Immunhistochemischer und immunfluoreszenzoptischer Nachweis
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Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. Dirk Theegarten Dienstort: Universitätsklinikum Essen, Institut für Pathologie und Neuropathologie Immunhistochemischer und immunfluoreszenzoptischer Nachweis von Chlamydophila psittaci in kindlichen Adenoiden und im adulten Nasopharynx Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Jochen Gerhardt aus Arnsberg 2007 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Priv.-Doz. Dr. med. D. Theegarten Korreferent: Prof. Dr. med. S. Gatermann Tag der mündlichen Prüfung: 21.04.2009 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Adenoide und ihre Bedeutung 2 2.1 Anatomie und Histologie der Adenoide 2 2.1.1 Allgemeines und Diagnostik 2 2.1.2 Anatomische Lage und Histologie 3 2.1.3 Anatomische Besonderheit: M-Zellen 4 2.1.4 Oberflächensekretion 5 2.1.5 Lymphatische Antwort 6 2.2 Pathophysiologie der Adenoide 6 2.2.1 Allgemeines 6 2.2.2 Erregerpersistenz 7 2.2.3 Rolle der Tonsilla pharyngealis in der Immunantwort 7 2.3 Pathologie und Folgen vergrößerter Adenoide 8 2.4 Operationsindikationen 8 2.4.1 Rekurrente Infektion der oberen Atemwege 9 2.4.2 Mittelohrerkrankungen (Otitis media, Serotympanon) 9 2.4.3 Operationsverfahren 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 10 11 3.1 Taxonomie 11 3.2 Historie, Epidemiologie und Erkrankungen durch Chlamydien 12 3.2.1 Chlamydophila pneumoniae 13 3.2.2 Chlamydophila psittaci 15 3.2.3 Chlamydia trachomatis 18 3.2.4 Weitere Erkrankungen im Zusammenhang mit Chlamydien 19 3.3 Biologie der Chlamydien 19 3.3.1 Allgemein 19 3.3.2 Aufbau der Chlamydien 19 3.4 Infizierte Zellen 20 3.5 Lebenszyklus 20 3.5.1 Das Elementarkörperchen 20 3.5.2 Andocken 21 3.5.3 Die Inklusion 21 3.5.4 Reproduktion 22 3.5.5 Teilung, Redifferenzierung und Freisetzung 22 3.5.6 Besonderheiten des Aufbaus von Chlamydien 25 3.6 Antigene Strukturen von Chlamydien 25 3.6.1 Einleitung 25 3.6.2 Chlamydiale Antigene 26 3.6.3 Polysaccharid 27 3.7 Die Immunantwort des Wirtsoganismus 3.7.1 Allgemeines 3.8 Diagnostik 27 27 29 3.8.1 Serologie 29 3.8.2 Nukleinsäureamplifikationsverfahren 30 3.8.3 Immunhistologische Nachweismethoden 31 3.8.4 Zellkultur 32 4 Material und Methoden 33 4.1 Positiv- und Negativkontrollen 33 4.2 Adenoide 33 4.3 Fetale und adulte Nasopharynx-Proben 34 4.4 Immunhistochemie 35 4.5 Immunfluoreszenz 41 4.6 Etablierung der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Färbemethoden 46 4.6.1 Immunhistochemie 46 4.6.2 Immunfluoreszenz 47 4.7 PCR 47 4.8 Patientenbefragung 49 5 Ergebnisse 51 5.1 Immunhistochemische und immunfluoreszenzoptische Untersuchung der Kollektive 51 5.1.1 Adenoide vs. fetale und adulte Nasopharynxproben mittels Immunhistochemie 51 5.1.2 Adenoide vs. Vergleichskollektive mittels Immunfluoreszenz 55 5.1.3 Adenoide: Immunfluoreszenz vs. Immunhistochemie 56 5.1.4 Adenoide: Immunhistochemie vs. PCR 58 5.1.5 Adenoide: Immunfluoreszenz vs. PCR 60 5.1.6 Geschlechtsspezifität 61 5.2 Nachweis von Cdp. psittaci in Makrophagen, Lymphozyten und Epithelien 62 5.3 Zusammenfassung 73 5.4 Ergebnisse der Umfrage 74 6 Diskussion 76 6.1 Diskussion der Ergebnisse 76 6.2 Weiterer Ausblick 81 Literaturverzeichnis 82 Abkürzungsverzeichnis abkürzung bedeutung AK Antikörper AOM Akute Otitis Media Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser) ATP Adenosintriphosphat BAL Bronchio-alveoläre Lavage BGM Buffalo Green Monkey C-Atom Kohlenstoffatom CAP Community Acquired Pneumonia CD Cluster of Differentiation CDC Center for Disease Control and Prevention Cdp. Chlamydophila CF Complement Fixation Chl. Chlamydia Ck Cytokeratin COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease CTL Zytotoxische T-Lymphozyten DAPI 4’,6-Diamidino-2-Phenylindol DC Dendritic Cell DNA Deoxyribonucleic Acid EB Elementary Body (Elementarkörperchen) EIA Enzyme Immuno Assay ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EM Elektronenmikroskopie et al. et aliae FDC Follicular Dendritic Cells FISH Fluorescent In Situ Hybridisation Gt Goat HEV Hochendotheliale Venule H. influenzae Hämophilus influenzae HIV Human Immunodeficiency Virus HSP Heat Shock Protein abkürzung bedeutung IDC Interdigitating Dendritic Cells IDO Indolamin 2,3-Dioxygenase IF Immunfluoreszenz IFU Inclusion forming unit Ig Immunglobulin IHC Immunhistochemie IL Interleukin KBR Komplementbindungsreaktion KDO Ketodesoxyoctulonsäure-Säure KHK Koronare Herzkrankheit LCA Leukocyte Common Antigen LCR Ligase Chain Reaction LGV Lymphogranuloma venereum LPS Lipopolysaccharid M-Zellen Membranöse Zellen MALT Mucosa Associated Lymphatic Tissue MCP Monocyte Cationic Protein MIF Micro Immuno Fluorescence Test MHC Major Histocompatibility Complex MO Mikroorganismus MOMP Major Outer Membrane Protein Ms Mouse NAD Nicotinamidadenindinucleotid NALT Nasal Associated Lymphatic Tissue ompA Genlocus des outer membrane protein A OSAS Obstruktives Schlafapnoe-Syndrom PBS Phophate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PID Pelvic Infammatory Disease Rb Rabbit RB Reticulate Body (Retikularkörperchen) RNA Ribonucleic Acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid RSV Respiratory Syncytial Virus abkürzung bedeutung S Svedberg-Einheit SOM Secretory Otitis Media Spp. Species TEM Transmissions-Elektronen-Mikroskopie Th T-helper TLR Toll-like-Rezeptoren TNF Tumornekrosefaktor Trpf. Tropfen USA United States of America ZNS Zentrales Nervensystem Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1: Symptome der Rachenmandelhyperplasie. 8 Tabelle 2.2: Folgen des Verschlusses der Tuba auditiva. 9 Tabelle 2.3: Die häufigsten Operationsindikationen bei Adenoiden. 9 Tabelle 3.1: Übersicht über die neue Taxonomie der Chlamydiaceae. 12 Tabelle 3.2: Übersicht der durch Chlamydien verursachten Erkrankungen. 13 Tabelle 4.1: Übersicht der in der Immunhistochemie verwendeten Primär-Antikörper.36 Tabelle 4.2: Versuchsprotokoll Immunhistochemie. 39 Tabelle 4.3: Übersicht der in der Immunfluoreszenz zusätzlich verwendeten Primärantikörper. 42 Tabelle 4.4: Übersicht der in der Immunfluoreszenz verwendeten Sekundärantikörper.42 Tabelle 4.5: Versuchsprotokoll Immunfluoreszenz. 45 Tabelle 4.6: Fragebogen bzgl. des möglichen zoonotischen Potentials einer Infektion mit Cdp. psittaci. 50 Tabelle 5.1: Vergleich von Adenoiden, fetalen und adulten Nasopharynxproben anhand der Immunhistochemie. 51 Tabelle 5.2: Vergleich von Adenoiden, fetalen und adulten Nasopharynxproben anhand der Immunfluoreszenz. 55 Tabelle 5.3: Vergleich der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Präparate der Adenoide untereinander. 56 Tabelle 5.4: Vergleich der Ergebnisse von immunhistochemischem Nachweis und der Detektion von Cdp. psittaci durch PCR. 58 Tabelle 5.5: Vergleich der Ergebnisse der Detektion von Cdp. psittaci und Cdp. pnuemoniae durch PCR. 58 Tabelle 5.6: Vergleich der Ergebnisse von immunfluoreszenzoptischem Nachweis und der Detektion von Cdp. psittaci durch PCR. 60 Tabelle 5.7: Geschlechtsspezifischer Unterschied in der Immunfluoreszenz. 61 Tabelle 5.8: Geschlechtsspezifischer Unteschied in der Immunhistochemie. 62 Tabelle 5.9: Vergleich der Ergebnisse von immunfluoreszenzoptischem Nachweis von Cdp. psittaci in Makrophagen (CD 68) und Lymphozyten (CD 45). 63 Abbildungsverzeichnis Abbildung 2.1: Ansicht der Adenoide bei posteriorer Rhinoskopie. Internet: http://www.allgemeinpraxis.ch/images/gast/Adenoid.jpg.; Zugriffsdatum 12.05.05 2 Abbildung 2.2: Anatomische Nasopharynx. Lage Internet: der Tonsilla pharyngealis (Adenoide) im http://www.homeomiracles.com/Index/ Paediatrics/Paediatrics_article/Adenoids/Adenoid%20Anatomy.gif.; Zugriffsdatum 3 12.05.05 Abbildung 2.3: Intraoperativer Situs bei Adenoidektomie. Adenoide durch rote Pfeile markiert. Internet: http://www.entusa.com/oral_photographs/adenoid-top.jpg.; 5 Zugriffsdatum 12.05.05 Abbildung 3.1: Der typische Lebenszyklus der Chlamydien (© Jochen Gerhardt 2007)24 Abbildung 4.1: Schematische Darstellung des Prinzips einer immunhistochemischen Markierung mittels Primär- und Sekundärantikörpern (© Jochen Gerhardt 2007).40 Abbildung 4.2: Schematische Darstellung des Prinzips einer immunfluoreszenzoptischen Markierung mittels Primär- und Sekundärantikörpern (© Jochen Gerhardt 2007).41 Abbildung 5.1: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in 52 Lymphollikeln (blaue Pfeile). Vergrößerung 200×. Abbildung 5.2: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in 52 Epithelien. Vergrößerung 400×. Abbildung 5.3: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in 53 Epithelien. Vergrößerung 400×. Abbildung 5.4: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, gelbe Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400×. 54 Abbildung 5.5: Fetales immunologisches Gewebe aus dem Nasopharynx. Kein immunhistochemischer Nachweis von Chlamydien (Markierung mit Mouse-AntiCdp. psittaci 73/0200) in Epithelien (rote Pfeile) und dem darunter liegenenden 54 immunologischen Gewebe (blaue Pfeile). Vergrößerung 400×. Abbildung 5.6: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne 55 Immunfluoreszenzoptischer Nachweis. Vergrößerung 600×. Abbildung 5.7: Material aus kindlichen Adenoiden. Pfeile). Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, orange Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 56 Immunfluoreszenzoptischer Nachweis. Abbildung 5.8: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in immunologischen Zellen eines Lymphfollikels. Vergrößerung 400×. Abbildung 5.9: Material aus kindlichen Adenoiden. 57 Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) bei Gegenmarkierung von Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). 57 Vergrößerung 600×. Abbildung 5.10: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.11: Material aus kindlichen Adenoiden. 59 Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in 59 Epithelien. Vergrößerung 400×. Abbildung 5.12: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 60 Abbildung 5.13: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Makrophagen (Mouse-Anti-CD-68 grün, grüne Pfeile).Vergrößerung 600× mit 61 Detailvergrößerung. Abbildung 5.14: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. Abbildung 5.15: Material aus kindlichen Adenoiden. 63 Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 64 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.16: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 65 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.17: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-CD-68 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit 65 Detailvergrößerung. Abbildung 5.18: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 66 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.19: Material aus adultem Nasopharyngewebe. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 66 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.20: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 67 Abbildung 5.21: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyzen (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 67 Abbildung 5.22: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 68 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.23: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) bei Gegenmarkierung von Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). 69 Vergrößerung 600×. Abbildung 5.24: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 69 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.25: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Makrophagen (Mouse-Anti-CD-68 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit 70 Detailvergrößerung. Abbildung 5.26: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 70 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.27: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit 71 Detailvergrößerung. Abbildung 5.28: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. Abbildung 5.29: Material aus kindlichen Adenoiden. 71 Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien und im darunter liegeneden Gewebe (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 72 Abbildung 5.30: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× 72 mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.31: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 73 1 Einleitung Die Ätiologie der Rachenmandelhyperplasie des Kindes (Adenoide) ist unklar. Angenommen wird derzeit ein mutlifaktorielles Geschehen aus hereditären Faktoren, endokrinen Fehlregulationen, konstitutionellen Gegebenheiten, Ernährungsgewohnheiten und rezidivierenden Infekten der oberen Atemwege [81]. Klinische Symptome der Adenoide können ein Tubenkatarrh mit Sinusitis oder Otitis media, eine Rhinolalia clausa mit Schnarchen und einem typischen Gesichtsausdruck (Facies adenoidea) durch die behinderte Nasenatmung sein. Die einzige bisher bekannte Therapie der Adenoide besteht in der chirurgischen Entfernung (Adenotomie oder Adenoidektomie). Da die Adenoide eine der ersten Stationen der Erregerabwehr bei Infektionen der oberen Atemwege sind, liegt der Gedanke nahe, dass Mikroorganismen als Ursache einer Hyperplasie in Frage kämen oder dass ihnen zumindest im Rahmen einer opportunistischen Besiedlung eine Relevanz zukommen könnte [31]. Chlamydien sind obligat intrazellulär lebende Bakterien, die sich für eine Reihe von Erkrankungen des Menschen verantwortlich zeichnen. Cdp. psittaci ist im Tierreich und hier besonders bei Vögeln weit verbreitet und hauptsächlich an der Entstehung von Erkrankungen der oberen Luftwege beteiligt [78]. In letzter Zeit rückt Cdp. psittaci auch als humanpathogener Erreger vermehrt in den Mittelpunkt des Interesses. Insbesondere an der Entstehung chronischer Lungenerkrankungen (z. B. COPD) wird dem Bakterium nach Studien von Theegarten et al. eine Mitbeteiligung nachgesagt [9, 104]. Diesbezüglich stellt sich die Frage, wann und wie der Erstkontakt mit den Mikroorganismen stattfindet und ob die Entstehung der Folgeerkrankungen durch eine frühzeitige Therapie verhindert werden könnte. Eine frühkindliche Infektion mit einer Persistenz des Erregers im Wirtsorganismus käme ursächlich in Frage. Studien bzgl. des Vorkommens von Cdp. pneumoniae in Adenoiden wurde von Normann et al. durchgeführt [72]. In der Arbeit wurde das Bakterium überdurschnittlich häufig in Adoidgeweben gefunden. Diese Studie soll vergleichen, ob Cdp. psittaci sowohl in kindlichen Adenoiden als auch in nicht verändertem adultem Nasopharynxgewebe nachweisbar ist. Formalinfixierte Operationspräparate kindlicher Rachenmandelhyperplasien wurden daher mittels PCR, immunfluoreszenzoptischen und immunhistochemischen Methoden untersucht und die Ergebnisse mit Kollektiven adulter und fetaler Proben verglichen. Zudem sollte mittels einer Umfrage ein eventuell vorhandenes zoonotisches Potential aufgedeckt werden. 2 Adenoide und ihre Bedeutung 2.1 Anatomie und Histologie der Adenoide 2.1.1 Allgemeines und Diagnostik Adenoide Vegetationen (Adenoide, Rachenmandelhyperplasien; im Volksmund auch unter dem Begriff „Polypen“ bekannt) wurden erstmals 1870 vom dänischen Chirurgen Meyer beschrieben [68]. Das Haupterkrankungsalter liegt zwischen dem zweiten und dem sechsten Lebensjahr. Angenommen wird eine multifaktorielle Entstehung, wobei neben hereditärer Disposition, auch endokrine oder konstitutionelle Gegebenheiten, Ernährung und rezidivierende bzw. chronische Infekte diskutiert werden [81]. Abbildung 2.1: Ansicht der Adenoide bei posteriorer Rhinoskopie. Internet: http://www.allgemeinpraxis.ch/images/gast/Adenoid.jpg.; Zugriffsdatum 12.05.05 Meyers einziges diagnotisches Werkzeug waren seine eigenen Finger, heute werden meist die posteriore Rhinoskopie und seltener andere Untersuchungsverfahren herangezogen, da adenoide Vegetationen im Allgemeinen durch bloße Inspektion des Rachenraumes peroral nicht sichtbar sind. Als neuestes Verfahren wurde in den letzten Jahren die Rhinoskopie mittels flexiblen Endoskops eingeführt und verbessert. Diese verdrängt nach und nach die oben genannten Verfahren, besonders vor geplanten Operationen wird heute kaum noch auf eine Untersuchung des Pharynx mit der Kamera verzichtet 2 Adenoide 3 [112]. 