zusammenfassung - OvGU
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M. Sc. Just, Sissy “T cell specific function of the deubiquitinating enzyme A20 in murine listeriosis” ZUSAMMENFASSUNG Unter normalen Bedingungen befindet sich das Immunsystem im Gleichgewicht, muss jedoch schnell und effizient gegen Pathogene vorgehen können. CD8+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Bekämpfung intrazellulärer Krankheitserreger, unter anderem gegen das grampositive Stäbchenbakterium Listeria monocytogenes. Während einer Infektion werden CD8+ T-Zellen aktiviert, was zur klonalen Expansion und zur Migration an den Infektionsherd führt. Dort produzieren die Pathogen-spezifischen CD8+ T-Zellen Effektormoleküle, wie IFN- und Granzyme B, was zur Eliminierung von infizierten Zellen beiträgt. Nach der erfolgreichen Beseitigung der Krankheitserreger im Wirtsorganismus, erfolgt eine Kontraktion der Pathogen-spezifischen CD8+ T Zellen, was zu einer Abnahme der Effektorzellzahl führt. Parallel dazu bilden sich CD8+ Gedächtnis T-Zellen aus, die mehrere Jahre, oder sogar lebenslang im Wirt überdauern können. Infiziert sich der Wirt erneut mit dem Krankheitserreger, werden diese Gedächtniszellen reaktiviert, was zu einer raschen Expansion der Pathogen-spezifischen CD8+ T-Zellen und zur schnellen Eliminierung des Krankheitserregers führt. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-κB, der für Prozesse wie Proliferation und Produktion von Effektormolekülen in CD8+ T-Zellen von entscheidender Bedeutung ist, wird durch post-translationale Modifizierung von Signalmolekülen, z.B. durch Ubiquitinierung reguliert. Das Ubiquitin-modifizierende Enzym A20 (auch TNFAIP3 genannt) spielt eine wichtige Rolle bei der Herunterregulation der NF-κB Aktivität. Es ist bekannt, dass A20 Tumor-spezifische CD8+ T-Zellen hemmt, wohingegen es die autoimmune CD4+ T-Zellantwort verstärkt. Um die T-Zell-spezifische Funktion von A20 während einer bakteriellen Infektion zu untersuchen, infizierten wir Mäuse mit A20-defizienten T-Zellen (CD4-Cre A20fl/fl) und A20-kompetente Kontrolltiere mit L. monocytogenes. Pathogen-spezifische, A20defiziente CD8+ T-Zellen expandierten stärker und produzierten größere Mengen an IFN- und Granzyme B, was zu einer verminderten Bakterienlast in CD4-Cre A20fl/fl Mäusen führte. Wurden diese Tiere jedoch 50 Tage später erneut mit L. monocytogenes infiziert, konnte eine beeinträchtigte Expansion und Zytokinproduktion der A20defizienten Gedächtnis-T-Zellen beobachtet werden. Dies wiederum führte zu einer erhöhten Bakterienlast in CD4-Cre A20fl/fl Mäusen. Mittels bildgebender Durchflusszytometrie konnte ex vivo festgestellt werden, dass eine vermehrte Apoptose und Nekroptose A20-defizienter pathogen-spezifischer CD8+ T-Zellen Ursache einer reduzierten Zahl an Gedächtnis-T-Zellen war. Weitere Versuche zeigten, dass nach T- M. Sc. Just, Sissy “T cell specific function of the deubiquitinating enzyme A20 in murine listeriosis” Zellrezeptor-Stimulation in A20-defizienten CD8+ T-Zellen eine vermehrte Spaltung von Caspase-3 und -8 einhergehend mit einer erhöhten Caspase-3/7 Aktivität, Merkmale apoptotischer Zellen, sowie eine vermehrte Bildung von RIPK1/RIPK3-Komplexen, eine Besonderheit nekroptotischer Zellen zu beobachten war. Sowohl A20-defiziente Pathogen-spezifische CD8+ T-Zellen in vivo, als auch T-Zellrezeptor-stimulierte CD8+ TZellen in vitro exprimierten vermehrt den Todesrezeptor CD95 auf ihrer Oberfläche. Wir konnten weiterhin nachweisen, dass die CD95-Expression in Abhängigkeit mit gesteigerter NF-κB Aktivierung erfolgte, da eine Blockierung der NF-κB Aktivität in vitro in einem Rückgang von CD95 mRNA resultierte, der die Unterschiede zwischen A20-defizienten und A20-suffizienten CD8+ T-Zellen aufhob. Außerdem induzierte die Stimulation mit CD95L einen verstärkten Caspase-3/7-vermittelten Zelltod der A20defizienten CD8+ T-Zellen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass A20 den CD95-vermittelten Zelltod durch die Herunterregulation von NF-κB limitiert. