe aller Makrophagen im GB. E (rechts)
Abschließend wurden Unterschiede in dem Vorkommen der verschiedenen Zelltypen
bzw. der Summe der Markierung, bezogen auf die verschiedenen Emphysemformen
untersucht. Hierbei zeigten sich besonders große Unterschiede in der Anzahl
markierter sowie nicht markierter Makrophagen im GB. E. im Vergleich zum Non-
87
A1ATM-E. bzw. A1ATM-E. (p=0,01 bzw. p=0.007) (Fig 5.1). Ebenfalls beim GB. E
waren die markierten Lymphozyten am meisten vertreten (p=0,036 gegenüber dem
Non-A1ATM-E.) (Tab. 5.2). Die markierten Pneumozyten zeigten im Non-A1ATM-E.
die höchsten Raten (p=0,029 gegenüber dem GB. E bzw. p=0,087 gegenüber dem
A1ATM-E.) (Tab.5.3). Für die bronchiolären Epithelzellen wurden keine signifikanten
Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen gefunden.
Tab. 5.1: Summe markierter (links) sowie Summe aller Makrophagen (rechts)
Tab. 5.2: Summe markierter Lymphozyten
88
Tab. 5.3: Summe markierter (links) bzw. aller (rechts) Pneumozyten
7. Diskussion
6.1 Pathogenetische Relevanz
C. psittaci-Infektionen sind bekannte unterschiedlich stark symptomatische
Infektionskrankheiten, die insbesondere im Tierreich auftreten und auf den Menschen
übertragen werden können. Die Übertragung findet über (i) den respiratorischen Weg
(u. a. durch Aerosolbildung von getrocknetem Fäzes, Husten, Niesen), über (ii) den
gastrointestinalen Weg sowie über (iii) Hautkontakt bzw. Hautverletzungen statt [137,
167].
Insgesamt ist C. psittaci in über 130 Vogelarten und 32 anderen Haus- und Wildtieren
als Erreger inapparenter, subklinischer und klinischer Infektionen nachgewiesen
worden [5]. Aufgrund der Annahme, dass eine C. psittaci-Infektion mit Vogelhaltung
assoziiert ist, wurde wahrscheinlich bisher zu selten auf C. psittaci getestet, was
insgesamt eine Unterdiagnostizierung mit sich führte [139]. In einem Teil der Fälle
konnten Wildvögel als Überträger nachgewiesen werden, derartige Übertragungswege
werden jedoch nur selten aufgedeckt [174]. In der vorliegenden Studie wurden im
Vergleich zur PCR und TEM in einem hohen Prozentsatz C. psittaci-Ag. in
verschiedenen Zellen des Respirationstraktes gefunden. Ähnliches wurde bereits für C.
89
pneumoniae beschrieben, und spiegelt die hohe Sensitivität der Immunhistochemie im
Vergleich zu den anderen Methoden (vgl. Kap. 6.3) für formalinfixiertes, in Paraffin
eingebettetes Material wieder [3].
Das Vorkommen von C. psittaci-Ag. zeigt hierbei ein sehr inhomogenes Bild. So gibt
es in einzelnen Fällen lediglich einzelne Hot-Spots mit wenigenAg. positiven Zellen,
was damit zu erklären ist, dass eine regional stark variierende Infektion vorliegt.
Besonders peribronchioläre bzw. perivaskuläre Bereiche zeigen ein sehr hohes
Vorkommen von Makrophagen und Lymphozyten bei einer starken Ag.-Anfärbung
besonders im Bereich der bronchiolären Epithelien. Dies spiegelt offenbar den
Infektionsweg, ausgehend vom bronchiolären Epithel und der örtlichen Ausbreitung
bzw. Entzündungsreaktion wieder. Aufgrund dieser Variabilität ergeben sich für die
einzelnen Zielzellen zum Teil größere Standardabweichungen.
