Kostimulatorische Rezeptoren in der Aktivierung humaner

Kostimulatorische Rezeptoren in der
Aktivierung humaner neutrophiler
Granulozyten
Dissertation
Zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Am Fachbereich Biologie
Der Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Philipp Vinzent Haselmayer
geb. am 27. Mai 1975 in Wiesbaden-Sonnenberg
Mainz, 2008
Dekan:
1.Berichterstatter:
2.Berichterstatter:
Tag der mündlichen Prüfung:
1. Einleitung
1
1.1 Das Immunsystem
1
1.1.2 Das angeborene Immunsystem
1.1.3 Das adaptive Immunsystem
1
3
1.2 Inflammation / Entzündungsreaktion
4
1.2.1 Lösliche Bestandteile der Inflammation / Entzündungsreaktion
1.2.2 Zelluläre Bestandteile der Inflammation
1.2.2.1 Monozyten / Makrophagen
1.2.2.2 Neutrophile Granulozyten (PMN (engl. „polymorphnuclear neutrophil“)
1.2.2.3 Inflammation und Thrombozyten (Blutplättchen)
1.2.3. Auflösen der Entzündungsreaktion „resolution of Inflammation“
1.4 Rezeptoren des angeborenen Immunsystems (Pattern Recognition Receptors (PRRs))
1.4.1 Toll Like Rezeptoren (TLR)
5
6
6
6
8
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10
10
1.5 Herpes Virus Entry Mediator (HVEM)
12
1.6 Triggering Receptor expressed on Myeloid Cells 1 (TREM-1)
13
1.3 Intrazelluläre Signalkaskaden führen zur Aktivierung von Zellen
15
1.3.1 Ras eine kleine GTPase / GTP-Bindendes Protein
1.3.2 Aktivierung der Phospholipase C-γ (PLC−γ)
1.3.3 Mitogen aktivierte Proteinkinasen (MAPKinasen (MAPK)
15
16
16
2.Material und Methode
19
2.1 Material
19
2.1.1 Grundmedien
2.1.1.1 Medium für polymorph nukleäre Zellen (PMN)
2.1.1.2 Test Medium (TM)
2.1.1.3 Humaner Tyrode Puffer
2.1.1.4 Medium zum Einfrieren von Zellen
2.1.1.5 Medium für Hybridomzellen bzw. SP02
2.1.2 Antikörper
2.1.2.1 Primäre Antikörper
2.1.2.1.1 Konjugierte Primäre Antikörper
2.1.2.1.2 Primäre Antikörper aus eigener Herstellung
2.1.2.2 sekundäre Antikörper
2.1.3 ELISA- Standards und Kits
2.1.4 Standard Chemikalien
2.1.5 Materialien
2.1.6 Puffer
2.1.7 Inhibitoren
2.1.8 Stimulantien
2.1.9 Verwendete Geräte
2.1.10 Plastik und Glas Waren
2.2 Methoden
2.2.1 Zellen
2.2.1.1 Zelllinien
2.2.1.2 Aufreinigen von polymorphnukleären Zellen (PMN) aus humanen Blut
2.2.1.3 Aufreinigen von Thrombozyten aus humanen Blut
2.2.1.4 Zellzahl Bestimmung
2.2.2 Zellstimulation
2.2.3 Gewinnung von Antikörpern und Fusionsprotein
2.2.3.1 Überstand von Hybridomazellen sammeln
2.2.3.2 Fusionsprotein
2.2.3.3 Fällen des Überstandes von Hybridomazellen und SP02 Zellen mit Ammoniumsulfat
2.2.3.4 Aufreinigen von Antikörpern und Fusionsproteinen
2.2.4 Biotinylierung von Antikörpern bzw. Fusionsproteinen
2.2.5 „respiratory burst“
2.2.6 IL- 8 Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
2.2.7 Durchflusszytometrie / FACS Analyse
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2.2.8 Phagozytose Assay
2.2.9 Ca2+ FLUX
2.2.10 Apoptose Messung/ Nicoletti Assay
2.2.11 Aggregation von Thrombozyten
2.2.11 Zelllyse
2.2.12 SDS Gel
2.2.13 2D-Elektrophorese
2.2.14 Western Blot
2.2.15 Proteinbestimmungen
2.2.16 RAS „activation“ Assay
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31
3.Ergebnisse
33
3.1 Ligation von Herpes Virus Entry Mediator (HVEM) wirkt synergistisch mit Toll-like
Rezeptoren und GM-CSF in der Aktivierung neutrophiler Granulozyten.
33
3.2. TREM-1 Ligand ist auf Thrombozyten exprimiert.
44
3.1.1 Der monoklonale Antikörper α-Herpes Virus Entry Mediator (HVEM) Klon 122 aktiviert
polymorphnukleäre Neutrophile (PMN).
33
3.1.2 α−HVEM stimuliert PMN in Synergie mit TLR Liganden und GM-CSF.
36
3.1.3. HVEM Ligation resultiert in einer verstärkten phagozytischen Aktivität von neutrophilen
Granulozyten zusammen mit komplementopsonisierten Partikeln, aber nicht mit TLR Ligand oder GMCSF.
40
3.1.4 Die Stimulation von HVEM beeinflusst nicht die Apoptose von neutrophilen Granulozyten
42
3.2.1 Ein Ligand für TREM-1 ist auf humanen Thrombozyten exprimiert.
3.2.2 rsTREM-1 hat keine aktivierenden Auswirkungen auf Thrombozyten.
3.2.3 Thrombozyten verstärken die Aktivierung von LPS stimulierten neutrophilen Granulozyten.
3.2.4 Die durch Thrombozyten vermittelte Aktivierung von neutrophilen Granulozyten ist TREM-1
abhängig.
3.2.5 Die TREM-1/TREM-1L Wechselwirkungen spielen keine Rolle bei der Konjugatformierung
zwischen neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten. Die Konjugatformierung ist Selektin/Integrin
abhängig.
3.2.6 Ohne Konjugatbildung bleibt die Aktivierung von PMN durch Thrombozyten aus.
3.3. Ras ist essentiell für den LPS vermittelten „respiratory burst“ von neutrophilen
Granulozyten.
