Ein Enzym mit enger Verwandtschaft zu humanen

Jahrbuch 2009/2010 | Bartunik, Hans D. | Ein Enzym mit enger Verw andtschaft zu humanen
Monoaminoxidasen ermöglicht Bodenbakterium ein Leben von Nikotin
Ein Enzym mit enger Verwandtschaft zu humanen
Monoaminoxidasen ermöglicht Bodenbakterium ein Leben von
Nikotin
An enzyme structurally closely related to human monoamine
oxidases enables a soil bacterium to live on nicotine
Bartunik, Hans D.
Max-Planck-Arbeitsgruppen für strukturelle Molekularbiologie am DESY, Hamburg
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Das Bodenbakterium Arthrobacter nicotinovorans „ernährt“ sich von Nikotin. Der Abbau von L-Nikotin und DNikotin erfolgt durch zw ei genetisch nicht verw andte Flavoenzyme, 6HLNO und 6HDNO. Ihre Kristallstrukturen
bieten
eine
Erklärung
für
die
Stereospezifizität
der
Enzymkatalyse. 6HLNO
zeigt
in
Struktur
und
Funktionsw eise enge Verw andtschaft zu humanen Monoaminoxidasen (MAO), die eine zentrale Rolle beim
Abbau von Neurotransmittern spielen. Die Strukturanalyse von 6HLNO-Reaktionsintermediaten und des
Inhibitionsmechanismus erw eitert die Grundlagen für eine mögliche Entw icklung neuer MAO-W irkstoffe.
Summary
The soil bacterium Arthrobacter nicotinovorans grow s on nicotine. Degradation of L-nicotine and D-nicotine
involves tw o genetically unrelated flavoenzymes, 6HLNO and 6HDNO. Their crystal structures may explain the
stereospecificity of their enzymatic reactions. 6HLNO by its structure and mechanism is closely related to
human monoamine oxidases (MAO), w hich play central roles in degradation of neurotransmitters. Structural
analysis of 6HLNO reaction intermediates and the inhibition mechanism extends the basis for possible
development of new leads for MAO.
Nikotinabbau durch zwei verschiedene Enzyme mit spiegelbildlicher Reaktionsweise
Nikotin, das in Tabakpflanzen nahezu vollständig in der (linksdrehenden) L-Form vorliegt und als Insektizid
fungiert, dient einer Reihe von Bakterienarten als alleinige Nahrungsquelle, um aus dem Abbau des Alkaloids
ihren Bedarf an Kohlenstoff und Stickstoff zu decken [1]. Im Bodenbakterium Arthrobacter nicotinovorans
beginnt der Nikotinabbau mit der Hydroxylierung des Pyridinrings an C6. Im darauf folgenden Schritt, der für LNikotin durch 6-Hydroxy-L-Nikotin-Oxidase (6HLNO) und für D-Nikotin durch 6-Hydroxy-D-Nikotin-Oxidase
(6HDNO) katalysiert w ird, w ird der Pyrrolidinring zum Myosmin-Intermediat oxidiert. Anschließende Ringöffnung
durch Hydrolyse führt zum Produkt 6-Hydroxy-Pseudooxynikotin (Abb. 1). Im menschlichen Körper, der Nikotin
(auch) durch Passivrauchen und in vergleichbarer Menge durch Nahrung (bestimmte Gemüse, Tee) aufnimmt,
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beginnt der Abbau von Nikotin zu einem hohen Prozentsatz mit einem direkten Angriff auf den Pyrrolidinring,
dessen Oxidation durch die Enzyme Cytochrom-P450 und Aldehydoxidase zur Bildung von Cotinin führen [2].
Nik otina bba u durch Arthroba cte r nicotinovora ns.