2.1.2 Anatomische Lage und Histologie Die nasopharyngealen Tonsillen (Adenoide, Tonsilla pharyngea, Tonsilla pharyngealis) sind ein prominentes Mitglied des sogenannten NALT (=Nasal Associated Lymphatic Tissue), das im oberen aero-digestiven Trakt eine wichtige Rolle in der Entstehung der mukosalen Immunantwort einnimmt. Es ist bei den meisten Säugern (Mensch, Schwein, Pferd, Kaninchen, Hund) in Form des Waldeyer’schen Rachenrings ausgebildet, zu dem neben den Tonsillae pharyngeales auch die Zungen und Gaumenmandeln gehören [95]. Makroskopisch betrachtet liegt die unpaare Tonsilla pharyngea dem Dach des Pharynx (Fornix pharyngis) von unten an. Da sie relativ weit dorsal lokalisiert ist, hat sie eine enge Beziehung sowohl zum Naso- als auch zum Oropharynx und steht somit immer in Kontakt mit inhalierten Antigenen und Mikroorganismen, sowie Bestandteilen der Mundflora und verschiedenen mit der Nahrung aufgenommenen Allergenen [95]. Abbildung 2.2: Anatomische Lage der Tonsilla pharyngealis (Adenoide) im Nasopharynx. Internet: http://www.homeomiracles.com/Index/ Paediatrics/Paediatrics_article/Adenoids/Adenoid%20Anatomy.gif.; Zugriffsdatum 12.05.05 2 Adenoide 4 Histologisch imponiert die Tonsilla pharyngealis als ein lymphoepitheliales Organ, das überwiegend aus Lymphfollikeln besteht. Bedeckt werden die Follikel von mehrreihigem (respiratorischem) Flimmerepithel, das kleine Ausbuchtungen bildet, in die Ausführungsgänge gemischter Drüsen einmünden. Innerhalb des Epithels liegen zudem Becherzellen. Selten findet man in den Buchten der nicht pathologisch veränderten Tonsilla pharyngea Detritus. Eine umgebende Bindegewebskapsel ist vorhanden aber nur schwach ausgeprägt. Im Hinblick auf die Funktion der Tonsilla pharyngea als immunologisches Organ erfolgt eine Einteilung in folgende Kompartimente: — retikuläres Kryptenepithel (mit FDCs und Makrophagen); — extrafollikuläre Zone (besiedelt von IDC und T-Lymphozyten); — Mantelzone der Lymphfollikel (bestehend aus reifen B-Lymphozyten); — follikuläre Keimzentren (aus FDC und B-Lymphozyten). Im retikulären Kryptenepithel werden Antigene von FDC und Makrophagen aufgenommen und prozessiert, um danach B- und T-Zellen präsentiert werden zu können. Im Keimzentrum von Lymphfollikeln werden anschliessend die B-Lymphozyten mit dem zur Abwehr geeigneten Antikörpermuster selektioniert. Aus Vorläuferzellen entstehen entweder antikörpersezernierende Plasmazellen oder für Reinfektionen mit dem gleichen Antigen wichtige Gedächtniszellen. Die Plasmazellen in den Krypten sind nach Aktivierung in der Lage, einen von insgesamt fünf möglichen Typen von Immunglobulinen zu produzieren [89]. Histologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen an vergrößerten Rachenmandeln zeigten besonders Veränderungen im Epithel, die auf eine chronische Entzündungsreaktion hinweisen. Das Epithel zeigt sich in nahezu allen Fällen hyperplastisch, viele Fälle weisen sogar eine Plattenepithelmetaplasie auf [77]. 2.1.3 Anatomische Besonderheit: M-Zellen Mittlerweile wurde auch die Existenz einer weiteren immunologisch kompetenten Zellart, der M-Zellen (membranösen Zellen), im Epithel der pharyngealen Tonsillen nachgewiesen [53]. Diese befinden sich sonst in den Peyer’schen Plaques im Gastrointestinaltrakt [36] und spielen eine Rolle in der Initiation der Immunantwort. So können die Mikroorganismen, die normalerweise nicht in der Lage sind, die Mukosa-Barriere zu überwinden in tiefere Gewebe vordringen [37]. Für Influenza A Viren wurden M-Zellen bereits als Haupteintrittspforte in die Mukosa des Nasopharynx beschrieben [33]. 2 Adenoide 5 Abbildung 2.3: Intraoperativer Situs bei Adenoidektomie. Adenoide durch rote Pfeile markiert. Internet: http://www.entusa.com/oral_photographs/adenoid-top.jpg.; Zugriffsdatum 12.05.05 2.1.4 Oberflächensekretion Einen wichtigen Schutz gegen Erreger bildet die Oberflächensekretion der Adenoide, da über diese der erste Kontakt der Schleimhaut mit einem Antigen abläuft. Das auf der Oberfläche befindliche Sekret kann sowohl Mikroorganismen als auch Immunglobuline (besonders IgA und IgM) binden und enthält Entzündungsmediatoren und Granulozyten [95]. Eine bedeutende Rolle in der Immunität von Schleimhäuten gegenüber Mikroorganismen und anderen Antigenen kommt dem IgA zu [75], das von Plasmazellen produziert über rezeptorvermittelte Endozytose in die Epithelzellen aufgenommen und nach Transzytose an die Oberfläche der Adenoide sezerniert wird und somit lokal das darunterliegende Gewebe schützt. Sekretorische Komponenten für IgA und auch für IgM wurden in Epithelzellen von Adenoiden nachgewiesen. Besonders die Granulozyten weisen eine starke Phagozytoseaktivität auf, welche essentiell für die Bekämpfung von Bakterien ist [19, 89]. 2 Adenoide 2.1.5 6 Lymphatische Antwort Nach Überwinden der Epithelbarriere kommt es zum Kontakt mit dem lokalen Immunsystem, dass in Form eines Dom-Areals unterhalb des Epithels liegt und aus einer Ansammlung von überwiegend T- und B-Lymphozyten besteht. Histologisch und immunologisch lassen sich in den unter dem Dom-Areal liegenden Follikeln follikuläre dendritische Zellen (=FDC) und B-Lymphozyten nachweisen. Interfollikuläre Areale werden meist durch T-Lymphozyten und interdigitierende dendritische Zellen (=IDC) bevölkert. Die Versorgung der IDC mit Lymphozyten wird durch hochendotheliale Venulen gewährleistet. Durch diese Aktivierung über die FDC sind Plasmazellen der Tonsillen dann selbst in Lage, eine der fünf Immunglobulin-Klassen zu produzieren oder als Gedächtniszellen eine schnellere Antwort auf eine zweite Infektion mit dem gleichen Erreger einzuleiten [24]. Nach der Präsentation der Mikroorganismen an Makrophagen und Lymphozyten vor Ort kommt es zu einer Kaskade von Reaktionen, an deren Ende der Kontakt mit dem nicht ortsständigen Immunsystem vor allem in Blut- und Lymphgefäßen steht, so dass auch eine Infektion von Zellen ausserhalb des Respirationstrakts möglich ist. Verschiedene Studien zeigen, dass Lymphozyten kontinuierlich zwischen Gefäßsystem und Tonsillen zirkulieren, indem sie via HEV in das Gewebe und über die Lymphe wieder zurück ins Blut gelangen. Daraus resultiert ein Einfluss der nasopharyngealen Tonsillen auf die Reifung nicht nur von lokaler, sondern auch von systemischer Immunität gegenüber vorhandenen Antigenen. Das NALT des Menschen inklusive der Tonsilla pharyngealis drainiert in die cervikalen Lymphknoten [12]. 2.2 Pathophysiologie der Adenoide 2.2.1 Allgemeines Induktive Orte der Immunantwort sind u. a. durch das Vorkommen von geordneten lymphatischen Strukturen wie den Peyer-Plaques im Gastrointestinaltrakt oder dem Waldeyer-Ring im Pharynx gekennzeichnet. Die Schleimhaut-Immunität ist nicht nur ein lokaler Prozess, sondern basiert u. a. auf zirkulierenden Lymphozyten, die aber auch wieder an den Ort des Antigenkontaktes zurückkehren können. In seiner Gesamtheit wird das Schleimhaut-assoziierte lymphatische Gewebe kurz als MALT bezeichnet [89]. 2 Adenoide 2.2.2 7 Erregerpersistenz Trotz aller aufgeführten immunologischen Mechanismen bilden Adenoide ein Reservoir für Erreger und können daraus resultierend Ausgangsort für rezidivierende Infektionen sein. Operationspräparate von in einem infektionsfreien Intervall adenoidektomierten Kindern wurden untersucht und in allen Proben nicht kapselbildende H. influenzae mittels FISH und IHC nachgewiesen. Die meisten infizierten Zellen waren Makrophagen oder Monozyten, in manchen Fällen wurden die Bakterien aber auch intraepithelial gefunden [32]. Andere Studien mit Vorschulkindern fanden andere Erreger, die die Fähigkeit besitzen, in Adenoiden zu persistieren (u. a. HIV, Adenoviren, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis) [62, 107]. 2.2.3 Rolle der Tonsilla pharyngealis in der Immunantwort Die Rolle der Tonsilla pharyngealis in Bezug auf die Immunantwort ist noch nicht bis ins letzte Detail geklärt. Fest steht, dass sie einen wichtigen Faktor für die lokale und generelle Immunität darstellt [8]. Eine gestörte Immunantwort auf Bakterien wie Chlamydien könnte zur Persistenz des Erregers und zur Ausbildung von Adenoiden beitragen. Besonders die T-Zellen scheinen bei Rachenmandelhyperplasien eine wichtige Rolle zu spielen, da eine verminderte Produktion von Th1-Zytokinen eine verminderte Elimination u.a. von Chlamydien bewirken und somit eine Persistenz des Erreger begünstigen kann. Als Folge auf die dauernde Stimulation des Zellwachstums durch Zytokine entsteht eine Hypertrophie des lymphatischen Gewebes, sowie eine Mitreaktion von Epithelien und bindegewebigen Anteilen im Sinne einer Hyperplasie [7]. Ausgelöst wird die Kaskade der Immunreaktionen wahrscheinlich durch Bindung antigener Komponenten an TLR (Toll Like Rezeptoren) auf der Oberfläche immunkompetenter Zellen. Diese sind nach Kontakt mit Bestandteilen von Mikroorganismen in der Lage, die Zelle zur Produktion proinflammatorischer Cytokine zu stimulieren [61]. Besonders IL-1β und TNF α sind bei Patienten mit adenoiden Vegetationen sowohl im pharyngealen Gewebe selbst, als auch im Blutserum erhöht und scheinen bei der chronischen Entzündungsreaktion eine Rolle zu spielen [77]. 2 Adenoide 2.3 8 Pathologie und Folgen vergrößerter Adenoide Das Ausmaß der Symptome adenoider Vegetationen variiert individuell stark, sodass sich ein Spektrum von anfangs eher harmlosen Auffälligkeiten wie Mundatmung und Schnarchen bis zum obstruktiven Schlafapnoe-Syndrom und chronischen Mittelohrerkrankungen ergibt. Als Ursache für rekurrente Episoden von akuter Otitis media (=AOM) wird ein lokaler Immundefekt der T-Zellantwort postuliert [7]. Eine Rolle von Adenoiden bei der Entstehung von sekretorischer Otitis media (=SOM) und nasaler Obstruktion gilt als gesichert, eine Adenoidektomie hat einen positiven Effekt auf beide Krankheitsbilder [109]. 2.4 Operationsindikationen Die operative Entfernung ist nach wie vor das Mittel der Wahl zur Behandlung von Rachenmandelhyperplasien. Medikametöse Therapien zeigen zwar gute Kurzzeitergebnisse (Verminderung des adenoidalen Volumens und des Quotienten aus Rachenmandelgröße und Choanendurchmesser und konsekutiv eine Verbesserung der Symptomatik), jedoch kommt es hierbei vermehrt zu Rezidiven [38]. Nach Operationen kommt es in bis zu 88 % der Fälle zur kompletten Rückbildung der präoperativ bestehenden Symptome. Diese bestehen in einer nasalen Obstruktion (91,6%), Mundatmung (85%), Schnarchen (83%) und Hörverlust (46%) [3]. Seltener sind Adenoide auch Auslöser eines obstruktiven Schlafapnoe-Syndroms bei Kindern [71]. Eine Übersicht der Symptome geben die Tab. 2.1 und 2.2. Tabelle 2.1: Symptome der Rachenmandelhyperplasie. behinderung der nasenatmung führt zu: Schnarchen Veränderungen der Sprache (Rhinolalia clausa) Obstruktivem Schlafapnoe Syndrom (OSAS) typischem Gesichtsausdruck mit geöffnetem Mund (Facies adenoidea) chronischer Rhinitis, Tracheitis, Pharyngitis, bronchopulmonalen Infekten 2 Adenoide 9 Tabelle 2.2: Folgen des Verschlusses der Tuba auditiva. verschluss der tuba auditiva führt zu: Tubenkatarrh chronischer und akuter Sinusitis bzw. Otitis media chronischer Rhinitis, Laryngitis, Tracheitis Aus der Schwere der klinischen Symptome ergibt sich die Operationsindikation (Tab. 2.3). Tabelle 2.3: Die häufigsten Operationsindikationen bei Adenoiden. häufigste operationsindikationen sind: rekurrente Infektionen der oberen Atemwege eine nasale Obstruktion ein Tubenkatarrh („glue ear“, Serotympanon) das Obstruktive Schlafapnoe Syndrom (OSAS) 2.4.1 Rekurrente Infektion der oberen Atemwege Eine Infektion der oberen Atemwege wird durch eine Minderbelüftung des Nasopharynx in Zusammenhang mit einer verminderten Clearance des anfallenden erregerbesiedelten Sekretes begünstigt. Eine kürzlich in England durchgeführte Studie zeigt einen starken Zusammenhang zwischen vergrößerten Adenoiden und einer bestehenden Rhinosinusitis bei Kindern. Eine Rückbildung der Rachenmandelvergrößerung in kernspintomographischen Bildern unter antibiotischer und antiinflammatorischer Therapie resultierte in einem starken Rückgang der klinischen Symptome, insbesondere der Mundatmung [38]. 2.4.2 Mittelohrerkrankungen (Otitis media, Serotympanon) Neben anderen Faktoren spielen Adenoide eine zentrale Rolle in der Entstehung von Mittelohrerkrankungen [34], weil sie u. a. eine Dysfunktion der Tuba Eustachii hervorrufen können. Dadurch kommt es zu einer Behinderung des Sekretabflusses mit der 2 Adenoide 10 Entstehung eines Serotympanon (sog. „glue ear“) und der Begünstigung anderer Mittelohrerkrankungen [17]. Welche Rolle Cdp. pneumoniae (auslösendes Agens oder nur Opportunist) in der Pathogenese von Adenoiden und/oder SOM spielt, konnte bisher nicht eruiert werden. Allerdings können diese Bakterien häufig aus Gewebe und Sekreten bei o. g. Erkrankungen nachgewiesen werden [23]. Als gesichert gilt, dass Cdp. pneumoniae bei Kindern lang andauernde Infekte der oberen Atemwege verursachen kann [29]. In neueren Studien wurden Toll-like-Rezeptoren in Adenoiden nachgewiesen, die beim Internalisierungsprozess von Chlamydien in das Zellinnere von Wirtszellen eine Rolle spielen [61]. Studien zeigen, dass eine Adenoidektomie einen positiven Effekt auf die Heilung von Kindern mit SOM hat [3, 34, 108]. Besonders in Kombination mit einer Tubenextrusion zeigen sich Erfolge (weniger Krankheitstage und Verringerung der Episodenzahl) bei Kindern mit rezidivierenden Episoden von AOM [76]. Besonders Kinder mit bronchopulmonalen Infekten in Kombination mit obstruktiven nasalen (z. B. Septumdeviationen) und nasopharyngealen Erkrankungen (z. B. Adenoide Vegetationen) profitieren von einer im Allgemeinen operativen Therapie der entstandenen anatomischen Engstellen. Derzeit wird propagiert, die normalen anatomischen Verhältnisse so schnell wie möglich wieder herzustellen, damit eine Verschlimmerung des vorherrschenden Krankheitsbildes sowie Folgeerkrankungen vermieden werden können [15]. 2.4.3 Operationsverfahren Die einzige Therapie, die die Adenoide beseitigt, besteht in der chirurgischen Entfernung. Andere Therapieoptionen wie topische Anwendungen von Steroiden zeigen zwar eine kurzzeitige Linderung, können eine adenoidale Hypertrophie jedoch nicht auf Dauer verringern [16]. Den Goldstandard stellt die Beseitigung des pathologischen Gewebes peroral mit dem Beckmann-Ringmesser in Vollnarkose dar. Das enstandene Wundgebiet verheilt anschließend primär. Eine Verbesserung der Operationsergebnisse besonders bei Patienten mit kleiner Mundhöhle und somit unübersichtlichen Verhältnissen könnte die Video-assistierte Adenoidektomie in sich bergen. Dabei wird nasal eine Glasfaseroptik eingeführt, um die vorherrschenden anatomischen Verhältnisse und den Operationsverlauf besser beurteilen zu können. Umfassende Studien zu Vor- und Nachteilen stehen hierbei allerdings noch aus [112]. Insbesondere bei Kindern mit einem Schlafapnoesyndrom hat die Operative Entfernung von Rachenmandelhyperplasien einen positiven Effekt [71]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 3.1 Taxonomie Die Taxonomie der Chlamydien wurde erst kürzlich komplett erneuert, da sich aufgrund der Ergebnisse umfangreicher DNA- und RNA-Analysen die alte, überwiegend auf Proteinbestandteilen basierende Einteilung nicht mehr komplett aufrechterhalten ließ [28]. Schon morphologisch lassen sich die EB von Cdp. pneumoniae im Elektronenmikroskop von den EB anderer Chlamydienspezies unterscheiden. Erstere imponieren als eher birnenförmig, letztere sind eher von rundlicher Struktur. DNA-Analysen durch DNA/DNA-Hybridisierung zeigten niedrige Homologien (5 %–10 %) des Genoms von Chl. pneumoniae gegenüber dem von Cdp. psittaci oder Chl. trachomatis. Vergleiche unterschiedlicher Stämme von Cdp. pneumoniae untereinander ergaben 94 %–100 % homologe DNA-Sequenzen. Bei der Betrachtung einzelner Gensequenzen, die für bestimmte Proteine codieren, fiel auf, dass manche DNA-Abfolgen mehr und manche weniger hoch zwischen den Chlamydienarten konserviert sind. Dabei erscheinen die Sequenzen für das MOMP genetisch in allen Chlamydienarten ähnlich und die Genloci für die cysteinreichen Proteine als eher heterogene Gruppe. Heat-shock Proteine (z. B. HSP, GroEL) erweisen sich mit 95–97 % DNA-Homologie unter den Arten Chl. trachomatis, Cdp. pneumoniae und Cdp. psittaci als hochkonserviert [57]. Analysen und Vergleiche der 16S rRNA zeigten im Vergleich zur DNA/DNAHybridisierung weitaus größere Homologien von bis zu 95 % unter den verschiedenen Spezies [28]. Als Urheber der neuen Taxonomie ist die Forschungsgruppe von Everett et al. anzusehen, die 1999 und 2000 verschiedene Gene sowie RNA-Stränge (16S rRNA, 23S rRNA, das ompA-Gen, sowie die Gene für Gro EL, die KDO-Transferase, das small cysteine-rich Protein und das large cysteine-rich Protein (ompB)) sequenzierten und eine auf ihren Ergebnissen fußende Neueinteilung vornahmen [28]. Diese ist jedoch nicht unumstritten. Aufgrund der Entschlüsselung und Interpretation homologer und heterologer Sequenzen teilt sich die Familie der Chlamydiaceae in die Gattungen der Chlamydiae und die der Chlamydophilae auf (s. Tabelle 3.1). Alle Chlamydiaceae gehören der Ordnung der Chlamydiales an. Ebenfalls der Ordnung der Chlamydiales unterstehen Parachlamydi- 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 12 aceae, Simkaniaceae und Waddliaceae, deren Krankheitswert bzw. Bedeutung in der Human- wie Veterinärmedizin noch geklärt werden muss [90]. Tabelle 3.1: Übersicht über die neue Taxonomie der Chlamydiaceae. alte spezies neue spezies wirtsspezifität Chlamydia trachomatis Mensch Chlamydia muridarum Maus, Hamster Chlamydia suis Schwein Chlamydophila psittaci Vögel, Wiederkäuer, Pferd Chlamydophila abortus Schaf, andere Wiederkäuer, Schwein, Vögel Chlamydophila caviae Meerschweinchen Chlamydophila felis Hauskatze Chlamydia pecorum Chlamydophila pecorum Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Koala Chlamydia pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Mensch, Koala, Pferd, Reptilien Chlamydia trachomatis Chlamydia psittaci 3.2 Historie, Epidemiologie und Erkrankungen durch Chlamydien In der heutigen Zeit sind Chlamydien weltweit verbreitet und vermutlich macht fast jeder im Laufe des Lebens eine Infektion mit ihnen durch. Sie gelten als Verursacher verschiedenster Erkrankungen sowohl beim