44
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55
56
3.3.1 Die PI3 Kinase und PLC-γ sind essentiell für den TREM-1/LPS vermittelten „respiratory burst“ von
neutrophilen Granulozyten
56
3.3.2 ERK1/2 zeigt ein biphasisches Phosphorylierungsmuster nach TREM-1 / LPS Stimulation und liegt
der PI3 Kinase nachgeschaltet.
61
3.3.3 p-38 ist essentiell für die LPS/TREM-1 vermittelte Induktion des „respiratory burst“.
62
3.3.4 Ras vermittelt den LPS induzierten „respiratory burst“ „upstream“ der PI3 Kinase.
64
3.3.5 Ca2+ ist Essentiell für den TREM-1 LPS induzierten „respiratory burst“ von PMN
67
4. Diskussion
70
4.1 HVEM aktiviert humane PMN synergistisch mit Toll like Rezeptoren und GM-CSF
70
4.2 Ein Ligand für TREM-1 ist auf der Oberfläche von Thrombozyten expremiert
73
4.3 Amplifikation des „respiratory burst“ nach TREM-1 und TLR4 Stimulation
76
5. Zusammenfassung
81
6. Abkürzungen
82
7. Referenzen
84
1 Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Das Immunsystem
Das Immunsystem hat sich entwickelt, um den permanenten Angriffen von
Pathogenen, denen ein Organismus ausgesetzt ist, entgegenzuwirken. Um die
Bekämpfung von Mikroorganismen und Viren erfolgreich zu gestalten, hat das
Immunsystem eine Vielzahl von Möglichkeiten, Pathogene zu erkennen und diese
zu eliminieren. Traditionell teilt man das Immunsystem in das angeborene
Immunsystem und adaptive Immunsystem ein. Jede Immunantwort wird von aber
von beiden Säulen des Immunsystems (angeboren und adaptiv) getragen. Das
angeborene Immunsystem erkennt konservierte Strukturen auf Pathogenen und
leitet eine schnelle Antwort auf das jeweilige Pathogen ein. Das adaptive
Immunsystem
ist
charakterisiert
durch
seine
hohe
Spezifität
in
der
Antigenerkennung, der Erkennung einer Vielzahl von Erregern, und, die Rezeptoren
des
Immunsystems
können
an
ein
Pathogen
adaptieren.
Das
adaptive
Immunsystem hat zusätzlich die Fähigkeit, ein immunologisches Gedächtnis zu
entwickeln; dabei muss es immer tolerant gegen köpereigene Antigene bleiben, um
Autoimmunreaktionen zu vermeiden.
1.1.2 Das angeborene Immunsystem
Das angeborene Immunsystem besteht aus verschiedenen Bestandteilen. Ein
allgemeiner Schutz vor Pathogenen ist die erste Barriere des angeborenen
Immunsystems: die Haut und die Schleimhaut. Diese haben antimikrobielle
Substanzen, welche dazu führen, dass die Haut und die Schleimhaut nicht nur eine
physikalische Barriere, sondern auch eine chemische Barriere darstellen.
Passiert ein Erreger diese erste Barriere, so kann er durch weitere Komponenten
des angeborenen Immunsystems erkannt werden. Es kommt in Folge dessen zur
Aktivierung einer Vielzahl von molekularen und zellulären Veränderungen zur
Bekämpfung der Erreger. Diese schnelle Antwort des Immunsystems wird
Inflammation genannt.
Das Erkennen von Erregern ist ein kritischer Punkt bei der Pathogenbekämpfung.
Durch Mutationen befinden sich Erreger im ständigen Wandel und müssen dennoch
1 Einleitung
2
erkannt werden, ohne dass das Immunsystem körpereigene Strukturen erkennt und
so gegen den eigenen Organismus eine inflammatorische Antwort auslöst.
Hierfür hat das Immunsystem eine Reihe von Rezeptoren („pattern recognition
Receptors“ (PRRs)) entwickelt, welche häufig vorkommende Strukturen auf
Pathogenen („pathogen associated molekular patterns“ (PAMPs)), die sich selten
verändern, erkennen, und nicht auf höheren Eukaryonten zu finden sind. Die
zellgebundenen PRRs befinden sich vor allem auf Zellen des angeborenen
Immunsystems, wie Granulozyten, Monozyten, Makrophagen aber auch auf
solchen, welche nicht im klassischen Sinn zum angeborenen Immunsytem gehören,
wie z.B.
Thrombozyten [1] und Epithelzellen. Zellen des angeborenen
Immunsystems phagozytieren Pathogene nach Erkennen und töten diese ab.
Makrophagen sind zusätzlich in der Lage, aufgenommene Pathogene zu
prozessieren und die Antigene T-Zellen auf MHCII (Major Histocompatibility
Complex II) Molekülen zu präsentieren und so das adaptive Immunsystem zu
aktivieren. Lösliche PRRs dienen z.T. der Opsonisierung von Pathogenen, oder wie
im Fall des Komplementsystems, der Aktivierung einer Molekülkaskade, welche in
der Zerstörung des Pathogens enden kann. Die Zellen des angeborenen
Immunsystems setzten zusätzlich eine Reihe inflammatorischer Mediatoren frei, die
zur Zerstörung von Pathogenen führen können (antimicrobielle Peptide, lysierende
Enzyme, Proteasen und Sauerstoffradikale).
„Natural Killer Cells“ (NK-Zellen) sind ein weiterer Bestandteil des angeborenen
Immunsystems und können veränderte Expression von MHC I Molekülen an der
Oberfläche von Zellen erkennen. Erkennt eine NK-Zelle eine verringerte MHC I
Expression an der Oberfläche von Körperzellen , welche bei einigen Tumorarten und
Virusinfektionen zu beobachten ist, so werden diese von NK-Zelle lysiert, oder
gezwungen apoptotisch zu werden.
Die meisten Infektionen können mit den Möglichkeiten des angeborenen
Immunsystems bereinigt werden. Einige Erreger überdauern das angeborene
Immunsystem oder entwinden sich diesem. In einem solchen Fall kommt das
adaptive Immunsystem ins Spiel, um eine Beseitigung der Erreger zu gewährleisten.
