Integration von Signalen

Integration von Signalen
Optimale Abstimmung der Entwicklung und des Verhaltens eines Organismus
durch Integration von endogenen und exogenen Signalen
exogen
endogen
Entwicklungsprogramm
Kommunikation im Organismus
Umwelt
“Aussen-Kommunikation”
“Reize”
Lichtreiz
Signal
Schwerkraft
Temperatur
Schall, Geruch
Signaltransduktion
Steuerung von Reaktionen
Steuerung der Entwicklung
Exogene Signale
exogene Signale
Tier
Pflanze
Mikroorg.men
+
+
+
+/-
-
-
(Perzeption der Gasphase)
+
+
+
Geschmacksstoffe
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Licht
Schall
Geruchsstoffe
(Perzeption der Flüssigphase)
Widerstand (Fühlen)
(Perzeption der Festphase)
Temperatur
Schwerkraft
Endogene Signale/ Botenstoffe bei Säuger und Pflanze
endogene Signale
Tier/Mensch
Pflanze
+
+
Wachstumshormone
+
Adrenalin
Auxin (P)
+
+
Östrogen
Brassinosteroide (P)
+
+
Jasmonat (P)
+
+
Acetylcholin
Histamin
+
+
Ca, cGMP,
Beispiel
Hormone-Endokrine / Phytohorm.
(intraorganism.
intraorganism. Kommunikation,
speziell der Organe)
Organe)
Peptid/Protein
Aminosäurederivate
Terpenderivate
(u.a. Steroide)
+
weitere Botenstoffe
Pheromone
(interorgamism.
interorgamism. Kommunikation über
chemische Signale)
Transmitter
(interzelluläre,
interzelluläre, lokale Kommunikation)
sekundäre Botenstoffe
(intrazelluläre Kommunikation,
Bildung nach SignalSignal-RezeptorRezeptorInteraktion)
Phytohormone als zellübergreifende endogene Signale
exogen
endogen
Entwicklungsprogramm
Kommunikation im Organismus
Umwelt
Integration von Außenfaktoren
Endogenes Signal
Phytohormon
Signaltransduktion
Ionenflüsse
Enzymaktivitäten
Genexpression
Steuerung
von Reaktionen
und der Entwicklung
Cytoskelett
Definition
Phytohormone:
sind niedermolekulare pflanzliche Botenstoffe, die in
geringen Konzentration (< 10 -5 M) eine regulatorische, in der Regel
zellübergreifende, Wirkung zeigen ohne hierbei selbst chemisch
verändert zu werden.
Hormonrezeptoren:
sind hochaffine und spezifische Bindestellen für
Hormone, die durch eine reversible Bindung des Liganden
gekennzeichnet sind und dieses Signal im Sinne einer Reizleitung
transduzieren.
Einteilung der Phytohormone
wachstumsstimulierende Phytohormone
Auxine
Cytokinine
Gibberelline
Brassinosteroide
wachstumsinhibierende Phytohormone
Ethylen
Abscisinsäure
Jasmonsäure
Salicylsäure
wachstumstimulierende Phytohormone (Übersicht)
elongation growth
cell division
apical dominance
adventitous roots
-CH2-COOH
indol
acetic acid
N
H
_
HN-CH2-CH=C
Cytokinin
cell division
adventitous buds
antagonist of senescence
_ CH2OH
_
Auxin
CH3
N
N
zeatin
N
H
N
_
O
CO
Gibberellin
HO
_
_
_
H3C
HOOC
CH2
gibberellic acid 1
Brassinosteroid
OH
_
elongation growth
germination
flower control
_
CH3
elongation growth
_
CH3
HO
_
campesterol
wachstumsinhibierende Phytohormone (Übersicht)
Ethylene
Abscisic acid
Jasmonic acid
fruit ripening
senecence
leaf abscission
stomatal closure
dormancy
desiccation tolerance
cold tolerance
pathogen response
wound response
tendril coiling
H
C
C
H
H
H
OH
COOH
O
O
COOH
COOH
Salicylic acid
thermogenesis
pathogen response
OH
Regulation endogener Signale
Transport
Konjugierung
Speicherung
Biosynthese
Katabolismus
Physiologisch
aktives
Signal
Signaltransduktion
Def. Signaltransduktion: Perzeption und Übertragung eines Signals, d.h.
exogenen Reizes oder endogenen Botenstoffes, in einer molekularen Wirkkette
-CH2-COOH
Auxin
N
H
indol
acetic acid
wichtigstes Auxin: Indolessigsäure
vorwiegende
Bildungsorte:
Transport
Meristeme
Embryonen
junge Blätter
basipetal:
Spross, vom Apex zur Basis
Wurzel
unter Beteiligung des Auxinefflux-Carriers PIN1, der über
Vesikel ortsselektiv in das
Plasmalemma inseriert wird,
und AUX1 (Auxin-Influx-Carrier)
z.T. ungerichtete Diffusion
Phyllotaxis induced by exogenous auxin
pin1 mutant
Reinhardt et al, Nature 426, 255 (2003)
Secondary Root Formation
Auxin-Verteilung (Auxin-induzierte GUS Expression, blau,
und Lokalisation uber Auxin-spez. Antikörper, braun)
Benkova et al., Cell 115, 591 (2003)
PIN1 Expression
Wirkung
Auxin fördert:
Streckungswachstum (i.d.R.)