Menschen als auch bei Tieren [93]. Das Trachom wurde bereits bei den alten Chinesen und Ägyptern beschrieben. Meist verläuft der Befall mit diesen Bakterien bei Menschen mild bis asymptomatisch [56], allerdings nimmt die Anzahl der (auch z. T. schweren) Erkrankungen, die mit einer Chlamydieninfektion in Zusammenhang gebracht werden stetig zu. Gerade bei älteren und immunsupprimierten Patienten können Chlamydieninfektionen auch schwere Verläufe nehmen [64]. Die verschiedenen Chlamydienstämme werden überwiegend nach ihrer klinischen Hauptmanifestation benannt. So entsteht durch eine länger anhaltende okuläre Infektion mit Chl. trachomatis das sogenannte Trachom. Cdp. pneumoniae hingegen zeichnet sich für ca. 10 % der ambulant erworbenen Pneumonien verantwortlich. Cdp. psittaci findet sich weitverbreitet bei Vögeln, insbesondere Psittaciden und verursacht bei Übertragung auf den Menschen die Ornithose. Der Erreger ist bei Stadttauben verbreitet und 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 13 kommt auch bei Nutztieren, insbesondere Rindern aber auch Pferden vor [105]. Damit ist ein ubiquitäres Kontaktpotential für alle Bevölkerungsschichten gegeben. Eine Übersicht über die durch Chlamydien verursachten Erkrankungen gibt Tabelle 3.2. Tabelle 3.2: Übersicht der durch Chlamydien verursachten Erkrankungen. spezies akute erkrankung Chlamydia trachomatis Serovar A–C Serovar D–K Konjunktivitis Urethritis, Cervicitis LGV-Serovare Lymphogranuloma venereum Chlamydophila pneumoniae Pharyngitis, Sinusitis, Bronchitis, ambulant erworbene Pneumonie Chlamydophila psittaci Fraglich: Adenoide Psittakose, atypische Pneumonie, Infektionen der oberen Atemwege; bei Tieren auch Konjunktivitis, Endokarditis, hepatische und renale Dysfunktionen, Aborte 3.2.1 chronischer verlauf/ folgen der erkrankung Trachom Epididymo-Orchitis, ReiterSyndrom, PID, ektope Schwangerschaft, tubale Infertilität, Fitz-Hugh-CurtisOphthalmia neonatorum, neonatale Syndrom Pneumonie Fraglich: Cardiovaskuläre Komplikationen, Asthma Chlamydophila pneumoniae Allgemein Das Spektrum von Erkrankungen, bei dem eine Infektion durch Cdp. pneumoniae diskutiert wird ist groß. Eine Rolle als Auslöser von Pneumonien gilt als gesichert. Eine Assoziation mit atherosklerotischen Veränderungen arterieller Gefäße und der koronaren Herzkrankheit sowie mit chronischen Lungenerkrankungen wird diskutiert, die pathogenische Relevanz ist jedoch umstritten. Die Seroprävalenz für Antikörper gegen Cdp. pneumoniae bei Erwachsenen beträgt in den westlich orientierten Nationen zwischen 40 % und 70 %. Ein positiver Titer bietet jedoch häufig keinen ausreichenden Schutz gegen den Mikroorganismus, so dass Reinfektionen häufig vorkommen und als normal zu betrachten sind [78]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 14 Obere Atemwege Im Bereich der oberen Atemwege ist eine Beteiligung von Chlamydien an verschiedenen Erkrankungen hypothetisch möglich, doch nicht bewiesen. Cdp. pneumoniae wird als Pathogen bei Kindern mit lang andauernden Sinusititden und Tonsillitiden gefunden, jedoch ist die Frage nach dem Auftreten als ursächlichem Agens oder nur opportunistischer Besiedlung bei vorbetstehenden Gewebsschädigungen ungeklärt. Keine genaue Aussage lässt sich auch über die Rolle von Cdp. pneumoniae an der Entstehung von Adenoiden und sekretorischer Otitis media (SOM) machen, da das Bakterium häufig bei Erkrankten, aber auch bei gesunden Probanden gefunden wurde [17, 29]. Pneumonien Aufgrund der Übertragung von Mensch zu Mensch sowie einer Inkubationszeit von 7 bis 21 Tagen sind Epidemien von Pneumonien besonders in Schulen, Familien, Militäreinrichtungen und Wohnheimen nicht selten. In Einzelfällen wurde Cdp. pneumoniae auch aus Tieren (z. B. Koalas, Reptilien, Amphibien, Pferde) isoliert. Das Erregerreservoir für den Menschen ist der Mensch, das für die spezifischen Tierarten innerhalb derer Art [98]. Neben Viren, Mykoplasmen und Legionellen sind Chlamydien mit die häufigsten Erreger, die bei ambulant erworbenen Pneumonien nachgewiesen werden können. In Korea wurden bei 12,3 % der erwachsenen Patienten mit CAP serologisch positive Ergebnisse für Cdp. pneumoniae gefunden, in Bezug auf Cdp. psittaci zeigte sich in der Studie jedoch kein einziger positiver Befund [60]. Studien aus anderen Ländern kamen zu ähnlichen Ergebnissen in Bezug auf ambulant erworbene Pneumonien (in etwa 10 % der Fälle wurde Cdp. pneumoniae nachgewiesen). Desweiteren werden etwa 5 % der ambulant erworbenen Bronchitiden und ein nicht näher bestimmter Anteil an Sinusitiden durch Cdp. pneumoniae verursacht [29]. Eine Koinfektion mit anderen Viren und Bakterien wird hierbei gehäuft beobachtet. Die Erstinfektion mit Cdp. pneumoniae erfolgt im Allgemeinen im Vorschulalter. So können die Bakterien aus Gewebeproben und Abstrichen des Rachens von Vorschulkindern bei Infektionen des oberen Respirationstraktes häufig mittels PCR und IHC nachgewiesen werden [71, 72]. Serologisch finden sich weitaus seltener positive Ergebnisse, da nur eine Minderheit der Kinder nachweisbare Antikörper oder nachweisbare Mengen an Antikörpern gegen Cdp. pneumoniae produziert. Es bestehen auch hier häufig Koinfektionen mit anderen Bakterien oder Viren [78]. Durch das häufige Vorkommen und die oft fehlende oder nur schwach ausgeprägte Antikörperantwort des befallenen Organismus stellt sich die Frage, ob Chlamydien zur 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 15 pharyngealen Normalflora gehören oder eine häufig nur subklinische, respektive latente Infektion verursachen. Die Therapie der manifesten Erkrankung besteht neben allgemeinen symptomatischen Maßnahmen aus der Gabe von Doxycyclin oder Makrolidantibiotika [78]. Asthma PCR-Studien zeigen eine hohe Prävalenz chronischer Infektionen mit Cdp. pneumoniae bei Kindern mit und ohne Asthma bronchiale. Dies könnte eine Erklärung für die Beobachtung sein, dass eine antibiotische Behandlung von Asthma-Patienten in manchen Fällen zur Besserung der Symptomatik führt. Allerdings werden akute Infektionen mit besagtem Erreger bei Exazerbationen nicht gehäuft nachgewiesen [51]. Arteriosklerose Die Frage nach einer Beteiligung von Chlamydien an der Entstehung und Progredienz von Arteriosklerose und koronarer Herzkankheit ist ein häufig diskutiertes Thema und nach wie vor nicht aufgeklärt. Eine Isolation von Cdp. pneumophila aus und der Nachweis chlamydialen Antigens in arteriosklerotischen Plaques gelang bisher verschiedenen Forschungsgruppen. Die Frage nach einer ursächlichen Mitbeteiligung oder einer Bystander-Infektion wurde bis dato allerdings nicht geklärt. Eine gegen Chlamydien gerichtete antibiotische Therapie zeigte keine Wirkung auf das Outcome von Patienten mit koronarer Herzkrankheit [41]. Auch eine Mitbeteiligung von Chlamydien bei arteriosklerotischen Läsionen von Carotiden, der Zentralarterie der Retina oder der Femoralarterie wird postuliert [22, 63, 111]. Richtig ist es sicherlich, bei der Arteriosklerose von einem multifaktoriellen Geschehen auszugehen, bei der Cpd. pneumoniae im Konzert exogener (insb. Zigarettenrauchen) und endogener (genetischer) Faktoren eine Rolle spielt. Zu berücksichtigen ist auch die Persistenz der Erreger in Monozyten und deren dadurch mögliche sekundäre Ansiedlung im Entzündungsgeschehen. 3.2.2 Chlamydophila psittaci Allgemein Cdp. psittaci zeichnet sich eigentlich durch ein weitgehend wirtsbezogenes Vorkommen in Vögeln (hierbei besonders in sog. Psittacine, also papageienähnlichen Arten -daher 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 16 auch der Name) aus, jedoch wird nach neueren Forschungsergebnissen davon ausgegangen, dass die Bakterien häufig bei Säugetieren und auch beim Menschen Erkrankungen verursachen. Eine Infektion von Rindern, Schweinen und anderen Tieren gilt als gesichert. Bei Katzen werden insbes. Cdp. felis und gelegentlich Cdp. psittaci gefunden. Beruflich exponierte Personen tragen ein erhöhtes Risiko für eine Infektion. Eine Übertragung von Mensch zu Mensch findet nur selten statt, kann aber bei Epidemien beobachtet werden [78]. Cdp. psittaci verursacht eine ganze Anzahl von verschiedenen Erkrankungen beim Menschen, allerdings verläuft ähnlich wie bei Cdp. pneumoniae ein Großteil der Infektionen inapparent [70]. Die klinischen Erscheinungen reichen von grippeähnlichen Symptomen über eine manifeste Pneumonie bis zur Sepsis mit Multiorganbeteiligung. Seltener zu finden sind Erkrankungen wie Konjunktivitis, Enzephalitis, Glomerulonephritis und Endokarditis. Am häufigsten entstehen jedoch Affektionen des oberen und unteren Respirationstraktes [78]. Begrifflich unterscheidet sich die Infektion von Papageien und anderen Vögeln von der, anderer Tiere durch Cdp. psittaci. Im ersten Fall spricht man von einer Psittakose, die dem Tierseuchengesetz untersteht, im zweiten Fall von einer Ornithose. Eine akute Infektion des Menschen ist nach dem Infektionsschutzgesetz meldepflichtig [90]. Psittakose bei Vögeln Vögel können asymptomatische Träger von Cdp. psittaci sein aber trotzdem infektiöse Bakterien ausscheiden und so zu einer unbemerkten Verbreitung des Erregers beitragen [1]. In pharyngealen Abstrichen aus asymptomatischen belgischen Truthähnen wurde Cdp. psittaci mittels PCR in bis zu 52 % der Fälle nachgewiesen [108]. Die Verbreitung bei Wildvögeln, insbesondere bei Stadttauben ist so ausgeprägt, dass jeder auch unwissentlich exponiert sein kann. Chlamydiale EB werden überwiegend in Fäzes und nasalem Sekret von infizierten Vögeln ausgeschieden. Die Organismen sind resistent gegen Austrocknung und können über Wochen bis Monate infektiös bleiben. Die Zeit zwischen Exposition gegenüber dem Erreger und ersten Symptomen einer Erkrankung schwankt zwischen drei Tagen und einigen Wochen, wobei der Ausgang der Infektionen von vielen Variablen abhängt [1]. Klinische Anzeichen einer Erkrankung sind in den ersten fünf Tagen post infectionem häufig nicht nachweisbar, die meisten Vögel werden erst nach vier Wochen symptomatisch [74]. Die klinischen Zeichen der 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 17 Psittakose bei Vögeln sind vielfältig und reichen von asymptomatischen Befall bis zum Tode. Am häufigsten beobachtet werden allgemeine Symptome wie Lethargie, Anorexie und ein rauhes Gefieder. Ausserdem können Sekretfluss aus Augen und Nase, Diarrhö sowie gelblich bis grün erscheinende Exkremente als Symptome einer Infektion bestehen. Oberstes Gebot in der Therapie sind eine Isolation erkrankter Vögel (wobei auch behandelte Vögel wegen der Gefahr einer Reinfektion berücksichtigt werden sollten) und eine Desinfektion der Käfige [74]. Ornithose beim Menschen Zwischen 1929 und 1930, also in der Zeit vor den Antibiotika, wurden mit Cdp. psittaci infizierte Vögel aus Argentinien exportiert und verursachten weltweit Epidemien, bei denen die Todesrate der infizierten Menschen bei fast 40 % lag [93]. Die Inkubationszeit vom Befall des Organismus bis zu den ersten Krankheitssymptomen beträgt sechs bis 19 Tage [1]. Eine Infektion von Menschen und anderen Säugetieren basiert überwiegend auf der Inhalation von Exkrementen (Fäces, lacrimale/nasale Exkretionen) bereits Bakterien tragender Tiere. Seltener kommt es zur klinisch apparenten Erkrankung nach Aufnahme des Erregers über die Schleimhäute des Verdauungstraktes. Eine Mensch zu Mensch Transmission ist eine Rarität, kann aber bei Epidemien beobachtet werden [78]. Hinsichtlich der Virulenz und der Ansteckungsgefahr für den Menschen scheinen Isolate von Papageien und einigen Truthähnen am gefährlichsten zu sein. Andere Stämme von psittaciformen Vögeln, Enten und manchen Truthahnarten sind lediglich schwach virulent für den Menschen. Aus Tauben isolierte Bakterien rufen nur ganz selten Krankheitssymptome beim Menschen hervor. Eine manifeste Ornithose des Menschen äussert sich klinisch meist in einer grippeähnlichen Symptomatik mit Kältegefühl, häufig unproduktivem Husten bis hin zu einer atypischen Pneumonie mit Atemlosigkeit und Thoraxschmerzen. Weitere Anzeichen können eine Pharyngitis mit Heiserkeit und Hämoptysen, Diarrhö und Erbrechen, sowie Myalgien, Arthralgien und Gelenkschwellungen sein [1, 70]. Bei systemischer Affektion ist auch die Beteiligung anderer Organe möglich (Endo- und Myokarditis, Hepatits, septische Arthritis, Keratokonjunktivitis, Enzephalitis). Bei Schwangeren wurden auch Todesfälle beschrieben [70]. Eine Studie aus Japan zeigte neben anderen Bakterien wie Salmonellen und Mykobakterien eine besonders hohe Kontaminierung (22,9 %) von Kot freilebender Tauben mit Cdp. psittaci und Cdp. pecorum [101]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 18 Hinweise auf das Vorliegen eines Ornithose-Falles beim Menschen resultieren aus Befunden von klinischer Untersuchung und apparativer Diagnostik. Differentialdiagnostisch müssen andere Infektionskrankheiten durch Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, andere Chlamydophila, Legionellen, Viren (z. B. Influenza) gegen die Ornithose abgegrenzt werden. Die Therapie erfolgte sowohl antibiotisch (z.B. mit TetracyclinDerivaten) als auch symptomatisch [70]. Lungenemphysem Durch PCR und TEM wurde durch Theegarten et al. eine überdurchschnittlich hohe Infektionsrate mit Cdp. psittaci bei Patienten mit Lungenemphysem bei COPD gefunden. Patienten mit angeborenem α-1 Antitrypsin Mangel scheinen für eine Besiedlung mit Chlamydien besonders empfänglich zu sein. Cdp. psittaci zeigte hierbei eine größere Präsenz als Cdp. pneumoniae, das nur in Einzelfällen gefunden wurde [104]. Pneumonie Eine 2003 in Kanada durchgeführte Studie von Marrie und Peeling beschäftigte sich mit den Erregern Cdp. psittaci (bei Vögeln und Katzen gefunden Varianten), Cdp. pneumoniae und Cdp. pecorum als Auslöser der ambulant erworbenen Pneumonie. Cdp. psittaci konnte nur in einzelnen Fällen nachgewiesen werden, hierbei auch nur die von Katzen stammende Subspezies. Auch Koinfektionen mit anderen Erregern (Streptococcus pneumoniae, Influenza A, RSV) wuden gefunden [65]. 3.2.3 Chlamydia trachomatis Jährlich werden ca. 500 Mio. Fälle von okulärer Infektionen mit Chl. trachomatis (= Trachom) – darunter 7 Mio. Erblindungsfälle – sowie 89 Mio. Fälle nachgewiesener genitaler Infektion weltweit gemeldet [78]. Chl. trachomatis ist somit der häufigste Erreger von Genitalinfektionen, sowie die häufigste Ursache von vermeidbarer Blindheit und stellt besonders in den Entwicklungsländern ein großes Problem dar. Eine chronische, rezidivierende oder aszendierende Infektion kann zur PID führen und durch Störungen des Zilienepithels eine tubale Infertilität verursachen sowie eine ektope Schwangerschaft begünstigen. Deweiteren steigt bei gleichzeitig florider genitaler Infektion durch Chl. trachomatis und ungeschütztem sexuellen Verkehr das Risiko der Ansteckung mit anderen durch Körpersekrete und Blut übertragbarer Krankheitserreger (HIV, Hepatitis B und C, Treponema pallidum) [78]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 3.2.4 19 Weitere Erkrankungen im Zusammenhang mit Chlamydien Eine Arbeit von Anttila et al. zeigt die Möglichkeit einer Beteiligung von Chlamydien an der Entstehung von malignen Lymphomen auf [2]. Bestätigt werden die Ergebnisse durch neuere Studien, wie die von Ferreri et al. Sie fanden einen Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Cdp. psittaci DNA in Tumorgewebe und peripheren Blutmonozyten bei Patienten mit malignen Lymphomen der Augenanhangsgebilde [30]. Bei unter 60-jährigen soll zwischen einem erhöhten Serum-Titer für Anti-Cdp.pneumonia-IgA und der Enstehung eines Bronchialkarzinoms ein Zusammenhang bestehen [50]. 3.3 Biologie der Chlamydien 3.3.1 Allgemein Chlamydien sind obligat intrazelluläre Mikroorganismen, die nach den heutigen Erkenntnissen zu den Bakterien gezählt werden, allerdings einem einzigartigen, biphasischen Lebenszyklus folgen, der aus dem extrazellulären Erscheinungsbild des Elementarkörperchens und der intrazellulären reproduktionsfähigen Form des Retikularkörperchens besteht. Dieser Lebenszyklus ähnelt in den Grundzügen dem einiger viraler Organismen, weshalb früher Chlamydien auch als untypische oder große Viren bezeichnet wurden. Tatsächlich aber sind sie Prokaryonten, da sie sowohl DNA, RNA als auch Ribosomen enthalten [28]. 3.3.2 Aufbau der Chlamydien Der Aufbau der Chlamydien ist komplexer als der vieler anderer Mikroorganismen. Umgeben werden sie von einer inneren und einer äusseren Membran mit einer besonderen Lipopolysaccharid-Struktur und einem Hauptprotein, dessen Monomere über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind und das ca. 60 % des Volumens der äusseren Membran ausmacht [88, 100]. Als Hauptfunktion wird für dieses sog. MOMP die Aufrechterhaltung der osmotischen Stabilität der Chlamydienmembran angenommen. Die Vorgänge während des Andockens an und des Eindringens in die Wirtszelle, die Immunevasion und Vermehrung sowie die während der Verwandlung von EΒ in RB und retour 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 20 ablaufenden Vorgänge sind noch nicht bis ins Detail aufgeklärt und Teil der derzeitigen Forschung. 