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Kopf-Hals-Karzinome beeinträchtigen die Immunfunktionen
von dendritischen Zellen
Sabrina Jeske, Ralph Pries und Barbara Wollenberg
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein – Campus Lübeck,
Klinik für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde
www.hno.uni-luebeck.de
Hintergrund
Das CpG ODN
Es wurde nachgewiesen, dass plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) als
Teil des angeborenen Immunsystems die bösartigen Kopf-Hals-Tumore
infiltrieren, wobei sich jedoch bei den Patienten eine deutliche Verminderung
der zellvermittelten Immunantwort zeigt.
pDCs sind durch die schnelle Bildung von großen Mengen des Botenstoffes
IFN-α als Antwort auf immunologische Stimuli wie zum Beispiel Viren
gekennzeichnet. Fehlt dieser Stimulus unterstützen pDCs eine
Toleranzentwicklung bei T-Zellen und spielen somit eine wichtige Rolle bei
der Hemmung einer gegen den Tumor gerichteten T-Zell vermittelten
Immunantwort.
Schon vor über 100 Jahren erkannte der New Yorker Chirurg William Coley,
dass das Immunsystem Tumore erfolgreich bekämpfen kann. Er
beobachtete, dass sich Sarkome (Tumore des mesenchymalen
Stützgewebes) nach einer bakteriellen Infektion im Bereich des Tumors
zurückbildeten.
Innerhalb des bakteriellen Erbguts konnten die immunologisch aktiven
Anteile vor etwa 20 Jahren eingegrenzt werden und sogenannte Palindromsequenzen (spiegelbildliche Sequenzen um ein zentrales Dinukleotid)
verantwortlich für die Aktivierung gemacht werden. Als nächster Schritt
konnte mit synthetischen Oligonukleotiden (CpG ODN), die solche Palindromsequenzen enthielten, die immunstimulatorische Wirkung genomischer
DNA von Bakterien reproduziert werden. Erkannt werden diese
Palindromsequenzen durch den sogenannten Toll-like-Rezeptor 9, der sich
unter anderem auf den pDCs befindet, und führen als Imitat einer
mikrobiellen Infektion zur Stimulation des Immunsystems.
Dieser immunologische Therapieansatz könnte eine enorme Verbesserung
der Behandlungsmöglichkeiten eröffnen.
- Es wurden drei CpG ODN-Klassen definiert, die sich in ihrer Sequenz sowie
in ihrer Wirkung wesentlich unterscheiden.
Typ A CpG (z.B. ODN 2216: 5‘-ggGGGACGATCGTCgggggG-3‘)
stimuliert pDCs dazu große Mengen an IFN-α and IFN-β zu
produzieren. Der Mechanismus ist hierbei ähnlich einer
Virusinfektion.
B-Zelle
CpG ODN
pDC
Gesteigerte Synthese von
IL12 und IFN-α stimuliert
indirekt NK-Zellen
Typ B CpG (z.B. ODN 2006: 5'TCgTCgTTTTgTCgTTTTgTCgTT-3' ) unterstützt die pDC
Zellreifung, ist effektiv in der Stimulierung von B-Zellen, hat aber
nur eine geringe IFN-α Produktion zur Folge. In Kombination mit
dem Rezeptor CD40L werden große Mengen an IL-12 von der
pDC produziert, welches zu einer IL-12 abhängigen TH1Immunantwort führt.
Typ C CpG verbindet beide Aktivitäten von CpG-A und CpG-B
Untersuchungsmethoden
Isolierung der plasmazytoiden dendritischen Zellen
Leukozyten werden aus dem Blut gesunder Spender über einen Dichtegradienten (Ficoll) isoliert, die pDCs mit Eisenoxid/Dextranmatrix
gekoppelten Antikörpern gegen BDCA4/Neuropilin1 markiert und anschließend über Magnetsäulen angereichert.
FACS Analyse
Die „Teilnehmer“
Die pDC
- gehört zur Gruppe der Dendritische Zellen (DC),
dieses
sind
hochspezialisierte
antigenpräsentierende Zellen des Immunsystems.
