Tumorantigen-spezifische CD8 T-Zellen bei Patienten mit
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Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Innere Medizin II (Schwerpunkt: Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Infektiologie) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Tumorantigen-spezifische CD8+ T-Zellen bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2013 von Nathalie Schmidt geboren in Heidelberg Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. Robert Thimme 2. Gutachter: Prof. Dr. Klaus Warnatz Jahr der Promotion: 2013 Diese Arbeit wurde von April 2011 bis August 2012 im Labor von Prof. Dr. Robert Thimme in der Abteilung Innere Medizin II (Schwerpunkt: Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Infektiologie) des Universitätsklinikums Freiburg erstellt. Hiermit versichere ich, die Arbeit selbst angefertigt und keine Hilfsmittel und Quellen außer den angegebenen verwendet zu haben. Nathalie Schmidt Freiburg I Zusammenfassung Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der fünfthäufigste Tumor weltweit mit einer hohen Mortalität. Da die zur Verfügung stehenden Behandlungsoptionen limitiert sind, ist die Entwicklung neuer Therapieansätze von hoher klinischer Relevanz. Auf Grund der antitumoralen Eigenschaften des Immunsystems stellt die Immuntherapie eine vielversprechende Behandlungsoption dar. Hierbei nehmen therapeutische Tumorvakzinierungen basierend auf Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) einen hohen Stellenwert ein. Diese haben das Ziel bereits vorhandene TAA-spezifische Immunantworten zu stärken oder neue Immunantworten zu induzieren. Voraussetzung für die Entwicklung sicherer und effizienter Tumorvakzine ist eine genaue Identifizierung und Charakterisierung natürlicher Immunantworten bei Patienten mit HCC. Daher untersuchte ich im Rahmen meiner Doktorarbeit CD8+ T-Zell-Antworten gegen die TAAs α-Fetoprotein (AFP), Glypican-3, Bax, Melanom-assoziiertes Gen-A (MAGE-A) sowie NY-ESO-1. So gelang der Nachweis spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten gegen alle untersuchten TAAs mit Ausnahme von Bax und die Identifizierung neuer, bisher nicht beschriebener Epitope. Interessanterweise konnten wir in einem großen Anteil der HCC-Patienten Immunantworten gegen NY-ESO-1 und MAGE-A nachweisen. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass sich künftige Vakzinierungsstudien nicht wie bisher auf AFP und Glypican-3 beschränken sollten. Um NY-ESO-1- und MAGE-A-spezifische CD8+ T-Zellen genauer zu charakterisieren, expandierten wir diese Antigen-spezifisch. Mit Hilfe von Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I Tetrameren gelang so der direkte Nachweis TAAspezifischer CD8+ T-Zellen in einer großen Zahl von Patienten mit HCC, malignem Melanom und gesunden Kontrollen. Patienten der Kontrollkohorte wiesen hierbei signifikant niedrigere Frequenzen der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen als Patienten mit HCC (p=0,0002) oder malignem Melanom (p=0,0039) auf. Interessanterweise sind diese TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen im Gegensatz zu Virusspezifischen CD8+ T-Zellen derselben Patientenkohorte hoch dysfunktionell, so dass typische CD8+ T-Zell-Zytokine nicht oder nur in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden konnten. Um mögliche Mechanismen, die zu diesem Versagen der Tumor-spezifischen Immunantwort beitragen, zu identifizieren, stimulierten wir die CD8+ T-Zellen zusätzlich mit Interleukin-7 und -12, depletierten regulatorische T-Zellen und blockierten den inhibitorischen Rezeptor programmierter Zelltod-1 (PD-1, programmed cell death-1). Dies führte bei einem großen Teil der Patienten zu einer Steigerung der Proliferation TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen, wohingegen deren Funktionalität nur in Einzelfällen wieder hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit in künftigen Studien zusätzlich zu einer Tumorvakzinierung mit den idealen TAAs auch inhibitorische Mechanismen zu blockieren, um die Effektivität der Immuntherapie bei HCC-Patienten zu erhöhen und andauernde klinische Erfolge zu erzielen. II Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ....................................................................................................................................1 1.1 2 Das Immunsystem ...............................................................................................................1 1.1.1 Das angeborene Immunsystem ....................................................................................1 1.1.2 Das adaptive Immunsystem .........................................................................................1 1.1.3 T-Lymphozyten ............................................................................................................2 1.2 Das hepatozelluläre Karzinom..............................................................................................4 1.3 Natürlich auftretende HCC-spezifische Immunantworten ....................................................5 1.4 Tumorantigene ....................................................................................................................6 1.4.1 α-Fetoprotein ..............................................................................................................7 1.4.2 Glypican-3....................................................................................................................7 1.4.3 Bax ..............................................................................................................................8 1.4.4 MAGE-A ..................................................................................................................... 10 1.4.5 NY-ESO-1 ................................................................................................................... 11 1.5 Versagen der antitumoralen Immunantwort...................................................................... 12 1.6 Zielsetzung der Arbeit........................................................................................................ 16 Material und Methoden ............................................................................................................ 17 2.1 Material............................................................................................................................. 17 2.1.1 Chemikalien ............................................................................................................... 17 2.1.2 Puffer und Medien ..................................................................................................... 18 2.1.3 Biologika .................................................................................................................... 18 2.1.4 Magnetisierte Antikörper ........................................................................................... 19 2.1.5 Peptide ...................................................................................................................... 19 2.1.6 Tetramere.................................................................................................................. 21 2.1.7 Fluoreszenz-markierte Antikörper .............................................................................. 21 2.2 Zellulär-immunologische Methoden .................................................................................. 22 2.2.1 Zellkultur ................................................................................................................... 22 2.2.2 Isolation mononukleärer Zellen aus peripherem Blut ................................................. 22 III 2.2.3 Bestimmung der Zellzahl ............................................................................................ 22 2.2.4 Kryokonservierung der Zellen..................................................................................... 22 2.2.5 Auftauen der kryokonservierten Zellen ...................................................................... 23 2.2.6 Isolation der CD8+ T-Zellen ......................................................................................... 23 2.2.7 Bestrahlung der Stimulationszellen ............................................................................ 23 2.2.8 Antigen-unspezifische Expansion von CD8+ T-Zellen ................................................... 23 2.2.9 Antigen-spezifische Expansion von CD8+ T-Zellen ....................................................... 23 2.3 3 Durchflusszytometrie ........................................................................................................ 25 2.3.1 Grundlagen der Durchflusszytometrie ........................................................................ 25 2.3.2 Bestimmung des HLA-Profils der Kontrollkohorte....................................................... 25 2.3.3 Stimulation von CD8+ T-Zellen .................................................................................... 25 2.3.4 Oberflächenfärbung ................................................................................................... 26 2.3.5 Intrazellulärfärbung ................................................................................................... 26 2.3.6 Multizytokinfärbung .................................................................................................. 26 2.3.7 Tetramer-Färbung ...................................................................................................... 27 2.3.8 Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie ...................................................... 27 2.4 Patientenkohorte .............................................................................................................. 28 2.5 Software ............................................................................................................................ 35 2.6 Statistische Analysen ......................................................................................................... 35 Ergebnisse................................................................................................................................. 36 3.1 Patientenkohorte .............................................................................................................. 36 3.2 TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten .............................................................................. 36 3.2.1 α-Fetoprotein ............................................................................................................ 39 3.2.2 Glypican-3.................................................................................................................. 40 3.2.3 Bax ............................................................................................................................ 41 3.2.4 MAGE-A ..................................................................................................................... 41 3.2.5 NY-ESO-1 ................................................................................................................... 42 3.2.6 Immunogenität der Antigene ..................................................................................... 44 IV 3.2.7 3.3 Klinische Parameter ................................................................................................... 45 TAA-spezifische CD8+ T-Zellen ............................................................................................ 46 3.3.1 Stimulation mit IL-7 und IL-12 .................................................................................... 52 3.3.2 Depletion von Treg ...................................................................................................... 54 3.3.3 Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges ....................................................................... 57 3.3.4 Klinische Parameter ................................................................................................... 58 3.3.5 Funktionalität Virus-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC ........................ 59 4 Diskussion ................................................................................................................................. 61 5 Literaturverzeichnis................................................................................................................... 69 6 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. 88 7 Abbildungen und Tabellen......................................................................................................... 91 8 7.1 Abbildungen ...................................................................................................................... 91 7.2 Tabellen ............................................................................................................................ 92 Danksagung .............................................................................................................................. 93 1 1 Einleitung 1.1 Das Immunsystem Das Immunsystem des Menschen ist ein komplexes System aus zellulären und nicht-zellulären Bestandteilen mit der Hauptaufgabe den Körper vor Infektionen durch Mikroorganismen wie Bakterien, Viren und Pilzen zu schützen. Des Weiteren sind die Zellen des Immunsystems in der Lage, maligne transformierte Zellen zu erkennen, so dass im Idealfall eine Tumorentstehung verhindert wird. Hierbei ist die Unterscheidung zwischen körpereigenen, körperfremden und körpereigenen, jedoch transformierten Strukturen essentiell. Das Immunsystem kann in zwei Systeme unterteilt werden: das angeborene Immunsystem und das adaptive, erworbene Immunsystem [113]. 1.1.1 Das angeborene Immunsystem Zum angeborenen Immunsystem zählen sowohl anatomische Barrieren als auch verschiedene Zelltypen, wie dendritische Zellen (DCs, dendritic cells), Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und Granulozyten. Die Erkennung körperfremder Strukturen erfolgt über Mustererkennende Rezeptoren (PRR, pattern recognition receptors), deren Spezifität genetisch determiniert ist. Dies hat zur Folge, dass nur eine geringe Anzahl an Antigenen durch Zellen des angeborenen Immunsystems erkannt werden kann. Hierbei handelt es sich ausschließlich um hochkonservierte Strukturen, die als Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs, pathogene associated molecular patterns) bezeichnet werden. Die Antigenerkennung resultiert in einer Zellaktivierung und in einer konsekutiven Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) sowie in einer gesteigerten Phagozytosefähigkeit [14,113]. Darüber hinaus wird die Produktion proinflammatorischer Zytokine induziert, die Leukozyten zum Gebiet der Entzündung rekrutieren [36]. Aktivierte DCs wandern in lokale Lymphknoten, wo sie zu Antigen-präsentierenden Zellen (APCs, antigen presenting cells) reifen, die in der Lage sind, Zellen des adaptiven Immunsystems zu aktivieren [64,142]. 1.1.2 Das adaptive Immunsystem Die wichtigsten Merkmale des adaptiven Immunsystems sind zum einen die gezielte, Antigenspezifische Immunreaktion, zum anderen die Bildung eines immunologischen Gedächtnisses, das bei einem zweiten Antigenkontakt eine schnellere und effektivere Immunantwort ermöglicht [107]. Die Zellen des adaptiven Immunsystems sind Lymphozyten, die in B- und T-Lymphozyten unterteilt werden. Jede dieser Zellen trägt einen individuellen B-Zell- bzw. T-Zell-Rezeptor an ihrer Oberfläche, 2 der die Erkennung genau eines spezifischen Antigens ermöglicht. Durch somatische Rekombination entsteht ein fast unbegrenztes Repertoire an strukturell einzigartigen Rezeptoren, so dass nahezu jedes körperfremde Antigen erkannt werden kann [113]. Um die Entstehung autoimmuner Prozesse zu vermeiden, werden Lymphozyten, die körpereigene Antigene zu stark binden, im Knochenmark (B-Zellen) bzw. im Thymus (T-Zellen) deletiert [146]. Im Gegensatz hierzu führt die Antigenerkennung in der Peripherie im Rahmen einer Entzündungsreaktion zu einer Aktivierung und klonalen Expansion der Antigen-spezifischen Zelle [113]. Die durch B-Zellen vermittelte Immunreaktion wird als humorale Immunantwort bezeichnet. Wird eine B-Zelle aktiviert, wandelt sie sich in eine Plasmazelle, die die Spezifizität des B-Zell-Rezeptors beibehält und in der Lage ist, Antigen-spezifische Antikörper zu sezernieren. Diese binden an extrazelluläre Antigene und führen auf diese Weise zu einer Neutralisierung von Toxinen oder Viren und zu einer Opsonierung von Bakterien oder eukaryoten Zellen. Dies begünstigt eine Lyse durch NKZellen oder eine Phagozytose durch Makrophagen und Granulozyten [113]. Die durch T-Zellen vermittelte Immunreaktion wird als zelluläre Immunantwort bezeichnet und wird im nächsten Kapitel genauer erläutert. 1.1.3 T-Lymphozyten Die Vorläuferformen der T-Zellen entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark. Diese wandern im Laufe ihrer Entwicklung in den Thymus, wo sie reifen und sowohl positiv als auch negativ selektioniert werden [144,146]. Auf Grund der Expression zweier Korezeptoren des T-Zell-Rezeptors, CD4 und CD8, lassen sich T-Zellen in zwei Gruppen unterteilen: CD4+ T-Zellen und CD8+ T-Zellen, sogenannte zytotoxische T-Zellen. CD4+ T-Zellen lassen sich unter anderem anhand ihrer Zytokinproduktion in weitere Subtypen, wie Th1, Th2, Th17 und regulatorische T-Zellen (Treg) unterteilen [113]. Im Gegensatz zu B-Zellen können T-Zellen ihr spezifisches Antigen nur erkennen, wenn dieses in Form von Peptiden, sogenannten Epitopen, gemeinsam mit Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC, major histocompatibility complex) präsentiert wird. Im Menschen wird der MHC häufig auch als humanes Leukozytenantigen (HLA, human leukocyte antigen) bezeichnet. MHC Moleküle lassen sich in zwei Klassen unterteilen [113]. MHC Klasse I Moleküle werden durch die drei HLA-Gene HLA-A, HLA-B und HLA-C kodiert und auf allen kernhaltigen Zellen, mit Ausnahme testikulärer Keimzellen, exprimiert [70,113]. Im Gegensatz hierzu werden MHC Klasse II Moleküle, die durch HLA-DP, HLA-DQ und HLA-DR kodiert werden, fast ausschließlich auf professionellen APCs, wie DCs, Makrophagen und B-Zellen, exprimiert. Während MHC Klasse II Moleküle exogen aufgenommene Antigene an CD4+ T-Zellen präsentieren, werden von 3 MHC Klasse I Molekülen hauptsächlich intrazelluläre Antigene, die im Proteasom zu kleineren Peptidfragmenten prozessiert wurden, an CD8+ T-Zellen präsentiert [113]. CD8+ T-Zellen benötigen für ihre vollständige Aktivierung sowohl starke kostimulatorische Signale durch APCs als auch eine zusätzliche Stimulation durch CD4+ Th1-Zellen. Aktivierte CD8+ T-Zellen sind in der Lage, die Apoptose ihrer Zielzellen zu induzieren. Dies kann über verschiedene Signalwege erfolgen, beispielsweise durch die Expression des CD95-Liganden (Fas-Ligand, FasL) oder des Tumornekrosefaktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL, tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand) [8]. Auch die Freisetzung von Perforin und Granzyme B induziert eine Lyse und Apoptose der Zielzellen. Des Weiteren sind CD8+ T-Zellen in der Lage, diverse Zytokine, wie beispielsweise Interferon-γ (IFNγ), zu sezernieren [113]. 1.1.3.1 Interleukin-7 und Interleukin-12 Die Fähigkeit des Immunsystems, trotz der natürlichen T-Zell-Depletion und -Proliferation eine konstante Zahl an peripheren T-Zellen aufrecht zu erhalten, wird als Homöostase bezeichnet. Diese Prozesse werden überwiegend durch Zytokine gesteuert. Hierbei nehmen Interleukin (IL)-7 und -12 einen zentralen Stellenwert ein. IL-7 zählt zu den Zytokinen mit gemeinsamer γ-Kette, die für die Generation, die Proliferation und das Überleben von Lymphozyten von entscheidender Bedeutung sind. IL-7 wird konstitutionell im Knochenmark sowie in Epithelzellen des Thymus und des Intestinaltraktes produziert. Der Effekt von IL-7 wird unter anderem durch die Expression des IL-7-Rezeptors (IL-7R) auf der Zelloberfläche, den Differenzierungsstatus der T-Zelle sowie durch die IL-7-Konzentration reguliert. In naiven T-Zellen bewirkt die permanente Stimulation durch niedrige Mengen an IL-7 keine Proliferation, sondern ein verlängertes Überleben im Ruhezustand. Dieser Effekt wird durch hohe Mengen des antiapoptotischen Proteins B-Zell-Lymphoma-2 (BCL-2) vermittelt. Darüber hinaus nimmt IL-7 gemeinsam mit IL-15 eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Proliferation und des Überlebens von CD8+ T-Gedächtniszellen ein. Im Gegensatz hierzu zeichnen sich Effektor-T-Zellen durch eine geringe Expression des IL-7R aus, so dass in dieser Phase der Immunantwort IL-7 nur eine untergeordnete Rolle zukommt [17,18]. Für die Ausreifung in Effektor-T-Zellen benötigen naive CD8+ T-Zellen neben ihrem spezifischen Antigen und kostimulatorischen Molekülen ein drittes Signal durch IL-12 oder Klasse-I-Interferone. Auch die Proliferation und das Überleben der Effektor-T-Zellen sowie die Entstehung der CD8+ T-Gedächtniszellen werden durch IL-12 begünstigt. Hierbei scheint vor allem die Hochregulierung des anti-apoptotischen Proteins BCL-3 eine zentrale Rolle zu spielen [158]. 