Erfolgreiche Optimierung einer Chemotherapie mittels

FO RT B I LDU N G
Chemosensitivitätsprüfung ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN
Erfolgreiche Optimierung einer Chemotherapie
mittels Chemosensitivitätsprüfung an
zirkulierenden Tumorzellen
C. Weigl1, C. Rabenstein1, U. Pachmann1, K. Pachmann1,2.
Im hier vorgestellten Fall wird gezeigt, wie die chemotherapeutische Behandlung einer 73-jährigen Patientin mit beidseitigem Ovarialkarzinom mittels Chemosensitivitätstestung begleitet, überwacht und individuell angepasst werden
konnte. Die Sensitivitätstests erfolgten an im Blut zirkulierenden Tumorzellen. Da diese die aktuellen Eigenschaften
des Primärtumors widerspiegeln, können die daraus gewonnenen Daten erfolgreich auf die chemotherapeutische
Behandlung der Patientin und das systemische Verhalten des Tumors extrapoliert werden. Damit hätte in diesem Fall
nicht nur eine Progression der Krankheit unter schlecht wirksamen Chemotherapeutika frühzeitig entdeckt werden
können, die zirkulierenden Tumorzellen halfen auch bei der anschließenden Auswahl eines wirksamen Medikamentes.
Einleitung
Die Chemotherapie ist nach wie vor
eine der drei Säulen der Behandlung
von Karzinomen. Zur Auswahl der eingesetzten Medikamente stehen dem
Arzt nur statistisch abgeleitete Daten
über deren Wirksamkeit aus vorangegangenen Studien zur Verfügung [1].
Hieraus lässt sich nicht zwangsläufig
ein optimales Ansprechen für den
einzelnen Patienten ableiten. Wird
ein Patient mit weniger wirksamen
Medikamenten therapiert, muss er
die erheblichen Nebenwirkungen einer Chemotherapie ertragen, ohne
den bestmöglichen therapeutischen
Erfolg daraus zu ziehen. Ein vielversprechender Ansatz ist es, die Chemosensitivität der Tumorzellen für jeden
Patienten vor einer entsprechenden
Behandlung individuell zu bestimmen.
Es gibt Ansätze in der Brustkrebsbehandlung, das Ansprechen auf eine
neoadjuvante Medikation als in vivo
Chemosensitivitätstest heranzuziehen
[2-4]. Da neoadjuvante Chemotherapien bei manchen Brustkrebstypen in
einem hohen Prozentsatz zu einer pathologisch kompletten Remission führen, werden sie immer häufiger auch
bei operablen Tumoren der Brust eingesetzt [2]. Allerdings wird dadurch
nicht immer das rezidivfreie Überleben verbessert. Es gibt Hinweise,
dass eine neo-adjuvante Therapie bei
Patientinnen mit triple-negativem Tumor zu höheren Rezidiv-Raten führen
kann als eine adjuvante Therapie [5].
Eine neue Möglichkeit, die Chemosensitivität des Tumors zu bestimmen,
basiert auf dem Einsatz von zirkulierenden Tumorzellen [6], im folgenden
CETCs (circulating epithelial tumor
cells) genannt. Diese CETCs werden
vom Primärtumor während seines
Wachstums kontinuierlich in Lymphund Blutgefäße abgegeben [7]. Der
große diagnostische Vorteil dieser
zirkulierenden Tumorzellen besteht
darin, dass sie die Eigenschaften der
Gesamttumorlast im Körper widerspiegeln [8]. Tumorverdächtige Zellen,
welche in einer Patienten-Blutprobe
identifiziert werden, können direkt
auf ihre Sensitivität für die jeweils
geplanten Medikamente untersucht
werden. In dem folgenden Fall soll dargestellt werden, welche Vorteile diese
Methode für die individuelle Behandlung haben könnte.
Methoden
Die Tumorzellen aus Patientenblut
wurden, wie bereits publiziert [9],
lediglich durch die Lyse der roten
Blutzellen und einen Zentrifugationsschritt aufbereitet. Dafür wurde
1 ml Blut mit 15 ml Lysepuffer für 15
min im Kühlschrank inkubiert und anschließend bei 700 g abzentrifugiert.