Die
aufgenommenen
antigenen
Strukturen
werden in der Folge prozessiert und sehr effizient
dem weiteren Immunsystem präsentiert. Gleichzeitig
werden die DCs aktiviert, was zu einer beginnenden
Zellreifung und zur Sekretion von Botenstoffen (Zytokine) wie z.B. IFN-α
führt. Diese rekrutieren weitere immunkompetente Zellen an den Ort der
beginnenden Immunreaktion.
- im zweiten Abschnitt der speziellen Funktion der DCs, steht die Aktivierung
und Einbeziehung der spezifischen Immunabwehr. Dazu wandern die
reifenden DC in die regionären Lymphknoten, wo sie die Antigenstrukturen
den noch naiven T-Zellen präsentieren.
Die zu untersuchenden Rezeptoren der pDCs werden mit fluoreszierenden
Antikörpern markiert und können dann im sogenannten Durchflusszytometer
gemessen werden. Änderungen in der Rezeptordichte und die Zu-/Abnahme
an tragenden Zellen, die u.a. den Reifegrad der Zelle und die
Migrationsfähigkeit zeigen, können so gemessen werden. Auch lassen sich
durch diese Methode die pDCs in einer Zellpopulation genau bestimmen.
ELISA
Das IFN-α
- Protein aus 166 Aminosäuren
- führt zu einer gesteigerten Produktion von Proteinen,
die einerseits z.B. die weitere Virusproduktion und
andererseits den Abbau von viraler und zellulärer DNA
bewirken. Außerdem werden vermehrt Rezeptoren und
andere Proteine gebildet, welche die markierten Zellen
durch T-Lymphozyten leichter angreifbar machen.
- aktiviert NK-Zellen (natürliche Killer-Zellen).
- stimuliert die Entwicklung von TH1-Zellen.
Die Zellen der bösartigen Kopf-Hals-Tumore
- Für unsere Untersuchungen in vitro, das heißt,
außerhalb des Organismus, verwenden wir
speziell gezogene, reproduzierbare Zelllinien.
- Die Untersuchungen dieser Doktorarbeit werden
mit den Zelllinien BHY und PCI-13 durchgeführt.
Beide Zelllinien entstammen Kopf-Hals-Karzinomen,
weisen jedoch andere Eigenschaften und Profile
von ausgeschütteten Botenstoffen auf.
- schaffen es durch unterschiedliche Mechanismen dem
Immunsystem zu entfliehen. Unter anderem sezernieren
sie Botenstoffe z.B. TGF-β, die die T-Zell-Entwicklung unterdrücken oder TSuppressorzellen aktivieren, oder IL-10 welches die Aktivierung der DCs
hemmt.
Mittels ELISA kann das im Zellüberstand vorhandene IFN-α durch eine Antikörperreaktion quantitativ bestimmt werden. Durch eine Antikörper-AntigenAntikörper-Enzymreaktion entsteht ein gelblicher Farbstoff dessen
Konzentration dann in einem Photometer gemessen wird.
Ergebnisse
Die Ergebnisse unserer Untersuchungen zeigen den Einfluss des
Tumormillieus auf die Produktion von IFN-α und die Ausbildung der
untersuchten Rezeptoren. Durch das Verhindern einer adäquaten IFN-α
Antwort der pDCs kommt es nur zu einer unzureichenden TH1-Antwort im
Microenvironment des Tumors, mit der Konsequenz, dass er einem Angriff
des Immunsystems entgeht.
Die verschiedenen Typen der CpG Oligonukleotide zeigen unterschiedliche
Potenzen in der Stimulierung der pDCs zur IFN-α Synthese.
Es ist festzustellen, dass Zeit und Konzentration einen Einfluss ausüben. Je
größer das Zeitfenster und je höher die Konzentration, desto höher die
Menge an ausgeschüttetem IFN-α.
Bei den Untersuchungen zum Einfluss von Tumorzellen und Tumormillieu auf
die IFN-α Sekretion der pDCs, zeigte sich ein Unterschied in der
Suppressionspotenz
der
einzelnen
untersuchten
permanenten
Tumorzelllinien.
In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es sich hierbei um
einen Botenstoff im Tumormillieu handelt.
Literatur und Quellennachweise beim Autor
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, Klinik für HNO
Ratzeburger Allee 160
D-23538 Lübeck
Tel 0451-500-6598
Sabrina Jeske
[email protected]