4 1.2 Das hepatozelluläre Karzinom Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der fünfthäufigste Tumor weltweit mit einer hohen Mortalität. Es stellt die dritthäufigste Ursache für Tumor-bedingte Todesfälle dar und führt so jährlich zu über 600.000 Todesfällen [28,125,138]. In der Regel entwickelt sich das HCC in Patienten mit chronischen Lebererkrankungen. Zu den häufigsten Risikofaktoren zählen Infektionen mit dem Hepatitis B Virus (HBV) und dem Hepatitis C Virus (HCV) sowie Lebererkrankungen als Folge von Ethanol-Abusus und Steatosis hepatis. Aus diesem Grund findet sich in Gebieten wie Süd-Ost-Asien und Subsahara-Afrika, in denen HBVInfektionen endemisch auftreten, eine hohe Prävalenz des HCCs. Zu den weniger häufigen Ursachen zählen hereditäre Lebererkrankungen sowie Autoimmunhepatitis und Toxine, wie beispielsweise Aflatoxin. Diese Risikofaktoren führen in der Regel zu der Entwicklung einer Leberzirrhose, welche in 80-90% der Patienten die Grundlage der HCC-Entstehung darstellt [46,48]. Das kumulative FünfJahres-Risiko für die Entstehung eines HCCs in Patienten mit Leberzirrhose liegt zwischen 5% und 30% und ist sowohl von der ethnischen Zugehörigkeit als auch von der Ursache und dem Stadium der Leberzirrhose abhängig [50]. Darüber hinaus haben Männer ein etwa dreifach erhöhtes Risiko ein HCC zu entwickeln. Dies lässt sich zum einen durch eine erhöhte Exposition gegenüber Risikofaktoren erklären, zum anderen scheinen hohe Androgen-Level die Entstehung eines HCCs zu begünstigen [48,176,177]. Neben Zeichen der Leberzirrhose und portalen Hypertension zählen Gewichtsverlust, Schmerzen im rechten oberen Quadranten des Abdomens sowie Anämie zu den unspezifischen Symptomen des HCCs. Allerdings treten diese häufig erst in fortgeschrittenen Stadien der Tumorerkrankung auf, weshalb regelmäßige Screening-Untersuchungen bei Hochrisikopatienten empfohlen werden. Bildgebende Verfahren wie Computertomographie und Magnetresonanztomographie mit Kontrastmittelgabe stellen die Grundlage der Diagnose dar. Hier zeigen HCC-Läsionen eine typische Kontrastmittelanreicherung in der arteriellen Phase kombiniert mit einer Hypointensität in der portalvenösen Phase, da die Blutversorgung des Tumors in der Regel durch die Arteria hepatica erfolgt. Bei atypischen Befunden wird die Diagnose durch eine Biopsie gesichert. Neben der Bildgebung spielt die Bestimmung des α-Fetoproteins (AFP) im Serum eine entscheidende Rolle. Bei Patienten mit einer Leberzirrhose sind Serum-AFP-Level über 200 ng/ml hoch spezifisch für das Vorhandensein eines HCCs [47]. Da die Diagnose eines HCCs häufig erst in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung gestellt wird und die zur Verfügung stehenden Behandlungsoptionen limitiert sind, haben Patienten mit HCC eine relative Fünfjahresüberlebensrate von nur 14% [5,46]. Zu den Behandlungsmöglichkeiten zählen neben der Leberresektion und der Lebertransplantation, die Radiofrequenz-(Thermo-)Ablation 5 (RF(T)A), die perkutane Ethanolinjektion (PEI) und die transarterielle Chemoembolisation (TACE) [47]. Darüber hinaus ermöglicht die Therapie mit Sorafenib, einem Multi-Kinase-Inhibitor, bei Patienten in einem fortgeschrittenen Erkrankungsstadium ein verlängertes Überleben [77,101]. Diese Therapien sind jedoch nur in ausgewählten Patienten möglich und mit zahlreichen Kontraindikationen und Nebenwirkungen assoziiert. Daher ist die Entwicklung neuer Therapieansätze von großer Bedeutung. Eine Studie aus dem Jahr 1991 zeigte bei Patienten mit primären sowie sekundären Lebertumoren eine intratumorale Anreicherung von Lymphozyten, die in vitro mit IL-2 und anti-CD3-Antikörper stimuliert und anschließend in eine intrahepatische Arterie injiziert wurden. Diese Ergebnisse stellten eine entscheidende Grundlage für die Entwicklung immuntherapeutischer Strategien für Patienten mit HCC dar [148]. So führte, wie in einer folgenden klinischen Studie gezeigt, die adjuvante Administration von autologen Lymphozyten, die auf gleiche Weise in vitro aktiviert wurden, bei Patienten nach kurativer Resektion des HCCs zu einem signifikant späteren Auftreten des Tumorrezidives sowie zu einem signifikant verlängerten rezidivfreien Überleben [149]. Auf Grund dieses möglichen antitumoralen Effektes des Immunsystems stellt die Immuntherapie eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit beim HCC dar. 1.3 Natürlich auftretende HCC-spezifische Immunantworten T-Zell-vermittelte Immunantworten haben eine protektive Rolle in Tumorerkrankungen und können zur Regression verschiedener Tumore sowohl im Maus-Modell als auch im Menschen führen [130]. Für die Generierung einer effektiven antitumoralen Immunantwort sind jedoch mehrere Schritte notwendig. Nach der Aufnahme Tumor-assoziierter Antigene (TAAs) durch DCs werden die TAAs prozessiert und über MHC Klasse I und II Moleküle den T-Zellen präsentiert. Dies führt gemeinsam mit weiteren kostimulatorischen Signalen zu einer Aktivierung TAA-spezifischer T-Zellen [108]. Dieser Vorgang wird auch als Priming bezeichnet. Die aktivierten TAA-spezifischen T-Zellen müssen das Tumorgewebe infiltrieren, um antitumoral wirksam zu sein. Tatsächlich sind HCC-Läsionen von einer großen Zahl Lymphozyten infiltriert [173]. Die Stärke dieser T-Zell-Infiltration korreliert mit einem verminderten Wiederauftreten des HCCs nach Tumorresektion und Lebertransplantation und wird durch eine hohe Expression von Adhäsionsmolekülen im Tumorgewebe, wie beispielsweise interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1) und vaskuläres Adhäsionsmolekül-1 (VAP-1, vascular adhesion protein-1), begünstigt [157,162,173]. In der Gruppe der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TILs) stellen CD8+ T-Zellen den größten Anteil dar [162]. 6 1.4 Tumorantigene Basierend auf der Expression des Ursprungsproteins lassen sich TAAs im Allgemeinen in fünf Gruppen unterteilen [160]: Virale Antigene; Antigene, die durch Mutationen entstehen; überexprimierte, universelle Antigene; Differenzierungsantigene; Tumor-spezifische, geteilte Antigene. Virale Antigene stammen von onkogenen Viren ab. Hierzu zählt beispielsweise das E7 Oncoprotein des humanen Papillomavirus 16, das in einem Großteil der Zervixkarzinome nachgewiesen werden kann [129].Antigene, die durch Mutation von Proteinen im Tumorgewebe entstehen, sind spezifisch für das Tumorgewebe und können beispielsweise die Zellproliferation stimulieren oder die Apoptose inhibieren [160]. Auch chimäre Proteine, die durch chromosomale Translokation entstehen, zählen zu dieser Gruppe. Ein Beispiel hierfür ist die Expression von bcr-abl in myeloischen Leukämien, das durch eine Translokation t(9;22) entsteht [16]. Auch nicht-mutierte Proteine, die sowohl im gesunden Gewebe als auch im Tumor exprimiert werden, können als TAAs dienen. Hierzu zählt zum Beispiel HER-2/neu, das in einem Teil der Mamma- und Ovarial-Karzinome verstärkt exprimiert wird [54]. Weiterhin konnten Differenzierungsantigene vor allem im malignen Melanom nachgewiesen werden. Diese Proteine sind typisch für den Zelltyp, der dem Tumor zu Grunde liegt. Ein Beispiel hierfür ist das melanozytäre Enzym Tyrosinase [154]. Tumor-spezifische, geteilte Antigene werden durch Gene codiert, die in gesundem Gewebe inaktiv sind und in zahlreichen verschiedenen Tumorarten reaktiviert werden. Sie können typischerweise während der Embryonalentwicklung und/oder in testikulären Keimzellen, die keine MHC Klasse I Moleküle exprimieren, nachgewiesen werden [70]. Ein typischer Vertreter dieser sogenannten Tumor/Testis-Antigene ist die Melanom-assoziierte Gen-Familie (MAGE, melanoma-associated gene), auf die in Kapitel 1.4.4 genauer eingegangen wird [41,147]. Zusammenfassend sind viele verschiedene Klassen Tumor-spezifischer Antigene bekannt, die durch unterschiedliche Mechanismen entstehen. Auch für das HCC wurden zahlreiche TAAs beschrieben. Die HCC-spezifischen Antigene, die in dieser Doktorarbeit von Bedeutung sind, werden in den folgenden Abschnitten genauer erläutert. 7 1.4.1 α-Fetoprotein AFP ist ein Glykoprotein, das zu einer albuminoiden Genfamilie zählt, zu der auch Albumin, alphaAlbumin und das Vitamin-D-bindende Protein gerechnet werden. Diese Proteine zeichnen sich vor allem durch ihre Liganden/Träger-Transportfunktion aus, sie haben jedoch noch zahlreiche weitere Funktionen, wie beispielsweise Chemotaxis, Leukozytenadhärenz und Esteraseaktivität [106,111]. AFP ist ein onkofetales Antigen, das während der fetalen Entwicklung sowohl in der Leber als auch im Dottersack und Gastrointestinaltrakt synthetisiert wird. Unmittelbar vor der Geburt wird die AFPSynthese terminiert. Im Erwachsenen können erhöhte AFP-Werte im Serum bei verschiedenen Erkrankungen nachweisbar sein, zum Beispiel bei HCC, Keimzelltumoren und vereinzelt auch bei chronischer Hepatitis. In der Klinik dient AFP als Tumormarker für HCC, da es in 50-80% der Patienten erhöht ist [38,153]. Auf Grund der oben beschriebenen Eigenschaften handelt es sich bei AFP um ein Tumor-spezifisches, geteiltes Antigen. Zahlreiche Studien konnten eine große Zahl AFP-spezifischer Epitope identifizieren, die in der Lage sind nach in vitro Stimulation mit den korrespondierenden AFP-Peptiden niedrige bis moderate CD8+ und CD4+ T-Zell-Antworten in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs, peripheral blood mononuclear cells) von Patienten mit HCC hervorzurufen [24,26,99,109,110,151,166]. Interessanterweise konnte in Maus-Studien gezeigt werden, dass die erfolgreiche Induktion von Immunantworten durch Vakzinierung mit AFP zu einer Regression des HCCs führen kann [69].Bis zum heutigen Zeitpunkt bildet AFP daher die Grundlage der meisten klinischen Studien zur Entwicklung therapeutischer Tumorvakzinierungen. In einer ersten Phase-I-Studie wurden sechs Patienten, die an einem AFP-exprimierenden HCC erkrankt waren, mit vier AFP-Peptiden immunisiert. Alle Patienten entwickelten AFP-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten. Diese Studie unterstreicht so die Immunogenität von AFP in vivo [26]. In einer konsekutiven Phase-I/II-Studie mit einer ähnlichen Kohorte wurden Patienten mit vier AFP Peptiden vakziniert, die auf autologe DCs geladen wurden, da sowohl im Mausmodell als auch in in vitro Zellkulturen auf DCs geladene Peptide eine höhere Immunogenität aufweisen [23,25]. Die in dieser Studie induzierten Immunantworten waren jedoch nur transient. 1.4.2 Glypican-3 Ein weiterer Vertreter der Gruppe der onkofetalen Proteine ist Glypican-3 (GPC-3). Es zählt zur Familie der Glykosyl-Phosphatidylinositol (GPI)-verankerten Heparansulfatproteoglykane der Zelloberfläche [13,53]. Erstmals entdeckt wurde GPC-3 bei der Erforschung des Simpson-GolabiBehmel-Syndroms, das durch eine Loss-of-function-Mutation im GPC-3-Gen hervorgerufen wird. Hierbei handelt es sich um eine X-chromosomale Erkrankung, bei der ein prä-und postnatales 8 gesteigertes Wachstum sowie zahlreiche viszerale und ossäre Anomalien im Vordergrund stehen. Auch ein erhöhtes Tumorrisiko wurde beschrieben [52,127]. GPC-3 wird in über 70% der HCC exprimiert, wohingegen es in gesundem Lebergewebe und in benignen Lebererkrankungen nicht detektierbar ist [29]. Da es nicht nur auf der Zelloberfläche exprimiert sondern auch in die Tumorumgebung sezerniert wird, kann es, wie auch AFP, als serologischer Tumormarker für das HCC dienen [29,72]. Durch Bindung von zellulären Wachstumsfaktoren scheint GPC-3 eine aktive Rolle in der Karzinogenese zu spielen. So stimuliert GPC-3 beispielsweise den Wnt-Signalweg. In Geweben, in denen der Wnt-Signalweg einen dominanten Einfluss ausübt, wird die Zellproliferation durch eine vermehrte GPC-3-Expression daher gesteigert. Letzteres ist beispielsweise in Zellen des HCCs der Fall, sodass eine Überexpression von GPC-3 das Tumorwachstum fördert [52]. Interessanterweise kann die Proliferationsrate von HCC-Zelllinien durch die Infektion mit einem Lentivirus, das lösliches GPC-3 exprimiert, verringert werden, da das lösliche GPC-3 anstelle des von der Zelllinie exprimierten GPC-3 an die Wachstumsfaktoren bindet [181]. Im Maus-Modell zeigt GPC-3 eine starke Immunogenität und ist in der Lage, eine effektive antitumorale Immunantwort hervorzurufen ohne Autoimmunität zu induzieren [117]. Auch bei Patienten mit HCC war es möglich durch die in vitro Stimulation von PBMCs mit GPC-3-Peptiden spezifische CD8+ T-Zell-Antworten hervorzurufen [88]. In mehreren Phase-I-Studien wurden HCC-Patienten in einem fortgeschrittenen Tumorstadium mit GPC-3-Peptiden vakziniert. Dies resultierte in einer erhöhten Frequenz GPC-3-spezifischer CD8+ T-Zellen, die mit der Dosis der verabreichten Peptide korrelierte. Darüber hinaus waren Zellklone von PBMCs der Patienten in der Lage, HCC-Zelllinien, die GPC-3 exprimierten, zu erkennen [174]. So konnte selbst zwei Monate nach der Behandlung in etwa 2/3 der Patienten eine Stabilisierung der Tumorerkrankung festgestellt werden. Interessanterweise korreliert die Höhe der GPC-3-spezifischen CD8+ T-Zell-Frequenz signifikant mit dem Gesamtüberleben der Patienten [135]. 1.4.3 Bax Eines der typischen Kennzeichen von Tumorzellen ist das Umgehen von Apoptose [71]. Dies wird häufig durch eine Dysregulation von pro- und antiapoptotischen Mitgliedern der BCL-2-Familie begünstigt [172]. Bax ist gemeinsam mit Bak ein proapoptotisches Mitglied der BCL-2-Familie, das vor allem bei der intrinsischen Induktion von Apoptose eine entscheidende Rolle spielt (Abb. 1.1). Hierbei resultiert eine Inaktivierung antiapoptotischer Mitglieder der BCL-2-Familie, wie BCL-2, in einer Aktivierung von Bax und Bak. Diese begünstigen die Induktion der Apoptose durch eine mitochondriale Fragmentierung und eine konsekutive Freisetzung von Cytochrom C. Durch eine 9 Verbindung von Cytochrom C mit dem Apoptose-auslösenden Faktor 1 (APAF1, apoptotic protease activating factor 1) entsteht ein Apoptosom, das Caspase-9 aktiviert. Aktivierte Caspase-9 aktiviert ihrerseits Caspase-3, die letztendlich die Apoptose ermöglicht. Darüber hinaus können Bax und Bak über den extrinsischen Pfad aktiviert werden. Dieser wird durch den Tumornekrosefaktor-Rezeptor-1 (TNFR1) und Fas reguliert und führt über eine Caspase-8-Aktivierung und einer konsekutiven Aktivierung des BH3 interacting domain death agonist (BID) letztendlich ebenfalls zu einer Induktion von Bax und Bak [175]. Ein gesteigerter proteasomaler Abbau oder genetische Mutationen können im Tumorgewebe zu einer verminderten Expression von Bax führen und auf diese Weise die Apoptose limitieren [120]. Verminderte Bax-Level konnten in einer Vielzahl verschiedener Tumore nachgewiesen werden [51,96,102]. Interessanterweise zeigt eine gesteigerte proteasomale Degradierung von Bax klinische Relevanz, da sie beispielsweise im Prostatakarzinom mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium korreliert [96] und bei der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) zu einer Chemoresistenz und somit zu einer schlechteren Prognose beiträgt [1,98,126,145]. Dieser gesteigerte proteasomale Abbau von Bax in Tumorzellen resultiert in einer vermehrten Präsentation von Peptiden, die von Bax abstammen, durch MHC Klasse I Moleküle an der Zelloberfläche. Dies ist in gesunden Zellen nicht der Fall, da hier die Bax-Expression und -Funktion, wie oben beschrieben, nicht durch proteasomalen Abbau sondern durch Interaktion mit anderen Mitgliedern der BCL-2-Familie reguliert wird. Interessanterweise sind Bax-spezifische CD8+ T-Zell-Klone aus dem Blut gesunder Probanden in der Lage, Tumorzellen von CLL und HCC, spezifisch zu erkennen und zu töten [120]. 10 Abbildung 1.1 Regulation der Apoptose durch Bax Adaptiert nach [175] 1.4.4 MAGE-A Bereits zu Beginn der neunziger Jahre des 20. Jahrhunderts gelang erstmals die Klonierung eines humanen TAAs, das später als MAGE-A1 bezeichnet wurde und in der Lage war, spontane CD8+ T-Zell-Antworten zu induzieren [156,161]. MAGE-A1 zählt zur Familie der Tumor/TestisAntigene [15]. Nachdem es zunächst im malignen Melanom entdeckt wurde, konnte es später in zahlreichen weiteren Tumoren, einschließlich in 80% der HCCs, nachgewiesen werden [22,170,178]. Bis heute wurde eine Vielzahl weiterer Mitglieder der MAGE-Familie identifiziert, deren Genprodukte alle einen gemeinsamen, konservierten Aminosäure-Abschnitt aufweisen, die sogenannte MAGEhomologe Domäne. Basierend auf ihrer Gewebs-spezifischen Expression und chromosomalen Lokalisation können die Mitglieder der MAGE-Familie in Typ I (Tumor/Testis-Antigene) und Typ II (ubiquitäre MAGE) unterteilt werden. MAGE-A zählt, wie auch MAGE-B und MAGE-C, zu Typ I [134]. Zur MAGE-A-Familie werden 12 Subtypen gerechnet, MAGE-A1 bis MAGE-A12, die alle auf dem X-Chromosom lokalisiert sind [41]. Im gesunden Gewebe ist die Expression von MAGE Typ I durch eine DNA-Methylierung der Promotorregion unterdrückt. Im Tumorgewebe kommt es jedoch durch epigenetische Prozesse zu einer Demethylierung, die eine aberrante Expression zur Folge hat [143]. 11 Die exakte Funktion der Mitglieder der MAGE-A-Familie in den Keimzellen und im Tumorgewebe ist bisher nicht vollständig verstanden, jedoch scheinen sie eine wichtige Rolle in der humanen Tumorentstehung zu spielen. MAGE-A1 beispielsweise fungiert als potenter Repressor der Transkription durch eine Rekrutierung von Histon-Deacetylasen und Bindung an Ski-interagierende Proteine [94]. Dies führt unter anderem zu einer Inhibierung des Tumorsuppressors p53 [112]. Auf Grund der spezifischen Expression von MAGE-A1 im Tumorgewebe und seiner möglichen Rolle bei der Tumorentstehung ist MAGE-A1 ein vielversprechendes Zielmolekül für immuntherapeutische Ansätze. Interessanterweise sind Proteine der MAGE-A-Familie in der Lage, spezifische CD8+T-ZellAntworten nach in vitro Stimulation zu induzieren [22,65,179]. In einer Phase-I-Studie mit Patienten mit fortgeschrittenem malignen Melanom resultierte die Vakzinierung mit einem rekombinanten Kanarienpockenvirus, das Epitope von MAGE-A1 und MAGE-A3 enthielt, in einer Tumorregression und einer Induktion spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten [159]. Auch bei Patienten mit HCC konnten MAGE-A-spezifische CD8+ T-Zellen intratumoral nachgewiesen werden [178]. Jedoch sind diese Zellen trotz der hohen Anzahl MAGE-A-exprimierender HCCs bisher nur wenig untersucht. 1.4.5 NY-ESO-1 NY-ESO-1 zählt ebenfalls zur Gruppe der Tumor/Testis-Antigene, deren Expression im Gesunden auf die männlichen Keimzellen beschränkt ist [15]. NY-ESO-1 ist ein hoch immunogenes TAA, das in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert wird, beispielsweise im HCC, malignen Melanom, Mamma-Karzinom und Ovarial-Karzinom [21,35]. So weisen 36,7% der HCCs eine Expression von NY-ESO-1 messenger Ribonukleinsäure (mRNS) auf [33]. Bei etwa 25-50% der Patienten mit fortgeschrittenem, NY-ESO-1 exprimierendem Tumor können NY-ESO-1-spezifische Antikörper nachgewiesen werden. Das Auftreten dieser Antikörper korreliert in der Regel auch mit einer spezifischen Reaktion der CD8+ T-Zellen. Eine Progression des Tumors führt zu einer Steigerung der TAA-spezifischen Immunantworten, wohingegen eine Resektion oder Regression des Tumors in einer Abnahme der Immunreaktionen resultiert. Diese Kombination aus humoraler und zellulärer Immunantwort in einer Vielzahl der Patienten zeigt deutlich, dass es sich bei NY-ESO-1 um eines der immunogensten TAAs handelt. Dies macht NY-ESO-1 zu einem vielversprechenden Ziel TAA-spezifischer Immuntherapien [27,79,82,90,116,139]. Bis heute konnten bei Patienten mit malignem Melanom zahlreiche NY-ESO-1-spezifische CD8+ T-ZellEpitope identifiziert werden [12,45,66,78,81,86,105,163,169]. Daher stellt NY-ESO-1 eine entscheidende Grundlage für die Entwicklung der Immuntherapie bei malignem Melanom dar. In ersten klinischen Studien wurden Peptid-basierte Vakzine verwendet, die in der Lage waren, NY-ESO-1-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten zu induzieren. Interessanterweise konnte bei einigen 12 Patienten sogar eine Stabilisierung der Erkrankung erreicht werden [10,80,83]. In einer konsekutiven Studie mit Patienten nach vollständiger Tumorresektion diente erstmals ein rekombinantes Protein als Vakzinierungsgrundlage. Dies führte sowohl zu einer Induktion der humoralen Immunantwort als auch zu einer CD4+ und CD8+ T-Zellantwort in einem Teil der Patienten. Zudem konnten klinische Erfolge in Form eines reduzierten Rekurrenz-Risikos erzielt werden [40]. Jedoch konnten diese vielversprechenden Erfolge in einer weiteren Studie mit Patienten im Tumorstadium III/IV nicht bestätigt werden. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die hohe Zahl an Treg im Blut der Patienten in diesen fortgeschrittenen Tumorstadien [119]. Doch NY-ESO-1 dient nicht nur als Grundlage für die Entwicklung von TAA-spezifischen Vakzinierungen, sondern ist auch bei adoptiven Ansätzen der Immuntherapie von Bedeutung. So konnte aus dem Blut eines Patienten mit metastasiertem malignen Melanom ein CD4+ T-Zell-Klon gewonnen werden, der spezifisch ein HLA-restringiertes NY-ESO-1-Epitop erkannte. Dieser wurde in vitro expandiert und dem Patienten wieder injiziert. Interessanterweise konnte hiermit eine vollständige Rückbildung der pulmonalen Metastasen und Lymphknotenmetastasen erreicht werden [76]. Diese Studie zeigt die große Bedeutung der Identifizierung exakter T-Zell-Epitope für die Entwicklung erfolgreicher Immuntherapien. 1.5 Versagen der antitumoralen Immunantwort Trotz des Nachweises TAA-spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten scheint ihr Einfluss auf die Kontrolle der Tumorentstehung und des Tumorwachstums eher gering. Die genauen Mechanismen, die zu einem Versagen der Tumor-spezifischen Immunantwort beitragen, sind bisher nur wenig charakterisiert. In den letzten Jahren konnten jedoch neue Einblicke gewonnen werden, so dass für das HCC eine große Zahl verschiedener immunsuppressiver Mechanismen beschrieben wurden (Abb. 1.2). So kann das Immunsystem bereits in frühen Stadien der Tumorgenese durch die Eliminierung von Tumorzellen vor der Tumorentstehung schützen. Gelingt jedoch nicht die vollständige Eliminierung aller Tumorzellen, folgt eine Equilibriumsphase, in der das Immunsystem einen Selektionsdruck auf die Tumorzellen ausübt. Durch eine Akkumulation mehrerer Mutationen erlangen einige Tumorzellen eine gesteigerte Resistenz gegenüber der antitumoralen Immunabwehr. So verhindern viele Tumore die Antigenprozessierung und -präsentation, etwa durch eine verminderte HLA Klasse I Expression [3,104]. Die Tumorzellen, die in der Lage sind der Überwachung des Immunsystems zu entkommen, können schließlich ungehindert proliferieren und bilden einen Tumor, der vor dem Einfluss des Immunsystems geschützt ist. So resultiert dieser Prozess, der auch als Immunoediting bezeichnet wird, letztendlich in der Entstehung eines Tumors trotz einer intakten Immunabwehr [43,44]. Interessanterweise finden sich auch im HCC Hinweise, die eine Tumorzellveränderung durch 13 Immunoediting nahelegen. So zeigen viele HCCs eine Herabregulierung von Fas und dem IFNγRezeptor, die für die zytotoxische Effektorfunktion der CD8+ T-Zellen obligat sind [114,115]. Abbildung 1.2 Versagen der antitumoralen Immunantwort Zahlreiche verschiedene Mechanismen tragen zu einem Versagen der antitumoralen Immunantwort bei. 1. Immunoediting; 2. Priming-Defekte und Beeinträchtigung der TAA-Prozessierung und -Präsentation; 3. Hochregulierung inhibitorischer Rezeptoren und deren Liganden; 4. Suppression der NK-Zell-Funktion; 5. Immunsuppressive Zellen; 6. Fehlende CD4+ T-Zell-Hilfe. Weiterhin stellt die Leber ein hoch immuntolerantes Organ dar, in dem das Priming von T-Zellen zu einer Induktion von Antigentoleranz führen kann [136,152]. Das korrekte Priming von CD8+ T-Zellen wird darüber hinaus durch eine mangelnde IL-12-Sekretion der DCs in HCC-Patienten erschwert [122]. Auch eine beeinträchtigte Prozessierung und Präsentation der TAAs im HCC-Gewebe tragen zu der Störung des Primings bei. Mögliche Ursachen hierfür sind eine verminderte Expression von MHC Klasse I und kostimulatorischen B7-Molekülen [58,93,150]. Die Dysfunktion TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen ist zudem mit einer Expression inhibitorischer Rezeptoren assoziiert. So konnte in Tumorpatienten eine Hochregulierung verschiedener inhibitorischer Rezeptoren, wie beispielsweise zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen-4 (CTLA-4, 14 cytotoxic T-lymphocyte antigen-4), T-Zell-Immunglobulin-Domäne, -Muzin-Domäne-3 (Tim-3, T-cell immunoglobulin domain, mucin domain) oder programmierter Zelltod-1 (PD-1, programmed cell death-1) gezeigt werden [56,131,133]. Zurzeit ist PD-1 hierbei der am besten untersuchte Rezeptor, der vor allem an der Zelloberfläche aktivierter T-Zellen exprimiert wird [108]. Durch eine Repression von Bcl-xL und zahlreichen Transkriptionsfaktoren führt die Aktivierung von PD-1 durch den PDLiganden-1 (PD-L1) zu einer verminderten Effektorfunktion der CD8+ T-Zellen und letztendlich zu einer Anergie oder funktionellen Erschöpfung [84]. Interessanterweise zeigen HCC-infiltrierende Lymphozyten eine Hochregulierung von PD-1. Dies korreliert mit einer verminderten Expression von CD28 und CD3ζ auf CD8+ T-Zellen, die von entscheidender Bedeutung bei der T-Zell-Aktivierung sind, sowie mit einer vermehrten Caspase-3-Aktivität, die, wie in Kap. 1.4.3 beschrieben, Apoptose initiiert [75,103]. Tatsächlich konnte beim HCC neben einer erhöhten PD-1-Expression auf TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen auch eine Hochregulierung von PD-L1 auf Kupfferzellen, Tumorzellen und Suppressorzellen aus der Myeloid-Linie (MDSCs, myeloid-derived suppressor cells) nachgewiesen werden [91,167]. Interessanterweise korreliert die Stärke der PD-1 Expression auf CD8+ T-Zellen mit einem fortgeschrittenen HCC-Stadium, einer schlechteren Prognose der Erkrankung und einer früheren Tumorrekurrenz nach Leberresektion [63,141]. NK-Zellen sind im hepatischen Gewebe angereichert und in der Lage, Tumorzellen mit einer verminderten MHC Klasse I Expression oder mit einer Hochregulierung der NK-Zell-aktivierenden MHC Klasse I Polypeptid-verwandten Sequenz A (MICA, MHC class I polypeptide-related sequence A) direkt zu lysieren [20,61]. Diese NK-Zell-Aktivierung wird im HCC durch ein Entfernen von MICA von der Zelloberfläche limitiert [87]. Interessanterweise wird in Patienten mit chronischer HCV-Infektion die Entstehung eines HCCs begünstigt, wenn diese einen Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP, single nucleotide polymorphism) im MICA-Gen aufweisen [92]. Des Weiteren tragen verschiedene Zelltypen mit immunsuppressiver Funktion zu einem Versagen der antitumoralen Immunantwort bei. So konnte in zahlreichen Studien die zentrale Rolle von Treg in der Suppression der antitumoralen Immunantwort gezeigt werden. Treg sind T-Zellen, die unter anderem eine Koexpression von CD25 und forkhead box P3 (FoxP3) aufweisen [74,132]. Die Akkumulation von Treg korreliert in zahlreichen epithelialen Tumoren mit einer schlechten Prognose der Erkrankung [39,89]. Interessanterweise zeigen auch HCC-Patienten eine Anreicherung von Treg sowohl im peripheren Blut als auch im Lebergewebe, wobei eine hohe Expression an CC Chemokinligand 20 (CCL20) die Rekrutierung der Treg in den Tumor begünstigt [34,123]. Dies resultiert in einer verminderten NK-Zell-Funktion und in einer Inhibierung der Proliferation, der Aktivierung und der Effektorfunktion der CD8+ T-Zellen 15 [55,57]. Interessanterweise korreliert in Patienten mit HCC eine intratumorale Akkumulation der Treg mit einer progressiven Tumorerkrankung und einer schlechteren Prognose [34,57,62]. Doch nicht nur Treg, auch MDSCs sind in der Lage die Tumor-spezifische Immunantwort in Patienten mit HCC zu supprimieren. MDSCs sind eine heterogene Zellpopulation, die sich vor allem aus myeloiden Progenitorzellen, unreifen Makrophagen, unreifen DCs und unreifen Granulozyten zusammensetzt. Die Mitglieder dieser Zellfamilie lassen sich durch eine typische Koexpression von CD33 und CD11b charakterisieren, wohingegen CD14 nicht exprimiert wird. Eine gesteigerte Zahl MDSCs findet sich nicht nur bei Tumorerkrankungen, sondern auch bei inflammatorischen Prozessen und Infektionen. Sowohl über eine Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO, nitric oxide) und ROS als auch über eine Hochregulation der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase und Arginase I führt die Aktivierung von MDSCs zu einer Suppression der T-Zell- und NK-Zell-Funktion und zu einer TregInduktion [60,73]. Zuletzt sind CD4+ T-Zellen von entscheidender Bedeutung bei der Generierung einer effizienten TAAspezifischen Immunreaktion, in dem sie nicht nur das Priming und die Expansion TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen begünstigen sondern auch selbst direkt antitumoral wirksam sind. Bei Patienten mit einem HCC in einem frühen Erkrankungsstadium, die normale oder leicht erhöhte AFP-Level im Serum aufwiesen, konnten nach in vitro Stimulation AFP-spezifische CD4+ T-Zell-Antworten sowohl im peripheren Blut als auch im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Patienten in fortgeschrittenen Tumorstadien mit hohen Serum-AFP-Werten wiesen dahingegen eine Erschöpfung dieser Immunantwort auf. AFP-spezifische CD4+ T-Zellen sind jedoch in Patienten mit HCC nur in sehr geringen Frequenzen im peripheren Blut und im Lebergewebe nachweisbar. Das Fehlen einer adäquaten CD4+ T-Zell-Hilfe stellt somit eine weitere wichtige Ursache für das Versagen HCCspezifischer Immunantworten dar [4,9,166]. Zusammenfassend können zahlreiche Mechanismen zum Versagen der natürlichen Tumorspezifischen Immunantwort in Patienten mit HCC beitragen. Da diese bisher jedoch noch nicht vollständig verstanden sind, sind weitere gezielte Untersuchungen der Immunsuppression im HCC notwendig, um eine Hemmung immunsuppressiver Mechanismen in klinischen Studien nutzen zu können. 16 1.6 Zielsetzung der Arbeit Immuntherapeutische Ansätze beim HCC haben das Ziel bereits vorhandene Immunantworten zu verstärken oder Immunantworten de novo zu induzieren. Für die Entwicklung sicherer und effizienter Tumorvakzine ist eine genaue Identifizierung und Charakterisierung natürlicher TAA-spezifischer Immunantworten bei Patienten mit HCC dringend notwendig, da so Hinweise auf besonders potente TAA-spezifische Immunantworten erlangt werden können. In ersten Arbeiten konnte unserer Arbeitsgruppe CD8+ T-Zell-Antworten gegen verschiedene HCC-spezifische TAAs nachweisen. Hierfür wurden mit Hilfe überlappender Peptide (OLP, overlapping peptides), jeweils bestehend aus 18 Aminosäuren, zahlreiche TAAs in ihrer gesamten Länge untersucht. Jedoch sind die Peptidfragmente, die natürlicherweise durch MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden, in der Regel kürzer und bestehen nur aus 8-11 Aminosäuren [171]. Frühere Studien zeigten zudem große Schwierigkeiten in der Expansion funktioneller HCC-spezifischer CD8+ T-Zelllinien in vitro [151,168]. Im Rahmen meiner Doktorarbeit wurden die folgenden wichtigen Fragestellungen bearbeitet: Welches sind die genauen Epitope, die TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten bei Patienten mit HCC induzieren? Können HCC-spezifische CD8+ T-Zelllinien in vitro expandiert werden? Welche Funktionen weisen HCC-spezifische CD8+ T-Zellen nach der Expansion auf? Inwieweit tragen inhibitorische Mechanismen, wie beispielsweise regulatorische T-Zellen, eine fehlende Interleukin-Stimulation oder die Expression inhibitorischer Rezeptoren, zu einem möglichen Versagen der HCC-spezifischen Immunantwort bei? Ist die mögliche Funktionseinschränkung von CD8+ T-Zellen abhängig von ihrer Antigenspezifität? 17 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien Tabelle 2.1 Chemikalien Verwendete Chemikalien Dimethylsulfoxid (DMSO) Firma (Firmensitz) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland) FACS Flow BD Biosciences (Franklin Lakes, USA) FACS Clean BD Biosciences (Franklin Lakes, USA) Trypanblau Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland) Fetales Kälberserum (FCS, fetal calf serum) Biochrom (Berlin, Deutschland) BD GolgiPlug BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) BD GolgiStop BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Hepes-Puffer (1 M) Biochrom (Berlin, Deutschland) Cytofix/Cytoperm Lösung BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) 10 x PermWash (Permeabilisierungspuffer) BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland) Dulbecco’s Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS, phosphate buffered saline) Invitrogen Life Technologies Penicillin Invitrogen Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland) (Karlsruhe, Deutschland) Streptomycin Invitrogen Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland) RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamin Invitrogen Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland) Pancoll-Separationsmedium PAN Biotech GmbH (Aidenbach, Deutschland) FCS wurde vor dem Gebrauch für 30 min im Wasserbad auf 56°C erwärmt um potentiell vorhandene Proteasen zu inaktivieren. 18 2.1.2 Puffer und Medien Tabelle 2.2 Verwendete Puffer und Medien Puffer, Medien Zusammensetzung RPMI-Vollmedium (RPMI+++) RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamin 10% FCS 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin 10 mM Hepes-Puffer Einfriermedium 80% FCS 10% DMSO 10% RPMI+++ Färbe-Puffer (SB, staining buffer) PBS 1% FCS 1 x Permeabilisationspuffer (PermWash) 10 x PermWash H2O Fixierungspuffer PBS 2% PFA 2.1.3 Biologika Tabelle 2.3 Biologika Verwendete Biologika Rekombinantes, humanes IL-2 Konzentration Firma (Firmensitz) 20 U/ml Hoffmann-La Roche (Basel, Schweiz) 100 U/ml Rekombinantes, humanes IL-7 10 µg/ml R&D Systems (Minneapolis, USA) Rekombinantes, humanes IL-12 4 µg/ml PeproTech (Rocky Hill, USA) Anti-Human-CD3-Antikörper 0,04 µg/ml Immunotech (Marseille, Frankreich) Anti-Human-CD28-Antikörper 0,5 µg/ml BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Anti-human-PD-L1-Antikörper 1,0 mg/ml eBioscience (San Diego, USA) Phorbol 12-Myristat 13-Acetat 10 ng/ml Sigma-Aldrich (Seelze, Deutschland) 0,2 µg/ml Sigma-Aldrich (Seelze, Deutschland) (PMA) Ionomycin 19 2.1.4 Magnetisierte Antikörper Tabelle 2.4 Verwendete magnetisierte Antikörper Magnetisierte Antikörper Firma (Firmensitz) Anti-CD8-Dynabeads Dynal (Oslo, Norwegen) Anti-CD25-Dynabeads Dynal (Oslo, Norwegen) 2.1.5 Peptide Die TAA-Peptide stammen von Genaxxon Bioscience (Ulm, Deutschland). Die OLP setzten sich aus 18 Aminosäuren zusammen, die kürzeren Peptidfragmente variieren in der Anzahl ihrer Aminosäuren und werden im Folgenden als 9-mere zusammengefasst. Zur Bestimmung der genauen Epitope wurden das Vorhersage-Computerprogramm SYFPEITHI und die Immun-Epitop-Datenbank (IEDB, Immune Epitope Database) verwendet (Kap. 2.5). Diese analysieren Peptidsequenzen in Hinblick auf die individuellen biochemischen Eigenschaften der einzelnen Aminosäuren und sagen auf diese Weise ideale Peptide für die Bindung und Präsentation durch bestimmte HLA-Klassen vorher. Wir untersuchten Peptide mit idealen Bindungseigenschaften für HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3 und HLA-B44, da diese in der Kohorte der HCC-Patienten häufig vertreten waren. Die Peptide wurden in 100% DMSO gelöst und bei -20°C gelagert. Vor der Verwendung wurden sie mit PBS zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt und bei 4°C gelagert. Tabelle 2.5 OLP AFP41-58 OLP Sequenz ISLADLATIFFAQFVQEA AFP529-546 DKFIFHKDLCQAQGVALQ GPC-3137-154 LTPQAFEFVGEFFTDVSL GPC-3281-298 VMQGCMAGVVEIDKYWRE GPC-3513-530 MIKVKNQLRFLAELAYDL MAGE-A189-106 STSCILESLFRAVITKKV MAGE-A1105-122 KVADLVGFLLLKYRAREP NY-ESO-1137-154 LTAADHRQLQLSISSCLQ NY-ESO-1153-170 LQQLSLLMWITQCFLPVF 20 Tabelle 2.6 Epitop AFP42-50 TAA-Epitope Sequenz SLADLATIF OLP AFP41-58 Länge 9mer HLA-Bindung HLA-A3 AFP47-55 ATIFFAQFV AFP41-58 9mer HLA-A2 AFP542-550 GVALQTMKQ AFP529-546 9mer HLA-A2 Bax136-144 IMGWTLDFL nicht vorhanden 9mer HLA-A2 GPC-3144-152 FVGEFFTDV GPC-3137-154 9mer HLA-A2 GPC-3281-289 VMQGCMAGV GPC-3281-298 9mer HLA-A2 GPC-3287-295 AGVVEIDKY GPC-3281-298 9mer HLA-B44 GPC-3519-528 QLRFLAELAY GPC-3513-530 10mer HLA-A3 GPC-3522-530 FLAELAYDL GPC-3513-530 9mer HLA-A2 MAGE-A191-101 SCILESLFRAV MAGE-A189-106 11mer HLA-A2 MAGE-A192-100 CILESLFRA MAGE-A189-106 9mer HLA-A2 MAGE-A194-102 LESLFRAVI MAGE-A189-106 9mer HLA-B44 MAGE-A196-104 SLFRAVITK MAGE-A189-106 9mer HLA-A3 MAGE-A1105-114 KVADLVGFLL MAGE-A1105-122 10mer HLA-A2 MAGE-A1108-116 DLVGFLLLK MAGE-A1105-122 9mer HLA-A3 MAGE-A1108-117 DLVGFLLLKY MAGE-A1105-122 10mer HLA-B44 MAGE-A3271-279 FLWGPRALV nicht vorhanden 9mer HLA-A2 NY-ESO-1145-153 LQLSISSCL NY-ESO-1137-154 9mer HLA-A2 NY-ESO-1157-165 SLLMWITQC NY-ESO-1153-170 9mer HLA-A2 NY-ESO-1157-167 SLLMWITQCFL NY-ESO-1153-170 11mer HLA-A2 NY-ESO-1159-167 LMWITQCFL NY-ESO-1153-170 9mer HLA-A2 NY-ESO-1162-170 ITQCFLPVF NY-ESO-1153-170 9mer HLA-A1 Die Kontrollpeptide stammen von Influenza (Flu), Cytomegalie-Virus (CMV) und Eppstein-Barr-Virus (EBV) ab und wurden von Genaxxon Bioscience (Ulm, Deutschland) bezogen. Diese wurden ebenfalls in 100% DMSO gelöst und bei -20°C gelagert. Vor der Verwendung wurden sie mit RPMI+++ zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnt und bei 4°C gelagert. Tabelle 2.7 Epitop Flu CMV EBV Kontrollpeptide Sequenz GILGFVFTL NLVPMVATV GLCTLVAML Protein Matrix pp65 BMLF-1 Position 58-66 495-103 259-267 Länge 9mer 9mer 9mer HLA-Bindung HLA-A2 HLA-A2 HLA-A2 21 2.1.6 Tetramere Korrespondierende Tetramere zu Flu, CMV und EBV wurden von ProImmune (Oxford, Großbritannien) bezogen. Die Monomere für die Herstellung von Tetrameren korrespondierend zu den TAA-Epitopen NY-ESO-1145-153, NY-ESO-1157-165 und MAGE-A196-104 wurden uns freundlicherweise von David A. Price (Institute of Infection and Immunity, Cardiff, Wales) zur Verfügung gestellt. 2.1.7 Fluoreszenz-markierte Antikörper Tabelle 2.8 Antikörper Anti-CD8 Verwendete Fluoreszenz-markierte Antikörper Spezifität Isotyp Klon Fluoreszenz Humanes CD8 Maus IgG1 SK1 PE Firma (Firmensitz) BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Anti-CD8 Humanes CD8 Maus IgG1 SK1 APC-Cy7 BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Anti-CD8 Humanes CD8 Maus IgG1 SK1 APC BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Anti-IFNγ Humanes IFNγ Maus IgG1 4S.B3 FITC BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Anti-IFNγ Humanes IFNγ Maus IgG1 4S.B3 PacificBlue eBioscience (San Diego, USA) Anti-CD107a Humanes Maus IgG1 - PE CD107a Anti-MIP-1β Humanes (Heidelberg, Deutschland) Maus IgG2b - FITC MIP-1β Anti-IL-2 Humanes IL-2 Humanes TNFα R&D Systems (Minneapolis, USA) Maus IgG1 MQ1- PerCP-Cy5.5 17H12 Anti-TNFα BD Pharmingen - - BioLegend (San Diego, USA) PE-Cy7 BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) ViaProbe DNA - - PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) Anti-HLA-A2 HLA-A2 - - FITC One Lambda (Los Angeles, USA) Anti-HLA-A3 Streptavidin HLA-A3 bindet Biotin - - - - gebunden an One Lambda Biotin (Los Angeles, USA) APC R&D Systems (Minneapolis, USA) 22 2.2 Zellulär-immunologische Methoden 2.2.1 Zellkultur Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden unter Laminar Flow Sterilbänken durchgeführt. Als Kulturmedium wurde RPMI+++ Medium verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C und 95% Luftfeuchtigkeit mit einem Anteil von 5% CO2 inkubiert. 2.2.2 Isolation mononukleärer Zellen aus peripherem Blut Zur Isolation von PBMCs wurde frisches, venöses Vollblut verwendet, das mit Ethylendiamintetraacetat (EDTA) antikoaguliert wurde. Dieses wurde mit PBS verdünnt, über Pancoll Seperationsmedium geschichtet und über eine Dichtegradientenzentrifugation aufgetrennt (Abb. 2.1). Durch seine spezifische Dichte von 1.077 g/ml hält Pancoll Separationsmedium bei einer PBMCs oberhalb des Separationsgradienten zurück, während Erythrozyten und Granulozyten auf Grund ihrer höheren Dichte sedimentieren. Plasma befindet sich oberhalb der mit PBMCs angereicherten Interphase. Vor Zentrifugation Verdünntes Blut Nach Zentrifugation Plasma Interphase mit PBMCs Pancoll Pancoll Erythrozyten/ Granulozyten Abbildung 2.1 Isolation von PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation 2.2.3 Bestimmung der Zellzahl Ein Teil der Zellen wurde im Verhältnis 1:5 mit 0,4% Trypanblau verdünnt und in eine NeubauerZählkammer gegeben. Tote Zellen färben sich bei der Zugabe von Trypanblau auf Grund ihrer defekten Zellmembran blau an. Die lebenden Zellen wurden unter dem Lichtmikroskop bei 40facher Vergrößerung gezählt und die Zellzahl pro ml anhand folgender Formel bestimmt. 2.2.4 Kryokonservierung der Zellen Zellen, die nicht sofort verwendet wurden, wurden kryokonserviert. Hierfür wurden etwa 20-30 x 106 Zellen je 1 ml Einfriermedium bei -80°C gelagert. 23 Zusätzlich wurden für jeden Patienten 5 x 106 Zellen ohne Medium bei -20°C gelagert. Dies dient der späteren Extraktion der Desoxyribonucleinsäure (DNS) zur genauen Analyse des HLA-Typs des Patienten. 2.2.5 Auftauen der kryokonservierten Zellen Zum Auftauen wurden die bei -80°C in Einfriermedium gelagerten Zellen in 10 ml RPMI+++ aufgenommen, das zuvor auf 37°C erwärmt wurde. Die Zellen wurden über 10 min bei 500xg zentrifugiert und erneut in RPMI+++ aufgenommen. 