Simulation von Enzymzuständen am Computer - biophysik

Simulation von Enzymzuständen am Computer –
ein Weg zum Verständnis molekularer Details
gen unterschiedliche Enzymzustände eines ionentransportierenden Membranproteins simuliert, infrarotspektroskopische
Daten
dadurch
genauer
interpretierbar und neue Erkenntnisse
zur Aufklärung des Ionentransportmechanismus erhalten werden.
Die Ca2+-ATPase – das Enzym zum
„Relaxen“
Karin Hauser
Die Ca2+-ATPase ist das Enzym, welches für
die Entspannung von Muskeln verantwortlich ist. Dafür pumpt es Ionen über die
Membran. Mit Hilfe von Elektrostatik-Rechnungen konnte die Beteiligung der Aminosäure Asp 800 an diesem komplexen Transportmechanismus gefolgert werden.
Mehrere Entwicklungen der letzten
Jahre haben den Einsatz von Computern
zur Untersuchung von Enzymreaktionen
extrem vorangebracht: zum einen ist es
die Verfügbarkeit von immer mehr
Strukturdaten, die auf frei zugänglichen
Datenbanken bereitgestellt werden. Zur
Zeit sind es mehr als 30.000 Molekülstrukturen,
deren
Atomkoordinaten
hauptsächlich über die die NMR-Spektroskopie und die Röntgenstrukturanalyse bestimmt wurden. Diese Strukturdaten werden als Ausgangsbasis für
Rechnungen benötigt. Zum anderen hat
die rapide Entwicklung von Rechnerleistung und PC-Clustern die Möglichkeit eröffnet, auch komplexe biologische Makromoleküle am Rechner zu simulieren.
Simulationen am Computer können dafür eingesetzt werden, experimentelle
Daten zu interpretieren oder Vorhersagen zu treffen, wenn (noch) keine experimentellen Daten vorhanden sind. In diesem Beitrag soll demonstriert werden,
wie mit Hilfe von Elektrostatik-Rechnun-
Keywords
Ca2+-ATPase, Ionentransport,
Elektrostatik-Rechnungen
Die Kontraktion und Relaxation von
Muskeln wird über Calcium gesteuert.
Über Calciumkanäle strömt Calcium ins
Cytoplasma der Muskelzelle, was zur
Muskelkontraktion führt. Die Ca2+-ATPase ist das Membranprotein, das Calcium
wieder aus der Zelle herauspumpt, wenn
der Muskel entspannt werden soll. Dabei
wird Calcium aus dem Cytoplasma ins
Innere der Ca2+-ATPase gebunden und
auf der lumenalen Membranseite ins
Sarkoplasmatische Retikulum abgegeben. Dieser komplexe Transportmechanismus wird derzeit mit verschiedenen
Methoden untersucht, die molekularen
Details sind jedoch noch nicht vollständig
verstanden, insbesondere die genauen
Transportwege innerhalb der Ca2+-ATPase und die daran beteiligten Aminosäuren sind nach wie vor unklar [1,2].
Abb. 1: Die Ca2+-ATPase pumpt 2 Calciumionen
über die Membran vom Cytoplasma in das Lumen des Sarkoplasmatischen Retikulums. 2–3
Protonen werden dabei in entgegengesetzter
Richtung transportiert. Die Zahlen bezeichnen
die zeitliche Abfolge der einzelnen Schritte.
In Abbildung 1 sind die wesentlichen
Schritte des Transportmechanismus zusammengefasst: nur wenn die Calciumbindestelle, die sich im Transmembranbereich des Enzyms befindet, mit 2
Calciumionen gesättigt ist, kann ATP an
die Nukleotidbindestelle im cytplasmatischen Teil der Ca2+-ATPase binden. Die
Hydrolyse des ATP stellt letztlich die
Abb. 2: Während des Reaktionszyklus nimmt die Ca2+-ATPase mehrere Enzymzustände an, die hier in einem vereinfachten Schema dargestellt sind. Bindung und Transport von Calcium wechseln sich ab mit
Phosphorylierung und Dephosphorylierung des Enzyms. Über Elektrostatik-Rechnungen werden die Ionisationszustände jeder einzelnen Aminosäure im Protein in Abhängigkeit des äußeren pH-Wertes berechnet. Diese hängen von den Wechselwirkungen mit anderen Aminosäuren, vorhandenen Ionen oder
Wassermolekülen in der Umgebung ab. Die Enzymzustände, die in den Rechungen behandelt wurden,
sind rot hervorgehoben.
