Ein diagnostisches Konzept zum Nachweis der Paratuberkulose
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Ein diagnostisches Konzept zum Nachweis der Infektion mit Mc. avium ssp. paratuberculosis Dr. Tilman Kühn Gliederung - Einführung - Stand der Diagnostik - Methodenvergleich zum Erregerdirektnachweis -- Kultur auf festen Nährböden -- Flüssigkultur -- PCR - CATTLETYPE MAP – ein diagnostischer Werkzeugkasten - Ausblick auf die Serologie - Zusammenfassung Einführung Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Ziehl-Neelsen-Färbung Diagnostik säurefeste Stäbchen in Nestern liegend Methodenvergleich Erreger - Direktnachweis von Mycobacterium paratuberculosis Sensitivität Spezifität ? 100 % Flüssigkultur (BACTEC, MGIT) ? 100 % PCR (IS 900, IS MAV2 ) ? ?% Kultur auf festen Nährböden (z.B. Herrolds Egg Yolk) Musterbestand zur ParaTb-Bekämpfung in Thüringen, ca. 400 Tiere, HF Sensitivität Kultur klinisch ParaTB verstärkt aufgetreten 75 Rinder zur Sektion 21 ohne klinische Zeichen 23 klinischer Verdacht 35 klinisch Paratuberkulose pathomorphologischer Nachweis kultureller Nachweis davon in 100 % positiv 61 = Ileum / Ileocecalln. 38 Caecum 30 Rectum 10 Euter / Euterln. 15 81 % positiv Verdickung der Ileumschleimhaut durch die granulomatöse Entzündung Sensitivität Kultur vergleichend unveränderte Schleimhaut diffuse transmurale granulomatöse Entzündung durch Infiltration mit Macrophagen und Lymphozyten Sensitivität Kultur Riesenzellbildung Musterbestand zur ParaTb-Bekämpfung in Thüringen, ca. 400 Tiere, HF Sensitivität Kultur klinisch ParaTB verstärkt aufgetreten 75 Rinder zur Sektion 21 ohne klinische Zeichen 23 klinischer Verdacht 35 klinisch Paratuberkulose pathomorphologischer Nachweis kultureller Nachweis davon in 100 % positiv 61 = Ileum / Ileocecalln. 38 Caecum 30 Rectum 10 Euter / Euterln. 15 81 % positiv Kultur auf festen Nährböden z.B. Harrolds Egg Yolk mit Mycobactin Kultur auf festen Nähböden Dekontamination mit HPC arbeits- und zeitaufwändig Beimpfen fester Nährböden mindestens 3 Röhrchen ! (Kostenfaktor) bis zu 12 Wochen bei 37 °C bebrüten wöchentliche Beurteilung der Nährböden auf Verunreinigung und Wachstum und auf verdächtige Kolonien Automatisierte Flüssigkultur mit MGIT Flüssigkultur Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) ist eine fluoreszensgestützte Nachweismethode für Mycobakterien. Das Kulturmedium -Middlebrook 7H9 Broth- kann für die Ansprüche von MAP modifiziert werden mit: Mycobactin Antibiotika (Chloramphenicol, Vancomycin) Eigelb (bei HPC-Dekontamination Flüssigkultur Kotproben in MGIT-Flüssigkultur nach Dekontamination mit Hexadecyl-Pyridinium-Chloride (HPC) werden positiv innerhalb von 8-35 Tagen. Die Kontaminationsrate schwankt in Abhängigkeit von der Fütterung und dem Frischezustand der Proben erheblich (zw. 525 %). Die NaLC-Dekontamination ist nicht ausreichend. Der Eigelbzusatz beeinträchtigt die Fluoreszenzauswertung nicht. 300 Kotproben PCR vs. Kultur von serologisch positiven Tieren PCR positiv Kultur positiv PCR positiv 40 Kultur positiv PCR negativ Kultur negativ 53 46 PCR positiv 13 Kultur negativ 241 PCR negativ Kultur positiv 6 Methodenvergleich Bewertung der diagnostischen Methoden Derzeit verfügbare Methoden zum Nachweis von MAP sind Ö zeit- und arbeitsaufwändig Ö gering sensitiv Ö störanfällig Ö teuer Der kulturelle Direktnachweis ist der Goldstandard zum Nachweis der Paratuberkulose aus Kotproben. CATTLETYPE MAP CATTLETYPE MAP entwickelt sich zu einem Baukastensystem, mit dem alle diagnostischen Werkzeuge in Abhängigkeit von der Bestandsituation, der epidemiologischen Situation und der Laborvorausetzungen optimal miteinander kombiniert werden können CATTLETYPE MAP CATTLETYPE Eigelb-Nährboden nach Herrold mit Mycobactin MAP Ö entspricht in der Zusammensetzung der aktuellen AVID-Empfehlung Ö kostengünstig Ö vergleichbar zu etablierten Produkten CATTLETYPE MAP Die Kombination von CATTLETYPE MAP Eigelb-Nährboden nach Herrold mit Mycobactin und BACTOTYPE MAP PCR Amplification Kit Ö liefert Ergebnisse bereits nach 4-5 wöchiger Kulturzeit Ö erhöht die Sensitivität der Kultur Ö verringert / eliminiert Inhibitoren CATTLETYPE MAP CATTLETYPE PARATYPE KOLOSTRUM* MAP DNA-Extraktionssystem Ö ermöglicht den Aufbau MAP-freier Kolostrumbanken Ö unterbricht damit einen Infektionsweg Ö kann mit anderer neonataler Diagnostik kombiniert werden (z.B. BVD-Ohrstanze) * in Entwicklung Serologische Nachweisverfahren Serologie Ö erfassen nicht alle infizierten und ausscheidenden Tiere Ö haben entweder hohe Sensitivität bei verminderter Spezifität oder hohe Spezifität bei verminderter Sensitivität Ö möglicher Ausgleich durch kombinierte Anwendung (SMAPS-Konzept) Serologie CATTLETYPE MAP Ab ELISA* Ö konzipiert zum Einsatz für Serum und Milchproben Ö neuartiges innovatives Screeningverfahren zur Antigenentwicklung * in Entwicklung Zusammenfassung Alle diagnostischen Verfahren zum Nachweis der Paratuberkulose erfassen derzeit nicht den kompletten Infektionsablauf und haben damit Defizite in Sensitivität und Spezifität. Für die Kultur auf festen Nährböden ist das derzeitige Optimum mit einer Kombination mit der PCR nach Abschwemmung zu erzielen Die Sensitivität der Flüssigkultur kann höher liegen, das Problem der erhöhten Kontamination ist noch nicht gelöst. Für die Direkt-PCR fehlen noch immer zuverlässige Extraktionsverfahren. Die kombinierte Anwendung von serologischen Verfahren sollte Standard werden, mit dem CATTLETYPE MAP Ab ELISA wird die Palette der zur Verfügung stehenden Tests erweitert. Ich bedanke mich für Ihre Aufmerksamkeit !
