Praktikumsskript

Yaroslav Tsytsyura, Teja Wolfgang Grömer, Jürgen Klingauf
Versuchsprogramm: Physikalische Methoden in der Neurophysiologie
Blockpraktikum Biophysik
Patch Clamp
1. Ganzzell-Ableitungen von Neuronen
A) Ruhepotential, Aktionspotential, Stromreizung im "current-clamp"-Modus, unter
angenäherten "physiologischen Bedingungen" (d.h. außen Ringer, innen K-Gluconat, pH
7.2, ATP, GTP).
B) Spannungsabhängige Stromkomponenten in Nervenzellen (INa, IK). Isolation des
Kaliumstroms mit TTX. Umkehrpotential und Überprüfung der Voraussagen der NernstGleichung durch Änderung der externen Kaliumionenkonzantration.
2. Synaptische Ströme im "voltage clamp"-Modus
A) Spontanaktivität ("Minis").
B) Ableitung excitatorischer postsynaptischer Ströme (EPSC’s) durch autaptische Stimulation.
Pharmakologische Isolation der AMPA- und NMDA-Stromkomponenten.
Methoden
1. Ohm´sches Gesetz und Spannungsteiler
I
U
R
U1
I=U
R
U1
I=
R1 + R 2
R1
U2
R2
R2
U2 = R2⋅ I = U1
R1 + R 2
2. Spannungsmessung und Strommessung
a) Spannungsmessung: Welche Spannung entwickelt eine Signalquelle, wenn sie möglichst
ungestört ist?
Rs
U1
U2
Ausgangssignal proportional U2
Ri
U2 = U1
Ri + R s
Ri
Ein "gutes" Spannungsmeßgerät muß einen hohen Innenwiderstand Ri haben; eine Spannung ist
umso besser meßbar, je niedriger der Serienwiderstand Rs ist; sie wird umso weniger belastet, je
höher der Innenwiderstand ist.
b) Strommessung: Welchen Strom kann eine Signalquelle liefern, wenn eine bestimmte
Spannung anliegt?
U1
Ausgangssignal proportional I
Rs
I
Ri
Der Strom wird exakt gemessen, jedoch die an der Stromquelle anliegende Spannung ist
U - I(Rs + Ri); d.h. die Spannung ist umso ähnlicher der Sollspannung, je kleiner Rs + Ri ist. Ein
Strom-Meßgrät ist umso besser, je kleiner sein Innenwiderstand ist; die Strom-Spannungscharakteristik kann umso genauer gemessen werden, je niedriger der Serienwiderstand ist.
3. Current-Clamp und Voltage-Clamp
a) Current-Clamp: Spannungsmessung (an der möglichst ungestörten Zelle)
IV Wandler
Pipette
StromMonitor
¾ Ref. Pot.
Σ
Σ
V0-Offset
I-hold
Bad-Elektrode
Stim. In
SpannungsMonitor
b) Voltage-Clamp: Strommessung (bei fest vorgegebener Spannung)
IV Wandler
Pipette
StromMonitor
¾ Ref. Pot.
Σ
Σ
V0-Offset
V-hold + Stim. In
Bad-Elektrode
Stim. In
SpannungsMonitor
Für "Voltage-Clamp"-Messungen (Strom-Messung) muß der Serienwiderstand (und der
Eingangswiderstand des Meßgerätes) möglichst klein sein. Dies ist bei Patch-Clamp Messungen
in der Regel der Fall, da Rm 1 G und Rs 10 M ist. Wenn man fordert, daß der
Spannungsfehler weniger als 1 mV sein soll, so darf durch das Präparat höchstenfalls ein Strom
I fließen, der (Ohm´sches Gesetz angewandt auf Rs)
10−3 V
I=
= 10−10 A = 100 pA ist.
7
10 Ω
Bei Mikroelektrodenableitungen sind in der Regel die Rs-Werte höher (50 M ) und die
Rs-Werte niedriger (10-100 M ), da mit größeren Zellen gearbeitet wird. Somit ist Rs « Rm nicht
mehr erfüllt und man benötigt zwei Mikroelektroden und einen Rückkopplungsverstärker, um
der Zelle eine bestimmte Spannung aufzuprägen.
Literatur
einführend:
Alberts B., Bray, D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. D. (1989) Molecular Biology of
the Cell, Chapter 19, pp. 1059-1085. Garland, New York.
Schmidt R. F., Thews G. [Hrsg.] (1993) Physiologie des Menschen. Kapitel 1 - 3. Springer,
Berlin, Heidelberg, New York.
Nicholls J. G., Martin A. R., Wallace B. G. (1992) From Neuron to Brain. Sinauer, Sunderland.
weiterführend:
Hille B. (1992) Ionic Channels of Excitable Membranes. Sinauer, Sunderland.
Rudy B., Iverson L. E. (1992) Methods in Enzymology, 207 (Ion Channels). Academic Press,
San Diego.
Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F. J. (1981) Improved patch-clamp
techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.
Pflügers Arch. 391:85-100.
Neher E. (1992) Ion channels for communication between and within cells.
Science 256:498-502.
Neher E., Sakmann B. (1992) The patch clamp technique. Sci. Am. 266:28-35.
Sakmann B. (1992) Elementary steps in synaptic transmission revealed by currents through
single ion channels. Science 256:503-512.
Penner R. (1994) A practical guide to patch clamping. In "Single Channel Recording"
(B. Sakmann & E. Neher, eds.), Chapter 1. Plenum, New York (in press).