GIT Labor-Fachzeitschrift 10/2005, S. 836–838, GIT VERLAG GmbH & Co. KG, Darmstadt, www.gitverlag.com, www.pro-4-pro.com
Abb. 3: Die Calciumbindestelle, die
sich im Transmembranteil der Ca2+ATPase befindet. Benannt sind die
Aminosäuren, die die beiden Calciumionen binden.
Energie für den Calciumtransport zur Verfügung, der aktiv gegen einen Konzentrationsgradienten
getrieben
werden muss. Dabei wird die
Ca2+-ATPase phosphoryliert,
was die Voraussetzung für die
Abgabe von Calcium in das
Lumen ist. Die Enzymkonformation ändert sich während
des Pumpprozesses erheblich
und geht mit einer Affinitätsund
Zugänglichkeitsänderung der Calciumbindestelle
einher. Der Membrankanal
öffnet sich in Richtung Lumen, Wasser kann eintreten.
Nach
Dephosphorylierung
des Enzyms geht die Konformation wieder in ihren Ausgangszustand zurück, wobei
die Calciumbindestelle wieder dem Cytoplasma zugänglich wird und von dort neue
Calciumionen binden kann.
Dem Calciumtransport entgegengesetzt gerichtet werden Protonen transportiert.
Über diesen Protonengegentransport ist noch sehr wenig
bekannt. Man nimmt an, dass
die Protonen zur Stabilisierung der negativ geladenen
Aminosäuren der Calciumbindestelle benötigt werden,
wenn das Enzym im calciumfreien Zustand vorliegt. Im
Reaktionszyklus der Ca2+-ATPase alternieren somit Bindung und Transport von Calcium mit Phosphorylierung
und Dephosphorylierung des
Enzyms. Ein vereinfachtes
Reaktionsschema ist in Abbildung 2 dargestellt. Netto werden pro hydrolysiertem ATP 2
Calciumionen
vom
Cytoplasma in das Lumen ge-
pumpt und 2–3 Protonen in
Gegenrichtung transportiert.
Vor kurzem wurden hochaufgelöste Röntgenstrukturdaten der Ca2+-ATPase in
unterschiedlichen Enzymzuständen des Reaktionszyklus
aufgeklärt. Dies ermöglicht
nicht nur eine Visualisierung
und bessere Vorstellung der
einzelnen
Enzymzustände
und der Aminosäuren, die an
der Calciumbindung beteiligt
sind (Abb. 3), sondern macht
die Untersuchung des Ionentransportmechanismus
für
Rechnungen zugänglich.
Rechnungen zur
Elektrostatik
Elektrostatische Wechselwirkungen von Dipolen und Ladungen, die durch die komplexe
Struktur
aus
ionisierbaren und polarisierbaren Gruppen im Protein zustande kommen, spielen bei
Ladungstransfermechanismen von Proteinen eine bedeutende Rolle [3]. Verglichen mit dem pK-Wert in
wässriger Lösung können die
pK-Werte von Aminosäuren
innerhalb des Proteins um
mehrere Einheiten abweichen.
Die
überwiegend
hydrophobe
Proteinumgebung ist weniger stark polarisierbar als zum Beispiel Wasser, was sich auf den pK-Wert
und damit die Ionisierbarkeit
einzelner Aminosäuren auswirkt. Werden Ladungen
durch ein Protein geschleust,
ändern sich die elektrostatischen Wechselwirkungen und
auch oft die Konformation im
Protein. Über die Rechnungen versucht man, die wirkenden Kräfte im Protein zu
beschreiben und ihre Auswirkungen auf die Ladungszustände und Konformation der
einzelnen Aminosäuren zu
bestimmen. Dabei müssen
auch Wassermoleküle berücksichtigt werden, die sich
in Proteinhohlräumen befinden können und möglicherweise am Ladungstransfermechanismus beteiligt sind.
Startpunkt der Rechnungen sind die Atomkoordina-
Abb. 4: Berechnete Titrationskurven des Calciumliganden Asp 800 in verschiedenen Enzymzuständen.
Im Ca2+-gebundenen Enzymzustand E1·2Ca2+ (blau) liegt Asp 800 ionisiert vor, im Ca2+-freien Zustand
E2 (rot) protoniert bei pH7 und titriert mit einem pK-Wert 5 7.9. In Kombination mit infrarotspektroskopischen Daten konnte diese Aminosäure identifiziert werden, sowohl am Calciumtransport als auch
am Protonengegentransport beteiligt zu sein.
schaften treffen für die Asparaginsäure
800 zu, einem der Calciumliganden, dessen berechneten Titrationskurven in Abbildung 4 dargestellt sind. Mit Hilfe der
Rechnungen konnten somit die experimentellen Infrarotdaten nicht nur genauer interpretiert werden, sondern sie
ermöglichten auch die Identifikation einer Aminosäure, die sowohl an der Calciumbindung als auch am Protonengegentransport beteiligt ist. In Zukunft sollen
die Elektrostatik-Rechnungen auch dafür eingesetzt werden, den Energietransduktionsmechanismus zu untersuchen,
um zu verstehen, wie die Energie vom
cytoplasmatischen Bereich (wo das energieliefernde ATP bindet) in den Transmembranbereich (in welchem die Ionentranslokation stattfindet) übertragen
wird.