2.2.6 Isolation der CD8+ T-Zellen CD8+ T-Zellen wurden mit Hilfe magnetischer Beads, die an anti-human-CD8-Antikörper gebunden waren, positiv selektioniert. Hierfür wurden 17,5 µl magnetische CD8-Beads mit 4 x 106 PBMCs für 30 min bei 4°C auf einem Roller inkubiert. Danach konnten durch die magnetische Halterung CD8+ T-Zellen, die die magnetischen Beads gebunden hatten, von CD8- PBMCs isoliert werden. Die CD8- PBMCs wurden in RPMI+++ Medium aufgenommen, bestrahlt und als Stimulationszellen verwendet. 2.2.7 Bestrahlung der Stimulationszellen Die Stimulationszellen wurden in 10 ml RPMI+++ Medium aufgenommen und mit dem Bestrahlungsgerät der Transfusionsmedizin des Universitätsklinikums Freiburg mit 30 Gy GammaStrahlen bestrahlt. Dies soll ihre Proliferation in der Zellkultur verhindern. 2.2.8 Antigen-unspezifische Expansion von CD8 + T-Zellen Nach der Isolation der CD8+ T-Zellen wurden diese in 2 ml RPMI+++ resuspendiert und gemeinsam mit 100 U/ml rekombinantem humanem IL-2, 0,04 µg/ml anti-CD3 und den bestrahlten Stimulationszellen in ein Well einer 24-Well-Platte gegeben. Über 3 Wochen wurden die Zellen nach jeweils drei Tagen resuspendiert und 1 ml in ein neues Well transferiert. Beide Wells wurden mit 1 ml RPMI+++ Medium und 100 U/ml IL-2 aufgefüllt und resuspendiert. Nach drei Wochen wurden die magnetischen Beads mit Hilfe der magnetischen Halterung entfernt. 2.2.9 Antigen-spezifische Expansion von CD8+ T-Zellen Zur Analyse der Proliferation und Funktionalität Antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen wurden Antigenspezifische Zelllinien erstellt. Hierfür wurden 4 x 106 PBMCs in 1 ml RPMI+++ Medium resuspendiert und gemeinsam mit 0,5 µg/ml anti-CD28 und 10 µg/ml synthetischem Peptid in ein Well einer 24-Well-Platte gegeben. Als Peptid wurden bei HLA-A2+ Patienten EBV, CMV, Flu, NY-ESO-1157-165 oder NY-ESO-1145-153 verwendet. Bei HLA-A3+ Patienten wurden die Zellen mit dem Peptide MAGE-A196-104 stimuliert. An Tag 4 und 11 wurden 1 ml RPMI+++ Medium und 20 U/ml IL-2 hinzugegeben. An Tag 7 24 wurde das Medium entnommen und die Zellen wurden mit 2 x 106 bestrahlten PBMCs in 1 ml RPMI+++ Medium und 10 µg/ml Peptid restimuliert. An Tag 14 wurden die Zellen in einer 96-WellPlatte ausplattiert und an Tag 15 mittels Durchflusszytometrie anhand von Tetramer-Färbungen und Zytokin-Färbungen analysiert. 2.2.9.1 Stimulation mit IL-7 und IL-12 Um die Wirkung stimulierender Zytokine auf die Proliferation und Funktionalität TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen zu untersuchen wurden PBMCs, wie in Kap. 2.2.9 beschrieben, Antigen-spezifisch expandiert. An Tag 0 wurden zusätzlich 10 ng/ml IL-7 und 100 pg/ml IL-12 hinzugegeben. 2.2.9.2 Depletion von Treg Um den Einfluss von Treg auf die Proliferation und Funktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen zu analysieren wurden CD25+ T-Zellen mit Hilfe magnetischer Beads, die an anti-human-CD25Antikörper gebunden waren, depletiert. Hierfür wurden 50 µl magnetische CD25-Beads mit 4x 106 PBMCs für 30 min bei 4°C auf einem Roller gelagert. Danach konnten durch die magnetische Halterung CD25+ T-Zellen, die die magnetischen Beads gebunden hatten, isoliert werden. Die CD25+ T-Zellen wurden verworfen, die CD25- PBMCs wurden wie in Kap. 2.2.9 beschrieben, Antigenspezifisch zu expandiert. Für die Restimulation an Tag 7 wurden ebenfalls CD25- PBMCs verwendet. 2.2.9.3 Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges Kryokonservierte PBMCs wurden aufgetaut und gezählt (Kap. 2.2.5, 2.2.3). Je Well wurde mit 2x106 PBMCs gearbeitet. Die Zellen wurden in 1 ml RPMI+++ Medium resuspendiert und gemeinsam mit 0,5 µg/ml anti-CD28 und 10 µg/ml synthetischem Peptid in ein Well einer 48-Well-Platte gegeben. Als Peptid wurde bei HLA-A2+ Patienten NY-ESO-1157-165 und bei HLA-A3+ Patienten MAGE-A196-104 verwendet. Zur Blockade von PD-1 wurden 10 µl anti-PD-L1 hinzugegeben. An Tag 4 und 11 wurden 0,5 ml RPMI+++ Medium abgenommen und 0,5 ml frisches RPMI+++ Medium sowie 20 U/ml IL-2 hinzugegeben. An Tag 7 wurde das Medium entnommen und die Zellen wurden mit Stimulationszellen in 1 ml RPMI+++ Medium und 10 µg/ml Peptid restimuliert. Als Stimulationszellen wurden für HLA-A2+ Patienten bestrahlte Zellen der FI-Zelllinie, einer EBV-immortalisierte B-ZellLinie, verwendet. HLA-A3+ Patienten wurden mit 1 x 106 bestrahlten, autologen PBMCs restimuliert. An Tag 14 wurden die Zellen in einer 96-Well-Platte ausplattiert und an Tag 15 mittels Durchflusszytometrie anhand von Tetramer-Färbungen und Zytokin-Färbungen analysiert. 25 2.3 Durchflusszytometrie 2.3.1 Grundlagen der Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie (FACS, fluorescence–activated cell sorter) erlaubt eine genaue Charakterisierung der untersuchten Zellen. Hierfür werden die Zellen in einem laminaren Flüssigkeitsstrom durch einen Laserstrahl geführt. Trifft der Laserstrahl auf eine Zelle bewirken spezifische Eigenschaften der Zelle eine Streuung des Lichtes. Das Vorwärtsstreulicht (FSC, forward scatter) wird in einem Winkel von 2-15° gestreut und gibt Aufschluss über die Zellgröße. Je größer die Zelle ist, desto größer ist das Vorwärtsstreulicht. Im Gegensatz hierzu lässt das Seitwärtsstreulicht (SSC, sideward scatter), das im 90°-Winkel zum Laserstrahl entsteht, eine Aussage über die Granularität der Zelle zu. Neben der Bestimmung von Größe und Granularität können auch Aussagen über die Antigenspezifität und Zytokinproduktion der Zellen getroffen werden. Hierfür werden die Zellen durch Antikörper oder Tetramere, die an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind, markiert. Diese Fluoreszenzfarbstoffe werden durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und emittieren daraufhin Lichtquanten einer bestimmten Wellenlänge. Auf diese Weise können unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe unterschieden werden, was eine Analyse zahlreicher verschiedener Eigenschaften einer Zelle ermöglicht. 2.3.2 Bestimmung des HLA-Profils der Kontrollkohorte 4x104 PBMCs wurden in 100 µl PBS in ein Well einer 96-Well-Platte ausplattiert. 1 µl anti-HLA-A2-FITC bzw. 1 µl anti-HLA-A3-Biotin wurde hinzugefügt und für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde 1 µl Streptavidin-APC, das an Biotin bindet, hinzugefügt und für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit SB gewaschen, mit 100 µl 2% PFA-Lösung fixiert und mit Hilfe des Durchflusszytometers gemessen. 2.3.3 Stimulation von CD8 + T-Zellen Am Vortag der Stimulation wurden 0,5-1,0 x 106 Zellen in 150 µl RPMI+++ Medium in einer 96-WellPlatte ausplattiert und bei 37°C und 5% CO2 über Nacht gelagert. Je 3 µl Peptide und 37 µl RPMI+++ Medium wurden ebenfalls in einer 96-Well-Platte ausplattiert und bei 4°C gelagert. Am Tag der Stimulation wurden zu den Zellen 9,3 µl RPMI+++ Medium, 0,5 µl IL-2 und 0,2 µl GolgiPlug gegeben, was in einer Endkonzentration von 100 U/ml IL-2 und 1 µl/ml GolgiPlug resultierte. Der Hauptbestandteil von GolgiPlug ist Brefeldin A, ein Inhibitor des Golgitransporters. Dieser wird verwendet um eine Zytokinsekretion zu verhindern und so eine intrazelluläre Zytokinfärbung zu ermöglichen [59]. Die Zellen wurden daraufhin mit den jeweiligen Peptiden 26 stimuliert. Zwei unstimulierte Wells wurden als Negativkontrolle verwendet. Um die gleiche Konzentration an IL-2 und GolgiPlug zu erreichen, wurden diese mit 40 µl RPMI+++ Medium resuspendiert. Ein Well wurde als Positivkontrolle mit 10 ng/ml PMA, 0,2 µg/ml Ionomycin und 30 µl RPMI+++ Medium stimuliert. Ionomycin ermöglicht einen Influx von Ca ++ Ionen über die Zellmembran während PMA die Proteinkinase C aktiviert [30,97]. Beide Mechanismen werden auch bei Stimulation über den T-Zell-Rezeptor ausgelöst und resultieren in einer Zellaktivierung [113]. Die Zellen wurden daraufhin für 5 Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. 2.3.4 Oberflächenfärbung Um Antigene, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, nachzuweisen, wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugierte, monoklonale Antikörper verwendet. Nach 5 Stunden Stimulation (Kap. 2.3.3) wurden die Zellen in einem Volumen von 50 µl SB mit den Oberflächenantikörpern, z.B. 1 µl ViaProbe und 1 µl anti-CD8-PE, resuspendiert und 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Bei ViaProbe handelt es sich um 7-Amino-actinomycin D (7-AAD), einen DNS-Farbstoff, der zur Unterscheidung lebender und apoptotischer Zellen dient. Durch Apoptose wird die Permeabilität der Zellmembran gesteigert, was eine Aufnahme und DNS-Bindung von 7-AAD ermöglicht [95,137]. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit SB gewaschen und intrazellulär gefärbt. 2.3.5 Intrazellulärfärbung Um intrazelluläre Proteine, wie beispielsweise Zytokine, nachweisen zu können, muss die Zellmembran permeabilisiert werden. Hierfür wurden die Zellen nach der Oberflächenfärbung (Kap.2.3.4) in 100 µl Cytofix/Cytoperm resuspendiert und für 15 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Permwash gewaschen bevor sie in einem Volumen von 50 µl Permwash mit 2 µl anti-IFNγ-FITC resuspendiert und für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und anschließend mit 150 µl 2% PFA-Lösung fixiert. Die fixierten Zellen wurden bei 4°C im Dunkeln gelagert und am nächsten Tag mit Hilfe des Durchflusszytometers gemessen. 2.3.6 Multizytokinfärbung Um mehrere Zytokine nachzuweisen, wurden an Tag 20 0,5-1,0x 106 Zellen in 150 µl RPMI+++ Medium in einer 96-Well-Platte ausplattiert und bei 37°C und 5% CO2 über Nacht gelagert. In eine weitere 96-Well-Platte wurden je 3 µl Peptide und 37 µl RPMI+++ Medium ausplattiert und bei 4°C gelagert. An Tag 21 wurden die Zellen mit 10 ng/ml PMA und 0,2 µg/ml Ionomycin bzw. mit dem jeweiligen Peptid stimuliert und zusätzlich mit 3 µl anti-CD107a-PE gefärbt. Nach einer Inkubation von 60 min bei 37°C im Dunkeln wurden 0,1 µl GolgiPlug und 0,1 µl GolgiStop in 10 µl RPMI+++ Medium hinzugefügt und weitere 5 Stunden bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation 27 wurden Oberflächenfärbungen (Kap. 2.3.4) und Intrazellulärfärbungen (Kap. 2.3.5) durchgeführt. Für die Oberflächenfärbung wurden 3 µl anti-CD8-APC-Cy7 oder 1 µl anti-CD8-APC verwendet. Bei der Intrazellulärfärbung wurden 5 µl anti-IFNγ-PacificBlue und jeweils 3 µl anti-MIP-1β-FITC, anti-IL-2-PerCP und anti-TNF-α-PE-Cy7 verwendet. Die Proben wurden mit 150 µl 2% PFA-Lösung fixiert und mit Hilfe des Durchflusszytometers am selben Tag gemessen. 2.3.7 Tetramer-Färbung Tetramer-Färbungen erlauben den direkten Nachweis Antigen-spezifischer T-Zellen unabhängig von deren Funktionalität. Wie in Kap. 1.1.3 beschrieben, können CD8+ T-Zellen ihr spezifisches Antigen nur erkennen, wenn dieses in Form von Peptiden gemeinsam mit MHC Klasse I Molekülen präsentiert wird. Da die Bindung einzelner Peptid-MHC-Komplexe an den T-Zell-Rezeptor nur eine geringe Affinität aufweist, ist die Verwendung von Tetramer-Komplexen zur Stabilisierung der Bindung notwendig. Tetramere bestehen aus vier MHC Klasse I Molekülen, die über Biotin und Fluoreszenzfarbstoff-markiertes Streptavidin verbunden und mit dem jeweiligen Peptidantigen beladen sind [6]. Tetramer-Färbungen wurden üblicherweise an Tag 15 durchgeführt. Bei Multizytokinfärbungen wurde an Tag 21 eine zweite Tetramer-Färbung durchgeführt. Am Vortag der Tetramer-Färbung wurden 0,5-1,0x106 Zellen in 150 µl RPMI+++ Medium in einer 96-Well-Platte ausplattiert und bei 37°C und 5% CO2 über Nacht gelagert. Am Tag der Färbung wurden die Zellen in 50 µl SB mit dem jeweiligen an APC-gebundenen Tetramer für 15 min bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurde mit SB gewaschen und zur Absättigung unspezifischer Antikörperbindungsstellen mit 45 µl SB und 5 µl unkonjugiertem Immunglobulin 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Danach wurde eine Oberflächenfärbung (Kap 2.3.4) durchgeführt. Nach der Fixierung mit 150 µl 5% PFA wurden die Proben am selben Tag mit Hilfe des Durchflusszytometers gemessen. 2.3.8 Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie Nach der Messung mit dem Durchflusszytometer wurden die gewonnen Daten mit der Auswertungssoftware FlowJo analysiert (Abb. 2.2). Mit Hilfe des FSC und SSC ist es möglich die Lymphozytenpopulation anhand ihrer Größe und Granularität abzugrenzen (Abb 2.2 A; Kap. 2.3.1). Daraufhin wurden tote Zellen, deren DNS sich mit ViaProbe anfärben lies, ausgeschlossen (Abb. 2.2 B). Nur die lebenden, ViaProbe negativen Zellen wurden für die weiteren Analysen verwendet. Bei der Intrazellulärfärbung wurden mit Hilfe der Positiv- und Negativkontrolle für jeden Patienten individuelle Analysefenster (Gates) festgelegt (Abb. 2.2 C+D). Als spezifische Immunantwort wurde eine IFNγ-Produktion von mindestens 0,01% der CD8+ T-Zellen nach Abzug der Negativkontrolle gewertet. Bei Tetramer-Färbungen wurden ebenfalls mit Hilfe der Negativkontrolle 28 für jeden Patienten Gates festgelegt. Als spezifische Tetramer-Anfärbung wurden Tetramer-positive Färbungen von mindestens 0,01% der CD8+ T-Zellen nach Abzug der Negativkontrolle gewertet. Abbildung 2.2 Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie Gezeigt ist die Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie am Beispiel der Analyse der IFNγ-Produktion. A Mit Hilfe von FSC und SSC wird die Lymphozytenpopulation definiert. B ViaProbe-positive Zellen werden aus der Analyse ausgeschlossen. C+D Mit Hilfe der Positivkontrolle (C) und Negativkontrolle (D) werden für jeden Patienten individuelle Gates festgelegt. E Exemplarische IFNγProduktion nach der Stimulation mit MAGE-A1105-114 (HCC 41). 2.4 Patientenkohorte In Übereinstimmung mit der Ethikkommission der Universität Freiburg wurden nach Aufklärung und Einverständnis der Spender Blutproben entnommen. Tab. 2.11 zeigt die HLA-Typisierung, das Alter und das Geschlecht (m: männlich, w: weiblich) der Patienten mit HCC sowie die Ursache der HCC-Erkrankung. Tab. 2.12 führt die klinischen Parameter der Patienten mit HCC auf. Hierbei verzichteten wir auf die Verwendung der Barcelona clinic liver cancer (BCLC) Klassifikation [100] um die in ihr beinhalteten Parameter, wie Leberzirrhose, Tumorgröße und Tumormetastasierung getrennt zu berücksichtigen. 29 Um den Einfluss der Tumorgröße und der Metastasierung zu beurteilen, wurde das Tumorstadium der Patienten nach der 6. Edition der TNM-Klassifikation des American Joint Committee On Cancer (AJCC) anhand von Computertomographie-Aufnahmen bestimmt [2]. Das Stadium der Zirrhose wurde anhand der Child-Pugh-Kriterien klassifiziert, die Serum-Albumin, Gesamt-Serum-Bilirubin, Gerinnungsparameter (INR, international normalized ratio), sowie Aszites und hepatische Enzephalopathie berücksichtigen [37,128]. Darüber hinaus werden die Serum-AFP-Werte, Serumwerte der Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) und die Behandlung des HCCs aufgeführt. Nicht durchgeführte Untersuchungen wurden mit n. d. (not determined) gekennzeichnet. Tab. 2.13 und 2.14 führen die Eigenschaften der Patienten mit malignem Melanom auf. Das Tumorstadium wurde nach den Kriterien des AJCC bestimmt [7]. Tab. 2.15 und 2.16 zeigen die Eigenschaften der Patienten der Kontrollkohorte. Tabelle 2.9 Patient HCC 1 HCC 2 HCC 3 HCC 4 HCC 5 HCC 6 HCC 7 HCC 8 HCC 9 HCC 10 HCC 11 HCC 12 HCC 13 HCC 14 HCC 15 HCC 16 HCC 17 HCC 18 HCC 19 HCC 20 HCC 21 HCC 22 HCC 23 HCC 24 HCC 25 HCC 26 Übersicht der Patienten mit HCC HLA-Typisierung Alter [Jahre] A0101, A0301, B39XX, B4402 77 A0101, A0201, B0801, B4402 75 A0201, B0702, B5101 72 A2, A29(19), B44(12), B57(17) 83 A2, B18, B60(40) 80 A0301, A1101, B0702, B5101 80 A0201, A6601, B0801, B3501 74 A0201, B1501 61 A0201, A2601, B3801, B7301 69 A0101, A0301, B0801, B2702 68 A0201, A0301, B0702, B5701 74 A0301, A2402, B1801, B5601 61 A0201, A0301, B5101, B5501 74 A0201, A3101, B1302, B4402 63 A0201, A6801, B4001, B5801 70 A0201, A2301, B0702, B5001 66 A0201, A2402, B1801, B3901 81 A0101, A0205, B1801, B3501 83 A0301, B0801 63 A0201, A2402, B1518, B4402 57 A0202, A2301, B4101, B4403 58 A0301, A6801, B3503, B5001 77 A0201, A2501, B2705, B4402 58 A0101, A0201, B0702, B1302 72 A0201, B1501, B4403 68 A2 pos., A3 neg., B27 neg. 76 Geschlecht m w m m m m m w m w m m w w m m m m m m m m m w m m Ursache des HCC Ethanol-Abusus HCV Ethanol-Abusus HCV HBV kryptogen Ethanol-Abusus HCV Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus HCV HBV kryptogen Autoimmunhepatitis Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus kryptogen HCV Steatosis hepatis Ethanol-Abusus HBV Steatosis hepatis Ethanol-Abusus Steatosis hepatis HBV kryptogen 30 Patient HCC 27 HCC 28 HCC 29 HCC 30 HCC 31 HCC 32 HCC 33 HCC 34 HCC 35 HCC 36 HCC 37 HCC 38 HCC 39 HCC 40 HLA-Typisierung A0201, A2902, B4402, B4403 A0201, A3101, B4001 A0201, A1101, B1803, B5101 A0301, A3002, B35XX, B1801 A0301, B0702 A0301, A6801, B5101, B5801 A0202, A3101, B0702, B5801 A0201, A2402, B4001, B4402 A0201, A1101, B1801, B2702 A0201, A3201, B4402, B4405 A0301, A3301, B1402, B1801 A0201, A0301, B1501, B4402 A3, B7, B56(22) A0201, B0702, B1801 Alter [Jahre] 62 75 83 83 73 70 75 55 73 57 73 53 58 63 Geschlecht w m m w m m m m m m m m w m HCC 41 HCC 42 HCC 43 HCC 44 HCC 45 HCC 46 HCC 47 HCC 48 HCC 49 HCC 50 HCC 51 HCC 52 HCC 53 HCC 54 HCC 55 HCC 56 HCC 57 HCC 58 HCC 59 HCC 60 HCC 61 A0201, A2402, B1501, B1801 A2402, A2902, B3501, B4403 A2 pos., B27 neg. A0101, B0801, B4403 A0301, A3201, B3801, B4002 A0101, A3201, B0801, B5101 A0201, A1101, B3503, B5201 A2902, A6801, B4001, B4403 A1, A3, B8, B35 A0201, A6601, B3502, B5101 A0203, A3303, B4601, B5601 A0201, A0301, B1501 A1, A2, B8, B17 A0101, B0801, B4901 A3, A32(19), B50(21), B61(40) A0301, A2501, B1501, B4402 A0101, A2402, B0702, B0801 A0101, A0201, B3701, B4402 A0101, A2402, B0801, B1501 A0101, A2402, B1801, B5703 A0301, A2402, B0702, B1402 72 63 56 63 66 63 64 78 69 63 50 73 80 71 77 64 68 68 64 74 80 m m m m m m m m m m m w m m m m m m m m w Tabelle 2.10 Patient HCC 1 HCC 2 HCC 3 Klinische Parameter der Patienten mit HCC Stadium Therapie AFP [ng/ml] IVa TACE 5,3 I Resektion 15 Remission TACE 3 Ursache des HCC kryptogen Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus HBV Hämochromatose Ethanol-Abusus Steatosis hepatis Ethanol-Abusus HBV, HCV HBV, HDV Steatosis hepatis Steatosis hepatis kryptogen Steatosis hepatis, Ethanol-Abusus kryptogen HBV, Ethanol-Abusus HCV, Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus Steatosis hepatis HBV HCV Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus HBV kryptogen Ethanol-Abusus HCV HCV Steatosis hepatis Ethanol-Abusus Ethanol-Abusus kryptogen HBV, HCV HCV GPT [U/l] 22 74 42 Zirrhose Child B keine Child A 31 Patient HCC 4 HCC 5 HCC 6 HCC 7 HCC 8 HCC 9 HCC 10 HCC 11 HCC 12 HCC 13 HCC 14 HCC 15 HCC 16 HCC 17 HCC 18 HCC 19 HCC 20 HCC 21 HCC 22 HCC 23 HCC 24 HCC 25 HCC 26 HCC 27 HCC 28 HCC 29 HCC 30 HCC 31 HCC 32 HCC 33 HCC 34 HCC 35 HCC 36 HCC 37 HCC 38 Stadium II IIIb I II IVa unbekannt II II IVa II I II II IIIa unbekannt Remission IVb Remission II II II IVa IIIb IVb I IVa unbekannt II II II IIIb unbekannt IVb I IVb HCC 39 IVb HCC 40 HCC 41 HCC 42 HCC 43 HCC 44 IVa Remission IVa IVb Remission Therapie Resektion, TACE TACE Resektion Resektion Resektion, TACE Resektion TACE TACE TACE Resektion Resektion, TACE, Resektion, TACE TACE TACE TACE Resektion, TACE keine Resektion TACE TACE Resektion Resektion Resektion Resektion, TACE keine TACE TACE Resektion, TACE TACE RFTA, TACE keine keine TACE keine Resektion, TACE, Sorafenib Resektion, Radiatio, TACE TACE RFTA, TACE TACE Radiatio, Sorafenib Resektion AFP [ng/ml] 24 3,2 2 5,5 441,2 2,2 4,2 4154 1,4 16,6 3,4 3,3 5 3,1 4 11,4 6549 12,8 10,4 375,2 52,4 4 n. d. 52,2 7 55,4 15,9 1,2 5,4 1,6 7399 41,2 119,3 2,9 417,1 GPT [U/l] 82 14 19 19 18 44 20 71 83 24 30 22 43 18 8 59 44 131 34 25 24 24 34 120 18 32 30 11 21 28 61 37 41 90 95 Zirrhose Child A Child B keine Child A Child A Child A Child A Child B keine keine keine keine keine keine keine Child A keine Child A Child A Child A keine keine keine keine Child A Child A Child C Child A Child A keine Child B Child B Child A keine keine 2,7 24 keine 6188 1,9 4,8 39966 3,5 n. d. 44 94 60 15 Child B Child A Child A Child C Child A 32 Patient HCC 45 Stadium II HCC 46 HCC 47 HCC 48 HCC 49 HCC 50 HCC 51 HCC 52 HCC 53 HCC 54 HCC 55 HCC 56 HCC 57 HCC 58 HCC 59 HCC 60 HCC 61 IVa IVa IVa II unbekannt IVb Remission IVa IIIb II IVb IVb IVa Remission IVa IVa Tabelle 2.11 Patient M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 Therapie Resektion, TACE, Sorafenib TACE TACE TACE Resektion, TACE, TACE Resektion, TACE keine TACE TACE RFTA, TACE TACE Resektion, TACE TACE Resektion, TACE TACE TACE Patienten mit malignem Melanom HLA-Typisierung A0301, B0801, B5501 A0301, A1101, B1402, B1501 A0201, A2902, B0702, B4403 A0201, A0301, B0702 A0201, A2902, B4002, B5601 A0201, B1501, B4001 A0201, A1101, B3501, B5101 A0201, B0702, B5101 AFP [ng/ml] 503,1 GPT [U/l] 176 Zirrhose