Spross u. Wurzel
unterschiedliche Sensitivität
(Überversorgung hemmt!)
Teilungsaktivität des Kambiums
induziert Entwicklung des interfascikulären Kambiums
(sek. Dickenwachstum)
Usambaraveilchen
Seitenwurzelbildung
Auxin wirkt hier antagonistisch
zu Cytokinin
10 Tage
Stecklingsbewurzelung durch
Auxin (v.a. Indolbuttersäure)
gefördert
Adventivwurzeln
+ Auxin
Apikaldominaz
Entwicklung von Seitensprossen wird unterdrückt
- Auxin
Fruchtentwicklung
wird durch Auxin induziert
Kontrolle
Samen entfernt
bis auf einen !
Samen entfernt
bis auf drei !
Samen entfernt
+ Auxin
- Auxin
Samenlose
Frucht
(parthenokarp)
Auxinapplikation auf Fruchtknoten löst vielfach samenlose (parthenokarpe) Fruchtentwicklung aus
z.B. bei Erdbeere, Tomate, Wassermelone
Biosynthese
über Tryptophan
- C=N
Indol-3-acetonitril
4
Tao et al., 2008
Cell 133,164-176
1) Trp-deaminase
2) Indol-3-pyruvat-Decarboxylase
3) Indol-3-acetaldehyd-DH
4) Indol-3-acetonitril-Nitrilase
npr
Agrobacterium tumefaciens
Gram-negatives Bodenbakterium
Pflanzenpathogen: Verursacher des
Wurzelhalstumors bei Dicotylen
ca. 90 Pflanzenfamilen (>600 Spezies)
unter Kulturbedingungen auch Monocotyle
wie Reis und Mais
Pflanzenkontakt: Einschleusen der einzelsträngigen
T-DNA (ca. 23 kb), Region des Ti-Plasmids,
Integration ins Wirtgenom,
T-DNA
Gene für Auxin- und Cytokininbiosynthese
Gene für Opinbiosynthese
eukaryotische Transkription !
transgene Tabakpflanze mit
grün-fluoreszierendem
Quallenprotein (GFP)
Genome of Agrobacterium
tumefaciens strain C58 and
mechanism of plant-cell
transformation.
npr
The four genetic elements of the
Agrobacterium genome are
represented in relative scale to each
other. The circular chromosome
(purple) is 2.84 Mb and contains 2,750
ORFs; the linear chromosome (blue)
is 2.08 Mb and contains 1,850 ORFs;
plasmid pAtC58 (green) is 543 kb and
contains 550 ORFs; and plasmid
pTiC58 (red) is 214 kb and contains
198 ORFs. Agrobacterium transfers
the T-DNA as a complex with the
VirD2 protein to the plant cell via a
type IV transporter system encoded
on pTiC58. The T-DNA is imported to
the nucleus, where it becomes
integrated into the plant-cell genome.
Expression of wild-type T-DNA–
encoded genes results in
tumorigenesis. In the laboratory,
replacement of T-DNA sequences with
recombinant DNA allows genetic
engineering of susceptible species.
Zupan J, Ward D, Zambryski P. (2002)
Nat Biotechnol. 20:129-131.
npr
Gen 1
Auxin-Inaktivierung
Oxidation: IAA-Oxidase
Konjugation an IAA-Carboxygruppe:
- von Glucose über C1 (reversibel)
- von Aspartat über N
(irreversibel
Abbau)
Inaktivierung von Auxin initiiert durch IAAIAA-Oxidase
Auxin-Signaltransduktion
Targets?
Analyse?
Auxin-abhängige Genregulation über ARF Transkriptionsfaktoren
Transkriptionsfaktoren ARF (auxin-response factors, sind Aktivatoren)
AUX/IAA
homodimerisieren bzw.
ARF
heterodimerisieren
mit Transkriptionsregulatoren AUX
Inaktives Heterodimer
bzw. IAA (wirken als Repressor,
24 Vertreter in Arabidopsis) ARF-AUX/IAA Heterodimer inaktiv!
Aktivierung der ARF durch Abbau des Inhibitors IAA/AUX
über Ubiquitinierung von AUX/IAA (Dömäne II interagiert mit Ubiquitinligase)
Experimenteller Beweis:
Auxin-insensitive IAA/AUX Mutanten mit Defekt im Abbau
(spezifisch für Auxinwirkung!)