Tumorzellen wurden über ihre epithelialen Eigenschaften mittels EpCAM (epithelial cell adhesion molecule; CD326) – ein anti-epithelialer
Antikörper konjugiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) – erfasst.
Absterbende Zellen wurden mittels
Propidiumjodid, wodurch nur der Kern
von Zellen mit einer permeablen Membran, die sich in der Absterbephase befinden, angefärbt wurde, identifiziert.
100 μl der Zellsuspension wurden
anschließend unter Zellkulturbedingungen mit den in Frage kommenden
Medikamenten inkubiert. Zum Test
der Effektivität des Medikamentes
wurden alle weißen Blutzellen des
Pellets aus 100 µl Blut verschiedenen
Konzentrationen des zu untersuchenden Medikaments ausgesetzt. Die
mittlere Konzentration entsprach der
Tagesdosis, berechnet auf 5 Liter Blut,
zusätzlich wurden die 10fache und die
1/10fache Konzentration getestet. Als
Vergleich wurde ein Kontrollansatz
ohne Medikamente gemessen.
Die Zellen wurden unter diesen Bedingungen für bis zu neun Stunden
inkubiert, wobei der zytotoxische Effekt nach jeweils drei, sechs und neun
rbeitsgruppe Transfusionsmedizinisches Zentrum
A
Bayreuth (Arge. TZB)
2
Universitätsklinikum Jena
1
www.journalonko.de
285
JOURNAL ONKOLOGIE 4/2014
Leberprogress
11
Progress
EoC
10
7
6 x CarbPl
Pax
100.000
9
Die Ergebnisse zeigten bereits,
im Gegensatz zur Messung vom
17.03.2010, bei den ersten Tests von
21.06.2010 ein verringertes Ansprechen der Zellen auf Carboplatin und
Paclitaxel. Im weiteren Verlauf sinkt
8
6
5
4
3
1
2
1.000.000
Fallbericht
6 x CarbPl
Pax
pegyliertes
Doxorubicin
10.000
1.000
100
23.01.2011
15.10.2010
07.07.2010
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Carbo
Pac
Jan. 2011
Dez. 2010
Nov. 2010
Okt. 2010
Sep. 2010
Jul. 2010
Aug. 2010
Jun. 2010
Mai 2010
Apr. 2010
Feb. 2010
Doxo
Mrz. 2010
b)
29.03.2010
10.09.2009
10
Nov. 2009
Die Ergebnisse dieses Vorgehens und
ihre klinische Relevanz sollen im Fall
einer 73-jährigen, weiblichen Patientin mit beidseitigem Ovarialkarzinom
(Figo IV mit Leber und Milzherden
ED 16.09.2009) dargestellt werden.
Nach der operativen Teilsanierung vom
19.10.2009 begann der erste Behandlungszyklus der Chemotherapie am
19.11.2009 mit einer Kombination aus
Carboplatin und Paclitaxel im Abstand
von jeweils drei Wochen. Zusätzlich erfolgte zu jedem Behandlungszyklus eine
Bestimmung der CETCs aus dem Blut
der Patientin. Die Werte der einzelnen
Bestimmungen sind in Abbildung 1a dargestellt. Während dieser ersten Chemotherapie schwankten die CETC-Werte,
gemessen nach jedem Behandlungszyklus, deutlich. Nach einem anfänglichen
Anstieg bis zum dritten Zyklus auf 2.720
Da die Patientin eine weitere Operation ablehnte, wurde am 21.06.2010
eine erneute Behandlung mit Carboplatin und Paclitaxel begonnen, wobei man am vorhergehenden Schema
festhielt. Vor Beginn dieser folgenden
Chemotherapie wurden keine CETCWerte bestimmt. Die nächste Messung stammt vom 12.07.2010, vor
dem zweiten Zyklus des neuen Therapieblocks. Zusätzlich wurden am
12.07.2010, 23.08.2010, 30.11.2010
und am 11.01.2011 Chemosensitivitätstestungen nach dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt. Neben
den bereits eingesetzten Medikamenten wurde Doxorubicin, normalerweise
ein Medikament der Second-Line-Therapie, in die Tests miteinbezogen.