Nicht alle mikrobiologischen Studien, die mit C. pneumoniae gemacht wurden, sind in
gleicher Weise auch an C. psittaci-Isolaten durchgeführt worden. Jedoch sind sich die
einzelnen Chlamydophila-Spezies so ähnlich und auch in ihrer DNA homolog, dass ein
ähnliches Reaktionsmuster in grundlegenden Erregerantworten erwartet werden kann.
So wurde bereits eine Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen bzw. Lymphozyten
bei einer C. trachomatis- bzw. C. pneumoniae-Infektionen gezeigt [98, 149].
Interressanterweise werden in der vorliegenden Studie beim GB. E nicht nur die
höchste Anzahl von Makrophagen sondern auch eine starke Korrelation (r=0,822)
zwischen Anzahl der C. psittaci-Ag. positiven Pneumozyten und der Anzahl der
Makrophagen gesehen. Dieses könnte ein örtliches "Durchbrennen" der
Entzündungsreaktion mit massiver Freisetzung von Proteasen und Entstehung eines
GB. E erklären. Das GB. E. ist typischerweise apikal betont. Offenkundig mangelt es
hier perfusionsbedingt, ähnlich wie bei der Tuberkulose, an einer effektiven
Begrenzung der Entzündungsreaktion.
Für das Non-A1ATM-E. zeigt sich ebenfalls eine positive Korrellation zwischen der
Summe C. psittaci-Ag. positiver Pneumozyten und der Summe aller Makrophagen.
Die Patienten des GB. E weisen die höchste Anzahl packyears und die stärkste
Korrelation von Makrophagen und C. psittaci-Ag. positiven Pneumozyten auf.
Jedoch liegt in diesen Fällen keine direkte Korrelation zwischen dem Rauchverhalten
und der Anzahl an Makrophagen bzw. Lymphozyten vor. Ähnliches wurde bereits
90
unabhängig einer Chlamydiendiagnostik für neutrophile Granulozyten beschrieben.
Hierbei wurde Biopsiematerial von Rauchern mit COPD versus Nichtrauchern mit
COPD verglichen. Auch hierbei fand sich bei COPD-Patienten keine Korrelation
zwischen dem Rauchverhalten und Vorkommen von neutrophilen Granulozyten [26].
In zwei Studien von Wiedemann et al. wurde der Entwicklungszyklus von C.
pneumoniae unter Einfluss von Tabakrauch untersucht. Hierbei wurde zunächst
nachgewiesen, dass rauchexponierte Chlamydien in humanen epthelialen Zelllinien in
ein Stadium der Persistenz übergehen. Gleichzeitig konnte aber auch gezeigt werden,
dass bei Rauchentzug und Zugabe von L-Tryptophan die Chlamydien wieder in einen
aktiven Vermehrungszyklus übergehen. Es ist also zu vermuten, dass die
Tabakrauchinhalation einen entscheidenden Faktor in der Entstehung einer
persistierenden chronischen Chlamydieninfektion darstellt [168, 169].
Pneumonien, die durch Chlamydien verursacht werden, zeichnen sich durch eine
intraalveoläre Inflammation aus. Hierbei können sich die Erreger hämatogen im Sinne
einer Chlamydiämie auf andere Organsysteme, eingeschlossen der Lungen ausbreiten
[137].
Als Vektoren der Ausbreitung von C. pneumoniae werden infizierte
Monozyten/Makrophagen angesehen, die durch die Mukosabarriere transmigrieren und
über das lymphatische System Anschluss an das Blutsystem erhalten [150]. In der
Immunofluoreszenz konnten auch in dieser Arbeit für C. psittaci-Ag. markierte
Makrophagen subepitehial und in der Transmigration (Abb. 23) gezeigt werden.
Weiterhin wurde von Canudet et al. zwischen dem Auftreten eines okulären
Lymphoms und der C. psittaci-Infektion eine Assoziation gefunden und dabei eine
persistierende C. psittaci-Infektion als ein Antigenstimulus diskutiert [159]. Ein
Antigenstimulus führt auch im Lungengewebe zur Zellakkumulation von
Lymphozyten und Monozyten/Makrophagen [151].