keine 10,2 2,5 109 216,4 49,8 4,3 5,9 3 17,1 20 691,5 n. d. 14810 4,1 5,9 12,6 71 46 87 273 84 98 41 25 112 n. d. 54 201 n. d. 28 29 57 keine Child B Child A Child C Child C Child A Child B Child B Child C Child B keine Child A Child B Child A Child C Child A Alter [Jahre] 76 63 70 53 80 50 73 35 Geschlecht W M W M W W W M Tabelle 2.12 Klinische Parameter der Patienten mit malignem Melanom Patient Stadium Therapie AFP [ng/ml] M1 IIc Resektion, IFN-alpha n. d. M2 IV Resektion, Dacarbazin, Vinblastin, Cisplatin, n. d. Temozolomid, selektive interne Radiotherapie, Radiochirurgie, IL-2, IFN-alpha M3 IV Resektion, Bestrahlung, Radiochirurgie, n. d. Temozolomid, Dacarbazine, IFN-alpha M4 Remission Rutheniumapplikator n. d. M5 Remission Resektion, DC-Vakzinierung n. d. M6 IV Resektion, Bestrahlung n. d. GPT [U/l] 63 95 Zirrhose 20 n. d. 18 22 22 n. d. n. d. n. d. n. d. n. d. 33 Patient Stadium Therapie M7 M8 unbekannt III Resektion Resektion AFP [ng/ml] n. d. n. d. Tabelle 2.13 Patienten der Kontrollkohorte Patient HLA-Typisierung Alter [Jahre] K1 A2 neg., A3 pos., B27 neg. 24 K2 A2 neg., A3 pos., B27 neg. 26 K3 A2 pos., A3 neg., B27 neg. 25 K4 A2, A23(9), B13, B57(17) 29 K5 A2 pos., A3 neg., B27 neg. 25 K6 A0301, A3201, B0702, B1801 38 K7 A2 pos., A3 neg., B27 neg. 22 K8 A3, A30, B7, B18 41 K9 A0301, A6801, B5101, B5801 40 K 10 A2 pos., B27 neg. 23 K 11 A2 pos., A3 neg., B27 neg. 24 K 12 A3, A11, B8 49 K 13 A2 neg., A3 pos. 30 Geschlecht w m w m m m m m m m w m m K 14 K 15 K 16 K 17 K 18 A2 neg., A3 pos., B27 neg. A2 neg., A3 pos., B27 neg. A2 neg., A3 pos. B27 neg. A2 pos., B27 neg., DR1 pos. A2 pos., A3 neg., B27 neg. 46 59 50 63 28 w m m w m K 19 A2 pos., A3 neg., B27 neg. 26 m K 20 K 21 K 22 K 23 K 24 K 25 K 26 K 27 K 28 K 29 K 30 K 31 K 32 A2 pos., B27 neg. A0101, A0201, B0801, B2705 A0101, A0201, B0702, B4101 A2 pos., B27 neg. A2 pos., A3 pos., B27 neg. A0201, A0301, B4001, B5301 A2 pos., A3 neg., B27 neg. A0201, A2601, B3801, B5101 A0301, A0702, B3501 A0301, A1101, B0702, B5501 A2 pos., A3 pos., B27 neg. A2 pos., A3 neg., B27 neg. A0301, A2301, B4701, B5301 71 40 73 55 22 62 23 46 56 41 23 40 57 w m w m m w w w m m w m w K 33 A0201, A0301, B0702 46 m GPT [U/l] 20 58 Zirrhose n. d. n. d. Erkrankung gesunde Kontrolle gesunde Kontrolle gesunde Kontrolle gesunde Kontrolle gesunde Kontrolle HCV; Genotyp 1b gesunde Kontrolle HCV; Genotyp 1b HCV; Genotyp 3a gesunde Kontrolle gesunde Kontrolle HBV Chronisch-entzündliche Darmerkrankung HBV HCV; Genotyp 1b HBV HCV Chronisch-entzündliche Darmerkrankung Chronisch-entzündliche Darmerkrankung Steatosis hepatis HCV; Genotyp 3a HBV, HCV; Genotyp 1b Steatosis hepatis gesunde Kontrolle HCV; Genotyp 1b gesunde Kontrolle HCV; Genotyp 1b HBV, HCV; Genotyp 3a HCV; Genotyp 3a gesunde Kontrolle HCV; Genotyp 3a HCV; Genotyp 1b, Kolonkarzinom Morbus Hodgkin, Fokale noduläre Hyperplasie 34 Patient K 34 HLA-Typisierung A0201, A0301, B3501, B5101 Alter [Jahre] 54 Geschlecht m K 35 A2, A24(9), B44(12), B15 31 w Tabelle 2.14 Patient K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K 10 K 11 K 12 K 13 K 14 K 15 K 16 K 17 K 18 K 19 K 20 K 21 K 22 K 23 K 24 K 25 K 26 K 27 K 28 K 29 K 30 K 31 K 32 K 33 K 34 K 35 Erkrankung HAV, HCV; Genotyp 1a, B-Zell-Lymphom gesunde Kontrolle Klinische Parameter der Patienten der Kontrollkohorte Therapie AFP [ng/ml] GPT [U/l] keine n. d. n. d. keine n. d. n. d. keine n. d. n. d. keine n. d. n. d. keine n. d. n. d. keine 3,1 77 keine n. d. n. d. Interferon-Alpha 2a, Ribavirin 3,2 36 Interferon-Alpha 2b, Ribavirin 9,5 40 keine n. d. n. d. keine n. d. n. d. Entecavir 1,3 58 Sulfasalazin n. d. n. d. Entecavir 1,2 14 keine 4 126 Enofovir Disoproxil Fumarat 18,5 43 Interferon-Alpha 2b, Ribavirin 8,2 27 keine n. d. n. d. Mesalazin n. d. 8 keine 1,6 32 keine 1,9 69 Interferon-Alpha 2a/Ribavirin 6,1 49 keine 2,5 110 keine n. d. n. d. keine 1,8 39 keine n. d. n. d. Interferon-Alpha 2a/Ribavirin 2,2 18 keine n. d. n. d. keine 3,8 n. d. keine n. d. n. d. keine 3,4 38 keine 3,7 116 autologe Stammzelltransplantation, 2,4 50 Hemihepatektomie keine 3,4 68 keine n. d. n. d. Zirrhose n. d. n. d. n. d. n. d. n. d. Keine n. d. keine Child A n. d. n. d. keine n. d. keine keine keine keine n. d. n. d. n. d. keine keine n. d. n. d. keine n. d. keine keine keine n. d. keine keine n. d. keine n. d. 35 2.5 Software Tabelle 2.15 Software Verwendete Software Firme (Firmensitz) Microsoft Office 2010 Microsoft (Redmond, USA) Adobe Acrobat Adobe Systems GmbH (München, Deutschland) GraphPad Prism Version 5 GraphPad Software Inc. (San Diego, USA) FlowJo Version 8.8.6 Treestar (San Carlos, USA) BD FACSDiva BD Bioscience (San Jose, USA) EndNote X4 Thomson Reuters (New York, USA) SYFPEITHI Biomedical Informatics (Heidelberg, Deutschland) Immun-Epitop-Datenbank (IEDB) National Institutes of Health (Bethesda, USA) 2.6 Statistische Analysen Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Programms GraphPad Prism Version 5 durchgeführt. Zunächst wurden mit Hilfe des Kolmogorow-Smirnow-Tests Aussagen über die Normalverteilung der gemessenen Werte getroffen. Bei normalverteilten Werten wurde zur Berechnung der Signifikanz der ungepaarte bzw. gepaarte Student’sche t-Test angewendet. Bei Werten, die nicht normalverteilt waren, wurde hierfür der Mann-Whitney-U-Test bzw. der Wilcoxon-Test für gepaarte Werte verwendet. Bei multiplen Testungen wurde zusätzlich der korrigierte Wert nach Kruskal-Wallis-Test und Dunns Test für multiple Testungen angegeben. Die Berechnung der Kontingenz wurde mit Hilfe des Chi-Quadrat-Tests durchgeführt. Zur Analyse des progressionsfreien Überlebens wurden der Logrank-(Mantel-Cox-)Test sowie die Gehan-Breslow-Wilcoxon-Methode angewendet. Alle Analysen erfolgten zweiseitig (two-tailed) mit einem Signifikanzniveau von 95%. Die p-Werte wurden wie folgt gekennzeichnet: p≤0,05: *; p≤0,01: **; p≤0,001: ***. In den Abbildungen ist der Median dargestellt. 36 3 Ergebnisse 3.1 Patientenkohorte Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden Antigen-spezifische CD8+ T-Zellen von Patienten mit HCC analysiert. Patienten mit malignem Melanom fungierten als Tumor-Kontrollgruppe, da ein Teil der untersuchten TAAs in dieser Erkrankung ebenfalls beschrieben wurden. Als weitere Kontrollkohorte dienten Patienten mit anderen benignen Lebererkrankungen, wie beispielsweise viraler Hepatitis und Steatosis hepatis, Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen sowie gesunde Spender. Einige charakteristische Eigenschaften der Patientengruppen werden in Tab. 3.1 aufgeführt. Tabelle 3.1 Patientenkohorte Anzahl der Patienten männlich medianes Alter [Jahre] HCV-Infektion HBV-Infektion medianes Serum-AFP [ng/ml] medianes Serum-GPT [U/l] Leberzirrhose TACE HCC 61 82% 70 20% 18% 10,2 41 66% 72% Malignes Melanom 8 38% 67 0% 0% n. d. 22 n. d. 0% Kontrollkohorte 35 63% 40 40% 14% n. d. n. d. n. d. 0% Die Mehrzahl der Patienten mit HCC war in einem fortgeschrittenen Alter und männlich. In der Literatur stellt in 80-90% der Patienten die Leberzirrhose die Grundlage der HCC-Entstehung dar [46,48]. In unserer Kohorte wiesen jedoch nur 66% der Patienten mit HCC eine diagnostizierte Leberzirrhose auf. Das HCC entwickelte sich in der Regel in Patienten mit chronischen Lebererkrankungen, wie Ethanol-Abusus (50%) und chronische virale Hepatitis (38%). Seltenere Ursachen wie Steatosis heaptis und Hämochromatose konnten in einzelnen Patienten beobachtet werden. 49% der Patienten mit HCC zeigten erhöhte Serum-AFP-Werte (Grenzwert: 7 ng/ml). In der Kohorte der Patienten mit anderen, benignen Lebererkrankungen waren dies 11%. 3.2 TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten Erstes Ziel dieser Doktorarbeit war es, die exakten Epitope zu identifizieren, die von HCC-Patienten mit Immunantworten gegen OLP erkannt werden. Hierfür wurden die TAAs AFP, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, GPC-3 und Bax untersucht. Um Epitope mit idealen Bindungseigenschaften für häufige HLA-Allele unserer Patientenkohorte zu identifizieren, wurden in silico Vorhersagen angewandt (Kap. 2.5). Diese analysieren Peptidsequenzen in Hinblick auf die individuellen 37 biochemischen Eigenschaften der einzelnen Aminosäuren und sagen so ideale Epitope für die Bindung und Präsentation durch bestimmte HLA-Klassen vorher. Auf diese Weise identifizierten wir für 9 OLP insgesamt 22 potentielle Epitope (Kap.2.1.5). Da diese Peptidfragmente zu einem Großteil aus 9 Aminosäuren bestehen, werden sie im Folgenden zusammenfassend als 9-mere bezeichnet. CD8+ T-Zellen wurden aus dem Blut der Patienten isoliert (Kap. 2.2.2) und nach 3 Wochen Antigenunspezifischer Expansion (Kap. 2.2.8) mit den OLP und 9-meren stimuliert, anschließend gefärbt und mit dem Durchflusszytometer gemessen (Kap. 2.3). In Abhängigkeit vom HLA-Typ des Patienten wurden die CD8+ T-Zellen mit genau den 9-meren stimuliert, die ideale Bindungseigenschaften für diesen HLA-Typ aufweisen. Aus diesem Grund wurden die CD8+ T-Zellen jeweils mit einer unterschiedlichen Anzahl an verschiedenen Peptiden stimuliert (Tab. 3.2). Tabelle 3.2 Anzahl der getesteten Peptide für jeden HLA-Typ HLA-Typ 9-mere OLP HLA-A1 1 1 HLA-A2 14 9 HLA-A3 4 4 HLA-B44 3 3 Insgesamt wurden 12 HLA-A1+, 37 HLA-A2+, 17 HLA-A3+ und 11 HLA-B44+ Patienten mit HCC getestet. Des Weiteren wurden 6 HLA-A2+ und 3 HLA-A3+ Patienten mit Melanom sowie 19 HLA-A2+, 16 HLA-A3+ und 1 HLA-B44+ Kontrollpatienten untersucht. Patienten, die mehrere der analysierten HLA-Typen aufwiesen, werden in den folgenden Analysen für jeden dieser HLA-Typ aufgeführt. Nach der Messung mit dem Durchflusszytometer wurden die gewonnen Daten mit der Auswertungssoftware FlowJo analysiert (Kap. 2.3.8). Abb. 3.1. zeigt exemplarisch die IFNγ-Produktion nach der Stimulation mit dem OLP MAGE-A1105-122 und mit dem korrespondierenden 9-mer MAGE A1105-114. 38 Abbildung 3.1 TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten Gezeigt ist die IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen (HCC 41) nach der Stimulation mit MAGE-A1-Peptiden. A Negativkontrolle; B MAGE-A1105-122; C Das von MAGE-A1105-122 abstammende 9-mer MAGE-A1105-114. HLA-A2+ Patienten mit HCC wiesen signifikant häufiger CD8+ T-Zell-Antworten gegen OLP auf als Patienten der Kontrollkohorte (p=0,0452; Abb. 3.2 A). Auch bei Patienten mit malignem Melanom waren im Vergleich zur Kontrollkohorte signifikant häufiger Immunantworten nachweisbar (p=0,0149). Interessanterweise zeigten sich bei HLA-A3+ Patienten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten. Abbildung 3.2 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten A Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit Immunantworten gegen OLP. HLA-A2+ Patienten der Kontrollkohorte weisen signifikant seltener Immunantworten auf als HLA-A2+ Patienten mit HCC (p=0,0452) oder malignem Melanom (p=0,0149). B Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit Immunantworten nach der Stimulation mit 9-meren. 39 Tatsächlich konnte bei 57% der getesteten HLA-A2+ HCC-Patienten und bei 11% der HLA-A3+ HCCPatienten spezifische CD8+ T-Zell-Antworten gegen ein oder mehrere der getesteten 9-mere nachgewiesen werden (Abb.3.2 B). Bei Patienten mit malignem Melanom war dies in allen HLA-A2+ Patienten und keinem der HLA-A3+ Patienten möglich. Interessanterweise wiesen in der Kontrollkohorte 74% der HLA-A2+ Patienten und 18% der HLA-A3+ Patienten spezifische Immunantworten gegen TAA-9-mere auf, so dass sich hier keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten zeigten. Die Stärke der detektierten Immunantworten gegen OLP (Abb. 3.3 A) und 9-mere (Abb. 3.3 B) unterschied sich hingegen nicht statistisch signifikant zwischen den Kohorten. Abbildung 3.3 Stärke der TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten Gezeigt ist die Stärke der detektierten CD8+ T-Zell-Antworten gegen OLP (A) und 9-mere (B). Im Folgenden werden die spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten gegen die einzelnen getesteten TAAs genauer analysiert. 3.2.1 α-Fetoprotein Wir untersuchten die AFP-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten nach der Stimulation mit drei verschiedenen 9-meren und nach der Stimulation mit den zwei korrespondierenden OLP (Abb. 3.4). Uns gelang so bei 10% der Patienten mit HCC der Nachweis spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten gegen das OLP AFP41-58. Gegen das korrespondierende 9-mer AFP47-55 konnten bei 3% der HLA-A2+ Patienten mit HCC Immunantworten nachgewiesen werden. AFP47-55 war bisher noch nicht als Epitop beschrieben worden. Interessanterweise konnte bei keinem der Patienten mit malignem Melanom eine Immunantwort gegen AFP-Peptide detektiert werden. 40 Abbildung 3.4 AFP-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten Abbildung: Gezeigt ist der Anteil der getesteten Patienten mit AFP-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten. Das neu identifizierte, HLA-A2-restringierte Epitop ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Tabelle: Gezeigt ist die vorhergesagt HLA-Restriktion der Epitope sowie die Anzahl der Patienten mit CD8+ T-Zell-Antworten/Anzahl der getesteten Patienten. 3.2.2 Glypican-3 Um GPC-3-spezifische Immunantworten zu analysieren, stimulierten wir CD8+ T-Zellen mit insgesamt 5 verschiedenen 9-meren sowie mit den entsprechenden OLP (Abb. 3.5). So konnten wir die Erkennung des bereits vorbeschriebenen Epitops GPC-3522-530 bei 3% der HLA-A2+ Patienten mit HCC nachweisen. Zudem identifizierten wir GPC-3281-289 (HLA-A2+) und GPC-3519-528 (HLA-A3+) als neue Epitope, die von Patienten mit HCC in 3% bzw. 11% erkannt wurden. Auch in der Kohorte der Patienten mit malignem Melanom und bei einzelnen Patienten der Kontrollkohorte waren GPC-3spezifische CD8+ T-Zell-Antworten nachweisbar. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass es sich bei GPC-3 um ein immunogenes TAA handelt, dessen Peptide vor allem bei HCC-Patienten, jedoch auch bei vereinzelten Patienten mit malignem Melanom und bei Patienten der Kontrollkohorte, eine IFNγ-Produktion induzieren können. 41 Abbildung 3.5 GPC-3-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten Abbildung: Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit GPC-3-spezifischen CD8+ T-ZellAntworten. Die neu identifizierten Epitope sind durch einen Pfeil gekennzeichnet. Tabelle: Gezeigt ist die vorhergesagt HLA-Restriktion der Epitope sowie die Anzahl der Patienten mit CD8+ T-Zell-Antworten/Anzahl der getesteten Patienten. 3.2.3 Bax Keiner der getesteten Patienten mit HCC (n=28) oder malignem Melanom (n=6) wiesen spezifische CD8+ T-Zell-Antworten gegen Bax136-144 auf. Lediglich 1 von 18 getesteten Kontrollpatienten (6%) zeigte eine Immunantwort nach der Stimulation mit Bax136-144. Dies zeigt, dass grundsätzlich eine Stimulation des Immunsystems durch das körpereigene Protein Bax möglich ist. Um die exakten Epitope zu definieren, die in Patienten mit HCC oder malignem Melanom eine spezifische Immunreaktion induzieren können, müssen jedoch noch weitere Untersuchungen durchgeführt werden. 3.2.4 MAGE-A Wir untersuchten die MAGE-A-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten nach der Stimulation mit 8 verschiedenen 9-meren und nach der Stimulation mit den beiden korrespondierenden OLP (Abb. 3.6). So detektierten wir spezifische CD8+ T-Zell-Antworten bei 4% bzw. 6% der getesteten Patienten mit HCC nach der Stimulation mit den 9-meren MAGE-A3271-279 (HLA-A2+) bzw. MAGE-A196-104 (HLA-A3+), die als Epitope bereits vorbeschrieben waren. Zudem zeigten 3% der HLA-A2+ Patienten mit HCC spezifische Antworten gegen das 9-mer MAGE-A1105-114, das bisher nur als potentielle HLA-A2-Ligand, nicht jedoch als Epitop, beschrieben wurde. 42 Abbildung 3.6 MAGE-A-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten Abbildung: Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit MAGE-spezifischen CD8+ T-ZellAntworten. Das neu identifizierte, HLA-A2 restringierte Epitop ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Es wurde von Patienten mit malignem Melanom signifikant häufiger erkannt als von Patienten mit HCC (p=0,0211) und von Patienten der Kontrollkohorte (p=0,0149). Tabelle: Gezeigt ist die vorhergesagt HLA-Restriktion der Epitope sowie die Anzahl der Patienten mit CD8+ T-Zell-Antworten/Anzahl der getesteten Patienten. Interessanterweise erkannten 43% der Patienten mit HCC das 9-mer MAGE-A191-101, das von dem OLP MAGE-A189-106 abstammt. Dieses Peptid, das bisher noch nicht als Epitop vorbeschrieben war, wurde auch von allen 6 getesteten Patienten mit malignem Melanom und von 37% der getesteten Kontrollpatienten erkannt. Dies zeigt, dass Peptide der MAGE-A-Familie hochpotente TAAs darstellen, die sowohl in Patienten mit malignem Melanom, wo sie erstmals beschrieben wurden, als auch in Patienten mit HCC und Kontrollpatienten spezifische CD8+ T-Zell-Immunantworten induzieren können. Vor allem MAGE-A191-101 ist ein von uns neu identifiziertes, hoch immunogenes Epitop der MAGE-A1-Familie, das in einem großen Anteil der Patienten mit HCC und malignem Melanom Immunantworten induzieren kann. 3.2.5 NY-ESO-1 Zuletzt untersuchten wir NY-ESO-1-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten. Hierfür wurden CD8+ T-Zellen mit zwei OLPs sowie mit den 5 korrespondierenden 9-meren stimuliert (Abb. 3.7). Sowohl bei einer großen Zahl an Patienten mit HCC und malignem Melanom, als auch in der Kontrollkohorte konnten Antworten gegen NY-ESO-1-Peptide nachgewiesen werden. So detektierten wir bei 3% der HLA-A2+ Patienten mit HCC Antworten gegen das bereits als Epitop beschriebene 9-mer NY-ESO-1157-167. 43 Darüber hinaus waren bei 27% der HLA-A2+ HCC-Patienten CD8+ T-Zell-Antworten gegen das 9-mer NY-ESO-1145-153 nachweisbar, das von dem OLP NY-ESO-1137-154 abstammt und bisher noch nicht als Epitop beschrieben wurde. Abbildung 3.7 NY-ESO-1-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten Abbildung: Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit NY-ESO-1-spezifischen CD8+ TZell-Antworten. Das neu identifizierte, HLA-A2-restringierte Epitop ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Das OLP NY-ESO-1153-170 wird von Patienten mit HCC (p=0,0169) und malignem Melanom (p=0,0119) signifikant häufiger erkannt als von Patienten der Kontrollkohorte. Tabelle: Gezeigt ist die vorhergesagt HLA-Restriktion der Epitope sowie die Anzahl der Patienten mit CD8+ T-Zell-Antworten/Anzahl der getesteten Patienten. Zusammenfassend wird deutlich, dass es sich bei NY-ESO-1 um ein Antigen mit starkem immunogenen Potential handelt, das sowohl in einer großen Anzahl von Tumorpatienten als auch in zahlreichen Patienten der Kontrollkohorte in der Lage ist, Immunantworten zu induzieren. Insgesamt konnten wir so bei Patienten mit HCC spezifische CD8+ T-Zell-Antworten gegen alle getesteten TAAs mit Ausnahme von Bax nachweisen. In 57% der getesteten HLA-A2+ HCC-Patienten und in 11% der HLA-A3+ HCC-Patienten waren CD8+ T-Zell-Antworten gegen mindestens eines der getesteten 9-mere nachweisbar. Zudem gelang uns bei Patienten mit HCC die Neuidentifikation von einem HLA-A3+-restringierten und 4 HLA-A2+-restringierten Epitopen, die bisher noch nicht vorbeschrieben waren. Auch bei Patienten mit malignem Melanom und bei Patienten der Kontrollkohorte waren TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten nachweisbar. 44 3.2.6 Immunogenität der Antigene Wie in Kap. 3.2.1-3.2.5 beschrieben unterscheiden sich die getesteten TAAs deutlich in ihrer Fähigkeit Immunantworten zu induzieren. Jedoch zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Stärke der induzierten IFNγ-Produktion (Abb. 3.8 A+B). Interessanterweise konnten wir jedoch zeigen, dass 9-mere in der Lage sind, signifikant stärkere Immunantworten hervorzurufen als die OLP (p=0,0011; Abb. 3.8 C). Abbildung 3.8 Stärke der Immunantwort A Vergleich zwischen den einzelnen TAAs in Hinblick auf die durch OLP induzierte IFNγ-Produktion. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. B Vergleich zwischen den einzelnen TAAs in Hinblick auf die durch 9-mere induzierte IFNγProduktion. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. C Gezeigt ist der Vergleich der durch OLP und 9-mere hervorgerufenen IFNγ-Produktion. 9-mere induzieren signifikant stärkere Immunantworten (p=0,0011). 