3.4 Infizierte Zellen Durch Chlamydien infizierbare Zellen sind: Makrophagen [86], Epithelien (hierbei besonders die von Schleimhäuten) [96], Endothelien und glatte Muskelzellen [58]. Cdp. pneumoniae kann bei einer Infektion von Flimmerepithel eine ziliäre Dysfunktion hervorrufen, so dass es zu einer Beeinträchtigung der mukoziliären Clearance im Respirationstrakt des Wirtsorganismus kommen kann [96]. 3.5 Lebenszyklus Die Dauer eines Vermehrungszyklus beträgt in vivo zwischen 18 und 72 Stunden in vitro etwa 3 bis 4 Tage, variiert jedoch interindividuell und unterteilt sich in verschiedene Teilabschnitte. Am Zyklusende steht zumeist die Zellyse mit der Freisetzung vieler neuer Elementarkörperchen [113] (Abb. 3.1). Zwei Stunden nach Infektion einer Zellkultur sind die Mikroorganismen intrazellulär nachweisbar. Nach zwei Tagen sind Chlamydien in der Wirtszelle in Vakuolen zu finden, die u. a. durch endosomale, lysosomale und MHC-II-Proteine in der vakuolären Membran charakterisiert sind. Einige Zeit nach dem Eindringen in eine Wirtszelle formen die Chlamydien zusammen mit wirtszelleigenen Bestandteilen die sog. Inklusion. Von ihr spricht man, wenn die mit den Bakterien infizierten Vakuolen groß genug sind, um sie durch das Lichtmikroskop sehen zu können [113]. 3.5.1 Das Elementarkörperchen Die Zellwand der EB ist zu einem großen Teil aus Membranproteinen (outer membrane proteins) aufgebaut, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind und so die Zellwandstabilität aufrechterhalten [113]. Aufgrund dieser stabilisierenden Eigenschaften sind die EB ausserhalb des Wirtsorganismus mehrere Tage bis Wochen lebensfähig. Desweiteren setzt sich das Elemantarkörperchen aus kondensiertem genetischem Material, einem ATP-Speicher und der zur Energiefreisetzung wichtigen ATPase zusammen, 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 21 Ein Peptidoglykan, wie es bei anderen Bakterien vorkommt, fehlt den Chlamydiaceae [45]. Die Form der freigesetzten EBs ist im elektronenemikroskopischen Bild für Cdp. psittaci und Chl. trachomatis eher kugelig und für Cdp. pneumoniae eher birnenförmig. Zudem ist der periplasmatische Raum bei den EB von Cdp. pneumoniae stärker ausgeprägt als bei denen von Chl. trachomatis und Cdp. psittaci [114]. 3.5.2 Andocken Am Anfang des Reproduktionskreislaufes steht das Andocken (Abb. 3.1) des im Durchmesser ca. 200–300 nm großen und von zwei Membranen mit rigider Struktur umschlossenen Elementarkörperchens an die Oberfläche der Wirtszelle [113]. Die Art des Eindringens in die Wirtszelle gestaltet sich vom Ablauf her anders als bei der Großzahl von Bakterien. Chlamydien docken über elektronenmikroskopisch sichtbare, auf der Oberfläche der EB liegende kleine Protrusionen an die Wirtszelle an [97], formen Zellwandprotrusionen an der eigenen Membran aus, um damit die Ausbildung weiterer Bindungsstellen zu ermöglichen. Die Wirtszelle reagiert darauf mit der Formung von Invaginationen und am Ende mit der Endozytose des Bakteriums, dass intrazellulär in vakuolären Vesikeln zu finden ist [113]. Die Gesamtheit der Abläufe des Internalisierungmechanismus ist noch nicht bis ins letze Detail geklärt, cholesterol-reiche Mikrodomänen, Glykosaminoglykane und Heparansulfat-ähnliche Moleküle scheinen eine Rolle zu spielen[47, 99]. 3.5.3 Die Inklusion Nach Aufnahme in die Wirtszelle ist das Entkommen vor den zelleigenen Abwehrmechanismen von existentieller Bedeutung für intrazelluläre Bakterien. Chlamydien entziehen sich diesen durch die Ausbildung eines Vesikels [43], der von einer Inklusionsmembran umgeben ist [102]. Die Funktionen dieser Membran sind auf der einen Seite der Zugang zu überlebenswichtigen Substanzen wie ATP [106], auf der anderen Seite die Separierung des Mikroorganismus von der Wirtsabwehr, was bei manchen Spezies gleichbedeutend mit der Verhinderung der Verschmelzung des Vesikels mit Lysosomen ist [21]. Die native Einschlusskörperchenmembran entsteht aus der Plasmamembran der Wirtszelle. Die Verhinderung der endolysosomalen Fusion wird durch den Einbau wirtszelleigener Stoffwechselprodukte (z. B. vom Golgi-Apparat) in dieselbe bewerkstelligt. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 22 Durch die essentielle Nähe zur distalen Region des Golgi-Apparates erklärt sich auch das Erscheinungsbild der Chlamydien im Mikroskop als meist perinukläre Einschlusskörperchen. Bereits zwei bis vier Stunden post infectionem sind Cluster von EB neben dem Golgi-Apparat nachweisbar [94]. 3.5.4 Reproduktion Innerhalb der Inklusion findet ca. acht bis zwölf Stunden nach der Internalisierung die Umwandlung von EB in die wesentlich größeren (0,8–1,0 µm), metabolisch aktiven und reproduktionsfähigen RB statt. Bei dieser Konversion scheinen ebenso wie bei der vom RB zurück zum EB chlamydiale Oberflächenantigene eine Rolle zu spielen [114]. Die RB entstehen durch Aktivierung der ATPase, die Lösung von Disulfidbrücken zwischen den Komplexen der Outer Membrane Proteins und die Synthese verschiedener chlamydialer Proteine. Durch die Lyse der Disulfidbrücken der Membranproteine fehlt den RB die die EB auszeichnende Stabilität und Resistenz gegenüber Umwelteinflüssen [27]. Grundlage für die Replikation und viele andere physiologische Vorgänge innerhalb einer Zelle ist die Möglichkeit der Nutzung energiereicher Substanzen. Chlamydien werden als Energieparasiten bezeichnet, da sie durch den Mangel einiger zur Energiegewinnung wichtiger Enzyme auf bestimmte Substanzen des Wirtszell-Stoffwechsels angewiesen sind. So sind sie auxotroph für drei von vier Nukleosidtriphosphaten, obwohl die genetische Information für glukosekatabolisierende Enzyme im Erbgut der Chlamydien vorhanden ist, die zur Generation von ATP genutzt werden können. Chlamydien mangelt es zudem an Enzymen der Atmungskette (Elektronentransportkette), zur Oxidation von NAD und der de-novo-Synthese von Nukleotiden [67]. Cdp. psittaci scheint zudem einen neuen Mechanismus für die Unterbrechung des Tryptophanstoffwechsels der Wirtszelle zu besitzen. Das Bakterium ist in der Lage, ein frühes Abbauprodukt der Aminosäure in Tryptophan zu recyclen und so eventuell eine chronische Persistenz zu begünstigen, da es sich so einem wichtigen Wirkmechanismus von Interferon-γ entzieht [118]. 3.5.5 Teilung, Redifferenzierung und Freisetzung Nach der Differenzierung der EB in RB erfolgt die Vermehrung der Chlamydien durch zehn bis zwölf aufeinander folgende Zellteilungen, so dass in einer infizierten Wirtszelle 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 23 bis zu 1000 Chlamydien entstehen können (Abb 3.1). Dieser Vorgang ist noch nicht sicher aufgeklärt, jedoch sind Besonderheiten über ihn bekannt. So ist er unabhängig von Peptidoglykanen, die bei anderen Bakterienarten für die Integrität der Membran und als wichtiger Faktor für die Zellteilung vorhanden sind [13]. Eine Ausbreitung intrazellulärer Mikroorganismen kann über verschiedene Wege erfolgen: direkt von Zelle zu Zelle oder durch zwischenzeitliche Freisetzung aus der Wirtszelle über Exozytose oder Zelllyse und dann folgend die Infektion weiterer Ziele. Morphologische und biochemische Veränderungen in verschiedenen Zellen (Epithelzellen und Makrophagen) nach Chlamydieninfektion deuten auf den Weg über die Apoptose hin. Die Freisetzung der entstandenen EB geschieht nach den abgeschlossenen Reproduktionsvorgängen, also etwa 18–30 h post infectionem, durch Kondensation der RB unter Cysteinverbrauch. Die bis zum Zeitpunkt des Zelltodes nicht kondensierten RB gehen dabei zu Grunde [85]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen ionen 24 Der typische Lebenszyklus der Chlamydien Legende: Wirtszelle RB EB Inklusion Rezeptor Andocken Internalisierung Differenzierung Vermehrung Redifferenzierung Zelllyse und Freisetzung neuer EB Abbildung 3.1: Der typische Lebenszyklus der Chlamydien (© Jochen Gerhardt 2007) 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 3.5.6 25 Besonderheiten des Aufbaus von Chlamydien Chlamydien haben kein Peptidoglykan in der Zellhülle, obwohl im Genom alle Gene für die Synthese, Zusammenfügung und Degradation vorhanden sind [5]. Eine Analyse der Gensequenzen ergab allerdings Insertionen in denen für die Enzyme codierenden Abschnitte, die eventuell die ungewöhnliche Zellwandstruktur der Mikroorganismen erklären könnte, zumal diese eingefügten Sequenzen mit Ausnahme in der Gattung der Streptomyces nur bei den Chlamydiales (Chlamydia spp., Simkaniaceae, Waddliaceae) vorkommt [42]. Umso erstaunlicher erscheint diesbezüglich die Beobachtung, dass unter dem Einfluss von Penicillin, bei Chlamydien fehlgeformte und nicht teilungsfähige RB entstehen. Dieses Paradoxon ist in der Fachwelt als die „chlamydiale Anomalie“ bekannt und legt nahe, dass in der Zellwand des Bakteriums ein Polymer als Äquivalent für das Peptidoglykan bei anderen MO vorhanden sein muss, dessen Synthese empfindlich auf Penicillin reagiert [39]. 3.6 Antigene Strukturen von Chlamydien 3.6.1 Einleitung Wie auch bei anderen Infektionen spielen bei der Auseinandersetzung des Wirtes mit Chlamydien von Plasmazellen produzierte Antikörper eine Rolle. So kommt es bei einer akuten Infektion zur Bildung von IgM und IgG, bei Persistenz des Organismus und chronischer Inflammation vorwiegend zur Synthese von IgG und IgA [114]. Erhöhte Titer der einzelnen Immunglobuline sind häufig Bestandteile von Studien. Allerdings geht eine Chlamydieninfektion aufgrund ihres überwiegend intrazellulären Ablaufes nicht zwangsläufig mit einer Erhöhung von Antikörpertitern einher. Vielmehr gibt es Krankheitsverläufe, die ohne relevante Antikörperkonzentrationen im Serum einhergehen. Zudem spielen später noch erwähnte Mechanismen der Immunevasion eine wichtige Rolle, da sie gerade dabei helfen, einer Erkennung der Bakterien durch den Wirtsorganismus zu entgehen [114]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 3.6.2 26 Chlamydiale Antigene Die meisten der bisher entdeckten Antigene, die eine Plasmazellantwort mit Produktion von Antikörpern initiieren können, sind auf der äusseren chlamydialen Membran lokalisiert. Sie haben in der Membran meist stabilisierende Eigenschaften oder dienen als Porine vor allem dem Austausch von Stoffwechselprodukten und Ionen. Als besonders immunogen hervorzuheben sind hierbei das Lipopolysaccharid (LPS) mit der Besonderheit der Ketodesoxyoctulonsäure-Säure-Gruppe (KDO), major outer membrane protein (MOMP) mit gattungs- sowie speziesspezifischen Strukturen und verschiedene Stressproteine. Bereits 1990 gelang es Campbell et al. in Versuchen mit Kaninchenseren acht Proteine mit antigenen Eigenschaften aus Cdp. pneumoniae zu isolieren, wobei viele der Eiweisse eine Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydienarten aufweisen [14]. MOMP Nach bisheriger Erkenntnis handelt es sich beim MOMP, wenn es als Trimer assoziiert ist, um eine porinähnliche Struktur mit den Charakteristika eines Ionenkanals [117]. Physiologische Funktionen sind einmal der Transport von Nukleosidtriphosphaten in das Chlamydieninnere, zum anderen erfolgt bei der Ausbildung der EB mittels Kondensation eine Verknüpfung verschiedener MOMP über Disulfidbrücken der Aminosäure Cystein, was in einer verbesserten Membranstabilität und einer rigiden Struktur der EB resultiert [116]. So hat das MOMP einerseits eine wichtige biologische Funktion für chlamydiale Mikroorganismen, andererseits gilt es bei manchen Spezies als ein potentes Antigen, gegen das Antikörper produziert werden [14]. Charakterisch für den Aufbau des MOMP ist eine Mischung aus variablen und konstanten Regionen in der Aminosäuresequenz. Die so erzielte hohe Variabilität der antigenen Determinanten ist bei der Immunevasion des Bakteriums von großer Bedeutung [55]. Neben dem MOMP spielen auch cystein-reiche Proteine [92], Porine (z. B. PorB) [54], Inklusions- und [4], Stressproteine (HSP) [115] eine Rolle bei der Induktion einer Antikörperantwort. LPS Das Lipopolysaccharid vieler Bakterien ist ein potentes Antigen und kann auf Seiten des befallenen Organismus eine starke bis überschiessende Immmunreaktion, die bis zum endotoxischen Schock führen kann, hervorrufen. Die LPS-Struktur der Chlamydien äh- 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 27 nelt der von anderen gramnegativen Bakterienarten, allerdings mit dem Hauptunterschied, dass im Kernoligosaccharid eine Sequenz von Ketodesoxyoctulonsäure-Säure vorkommt, die bei der Mehrzahl anderer Bakterien nicht vorhanden ist [87]. Der Aufbau des chlamydialen LPS im Einzelnen besteht aus dem Lipid A, dem Kernoligosaccharid mit der KDO-Sequenz und einem O-Polysaccharid. Lipid A Beim Großteil der Mikroorganismen mit einem LPS ist das Lipid A Hauptträger der immunogenen Eigenschaften und so für die Endotoxinwirkung verantwortlich. Dies trifft im Allgemeinen auch für Chlamydien zu, obwohl sich die chemische LPS-Struktur von der, anderer MO in einigen Details unterscheidet. Chlamydiales LPS ist im Vergleich zu dem anderer Bakterienarten weniger endotoxisch aktiv [114]. 3.6.3 Polysaccharid Die Membran der chlamydialen Zellwand beinhaltet neben den aussergewöhnlichen Fettsäureverbindungen eine Polysaccharid-Verbindung mit einem gruppenspezifischen Epitop, bestehend aus einem Trisaccharid von 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid (kurz KDO = Ketodesoxyoctulonsäure). KDO-Mono und Disaccharide allein sind nicht in der Lage eine Antikörperbildung des Wirtsorganismus zu induzieren. Dies geschieht jedoch durch das KDO-Trisaccharid [114]. 3.7 Die Immunantwort des Wirtsoganismus 3.7.1 Allgemeines Bei einer Infektion mit Chlamydien spielen sowohl zelluläre als auch humorale Immunreaktionen eine Rolle, wobei die durch Antikörper vermittelte Immunantwort wahrscheinlich eher von untergeordneter Bedeutung ist. Ein bis zwei Tage post infectionem wird die Wirtsabwehr auf eine Erstinfektion mikroskopisch durch das Auftreten einer Entzündung im betroffenen Gewebe nachweisbar. Die Schleimhäute werden durch neutrophile Granulozyten und eine geringere Anzahl an Monozyten infiltriert. Später kommen auch T-Zellen hinzu, die eine Rolle in der Kontrolle der Infektion spielen [83]. B-Zellen hingegen scheinen eine eher untergeordnete Rolle in der Bekämpfung von 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 28 Chlamydien zu spielen [82]. Meistens resultiert aus der Erstinfektion kein großer Gewebeschaden [84]. Eine Immunantwort kann eine Infektion mit Chlamydien limitieren und auflösen, aber auch selbst durch die Inflammation und die Ausschüttung zelltoxischer Substanzen Schäden verursachen (z. B. PID, tubare Infertilität, Trachom). So laufen Reinfektionen aufgrund einer erhöhten inflammatorischen Antwort meist mit einer größeren Schädigung des betroffenen Organs ab als die Erstinfektion. T-Lymphozyten erscheinen in größerer Anzahl und schneller am Infektionsort [84]. Auf zellulärer Ebene erfolgt die Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene durch verschiedene Mechanismen. Eine wichtige Rolle spielen die hauptsächlich von Makrophagen und neutrophilen Granulozyten produzierten reaktiven Sauerstoffmetabolite und Stickstoffmonoxid, sowie IFN-γ und TNF-α. Zudem sind Chlamydieninfektionen eng mit einer Induktion von Chemokinen und Chemokinrezeptoren, die an der Rekrutierung von Th1-Zellen zum Ort der Infektion beteiligt sind assoziiert [6, 8, 19, 84, 90]. Da die Wirkung einzelner Chemokine über einen Eingriff in den chlamydialen Stoffwechsel entsteht, kann eine Persistenz von Erregern im infizierten Gewebe unterstützt werden. An der Freisetzung der jeweiligen Faktoren sind sowohl immunologische als auch nicht immunologische Zellen (z. B. Epithelien) beteiligt [85, 114]. Bei einer normalen Abwehrreaktion des Wirtsorganismus auf eine Infektion mit einem intrazellulären Erreger überwiegt in der Aktivierung die Th2- die Th1-Antwort, was zu einer vermehrten Rekrutierung von CD-4+- und CD-8+-T-Zellen (CTL) führt. Ist die Th2-Antwort größer als die Th1-Antwort, führt dies eher zu einer persistierenden Infektion [44]. T-Zellen in Adenoiden produzieren nachweislich weniger Th1-Zytokine als normale Gewebe bei einer Infektion mit Chlamydien. Dies könnte ein möglicher Grund für eine verminderte Elimination von Chlamydien und eine konsekutive Hypertrophie des Gewebes durch eine chronische Besiedlung mit einhergehender (Fehl-) Aktivierung des Immunsystems sein [7, 59, 73]. Makrophagen und neutrophile Granulozyten stehen in vorderster Linie der Abwehr des Wirtsorganismus gegen Chlamydieninfektionen. Sie erscheinen ein bis zwei Tage post infectionem am betroffenen Ort und leiten hier die Entzündungsreaktion u. a. durch die Rekrutierung weiterer Entzündungszellen ein. Sie können durch eine suffiziente Fusion von Endo- und Lysosomen und durch die Sekretion von Myeloperoxidase und verschiedenen Oxidantien Elementarkörperchen vernichten [114]. Eine neue Studie von van Zandbergen und Gieffers zeigte, dass neutrophile Granulozyten zwar Chlamydien internalisieren, aber danach teilweise nicht abtöten können. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 29 Die Lebenszeit der mit Chlamydien beladenen Neutrophilen verlängert sich sogar von 10 auf 90 Stunden. Chlamydien scheinen also einen Schutzmechanismus zu besitzen, der ihnen das Überleben und die Vermehrung in neutrophilen Granulozyten ermöglicht. Da Neutrophile als erste Zellart des Immunsystems am Entzündungsort zu finden sind, könnte dieser Mechanismus der Immunevasion das Überleben der Bakterien in der Frühphase der Infektion sichern [110]. Makrophagen sind nicht nur für die Elimination der Chlamydien von Bedeutung, sondern können auf der anderen Seite auch für die Persistenz und Vermehrung der Bakterien im Wirtsorganismus verantwortlich sein. Eine Replikation besonders in nicht durch Zytokine aktivierten Monozyten wird beobachtet [46], auch durch Lymphokine aktivierte Makrophagen zeigen in Studien teilweise einen bakteriostatischen Effekt [25]. 3.8 Diagnostik Aufgrund des hauptsächlich intrazellulären Lebenszyklus der Chlamydien, ergeben sich für die Detektion der Mikroorganismen bzw. die klinische Diagnostik einer Infektion einige Schwierigkeiten. Ein direkter Nachweis des Bakteriums durch Anzüchtung auf Nährmedien ist nicht möglich, sodass bis vor kurzem noch die Vermehrung via Zelllinien die Methode der Wahl darstellte. Weiterentwicklungen in Serologie, ELISA, den Nukleinsäureamplifikationsverfahren und in der Immunhistochemie sowie Immunfluoreszenz drängen die Zellkultur derzeit in den Hintergrund und erleichtern zunehmend die Diagnostik. 3.8.1 Serologie Die Serologie basiert auf dem Nachweis von durch den Wirtsorganismus gebildeten Antikörpern gegen das krankheitsursächliche Agens. Für die Diagnostik einer Chlamydieninfektion stehen verschiedene Assays zur Verfügung, in denen Chlamydien oder Chlamydienbestandteile mit Patientenserum inkubiert und die gebundenen Antikörper sichtbar gemacht werden. Ein grundsätzliches Problem der Serologie bei Infektionen mit intrazellulären Erregern besteht in der häufig nur sehr schwach ausgeprägten humoralen Immunantwort. So erfolgt der Titeranstieg bei Chlamydieninfektionen meist in einem späteren Stadium der Krankheit [90, 114]. 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 30 Die derzeit gebräuchlichsten Methoden zum Nachweis gegen Chlamydien gerichteter Antikörper sind die MIF, die KBR, die rLPS-ELISA sowie der AK-Nachweis mittels LPS-extrahierter EB. In Bezug auf die Sensitivität der einzelnen Testverfahren zeigen sich große Unterschiede. Die MIF ist mit einem Wert von 88 % am sensitivsten, der EIA folgt mit 72 %, die KBR kommt lediglich auf 10 % [80]. Kommerziell erhältliche Kits reagieren gelegentlich kreuz zwischen Cdp. psittaci und Cdp. pneumoniae. Zudem divergieren Ergebnisse serologischer und mikrobiologischer Nachweise für Cdp. psittaci voneinander. Verglichen mit Ergebnissen anderer Nachweismethoden wird Cdp. psittaci bei rein serologischer Diagnostik unterdiagnostiziert [49]. 3.8.2 Nukleinsäureamplifikationsverfahren Die Nukleinsäureamplifikationsverfahren nehmen in der Diagnostik erregerbedingter Krankheiten immer mehr an Relevanz zu. Die Vorteile gegenüber anderen diagnostischen Methoden liegen in einem schnelleren Erhalt der Ergebnisse gegenüber der Zellkultur und in der Verbesserung sowohl der Spezifität als auch der Sensitivität gegenüber den serolgischen Methoden [49, 108]. Alternativ gibt es noch die Nachweismöglichkeit mittels FISH [80]. PCR Erster Schritt bei der Anwendung der PCR ist die Präparation der jeweiligen Nukleinsäure für die Amplifikation, also deren Freisetzung und Konzentration. Wichtig ist danach die Elimination von Inhibitoren, da Häm-Verbindungen, Polysaccharide und zur Präparation verwendete Reagenzien falsch negative Ergebnisse erzeugen können. Weitere Probleme der Nukleinsäureamplifikation sind falsch positive Ergebnisse bei Kontamination mit DNA/RNA aus vorherigen Proben oder durch Fremdorganismen, sowie die Verwendung zu unspezifischer Primer [49, 91]. Falsch negative Resultate können auch entstehen, wenn Mikroorganismen selbst inhibierende Faktoren sezernieren oder, besonders bei den EB der Chlamydien, die DNA in kondensierter Form vorliegt und somit der herkömmlichen Diagnostik nicht zugänglich ist [40, 49]. Neue kommerzielle Kits zur Detektion von Cdp. pneumoniae und Chl. trachomatis, deren Spezifität mit bis zu 97 % und Sensitivität mit bis zu 100 % beziffert werden, sind mittlerweile erhältlich. Allerdings gelten die meisten dieser angegebenen Werte für Ver- 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 31 suche, die in vitro durchgeführt wurden. Endgültige Ergebnisse mit klinischen Proben stehen noch aus [40, 49]. Für den Nachweis von Cdp. psittaci fehlen bislang Assays mit ähnlich guten Ergebnissen. Insbesondere die Anwesenheit der oben genannten Inhibitoren für Nukleinsäureamplifikationen spielen dabei eine große Rolle [40]. Auch die klinische Relevanz der Ergebnisse von Nukleinsäureamplifikationsverfahren wird kontrovers diskutiert, da sowohl lebende als auch tote Mikroorganismen detektiert werden und bei respiratorischen Proben und einem Nachweislimit von 0,1– 1 IFU/ml BAL für Cdp. pneumoniae und Cdp. psittaci [108] die Frage nach der Ursächlichkeit des Erregers an einer Erkrankung gestellt werden muss. Der schwierigere Nachweis der kondensierten extrazellulären Form gelingt mittels PCR bis zu einer Zahl von 10–100 EB pro gewonnener Probe [49]. In vielen neuen Studien stellte sich allerdings heraus, dass Sensitivität und Spezifität der PCR nicht sicher quantifizierbar sind und diese Methode für viele Mikroorganismen noch nicht ausreichend validiert ist. In der Forschung werden auf dem Nachweis von Nukleinsäuren basierende Verfahren oft eingesetzt, es gibt aber kein international standardisiertes Verfahren zur Diagnosestellung einer Infektion im klinischen Alltag [40]. Zudem fehlt eine internationale Standardisierung für die PCR-Verfahren [10]. 3.8.3 Immunhistologische Nachweismethoden Immunfluoreszenz und Immunhistochemie sind zwei sensitive Möglichkeiten, um chlamydiale Antigene in Gewebeproben und Sekreten wie Sputum zu detektieren. In der Interpretation der Ergebnisse herrscht derzeit allerdings Uneinigkeit, welche Anfärbungen als positiv anzusehen sind. Es wird propagiert, nur intrazelluläre Markierungen überhaupt als positiv gelten zulassen, wobei jedoch die Frage besteht, ob homogene Anfärbungen im Kontext als positiv gelten sollen oder nicht [60]. In der IHC können zudem körpereigene Pigmente (Lipofuszin und Hämosiderin) vom Untersucher als positives Signal fehlinterpretiert werden. Daher sind Resultate, die mit Hilfe dieser Methoden gewonnen werden auch immer als etwas subjektiv und somit von der Erfahrung des Untersuchers abhängig zu betrachten. Intrazelluläre Signale für IHC und IF wurden für die bereits in Kap 3.1 erwähnten Zellarten beschriebenen [58, 69, 73]. Normalerweise sind, verglichen mit Nukleinsäureamplifikationsverfahren, positive IHC-Ergebnisse häufiger, da die Degradation von DNA schneller vonstatten geht als die 3 Chlamydien und ihre Bedeutung bei respiratorischen Infektionen 32 von Antigenen (Proteinen), die DNA-Extraktion aus Gewebe schwierig ist und das Resultat von PCR/LCR-Verfahren zudem von der Beeinflussung durch Inhibitoren der Nukleinsäuresynthese abhängt [40, 49]. Durch unter den Chlamydienarten konservierte Proteinstrukturen (häufig MOMP) reagieren vom Wirtsorganismus produzierte Antikörper häufig kreuz unter den Spezies. Neuere Antikörper besitzen hingegen variable Fab-Fragmente, die nur noch mit Epitopen einer einzigen Spezies reagieren [9, 66]. Gruppen- bzw. genus-spezifische Antikörper werden zum Screenen von Proben auf alle Arten von Chlamydien verwendet, die selektiven AK zur Differenzierung der vorliegenden Art. Die IHC erweist sich im Vergleich mit der IF meist als weniger sensitiv, die IF produziert dafür mehr falsch positive Resultate [66]. Günstig ist in der IF die Verwendung von einem DNA-Markierungsstoff. 3.8.4 Zellkultur Nach wie vor ist die Zellkultur unerlässlich für die Dokumentation der Lebensfähigkeit von Chlamydien, zur Vermehrung für experimentelle Infektionen und zur Resistenztestung in Bezug auf verschiedene Antibiotika [18]. Andererseits ist Kultivierbarkeit nicht gleichzusetzen mit manifester Infektion, da vermehrungsfähige Mikroorganismen nicht immer auch ein Krankheitsbild hervorrufen. Die Anzüchtung erfolgt in der Regel in BGM-, McCoy- oder HeLa-Zellen, sowie in bebrüteten Hühnereiern [90]. Die Kultur bietet Probleme durch die Empfindlichkeit lebendiger Mikroorganismen beim Transport der Proben, falsch negative Ergebnisse durch eine zu niedrige Anzahl an Bakterien im Untersuchungsmaterial oder eine vorangegangene Einnahme von Antibiotika durch den Patienten. Eine Kontamination der verwendeten Zelllinien oder Proben mit Mykoplasmen ist zudem ein häufiges Problem [90]. 4 Material und Methoden 4.1 Positiv- und Negativkontrollen Als Negativkontrollen dienten 12 Operationspräparate von HamartochondromPatienten, die zwischen 1999 und 2001 einer Keilresektion in der Ruhrlandklinik Essen Heidhausen zugeführt wurden. Das Untersuchungsmaterial wurde in 4%iger phosphatgepufferter Formalinlösung fixiert, in aufsteigender Alkoholreihe dehydriert und in Paraffinwachs (Tissue-Wax®; Medite, Burgdorf ) eingebettet. Die aufsteigende Alkoholreihe besteht aus Bädern mit jeweils einer 35, 50, 70, 95 und 100%-igen EthanolKonzentration sowie einer abschließenden Behandlung mit 100%-igem Xylol. Die mit dem Mikrotom angefertigten Schnittpräparate hatten eine Dicke von 3 bis 5 µm und wurden auf hochgereinigte Objektträger aufgezogen. Einschlusskriterien für das Kollektiv der Negativkontrollen waren der Nichtraucherstatus und das Fehlen von Entzündungszeichen sowie emphysematösen Veränderungen in der lichtmikroskopischen Untersuchung Hämatoxylin-Eosin gefärbter Präparate. Die so definierten Negativkontrollen erwiesen sich auch in der TEM und PCR als negativ für Chlamydien. Alle verwendeten Proben entstammen dem Eingang der Abteilung für Pathologie der Ruhr Universität Bochum (Leiter: Prof. Dr. K. Morgenroth) im Zeitraum von 1999 bis 2001. Als Positivkontrollen dienten die Präparate von kindlichen Adenoiden, die sowohl in der PCR als auch in der TEM ein positives Ergebnis bzgl. Chlamydophila psittaci aufwiesen. Die Vorbehandlung der Präparate nach der operativen Entfernung erfolgte in gleicher Weise wie bei den als Negativkontrollen verwendeten Hamartochondromen. 4.2 Adenoide 42 Präparate von 27 männlichen und 15 weiblichen Kindern im Alter von 1,3 bis 12,0 Jahren (arithmetischer Mittelwert: 4,9 Jahre) wurden mittels PCR und immunfluoreszenzoptischen Methoden sowie 43 Präparate von 27 männlichen und 16 weiblichen Kindern im Alter von 1,3 bis 12,0 Jahren (arithmetischer Mittelwert 4,9 Jahre) mittels immunhistochemischer Methoden auf Chlamydia spp. bzw. Cdp. psittaci untersucht. 4 Material und Methoden 34 Alle verwendeten Proben entstammen dem Eingang der Abteilung für Pathologie der Ruhr Universität Bochum (Leiter: Prof. Dr. K. Morgenroth) im Zeitraum von 2001 bis 2002. Die Operationen wurden in der HNO-Klinik des St. Elisabeth-Hospitals Bochum (Leiter: Prof. Dr. H. Hildmann) durchgeführt, der operative Zugang erfolgt unter Vollnarkose peroral. Die Adenoide wurden mit dem Beckmann-Ringmesser aus dem Nasopharynx herausgeschnitten. Die Operationspräparate wurden sofort in 4%-iger phosphatgepufferter Formalinlösung fixiert und in das Labor transportiert. Dort erfolgte die Weiterbehandlung mittels aufsteigender Alkoholreihe und Xylol (s. o.), sowie die Einbettung in Paraffinwachs und später das Aufziehen auf hochgereinigte Objektträger. Die mit dem Mikrotom angefertigten Schnittpräparate hatten eine Dicke von 3 bis 5 µm. Die PCR-Untersuchungen wurden im Nationalen veterinärmedizinischen Referenzlabor für Psittakose in Jena (Friedrich-Loeffler-Institut, Bundeforschungsinstitut für Tiergesundheit, Leiter Dr. rer. nat. Konrad Sachse) durchgeführt. 4.3 Fetale und adulte Nasopharynx-Proben Als Vergleichskollektive wurden 15 im Alter von 39,6 bis 67,9 Jahren (arithmetischer Mittelwert: 56,8 Jahre) operativ gewonnene Proben aus der Nasopharynx-Schleimhaut erwachsener Patienten mit anderer Operationsindikation als einer nasopharyngealen Hyperplasie, sowie drei Präparate aus dem Gewebe des Nasopharynx von drei fetalen Aborten (19. bis 24. SSW) untersucht. Die Proben aus den Aborten wurden gleichzeitig als Negativkontrolle betrachtet, da ein intrauteriner Kontakt mit Cdp. psittaci unwahrscheinlich ist. Die Operationspräparate wurden in gleicher Weise wie die Adenoide aufgearbeitet. Die mit dem Mikrotom angefertigten Schnittpräparate hatten eine Dicke von 3 bis 5 µm. Alle verwendeten Proben entstammen dem Eingang der Abteilung für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum (Leiter: Prof. Dr. K. Morgenroth) im Zeitraum von 2001 bis 2005. 4 Material und Methoden 4.4 35 Immunhistochemie Die Immunhistochemie macht sich die Spezifität von gegen bestimmte Antigene gerichteter Antikörper zu Nutze, die aus immunisierten Tieren gewonnen werden. Die aus dem Blutserum extrahierten Antikörper werden in der Immunhistochemie gemeinsam mit dem zu untersuchenden Präparat inkubiert, um die Bindung an eventuell vorhandenes Antigen zu ermöglichen. Um gebundene Antikörper sichtbar zu machen, bedienen sich die unterschiedlichen Kits diverser Methoden. Am einfachsten ist es, den gebrauchten Antikörper direkt zu markieren. Dies geschieht mittels eines Enzyms, das eine farbgebende Reaktion katalysiert, die dann lichtmikroskopisch nachgewiesen werden kann. Um eine Verstärkung des Signals herbeizuführen, werden häufig Methoden angewandt, die auf der Bindung sogenannter Sekundärantikörper basieren. Die variablen Sequenzen der Sekundärantikörper binden an die konstanten Regionen der schweren Ketten der Primär-Antikörper (Fc-Fragmente), die konstanten Regionen der schweren Ketten der Sekundärantikörper sind wiederum mit einem Enzym verbunden, das eine farbgebende Reaktion katalysiert. Alternativ kann auch ein Sekundärantikörper ohne Markierung genommen werden, der dann mit einer freien variablen Region einen tertiären Enzym-gekoppelten Antikörper bindet. Der Sekundärantikörper fungiert somit als Bindeglied zwischen dem am Antigen gebundenen primären Antikörper und dem mit dem Enzym bestückten Tertiär-Antikörper (Abb. 4.1). Streptavidin ist ein Molekül mit vier Bindungsstellen, die eine hohe Affinität zu Biotin aufweisen. Koppelt man Biotin an einen Sekundärantikörper und Peroxidase an das Streptavidin, kann man eine Multiplikation des Farbsignal der Peroxidase-Reaktion im Vergleich zur einfachen Markierung des Primärantikörpers erzielen. Die bei den Versuchen benutzten Detektions-Kits basieren entweder auf dem Nachweis von alkalischer Phosphatase (Dako LSAB-System; Carpinteria CA, USA) oder von Peroxidase (Zymed LAB-SA System Histostain-SP Bulk Kit for Broad Spectrum; San Francisco, USA). Die in der Immunhistochemie verwendeten Antikörper sind in Tab. 4.1 dargestellt. 4 Material und Methoden 36 Tabelle 4.1: Übersicht der in der Immunhistochemie verwendeten Primär-Antikörper. nr. chlamydiale antkörper hersteller 1. Mouse anti (Ms-A-) Chlamydia psittaci 73/0200, Immunglobulin G Subklasse 2b (IgG2b); Konzentration 1:250 Firma Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland 2. Ms-A-Chlamydia psittaci (77/05), IgG2b; Konzentration 1:250 Firma Biotrend Chemikalien GmbH, Köln, Deutschland 3. Rabbit (Rb)-A-Chlamydia Lipopolysaccharid (LPS), polyklonales Antiserum; Konzentration 1:500 Firma Biodesign international, Asbach, Deutschland 4. Ms-A-Chlamydia LPS (ACI), IgG3; Konzentration 1:50 und 1:100 Progen Biotechmik GmbH, Heidelberg, Deutschland nr. antikörper gegen zellbestandteile hersteller 5. Ms-A-Cytokeratin (Ck) pan plus, IgG1; Konzentration 1:50 Firma Biocare Medical, Walnut Creek, USA 6. Ms-A-Leukocyte Common Antigene (CD 45), IgG1; Firma Dako Corporation, Konzentration 1:50 Carpinteria, USA 7. Ms-A-CD 68, IgG3; Konzentration 1:50 Firma Dako Corporation, Carpinteria, USA 8. Rb-A-Ck pan, IgG1; Konzentration 1:50 Firma Bio Genex, San Ramon, USA 9. Rb-A-Calreticulin, IgG1 Konzentration 1:1000 Sigma, Deisenhofen, BRD Eingesetzt wurden ein gruppenspezifisches Chlamydia Antiserum (Nr. 3) bzw. ein monoklonaler Antikörper (Nr.4) und zwei verschiedene Clone eines speziesspezifischen AK für Cdp. psittaci (Nr.1 und Nr. 2). Laut Hersteller sind die unter 1. und 2. aufgeführten Antikörper frei von Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydien-Spezies. Das policlonale Antiserum (Nr.3) bindet sowohl an das LPS als auch an das MOMP und reagiert kreuz mit Chl. trachomatis und Cdp. pneumoniae und wurde hauptsächlich zum Screenen der Präparate verwendet. Um valide Ergebnisse zu bekommen, musste zunächst anhand der Negativkontrollen und mittels der durch PCR und TEM nachgewiesen positiven Präparate des Adenoid-Kollektivs eine Vorbehandlung etabliert werden, unter der die Negativkontrollen bei der Markierung mit Primärantikörpern und unter der Verwendung des jeweiligen Kits stets keinen und die durch die anderen Nachweismethoden positiv getesteten Proben immer ein Farbsignal zeigen. 