EoC
a)
19.12.2009
Zur quantitativen Analyse der Zellen half das Image Analysis System des
scan^R (Olympus Hamburg, Deutschland) zur wiederholten Auswertung jeweils des gleichen Areals.
Ansprechrate (%)
286
Jan. 2010
Die Anzahl der lebenden und toten
CETCs wurde zu jedem Zeitpunkt sowohl im Vergleichsansatz wie auch in
den verschiedenen Konzentrationen der
Medikamentenansätze bestimmt. Aus
dem Quotienten zwischen den einzelnen Ansätzen mit dem Vergleichsansatz
wurde der Anteil der durch das Medikament zerstörten CETCs berechnet.
einer 100%igen Wirkung überzeugen.
Carboplatin hatte eine Chemosensitivität von 83%, Paclitaxel nur 53%.
Die Klinik zeigte einen partiellen
Erfolg dieser Behandlung. So konnte
am 17.03.2010 eine Regredienz der
vorliegenden intrahepatischen Metastasierung sowie eine deutliche Regredienz der Metastasierung der Milz
festgestellt werden. Allerdings trat an
anderer Stelle ebenfalls eine progrediente, plumpe Darstellung der linken
Nebenniere auf. Therapiebegleitend
wurde am 17.03.2010 die Chemosensitivität der eingesetzten Medikamente
an den CETCs bestimmt (Abb. 1b). Die
Ergebnisse sprachen für den in der Klinik beobachteten Krankheitsverlauf.
Keines der Medikamente konnte mit
Dez. 2009
1. Lebende Leukozyten ohne Fluoreszenzfärbung; nur im Durchlicht sichtbar
2. Tote Leukozyten mit permeabler
Membran, durch die Propidiumjodid
in die Zelle eindringen kann und daraus resultierende rote Fluoreszenz
im Kern
3. Lebende epitheliale (und damit Tumor-) Zellen; nur durch den FITCkonjugierten EpCAM-Antikörper mit
grüner Fluoreszenz angefärbt
4. Tote Tumorzellen, die sowohl eine
grüne EpCAM-Färbung wie auch
eine rote Propidiumjodid-Kernfärbung aufwiesen.
CETCs/ml Blut fielen sie vor dem vierten
Zyklus wieder auf 700 CETCs/ ml Blut
ab. Darauf folgten 2.270 CETCs/ml Blut
nach Zyklus vier und 1.220 CETCs/ml
Blut nach Zyklus 5. Nach dem sechsten
Zyklus, also nach Ende dieser ersten Therapie, zeigten die CETCs einen Spitzenwert von 7.800 CETCs/ml Blut. Beobachtet man den kompletten CETC-Verlauf
dieser ersten Chemotherapie zeigt sich
insgesamt ein sägezahnartiger Anstieg
von zu Beginn 250 Zellen/ml Blut auf
7.800 Zellen/ml Blut zum Ende.
ED
Stunden bestimmt wurde. Es wurde
nach folgenden Kriterien unterschieden:
ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN Chemosensitivitätsprüfung
Anzahl Zellen pro ml Blut
FO RTB IL DUN G
Abb. 1: a) Verlauf der zirkulierenden Tumorzellen, b) Prozentuale Sensitivität der
CETCs im Verlauf der Therapie. ED=Erstdiagnose, EoC=Zyklusende
Chemosensitivitätsprüfung ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN
die Paclitaxel-Wirkung sogar nahezu
auf 0%. Die Wirkung von Carboplatin
verbesserte sich in den folgenden Messungen nicht ausreichend um das Fortschreiten der Tumorerkrankung aufzuhalten (siehe Abb. 1b). Vergleicht man
hierzu die CETCs wird ein deutlicher Zusammenhang sichtbar. Auf den ersten
Therapiezyklus sprach der Tumor noch
relativ gut an.
Die zirkulierenden Tumorzellen wurden auf einen relativ niedrigen Wert gesenkt. Daraufhin stiegen sie allerdings
in den folgenden Messungen wieder
fast exponentiell an, sogar höher als
nach der ersten Chemotherapie.