45 3.2.7 Klinische Parameter Im Folgenden untersuchten wir mögliche Assoziationen zwischen klinischen Parametern und TAAspezifischen CD8+ T-Zell-Antworten bei Patienten mit HCC. Weder das Alter, das Vorhandensein oder das Ausmaß der Leberzirrhose, die Serum-AFP- und Serum-GPT-Werte noch die Behandlung mit TACE übten einen signifikanten Einfluss auf die TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten der Patienten mit HCC aus (Daten nicht gezeigt). Abbildung 3.9 Einfluss klinischer Parameter auf TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten A HCC-Patienten mit chronisch viraler Hepatitis zeigen signifikant schwächere CD8+ T-Zell-Antworten nach der Stimulation mit OLP als Patient mit HCC anderer Ätiologie (p=0,0095). B In der Kontrollkohorte zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen gesunden Patienten und Patienten, die an einer chronischen viralen Hepatitis erkrankt waren. C In der Kohorte der HCC-Patienten weisen nach der Stimulation mit 9-meren Frauen signifikant stärkere Immunantworten auf (p=0,0379). D In der Kontrollkohorte lassen sich keine Geschlechts-spezifischen Unterschiede nachweisen. Interessanterweise zeigten HCC-Patienten mit chronisch viraler Hepatitis signifikant schwächere CD8+ T-Zell-Antworten nach der Stimulation mit OLP als Patienten, deren HCC sich auf der Grundlage anderer Erkrankungen wie Ethanol-Abusus, Steatosis hepatis oder Hämochromatose, entwickelt hat (Abb.3.9 A). Bei der Stimulation mit 9-meren ließen sich diese Unterschiede jedoch nicht bestätigen. 46 In der Kontrollkohorte zeigte sich kein Zusammenhang zwischen einer chronisch viralen Hepatitis und der Stärke oder Häufigkeit der TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten (Abb. 3.9 B). In der Kohorte der Patienten mit chronisch viraler Hepatitis fanden sich zudem keine Unterschiede zwischen Patienten mit und ohne HCC. Des Weiteren zeigten nach der Stimulation mit 9-meren in der Kohorte der HCC-Patienten im Gegensatz zur Kontrollkohorte Frauen signifikant stärkere Immunantworten als Männer (Abb. 3.9 C+D). 3.3 TAA-spezifische CD8+ T-Zellen Um die TAA-spezifischen Immunantworten bei Patienten mit HCC genauer zu untersuchen, wurden PBMCs aus dem Blut der Patienten isoliert und Antigen-spezifisch expandiert (Kap. 2.2.9). Auf diese Weise untersuchten wir NY-ESO-1157-165-, NY-ESO-1145-153- und MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen. NY-ESO-1157-165 und MAGE-A196-104 waren bereits als Epitope vorbeschrieben, NY-ESO-1145-153 wurde von uns als Epitop neu identifiziert. Diese Antigen-spezifische Expansion ermöglicht zum einen eine genaue Analyse der Zytokinproduktion, zum anderen aber auch den Nachweis Antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen unabhängig ihrer Funktionalität durch die Färbung mit Tetrameren (Tet). Dies ist insbesondere in Hinblick auf frühere Studien, in denen die Expansion funktioneller TAA-spezifischer CD8+ T-Zelllinien in vitro nicht möglich war, von großer Relevanz [151,168]. Für NY-ESO-1157-165 (Abb. 3.10 A) sowie NY-ESO-1145-153 (Abb. 3.10 B) wurden HLA-A2Tetramere und für MAGE-A196-104 (Abb. 3.10 C) HLA-A3-Tetramere verwendet. Abbildung 3.10 TAA-spezifische CD8+ T-Zellen Gezeigt sind typische Beispielabbildungen für den Nachweis TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von MHC Klasse I Tetrameren. A NY-ESO-1157-165 (HCC 14); B NY-ESO-1145-153 (HCC 14); C MAGE-A196-104 (HCC 6). Nach 14-tägiger Antigen-spezifischer Expansion wurden die Zellen gefärbt und mit dem Durchflusszytometer gemessen (Kap. 2.3). Daraufhin wurden die gewonnen Daten mit der Auswertungssoftware FlowJo analysiert (Kap. 2.3.8). 47 Auf diese Weise wurden 25 HLA-A2+, 10 HLA-A3+ und 2 HLA-A2+/A3+ Patienten mit HCC getestet. Des Weiteren wurden 5 HLA-A2+, 2 HLA-A3+ und 1 HLA-A2+/A3+ Patienten mit malignem Melanom sowie 16 HLA-A2+, 13 HLA-A3+ und 3 HLA-A2+/A3+ Patienten der Kontrollkohorte untersucht. Tatsächlich gelang bei 41% der Patienten mit HCC und 50% der Patienten mit malignem Melanom der direkte Nachweis NY-ESO-1- und MAGE-A1-spezifischer CD8+ T-Zellen und deren spezifische Expansion in vitro (Abb.3.11). Interessanterweise konnte auch bei 38% Patienten der Kontrollkohorte die Proliferation TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen induziert werden. Abbildung 3.11 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen A Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen (Tet+). Dies waren 41% der Patienten mit HCC, 50% der Patienten mit malignem Melanom und 38% der Patienten der Kontrollkohorte. B Gezeigt ist der Anteil der Patienten mit NY-ESO-1157-165-, NY-ESO-1145-153- und MAGE-A196-104- spezifischen CD8+ T-Zellen. Somit zeigte sich in der Anzahl der Patienten, die TAA-spezifische CD8+ T-Zellen aufwiesen, kein signifikanter Unterschied zwischen den getesteten Kohorten. NY-ESO-1157-165-spezifische CD8+ T-Zellen waren bei 9 von 27 Patienten mit HCC, 3 von 6 Patienten mit malignem Melanom und 4 von 19 Patienten der Kontrollkohorte nachweisbar. Die spezifische Proliferation NY-ESO-1145-153spezifischer T-Zellen konnte deutlich seltener induziert werden. So zeigten nur 2 von 27 Patienten mit HCC, 1 von 6 Patienten mit malignem Melanom und 2 von 19 Patienten der Kontrollkohorte 48 NY-ESO-1145-153-spezifische CD8+ T-Zellen. MAGE-A196-104-spezifische Zellen konnten bei 6 von 12 Patienten mit HCC, 1 von 3 Patienten mit malignem Melanom und bei 7 von 16 Patienten der Kontrollkohorte nachgewiesen werden. Abbildung 3.12 Frequenzen TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen A Gezeigt ist die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen. Patienten mit HCC und malignem Melanom weisen signifikant höhere Frequenzen TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen auf als Patienten der Kontrollkohorte (p=0,0002 bzw. p=0,0039). B Gezeigt ist die Frequenz NY-ESO-1157-165-spezifischer CD8+ T-Zellen. Patienten mit HCC zeigen signifikant höhere Frequenzen als Patienten der Kontrollkohorte (p=0,0028). C Gezeigt ist die Frequenz NY-ESO-1145-153-spezifischer CD8+ T-Zellen. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. D Gezeigt ist die Frequenz MAGE-A196-104-spezifischer CD8+ T-Zellen. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Im Gegensatz hierzu zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in Hinblick auf die Frequenz der TAAspezifischen CD8+ T-Zellen (Abb. 3.12). So wiesen Patienten mit HCC signifikant höhere Frequenzen TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen auf als die Patienten der Kontrollkohorte (Mann-Whitney-U-Test p=0,0002 bzw. korrigierter Wert nach Kruskal-Wallis-Test und Dunns Test für multiple Testungen p=0,0004). Auch die Patienten mit malignem Melanom zeigten höhere Frequenzen als die Patienten der Kontrollkohorte (Mann-Whitney-U-Test p=0,0039 bzw. korrigierter Wert nach Kruskal-Wallis-Test und Dunns Test für multiple Testungen p=0,0078). Betrachtet man die individuellen TAA-Epitope, so 49 wird deutlich, dass die Frequenz der NY-ESO-1157-165-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC im Vergleich zu Patienten der Kontrollkohorte signifikant erhöht ist (Mann-Whitney-U-Test p=0,0028 bzw. korrigierter Wert nach Kruskal-Wallis-Test und Dunns Test für multiple Testungen p=0,0056). Patienten mit malignem Melanom wiesen ebenfalls einen starken Trend zu höheren Frequenzen NY-ESO-1157-165-spezifischer CD8+ T-Zellen auf (Mann-Whitney-U-Test p=0,0571 bzw. korrigierter Wert nach Kruskal-Wallis-Test und Dunns Test für multiple Testungen p=0,1142). Für NY-ESO-1145-153 und MAGE-A196-104 wird eine Tendenz in diese Richtung ebenfalls deutlich. Vergleicht man die Frequenzen der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen aller Patienten in Bezug auf die unterschiedlichen Epitope, so zeigt sich, dass NY-ESO-1157-165-und NY-ESO-1145-153-spezifische CD8+ T-Zellen in deutlich höherer Zahl vorkommen als MAGE-A196-104 spezifische-CD8+ T-Zellen % T e t+ / C D 8 + T - Z e lle n (Abb. 3.13). Dieser Unterschied ist jedoch nicht signifikant (p=0,0536 bzw. p=0,3750). 60 40 20 10 8 6 4 2 04 3 -1 15 96 5- 1 14 -A -1 E O M A G S -E Y N N Y -E S O -1 15 7- 16 5 0 Abbildung 3.13 Immunogenität der TAA-Epitope Gezeigt sind die Frequenzen TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen in Patienten aller drei Kohorten. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei getesteten Epitopen. Als nächstes untersuchten wir die Funktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen anhand ihrer Fähigkeit zur IFNγ-Produktion, wie in Kap. 2.3 beschrieben (Abb. 3.14). Keine der Zelllinien, die von HCC- oder Melanom-Patienten abstammen, war in der Lage, nach der Stimulation mit dem jeweiligen Peptid IFNγ zu produzieren. Lediglich bei 1 von 12 Kontroll-Zelllinien war eine IFNγ-Produktion nach der Stimulation mit NY-ESO-1157-165 nachweisbar. 50 Abbildung 3.14 IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen A Gezeigt ist die IFNγ-Produktion TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC. Diese sind stark dysfunktionell (p=0,0003). B Gezeigt ist die IFNγ-Produktion TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Patienten mit malignem Melanom. Diese sind stark dysfunktionell. C Gezeigt ist die IFNγ-Produktion TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Patienten der Kontrollkohorte. Diese sind stark dysfunktionell (p=0,0017). Um die Funktionalität der TAA-spezifischen Zellen genauer zu untersuchen, expandierten wir TAAspezifische Zelllinien über 3 Wochen und führten, wie in Kap. 2.3.6 beschrieben, Multizytokinfärbungen durch. Auf diese Weise untersuchten wir die Fähigkeit der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen zur Produktion von IFNγ, MIP-1β, TNFα und IL-2 sowie die Fähigkeit zur Mobilisation von CD107a an die Zelloberfläche. Die dreiwöchige Expansion übte hierbei keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Frequenz der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen aus (Daten nicht gezeigt). Nach der Stimulation mit dem jeweiligen Peptid war in allen Zelllinien eine geringe Zytokinproduktion nachweisbar. So konnte eine Produktion von IFNγ, MIP-1β und TNFα sowie eine Mobilisation von CD107a detektiert werden. IL-2 wurde hingegen nur in sehr geringen Mengen freigesetzt. Hierbei zeigten die drei Patientenkohorten ein einheitliches Zytokinprofil mit gleichen Quantitäten der einzelnen Zytokine (Abb. 3.15 A). Auch die Spezifität der Zellen übte hierauf keinen Einfluss aus (Daten nicht gezeigt). 51 Abbildung 3.15 Funktionalität der TAA-spezifische CD8+ T-Zellen A Die drei Kohorten zeigen ein einheitliches Zytokinprofil und keine statistisch signifikanten Unterschiede in der CD107a-Mobilisation. B Die Kreisdiagramme zeigen die durchschnittliche Multifunktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zelllinien. Die Mehrheit der funktionellen TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen übte 1-2 der 5 untersuchten Funktionen (Sekretion von IFNγ, MIP-1β, TNFα, IL-2; Mobilisation von CD107a) aus. Es zeigen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten. C Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen der Frequenz TAAspezifischer CD8+ T-Zellen und deren Fähigkeit zur Mobilisation von CD107a (p=0,0023) sowie deren Produktion von IFNγ (p=0,0031), IL-2 (0,0004), MIP-1β (p=0,0166) und TNF-α (0,0007). Gezeigt sind CD8+ T-Zelllinien aller drei Kohorten nach der Standard-Expansion über drei Wochen. Die Analyse des Funktionsprofils jeder individuellen reagierenden CD8+ T-Zelle zeigt, dass die Mehrheit der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nicht multifunktionell ist, sondern nur 1-2 der untersuchten 5 Funktionen ausüben kann (Abb. 3.15 B). Hierbei zeigen sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten, jedoch zeigen die Zelllinien der Kontrollkohorte im Vergleich zu Zelllinien der HCC-Patienten eine Tendenz zu Zellen mit zwei Funktionen. Auch die Spezifität der CD8+ T-Zelle übte keinen Einfluss auf ihr Funktionsprofil aus (Daten nicht gezeigt). Trotz des Nachweises minimaler Zytokinproduktion und CD107a-Mobilisation sind die TAAspezifischen CD8+ T-Zellen stark dysfunktionell (Abb. 3.15 C). 52 Zahlreiche mögliche Ursachen für dieses Versagen der Tumor-spezifischen Immunantwort sind in Kap. 1.5 erläutert. Zu den immunsuppressiven Mechanismen zählen unter anderem Priming-Defekte, Beeinträchtigung der TAA-Präsentation, inhibitorische Rezeptoren auf der Zelloberfläche Tumorspezifischer T-Zellen, Treg und eine fehlende CD4+ T-Zell-Hilfe. Im Folgenden adressierten wir einige dieser immunsuppressiven Mechanismen, um deren Einfluss auf die Proliferation und Funktionalität TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen zu analysieren. 3.3.1 Stimulation mit IL-7 und IL-12 Auf Grund der zentralen Rolle von IL-7 und IL-12 bei der Ausreifung und Proliferation von CD8+ T-Zellen (Kap. 1.1.3.1) stimulierten wir die TAA-spezifischen CD8+ T-Zelllinien zusätzlich mit IL-7 und IL-12 (Kap. 2.2.9.1). Abbildung 3.16 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Interleukin-Stimulation A Gezeigt ist der Anteil an Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nach der Standardexpansion und nach der zusätzlichen Stimulation mit IL-7 und IL-12. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Aufgeführt sind nur Patienten bei denen beide Expansionsmodelle untersucht wurden. B Gezeigt ist die Frequenz TAAspezifischer CD8+ T-Zellen nach der Stimulation mit IL-7 und IL-12 im Vergleich zu der Standard-Expansion. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Expansionsprotokollen. Diese Stimulation mit IL-7 und IL-12 resultierte nicht in einer signifikanten Veränderung des Anteils an Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen (Abb. 3.16 A). So zeigten in der Gruppe der HCCPatienten 2 von 16 Patienten NY-ESO-1157-165-spezifische, 3 von 16 Patienten 53 NY-ESO-1145-153-spezifische und 3 von 8 Patienten MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen. Bei Patienten mit malignem Melanom ließen sich bei 4 von 6 Patienten NY-ESO-1157-165- spezifische, 2 von 6 Patienten NY-ESO-1145-153-spezifische und bei 2 von 3 Patienten MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisen. In der Kontrollkohorte waren in keinem der 17 getesteten Patienten NY-ESO-1157-165- oder NY-ESO-1145-153-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisbar. 7 von 15 Patienten zeigten jedoch MAGE-A196-104 spezifische CD8+ T-Zellen. Zudem wurden die beiden Expansionsprotokolle in Hinblick auf die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen verglichen (Abb. 3.16 B). Hierbei wurden alle Zelllinien analysiert, die in mindestens einem der beiden Expansionsansätze TAA-spezifische CD8+ T-Zellen aufwiesen. Es zeigte sich, dass die zusätzliche Stimulation mit IL-7 und IL-12 insgesamt keinen signifikanten Einfluss auf die Frequenz der Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen ausübte. Jedoch zeigten sich interessanterweise in allen drei Kohorten Patienten, deren CD8+ T-Zellen von der zusätzliche Stimulation profitierten. Dieser Effekt trat unabhängig von der Antigen-Spezifität der CD8+ T-Zellen auf. Insgesamt konnte so in 50% der Zelllinien, die von HCC-oder Melanom-Patienten abstammten, ein Anstieg der Frequenz TAAspezifischer CD8+ T-Zellen erreicht werden. Auch bei 33% der Kontroll-Zelllinien stieg die Frequenz der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen an. Als nächstes untersuchten wir die Funktionalität der Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen (Abb. 3.17). Nach der zusätzlichen Stimulation mit IL-7 und IL-12 war keiner der 8 Patienten mit HCC, die Tetramer-positive CD8+ T-Zellen aufwiesen, in der Lage IFNγ zu produzieren. Auch bei keinem der 7 Patienten der Kontrollkohorte konnte die Funktion der CD8+ T-Zellen wieder hergestellt werden. In der Zellexpansion des Kontrollpatienten, dessen Zellen nach der Standard-Expansion in der Lage waren IFNγ zu produzieren, waren im Expansionsansatz mit IL-7 und IL-12 keine Antigen-spezifischen Zellen nachweisbar, so dass hier keine IFNγ-Produktion zu erwarten war. Interessanterweise gelang bei einem der 6 Patienten mit malignem Melanom, der sowohl nach Standard-Expansion als auch nach der zusätzlichen Interleukin-Stimulation MAGE-A196-104 spezifische CD8+ T-Zellen aufwies, die Induktion einer IFNγ-Produktion. Die Analyse des Funktionsprofils jeder individuellen reagierenden CD8+ T-Zelle zeigt, dass auch nach der Stimulation mit IL-7 und IL-12 die Mehrheit der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nur 1-2 der 5 untersuchten Funktionen (Sekretion von IFNγ, MIP-1β, TNFα, IL-2; Mobilisation von CD107a)ausüben kann (Abb. 3.17 D). 54 Abbildung 3.17 Funktionalität der CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit IL-7 und IL-12 A Gezeigt ist die IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC. Die Zellen sind hoch dysfunktionell (p=0,0142). B Gezeigt ist die IFNγProduktion der Tetramer+ CD8+ T-Zellen bei Patienten mit malignem Melanom. Die Zellen sind hoch dysfunktionell (p=0,0078). C Gezeigt ist die IFNγ-Produktion der TAAspezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten der Kontrollkohorte. Die Zellen sind hoch dysfunktionell (p=0,0156). D Die Kreisdiagramme zeigen die durchschnittliche Multifunktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zelllinien. Die Mehrheit der funktionellen TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen übte 1-2 der 5 untersuchten Funktionen (Sekretion von IFNγ, MIP-1β, TNFα, IL-2; Mobilisation von CD107a) aus. Die zusätzliche Stimulation mit IL-7 und IL-12 resultiert in keiner Veränderung des Funktionsprofils. 3.3.2 Depletion von Treg Zahlreiche Studien, die in Kap. 1.5 genauer erläutert werden, zeigen die zentrale Rolle der Treg bei der Suppression antitumoraler Immunaktivität. Um den Einfluss der Treg auf die Frequenz und Funktionalität der Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen zu untersuchen, depletierten wir CD25+ Zellen (Kap. 2.2.9.2). Die Depletion der Treg resultierte nicht in einer signifikanten Veränderung der Zahl der Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen (Abb. 3.18 A). So zeigten in der Gruppe der HCC-Patienten jeweils 1 von 7 Patienten NY-ESO-1157-165-spezifische bzw. NY-ESO-1145-153-spezifische und 4 von 8 Patienten MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen. Bei Patienten mit malignem Melanom ließen sich bei beiden untersuchten Patienten sowohl NY-ESO-1157-165-spezifische als auch NY-ESO-1145-153-spezifische und 55 bei einem Patienten MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisen. In der Kontrollkohorte waren bei 1 der 11 getesteten Patienten NY-ESO-1157-165-spezifische, bei keinem der 11 Patienten NY-ESO-1145-153-spezifische und bei 7 von 11 Patienten MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisbar. Abbildung 3.18 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Treg-Depletion A Gezeigt ist der Anteil an Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nach der Standardexpansion und nach der Treg-Depletion. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Aufgeführt sind nur Patienten, bei denen beide Expansionsmodelle getestet wurden. B Gezeigt ist die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen nach der Treg-Depletion im Vergleich zu der Standard-Expansion. Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Expansionsprotokollen. Zudem wurden die beiden Expansionsprotokolle in Hinblick auf die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen verglichen (Abb.3.18 B). Hierbei wurden die Frequenzen der Zelllinien verglichen, die in mindestens einem der beiden Expansionsansätze Tetramer-positive CD8+ T-Zellen aufwiesen. Es zeigte sich, dass die Depletion der Treg insgesamt keinen signifikanten Einfluss auf die Frequenz der Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen ausübte. Interessanterweise zeigte sich bei der Analyse der Frequenzen Antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen individueller Zelllinien jedoch ein sehr uneinheitliches Bild. Während bei 60% der Zelllinien, die von HCC-Patienten abstammen, die Frequenzen Antigenspezifischer CD8+ T-Zellen nach der Depletion der Treg stark anstiegen, zeigte sich bei anderen Zelllinien kein Effekt oder gar ein starker Abfall der Frequenz. Ähnliches war auch bei Patienten mit malignem Melanom und in Patienten der Kontrollkohorte zu beobachten und trat unabhängig von der Antigen-Spezifität der CD8+ T-Zellen auf. 56 Abbildung 3.19 Funktionalität der TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen nach Treg-Depletion A Gezeigt ist die IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC. Die Zellen sind hoch dysfunktionell (p=0,313). B Gezeigt ist die IFNγProduktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit malignem Melanom. Die Zellen sind hoch dysfunktionell (p=0,0625). C Gezeigt ist die IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten der Kontrollkohorte. Die Zellen sind hoch dysfunktionell (p=0,0078). Jedoch war in 3 von 8 Zelllinien eine IFNγ-Produktion nachweisbar. D Die Kreisdiagramme zeigen die durchschnittliche Multifunktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zelllinien. Jede der auf die Peptidstimulation reagierenden CD8+ T-Zellen wies zwischen 1 und 5 Funktionen auf (Sekretion von IFNγ, MIP-1β, TNFα, IL-2; Mobilisation von CD107a). Im Vergleich zur Standardexpansion führt die Treg-Depletion zu tendenziell weniger Zellen mit nur einer Funktion und mehr Zellen mit zwei Funktionen. Abb. 3.19 zeigt die Funktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen. Es wird deutlich, dass auch die Treg-Depletion bei Patienten mit HCC oder malignem Melanom trotz des starken Einflusses auf die Proliferation keine Wiederherstellung der Funktionalität ermöglicht. Interessanterweise gelang jedoch bei 3 von 7 Patienten der Kontrollkohorte (43%) mit MAGE-A196-104-spezifischen CD8+ T-Zellen eine Wiederherstellung der IFNγ-Produktion. Einer dieser Patienten wies zudem NY-ESO-1157-165spezifische CD8+ T-Zellen auf, deren Funktionalität durch die Treg-Depletion nicht beeinflusst wurde. Die Analyse des individuellen Funktionsprofils zeigt, dass auch nach der Treg-Depletion die Mehrheit der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nur 1-2 der 5 untersuchten Funktionen (Sekretion von IFNγ, MIP1β, TNFα, IL-2; Mobilisation von CD107a) ausüben kann (Abb. 3.19 D). Im Vergleich zur Standardexpansion führt die Treg-Depletion jedoch zu tendenziell weniger Zellen mit nur einer Funktion und mehr Zellen mit zwei Funktionen. 