4 Material und Methoden 37 Zunächst musste gewährleistet werden, dass sich bei Inkubation der Präparate ohne Antikörper aber mit Blutserum der Tiere, von denen die Antikörper gewonnen wurden kein positives Signal erzeugen lässt. Dieser spräche für einen unspezifischen Faktor im Tierserum, der einen farbiges Signal erzeugen und somit falsch positive Ergebnisse hervorrufen könnte. Aber auch unspezifische Bindungsstellen im Präparat selbst können zu falsch positiven Ergebnissen führen, weshalb diese eine Maskierung benötigen. Epitope des chlamydialen Antigens können unter Formalinfixierung so verändert werden, dass der gegen sie gerichtete Antikörper nicht mehr in der Lage ist, an sie zu binden. Daraus resultieren falsch negative Ergebnisse, weshalb chlamydiale Bestandteile demaskiert werden müssen. In unserem Falle erwies sich das Erhitzen der Präpartate mit Citrat-Puffer (Firma Bio Cyc GmbH, Luckenwalde, Deutschland) als suffizient. Die Pufferlösung wurde durch Verdünnung des kommerziell erwerblichen Konzentrates auf 1 : 25 mit Aqua dest. hergestellt und besaß einen pH von 6,0. Unter Verwendung diverser Vorbehandlungen und unterschiedlicher Inkubationszeiten ließ sich für das Dako-Kit kein zufriedenstellendes Versuchsprotokoll erstellen, für das Zymed LAB-SA-Kit erwies sich die in Tab. 4.2 dargestellte Anordnung als genügend zuverlässig. Als Negativkontrollen dienten in der Immunhistochemie 1. ein nur mit PBS, 2. ein mit PBS und Substrat, sowie 3. ein mit PBS, Streptavidin und Substrat behandelter Schnitt. Erstgenannter soll eventuelle Verunreinigungen der Pufferlösung aufdecken, sowie eine Beurteilung des endogenen Pigmentgehaltes der vorliegenden Probe ermöglichen, damit bei anschließender Betrachtung der markierten Präparate natürlich vorhandene Farbstoffe besser von tatsächlichen Anfärbungen unterschieden werden können. Negativkontrolle Nummer zwei dient dem Ausschluss von möglichen Farbumschlägen durch Reaktionen des Substrates mit im Gewebe befindlichen (beim Zymed LAB-SA Kit besonders die endogene Peroxidase) oder im Versuch verwandten Substanzen und Enzymen. Der dritte Schnitt soll unspezifische Bindungen des StreptavidinPeroxidase-Komplexes ohne vorherige Bindung des Primärantikörpers aufdecken. Als Positivkontrollen dienten Schnitte, die mit einem gegen einen im vorliegenden Gewebe auf jeden Fall vorhandenen Zellbestandteil gerichteten Primärantikörper nach Versuchsanordnung inkubiert wurden. Zur Verwendung kamen Mouse- und Rabbit-A-Ck pan, Mouse-A-LCA, Mouse-ACD 68 und Rabbit-A-Calreticulin. Alle anderen Schnitte eines Versuchsprotokolls entsprechen der Markierung der Gewebe durch die Bindung der gegen chlamydiale Antigene gerichteten Antikörper. Als positiv wurden nur lichtmikroskopisch erkennbare intrazelluläre, braunrote, granuläre Einschlüsse gewertet. 4 Material und Methoden 38 Zur Durchlichtmikroskopie wurde ein Zeiss Axiophot Mikroskop (Carl Zeiss; Oberkochen, Germany) mit einem “digital imaging system” (Diskus Software; Königswinter, Germany) eingesetzt. Der verwendete Primärantikörper ist ein monoklonaler Mouse-Anti-Cdp. psittaciAntikörper der Firma Biotrend in Köln. Nach Angaben des Herstellers besitzt er keine Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydienspezies, insbesondere nicht mit Cdp. pneumoniae. Der verwendete Mouse-Anti- Cdp. psittaci-Antikörper wurde in einer vorangegangenen Arbeit mittels IHC auf evtl. vorhandene Kreuzreaktivitäten, insbesondere mit Cdp. pneumoniae getestet. Hierbei konnte keine Kreuzreaktivität nachgewiesen werden [9, 19, 105]. Auch seitens der Herstellerfirma existieren Daten, in denen keine Kreuzreaktivität mit anderen Chlamydiales nachgewiesen werden konnte. Tabelle 4.2: Versuchsprotokoll Immunhistochemie. nr. Schritt 1 2 3 4 5 6 7 8 Entparaffinierung: 50 min in Xylol 10 min in 100%igem Ethanol 10 min in 95%igem Ethanol 10 min in 70%igem Ethanol 10 min in 50%igem Ethanol 10 min in 30%igem Ethanol 10 min in destilliertem Wasser 20 min Spülung in Phosphate Buffered Saline (PBS; Firma Sigma Diagnostics, Deisenhofen, BRD) Blockierung und Demaskierung: 9 Erhitzen (nicht Kochen) der Präparate im Citratpuffer-Bad für 4-mal 5 min in der Mikrowelle bei 300 Watt. 10 Abkühlen der Schnitte für 20 min 11 10 min Spülung in PBS 12 20 min in 1,8%igem Wasserstoffperoxid 13 10 min Spülung in PBS 14 Umkreisen der Präparate auf den Objektträgern mit dem Fettstift, vorsichtiges Abklopfen und Ablage in eine feuchte Kammer 15 Blockierung mit 2% Slim Fast (w/v) und Goat-Normalserum (Firma Dako A/S, Hamburg) 1 zu 100, verdünnt mit PBS für 45 min bei Raumtemperatur 16 10 min Spülen in PBS 17 Aufbringen von wenigen Tropfen 10%igen Non-immune-goat-Serums (erstes Reagenz des Zymed LAB-SA-Kits) und Inkubation für 10 min 18 Aufbringen des Primärantikörpers in der entsprechenden Konzentration (siehe AK-Tabelle) und Inkubation für 75 min bei 37 °C 19 10 min Spülen in PBS 20 Aufbringen vom biotinylierten Sekundärantikörper goat anti mouse, rabbit, guinea pig, rat IgG (zweites Reagenz des Zymed LAB-SA Kits) und 10 min Inkubation 21 10 min Spülen in PBS 22 10 min Inkubation mit dem Streptavidin-Peroxidase-Konjugate (drittes Reagenz des Zymed LAB-SA Kits) 23 Mischen und Aufbringen des Chromogens (viertes Reagenz des Zymed LAB-SA Kits, entspricht 1 ml aqua dest. + 1 Trpf. Substratpuffer + 1 Trpf. Chromogenlösung + 1 Trpf. HydrogenperoxidLösung) und Inkubation 15 min 24 10 min Spülen in PBS 25 Kernfärbung mit Hämatoxylin-Blau (Mayers Hämalaunlösung, Firma Merck, Darmstadt, Deutschland) für 20 sek. 26 sorgfältiges Spülen in Leitungswasser 27 Eindecken der Präparate mittels Kaisers Glyceringelatine (Firma Merck, Darmstadt) und Deckgläsern 4 Material und Methoden thoden 40 Das Prinzip der Immunhistochemie Peroxidase Sekundärantikörper Primärantikörper Chlamydia Abbildung 4.1: Schematische Darstellung des Prinzips einer immunhistochemischen Markierung mittels Primär- und Sekundärantikörpern (© Jochen Gerhardt 2007). 4 Material und Methoden thoden 4.5 41 Immunfluoreszenz Der Nachweis von Chlamydien mittels Immunfluoreszenz basiert wie auch die Immunhistochemie auf der Bindung von Antikörpern an spezifische Epitope. Allein das Sichtbarmachen der Bindung basiert auf einem anderen Prinzip. In unseren Versuchen wurde das Prinzip der indirekten Immunfluoreszenz genutzt, bei dem im Gegensatz zur direkten, wo der Fluoreszenzfarbstoff direkt an den Primärantikörper gekoppelt ist, gegen FcAnteile des Primärantikörpers gerichtete Sekundärantikörper verwandt werden. An diese ist dann das Fluorochrom gekoppelt, so dass eine Vervielfachung der Intensität der Leuchtkraft im Präparat erreicht werden kann (Abb. 4.2). Das Prinzip der Immunfluoreszenz Fluorochrom Sekundärantikörper Primärantikörper Chlamydia Abbildung 4.2: Schematische Darstellung des Prinzips einer immunfluoreszenzoptischen Markierung mittels Primär- und Sekundärantikörpern (© Jochen Gerhardt 2007). 4 Material und Methoden 42 Die in der Immunfluoreszenz verwendeten Primärantikörper entsprachen auch in der verwendeten Konzentration denen aus den IHC-Versuchen (siehe Tab. 4.1). Zusätzlich kamen die in Tab. 4.3 aufgeführten Antikörper zum Einsatz. Allerdings zeigte das Versuchsprotokoll bzgl. der zusätzlich verwendeten Primärantikörper eine nur unzureichende Verlässlichkeit. Tabelle 4.3: Übersicht der in der Immunfluoreszenz zusätzlich verwendeten Primärantikörper. nr. chlamydiale primärantikörper hersteller 1. Ms-A-Chlamydia (502), IgG1; Konzentration 1:250 Progen Biotechnik GmbH Heidelberg, Deutschland 2. Ms-A-Chlamydia pneumoniae MOMP, IgG3; Konzentration Biotrend Chemikalien GmBH, 1:250 Köln, Deutschland Die in der Immunfluoreszenz verwendeten Antikörperfragmente (Sekundärantikörper) sind in der folgenden Tabelle aufgelistet und wurden in der Konzentration 1 zu 250 eingesetzt (Tab. 4.4). Tabelle 4.4: Übersicht der in der Immunfluoreszenz verwendeten Sekundärantikörper. nr. sekundärantikörper 1. 594 F(ab’)2 von Goat-Anti-Mouse-IgG2b 2. 488 F(ab’)2 von Goat-Anti-Mouse-IgG1 3. 594 F(ab’)2 von Goat-Anti-Mouse-IgG1 4. 488 F(ab’)2 von Goat-Anti-Mouse-IgG2b 5. 594 F(ab’)2 von Goat-Anti-Rabbit-IgG 6. 488 F(ab’)2 von Goat-Anti-Rabbit-IgG Alle Sekundäranktikörper bzw. Antikörperfragmente stammen von der Firma Molecular-Probes Inc. (Leiden, Niederlande). Den Fragmenten fehlt der Fc-Teil der Antikörper, da dieser unspezifische Bindungen, insbesondere mit Fc-Rezeptoren eingehen kann und somit falsch positive Signale verursacht. An jedes Fragment sind 2–6 fluoreszierende 4 Material und Methoden 43 Partikel gekoppelt, die unterschiedliche Absorptions- und Emissionsmaxima in Bezug auf die Wellenlänge des Lichtes aufweisen. Die mit 594 gekennzeichneten Antikörper besitzen ein Absorptionsmaximum bei 590 nm und ein Emmissionsmaximum bei 617 nm, erscheinen dem menschlichen Auge also als rotes Licht. Die mit 488 gekennzeichneten Antikörper besitzen ein Absortionsmaximum bei 495 nm und ein Emmissionsmaximum bei 519 nm, erscheinen dem menschlichen Auge als grün. Die Fluoreszenzmarkierungen wurden als Dreifachfärbung mit einem chlamydialen und einem zellspezifischen Primärantikörper und unter zusätzlicher Verwendung des DNA-Farbstoffes DAPI mit einem Absorptionsmaximum bei 358 nm und einem Emmissionsmaximum bei 461 nm (erscheint in den Bildern als blau-violett) durchgeführt. Für die Immunfluoreszenz war eine Veränderung des IHC-Versuchsprotokolls von Nöten, um genügend valide Ergebnisse zu erhalten. Die Veränderung des Versuchsprotokolls wird in Kap. 4.6 dargelegt. Die in Tab. 4.5 angeführte Versuchsanordnung ergab zuverlässige Ergebnisse für die Immunfluoreszenz. Vor der ersten Betrachtung wurden die Präparate für zwei Stunden im Kühlschrank bei 4 °C gelagert. Für spätere Betrachtungen wurden die fertigen Präparate unter Lichtabschluss ebenfalls im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt. Als Negativkontrollen dienten in der Immunfluoreszenz ein nur mit PBS behandelte, sowie mit PBS und Sekundärantikörper behandelte Schnitte. Erstgenannte wurden zur Beurteilung der Eigenfluoreszenz der Gewebe sowie der verwandten Materialien herangezogen, letztgenannte dienten zum Ausschluss der direkten Bindung der Sekundärantikörper an Gewebsbestandteile ohne vorherige Markierung durch den Primärantikörper. Positivkontrollen waren nicht nötig, da die mit gegen Chlamydien gerichteten Antikörpern behandelten Präparate auch immer eine Doppelmarkierung mit einem gegen Zellbestandteile gerichteten Antikörper erhielten. Als positiv wurden nur intrazelluläre, granuläre und in der laut Versuchsprotokoll richtigen Farbe fluoreszierende Signale gewertet. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurde ein Olympus IX 70 (Olympus; Hamburg, Germany) Mikroskop benutzt. Das Mikroskop arbeitet dem Prinzip der Auflichtmikroskopie. Hierbei wird das Präparat durch das Objektiv, das gleichzeitig als Kondensor fungiert, beleuchtet. Mittels einzelner Filter werden unterschiedliche Wellenlängen als Anregungslicht eingesetzt und setzten fest, welche emmitierten Wellenlängen zum Okular gelangen. Verschieden Filter und dichrotische Spiegel können in Kombination geschaltet werden, so dass entweder nur blaues, nur grünes oder nur rotes Licht zum Oku- 4 Material und Methoden 44 lar weitergeleitet werden. Die Filterkombinationen werden in Blöcken zusammengesetzt, die sich mit einem Revolver austauschen lassen. 4 Material und Methoden Tabelle 4.5: Versuchsprotokoll Immunfluoreszenz. nr. schritt Entparaffinierung: 1 50 min in Xylol 2 10 min in 100%igem Ethanol 3 10 min in 95%igem Ethanol 4 10 min in 70%igem Ethanol 5 10 min in 50%igem Ethanol 6 10 min in 30%igem Ethanol 7 10 min in destilliertem Wasser 8 20 min Spülung in Phosphate Buffered Saline (PBS, Firma Sigma Diagnostics, St. Louis, USA) Blockierung und Demaskierung: 9 Erhitzen (nicht Kochen) der Präparate im Citratpuffer-Bad für 4-mal 5 min in der Mikrowelle bei 300 Watt 10 Abkühlen der Schnitte für 20 min 11 10 min Spülung in PBS 12 Umkreisen der Präparate auf den objektträgern mit dem Fettstift, vorsichtiges Abklopfen und Ablage in eine feuchte Kammer 13 Blockierung mit 2 % Slim Fast (w/v) und Goat-Normalserum (Firma Dako A/S, Dänemark) 1 zu 50, verdünnt mit PBS für 60 min bei Raumtemperatur 14 10 min Spülen in PBS 15 Aufbringen des/der Primärantikörper(s) in der entsprechenden Konzentration und Inkubation über Nacht (für 10 h) bei 4 °C 16 10 min Spülen in PBS 17 Aufbringen des/der Sekundärantikörper(s) und 60 min Inkubation bei 37 °C 18 10 min Spülen in PBS 19 Aufbringen von DAPI (4’6’ Diamino-2-Phenylindol; Firma Sigma Diagnostics, St. Louis, USA)-Kernfärbung und 30 min Inkubation bei 37 °C 20 10 min Spülen in PBS 21 Eindecken der Präparate mittels Kaisers Glyceringelatine und Deckgläsern 45 4 Material und Methoden 4.6 46 Etablierung der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Färbemethoden Um eine ausreichend hohe Sensitivität bzgl. der Detektion der chlamydialen Anti- gene zu erzielen und Niederschläge durch unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern, musste zunächst ein Protokoll zur Anfärbung der Präparate etabliert werden. Anfangs wurden die Seren der Ursprungstiere der Primärantikörper darauf getestet, ob in ihnen befindliche Immunglobuline Bindungen mit Antigenen des humanen Lungen- und Adenoidgewebes eingehen, welches zu unspezifischen Markierungen führen könnte. In der zunächst verwendeten APAAP-Methode zeigte sich, dass ohne Vorbehandlung das Gewebe unspezifische Markierungen aufwies. 4.6.1 Immunhistochemie Um unspezifische Bindungsstellen im Präparat zu blockieren, wurden die Präparate nach Entparaffinisierung mit bovinem Serumalbumin (BSA) in mehreren Konzentrationen (5 – 50% w/v) sowie unterschiedlichen Zeiten (30 und 60 min bei Raumtemperatur bzw. 10h bei 4°C) vorinkubiert. Zudem wurden Esel-Normal-Serum (Konzentrationen 1 zu 500 bis 1 zu 10; 30min bei Raumtemperatur (RT) sowie Trypsin als Alternativen untersucht. Hierbei traten jedoch weiterhin ungewollte Markierungen auf. In einer zweiten Versuchsreihe wurde mit der ABC-Methode in gleicher Weise nach einem Markierungsprotokoll gesucht. Nach Austestung der verschiedenen Substanzen bei unterschiedlichen Temperaturen und mit unterschiedlichen Inkubationszeiten fanden sich in der lichtmikroskopischen Untersuchung bei einer Blockierung mit 2% Slim Fast® in PBS mit Ziegen-Normalserum in einer 1 zu 50 Verdünnung in PBS bei 30 min. Inkubationszeit bei Raumtemperatur keine ungewollten Markierung mehr. In einer dritten Versuchsreihe wurden die Primärantikörper Mouse-Anti- Cdp. psittaci bzw. Rabbit-Anti-Chlamydia-LPS in der ABC-Methode ausgetestet. Es wurden die Protokolle genutzt, die bereits für die Normalseren ausgetestet worden waren. Auch hierbei kam Gewebe von Chondroharmatomen und Adenoiden zum Einsatz, die bereits in der PCR und TEM für Chlamydien negativ war. Ziel dieser Reihe war es sicher zu stellen, dass die Primärantikörper Mouse-Anti-Cdp. psittaci bzw. Rabbit-AntiChlamydia-LPS unter der etablierten Methode keine falsch positiven Markierungen ver- 4 Material und Methoden 47 ursachten. Unter der etablierten Vorbehandlung waren keine falsch positiven Signale nachweisbar. Nachdem die Primärantikörper in Fällen, die in der PCR und der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchung negativ auf das Vorhandensein von Chlamydien getestet waren keine unspezifischen Bindungen eingingen, wurden diese nun nach gleichem Protokoll an Proben, die in der TEM positiv auf Chlamydien und in der PCR positiv auf Cdp. psittaci getestet wurden eingesetzt. Hierbei traten zunächst keine Markierungen von chlamydialen Einschlüssen auf. Da die Präparate jedoch mit anderen Methoden für Chlamydien positiv getestet waren, schien es, dass die Sensitivität des benutzten Protokolls nicht hoch genug war. Um diese zu steigern wurde die Inkubationszeit des Primärantikörpers verlängert (von 30 auf 60 min. bei RT) sowie die Präparate in der Mikrowelle in einem Citratpuffer zu 3 x 5 min. erhitzt. Die Erhitzung in einem Citratpuffer führte zum gewünschten Erfolg. Gleichzeitig wurde dieses Protokoll nocheinmal an PCR- und TEM-negativen Chondrohamartomfällen getestet, ohne das unspezifische Bindungen auftraten. 4.6.2 Immunfluoreszenz Das für die Immunhistochemie etablierte Protokoll wurde auch zur Vorbehandlung der Präparate für die Immunofluoreszenz angewandt, bei dem sich die Inkubationszeiten der Primärantikörper als zu kurz erwiesen und neu etabliert werden mussten. Als Positivkontrollen wurden auch hier die bereits in der IHC verwandten Proben aus Adenoiden verwendet, die in der PCR und der TEM positiv auf Cdp. psittaci getestet wurden. Bei einer Inkubationszeit von 10h bei 4°C führte sie zum gewünschten Erfolg. Auch das neue Protokoll zeigte bei der ergänzend durchgeführten Testung an den Chondrohamartom-Präparaten keine unspezifischen Signale. 4.7 PCR Teile der operierten adenoiden Vegetationen wurden direkt nach der Entnahme auf -80°C heruntergekühlt und bei gleicher Temperatur gelagert. Die Untersuchung der Proben an sich geschah im Nationalen veterinärmedizinischen Referenzlabor für Psittakose in Jena (Friedrich-Loeffler-Institut, Bundeforschungsinstitut für Tiergesundheit, Leiter Dr. rer. nat. Konrad Sachse). Die DNA wurde mittels des High Pure PCR 4 Material und Methoden 48 Template Preparation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers extrahiert. 