ARF
ARF
Aktives
Dimer
Abbau von AUX/IAA beseitigt negative Regulation der Auxin-Antwort,
d.h. stimuliert Auxin-Signalisation
Gray et al. (2001) Nature 414, 271
Fusionsproteine von IAA-Glucuronidase sind stabilisiert in der
Auxin-insensitiven Mutante axr2 mit mutiertem IAA7-Gen (=AXR2)
und axr3 (=mutiertes IAA17)
Ubiquitin
- 76 Aminosäuren
- C-terminales Gly wird reversibel an Lysin-Reste
anderer Proteine konjugiert (Isopeptidbindung)
- hochkonserviert
(> 95 % Identität zwischen
Homo sapiens und Arabidopsis thaliana)
Funktionen
• Monoubiquitinierung: Stabilisierung
• Polyubiquitinierung: Abbau der Proteine
durch Proteolyse
RUB und SUMO mit struktureller Homologie zu Ubiquitin
60 % identity
Ubiquitin
RUB1 (NEDD8)
SUMO
Ubiquitinierung
+ ATP
SH
X
E1
C
O
-
O
O
C
AMP
O
C
S
NH3+
Monoubiquitinierung:
¾ Histone
¾ Proteolyse
E2
E3
O
C
SH
S
AMP
E2
E1
E1: UbIquitin-aktivierendes Enzym
E2: UbIquitin-konjugierendes Enzym
E3: UbIquitin-Ligase (SCF-Komplex)
2
>20
C
O
N
X
PPi
Polyubiquitinierung
und
Proteolyse
> 500 Gene in Arabidopsis
Ubiquitin und strukturverwandtes RUB in der Auxin-Signaltransduktion
Auxin
AXR1
(RUB-E1
UE)
RCE1
E1
E2
Cullin
SKP
F-box
ARF
AUX/IAA
AUX/IAA
ARF
Ubi
RUB
AUX/IAA
E3
(SCFTIR1
Complex)
inaktiv
E3: Ubiquitin-Ligas
heterotrimer
Untereinheiten
SCF
SKP1, Cullin, F-box
Cullin Kontakt mit E
aktiviert durc
SKP: Kontakt mit C
F-box: Substraterkennung
(TIR1 bei Au
antwort)
AUX/IAA
26S
Proteasome
TIR1: Auxinrezep
Dharmasine et al
a
Nature 435, 441
Kepinski and Ley
Nature 435, 446
Nemhauser and
Cell 112, 970
a, An overall view of the TIR1 surface pocket occupied by auxin (green) at the bottom and the highly coiled IAA7 peptide (orange) on
top. The surface of the three long top surface loops of TIR1 responsible for ligand binding is coloured red. b, A close-up side view of
the central GWPPV motif in the IAA7 peptide upon binding to TIR1. Interacting residues of the substrate peptide and TIR1 are shown
as orange and yellow stick models, respectively. Auxin is shown as a green stick model. To clarify the view, two hydrophobic
residues, one from the peptide and the other from loop-2 of TIR1, are not shown. c, A slab view of the TIR1–auxin–IAA7 peptide
complex, showing that auxin fills a cavity between two proteins. The molecular surface of TIR1 is shown in grey mesh. The IAA7
peptide and auxin are shown in orange surface representation and green CPK, respectively.
Xu et al. Nature 446, 640-645 (2007)
Proteolyse-abhängige Genregulation der Phytohormone
über F-Box Proteine
Auxin-Antwort
Aktivierung der ARF Transkriptionsfaktoren
durch Abbau der inhibitorischen IAA/AUX
Gibberellin-Antwort
GA-Bindung an Rezeptor: Rezeptor interagiert mit F-Box und
aktiviert den Abbau der inhibitorischen DELLA Proteine
(konserviert in Kormophyten nicht in Moosen, Algen)
Jasmonat-Antwort
JA-Isoleucin Konjugat perzipiert durch Rezeptor
COI (F-Box ), das den Abbau der inhibitorischen JAZ Proteine
einleitet, Aktivierung der Transkriptionsfaktoren (MYC2)
Jasmonat-Isoleucin-Signaltransduktion
a, JAZ proteins are normally bound to transcription factors and inhibit their activity. b, In
response to attack, jasmonoyl–isoleucine (JA–Ile, marked with a star) stabilizes the
interaction between COI1 and JAZ. c, The JAZ protein is probably then modified by ubiquitin
(U), so marking it for destruction. d, JAZ is destroyed, liberating the transcription factors; e,
this allows transcription of genes that produce proteins involved in defence and
development, as well as of JAZ genes to restrain the jasmonate response. (Only the COI1
component of the SCFCOI1 enzyme complex of which it is a part is shown.)