Dieser Beschreibung entsprechen die Beobachtungen der Immunofluoreszenz, in
welchen interstitielle perivaskuläre Lymphozytenherde in unmittelbarer Nähe von C.
psittaci-Ag. positiven Pneumozyten und bronchiolären Epithelzellen zu sehen sind.
Der Mechanismus dieser Akkumulation sowie deren Rolle in der Entstehung eines
Emphysems ist jedoch hiermit noch nicht erklärt.
91
Neben der Neutrophilen-Elastase werden die Metalloproteasen und Gelatinasen als
entscheidende Komponente für die Entstehung eines Lungenemphysems angesehen.
Diese werden von Makrophagen freigesetzt und führen zum Abbau von Elastin und
Kollagen [152, 153]. H. Yamaguchi et al. beschreiben anhand morphologischer
Kriterien eine Differenzierung von Monozyten zu aktiven Makrophagen, nachdem
diese mit vitalen C. pneumoniae beimpft werden [98]. TNF-alpha, welches als inaktive
Form membrangebunden in Makrophagen vorliegt, wird durch einen Stimulus wie z.B.
chlamydiales LPS freigesetzt und über membranständige Proteasen (TNF-Alpha
converting enzyme (TACE; ADAM-17)) in die aktive Form überführt [153].
Sowohl vitale als auch abgetötete C. pneumoniae führen in Monozyten zu einer
erhöhten Expression von MMP-1 und MMP-9 [155]. Es kann weiterhin gezeigt
werden, dass diese Metalloproteasen, wie auch MMP-2, MMP-7 und MMP-12 in der
Lage sind, das inaktive TNF-alpha in seine aktive Form zu überführen. TNF-Alpha
wiederum führt zu einer gesteigerten Expression von “vascular cell adhesion molecule1” (VCAM-1) [153] wie auch “intercellular adhesion molecule-1” (ICAM-1) in
vaskulären Endothelzellen. Dies führt zu einer erhöhten Transmigrationsrate von
Neutrophilen sowie Monozyten [156, 157, 158]. Diese setzen wiederum Elastasen und
Metalloproteinasen frei, welches zu einer Destruktion des Lungengerüstes führt [34,
44]. Ebenso wie bakterielles LPS ist auch chlamydiales HSP 60 ein Induktor für eine
gesteigerte TNF-alpha Sekretion der Makrophagen [94]. Interessanterweise wird
chlamydiales HSP 60 auch in Phasen der Chlamydienpersistenz synthetisiert.
Weiterhin sekretieren experimentell C. psittaci-infizierte HeLa-Zellen vermehrt IL-8,
welches chemotaktisch auf neutrophile Granulozyten wirkt [93]. Chemotaktisch
aktives IL-8 findet sich wiederum in hoher Konzentration im Sputum von Patienten
mit COPD [160].
Diese Faktoren erklären die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen sowie
Lymphozyten zu einer C. psittaci-Infektion hin, wie sie in vorliegender Arbeit gesehen
wird.
Weiterhin sprechen oben zitierte Studien auch dafür, dass hierbei nicht unbedingt eine
aktive Chlamydien-Infektion vorliegen muss, sondern auch eine Persistenz oder
lediglich die Anwesenheit von C. psittaci-Fragmenten hierfür ausreicht. Form und
Verteilung der Einschlüsse, sowie die Morphologie der Einschlüsse sprechen hierbei
eher für eine chronisch-persistierende C. pittaci-Infektion mit aktiven Schüben.