1 Einleitung
3
1.1.3 Das adaptive Immunsystem
Das adaptive Immunsystem reagiert spezifisch auf einen Erreger. Es wird dabei vom
angeborenen Immunsystem unterstützt und angeregt, hat aber seine eigenen
Möglichkeiten, Erreger auch dann noch zu bekämpfen, wenn die angeborene
Immunität versagt. Dies wird vor allem durch die Möglichkeit einer unbegrenzten
Vielfalt an zu erkennenden Antigenen gewährleistet. Die Zellen des adaptiven
Immunsystems sind Lymphozyten oder auch B- und T-Zellen. Sie besitzen jeweils
nur einen Rezeptor zur Antigenerkennung: dieser ist jedoch sehr variabel. Die
Variabilität der Rezeptoren ist durch die somatische Rekombination möglich, infolge
derer Gene kombiniert werden, um eine Vielzahl an unterschiedlichen Spezifitäten
zu erhalten. Vergrößert wird diese Vielfalt noch durch Punktmutationen.
Bei einer B-Zell vermittelten Immunantwort handelt es sich vor allem um eine
humorale Immunantwort, infolge derer Antikörper gebildet werden, die spezifisch ein
Antigen auf einem Erreger erkennen und so den Erreger opsonisieren, d.h. ihn für
das Immunsystem erkennbar machen. Die Antikörper haben nicht nur eine variable
Region, mit der sie spezifisch an ein Antigen binden können, sondern ein Antikörper
besteht zusätzlich aus einer konstanten Region (Fc-Region). Diese konstante
Region kann von Fc-Rezeptoren auf Phagozyten erkannt werden, welches die
Aufnahme und Zerstörung des Erregers zu Folge hat. Antikörper, die einen Erreger
opsonisiert haben, können auch die Komplementkaskade aktivieren.
B-Zellen können über ein starkes, kreuzvernetzendes
Signal direkt
über
membranständige Antikörper oder aber über die Erkennung eines Antigens bei
gleichzeitiger Stimulation durch eine Th2 Zelle aktiviert werden. Wenn Th2 Hilfe
vorliegt, kommt es zur so genannten Affinitätsreifung der B-Zellen, bei der die
Spezifität der Antikörper noch einmal gesteigert wird. Daraufhin können sich
Gedächtniszellen bilden, die bei erneuter Infektion mit dem gleichen Antigen zu
einer schnelleren, von B-Zellen vermittelten Antwort, führen, da eine Affinitätsreifung
und Kostimulation nicht mehr nötig sind.
T-Zellen können eine direktes Abtöten von Zellen (Cytotoxische T-Zelle (CTL))
vermitteln; sie dienen der Unterstützung von B-Zellen (T-Helfer Zelle 2 (Th2),
aktivieren Makrophagen (T-Helfer Zelle 1 (Th1) oder können regulierend auf
Immunantworten wirken (Regulatorische T-Zelle (Treg)). Eine neu beschriebene Art
der T-Zellen ist die Th17, welche sich durch die Produktion von Interleukin 17 (IL17)
auszeichnet.
1 Einleitung
4
T-Zellen erkennen ihr Antigen über den T-Zell Rezeptor (TZR), welcher sein Antigen
(Peptid)
zusammen
mit
dem
Haupthistokopatibilitätskomplex
(major
histocompatibility complex (MHC)) erkennt. Es gibt zwei verschiedene MHC
Komplexe: MHC I und MHC II. MHC I ist auf allen Köperzellen expremiert, MHC II ist
nur auf der Oberfläche von antigen-präsentierenden Zellen (APCs) vorhanden, wie
Makrophagen oder dendritischen Zellen (DC). Um aktiviert zu werden, benötigt eine
T-Zelle immer zwei Signale: 1. das Antigen mit einem MHC Molekül werden vom TZellrezeptor erkannt, und 2. ein weiteres kostimulatorisches von einer APC. CTLs
(CD8+) vermitteln ihre Zytotoxizität nach Aktivierung, wenn sie ein Antigen auf MHC I
erkennen. Dies führt zur Ausschüttung von Granzym B und Perforrin, welche die
Membran der Zielzelle perforieren. Es kann auch der FAS-Ligand an der Oberfläche
der T-Zelle expremiert werden, welcher an FAS auf der Zielzelle bindet und dort das
Apoptoseprogramm auslöst, und die Zelle schließlich stirbt.
T-Helfer Zellen (CD4+) erkennen ihr Antigen auf MHC II. Sie wirken unter anderem
durch das Ausschütten verschiedener Zytokine auf den Verlauf der Immunantwort.
1.2 Inflammation / Entzündungsreaktion
Wird ein eingedrungener Erreger erkannt, oder werden Zellen durch diese
penetriert, so entsteht eine unmittelbare Antwort des Immunsystems auf diese
Gefahrenzeichen
(„danger
Signals“).
Diese
Antwort
wird
als
Inflammation
bezeichnet. Die Inflammation hat die Aufgabe, Pathogene zu beseitigen. Während
dieses Vorganges arbeiten zelluläre sowie lösliche Faktoren zusammen. Obwohl es
die Aufgabe der Inflammation ist, Pathogene zu beseitigen und den gesunden
Zustand des befallenen Gewebes wieder herzustellen, kann es während der
Inflammation zu gefährlichen Gewebsschädigungen kommen, welche zum Tod des
Individuums führen können.
Gewebsschädigung durch Pathogene, Chemikalien oder Strahlung kann indirekt
erkannt werden, indem die zerstörten Zellen degradierte Zellbestandteile frei setzen,
welche zur Aktivierung der Plasma-Proteasen-Kaskade führen. Die Erkennung kann
auch direkt erfolgen, indem Erreger durch PRRs erkannt werden.
Die Inflammation zeichnet sich durch vier klassische physiologische Eigenschaften
aus: „rubor“ (Rötung), „calor“ (Hitze), „dolor“ (Schmerz), „tumor“ (Schwellung). Diese
1 Einleitung
5
werden von lokalen Infektzeichen wie Vasodilatation (Erweiterung der Blutgefässe),
Erhöhung der Permeabilität der Blutgefässe, Infiltration durch Neutrophile
Granulozyten und sytemischen Zeichen wie Fieber ausgelöst.