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DESY; a us [3]
6HLNO und 6HDNO sind Flavoenzyme, die mithilfe von FAD-Kofaktoren ein und dieselbe Reaktion an den
stereomeren Substraten katalysieren. Die beiden Enzyme w eisen jedoch völlig verschiedene Sequenzen und
Konformationen auf. Die Kristallstrukturanalyse von 6HLNO im Komplex mit 6-Hydroxy-L-Nikotin (Abb. 2) zeigt
d a s L-Substrat in einer Orientierung relativ zum Isoalloxazinring des Kofaktors, die Hydridtransfer vom
Pyrrolidin-Kohlenstoffatom C2’, dem chiralen Zentrum, zum FAD als ersten Reaktionsschritt ermöglicht [3]. Auf
der experimentellen Grundlage dieser Komplexstruktur und der Struktur des freien 6HDNO [4] w urde ein
Modell der Substratbindung an 6HDNO entw ickelt, das – bis auf eine Spiegelung an der Ebene des
Isoalloxazinrings –eine identische Orientierung des D-Substrats relativ zum Kofaktor zeigt. Arthrobacter
nicotinovorans setzt also zw ei genetisch nicht verw andte Proteine mit unterschiedlicher Gesamtstruktur und
chemisch induzierter Symmetriebeziehung in der Orientierung der spiegelbildlichen Substrate zum Flavinring
des Kofaktors ein, um absolute Stereospezifizität der Katalyse zu erreichen. In w eiteren Experimenten gelang
es unter Einsatz von Tieftemperaturverfahren, den gesamten Verlauf der Enzymreaktion in 6HLNO-Kristallen
vom Andocken des Substrats an die aktive Stelle (Michaelis-Zustand) über das Myosmin-Intermediat bis zur
Bildung des Keton-Produkts Pseudooxynikotin in einer Serie von Kristallstrukturen hoher Auflösung zu
verfolgen. In Verbindung mit früheren NMR-Messungen w urde damit eine experimentelle Grundlage zur
Aufklärung des vollständigen Strukturmechanismus einer Flavooxidase auf molekularer Ebene geschaffen.
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Krista llstruk tur de r 6-Hydrox y-L-Nik otin-O x ida se im Kom ple x
m it de m Substra t L-Nik otin. Die Abbildung ze igt e ine
Unte re inhe it de s hom odim e re n Enzym s, da s a us de r FADbinde nde n Dom ä ne (cya n) und de r Substra t-binde nde n
Dom ä ne m it zwe i Unte rdom ä ne n (S1: rot; S2: la chsfa rbe n)
a ufge ba ut ist. Da s Substra t (grün) binde t a n da s a k tive
Ze ntrum a n de r Re-Se ite de s FAD-Kofa k tors (ge lb). Die
Funk tion e ine s a n S1 ge bunde ne n P hospholipids (gra u) ist
noch unbe k a nnt.
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DESY; a us [3]
Enge Verwandtschaft von 6HLNO mit MAO-A und MAO-B
Die Aufklärung der Kristallstruktur von 6HLNO [3] zeigte eine enge Verw andtschaft zu einem Humanenzym auf,
das am Nikotinabbau nicht direkt beteiligt ist, aber durch Nikotinabbauprodukte inhibiert w ird und am
Entstehen der Nikotinabhängigkeit beteiligt ist [5]. Dieses Enzym, die in zw ei Isoformen vorliegende
Monoaminoxidase (MAO-A und MAO-B), spielt eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Konzentration von
Neurotransmittern w ie Dopamin und Serotonin in der Zelle. MAO-Inhibitoren sind von Bedeutung für die
Behandlung einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, die insbesondere Parkinson, Alzheimer und
me n t a le Störungen einschließen. MAO unterscheidet sich im dreidimensionalen Aufbau von 6HLNO im
Wesentlichen durch eine zusätzliche Helix am C-terminalen Ende, die der Verankerung in der mitochondrialen
Membran dient. Die aktiven Zentren w eisen ähnliche Lagen und Architekturen auf. Kristallstrukturen zeigten,
dass
6HLNO auch die
MAO-Substrate
Dopamin und Serotonin binden kann. Angesichts
der engen
Verw andtschaft der Struktur-Funktionsbeziehungen beider Aminoxidasen ist die Kenntnis des genauen
Reaktionsw egs und intermediärer Bindungsstellen im 6HLNO-Molekül von potenziellem Interesse für eine
mögliche gerichtete Entw icklung von MAO-Inhibitoren.
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[1] R. Brandsch:
Microbiology and biochemistry of nicotine degradation.
Applied Microbiology and Biotechnology 69, 493-498 (2006).
[2] J. Hukkanen, P. Jacob, N. L. Benowitz:
Metabolism and disposition kinetics of nicotine.
Pharmacological Review s 57, 79-115 (2005).
[3] G. S. Kachalova, G. P. Bourenkov, T. Mengesdorf, S. Schenk, H. R. Maun, M. Burghammer, C. Riekel, K.
Decker, H. D. Bartunik:
Crystal structure analysis of free and substrate-bound 6-hydroxy-L-nicotine oxidase from Arthrobacter
nicotinov orans.
Journal of Molecular Biology 396(3), 785-99(2010).
[4] J. W. A. Koetter, G. E. Schulz:
Crystal structure of 6-hydroxy-D-nicotine oxidase from Arthrobacter nicotinov orans.
Journal of Molecular Biology 352, 418-428 (2005).
[5] T. P. George, A. H. Weinberger:
Monoamine oxidase inhibition for tobacco pharmacotherapy.
Clinical Pharmacology & Therapeutics 83, 619-621 (2008).
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