Die klinische Untersuchung vom
14.09.2010 zeigte eine Progredienz mit
einer ausgedehnten abdominalen Metastase sowie Leber- Milz- und Lymphknoten-Metastasen. Weitere Veränderungen waren vereinbar mit einer
ausgeprägten mesenterialen Metastasierung sowie einer Peritonealkarzinose. Wegen fortschreitender Progression des Tumors wurde die Therapie
am 15.11.2010 abgebrochen und zum
30.11.2010 auf pegyliertes Doxorubicin (Caelyx®) umgestellt. Die Therapie wurde 14 tägig bis 17.01.2011
gegeben. Da dieses Medikament sich
in fast allen Chemosensitivitätstests
durch eine nahezu 100%ige Wirksamkeit auszeichnete, ist die folgende
Verbesserung des Krankheitsprozesses
nachvollziehbar. Die CETCs sanken
am 11.01.2011 wieder erst auf einen
Wert von 4.150 Zellen/ml Blut und am
31.01.2011 auf 490 Zellen/ml Blut.
Allerdings wurde nach Ende der Therapie am 02.03.2011 erneut ein Leberprogress bei der Patientin festgestellt.
Diskussion
In mehreren Publikationen wurde gezeigt, dass die zirkulierenden Tumorzellen zur effektiven Bestimmung des
Krankheitsverlaufs genutzt werden
können [10-12]. Der hier vorgestellte
Fall zeigt sowohl, wie eine zusätzliche
Chemosensitivitätsprüfung an den
CETCs eine laufende Chemotherapie noch wirkungsvoller optimieren
könnte, als auch den Zusammenhang
zwischen dem Ansprechen der CETCs
auf Medikamente in der Chemosensitivität und dem klinischen Ansprechen.
Im vorliegenden Fall wurden sowohl
die Verlaufsbestimmung der CETCs für
das Therapiemonitoring wie auch die
Chemosensitivitätsprüfung durchgeführt. Innerhalb der ersten, sechszyklischen Chemotherapie zeigte sich ein
sägezahnförmiger, insgesamt jedoch
stetig steigender CETC-Verlauf. Diagnostisch wurde gegen Ende dieses
ersten Behandlungsabschnitts eine teilweise Regredienz eines Teils der Metastasen festgestellt. An anderen Stellen
war ein Progress nicht auszuschließen.
In diesem Fall konnte die erste Chemotherapie die Tumorzellen nicht komplett
eliminieren. Dieser Krankheitsverlauf
lässt sich eventuell mit der gemessenen
Chemosensitivität der eingesetzten
Medikamente erklären. Danach waren
initial 83% der im Körper vorhandenen
Tumorzellen sensitiv auf Carboplation,
53% auf Paclitaxel. Damit wurden
möglicherweise an manchen Tumorherden Erfolge erzielt, an anderen Herden ergab sich jedoch offenbar keine
Wirkung. Durch Elimination der empfindlichen Tumorzellen konnten die resistenten Zellen eventuell besser wachsen. Somit kam es trotz der Regredienz
an einigen Stellen zum Progress an anderen, mit einer steigenden Tendenz in
der Anzahl CETCs und anschließender
genereller Verschlechterung des Krankheitsbildes. Ein mögliches Self-Seeding
durch zirkulierende Tumorzellen könnte
ebenfalls die Krankheitsentwicklung erklären. Kim et al. konnten im Mausmodell zeigen, dass im Blut zirkulierende
Tumorzellen wieder in den Primärtumor
oder vorliegende Metastasen einwandern und sich dort festsetzen können
[13]. Möglicherweise wurden aus den
regredienten Tumorherden vitale Zellen
ausgeschwemmt, die an anderen Stellen im Körper neue Metastasen gebildet
haben.