Edward E. Farmer
Nature 448, 659-660 (2007)
Yan et al. Plant Cell 8, 2220 (2009)
N
N
Cytokinin
_
_
HN-CH2-CH=C
_ CH2OH
CH3
zeatin
N
H
wichtigstes Cytokinin: Zeatin = Isopentenyladenin (Purinbiosyntheseweg)
N
vorwiegende
Bildungsorte:
Transport
Wirkung
Wurzelspitze
keimende Samen
junge Gewebebereiche
Biosynthese
Wirkung
eng
gekoppelt
unpolar
Cytokinin fördert:
Zellteilung und Streckungswachstum
Cytokinin aktiviert u.a. Cyclin-cdk-Komplex
(siehe Vorlesung PD. Torres)
Stoffwechsel und verhindert Seneszenz
Beispiel: Herbstlaub mit grünen Inseln (Cytokinin produziert von Mikroorganismus)
Differenzierung u. Entwicklung
im Zusammenspiel mit Auxin
Cytokinin fördert Seitensprossbildung
(Auxin unterdrückt)
Bildung von “Hexenbesen”
extrem: fascierte (verwachsene) Sprosse
Cytokinin unterdrückt Seitenwurzelbildung
(Auxin fördert)
Cytokinin/Auxin regulierte Organentwicklung
Beispiel: Organregeneration aus Kallus
fascierte Sprosse von Salix
Organdifferenzierung aus Kalli der Tabakpflanze (Nicotiana tabacum)
Indolessigsäure (mg/l)
0
0.005
Kallus
Wurzelinduktion
0
Kinetin (mg/l)
0.03
Kallusproliferation
0.2
Sprossinduktion
1
0.18
1
3
Biosynthese
über AMP
Nucleosidase
Hydroxylierung
Reduktion
Signalkette
2- Komponentensystem
Cytokininrezeptoren CRE 1, AHK2, AHK3,
sind strukturell ähnlich dem
Ethylen-Rezeptor ETR1
(To u. Kieber, 2008, Trends Plant Science 13, 85)
Schematische Darstellung der Primärstriktur
von CRE1 (CKI1) und ETR1 aus Arabidopsis
Inoue et al. 2001, Nature 409,1060
Klonierung von CRE1 (CKI1) durch AktivierungsAktivierungs-Tagging
Insertion der TT-DNA aktiviert Transkription
benachbarter Gene
Überexpression von CRE1 (C, D, G, H) führt zur
CytokininCytokinin-hypersensitiven Sprossinduktion
bei Arabidopsis Kalluskulturen (D, H). Kontrolle
(B, F)
AHK2,3 u. CRE1 sind Cytokininrezeptoren
mit struktureller Homologie zu bakteriellen „2-Komponenten-Systemen“
bakterielle „2-Komponenten-Systeme bestehen aus Sensor (membranst.
Rezeptor) und Regulator
ähnlich den Cytokinin-u. Ethylenrezeptoren, Fusion von Sensor und Regulator (Transduzent)
2-Komponenten System (Enzym-gekoppelter Rezeptor)
charakteristisch für prokaryotische Signalwege
Hefe: Osmoregulation
Pflanze: Ethylen- und Cytokininrezeptoren
Histidin-spezifische PROTEINKINASE als Sensor
überträgt Phosphatrest auf REGULATOR Protein
(Phosphoaspartat-Bildung)
Regulator häufig Transkriptionsregulator =Transduzent
Sensor-histidinkinase
z.B. CheA
Regulator z.B. CheY
Bakterielle Chemotaxis
Histidin-Phosphotransmitter
AHP (Arabidopsis Histidine-Phosphotransmitter)
binden an Rezeptoren und werden phosphoryliert
AHP1, AHP2 u. AHP5 zeigen Cytokinin-abhängige Lokalisation in Zellkern
Responseregulator
ARR (Arabidopsis Response Regulator)
sind Transkriptionsfaktoren
ARR1, ARR2 u. ARR10 sind Aktivatoren
der Genexpression und der CytokininAntwort (TFs, ARR B-Typ)
werden durch AHP1 u. AHP2 de-reprimiert
ARR4, ARR5, ARR6 u. ARR7 (ARR A-Typ)
sind negative Regulatoren der Cytokinin
Antwort, werden durch Cytokinin induziert
aus
Hwang und Sheen 2001, Nature 413,383
Ektopische Expression von CKI oder
ARR2 verstärkt die Cytokinin-Antwort
aus Hwang und Sheen 2001, Nature