z - B CUBE Dresden

2.2. Peptide
 Peptide entstehen durch Kondensation der a-Carboxylgruppe einer Aminosäure
mit der a-Aminogruppe einer anderen Aminosäure
 Peptid: bis zu ~30 linear über Peptidbindung verknüpfte Aminosäuren (AAs)
Polypeptid(kette): >30 linear über Peptidbindung verknüpfte AAs
Protein: gefaltete Polypeptidkette (enthält evtl. chemische Modifikationen)
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Peptide (I)
N-Terminus
C-Terminus
5 Aminosäurereste: Pentapeptid
Seryl-glycyl-tyrosyl-alanyl-leucin
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Peptide (II)
Ionisierung eines Peptids by pH 7.0
N-Terminus
C-Terminus
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2.3. Proteine
Durchschnittliche molekulare Masse pro Aminosäure: 110 Da
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 Bestimmung der molekularen Masse von Proteinen (und anderer Moleküle) mittels
Massenspektrometrie (MS):
Messung der Wanderungsgeschwindigkeit geladener Moleküle im elektrischen
Feld, kann das Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) jedes Moleküls bestimmt
werden
Prinzipieller Aufbau eines Massenspektrometers
Elektrospray Ionisierung
(ESI)
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 Proteinmoleküle werden in der Regel in einer sauren wäßrigen Lösung
(z.B. 0.5% Ameisensäure / 49,75% H2O / 49,75% Methanol) in das
Massenspektrometer injeziert.
→ sämtliche Proteinmoleküle sind dann vielfach positiv geladen
→ gegenüber dem ungeladenen Protein (a-Aminogruppe und a-Carboxylgruppe
am N- bzw C-Terminus und Seitenketten der Aminosäuren sind ungeladen)
erhöht sich die Ladung des Proteins mit jedem zusätzlich vorhandenen Proton
um +1 und die Masse um +1 Da (Protonenemasse)
→ ein Proteinmolekül, dass z zusätzliche Protonen enthält besitzt die Ladung
z(+1) und ist um die Masse z(1 Da) schwerer als das ungeladene
Proteinmolekül; es gilt also:
mungeladenes Protein + z
mProtein mit zH+
=
z
z
→ mungeladenes Protein = z 
muss aus
Massenspektrum
berechnet werden
(
Vereinfachung: das Vorzeichen der
Ladung wird nicht angegeben und
die Molekularmasse wird nur als
Zahlenwert (ohne Da) angegeben
mProtein mit zH+
-1
z
)
kann direkt aus
Massenspektrum
abgelesen werden
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 Wie bestimmt man z aus dem Massenspektrum eines Proteins?
Massenspektrum von Apomyoglobin
z11
z12
z9
z8
z6
z4
z13
z3
z15
z2
z1
 Die verschiedenen Signale stammen von Apomyoglobinmolekülen, die verschieden
stark protoniert sind
 Benachbarte Signale differieren in der Protonenanzahl nur um 1 Proton
 Je kleiner der m/z Wert desto stärker ist das Proteinmolekül protoniert
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 Für die Signale gilt
mProtein mit z H+
mProtein mit z H+
mProtein mit z H+
n
2
1
-1
- 1 =…= zn
- 1 = z2 
mungel. Protein = z1
z
z
z
(
1
) (
)
2
(
n
)
 Für die Ladungszahlen direkt benachbarter Signale gilt zn = zn+1 + 1
→ Auflösen der obigen Gleichung nach zn ergibt:
mProtein mit z
zn =
zn+1
mProtein mit z H+
n
zn
-
H+
n+1
-1
mProtein mit z
zn+1
H+
n+1
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2.4. Sequenzierung von Proteinen
 Erstes komplett sequenziertes Protein: Insulin (Frederic Sanger 1955)
 Allgemeine Strategie der Proteinsequenzierung:
a. Irreversible Spaltung der Disulfidbrücken (falls vorhanden)
b. Irreversible Spaltung der Polypeptidkette in kleinere (5-20 AAs) überlappende
Peptide (Proteolyse)
c. Trennung der Peptide mittels Chromatographie
d. Bestimmung der AA-Sequenz jedes Peptids
e. Rekonstruktion der Proteinsequenz
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Strategie der Proteinsequenzierung (I)
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Strategie der Proteinsequenzierung (II)
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a. Irreversible Spaltung der Disulfidbrücken
Disulfidbrücke in Protein
Mercaptoethanol
Mercaptoethanoldisulfid
Jodacetamid
Jodwasserstoff
carbamidomethylierte Proteine
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b. Irreversible Spaltung der Polypeptidkette in kleinere (~5-25 AAs)
überlappende Peptide (Proteolyse)
→ durch ortsspezifische Proteasen:
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→ durch Bromcyan (Cyanogenbromid):
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c. Trennung der Peptide mittels Chromatographie
Entscheidend für
Auftrennung der Peptide:
Unterschiede in Stärke ihrer
Wechselwirkung mit der
stationären Phase
(Ausnahme: Gelfiltration)
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→ geeignete stationäre Phasen für Peptidtrennungen:
Anionenaustauscher
Kationenaustauscher
Polymerkügelchen
(Durchmesser: ~5-20 µm)
Pore
(Innendurchmesser:
2-200 nm)
Umkehrphase
SiO2-Kügelchen
(Durchmesser: ~1-5 µm)
Gelfiltration/Gelpermeation
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d. Bestimmung der Peptidsequenz
→ durch Edman-Abbau:
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→ durch Edman-Abbau (Fortsetzung):
(H+)
Nach jedem Abspaltungszyklus:
Analyse der erhaltenen PTH-AA mittels
RP-Chromatographie
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→ durch Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS oder MS2):
Peptide
(Mutterionen)
Peptid Fragmente
(Fragmentionen)
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e. Rekonstruktion der Proteinsequenz
→ erfolgt Computer gestützt:
- Identifizierung der Überlapp-Bereiche und Abfolge der Peptide
-
Identifizierung der Peptidsequenz aus Massen von Mutterionen und den
zugehörigen Fragmentionen
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