In der darauf folgenden Behandlungsphase zeigte sich erneut ein deutlicher Anstieg der CETCs. Die Klinik
bestätigte ebenfalls einen Progress der
Krankheit. Diese Ergebnisse entsprachen der Resistenz der Tumorzellen
im Chemosensitivitätstest gegen die
eingesetzten Medikamente. Von den
beiden eingesetzten Medikamenten
FO RT B I LDU N G
zeigte Paclitaxel an den CETCs so gut
wie keine Wirkung. In allen vier Versuchen wurden durch das Medikament
im Durchschnitt nicht mehr als 10% der
Zellen abgetötet. Carboplatin zeigte
eine etwas bessere Wirkung. Die klinischen Untersuchungsdaten wie auch
das Ergebnis der Sensitivitätstestung
legen den Schluss nahe, dass diese Medikamentenkombination in der zweiten
Chemotherapie nicht mehr in der Lage
war, den Tumor effektiv zu bekämpfen.
Zusätzlich zu den beiden Chemotherapeutika wurde noch das Medikament
Doxorubicin während des Krankheitsverlaufs auf seine Wirksamkeit getestet.
Erstaunlicherweise wiesen die vier Chemosensitivitätstests für Doxorubicin eine
fast 100%ige Wirksamkeit auf. Wegen
des Krankheitsprogresses am Ende der
Carboplatin/Paclitaxel-Therapie wurde
die Medikation auf pegyliertes Doxorubicin umgestellt. Darunter reduzierte
sich die Zahl der CETCs deutlich. Diese
Tendenz setzte sich fort. Damit zeigte
das pegylierte Doxorubicin die durch die
Chemosensitivitätsprüfung bestimmte
Wirkung auch in vivo.
Nach Ende der pegylierten Doxorubicintherapie erlitt die Patientin erneut einen Leberprogress. Möglicherweise hätte
die Patientin von einer längeren Therapie
mit Doxorubicin weiter profitiert.
Ein weiterer Vorteil der Chemosensitivitätstets an CETCs besteht darin,
dass die Sensitivität eventueller Mikrometastasen, aus welchen ebenfalls zirkulierende Tumorzellen in die Blutbahn
abgeben, durch den Sensitivitätstest
miterfasst werden können [14]. Wird
daher eine Therapie nach den Ergebnissen dieser Tests ausgelegt, werden
diese oft unentdeckten Metastasen
möglicherweise ebenfalls wirksam bekämpft. Eine chemosensitivitätskonforme Behandlung von Patienten erscheint daher erstrebenswert.
Bereits die ersten Sensitivitätstests
unter der zweiten Chemotherapie belegten die überlegene Wirkung von
pegylierten Doxorubicin deutlich. Möglicherweise hätte eine frühere Gabe des
pegylierten Doxorubicin den Progress
der Krankheit aufhalten oder zumindest verlangsamen können.
www.journalonko.de
287
FO RTB IL DUN G
Fazit
Mit diesem Fall konnten wir die Vorteile einer therapieunterstützenden
Chemosensitivitätstestung an CETCs
darstellen. Es könnten die wirksamsten
Medikamente ausgewählt werden, um
dem Patienten die Nebenwirkungen
einer wirkungsärmeren Chemotherapie zu ersparen. Der behandelnde Arzt
muss seine Therapieentscheidung nicht
mehr nur auf statistische Studiendaten
gründen, sondern kann die eingesetzten Medikamente individuell auf den
Patienten zuschneiden.
AUTO R
Christian Weigl
Transfusionsmedizinisches
Zentrum Bayreuth
Kurpromenade 2
95448 Bayreuth
ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN Chemosensitivitätsprüfung
A B S TR AC T
C. Weigl1, C. Rabenstein1, U. Pachmann1, K. Pachmann1,2
The case reported here demonstrates how the chemotherapy of a
73-year-old woman with ovarian carcinoma was monitored and might
have been optimized through repeated testing of tumor chemosensitivity on circulating epithelial tumor cells (CETCs) from peripheral
blood. Since the characteristics of the CETCs reflect the features of the
primary tumor, the obtained results can be used for the systemic chemotherapy. Therefore, not only the progression of the disease under
insufficient chemotherapeutic drugs could have been early detected
in our case, the CETCs also contributed to find more effective agents.
1
Arbeitsgemeinschaft TZB, 2Universitätsklinikum Jena
Keywords: circulating epithelial tumor cells, CETCs, chemosensitivity
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