1.2.1 Lösliche Bestandteile der Inflammation / Entzündungsreaktion
Proinflammatorische, lösliche Mediatoren werden vor allem an Infektionsorten
gebildet; zu diesen Mediatoren gehören Lipide und Amine, wie Leukotriene,
Prostaglandine, Histamine and Serotonine, des weiteren Zytokine und Chemokine,
die von Zellen des Immunsystems sezerniert werden. Zu den inflammatorischen
Zytokinen bzw. Chemokinen gehören unter anderem TNF-α, IL1, IL-6 und IL-8.
Plasmaproteasen und Proteasen, welche von Makrophagen oder neutrophilen
Granulozyten freigesetzt werden, sind ebenfalls am Infektionsherd vorhanden und
tragen zum toxischen Milieu am Infektionherd bei. Eine weitere Komponente der
inflammatorischen Antwort ist das Komplementsystem. Das Komplementsystem
besteht aus ca. 25 Plasma Proteinen. Es gibt drei Arten, das Komplement- system zu
aktivieren: über den klassischen Weg, indem es über Pathogen bindende Antikörper
aktiviert wird, ferner über den alternativen Weg, der direkten Bindung an
Pathogenoberflächen und drittens der Bindung von Mannose auf Bakterien über
Mannan-bindendes
Lektin
(MBL).
Die
Folgen
der
Aktivierung
des
Komplementsystems sind unabhänig vom Weg der Aktivierung. Es wird eine
Kaskade von Serineproteasen aktiviert, deren Zweck die Zerstörung von Pathogen
mittels eines Membran-Angriff-Komplexes, die Opsonisierung von Pathogen mit
folgendender Phagocytose durch Phagozyten, die einen Komplementrezeptor haben,
und die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten, ist.
Am Entzündungsort befindliche Makrophagen und neutrophile Granulozyten
produzieren toxische Sauerstoffradikale („Reaktive Oxygen Species“ (ROS) und
„Reaktive
Oxygen
Intermediates“
(ROI)).
Verantwortlich
für
die
Sauerstoffradikalproduktion nach Aktivierung der Zellen sind die NADPH-Oxidase
und Myeloperoxidase (MPO). Zu den wichtigsten produzierten Sauerstoffradikalen
gehören: Hyperoxidanionen (O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2), Stickstoffoxid (NO)
und Peroxidradikale.
1 Einleitung
6
1.2.2 Zelluläre Bestandteile der Inflammation
1.2.2.1 Monozyten / Makrophagen
Monozyten
sind
myeloiden
Ursprungs
und
entwickeln
sich
aus
Knochenmarkvorläuferzellen. Makrophagen reifen aus permanent zirkulierenden
Monozyten, die ins Gewebe auswandern. Es sind phagozytierende Zellen, sie
können einen Infektionsort infiltrieren. Makrophagen im Gewebe dienen als eine Art
Alarmsystem. Sie könne eingedrungene Erreger erkennen und durch Freisetzung
von inflammatorischen Mediatoren dazu beitragen, eine Entzündungsreaktion in
Gang zu setzten. Makrophagen können auch als APCs in den Lymphknoten
einwandern und eine adaptive Immunantwort einleiten.
1.2.2.2 Neutrophile Granulozyten (PMN (engl. „polymorphnuclear neutrophil“)
Neutrophile Granulozyten (PMN) sind wie Monozyten myeloiden Ursprungs, d. h. sie
entwickeln sich im Knochenmark. 50-70 % der im Blut zirkulierenden Leukozyten
sind PMN. Entdeckt wurden sie von Eli Metchnikoff. Er entdeckte, dass sie
phagozytierende Zellen sind und nannte sie „microphagocytes“. Die Fähigkeit dieser
Zellen, Mikroben zu töten, konnte ebenfalls gezeigt werden, nachdem die Mikroben
innerhalb von zytoplasmatischen Granula im Zytoplasma der Granulozyten entdeckt
wurden [2]. Ein breites Spektrum an Erregern wird von neutrophilen Granulozyten
über PRRs erkannt. Zu Beginn einer Infektion werden Neutrophile durch Chemokine,
wie z.B. IL-8 angelockt und zu einem Infektionsort geleitet. Dazu müssen PMN das
Epithel
der
Blutgefässe
passieren.
Hierfür
sind
eine
Reihe
von
Oberflächenmolekülen auf PMN und Epithelzellen zuständig (Intergrine und
Selektine), welche das Rollen der PMN entlang des Epithels sowie deren Passage
(Transmigration) durch das Epithel steuern. Nach Infiltration des Infektionsortes
werden PMN über z.B. PRRs, TNF-α, IL-8, GM-CSF und die Komplementfaktoren
C5a und C3a aktiviert.
Die Aktivierung der PMN führt zu einem Anstieg von Sauerstoffradikalen, welche
maßgeblich an der Tötung von Mikroben beteiligt sind [3]. Da eine der zentralen
Funktionen der neutrophilen Granulozyten Abtöten von Erregern ist, wundert es
1 Einleitung
7
nicht, dass ihre Aktivierung auch zu Gewebsschädigung des eigenen Körpers führen
kann [4;5].
Die Produktion von Sauerstoffradikalen wird im englischen
„respiratory burst“
genannt, und im Folgenden weiter als „respiratory burst“ beschrieben.
Die Erzeugung der Sauerstoffradikale (engl. Reaktive Oxygen Species (ROS)) zum
Abtöten von Erregern wird von der Nicotin Adenin Dinucleotid Phosphat (NADPH)
Oxidase katalysiert. Die NADPH Oxidase katalysiert das Umwandeln von Sauerstoff
zu Hyperoxidanionen (O2-) durch Transport von Elektronen über eine Membran. Die
Elektronen werden dabei vom Flavocytochrom b558 transportiert, welches aus den
Untereinheiten gp91phox und p22phox besteht. Mutationen in Genen der
Untereinheiten der NADPH Oxidase oder Funktionsstörungen können zur „chronic
granulomatous disease“ (CGD) führen [6;7]. In unaktivierten PMN liegt die NADPH
Oxidase in getrennten Untereinheiten vor. Flavocytochrom b558 liegt angereichert in
spezifischen Granula (SG) oder in der Membran vor. p47phox, p67phox, p40phox
und Rac2 sind zytosolisch gespeichert. Nach Aktivierung der PMN wandern die
zytosolischen Phoxproteine zur Membran,
wo sie Flavocytochrom b558 binden.
