Harnstoffspaltung durch Urease Versuch 1:

Martin Raiber
Chemie Protokoll Nr.5
Harnstoffspaltung durch Urease
Versuch 1:
Materialien:
Reagenzglasgestell, Reagenzgläser, Saugpipetten, 100 ml-Becherglas mit Eiswasser,
100 ml-Becherglas mit Wasser von Zimmertemperatur, Wasserbad von ca. 40 °C,
Thermometer, Gasbrenner, Stoppuhr
Chemikalien:
5%ige Harnstofflösung, Phenolphthaleinlösung, Urease-Aufschwemmung 0,1%,
Bariumchloridlösung
Durchführung:
a)
Wir gaben zu etwa 10 ml Harnstofflösung und 10 ml Thioharnstofflösung jeweils
einige Tropfen Phenolphthaleinlösung, und versetzten diese Gemische mit jeweils 8
Tropfen Urease-Aufschwemmung.
b)
Wir gaben in 3 Reagenzglaser je 10 ml Harnstofflösung und fügten einige
Tropfen Phenolphthaleinlösung hinzu.
Wir stellten
- das eine Reagenzglas in Eiswasser
- eines bei Raumtemperatur (Temperatur notieren)
- das dritte in ein Wasserbad von ca. 40 °C
Wir gaben nach etwa 5 Minuten in jedes Reagenzglas 3 Tropfen UreaseAufschwemmung und wir stoppten die Zeit bis zum Farbumschlag.
c)
Wir gaben in drei Reagenzglaser je 2 cm hoch Wasser und fügten jeweils 10
Tropfen Urease-Aufschwemmung hinzu.
Ein Reagenzglas kochten wir auf und ließen es wieder abkühlen.
Zum zweiten gaben wir 10 Tropfen Bariumchloridlösung - das dritte diente als
Kontrolle.
Wir pipettierten in jedes Reagenzglas 4 ml Harnstofflösung und fügten je einen
Tropfen Phenolphthaleinlösung hinzu.
Beobachtungen:
a)
In der Harnstofflösung färbt sich das Phenolphthalein nach Zugabe von Urease
rosa, in der Thioharnstofflösung nicht.
b)
– Nach Zugabe der Urease in das Eiswasser war dieses trüb/milchig.
– Die Lösungen schlugen mit der vorgeschlagenen Ureasemenge nicht um. Bei
Zugabe von mehr Urease ergab sich ein sehr schneller Umschlag und diese
ungefähre Reihenfolge:
1. Eiswasser
2. Raumtemperatur
3. Wasserbad
c)
In den beiden Reagenzgläsern findet kein Umschlag statt. Nur in dem zur Kontrolle
dienenden Reagenzglas.
Auswertung:
Reaktionsgleichung:
Somit ist eine Verfärbung des Indikators ein Beweis dafür, dass die Reaktion
stattfindet.
a)
Urease ist ein Enzym d.h. es katalysiert nur bestimmte Reaktionen
->Substratspezifität
Man kann sich die Wirkungsweise nach einem Schlüssel-Schloss-Prinzip vorstellen:
Das aktive Zentrum der Urease ist vollständig an den Harnstoff angepasst. Ändert
der sich auch nur minimal ist es wahrscheinlich, dass die Urease den neuen Stoff
(hier: Thioharnstoff) nicht mehr spalten kann.
In diesem Fall ist das Schwefelmolekül sehr viel größer als das Sauerstoffmolekül.
b)
Die Reaktion ist stark temperaturabhängig. Dies kommt daher, dass das Substrat
erst an das Enzym „andocken“ muss - somit sich eine aktive Zone nur mit einem
Substrat befassen kann. Eine Temperaturerhöhung beschleunigt den
„Andockvorgang“ und den Vorgang der Substratveränderung. Der Durchsatz an
Reaktionen pro Zeiteinheit wird erhöht.
c)
Es finden keine Reaktionen bei den aufgekochten und mit Bariumchlorid versetzen
Lösungen statt, weil diese Aktionen die Urease denaturierten.
Das Abkochen zerstörte H-Brücken und das Bariumchlorid Ionenbindungen. Somit
wurde die aktive Zone verändert und das Enzym war nicht mehr funktionsfähig.