92
6.2
Validität des Primärantikörpers
Das experimentell mit C. pneumoniae infizierte Lungengewebe von Patienten mit
einem Lungenkarzinom (s. S. 52-53 u. 57-58) zeigte bereits vor der Infektion mit C.
pneumoniae eine C. psittaci-Ag.-Markierung. Lichtmikroskopisch kam es nach 24h
Inkubationszeit zur Zunahme C.-LPS markierter Zellen. In dem Fall, dass der MouseAnti-C. psittaci Antikörper mit C. pneumoniae kreuzreagierte, hätte auch hier die
Anzahl markierter Zellen ansteigen müssen. Da dies nicht der Fall war, weist dies
darauf hin, dass tatsächlich keine Kreuzreaktion des Mouse-Anti-C. psittaciAntikörpers mit C. pneumoniae besteht.
Als weitere experimentelle Versuchsreihe wurde Lungengewebe mit einem Speziesunspezifischen Rb-Anti-C.-LPS sowie einem C. psittaci-spezifischen Ak in der
Immunofluorenszenz doppelt markiert. Unter der Annahme, dass es sich bei den in
Abb. 38.1-3 markierten Ag. nicht lediglich um Fragmente sondern um vitale C.
psittaci-Einschlusskörperchen handelt, müssten diese von beiden Ak erfasst sein.
Handelt es sich aber um eine Infektion mit anderen Chlamydien mit Ausschluss von C.
psittaci, so müsste eine Markierung lediglich mit dem Rb.-Anti-C.-LPS stattgefunden
haben. Es sind deutlich abgehobene Spots vornehmlich in den Zellen 2. und 3. zu
erkennen, welche als Einschlusskörperchen zu deuten sind. Da es hier zu keiner
Anlagerung von Mouse-Anti-C. psittaci-Antikörpern gekommen ist, ist anzunehmen,
daß eine Infektion mit einer weiteren C.-Spezies vorliegt. Die getrennte Markierung
einzelner Einschlusskörperchen zeigt somit, dass der Mouse-Anti-C. psittaci-Ak nicht
kreuzreaktiv ist. Eine doppelte Infektion einzelner Zellen wird auch in einer Studie von
Poppert et al. beschrieben, in welcher HeLa-Zellen mit C. pneumoniae und C .
trachomatis infiziert wurden. Diese Zellen weisen ebenfalls getrennt markierte
Einschlusskörperchen auf [125]. Somit können die eingesetzten Antikörper als
hinreichend spezifisch für den Nachweis von C. psittaci gelten.
93
6.3
Wie korrelieren die benutzten Detektionsverfahren
miteinander?
In einer vorangegangenen Studie wurde C. psittaci-DNA in 66,75 (4/6) des A1ATME. vs. 29.0% (9/31) beim Non-A1ATM-E nachgewiesen. Lediglich ein Fall des
A1ATM-E. war in der PCR für C. pneumoniae positiv.
Die TEM zeigte eine höhere Sensitivität mit 100% (5/5) Nachweisrate bei dem
A1ATM-E. versus 79.4% (27/34) bei dem Non-A1ATM-E. [5]. Obgleich die TEM
keine genaue Differenzierung zwischen verschiedenen Chlamydienspezies zulässt,
werden die für die Infektion mit C. pneumoniae typischen birnenförmigen
Elementarkörperchen beschrieben [59, 162], die in diesen Fällen nicht beobachtet
wurde [5].
Im Vergleich ergaben sich jedoch bei der IHC insgesamt die höchsten Nachweisraten,
sowohl im Bezug auf die PCR-Ergebnisse als auch auf die TEM-Ergebnisse.
Die IHC-Methode stellt eine Möglichkeit dar, Antigene zu detektieren. Eine
Markierung von Chlamydien geschieht auch bei der Präsenz von Fragmenten, ohne
dass vitale Chlamydien anwesend sein müssen. Dies wurde bereits für C. pneumoniae
in vaskulärem Gewebe gezeigt [126].
Im Gegenstatz zur IHC ermöglicht die TEM nur die Begutachtung eines wesentlich
kleineren Ausschnittes. Es zeigen sich jedoch in der lichtmikroskopischen
Begutachtung der Präparate in erster Linie kleinere Areale, die C. psittaci-Ag. positive
Zellen aufweisen, allerdings auch größere antigenfreie Bereiche. Es handelt sich also
um eine Infektion mit einer eher fleckförmigen Ausbreitung. Dies erkärt die
niedrigeren Detektionsrate in der TEM gegenüber der IHC.