Dieser Vorgang wird nach der Phosphorylierung von p47phox durch die Protein
Kinase C eingeleitet [8;9]. Der Ort, an dem die Hyperoxidanionen gebildet werden,
ist vom Stimulus abhängig. Lösliche Stimuli verursachen die Bildung des NADPH
Komplexes an der Zellmembran und die Hyperoxidanionen werden durch
Elektronentransport extrazellulär gebildet. Hefe und Bakterien führen zur Bildung
Hyperoxidanionen in Phagosomen [10;11]. O2- bildet dann mit Wasser spontan
H2O2, welches in Gegenwart der Myeloperoxidase (MPO) in hochtoxische
„hypochlorous acid“ (HOCl) verwandelt wird. MPO ist in Azurophilischen Granula
(AG) gespeichert.
Das Abtöten von Erregern kann auch von den ROS unabhängig geschehen. Hierfür
sind
in
den
Granula
der
PMN
verschiedene
Stoffe
gespeichert.
1 Einleitung
8
Das Abtöten von phagozytierten Erregern kann aber auch unabhängig von
Sauerstoffradikalen erreicht werden. Hierfür ist eine Reihe von Stoffen in den
Granula der Zellen gespeichert.
Azurophile (primäre) Granula werden zuerst produziert und haben große Mengen an
Proteinen und Peptiden gespeichert, die zur Bekämpfung von Mikroben geeignet
sind. Dazu gehören z.B. Cathepsin G, Elastase und Proteinase 3, BaktricidalPermeability-Increasing
Protein
(BPI),
Defensine,
und
Lysozym
[12-14;14].
Spezifische (sekundäre) Granula beinhalten unter anderem ungesättigtes Lactoferrin,
Lysozym, Gelatinase und Flavocytochrom b558. Gelatinase (tertiäre) Granula
beinhalten Gelatinase in Abwesenheit von Lactoferrin. Auch ein Abtöten von
Bakterien nach dem Ableben der PMN durch aus DNA und Elastase bestehende
Nets mit in diesen verankerten, antibakteriellen Peptiden wurde beschrieben [15].
Neben Phagozytose und dem Töten von Erregern ist die PMN auch in der Lage
Zytokine (z.B. TNF-a) und Chemokine (z.B. IL-8) zu sekretieren. Neutrophile
Granulozyten haben eine kurze Lebensdauer: im Blut zirkulierend werden sie bereits
nach ca. 8h apoptotisch. Nach Aktivierung von PMN verzögert sich die Apoptose der
Zellen. Apoptotische PMN werden von Makrophagen aufgenommen, und so wird der
Infektionsort von ihnen bereinigt.
1.2.2.3 Inflammation und Thrombozyten (Blutplättchen)
Thrombozyten sind keine Zellen im eigentlichen Sinn: ihnen fehlt der Zellkern. Sie
entstehen durch Abschnürren von Megakaryozyten im Knochenmark. Thrombozyten
haben Mitochondrien und eine spezielle Form des rauen, Endoplasmatischen
Retikulums (rER), das sogenannte kanikuläre System, welches der schnellen
Mobilisierung von gespeicherten Granula dient [16]. Nach Aktivierung setzen
Thrombozyten sogenannte α−Granula frei: unter anderem Chemokine, adhäsive
Proteine, Wachstumsfaktoren und Glykoproteine. Zusätzlich werden „dense bodies“
freigesetzt. Nach einer Verletzung oder Infektion beginnen Thrombozyten zu
aggregieren und einen „Thrombus“ zu bilden. Dies geschieht vor allem über
membranständige Glykopreoteine, welche Kollagen und Fibrinogen [17;18] nach
Kontakt mit dem von Willebrandt Faktor (vWF) binden. Fibrinogen wird im weiteren
Verlauf durch Thrombin zu Fibrin gespalten, welches die Verbindungen im Thrombus
stabilisiert.
1 Einleitung
Thrombozyten
9
können
gramnegative
Bakterien
auch
direkt
über
den
membranständigen TLR4 Rezeptor erkennen [19]. Aktivierte Thrombozyten können
Leukozyten zu Infektionsorten leiten und den „respiratoriy burst“ von PMN und die
Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen bei PMN und Monozyten verstärken
[20-22].
Die
Bindung
von
Thrombozyten
an
Leukozyten
geschieht
über
membranständige Integrine und Selektine [23].
1.2.3. Auflösen der Entzündungsreaktion „resolution of Inflammation“
Eine Entzündungsreaktion muss reguliert werden, da eine anhaltende Entzündung
zu Gewebsschädigungen führen kann. Zum Auflösen der Inflammation tragen die
konstitutive Apoptose von PMN sowie die spätere Phagozytose durch Makrophagen
bei. Auch lösliche Faktoren spielen hierbei eine Rolle. IL-4 verringert die Aktivität der
NADPH-Oxidase in Phagozyten und die Freisetzung von IL-6. Von T-Zellen
produziertes IL-10 führt zu einer Verminderung von proinflammatorischen Zytokinen
sowie zur Induktion der Apoptose bei Neutrophilen. TGF-β wirkt ebenfalls als ein
antiinflammatorisches Zytokin. Unter anderem verringert es die Adhäsion von
Leukozyten am Endothel und hemmt die Freisetzung von proinflammatorischen
Zytokinen. Zusätzlich gibt es Lipide (Resolvin-E1, Protectin-D1)[24], welche aktiv
zum Auflösen einer Entzündungsreaktion bzw. dem Verlassen von Leukozyten und
einer geringeren Infiltration beitragen.