57 3.3.3 Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges Zahlreiche Studien, die in Kap. 1.5 genauer erläutert werden, zeigen die Rolle inhibitorischer Rezeptoren bei der Unterdrückung antitumoraler Immunantworten. Um den Einfluss des inhibitorischen Rezeptors PD-1 auf die Frequenz und Funktionalität der Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC zu untersuchen, blockierten wir den PD-1-Signalweg mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen dessen Liganden PD-L1 (Kap. 2.2.9.3). Die zusätzliche Blockade dieses Signalweges resultierte nicht in einer signifikanten Veränderung des Anteils an Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen (Abb. 3.20 A). So zeigte 1 von 5 Patienten NY-ESO-1157-165-spezifische, 0 von 2 Patienten NY-ESO-1145-153-spezifische und 5 von 7 Patienten MAGE-A196-104-spezifische CD8+ T-Zellen. Auch die Frequenz dieser Zellen veränderte sich nicht signifikant (Abb. 3.20 B). Interessanterweise führte die Blockade von PD-L1 in einem Patienten zu einer Wiederherstellung der IFNγ-Produktion TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen (Abb. 3.20 C). Abbildung 3.20 Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges A Die Blockade von PD-L1 resultiert in keiner signifikanten Veränderung der Anzahl an Patienten, in denen Antigen-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisbar waren. B Die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen wird nicht signifikant verändert. C Nach der Blockade von PD-L1 ist der Unterschied zwischen Tetramerfrequenz und IFNγProduktion nicht signifikant, da in einem Patienten die Wiederherstellung der IFNγProduktion gelang (p=0,0625). 58 3.3.4 Klinische Parameter Da sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der Standardexpansion, der zusätzlichen Stimulation mit IL-7 und IL-12 und der Treg-Depletion zeigten, wurden diese zur Beurteilung des Einflusses klinischer Parameter zusammengefasst. Dies war notwendig um eine für statistische Analysen geeignete Patientenkohorte zu erhalten. Zeigte ein Patient bei mehr als einem Expansionprotokoll TAA-spezifische CD8+ T-Zellen, wurde für die Analyse die Zelllinie mit der höchsten Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen verwendet. Das Alter, das Geschlecht, die Ätiologie des HCCs, die Serum-AFP-Werte, das Vorhandensein und der Grad der Leberzirrhose sowie die Behandlung mit TACE üben keinen Einfluss auf die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen aus (Daten nicht gezeigt). Jedoch zeigen Patienten mit erhöhten Serum-GPT-Werten im Vergleich zu Patienten, deren Serum-GPT-Werte im Normbereich lagen, signifikant niedrigere Frequenzen TAAspezifischer CD8+ T-Zellen (Abb. 3.21 A). Darüber hinaus sind bei Patienten im Tumorstadium I signifikant häufiger TAA-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisbar als bei Patienten, die sich in fortgeschrittenen Tumorstadien befanden (Abb. 3.21 B). Das Tumorstadium beeinflusste jedoch nicht die Frequenz der CD8+ T-Zellen. B * ** 100 % d e r P a tie n te n 40 20 0 80 60 40 20 5) (n =2 n= IIIV G P T [U /l] 5) 5 >3 <3 5 0 I( % T e t+ / C D 8 + T - Z e lle n A 60 Abbildung 3.21 Einfluss klinischer Parameter auf TAA-spezifische CD8+ T-Zellen A Patienten mit Serum-GPT-Werten über 35 U/l weisen im Vergleich zu Patienten mit Serum-GPT-Werten im Normbereich signifikant niedrigere Frequenzen TAAspezifischer CD8+ T-Zellen auf (p=0,0360). B Patienten im Tumorstadium I weisen signifikant häufiger TAA-spezifische CD8+ T-Zellen auf als Patienten in fortgeschrittenen Tumorstadien (p=0,0421). Zur Analyse der klinischen Relevanz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen untersuchten wir das progressionsfreie Überleben (PFS, progression-free survial) der Patienten mit HCC in Abhängigkeit vom Vorhandensein TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen (Abb. 3.22). Insgesamt war bei 33 Patienten eine Beurteilung des PFS anhand klinischer Parameter möglich. Hiervon wiesen 18 Patienten TAAspezifische T-Zellen auf. In beiden Kohorten wurden jeweils 6 Patienten zensiert, da bis zum Zeitpunkt der Analyse keine Progression der Tumorerkrankung aufgetreten war. Das mediane Überleben betrug 224 Tage bzw. 317 Tage für Patienten mit bzw. ohne nachweisbare TAA-spezifische 59 CD8+ T-Zellen. Insgesamt übte das Vorhandensein TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen keinen statistisch signifikanten Einfluss auf das PFS der Patienten aus. Abbildung 3.22 Progressionsfreies Überleben Nachweisbare TAA-spezifische CD8+ T-Zellen üben keinen Einfluss auf das PFS der Patienten mit HCC aus. Das mediane Überleben betrug 224 Tage bzw. 317 Tage für Patienten mit bzw. ohne nachweisbare TAA-spezifische CD8+ T-Zellen. 3.3.5 Funktionalität Virus-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC TAA-spezifische CD8+ T-Zellen der Patienten mit HCC sind stark dysfunktionell, so dass in der Regel keine IFNγ-Produktion nach der Stimulation mit dem jeweiligen Peptid nachweisbar war. Wir untersuchten daher, ob diese Dysfuntionalität ein generelles Phänomen aller CD8+ T-Zellen der getesteten Patienten darstellt, unabhängig von deren Antigenspezifität, oder ob der Funktionsverlust auf TAA-spezifische CD8+ T-Zellen beschränkt ist. Hierfür expandierten wir neben TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen auch EBV-, CMV- oder Flu-spezifische CD8+ T-Zellen und analysierten deren Fähigkeit zur IFNγ-Produktion nach der Stimulation mit dem jeweiligen Peptid (Abb. 3.23). Interessanterweise konnten wir zeigen, dass virale Antigene auch bei Patienten mit HCC eine adäquate IFNγ-Produktion der Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen induzieren. Obwohl sich keine signifikanten Unterschiede in der Frequenz der TAA- und Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen zeigten, war die IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen signifikant vermindert (p<0,0001). Dies zeigt deutlich, dass die Dysfunktionalität von CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC spezifisch für TAA-spezifische CD8+ T-Zellen ist. 60 Abbildung 3.23 Funktionalität der CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC A Gezeigt ist die Frequenz und Funktionalität der CD8+ T-Zellen eines repräsentativen Patienten mit HCC (HCC 16). B TAA-spezifische CD8+ T-Zellen weisen eine signifikant beeinträchtigte IFNγ-Produktion auf (p<0,0001), während Virus-spezifische CD8+ T-Zellen adäquat IFNγ produzieren. Obwohl sich keine signifikanten Unterschiede in der Frequenz der TAA- und Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen zeigten, war die IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Virusspezifischen CD8+ T-Zellen signifikant vermindert (p<0,0001). 61 4 Diskussion Auf Grund der hohen Inzidenz und Mortalität des HCCs ist die Entwicklung neuer Therapieansätze von großer klinischer Relevanz. Hierbei nehmen Immuntherapien, die den antitumoralen Effekt des Immunsystems therapeutisch nutzen, einen hohen Stellenwert ein. Für die Entwicklung effektiver immuntherapeutischer Ansätze ist jedoch die genaue Analyse und Charakterisierung natürlicher antitumoraler Immunantworten bei Patienten mit HCC von entscheidender Bedeutung. Erste Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe konnten das Auftreten von CD8+ T-Zell-Antworten gegen zahlreiche HCC-spezifische TAAs zeigen. Ein erstes Ziel dieser Doktorarbeit war die Identifikation der exakten Epitope, die diesen TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten zugrunde liegen. Hierfür expandierten wir CD8+ T-Zellen von Patienten mit HCC Antigen-unspezifisch und stimulierten diese in vitro mit Peptiden, die von den TAAs AFP, GPC-3, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3 und Bax abstammen. Auf diese Weise untersuchten wir sowohl OLP mit 18 Aminosäuren als auch kürzere Peptidfragmente, die aus 9-11 Aminosäuren bestehen und im Folgenden als 9-mere zusammengefasst werden. Da viele der getesteten TAAs nicht nur für das HCC sondern auch für das maligne Melanom beschrieben wurden, untersuchten wir zusätzlich Patienten mit malignem Melanom zur Validierung der Ergebnisse und zum Vergleich verschiedener Tumorerkrankungen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnten wir auf diese Weise bei Patienten mit HCC spezifische CD8+ T-Zell-Antworten gegen alle getesteten TAAs mit Ausnahme von Bax detektieren. So waren in 57% der getesteten HLA-A2+ HCC-Patienten und in 11% der HLA-A3+ HCC-Patienten CD8+ T-ZellAntworten gegen eines oder mehrere der getesteten 9-mere nachweisbar. Auch bei Patienten mit malignem Melanom waren bei allen HLA-A2+ Patienten TAA-spezifische CD8+ T-Zellen detektierbar. Dies zeigt deutlich, dass TAA-spezifische CD8+ T-Zellen im natürlichen T-Zell-Repertoire enthalten sind und weder zentral noch peripher deletiert werden, obwohl sie spezifisch für körpereigene Antigene sind. Die geringere Frequenz von CD8+ T-Zell-Antworten gegen HLA-A3-restringierte Epitope könnte auf Unterschiede in der Präsentation von TAA-Epitopen zwischen den verschiedenen HLA-Typen hindeuten. Allerdings wurde eine deutlich höhere Zahl HLA-A2-restringierter Epitope untersucht, so dass hier weitere Analysen nötig sind, um diese Frage zu klären. Interessanterweise waren auch bei zahlreichen Patienten der Kontrollkohorte TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten nach der Stimulation mit OLP nachweisbar, jedoch signifikant seltener als bei Patienten mit HCC oder malignem Melanom (p=0,0452 bzw. p=0,0149). Dem Nachweis TAAspezifischer CD8+ T-Zell-Antworten bei Patienten der Kontrollkohorte können mehrere Ursachen zugrunde liegen. Zum einen können TAA-spezifische CD8+ T-Zellen bei diesen Patienten ohne bekannte Tumorerkrankung möglicherweise auf intakte antitumorale Immunantworten gegen 62 einzelne (prä-)maligne Zellen hinweisen und somit auf eine effiziente Immunüberwachung und Elimination von entarteten Zellen, bevor diese sich zu Tumoren entwickeln können. Dies ist insbesondere in Hinblick auf die Tatsache relevant, dass 57% der Patienten in der Kontrollkohorte an einer chronischen Lebererkrankung leiden. Darüber hinaus sind 9% der Patienten in dieser Kohorte an anderen Tumoren erkrankt, die möglicherweise dieselben TAAs exprimieren wie das HCC oder das maligne Melanom und daher TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten induzieren können. Zwar ist der Anteil der Patienten mit Tumoren in unserer Kontrollkohorte sehr gering, jedoch ist unklar, in wie fern weitere Patienten an einem bisher nicht diagnostizierten Tumor erkrankt sind. Unterstützt wird dies durch die Beobachtung, dass Patienten der Kontrollkohorte nur selten Immunantworten gegen das HCC-spezifische TAA AFP aufweisen, aber häufig gegen die von zahlreichen Tumoren exprimierten geteilten Antigene NY-ESO-1 und MAGE-A. Anhand unserer großen Kohorte von 61 Patienten mit HCC konnten wir die Erkennung einiger bereits beschriebener TAA-Epitope bei Patienten mit HCC bestätigen. So detektierten wir CD8+ T-ZellAntworten gegen die HLA-A2-restringierten Epitope GPC-3522-530 [121], MAGE-A3271-279 [180] und NY-ESO-1157-167 [79]. Darüber hinaus war eine Immunantwort gegen MAGE-A1105-114 nachweisbar, das bisher zwar als potentieller HLA-A2-Ligand beschrieben wurde, jedoch noch nicht als TAA-Epitop bei Patienten mit Tumorerkrankungen [31]. Auch das bereits beschrieben HLA-A3-restringierte Epitop MAGE-A196-104 konnte bei HLA-A3+ Patienten mit HCC unserer Kohorte CD8+ T-Zell-Antworten induzieren [32]. Darüber hinaus gelang uns die Identifikation neuer, bisher unbekannter HLA-A2- und HLA-A3restringierter TAA-Epitope bei Patienten mit HCC. So zeigten HLA-A2+ Patienten mit HCC CD8+ T-ZellAntworten gegen AFP47-55, GPC-3281-289, MAGE-A191-101 und gegen NY-ESO-1145-153. Darüber hinaus waren bei HLA-A3+ Patienten spezifische CD8+ T-Zell-Antworten gegen GPC-3519-528 nachweisbar. Dies zeigt deutlich die große Bedeutung von NY-ESO-1- und MAGE-A-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC. Analysen TAA-spezifischer Immunantworten bei Patienten mit HCC und die Entwicklung neuer therapeutischer Tumorvakzinierungen dürfen sich daher nicht ausschließlich auf die HCC-spezifischen TAAs AFP und GPC-3 beschränken. Für Patienten mit malignem Melanom steht NY-ESO-1 im Zentrum der Entwicklung neuer Tumorvakzinierungen. Mehrere Studien zeigten hier erste vielversprechende Erfolge, wie die Induktion NY-ESO-1-spezifischer Immunantworten und die Stabilisierung der Erkrankung in einem Teil der Patienten [10,80,83]. Gemeinsam mit unseren Ergebnissen geben diese Studien Hoffnung für die Entwicklung neuer Tumorvakzine basierend auf NY-ESO-1 auch für Patienten mit HCC. Zudem konnten wir zeigen, dass die exakten 9-mere signifikant stärkere Immunantworten hervorrufen als die korrespondierenden OLP. Im Gegensatz zu den OLP, die aus 18 Aminosäuren 63 bestehen und zunächst enzymal degradiert werden müssen, besitzen die 9-mere bereits die ideale Länge und biochemischen Eigenschaften um von MHC Klasse I Molekülen gebunden und präsentiert zu werden. Dies hat zwei entscheidende Vorteile, die die verstärkte IFNγ-Produktion nach der Stimulation mit 9-meren erklären. Zum einen ist durch die vorhergehende Degradierung der OLP in kürzere Peptidfragmente im Vergleich zu den idealen 9-meren eine geringere Konzentration an Peptidfragmenten mit optimalen MHC Klasse I Bindungseigenschaften vorhanden, zum anderen bedeutet eine notwendige Fragmentierung der OLP ein zeitlicher Nachteil gegenüber den 9-meren. Dieses Phänomen konnte so auch für andere Peptid-Paare, beispielsweise bei der HCV-Infektion, gezeigt werden [118]. In früheren Studien konnten keine funktionellen AFP- bzw. GPC-3-spezifischen CD8+ T-Zelllinien in vitro expandiert werden [151,168], daher verwendeten wir MHC Klasse I Tetramere um TAAspezifische CD8+ T-Zellen unabhängig von ihrer Funktionalität nachzuweisen. Wir untersuchten so die beiden vorbeschriebenen Epitope NY-ESO-1157-165 (HLA-A2) und MAGE-A196-104 (HLA-A3) sowie das von uns neu identifizierte Epitop NY-ESO-1145-153 (HLA-A2). Tatsächlich konnten bei 15 der 37 Patienten mit HCC (41%) TAA-spezifische CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden. Auch bei 4 von 8 Patienten mit malignem Melanom (50%) und bei 12 von 33 Patienten der Kontrollkohorte (36%) gelang der Nachweis TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen. Hierbei waren die Frequenzen der TAAspezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC und malignem Melanom im Vergleich zur Kontrollkohorte signifikant erhöht (p=0,0002 bzw. p=0,0039). Mögliche Ursachen für den Nachweis TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen bei Patienten der Kontrollkohorte wurden bereits diskutiert. Zukünftige Studien mit Hilfe von MHC Klasse I Tetrameren werden durch die Analyse des Differenzierungsstatus dieser T-Zellen sowohl nach in vitro Expansion als auch direkt ex vivo nach Tetramer-spezifischer Anreicherung interessante neue Einblicke geben und zu einem besseren Verständnis dieses Phänomens beitragen können. Trotz des Nachweises TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen war jedoch in den Zelllinien der Patienten mit HCC oder malignem Melanom keine IFNγ-Produktion nachweisbar. Auch in der Kontrollkohorte wies lediglich ein Patient eine spezifische Produktion von IFNγ auf. Dieses Versagen der Immunantwort ist von großer Bedeutung, da die Induktion der IFNγ-Produktion durch T-Zellen eine der wichtigsten Determinanten des Erfolges immuntherapeutischer Vakzinierungen in verschiedenen Tumorerkrankungen darstellt [108]. Zur genaueren Analyse der Funktionalität TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen untersuchten wir die Sekretion von IFNγ, MIP-1β, TNFα und IL-2 sowie die Mobilisation von CD107a an die Zelloberfläche als Marker für Degranulation und Zytotoxizität. In allen Zelllinien konnte eine Zytokinproduktion bzw. CD107a-Mobilisation in sehr geringen Mengen nachgewiesen werden. Die Analyse der 64 Funktionsprofile der individuellen reagierenden Zellen zeigte, dass die Immunantwort überwiegend durch Zellen mit 1-2 der 5 untersuchten Funktionen bestimmt wird. Bei Patienten mit HCC sind dies 89% aller reagierenden CD8+ T-Zellen. Auch bei Patienten der Kontrollkohorte üben die CD8+ T-Zellen in 88% nur 1-2 Funktionen aus, jedoch liegt hier das Gleichgewicht im Gegensatz zu Patienten mit HCC tendenziell auf der Seite der Zellen mit 2 Funktionen. Zusammenfassend ist die detektierte Zytokinproduktion sehr gering und in Hinblick auf die Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen signifikant vermindert. Dies zeigt, dass eine Vielzahl der Effektorfunktionen der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen stark eingeschränkt ist und diese Zellen daher hoch dysfunktionell sind. Verschiedene Mechanismen können zu diesem Versagen der antitumoralen Immunantwort beitragen. Hierzu zählen beim HCC beispielsweise Veränderungen der Tumorzellen durch Immunoediting, und Primingdefekte -Präsentation, sowie Hochregulierung eine Beeinträchtigung inhibitorischer Rezeptoren der TAA-Prozessierung und deren Liganden, + immunsuppressive Zellen sowie eine fehlende Hilfe durch CD4 T-Zellen. Jedoch sind die genauen Ursachen, die zu einem Versagen der Tumor-spezifischen Immunantwort im HCC beitragen, bisher nur wenig charakterisiert. Aus diesem Grund adressierten wir im Folgenden verschiedene dieser immunsuppressiven Mechanismen. IL-7 und IL-12 nehmen eine zentrale Rolle bei der Ausreifung und Proliferation von CD8+ T-Zellen ein [17,18,158]. Auf Grund der mangelnden IL-12-Produktion der DCs ist das Priming naiver CD8+ T-Zellen in Patienten mit HCC jedoch erschwert [122]. Durch die zusätzliche Stimulation mit IL-7 und IL-12 konnte in 5 von 10 Zelllinien der HCC-Patienten (50%) ein Anstieg der Frequenz TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen erreicht werden. Auf die gleiche Weise konnte auch in 4 von 8 Zelllinien der MelanomPatienten (50%) und in 4 von 12 Zelllinien der Kontrollkohorte (33%) die Frequenz der TAAspezifischen CD8+ T-Zellen erhöht werden. Zudem konnte in der Zelllinie eines Melanom-Patienten nach der Stimulation mit IL-7 und IL-12 eine IFNγ-Produktion detektiert werden. Die IFNγ-Produktion der CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC oder Patienten der Kontrollkohorte konnte jedoch nicht wieder hergestellt werden. Dies zeigt deutlich den hohen Stellenwert von IL-7 und IL-12 bei der Induktion der TAA-spezifischen T-Zell-Proliferation ohne wesentlichen Einfluss auf die Funktionalität dieser Zellen. Des Weiteren zeigen zahlreiche Studien die zentrale Rolle von Treg in der Suppression antitumoraler Immunantworten. So korreliert bei Patienten mit HCC eine intratumorale Akkumulation der Treg mit einer progressiven Tumorerkrankung und einer schlechteren Prognose [57,62]. Basierend hierauf wurden in einer ersten klinischen Studie an Patienten mit fortgeschrittenem HCC Treg durch die Administration von niedrigdosiertem Cyclophosphamid depletiert. Dies führte zu einer Abnahme der Frequenz und Funktionalität der Treg und konsekutiv zum Nachweis AFP-spezifischer CD4+ T-Zell- 65 Antworten bei 6 von 13 behandelten Patienten [68]. Um den Einfluss der Treg auf die Proliferation und Funktionalität TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen zu analysieren, depletierten wir CD25+ Zellen vor der Expansion. Auf diese Weise erzielten wir einen Frequenzanstieg der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen in 5 von 8 Zelllinien der HCC-Patienten (63%) sowie in 3 von 5 Zelllinien der MelanomPatienten (60%) und 8 von 11 Zelllinien der Kontrollkohorte (73%). Im Gegensatz hierzu trat jedoch bei einigen Patienten durch die Depletion der CD25+ Zellen ein starker Abfall der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen auf. Die wahrscheinlichste Ursache hierfür findet sich im Expressionsprofil von CD25. CD25 stellt die α-Untereinheit des IL-2-Rezeptors dar und wird nicht nur auf Treg, sondern unter anderem auch auf aktivierten, reifen T-Lymphozyten exprimiert [140], die daher durch die Depletion der CD25+ Zellen ebenfalls depletiert wurden. Trotz ihres großen Einflusses auf die Proliferation resultierte die Treg-Depletion nicht in einer Wiederherstellung der Funktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC oder malignem Melanom. Jedoch führte die Treg-Depletion zu einer Verschiebung der Zytokinproduktion von 1 Funktion hin zu 2 der 5 getesteten Funktionen (Produktion von IFNγ, MIP-1β, TNFα oder IL-2, Mobilisation von CD107a). Dies zeigt, dass die Treg-Depletion zwar nicht eine vollständige Wiederherstellung der Zytokinproduktion bewirkt, jedoch die Proliferation von Zellen mit mehr als einer Funktion begünstigt. Interessanterweise konnte in 3 von 7 MAGE-A196-104-Zelllinien der Kontrollkohorte (43%) nach der Treg-Depletion eine IFNγProduktion nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine wichtige Rolle der Treg bei der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz des Immunsystems hin. So konnte in diesem Zusammenhang gezeigt werden, dass Treg autoimmune Vorgänge über zahlreiche Mechanismen supprimieren und ihre Abwesenheit in multiplen autoimmunen Organschäden resultiert [165]. Zwar dient auch die negative Selektion der T-Zellen im Thymus der Verhinderung autoimmuner Prozesse, jedoch werden hierbei vor allem autoreaktive CD8+ T-Zellen, deren Rezeptoren stark an Selbstantigene binden, durch eine Apoptose-Induktion eliminiert [49]. Daher überleben TAA-spezifische CD8+ T-Zellen mit niedriger Avidität in der Regel diese negative Selektion im Thymus [42] und müssen in der Peripherie durch andere Mechanismen, wie zum Beispiel Treg, kontrolliert werden. So konnte im Mausmodel bereits gezeigt werden, dass eine Treg-Depletion eine Stabilisation der Interaktionen zwischen DCs und CD8+ T-Zellen mit niedriger Avidität begünstigt. Dies resultiert in einer Aktivierung und Proliferation dieser CD8+ T-Zell-Population [124]. Zudem korreliert bei Patienten mit HCC die Expression des inhibitorischen Rezeptors PD-1 auf CD8+ T-Zellen mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium, einer schlechteren Prognose der Erkrankung und mit einer früheren Tumorrekurrenz nach Leberresektion [63,141]. Zwei klinische Studien untersuchten die Wirksamkeit der Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges in der Therapie verschiedener Tumorerkrankungen, wie z.B. bei Nierenzellkarzinom und beim malignem Melanom, und konnten gute klinische Ansprechraten erzielen [19,155]. Diese Ergebnisse unterstreichen 66 prinzipiell, dass die Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges einen neuen immuntherapeutischen Ansatz bei Patienten mit Tumorerkrankungen darstellt. Inwieweit ein ähnlicher Effekt auch bei Patienten mit HCC besteht, muss jedoch noch evaluiert werden. Erste Studien im Mausmodell zeigten interessanterweise die potentielle Rolle von PD-1 für das Überleben intrahepatischer Tumore trotz einer antitumoralen Immunantwort in der Peripherie [164]. Aus diesem Grund blockierten wir PD-L1 und konnten so in 2 der 6 akquirierten CD8+ T-Zelllinien von HCC-Patienten (33%) einen Frequenzanstieg der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen erzielen. Interessanterweise gelang darüber hinaus auch die Wiederherstellung der IFNγ-Produktion in einem der beiden Patienten. Diese vielversprechenden Ergebnisse geben erste deutliche Hinweise auf eine Effektivität der Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges auch bei Patienten mit HCC. Bei Patienten mit chronischen viralen Infektionen sind erschöpfte CD8+ T-Zellen durch eine Koexpression zahlreicher inhibitorischer Rezeptoren wie PD-1, 2B4, CD160 und Killer-cell-lectin-like receptor G1 (KLRG1) charakterisiert [11]. In zukünftigen Studien ermöglichen MHC Klasse I Tetramere eine direkte Analyse der Expression dieser Rezeptoren auf TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen. Die Korrelation der Rezeptorexpression mit der antitumoralen Funktion und Antigen-Erkennung dieser Zellen wird in Zukunft ein tieferes Verständnis der Dysfunktionalität TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen ermöglichen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass bei Patienten mit HCC und malignem Melanom eine Vielzahl von Mechanismen zu einem Versagen der antitumoralen Immunantwort beitragen. So konnte durch eine Zytokinstimulation, eine Treg-Depletion oder eine Blockade des PD-1/PD-L1Signalweges die Proliferation TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen gesteigert werden. Allerdings konnte auf diese Weise nicht bei allen Patienten eine Proliferationssteigerung erreicht werden. Dies legt nahe, dass in individuellen Patienten die verschiedenen immunsuppressiven Mechanismen einen unterschiedlich hohen Stellenwert in der Suppression der antitumoralen Immunantwort einnehmen, und bietet eine mögliche Erklärung, weshalb immuntherapeutische Ansätze stets nur in einem Teil der Patienten Effekte erzielen. Zudem gelang durch die Stimulation mit IL-7 und IL-12 sowie durch die Treg-Depletion keine Wiederherstellung der Funktionalität der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC. Dies weist darauf hin, dass für die detektierte Dysfunktionalität zusätzliche oder andere immunsuppressive Mechanismen verantwortlich sind. Ähnliches konnte im Mausmodell bereits für das maligne Melanom gezeigt werden [67]. Unsere Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Adressierung mehrerer immunsuppressiver Mechanismen, etwa durch zusätzliche ZytokinAdministration, Treg-Depletion oder die Blockade inhibitorischer Rezeptoren, bei der Entwicklung neuer Tumorvakzinierungen für Patienten mit HCC, um die Effektivität dieser Therapieansätze zu steigern und bessere klinische Ansprechraten zu erzielen. 67 Weiterhin untersuchten wir den Einfluss klinischer Parameter auf die TAA-spezifischen T-Zellen. Interessanterweise waren bei Patienten im Tumorstadium I signifikant häufiger TAA-spezifische CD8+ T-Zellen nachweisbar als bei Patienten in fortgeschrittenen Stadien (p=0,0421). Dies gibt Hinweise darauf, dass sich die beschriebenen immunsuppressiven Mechanismen erst im Verlauf der Tumorerkrankung entwickeln und zu Beginn der Erkrankung eine zumindest teilweise intakte antitumorale Immunantwort vorhanden ist, die das Tumorwachstum einschränken kann. Diese Ergebnisse werden durch eine Studie unterstützt, die zeigen konnte, dass die Infiltration von Treg in das HCC und die damit verbundene Inhibition von CD8+ T-Zellen mit fortschreitendem Tumorstadium zunimmt [57]. Zudem konnten wir zeigen, dass Patienten mit einem erhöhten Serum-GPT-Level signifikant niedrigere Frequenzen TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen im peripheren Blut aufweisen. Erhöhte Serum-GPT-Werte sind ein Indikator für Hepatozytenschädigung [85] und könnten daher möglicherweise ein Hinweis für eine Akkumulation TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen im Tumorgewebe und eine konsekutive Lyse veränderter Hepatozyten sein. Andere klinische Parameter wie Geschlecht, Alter, Ätiologie der Tumorerkrankung, Leberzirrhose, Serum-AFP oder die Behandlung mit TACE übten keinen Einfluss auf die TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen aus. Daher bleibt weiterhin nicht vollständig geklärt, weshalb TAA-spezifische CD8+ T-Zellen nur in etwa der Hälfte der Patienten nachweisbar sind. Neben den bereits diskutierten immunsuppressiven Mechanismen kann eine fehlende Expression der getesteten TAAs durch den Tumor eine wichtige Ursache hierfür sein. So wird NY-ESO-1 nur in < 50% und MAGE-A in < 80% der HCCs exprimiert [21]. Dies muss in Studien, die die TAA-Expression des Tumors direkt mit der Analyse TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen korrelieren, genauer untersucht werden. Auch kann ein Fehlen TAA-spezifischer T-Zell-Rezeptoren im natürlichen T-Zellrepertoire des einzelnen Patienten oder eine Eliminierung TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen mit hoher Avidität durch die negative Selektion im Thymus zu einem Fehlen TAA-spezifischer Immunantworten beitragen. Zuletzt kann eine intrahepatische und/oder intratumorale Akkumulation der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen eine Ursache für die fehlende Detektion dieser Zellen im peripheren Blut darstellen. Zudem untersuchten wir das PFS von 33 Patienten mit HCC in Abhängigkeit vom Vorhandensein TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen. Das mediane Überleben betrug 224 Tage bzw. 317 Tage für Patienten mit bzw. ohne nachweisbare TAA-spezifische CD8+ T-Zellen. Insgesamt übte das Vorhandensein TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen keinen statistisch signifikanten Einfluss auf das PFS der Patienten aus. Dies ist nicht überraschend, da die TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen, wie oben beschrieben, hoch dysfunktionell sind und daher keine adäquate antitumorale Immunreaktion ausüben können. Zuletzt expandierten wir Virus-spezifische Zelllinien der Patienten mit HCC und analysierten ihre Fähigkeit zur IFNγ-Produktion um ein generelles Versagen der CD8+ T-Zellen in diesen Patienten auszuschließen. Tatsächlich sind Virus-spezifische CD8+ T-Zellen der Patienten mit HCC in der Lage 68 nach Antigen-spezifischer Expansion IFNγ zu produzieren. Obwohl sich keine signifikanten Unterschiede in der Frequenz der TAA- und Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen zeigten, war die IFNγProduktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zu Virus-spezifischen CD8+ T-Zellen signifikant vermindert (p<0,0001). Dies zeigt deutlich, dass die Dysfunktionalität kein generelles Phänomen aller CD8+ T-Zellen in Patienten mit HCC darstellt, sondern der Funktionsverlust auf TAAspezifische CD8+ T-Zellen beschränkt ist. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass es sich beim HCC um einen hoch immunogenen Tumor handelt, dessen TAAs in der Lage sind, CD8+ T-Zellen spezifisch zu induzieren. Die von uns neu identifizierten Epitope der geteilten TAAs NY-ESO-1 und MAGE-A1 legen nahe, dass sich künftige Tumorvakzinierungsstudien für Patienten mit HCC nicht wie bisher auf AFP und GPC-3 beschränken sollten. Die geringen klinischen Erfolge bisheriger Tumorvakzinierungen begründen sich in zahlreichen immunsuppressiven Mechanismen wie fehlender Zytokinstimulation, Treg oder die Expression von PD-1, die die Proliferation und in geringerem Maße auch die Zytokinproduktion TAAspezifischer CD8+ T-Zellen inhibieren. Daher müssen in künftigen Studien zusätzlich zu einer Tumorvakzinierung mit den idealen TAA-Epitopen auch diese inhibitorischen Mechanismen adressiert werden, um die Effektivität der Immuntherapie in Patienten mit HCC zu erhöhen und andauernde klinische Erfolge zu erzielen. 69 5 Literaturverzeichnis 1. 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Abbildung AFP α-Fetoprotein AJCC American Joint Committee on Cancer APC Antigen-präsentierende Zelle (antigen presenting cell) APC Allophycocyanin BCL-2 B-Zell-Lymphoma-2 (B-cell lymphoma-2) B-RAF B-rapide-akzelerierte Fibrosarkome (B-rapidly accelerated fibrosarcoma) bzw. beziehungsweise CD Differenzierungsgruppe (cluster of differentiation) CLL chronische lymphatische Leukämie CMV Cytomegalie-Virus CTLA-4 zytotoxisches T-Lymphozyten-Antigen-4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen-4) DC dendritische Zelle (dendritic cell) DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure EBV Eppstein-Barr-Virus FACS Durchflusszytometer (fluorescence activated cell sorter) FCS fetales Kälberserum (fetal calf serum) FITC Fluoreszein-Isothiocyanat Flu Influenza-Virus FSC Vorwärtsstreulicht (forward scatter) 89 g Gramm xg x9,81 m/s2 GPC-3 Glypican-3 GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase HBV Hepatitis-B-Virus HCC hepatozelluläres Karzinom (hepatocellular carcinoma) HCV Hepatitis-C-Virus HLA humanes Leukozytenantigen IFNγ Interferon-γ IL Interleukin Kap. Kapitel l Liter m männlich m Meter M Median M Molar MAGE Melanom-assoziierte Gen-Familie MDSC Suppressorzellen aus der Myeloid-Linie (myeloid-derived suppressor cells) MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) n Nano (10-9) n.d. nicht bestimmt (not determined) NK-Zelle natürliche Killerzelle OLP überlappendes Peptide (overlapping peptide) p Piko (10-12) 90 PBS Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) PBMC mononukleäre Zelle des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cell) PD-(L)1 programmierter Zelltod-(Ligand) 1 (programmed cell death-(ligand) 1) PE Phycoerythin PerCP-Cy5.5 Peridinin-Chlorophyll-Protein-Cy5.5-Konjugat PFA Paraformaldehyd PFS progressionsfreies Überleben (progression-free survival) RF(T)A Radiofrequenz-(Thermo-)Ablation ROS reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species) RPMI+++ RPMI 1640 Medium mit definierten Zusätzen s Sekunde SB Färbepuffer (staining buffer) SSC Seitwärtsstreulicht (sideward scatter) TAA Tumor-assoziiertes Antigen Tab. Tabelle TACE transarterielle Chemoembolisation Tet Tetramer Treg regulatorische T-Zelle U Einheit (unit) UV ultraviolett w weiblich 91 7 Abbildungen und Tabellen 7.1 Abbildungen Abbildung 1.1 Regulation der Apoptose durch Bax ................................................................... 10 Abbildung 1.2 Versagen der antitumoralen Immunantwort ...................................................... 13 Abbildung 2.1 Isolation von PBMCs mittels Dichtegradientenzentrifugation ............................. 22 Abbildung 2.2 Analyse der Ergebnisse der Durchflusszytometrie .............................................. 28 Abbildung 3.1 TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten .............................................................. 38 Abbildung 3.2 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten ...................................... 38 Abbildung 3.3 Stärke der TAA-spezifischen CD8+ T-Zell-Antworten ........................................... 39 Abbildung 3.4 AFP-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten .............................................................. 40 Abbildung 3.5 GPC-3-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten........................................................... 41 Abbildung 3.6 MAGE-A-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten ....................................................... 42 Abbildung 3.7 NY-ESO-1-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten ..................................................... 43 Abbildung 3.8 Stärke der Immunantwort.................................................................................. 44 Abbildung 3.9 Einfluss klinischer Parameter auf TAA-spezifische CD8+ T-Zell-Antworten........... 45 Abbildung 3.10 TAA-spezifische CD8+ T-Zellen............................................................................ 46 Abbildung 3.11 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen.................................................... 47 Abbildung 3.12 Frequenzen TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen ....................................................... 48 Abbildung 3.13 Immunogenität der TAA-Epitope ....................................................................... 49 Abbildung 3.14 IFNγ-Produktion der TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen ......................................... 50 Abbildung 3.15 Funktionalität der TAA-spezifische CD8+ T-Zellen ............................................... 51 Abbildung 3.16 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Interleukin-Stimulation ...... 52 Abbildung 3.17 Funktionalität der CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit IL-7 und IL-12 ................. 54 Abbildung 3.18 Patienten mit TAA-spezifischen CD8+ T-Zellen nach Treg-Depletion ..................... 55 Abbildung 3.19 Funktionalität der TAA-spezifischer CD8+ T-Zellen nach Treg-Depletion ............... 56 Abbildung 3.20 Blockade des PD-1/PD-L1-Signalweges .............................................................. 57 Abbildung 3.21 Einfluss klinischer Parameter auf TAA-spezifische CD8+ T-Zellen ........................ 58 Abbildung 3.22 Progressionsfreies Überleben ............................................................................ 59 Abbildung 3.23 Funktionalität der CD8+ T-Zellen bei Patienten mit HCC ..................................... 60 92 7.2 Tabellen Tabelle 2.1 Verwendete Chemikalien ........................................................................................... 17 Tabelle 2.2 Verwendete Puffer und Medien ................................................................................. 18 Tabelle 2.3 Verwendete Biologika ................................................................................................ 18 Tabelle 2.4 Verwendete magnetisierte Antikörper ....................................................................... 19 Tabelle 2.5 OLP ............................................................................................................................ 19 Tabelle 2.6 TAA-Epitope............................................................................................................... 20 Tabelle 2.7 Kontrollpeptide.......................................................................................................... 20 Tabelle 2.8 Verwendete Fluoreszenz-markierte Antikörper .......................................................... 21 Tabelle 2.9 Übersicht der Patienten mit HCC ................................................................................ 29 Tabelle 2.10 Klinische Parameter der Patienten mit HCC ................................................................ 30 Tabelle 2.11 Patienten mit malignem Melanom ............................................................................. 32 Tabelle 2.12 Klinische Parameter der Patienten mit malignem Melanom ....................................... 32 Tabelle 2.13 Patienten der Kontrollkohorte ................................................................................... 33 Tabelle 2.14 Klinische Parameter der Patienten der Kontrollkohorte ............................................. 34 Tabelle 2.15 Verwendete Software ................................................................................................ 35 Tabelle 3.1 Patientenkohorte ....................................................................................................... 36 Tabelle 3.2 Anzahl der getesteten Peptide für jeden HLA-Typ ...................................................... 37 93 8 Danksagung Zu allererst bedanke ich mich bei Prof. Dr. Dr. h.c. Hubert E. Blum, in dessen Abteilung ich meine Doktorarbeit durchführen durfte. Mein ganz herzlicher Dank gilt Prof. Dr. Robert Thimme, der mir diese Doktorarbeit in seiner Arbeitsgruppe ermöglicht hat. Besonders möchte ich mich dafür bedanken, dass er mich und meine Ideen immer unterstützt und nie den Glauben in das HCC-Projekt verloren hat. Ihm gelang es, in mir die Begeisterung für Immunologie und Hepatologie zu wecken. Darüber hinaus bedanke ich mich bei Prof. Dr. Klaus Warnatz für die Übernahme des Zweitgutachtens dieser Doktorarbeit. Ganz besonders bedanke ich mich bei Tobias Flecken für die Betreuung dieser Doktorarbeit, die Einführung in die Tumorimmunologie, die kompetente Beantwortung all meiner unzähligen Fragen und für so manchen langen gemeinsam verbrachten Donnerstagabend im Labor. Darüber hinaus bedanke ich mich bei Sandra Hild, die mir bei meinen ersten wackligen Schritten im Labor die Hand gehalten hat und auch danach immer für mich da war. Bei Nadine Hennecke und Bianca Martin bedanke ich mich für Unterstützung, Rat und Unterhaltung in allen Labor-, Tetramer- und Lebenslagen. Für eine wunderschöne, unterhaltsame und lehrreiche Zeit bedanke ich mich bei Christoph Neumann-Häfelin, Tayibe Altay, Bertram Bengsch, Dominik Bettinger, Tobias Böttler, Fabian Burk, Nico Büttner, Natalie Clauß, Anna-Maria Globig, Franziska Graß, Daniel Grimm, Maximilian Heeg, Alexander Hoh, Michael Kiraithe, Katja Nitschke und Julia Schmidt. Jeder von ihnen hat einen Teil zu dieser Doktorarbeit beigetragen und dafür gesorgt, dass ich jeden einzelnen Tag immer wieder gerne und motiviert ins Labor gekommen bin. Außerdem bedanke ich mich bei allen Patienten und gesunden Blutspendern, ohne deren Bereitschaft diese Doktorarbeit undenkbar gewesen wäre. Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern, meiner Schwester Ann-Kristin und meiner ganzen Familie bedanken, die mich bei allen Höhenflügen, Tiefschlägen und verrückten Ideen immer ausnahmslos unterstützt haben.