Untersuchungen, in denen sowohl die IHC als auch die PCR zur Detektion von
Chlamydien angewandt wurden, zeigen im Vergleich eine geringere Detektionsrate für
die PCR. Wenn also das gleiche fixierte Gewebe für die IHC und PCR eingesetzt wird,
werden besonders die Formalinfixierung als auch Paraffineinbettung von des
Lungengewebe als Faktoren für die niedrigere Sensitivität der PCR diskutiert [3]. Als
weitere Faktoren werden insbesondere beim Einsatz von Frischmaterial verschiedene
Gewebsinhibitoren in atheromatösem Gewebe genannt, welche die PCR direkt
beeinträchtigen [162, 165]. Diese Beobachtungen wurden durch die Daten dieser
Studie weiter unterstützt.
94
Weiterhin ist zu beachten, dass die IHC auch Antigenfragmente nachweisen kann,
während die PCR auf intakte DNA-Abschnitte im untersuchten Bereich angewiesen
ist. Eine gute Korrelation konnte jedoch von T. Mygind et al. zwischen quantitativer
PCR und IHC bei ebenfalls in Formalin fixierten mit C. pneumonia infizierten
Mäuselungen gezeigt werden. Es handelte sich allerdings um hoch akute Infektionen
von Mäuselungen mit vitalen C. pneumoniae und nicht um chronisch persistierende
Infektionen, wie sie bei COPD Patienten zu beobachten sind [126].
Zur Ergänzung des Methodenspektrums ist der Einsatz der Fluoreszenz-in-situ
Hybridisierung zu erwägen, die direkt mit Antigen-Nachweisverfahren gekoppelt
werden kann.
6.4 Ausblick
Zur Erfüllung der Henle-Koch’schen Postulate ist der kulturelle Nachweis von C.
psittaci noch zu erbringen.
Weiterhin ist nach dem dritten Henle-Koch’schen Postulat die Potenz von C. psittaci
eine COPD und letztlich ein Emphysem zu induzieren weitergehend zu untersuchen.
Bisherige tierexperimentelle Emphysemmodelle haben einseitig nur Labornager
eingesetzt [45]. Aufgrund des anatomischen Aufbaus des Atemtraktes und erheblicher
Speziesunterschiede in der Infektiosität vom Erreger ist jedoch dieser Ansatz sicher
unzureichend.
Wenn in Folge einer C. psittaci-Infektion eine Rekrutierung von Entzündungszellen
beobachtet werden kann, so stellt sich die Frage, ob eine solche Infektion als primäres
Phänomen in der Pathogenese der COPD gesehen werden muss oder sich als
“contributer” sekundär bei bestehender Parenchymdestruktion aufpfropft. Weiterhin ist
zu untersuchen, ob eine Infektion der humanen Lunge mit C. psittaci zu einer
gesteigerten Bildung von relevanten Zytokinen und Matrixmetalloproteinasen führt
und ob Unterschiede zur ebenfalls diskutierten Rolle der C. pneumoniae-Infektion
bestehen. Als mögliches Tiermodell zur Untersuchung einer chronisch persistierenden
Chlamydieninfektion käme das Pferd in Betracht, bei dem als einzigen Säugetier auch
eine COPD bekannt ist. Erste Ergebnisse konnten auch hier C. psittaci nachweisen
[172, 173].
95
Um die Reaktionen einer akuten Infektion mit C. psittaci zu untersuchen, scheinen
humane Precision Cut Lung Slices (PCLS) ein geeignetes Modell zu sein [134].
In humanen Primärkulturen und Zelllinien könnten weiterhin nach erfolgter Infektion
mit C. psittaci bzw. C. pneumoniae entsprechende Zytokine vergleichend
nachgewiesen werden. Auch ein Stadium der Chlamydienpersistenz könnte
weitergehend auf inflammatorische Aktivitäten untersucht werden.