Kann das Immunsystem einen Erreger nicht beseitigen, so kann es zum Ausbreiten
des Erregers in den Blutkreislauf kommen. Daraufhin kann eine systemische
Inflammation entstehen, welche klinisch in das „systemic inflammatory response
syndrom“ (SIRS) und die Sepsis unterteilt werden. Eine außer Kontrolle geratene,
systemische Entzündung kann zum septischen Schock mit multiplem Organversagen und schließlich zum Tod des Patienten führen. Allein in Amerika erkranken
ca. 750.000 Menschen jährlich an einer Sepsis und ca. 250.000 davon sterben an
den Folgen.
1 Einleitung
1.4
10
Rezeptoren
des
angeborenen
Immunsystems
(Pattern
Recognition Receptors (PRRs))
Das Immunsystem hat mehrere PRRs zum Erkennen von Pathogenen. Sie kommen
auf der Oberfläche von Zellen oder intrazellulär vor, andere wiederum werden ins
Plasma oder in Gewebsflüssigkeiten sezerniert [25]. Die Aufgabe der PRRs ist es,
Pathogen für das Immunsystem erkennbar zu machen (Opsonisierung), die
Aktivierung
des
Komplementsystems
und
der
Koaglutationskaskade,
der
Phagozytose und proinflammatorischer Signalkaskaden [26] zu bewirken.
Zu den sezernierten Rezeptoren gehören Mananbindendes Lektin (MBL), Creaktives Protein (CRP) und Serum Amyloid Protein (SAP), welche alle das
Komplementsystem aktivieren, sowie die Oberflächen von Pathogen binden bzw.
opsonisieren können [27-31].
Intrazelluläre Rezeptoren befinden sich in zellulären Kompartimenten, z.B. im
Zytosol. Sie schützen gegen Viren und Bakterien, welche ins Innere von Zellen
gelangt sind. Zu ihnen gehören die Proteinkinase R (PKR), welche dsRNA erkennt
[32], die Familie der NOD Proteine, welche unter anderem Lipopolysaccharid (LPS)
erkennen [33;34], retinic acid inducible gene-I (RIG-I), melanoma differentiation
factor-5 (MDA-5) und DNA-dependent activator of IRFs (DAI), die alle mit dem
Erkennen von Viren in Verbindung gebracht werden [35;36]. Auch in der Toll-Like
Rezeptorfamilie (TLR) gibt es einige intrazelluläre Rezeptoren: diese werden später
in einem eigenen Abschnitt behandelt.
PRRs an der Zelloberfläche sind z.B. der Makrophagen-Mannose-Rezeptor (MMR),
welcher grampositive und gramnegative Bakterien erkennt [37] Der MakrophagenSkavenger-Rezeptor (RSZ) erkennt unter anderem dsRNA und LPS [38], MARCO
erkennt bakterielle Zellwandbestandteile [39].
1.4.1 Toll Like Rezeptoren (TLR)
Gefunden wurde das erste Mitglied der Toll Familie in Embryonen von Drosophila
und ist dort an der Bildung der dorso-ventral Achse beteiligt [40;41]. Auch eine
Beteiligung von Toll Genen an der Reaktion in Drosophila gegen gramnegative
Bakterien und Pilze konnte nachgewiesen werden [42;43].
1 Einleitung
11
Der erste TLR, der bei Vertebraten mit dem Immunsystem in Zusammenhang
gebracht wurde, ist ein humanes Homolog zu Drosophila Toll, TLR4 genannt, und ist
unter anderem an der Detektion von LPS beteiligt [44-46]. TLR4 ist nicht direkt für die
Bindung von LPS verantwortlich. Das LPS Binding Protein (LBP) CD14 und MD-2
sind maßgeblich an der Bindung von LPS beteiligt [47;47-49]. Bis heute wurden 11
verschiedene TLRs gefunden, welche unterschiedliche Liganden erkennen und auf
der Zelloberfläche sowie intrazellulär vorkommen [50].
Nach Kontakt mit ihren jeweiligen Liganden induzieren TLRs die Expression
verschiedener Gene von beispielsweise
proinflammatorischen
Chemokinen,
Molekülen,
Zytokinen,
kostimulatorischem
MHC
antibakteterieller
Moleküle
und
und
antiviraler
Mediatoren [26]. Die Aktivierung dieser
Gene wird durch das Auslösen von
intrazellulären Signalkaskaden erreicht.
Nach Aktivierung eines TLR bindet das
Adaptormolekül MyD88, welches eine CTerminale TIR Domäne hat. MyD88
besitzt
zusätzlich
eine
N-Terminale
Abb. 1.1 TLR4 Signalkaskade
„Death Domain“, welche an die „Death
Domain“ des
Moleküls IRAK bindet
Abb. 1.4 TLR4 Signalkaskade
[51]. IRAK ist eine Serin Theorin-Kinase und phosphoryliert sich nach Bindung an
MyD88 selbst (Autophosphorylierung). Der so entstandene Komplex beinhaltet noch
TRAF6 und ist in der Lage, die IκB Kinase zu aktivieren, welches zur Degradation
von IκB führt und den Transkriptionsfaktor NFκB freisetzt, das ohne seinen Inhibitor
(IκB) in den Nucleus einwandern kann [52;53]. Zusätzlich zu dem beschriebenen
Weg müssen noch alternative, MyD88 unabhängige Wege nach der Aktivierung von
TLRs bestehen. Studien mit MyD88-/- (MyD88 knock out) Mäusen konnten zeigen,
dass es zu einer Aktivierung von NFκB kam, die unabhängig von MyD88 war [54].
Auch die Existenz anderer Signalwege neben der Aktivierung von NFκB ist
beschrieben. So kommt es nach TLR Stimulation zu Aktivierung der MAPK [55] oder
auch zur Aktivierung der PI3 Kinase [56-58].