5 µl des DNA-Extraktes wurden als Probe in der PCR verwendet. Die Proben wurden auf das Vorhandensein von Cdp. psittaci mittels einer modifizierten Version der nested PCR dem Schema von Kaltenboeck et al. folgend untersucht [52, 91]. Die im ersten Schritt verwendeten Primer detektieren das ompA Gen im Genom der Chlamydiae und stehen somit für eine genusspezifische Amplifikation der DNA. Die Sequenz der verwendeten Primer lautet 191CHOMP (5'-GCI YTI TGG GAR TGY GGI TGY GCI AC-3') und CHOMP371 (5'-TTA GAA ICK GAA TTG IGC RTT IAY GTG IGC IGC-3'). Für die zweite Amplifikation benutzten wir 1 µl des Produktes der genussepzifischen PCR und die Primer-Kombination 218PSITT (5'-GTA ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG-3')/CHOMP336s (5'-CCR CAA GMT TTT CTR GAY TTC AWY TTG TTR AT-3') für Cdp. psittaci. Die Größe der spezifischen Amplifikate betrug nach der ersten Amplifikation 576 bis 597 Basenpaare und nach der für Cdp. psittaci spezifischen nested-PCR 389 bis 404 Basenpaare. Das detaillierte Protokoll der Untersuchung wurde zuvor von Sachse und Hotzel publiziert [91]. 1. Die genusspezifische Detektion der Chlamydiae Die Reagenzienlösung für den ersten Amplifikationsprozess enthielt pro 50 µl: 1 µl dNTP mix (je 2 mM), 1 µl Primer 191CHOMP (20 pmol/µl), 1 µl Primer CHOMP371 (20 pmol/µl), 5 µl Pufferlösung (10× verdünnt), 0.2 µl Taq-DNAPolymerase (5 U/µl), 40.8 µl Wasser. In jedes Reaktionsgefäß kam zusätzlich 1 µl des aus dem infizierten Gewebe gewonnenen DNA-Extraktes. Zudem wurden als Kontrolle der richtig durchgeführten Amplifikation (Positivkontrolle) die DNA eines ReferenzChlamydienstammes und Wasser als Negativkontrolle anstelle einer Gewebeprobe eingesetzt. Die PCR wurde unter folgendem Temperatur- und Zeit-Profil durchgeführt: Initiale Denaturierung bei 95°C für 30 s, 35 Zyklen der Denaturation (95°C für 30 s), Anheftung der Primer (50°C für 30 s) und Verlängerung der Primer (72°C für 30 s). Bei richtiger Durchführung sollten sich Amplifiaktionsprodukte mit einer Größe von 576– 597 Basenpaaren, spezifisch für den Genus Chlamydia (nach der neuen Taxonomie: Chlamydia and Chlamydophila nach Tab. 3.1) ergeben. 2. Speziesspezifische Detektion von Chlamydophila psittaci: Die Reagenzienlösung für den zweiten Amplifikationsprozess enthielt pro 50 µl: 1 µl dNTP mix (je 2 mM), 1 µl Forward-Primer 218PSITT + 1 µl Reverse-Primer CHOMP336s (je 20 pmol/µl), 5 µl Pufferlösung (10× verdünnt), 0.2 µl Taq-DNA- 4 Material und Methoden 49 Polymerase (5 U/µl), 40.8 µl Wasser. In jedes Reaktionsgefäß wurde 1 µl der extrahierten DNA aus den Proben zugefügt. Zusätzlich wurden je 1 µl der Lösungen von Positiv- und Negativkontrolle des ersten Amplifikationsprozesses auch im zweiten Zyklus der PCR nach dem u.a. Protokoll verwendet. Zudem wurden nach dem Prinzip des im ersten Schritt beschriebenen Verfahrens zusätzlich frische Negativ- und Positivkontrollen angesetzt. Die PCR wurde unter folgendem Temperatur- und Zeit-Profil durchgeführt: Initiale Denaturation bei 95°C für 30 s, 35 Zyklen der Denaturation (95°C für 30 s), Anheftung der Primer (60°C für 30 s) und Verlängerung der Primer (72°C für 30 s). Bei richtiger Durchführung sollten sich Amplifiaktionsprodukte mit einer Größe von 389–404 Basenpaaren, spezifisch für Chlamydophila psittaci (nach der neuen Taxonomie: Chlamydia and Chlamydophila nach Tab. 3.1) ergeben. 3. DNA Sequenzierung: Für die Identifikation der vorliegenden Spezies wurden die nach dem ersten Schritt der PCR erhaltenen DNA- Sequenzen mittels des Primers 201CHOMP and CHOMP336s nochmals amplifiziert. Die in der Elektrophorese ersichtlichen spezifischen Banden wurden aus dem Agarosegel (1%) herausgeschnitten und die DNA mittels des QIAquick Gel Extraktions-Kits (Firma QIAGEN, Hilden, Germany) extrahiert. Vor der Prozessierung mittels des ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), wurde die extrahierte DNA unter der Verwendung der o.a. Primer mittels des BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) vervielfältigt. Die mittlere Länge der erhaltenen DNA-Sequenzen betrug 400 Nukleotide. Sequenzierung und Analysierung der erhaltenen Bruchstücke erfolgte unter Einsatz der Vector NTI Suite 8.0 Software (Informax Inc., Oxford, UK). 4.8 Patientenbefragung Unter den Eltern der Patienten, die der Adenoidektomie zugeführt wurden, führten wir eine Befragung bezüglich des Kontaktes zu möglichen Überträgern von Chlamydien durch. Die an die Eltern der Patienten gestellten Fragen sind in Tab. 4.6 aufgelistet. Tabelle 4.6: Fragebogen bzgl. des möglichen zoonotischen Potentials einer Infektion mit Cdp. psittaci. nr. frage 1 Werden oder wurden in Ihrem Haushalt Vögel als Haustiere gehalten? 1.1 Wenn ja, welche Vögel sind dieses? 1.2 Wenn ja, wie lange sind diese schon bei Ihnen? 1.3 Ist schon mal ein Tier gestorben oder an der Papageienkrankheit erkrankt? 2 Halten oder hielten Sie Vögel oder Geflügel in Aussenvolieren oder Verschlägen? 2.1 Wenn ja, welche Vögel sind dieses? 2.2 Wenn ja, wie lange sind diese schon bei Ihnen? 3 Besuch(t)en Sie (oder Ihr Kind) Freunde oder Verwandte, die Vögel halten? 3.1 Wenn ja, welche Vögel sind dieses? 3.2 Wenn ja, wie oft tun Sie dies? 4 Fütter(t)en Sie (oder Ihr Kind) Tauben oder andere freilebende Vögl oder habe Sie dies getan, bzw. haben Sie anderweitig Kontakt zu solchen Tieren (Stadttauben am Haus oder unterwegs)? 4.1 Wenn ja, welche Vögel sind dieses? 4.2 Wenn ja, wie oft tun Sie dies? 5 Befindet/befand sich in Ihrer Nähe eine Vogelhaltung (Taubenschlag, Geflügelfarm, Vogelstation)? 5.1 Wenn ja, welche Vögel? Ggf. nähere Umstaände der Situation: 6 Arbeiten oder arbeiteten Sie oder ein Mitglied der Familie in einem Zoo, einem Zoogeschäft oder einer Geflügelschlachterei, bzw. führen Sie Hausschlachtungen von Geflügel durch? 6.1 Wenn ja, welcher Tierkontakt besteht? Nähere Umstände (ggf. Todefälle oder Erkrankungen der Tiere) bitte angeben. 7 Haben/hatten Sie (oder Ihr Kind) Kontakt mit anderen Haus- oder Nutztieren? 7.1 Wenn ja, welche Tiere sind dies? Geben Sie nähere Umstände an. 5 Ergebnisse 5.1 Immunhistochemische und immunfluoreszenzoptische Untersuchung der Kollektive Die Auswertung aller Versuche erfolgte mittels der Vierfeldertafelanalyse, sowie dem exakten Fisher-Test. 5.1.1 Adenoide vs. fetale und adulte Nasopharynxproben mittels Immunhistochemie Tabelle 5.1: Vergleich von Adenoiden, fetalen und adulten Nasopharynxproben anhand der Immunhistochemie. Chlamydophila psittaci negativ Fetale Nasopharynxproben Chlamydophila psittaci positiv summe 3 (100 %) 0 (0 %) 3 Adenoide 06 (13,95 %) 37 (86,05 %) 43 Adulte Nasopharynxproben 12 (80,00 %) 3 (20,00 %) 15 Summe 21 (34,43 %) 40 (65,57 %) 61 Für den Vergleich von Adenoiden und den adulten Nasopharynxproben ergab sich für den exakten Fisher-Test ein p-Wert von < 0,001 [Tab. 5.1 und Abb. 5.1 bis 5.5]. Für den Vergleich von Adenoiden und fetalem Vergleichskollektiv ergab sich für den exakten Fisher-Test ein p-Wert von 0,006. 5 Ergebnisse Abbildung 5.1: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphollikeln (blaue Pfeile). Vergrößerung 200×. Abbildung 5.2: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400×. 52 5 Ergebnisse 53 Abbildung 5.3: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400×. 5 Ergebnisse Abbildung 5.4: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, gelbe Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400×. Abbildung 5.5: Fetales immunologisches Gewebe aus dem Nasopharynx. Kein immunhistochemischer Nachweis von Chlamydien (Markierung mit MouseAnti-Cdp. psittaci 73/0200) in Epithelien (rote Pfeile) und dem darunter liegenenden immunologischen Gewebe (blaue Pfeile). Vergrößerung 400×. 54 5 Ergebnisse 5.1.2 55 Adenoide vs. Vergleichskollektive mittels Immunfluoreszenz Tabelle 5.2: Vergleich von Adenoiden, fetalen und adulten Nasopharynxproben anhand der Immunfluoreszenz. Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe Fetale Nasopharynxproben 3 (100 %) 0 (0 %) 3 Adenoide 8 (19,05 %) 34 (80,95 %) 42 Adulte Nasopharynxproben 12 (80,00 %) 3 (20,00 %) Summe 23 15 (38,33 %) 37 (71,67 %) 60 Für den Vergleich von Adenoiden und den adulten Nasopharynxproben ergab sich im exakten Fisher-Test ein p-Wert von < 0,001 [Tab. 5.2 und Abb. 5.6 und 5.7]. Für den Vergleich von Adenoiden und den fetalen Nasopharynxproben ergab sich im exakten Fisher-Test ein p-Wert von 0,012. Abbildung 5.6: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Immunfluoreszenzoptischer Nachweis. Vergrößerung 600×. 5 Ergebnisse 56 Abbildung 5.7: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, orange Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. Immunfluoreszenzoptischer Nachweis. 5.1.3 Adenoide: Immunfluoreszenz vs. Immunhistochemie Tabelle 5.3: Vergleich der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Präparate der Adenoide untereinander. Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe Adenoide IHC 6 (13,95 %) 37 (86,05 %) 43 Adenoiden IF 8 (19,05 %) 34 (80,95 %) 42 14 (16,47 %) 71 (83,53 %) 85 Summe Für den Vergleich der Nachweise von Cdp. psittaci in Adenoiden mittels Immunhistochemie und Immunfluoreszenz ergab der exakte Fisher-Test zeigte einen p-Wert von 0,571 [Tab. 5.3 und Abb 5.8 bis 5.9]. 5 Ergebnisse Abbildung 5.8: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in immunologischen Zellen eines Lymphfollikels. Vergrößerung 400×. Abbildung 5.9: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) bei Gegenmarkierung von Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 57 5 Ergebnisse 58 Zudem erfolgte der Vergleich der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Methoden mit der PCR. 5.1.4 Adenoide: Immunhistochemie vs. PCR Tabelle 5.4: Vergleich der Ergebnisse von immunhistochemischem Nachweis und der Detektion von Cdp. psittaci durch PCR. Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe Adenoide IHC 6 (13,95 %) 37 (86,05 %) 43 Adenoide PCR 39 (90,70 %) 4 (9,30%) 43 Summe 45 (52,33 %) 41 (47,67 %) 86 Der exakte Fisher-Test lieferte für den Vergleich der Nachweise von Cdp. psittaci in Adenoiden mittels PCR und Immunhistochemie einen p-Wert von < 0,001 [Tab. 5.4 und Abb 5.10 und 5.11]. Tabelle 5.5: Vergleich der Ergebnisse der Detektion von Cdp. psittaci und Cdp. pnuemoniae durch PCR. Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe PCR Cdp. psittaci 39 (90.70 %) 4 (9,30 %) 43 PCR Cdp. pneumoniae 43 (100 %) 0 (0%) 43 Summe 82 (95,35%) 4 (4,65 %) 86 Der Nachweis von Cdp. pneumoniae mittels der PCR gelang in keiner der untersuchten Proben (Tab. 5.5). 5 Ergebnisse Abbildung 5.10: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.11: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien. Vergrößerung 400×. 59 5 Ergebnisse 5.1.5 60 Adenoide: Immunfluoreszenz vs. PCR Tabelle 5.6: Vergleich der Ergebnisse von immunfluoreszenzoptischem Nachweis und der Detektion von Cdp. psittaci durch PCR. Chlamydophila psittaci negativ Adenoide IF Chlamydophila psittaci positiv summe 8 (19,05%) 34 (80,95 %) 42 Adenoiden PCR 39 (90,70 %) 4 (9,30 %) 43 Summe 47 (55,29 %) 38 (44,71 %) 85 Der exakte Fisher-Test lieferte für den Vergleich der Nachweise von Cdp. psittaci in Adenoiden mittels PCR und Immunfluoreszenz einen p-Wert von < 0,001 [Tab. 5.6 und Abb 5.12 und 5.13]. Abbildung 5.12: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 5 Ergebnisse 61 Abbildung 5.13: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Makrophagen (Mouse-Anti-CD-68 grün, grüne Pfeile).Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 5.1.6 Geschlechtsspezifität Geschlechtsspezifische Unterschiede beim Nachweis von Cdp. psittaci in Adenoiden fanden sich weder in der Immunfluoreszenz (Tab. 5.7) noch in der Immunhistochemie (Tab. 5.8). Tabelle 5.7: Geschlechtsspezifischer Unterschied in der Immunfluoreszenz. Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe Männlich 4 (14,29 %) 24 (85,71 %) 28 Weiblich 3 (21,43 %) 11 (78,57 %) 14 Summe 7 (7,14 %) 35 (92,86 %) 42 Der exakte Fisher-Test zeigte einen p-Wert von 0,668 im Vergleich der Geschlechter beim immunhistochemischen Nachweis von Cdp. psittaci in Adenoiden. 5 Ergebnisse 62 Tabelle 5.8: Geschlechtsspezifischer Unteschied in der Immunhistochemie. Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe Männlich 5 (17,24 %) 24 (82,76 %) 29 Weiblich 2 (14,29 %) 12 (85,71 %) 14 Summe 7 (16,28 %) 36 (83,72 %) 43 Der exakte Fisher-Test zeigte einen p-Wert von 1,000 im Vergleich der Geschlechter beim immunfluoreszenzoptischen Nachweis von Cdp. psittaci in Adenoiden. 5.2 Nachweis von Cdp. psittaci in Makrophagen, Lymphozyten und Epithelien In ausgewählten Präparaten, in denen sich aufgrund der Zellmorphologie und Anordnung im Gewebe in den Screening-Versuchen der Verdacht auf eine Infektion immunologischer Zellen ergab, erfolgte zur Verifizierung eine immunfluoreszenzoptische Markierung mit spezifischen Zellmarkern. Hierbei konnte Cdp. psittaci in Makrophagen [Abb. 5.13, Abb. 5.17, Abb. 5.25] (durch Markierung des CD 68) und Lymphozyten [Abb. 5.14, Abb. 5.21, Abb. 5.23, Abb. 5.27, Abb. 5.28] (durch Markierung des CD 45) nachgewiesen werden. Ergänzend erfolgte auch der Nachweis in Epithelien, wobei ein Befall insbesondere vom Zilienpithel nachgewiesen werden konnte [Abb. 5.15, Abb. 5.16, Abb. 5.18 bis Abb. 5.20, Abb. 5.22 bis 5.24, Abb. 5.26, Abb. 5.29 bis 5.31]. Abb. 5.6 zeigt eine deutliche, Abb. 5.22 eine leichte Plattenepithelmetaplasie. Abb. 5.23 zeigt eine Übergangsepithelmetaplasie. In sechs von sieben (85,70 %) untersuchten CD 68 positiven Präparaten gelang der Nachweis des Cdp. psittaci-Antigens im Sinne eines intrazellulären Signals [Tab. 5.8]. Zudem wiesen alle sieben Präparate (100 %), in denen eine Lymphozytenmarkierung mittels CD 45 erfolgte ein positives Signal bzgl. des Cdp. psittaci-Antigens auf [Tab. 5.8]. 5 Ergebnisse 63 Tabelle 5.9: Vergleich der Ergebnisse von immunfluoreszenzoptischem Nachweis von Cdp. psittaci in Makrophagen (CD 68) und Lymphozyten (CD 45). Chlamydophila psittaci negativ Chlamydophila psittaci positiv summe CD 68 1 (14,30 %) 6 (85,70 %) 7 CD 45 0 (0 %) 7 (100 %) 7 Summe 1 (7,14 %) 13 (92,86 %) 14 Abbildung 5.14: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 5 Ergebnisse Abbildung 5.15: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 64 5 Ergebnisse Abbildung 5.16: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.17: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-CD-68 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 65 5 Ergebnisse Abbildung 5.18: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.19: Material aus adultem Nasopharyngewebe. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 66 5 Ergebnisse Abbildung 5.20: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. Abbildung 5.21: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyzen (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 67 5 Ergebnisse Abbildung 5.22: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 68 5 Ergebnisse Abbildung 5.23: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) bei Gegenmarkierung von Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. Abbildung 5.24: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 69 5 Ergebnisse Abbildung 5.25: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Makrophagen (Mouse-Anti-CD-68 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.26: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 70 5 Ergebnisse Abbildung 5.27: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.28: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Lymphozyten (Mouse-Anti-CD-45 grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600×. 71 5 Ergebnisse Abbildung 5.29: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien und im darunter liegeneden Gewebe (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. Abbildung 5.30: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 72 5 Ergebnisse 73 Abbildung 5.31: Material aus kindlichen Adenoiden. Genusspezifischer Chlamydiennachweis (Mouse-Anti-Cdp. psittaci 73/0200 rot, rote Pfeile) in Epithelien (Mouse-Anti-Cytokeratin-pan grün, grüne Pfeile). Vergrößerung 600× mit Detailvergrößerung. 5.3 Zusammenfassung Cdp. psittaci ist ein in kindlichen Adnoiden häufig anzutreffender Mikroorganismus. Mit immunhistochemischen Methoden gelingt der Nachweis in 86,05 % (37 von 43), mittels Immunfluoeszenz in 80,95 % (34 von 42) der Fälle. Das nicht hyperplastische lymphoepitheliale Nasopharynx-Gewebe des Vergleichskollektivs zeigte lediglich in 20,0 % (3 von 15) einen Befall mit Cdp. psittaci sowohl in der Immunhistochemie als auch in der Immunfluoreszenz. Die Auswertung der Ergebnisse mittels Vierfeldertafel-Analyse und des exakten Fisher-Tests zeigte signifikante Befunde beim Vergleich der Ergebnisse von Adenoiden und dem Vergleichskollektiv sowohl in Bezug auf die Immunhistochemie (p < 0,001) als auch auf die Immunfluoreszenz (p < 0,001). Das heisst, Cdp. psittaci wird im Vergleich mit normalem Nasopharynxgewebe überzufällig häufig in Rachenmandelhyperplasien gefunden. In als zweites Vergleichskollektiv eingesetzen fetalen nasopharyngealen Proben konnte Cdp. psittaci weder mit der Immunhistochemie (0 von 3) noch mit der Immunfluoreszenz (0 von 3) nachgewiesen werden. In der Vierfeldertafel-Analyse ergab sich im 5 Ergebnisse 74 Vergleich mit den Ergebnissen vom adenoidalen Gewebe ein p-Wert von 0,006 nach dem exakten Fisher-Test für die Immunhistochemie, sowie ein p-Wert von 0,012 nach dem exakten Fisher-Test für die Immunfluoreszenz. In der Gegenüberstellung von Immunhistochemie und Immunfluoreszenz mittels Vierfeldertafelanalyse zeigte sich im exakten Fisher-Test kein signifikanter Unterschied (p-Wert von 0,571). In der PCR zeigten sich lediglich 9,30 % (4 von 43) der Präparate positiv für Cdp. psittaci. Beim Vergleich dieses Wertes mit denen von Immmunhistochemie und Immunfluoreszenz zeigten sich signifikante Unterschiede bezüglich der Detektion von Cdp. pittaci (p-Wert jeweils < 0,001). 