Um gezielt Zellen aus einem Gewebeverbund zu untersuchen, bietet sich ebenfalls die
Methode der Laser-Mikrodissektion an. Hierbei werden mit Hilfe eines Lasers
einzelne Zellen oder Zellgruppen aus einem Gewebeverbund herausgeschossen und in
einem geeigneten Medium aufgefangen. Auch an diesen Zellen könnten dann
Untersuchungen zur inflammatorischen Aktivität der Chlamydieninfektion
durchgeführt werden.
Weiterhin stellt sich die Frage, auf welche Weise man eine C. psittaci-Infektion bei
COPD-Patienten behandeln kann. Im Falle einer C. pneumoniae-Infektion konnte
gezeigt werden, dass nach 6 wöchiger Behandlung mit Makroliden noch 41% der
Patienten C. pneumoniae-DNA im Blut aufwiesen, jedoch binnen 2 Monaten 71% der
Patienten wieder positiv getestetet wurden. Es muss demnach davon ausgegangen
werden, dass eine vollständige Eradikation nicht stattgefunden hat, oder es zu einer
Neuinfektion gekommen war [4].
Im Allgemeinen scheint derzeit eine antibiotische Behandlung von geringem
klinischen Nutzen zu sein [122], jedoch berichten einzelne Autoren von guten Erfolgen
einer langfristigen Tetrazyklin-Therapie bei COPD-Patienten [117].
96
7. Zusammenfassung
Die chronische Bronchiolitis ist eine Teilkomponente der chronisch obstruktiven
Lungenerkrankung. Pathologisch-anatomisch kann bei Emphysempatienten in 71,7%
eine zumindest minimale chronische Bronchiolitis nachgewiesen werden [150]. Die
relevante Rolle bakterieller und viraler Infektionen in der Pathogenese der COPD ist
seit langem bekannt.
Bisherige Untersuchungen konnten beim Lungenemphysem und in Sputumproben von
COPD-Patienten eine C. psittaci-Infektion nachweisen [5, 138]. Vergleichend wurde
in der vorliegenden Studie das Vorkommen der Erregerantigene in verschiedenen
Zielzellen bei unterschiedlichen Emphysemformen quantifiziert.
Operativ gewonnenes, in Formaldehyd fixiertes, in Paraffin eingebettetes
Lungengewebe von 12 Patienten mit einem Alpha1-Antitrypsinmangel-E. (A1ATME.), 47 Patienten mit einem Non-A1ATM-E. und 16 Patienten mit einem großbullösen
E. (GB. E.) wurde mit einem Maus-Anti-C. psittaci-Primärantikörper untersucht.
Unverändertes Lungengewebe diente als Negativkontrolle. Alle markierten und nicht
markierten Makrophagen, Pneumozyten Typ 2, bronchiolären Epithelzellen und
Lymphozyten wurden in fünf Gesichtsfeldern ausgezählt. Weiterhin wurden bei
einigen ausgewählten Fällen C. psittaci-Ag. sowie chlamydiales LPS
fluoreszenzmarkiert und mit einer Palette weiterer Antikörper in den verschiedenen
Zielzellen mittels der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie als auch der
Konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie (CLSM) lokalisiert.
In der Fluoreszenzmarkierung wurden C. psittaci-Ag.-Markierungen im apikalen
Bereich von bronchiolären Epithelzellen sowie perinukleär in Pneumozyten Typ 2
dargestellt. Hierbei wies der LPS-Antikörper eine diffus im Zellplasma verteilte
Antigenbindung auf, während der C. psittaci-Antikörper deutlich abgrenzbare
Einschlüsse darstellt. Des weiteren wurden C. psittaci-Ag. positive Makrophagen in
der Transmigration durch das bronchiolären Epithel gezeigt. Perivaskuläre
Infiltrationen von teils C. psittaci-Ag. positiv markierten Lymphozyten sind in enger
Nachbarschaft zu stark C. psittaci-Ag. positiv markierten Pneumozyten Typ 2 zu
finden.