1 Einleitung
12
1.5 Herpes Virus Entry Mediator (HVEM)
Der Herpes Virus Entry mediator (HVEM) ist ein Rezeptor der TNF Rezeptorfamilie
und ist auf einer Reihe von hämatopoetischen Zellen expremiert, darunter T- und BZellen sowie Zellen myeoliden Ursprungs, wie dendritischen Zellen, Monozyten und
neutrophilen Granulozyten [59;60]. Entdeckt wurde HVEM in seiner Eigenschaft,
Glycoprotein D des Herpes simplex Virus zu binden [61]. Der Rezeptor wird, wenn er
mit seinen natürlichen Liganden Lymphotoxin-α (LT-α) oder LIGHT (lymphotoxin,
exhibits inducible expression, and competes with Herpes simplex Virus glycoprotein
D for Herpes Virus Entry mediator) in Kontakt kommt, als kostimulatorischer
Rezeptor beschrieben [62-65]. LIGHT ist auf DCs, Monozyten und aktivierten TZellen expremiert, er kann aber auch von Thrombozyten freigesetzt werden und
unter anderem Monozyten aktivieren [66;67]. Lymphotoxin-α ist ein Mitglied der TNF
Zytokinsuperfamilie und war früher als TNF-β bekannt. Es kommt löslich als
Homotrimer vor und wird von B- und T-Zellen gebildet. HVEM bindet zusätzlich BTLA
(B- and T- Lymphocyte attenuator), welcher zur Immunoglobulin Superfamilie gehört.
Die Bindung von BTLA hat inhibitorische Auswirkungen auf HVEM expremierende TZellen [68-70]. BTLA ist auf B-, T-Zellen DCs myeloiden Zellen und in somatisches
Gewebe expremiert [71-73]. Stimulation von HVEM auf PMN kann deren
antibakterielle Aktivität erhöhen [59].
Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie trimerisieren, wenn sie ihre TNF Liganden über
cysteinreiche Regionen (cysteine rich domains (CRDs)) binden [74;75].
1 Einleitung
13
1.6 Triggering Receptor expressed on Myeloid Cells 1 (TREM-1)
TREM-1 gehört zur der Familie der TREM Proteine und war das erste, welches aus
dieser Familie identifiziert wurde [76]. Zur TREM Familie gehören Proteine, welche
auf DCs, Monozyten, Makrophagen, Mircroglia, Osteoclasten Thrombozyten und
PMN expremiert sind [76-86]. TREM Proteine haben pro- und anti-inflammatorische
Auswirkungen. Das TREM Cluster liegt beim Menschen auf dem Chromosomlokus
6p21 und bei der Maus auf 17C3 [87]. Alle Rezeptoren der TREM Familie gehören
zur Immunoglobulinsuperfamilie.
Das humane TREM-1 besteht aus einer Ectodomäne, einer transmembranen Region
und einem kurzem zytoplasmitischen Ende. Das zytoplasmatische Ende ist in der
Lage, mit dem Signaladaptermolekül DAP12 einen Komplex zu formen [76]. DAP12
besitzt eine „immunereceptor tyrosine-based activation motif“ (ITAM) [88-90]. Als
Antwort auf die Rezeptorligation phosphoryliert die Src Kinase das Tyrosin im DAP12
ITAM Motif. Daraufhin kann die Protein-Tyrosin-Kinase Syk an das phosphorylierte
Tyrosin (docking site) binden. Syk kann dann LAT und NTAL phosphorylieren,
welche wiederum die PI3 Kinase, Phospholipase C-γ, SLP76-Vav, Grb2-Sos und cCbl mobilisiert, und nachfolgend können Akt, MAPK, Protein Kinase C aktiviert sowie
Calcium mobilisiert werden [88-90]. TREM-1 ist proinflammatorisch, wohingegen
TREM2, welches ebenfalls mit DAP12 assoziiert ist, als die Inflammation inhibierend
beschrieben wird [76;91-95].
Es konnte gezeigt werden, dass
die
Oberflächenexpression
von
TREM-1 nach Stimulation mit LPS
oder anderen bakteriellen Stimuli
auf Monozyten hochreguliert wird.
Die Stimulation von TREM-1 (mit
monoklonalen
Antikörpern)
gemeinsam mit der Stimulation
von
TLRs
oder
Nod
like
Rezeptoren
führte
zur
synergistischen
Aktivität
von
Makrophagen
und
PMN
[76;91;92;94;96-98]. Dass TREMAbb. 1.2 TREM-1 Signalkaskade
1 Einleitung
14
1 die inflammatorische Antwort auf Bakterien „triggert“, konnte auch anhand von
Infektionsmodellen in Mäusen gezeigt werden. Hierfür wurden ein mit der TREM-1
Ectodomäne der Maus identisches Protein (rsTREM-1) und ein Peptid, welches einer
konservierten Struktur der Ectodomaine von TREM-1 bei Maus und Mensch
entsprach (LP17), hergestellt. Diese wurden den Tieren verabreicht, um in
Konkurrenz mit der Bindung von TREM-1 auf der Zelloberfläche an den natürlichen
Liganden zu treten, und so die Amplifikation der Immunantwort zu verhindern.
Versuche mit LPS induzierten endotoxischem Schock oder andere septischen
Tiermodellen (Cecal Ligation Puncture (CLP)) haben gezeigt, dass Zytokinlevel nach
Behandlung mit rsTREM-1 und LP17 reduziert waren, und mehr Tiere die
Behandlung überlebt hatten [99;100].
Neben der membranständigen Form von TREM-1 existiert auch eine lösliche Form
von TREM-1 (sTREM-1). Diese wurde in bronchoalveolären Lavagen und im Serum
von Patienten mit Infektionen gefunden und könnten zur Diagnose von infektiöser
Pneumonie oder Sepsis dienen [101;102], da bei Patienten ohne Infektion kein
sTREM-1 gefunden werden konnte. sTREM-1 wurde ebenfalls bei „peptic ulcer
disease-“ und beim „inflammatory bowel disease“-Patienten gefunden [103;104].
Nach Stimulation von PMN oder Monozyten mit TLR Liganden konnte ebenfalls
sTREM-1 in Kulturüberständen nachgewiesen werden [105;106] Der Ursprung der
löslichen Form von TREM-1 ist aber noch nicht endgültig aufgeklärt. Zu dem
Ursprung von sTREM-1 gibt es unterschiedliche Ergebnisse. sTREM-1 könnte durch
Translation einer alternativen mRNA Splice Variante [107;108] oder durch
Abspaltung oder Abwerfen (shedding) von der Membran [109;110] entstehen.