Fehleranalyse:
Es gab erhebliche Schwierigkeiten bei Teilversuch b), was eine quantitative
Messung unmöglich machte.
Die Menge an Urease die vorgeschlagenen war reichte nicht aus um in einem
angemessenen zeitlichen Rahmen zu einem Ergebnis zu führen. Wahrscheinlich war
unsere Urease aufgrund der langen Lagerungszeit nicht mehr sehr wirkungsvoll.
Wir waren also gezwungen Urease nachzuschütten, was uns nur noch eine
qualitative Messung ermöglichte.
Versuch 2:
Materialien:
Computer, CASSY Lab, pH-Einstabmesskette, Leitfähigkeits-Messzelle,
Magnetrührer, Becherglas 250 ml, Bürette, Stativmaterial, Digital-Thermometer
Chemikalien:
Urease-Aufschwemmung 0,1%, Harnstofflösung 1%, Eiswasser, Wasserbad ca
40°C, Kupfersulfat
Durchführung:
Aufbau entsprechend Skizze:
pH-Wert und Leitfähigkeit wurden vom SensorCASSY über die pH-Box an Eingang A und die
Leitfähigkeitsbox an Eingang B gemessen . Wir
füllten die 50 ml 1%ige Harnstofflösung ein und
bestimmten die Temperatur. Wir tauchten die
Elektrode ein und befestigten sie so, dass sie
einerseits eine ausreichende Eintauchtiefe
aufwies, andererseits aber auch nicht vom
rotierenden Rührstäbchen getroffen wurde.
Dann gaben wir 2 ml Ureaselösung in die Harnstofflösung. Gleichzeitig starteten
wir die Messung durch Anklicken des entsprechenden Symbols. Als die
Messkurve keine signifikanten Änderungen mehr vorwies, beendeten wir die
Messung.
Wir wiederholten den Versuch mit veränderter Temperatur und
vergifteten auch einmal die Urease mit Kupfersulfat.
Beobachtungen:
Leitfähigkeit bei verschiedenen Temperaturen
Auswertung:
Hier sieht man die Kurven bei 3 unterschiedlichen Temperaturen (C1=8°C,
C2=20°C, C3=36°C ).
Exemplarische Analyse bei t=300:
C1=1,1
C2=2,73
C3=3,55
RGT-Regel:
Verdoppelung der Temperatur führt zu einer 2-4-fach so schnellen Reaktion.
Hier: 9°C zu 20°C ca. 2,5fache Reaktionsgeschwindigkeit
20°C zu 36°C ca. 1,3fache Reaktionsgeschwindigkeit
-> RGT-Regel nur zu einem gewissen Maß anwendbar
Bei C3 wurde die Urease vergiftet, das heißt sie wurde mit dem Ionenbindungen
zerstörenden Schwermetall Kupfersulfat denaturiert. Ab diesem Punkt kommt die
Reaktion fast vollständig zum Erliegen. Das Enzym wirkt nicht mehr als Katalysator.
Die Leitfähigkeit erhöht sich deswegen an diesem Punkt, weil das Schwermetall aus
Ionen besteht.
Leitfähigkeit und pH-Wert bei Zimmertemperatur
Auswertung:
Hier erkennt man zusätzlich, dass ein gleichbleibender pH-Wert bei dieser Reaktion
nicht bedeutet, dass der Reaktion schon abgelaufen ist.
Hier entsteht eine Pufferlösung zwischen dem entstehenden Ammoniak und den
Ammonium-Ionen (siehe RG oben). Es entstehen also immer mehr Ionen aber der
pH-Wert ändert sich nicht mehr.
Leitfähigkeit und pH-Wert bei 40°
Auswertung:
Durch ein Steigungsdreieck kommt man hier auf die Steigung m=0,0048. Bei der
obrigen Kurve auf eine Steigung von m=0,0036. Das heißt diese Reaktion lief 1,35
Mal so schnell, wie die bei Zimmertemperatur ab, was das Ergebnis der obigen
Leitfähigkeitsmessungen bestätigt.
Fehleranalyse:
Die Schwankungen beim pH-Wert rühren vom fehlenden Magnetrührer her, auf den
zugunsten einer konstanten Temperatur im Wasserbad verzichtet wurde.