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass die Expansion von L. monocytogenesspezifischen CD8+ T-Zellen durch A20 inhibiert wird, gleichzeitig auch die Zelltodvermittelte Kontraktion reguliert, was zur Entwicklung einer stabilen Population an Gedächtniszellen beiträgt. Erkenntnisse über die Regulation der T-Zellantwort und die Entwicklung von Gedächtniszellen kann Möglichkeiten für die therapeutische Nutzung, beispielsweise bei der Entwicklung neuer Impfstoffstrategien, eröffnen. M. Sc. Just, Sissy “T cell specific function of the deubiquitinating enzyme A20 in murine listeriosis” ABSTRACT Under resting conditions, the immune system has to maintain a homeostasis, but responds rapidly to a wide range of pathogens. CD8+ T cells, a subpopulation of leukocytes, play an important role in eliminating intracellular pathogens, such as Listeria monocytogenes, by targeting infected cells. Upon infection, CD8+ T cells are activated, expand and produce effector molecules, such as interferon- and granzyme B. After successful elimination of the pathogen, the CD8+ T cell pool contracts and leaves behind a small population of pathogen-specific memory CD8+ T cells, persisting for many years or even lifelong in the host. Upon a secondary infection with the same pathogen, this population rapidly re-expands and mediates immediate protection. The major regulator of the CD8+ T cell response is NF-κB, which mediates activation, expansion and production of effector molecules. The ubiquitin-modifying enzyme A20 (TNFAIP3) negatively regulates NF-κB activation. To study the T cell-specific function of A20 in bacterial infection, we intravenously infected mice lacking A20 specifically in T cells (CD4-Cre A20fl/fl) and A20-competent mice with Listeria monocytogenes. Interferon- and granzyme B-producing A20-deficient pathogen-specific CD8+ T cells expanded stronger, resulting in an improved pathogen control at day 7 p.i. compared to the A20-sufficient counterparts. Surprisingly, upon secondary infection at day 50 p.i., expansion of pathogen-specific CD8+ T cells and pathogen control were significantly impaired in CD4-Cre A20fl/fl mice. Imaging flow cytometry revealed that the reduced secondary CD8+ T cell response was caused by an increased apoptosis and necroptosis of A20-deficient pathogen-specific effector, effector memory and central memory CD8+ T cells after day 7 p.i. In vitro, apoptosis and necroptosis of T cell receptor-stimulated A20-deficient CD8+ T cells were strongly induced, accompanied by increased caspase-3/7 activity, caspase-3 cleavage and RIPK1/RIPK3 complex formation. Furthermore, A20-deficient CD8+ T cells expressed significantly more CD95, which was completely abolished in vitro by inhibition of NF-κB. CD95L stimulation resulted in increased active caspase-3/7 and cell death of A20deficient CD8+ T cells indicating that A20 limited cell death by reducing NF-κBdependent CD95 expression. In conclusion, this study uncovers that T cell-specific A20 limits the expansion of Listeria-specific CD8+ T cells but reduces apoptosis and necroptosis resulting in an impaired clearance of Listeria in primary but improved control in secondary infection. Understanding mechanisms of T cell responses and development of memory T cells will be helpful in designing new vaccination strategies to boost T cell immune responses.