Literatur
[1] Stokes,
D.L.;
Green,
Ann.Rev.Biophys.Biom.Struct.
ten des Enzyms. Dies ist im Grunde eine
starre Struktur, die keine Informationen
über Protonen enthält und somit auch
nicht über Ionisationszustände einzelner
Aminosäuren. In den hier angewandten
Rechnungen werden zunächst die Protonen den Strukturdaten hinzugefügt, wobei nur energetisch günstige Positionen
erlaubt werden. Alle Aminosäuren werden über Punktladungen parametrisiert.
Sogenannte Konformere werden für die
Aminosäuren definiert, die sich durch
die Orientierung der Aminosäureseitenkette, den Ionisationszustand und unterschiedlicher Protonenpositionen unterscheiden.
Proteinzustände
werden
„künstlich“ erzeugt, indem jeweils ein
Konformer pro Aminosäure gewählt
wird. Über die Berechnung der paarweisen Wechselwirkungen wird dann der
wahrscheinlichste Proteinzustand in Abhängigkeit
des
pHWertes bestimmt. Dabei können pH-abhängig Ionisations- und Konformationsänderungen einzelner Aminosäuren auftreten und identifiziert werden, die
funktionell für das Protein von Bedeutung sein können. Energieterme können
zudem analysiert werden. Bisherige Arbeiten konnten z.B. zeigen, wie die Proteinstruktur von Cytochromen das Redoxpotential moduliert [4,5].
Die hier beschriebenen Rechnungen
wurden mit der calciumfreien und der
calciumgebundenen Struktur der Ca2+ATPase durchgeführt, um den Protonengentransport zu untersuchen. Man
nimmt an, dass die Calciumliganden um
die Calciumionen und die Protonen konkurrieren. Von infrarotspektroskopischen Daten weiß man, dass beim Übergang vom calciumgebundenen in den
calciumfreien Enzymzustand Carboxylgruppen protoniert werden [6]. Bei stark
alkalischem pH-Wert wird kein Protonengegentransport mehr beobachtet.
Dies bekräftigt die Hypothese, dass die
Calciumliganden, die Carboxylgruppen
enthalten, auch potentielle Kandidaten
für den Protonengegentransport sind.
Eine Zuordnung zu spezifischen Aminosäuren ist jedoch über die Infrarotdaten
ohne weitere Informationen nicht möglich. Die Berechnung der Ionisationsund Konformationszustände jeder der
994 Aminosäuren der Ca2+-ATPase im jeweiligen Enzymzustand und in Abhängigkeit des pH-Wertes ermöglicht eine
solche Zuordnung. Aminosäuren, die zu
den IR-Banden beitragen, müssen im
calciumgebundenen Zustand ionisiert
vorliegen, nach Calciumfreisetzung bei
pH 7 protoniert und bei höherem pHWert deprotoniert sein. Diese Eigen-
N.M.;
32
2003,
446–468
[2] Toyoshima, C.; Inesi, G.: Ann. Rev. Biochem.
73 2004, 69–72
[3] Gunner, M.R.; Alexov, E.G.: Biochim.Biophys.Acta 1458 2000, 63–87
[4] Mao, J.; Hauser, K.; Gunner, M.: Biochemistry,
42 2003, 9829-9840
[5] Hauser, K.; Mao, J.; Gunner, M.: Biopolymers,
74 2004, 51–54
[6] Barth,
A.;
Kreutz,
W.;
Mäntele,
W.:
J.Biol.Chem. 272 1997, 25507–25510
Juniorprof. Dr. Karin Hauser
1989–1995 Physikstudium in Freiburg; Promotionsstipendium des Graduiertenkollegs „Strukturbildung in
Makromolekularen Systemen“ der Universität Freiburg
und 2000 Promotion in Biophysik; 2001–2002 Humboldtstipendiatin und Postdoktorandin am City College of New York, New York, USA. Seit 2002 Juniorprofessorin für Biophysik im Fachbereich Physik der Uni
Frankfurt.
Institut für Biophysik
Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt
Max-von-Laue-Str. 1
60438 Frankfurt am Main
[email protected]