97
In der Immunhistochemie waren 100% des Non-A1ATM-E. und großbullösen E. und
83,33% des A1ATM-E. für C. psittaci-Ag. positiv. Die Detektionsraten waren in den
bronchiolären Epithelzellen am höchsten. Sie betrugen 54,04% beim A1ATM-E.,
68,87% beim Non-A1ATM-E. und 71,54% beim GB. E. Etwas niedrigere
Nachweisraten fanden sich in Makrophagen (64,95% bis 66,04%) und Pneumozyten
Typ 2 (55,74% bis 70,03%). Lymphozyten zeigten die geringste Markierungsrate
(18% bis 29,77%).
C. psittaci-Ag. konnten in den unterschiedlichen Zelltypen nachgewiesen werden.
Hierbei sind bei den verschiedenen Emphysemformen in unterschiedlichen Zellen
variierende Detektionsraten zu finden. Gleichzeitig wurde in der Immunofluoreszenz
ein morphologischer Bezug zum Entzündungsprozess dargestellt. Diese Daten stellen
einen Hinweis auf die pathogenetische Relevanz der C. psittaci-Infektion dar und
liefern gleichzeitig Ansätze zur Erklärung der verschiedenen Formen des Emphysems.
Für die genauere Einordnung der Rolle der C. psittaci-Infektion in der Pathogenese der
COPD und des Emphysems muss diese jedoch noch weiter in verschiedenen
Tiermodellen und humanen Zelllinien untersucht werden.
98
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25.09.2006)
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121
Danksagungen
Zunächst möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die mich in der Zeit der
praktischen Durchführung als auch in der theoretischen Aufarbeitung unterstützt
haben.
Insbesondere danke ich Herrn PD Dr. med. D. Theegarten für die freundliche
Überlassung des Themas sowie der stets guten und umfassenden Betreuung und
Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit.
Weiterhin danke ich Herrn Dr. med. O. Anhenn für die sehr konstruktiven
Diskussionen und Ratschläge besonders im praktischen Teil der Durchführung.
Frau Nellia Schatz danke ich für die stets sehr hilfsbereite und freundliche technische
Unterstützung.
Ein besonderer Dank gilt Prof. Dr. C. Cuvelier und A. Waeytens des Institutes für
Pathologie der Universität Gent/Belgien für die Bereitstellung des Konfokalen LaserRaster-Mikroskops sowie der überaus freundlichen Erörterungen von Fragen.
122
10.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Tobias Bexten
Geburtsdatum/-ort
12. 06. 1979 in Bottrop
Familienstand
ledig
Konfession
katholisch
Schullaufbahn
1985 - 1989
Grundschule Hünxe
1989 - 1999
Andreas Vesalus Gymnasium Wesel
Studium
10.2000
Medizinstudium an der Ruhr-Universität-Bochum
09.2002
Physikum
08.2003
1. Staatsexamen
10.2003 - 06.2004
Erasmus Austausch an der Universität Gent/Belgien
08.2004
2. Staatsexamen
Praktisches Jahr
Innere Medizin
Universitätsklinik Hiroshima/Japan
Chirurgie
Universitätsklinik Bilbao/Spanien
Unfallchirurgie
Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum
Dissertation/ Kongresse
Immunhistochemischer Nachweis von Chlamydophila psittaci
in drei verschiedenen Emphysemformen
09.2004
Posterdiskussion beim “European Respiratory Society (ERS)”
Kongress in Glasgow/Schottland
12.2004
Posterdiskussion beim jährlichen Treffen der “Deutsche
Gesellschaft für Lungen- und Atmungsforschung” in Bochum
03.2005
Posterdiskussion beim Kongress der “Deutschen Gesellschaft
für Pneumologie” in Berlin
06.2005
Posterdiskussion beim “Congress of Infectious and Tropical
Medicine” in Hamburg
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