5.4 Ergebnisse der Umfrage Bei lediglich durchwachsenem Rücklauf der Fragebögen (25 von 43, 58,14 %) fand sich kein eindeutiger Hinweis auf eine Übertragung von Cdp. psittaci durch wildlebende oder domestizierte Tiere. 21 von 25 Kindern (84 %) waren in der IHC, bzw. 20 von 25 (80 %) in der IF positiv auf Cdp. psittaci. Haustiere besaßen 10 von 25 (40 %) operierten Kindern (fünf Wellensittiche; vier Katzen, drei Hunde, ein Meerschweinchen, ein Hamster). Neun von zehn (90 %) der Kinder waren sowohl in der IHC als auch in der IF positiv auf Cdp. psittaci. Drei Patienten wohnten in der Nähe von Vogelzuchtstationen, alle (100 %) wurden positiv auf Cdp. psittaci in der IHC und IF getestet. Neun der operierten Kinder hatte gelegentlich Kontakt zu freilebenden Vögeln. Die Kontaktfrequenz variiert zwischen sechsmal im Jahr und mehrmals die Woche. Acht der neun (88,89%) Kinder waren in IHC und IF positiv für Cdp. psittaci. Sechs Kinder (24 %) wohnten in der Nähe (150 m–2000 m) von Ansammlungen wildlebender Vögel (z. B. Stadtpark) oder freiliegender Volieren. Alle (100 %) waren in IHC und IF positiv auf Cdp. psittaci. Ein sechsjähriger Junge, dessen Adenoide sowohl in der PCR als auch in der IHC sowie der IF positive Befunde für Cdp. psittaci aufwiesen, besaß zwei Wellensittiche, von denen einer kurz vor der Operation verstarb. Gewebeproben des verstorbenen Tieres waren in der PCR ebefalls positiv auf Cdp. psittaci. Hier liegt eine zoonotische Übertragung nahe. Ein beruflicher Kontakt zu Vögeln sowie die Hausschlachtung von Geflügel durch nahe Familienangehörige der getesteten Patienten wurden von allen Befragten negiert. 5 Ergebnisse 75 Desweiteren bestand bei sieben Patienten (28 %) ein gelegentlicher Kontakt zu Hunden in der Nachbarschaft. Sechs (85,71 %) von ihnen waren in IHC und IF positiv in Bezug auf Cdp. psittaci. Zwölf der 15 (80 %) Kinder, deren Eltern keinen engeren Kontakt zu Tieren angaben wurden jedoch ebenfalls in IHC oder IF positiv auf Cdp. psittaci getestet. 6 Diskussion 6.1 Diskussion der Ergebnisse 86,05 % der Operationspräparate wurden mittels Immunhistochemie und 80,95 % mittels Immunfluoreszenz positiv auf Cdp. psittaci-Antigene getestet. In der Kontrollgruppe von Gewebeproben, die aus dem Nasopharynx adulter Probanden entnommen wurden, waren lediglich 33,33 % in beiden Verfahren positiv für das Bakterium. Ob tatsächlich eine Altersabhängigkeit besteht bleibt spekulativ, da ein Vergleichskollektiv von Kindern ohne Adenoide fehlt. Normann et al. konnten im Gegensatz zu den hier gezeigten Ergebnissen Cdp. pneumoniae in kindlichen Adenoiden mittels immunhistochemischer Methoden nachweisen [72, 73]. Vorangegangene Studien der Forschergruppe um Theegarten et al. wiesen ein überdurchschnittlich häufiges Vorkommen von Cdp. psittaci bei Pat. mit COPD und in verschiedenen Emphysemformen nach. Aus den bislang durchgeführten Studien ergab sich die Frage, ob Cdp. psittaci in kindlichen Adenoiden und auch in nicht verändertem adultem Nasopharynxgewebe mit gleicher Häufigkeit gefunden werden kann. Das lymphatische System des Waldeyer´schen Rachenringes könnte eine Bedeutung für die Persistenz der Erreger besitzen. In unserer Studie wurde im Gegensatz zu Normann et al. Cdp. pneumoniae in der PCR nicht nachgewiesen. Die Unterschiede hinsichtlich des Nachweises von Cdp. pneumoniae bzw. Cdp. psittaci könnten auch regional begründet sein, da die Studie von Normann et al. in Schweden durchgeführt wurde. Weiterhin wurden nicht dieselben PCR-Protokolle für Cdp. pneumoniae benutzt, unterschiedliche Protokolle und Primer können aber auch zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Eine Klärung wäre nur durch einen direkten Vergleich der PCR-Verfahren und Kollektive möglich. Das hier eingesetzte Protokoll entsprach zum Zeitpunkt der Probennahme dem internationalen Standard, inzwischen ist jedoch die Realtime-PCR übliche Praxis. Die Untersuchung sollte also mit diesem Verfahren überprüft werden. Die ebenfalls durchgeführte PCR-Untersuchung der kindlichen Präparate ergab in Relation zu IHC und IF erheblich niedrigere positive Resultate in Bezug auf eine Besiedlung mit Cdp. psittaci. Ursache für eine niedrigere Detektionsrate in der PCR könnte einmal sein, dass zu wenig DNA für die Untersuchung zur Verfügung stand. Dies kann 6 Diskussion 77 Folge einer suboptimalen Behandlung der Probe postoperativ (unterschiedliche Zeiten und Temperaturen bis zum Einfrieren in der Pathologie), der Aufbewahrung, sowie dem Transport bis zur Untersuchung im Labor in Jena sein. Hierdurch kommt es zu DNAVerlusten und somit zu niedrigeren Nachweisraten. Zudem spielt das Phänomen des Antigen-Shedding bei der Untersuchung von Präparaten auf einen Chlamydienbefall mittels immunologischer und Nukleinsäureamplifikationsverfahren eine Rolle. Durch IHC und IF werden Antigene nachgewiesen, die bei Chlamydien-Infektionen bekanntermaßen in größerem Umfang auftreten, als die im Zellinneren gelegenen Nukleinsäuren [10]. Im Vergleich zu immunhistochemischen Detektion werden bei der PCR außerdem wesentlich kleinere Proben verwandt. Daher finden sich quantitativ mehr positive Präparate bei der IHC, bei der manche Befunde auch nur an einzelnen Stellen (z. B. in Epithelverbänden) positiv sind [72, 73]. Außerdem sind, verglichen mit Nukleinsäureamplifikationsverfahren, positive IHCErgebnisse häufiger, da die Degradation von DNA durch im Gewebe enthaltene Enzyme schneller vonstatten geht, als die von Antigenen (Proteinen). Die DNA-Extraktion aus Geweben ist zudem schwieriger und anfälliger für Störungen als die Aufarbeitung von Proben für immunhistochemische und immunfluoreszenzoptische Nachweisverfahren. Das Resultat von PCR/LCR-Verfahren wird des Weiteren durch Inhibitoren der Nukleinsäuresynthese beeinflusst [10, 35, 40, 49]. Daher ist die Entfernung aller die Replikation beeinflussenden Faktoren vor der Amplifikation unabdingbar. Ein Nachteil der immunhistochemischen und immunfluoreszenzoptischen Nachweismethoden ist jedoch die Kreuzreaktivität verschiedener Antigene mit denen anderer Chlamydienarten und somit eine verminderte Spezifität. Diese Kreuzreaktivität ist Folge von unter den Chlamydiaceae konservierten Proteinstrukturen (z. B. dem MOMP), damitwerdendie verschiedenen Chlamydienspezies nicht erkannt. Neuere Antikörper, wie die in unserer Versuchsreihe verwendeten, weisen hingegen nach Firmenangaben und durch vorausgegangene Studien bestätigt Fab-Anteile auf, die nur noch mit Epitopen einer einzigen Spezies reagieren. Die Firmenergebnisse konnten durch eigenen vorangegangene Studien bestätigt werden [9, 20]. Auch in den Studien von Normann et al. fand sich in der PCR lediglich eine sehr niedrige Nachweisrate von Cdp. pneumoniae, wohingegen in Immunhistochemie und Immunfluoreszenz ein hoher prozentualer Anteil positiv getestet wurde. Eine Testung der von diesen Autoren eingesetzten Antikörper hinsichtlich der sicheren Abgrenzung von Cdp. psittaci hat jedoch nicht stattgefunden [72, 73]. 6 Diskussion 78 Durch die essentielle Nähe zur distalen Region des Golgi-Apparates erklärt sich bei richtiger Anfärbung des Präparates und der Verwendung des richtigen Antikörpers das typische Erscheinungsbild der Chlamydien im Mikroskop als meist perinukleäre Einschlusskörperchen. Bereits zwei bis vier Stunden post infectionem sind Cluster von EB neben dem Golgi-Apparat nachweisbar [94]. Diese Gegebenheit und die im Vorfeld der eigentlichen Untersuchung durchgeführten Kontrollversuche verhindern so eine Verwechslung mit anderen Farbsignalen (endogenem Pigment, positives Signal durch das verwandte Ziegen-Normalserum oder anderen Bestandteilen des Versuchsaufbaus). Für die IF gilt dies in gleicher Weise, zudem ist die Eigenfluoreszenz des Gewebes bei der Auswertung zu berücksichtigten. Letztere ist jedoch ein allseits bekanntes Phänomen. Bei der IHC und IF werden Erregerantigene nachgewiesen. Diese können auch bei abgelaufenen Infektionen zum Teil noch in reichlichem Umfang beobachtet werden. Der Nachweis von Einschlusskörperchen in dieser Studie jedoch lässt zwingend auf eine relevante Infektion schließen. Eine Erklärung für das häufige Vorkommen von Chlamydien könnte die Tatsache sein, dass bereits ein kurzer Kontakt mit infizierten Tieren oder auch Exkrementen von Tieren oft genügt, um den Mikroorganismus zu übertragen. Daher berichten viele Personen nicht von einem Kontakt mit Vögeln oder erinnern sich nicht an ihn. Eine Übertragung der Psittakose wird sowohl von in Gefangenschaft aufgewachsenen als auch von frei lebenden Vögeln berichtet [70]. Chlamydien wurden bislang aus etwa 100 Vogelarten isoliert, am häufigsten jedoch aus „psittacinen“ (papageienähnlichen) Vögeln. Bei anderen in Gefangenschaft gehaltenen Vögeln sind Chlamydien am häufigsten in Tauben zu finden, aber die dort gefundenen Serovare gelten als weniger ansteckend [74]. Andere Chlamydienstämme, die früher als Untergruppen von Chlamydophila psittaci aufgefasst wurden, werden auch bei Säugetieren gefunden, sodass es auch bei einem Kontakt insbesondere mit Meerschweinchen und Katzen zu einer Ansteckung führen kann. Auch Viehherden wurden bereits als Quelle für eine humane Infektion beschrieben [70]. Eine Studie aus Japan zeigte neben anderen Bakterien wie Salmonellen und Mykobakterien eine besonders hohe Kontaminierung (22,9 %) von Kot freilenbender Tauben mit Cdp. psittaci und Cdp. pecorum [101]. Eine genaue Zeit und ein genauer Ort der Ansteckung von Menschen können somit bei vielen Chlamydieninfektionen schwer zu bestimmen sein. 6 Diskussion 79 Andere Studien, die einen hohen Durchseuchungsgrad mit Chlamydien zeigten, stützen sich auf Ergebnisse aus serologischen Untersuchungen. Das Problem bei serologischen Untersuchungen ist jedoch einerseits, dass Chlamydien aufgrund ihres intrazellulären Vorkommens gehäuft bei klinisch manifesten Infektionen keinen oder nur einen geringen Anstieg der Immunglobulin-Titer im Serum hervorrufen. Andererseits können stumm oder subklinisch verlaufende Infektionen mit einem hohen IgG- oder IgM-Titer einhergehen [11, 26]. Die pathogenetische Relevanz der in unserer Studie gewonnenen Ergebnisse kann nicht sicher abgeschätzt werden. Vorangegangene Studien, die sich mit anderen Mikroorganismen als Auslöser von Rachenmandelhyperplasien bei Voschulkindern beschäftigten, fanden in einer großen Anzahl der Fälle einen persistierenden Befall mit nicht kapselbildenden Hämophilus influenzae-Stämmen, anderen Viren und Bakterien (u. a. HIV, Adenoviren, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis) [32, 62, 107]. Die meisten infizierten Zellen waren Makrophagen oder Monozyten, in manchen Fällen wurden die Erreger aber auch intraepithelial gefunden. Somit wächst die Anzahl der an der Ätiologie der Rachenmandelhyperplasie beschuldigten Mikroorganismen stetig. Eine pathophysiologische Erklärung für einen ursächlichen Zusammenhang von Chlamydieninfektion und der Entstehung einer Rachenmandelhyperplasie könnte durch eine veränderte Cytokinausschüttung seitens des Wirtsorganismus bei chronischer Infektion erklärt werden. Bei einer Infektion der Schleimhäute wird die immunologische Reaktion des Wirtes in der Regel überwiegend durch Th1-Zellen vermittelt. Sie erscheinen relativ früh am Entzündungsort und verschwinden nach der Auflösung der Entzündung relativ schnell wieder [79]. Eine vermehrte Th1-Antwort aktiviert nachfolgend hauptsächlich Makrophagen und Granulozyten und bindet diese am Entzündungsort. Kommt es jedoch fälschlicherweise zu einer überwiegenden Th2-Antwort, führt diese eher zu einer Aktivierung von B-Lymphozyten und aufgrund einer unzureichenden Elimination von mit dem Erreger infizierten Zellen und dem Mikroorganismus an sich zu einer persistierenden Infektion [44, 48]. In Studien wurde ebendieses Missverhältnis von Th1- zu Th2-Antwort in Rachenmandelhyperplasien nachgewiesen. T-Zellen in Adenoiden produzieren weniger Th1Zytokine als normales Nasopharynx-Gewebe bei einer Infektion mit Chlamydien. Dies könnte ein möglicher Grund für eine verminderte Elimination von Chlamydien und eine konsekutive Hypertrophie des Gewebes durch eine chronische Besiedlung mit einhergehender (Fehl-) Aktivierung des Immunsystems sein [7]. Eine chronische Infektion mit Chlamydophila psittaci könnte also tatsächlich Ursache einer Rachenmandelhy- 6 Diskussion 80 perplasie sein. Andererseits wäre denkbar, dass sich die Chlamydien aufgrund der gestörten Immunität der bereits vergrößerten Adenoide erst opportunistisch etablieren können. Da nicht alle Menschen eine Rachenmandelhyperplasie entwickeln, spielen sicher auch genetische Polymorphismen eine Rolle. Beim okulären Marginalzellen-B-Zell-Lymphom wurde von Ferreri et al. eine Imbalance zwischen Th1- und Th2-Zell-Antwort gefunden [30]. Da auch bei einer Persistenz von Cdp. psittaci wie oben angeführt in humanem Gewebe, sowie in der Pathogenese der Adenoide eine Imbalance dieser Lymphozyten-Untergruppen beschrieben wurde, könnte ein Zusammenhang zwischen Chlamydieninfektion und der Entstehung von malignen Entartungen lymphatischer Gewebe bestehen. Insbesondere bzgl. des Tonsillenlymphoms sollten weitere Untersuchungen auf eine Assoziation mit Cdp. psittaci erfolgen. Der Nachweis von Cdp. psittaci in Adenoiden sollte zudem der Anstoß für weitere Untersuchungen bezüglich eines Zusammenhangs von einer Besiedlung mit dem Mikroorganismus und malignen Erkrankungen des Nasopharynx wie dem Nasopharynxcarcinom sein. Eine Infektion mit Cdp. psittaci verursacht eine Aktivierung des lymphatischen Systems und somit die Ausschüttung von Cytokinen. Bei einer Persistenz des Errgers und einer dauerhaften Aktivierung kann es unter Umständen durch zytoproliferative Substanzen zu malignen Entartungen kommen. Ähnliche Zusammenhänge zwischen einer chronischen Entzündung und malignen Entartungen bestehen z. B. im weiblichen Genital- und im Magen-Darmtrakt. So gilt sowohl der Zusammenhang einer Infektion des Epihels mit humanen Papillomviren beim Cervixcarcinom als auch eine Besiedlung der Schleimhaut mit Helicobacter pylori beim Magencarcinoms als gesichert. Beide Erkrankungen werden insbesondere durch die Ausschüttung zytoproliferativer Substanzen im Rahmen der persistierenden Infektion, wie sie auch bei einer Infektion der Schleimhäute mit Cdp. psittaci zu beobachten ist, hervorgerufen. 6.2 Weiterer Ausblick Weitere Studien müssen zeigen, ob Chlamydien tatsächlich in der Lage sind, eine Rachenmandelhyperplasie auszulösen, oder ob sie nur in bereits vergrößerten Adenoiden gehäuft vorkommen, weil sie dort aufgrund der veränderten immunologischen Verhältnisse vom Wirtsorganismus nicht suffizient bekämpft werden können. 6 Diskussion 81 Um die pathogenetische Relevanz des Chlamydienbefalls auf die Entstehung der Adenoide zu ergründen, sollte im fortführenden Studien probatorisch eine gegen Chlamydien wirksame antibiotische Therapie für mindestens drei Wochen erfolgen und der Effekt auf die Entwicklung der Adenoide beobachtet werden. Zudem sind weitere Untersuchungen wie die Chlamydien-Anzucht aus Adenoiden unter optimalen Bedingungen, experimentelle Untersuchungen zur Frage der Stimulation von Lymphozyten durch Cdp. psittaci und Untersuchungen von Kindern ohne Adenoide als Vergleichskollektiv z. B. durch Rachenabstriche erforderlich. Literaturverzeichnis [1] Antech Diagnostics News (August 2001). Review: Avian Chlamydiosis (Psittacosis) [2] Anttila, T., Lehtinen, T., Leinonen, M., Bloigu, A., Koskela, P., Lehtinen, M., Saikku, P. (1998). Serological evidence of an association between chlamydial infections and malignant lymphomas. Br J Haematol 103, 150–156 [3] Bahadir, O., Caylan, R., Bektas, D., Bahadir, A. (2006). Effects of adenoidectomy in children with symptoms of adenoidal hypertrophy. Eur Arch Otorhinolaryngol 263 (2), 156–159 [4] Bannantine, J. P., Stamm, W. E., Suchland, R. J., Rockey, D. D. (1998). 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Genome Biol 3 (9), research 0051.1–0051.17 Danksagung Vielen Dank an Herrn Dr. Theegarten für die Übelassung des Themas. Vielen Dank an Frau Nellja Schatz für die nette Betreuung und die Einarbeitung in die Immunhistochemie und Immunfluoreszenz. Vielen Dank an Herrn Dr. Olaf Anhenn für die Beantwortung der anfallenden Fragen. Vielen Dank an meine Eltern für die Unterstützung während Studium und Dissertation. Vielen Dank an meinen Bruder Holger für die Tipps bzgl. Layout und Formulierung. Vielen Dank an meine Frau Melanie für die Geduld während der unzähligen Tipp-Stunden. Lebenslauf Geboren am: 28. Mai 1979 im St. Johannes-Hospital in Arnsberg Eltern: Eheleute Rolf Gerhardt (pensionierter Realschullehrer) und Anneliese Gerhardt (Bankangestellte) Geschwister: Holger Gerhardt Schulbildung: August 1985 – Juli 1989 Grundschule Bodelschwinghschule Arnsberg August 1989 – Juli 1998 Gymnasium Laurentianum in Arnsberg Zivildienst: August 1998 – Juli 1999 Pflegeheim „Haus Sauerland“ in Arnsberg Studium der Humanmedizin: Oktober 1999 – Oktober 2005 an der Ruhr-Universität-Bochum Beruf: Seit Februar 2006 Assistenzarzt für Neurologie im Evangelischen Krankenhaus Herne