Ebenfalls beschrieben sind lösliche Formen von anderen Mitgliedern der TREMFamilien Proteine: TREM-2 und TLT1 [80;111].
Neben TREM-1 wurden folgende Mitglieder der TREM Familie entdeckt. TREM-2 auf
Microglia, Osteoclasten, Monozyten und DCs [80;81;83;85;112], TREM-3 auf
Mausmakrophagen [78], TREM Like Transcript 1 (TLT1), auf Thrombozyten
[113;114] und TLT2 auf B-Zellen, PMN und Makrophagen [115] identifiziert.
Liganden für TREM-1 oder für andere TREM-Familien Proteine wurden bisher nicht
identifiziert. Die Gegenwart eines TREM-1 Liganden in Patientenseren [116;117] und
dass Filoviren TREM-1 direkt aktivieren [118] wurde dokumentiert. Die in vivo
dokumentierte Relevanz der Unterbindung von TREM-1 Signalen spricht für die
Existenz eines endogen vorkommenden Liganden [119].
1 Einleitung
15
1.3 Intrazelluläre Signalkaskaden führen zur Aktivierung von Zellen
Wird ein Rezeptor von seinem Liganden gebunden, so wird eine Signalkaskade
ausgelöst. Moleküle werden am Rezeptor aktiviert, um ein Signal von der Membran
ins Zytosol und schließlich in den Kern einer Zelle weiterzuleiten. Dieses wird als
Signalkaskade bezeichnet und ist verantwortlich für die Steuerung der Funktionen
einer Zelle und kann in der Aktivierung von Genen und darauf folgend, in der
Neusynthese von Proteinen resultieren. Im Folgenden sollen einige, bekannte
Signalkaskaden erläutert werden.
1.3.1 Ras eine kleine GTPase / GTP-Bindendes Protein
Unter den kleinen GTPasen versteht man eine Familie von Molekülen, welche in
einer Reihe von zellulären Signalwegen involviert sind. Zu den kleinen GTPasen
gehören die Subfamilien Ras, Rho, Arf, Rab, und Ran (20-25kD). Alle GTPasen
wechseln zwischen einem aktivierten GTP bindenden und einem inaktiviertem GDP
bindenden Zustand. Kleine GTPasen werden durch postranslationelle Modifikationen
(anhängen
von
Fettsäureresten
Farnesyl-,
Geranylgeranyl-,
Myristyl-
oder
Palmitylrest) an die Membran gebunden.
Bei der Aktivierung der kleinen GTPase
Ras ist der „guaninenucleotide exchange
factor“ (GEF) maßgeblich beteiligt. Er
bindet GDP gebundenes Ras und GDP
kann daraufhin dissozieren und GTP so an
Ras
binden.
Der
Nukleotidaustausch
versetzt Ras in seinen aktivierten Zustand
und so kann Ras an Effektorproteine
binden.
Die
Inaktivierung
von
Ras
geschieht über Hydrolyse unter Mithilfe des
Abb. 1.3 Aktivierung von Ras
GTPase aktivierenden Proteins (GAP). Die Aktivierung von Ras resultiert unter
anderem in der Aktivierung der „mitogen activated protein kinasen“ (MAP Kinasen)
1 Einleitung
16
Signalkaskade. Eine Aktivierung der PI3 Kinase durch Ras wurde ebenfalls
beschrieben [120].
1.3.2 Aktivierung der Phospholipase C-γ (PLC−γ)
Die Phospholipase C-γ (PLC−γ) ist ein
Enzym,
welches
über
zwei
Src
Homologie-domainen 2 (SH2) verfügt und
mit diesen an ein Phosphotyrosin bindet.
Durch
die
Phosphorylierung
eines
Tyrosins wird die PLC−γ aktiviert. Die
PLC−γ leitet Signale von der Membran ins
Zytosol. Dabei spaltet sie das Molekül
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
(PIP2) in zwei Moleküle: Inositol-1,4,5trisphosphate
(IP3)
und
1,2-sn-
Diacylglycerol
(DAG).
Ein
Molekül
PLC−γ kann mehrere Moleküle IP3 und
DAG produzieren und somit fungiert die
Abb. 1.4 PLC-γ Signalkaskade
PLC−γ auch als Signalverstärker. IP3
bewirkt über seine Rezeptoren im Endoplasmatischen Reticulum ein Ausströmen von
Ca2+ Ionen ins Zytosol, welches wiederum weitere Moleküle aktivieren kann. DAG
kann die Proteinkinase C (PKC) aktivieren. PKC ist eine Serin-Threonin
Proteinkinase. Einige Isoformen von PKC werden auch durch Ca2+ aktiviert.
1.3.3 Mitogen aktivierte Proteinkinasen (MAPKinasen (MAPK)
Die Aktivierung der MAPK nach Phosphorylierung führt zu einer Regulierung und
oder Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Es gibt vier verschiedenen Gruppen von
MAPK: „extracellularsignal-regulated kinases“ (ERK)-1/2, Jun-amino-terminal kinases
1 Einleitung
17
(JNK)-1/2/3, stress activated protein kinases (SAPKs) oder p38 proteins (p38α/β/γ/δ)
und ERK 5. Die Signalkaskade, welche zur Aktivierung der MAPK führt, ist eine
Kinasenkaskade, in welcher MAPK Kinase (MAPKK), die MAPK aktiviert, selber
wiederum von der MAPKK Kinase aktiviert wurde (s.Abb.1.5). Die meisten von der
MAPK aktivierten Transkriptionfaktoren sind an der Aktivierung von FOS Genen
beteiligt sind. Fos Gene bilden Heterodimere mit Jun Proteinen und bilden den
„activation protein complex-1“ (AP-1). Aber auch andere Gene werden durch MAPK
reguliert. MAPK wurden mit der Stabilisation von m-RNA und der Regulierung von
Überleben und Tod von Zellen und verschiedenen, zellulären Prozessen in
Zusammenhang gebracht.
Abb. 1.5 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalkaskade
PI3 Kinasen sind eine Familie von Lipidkinasen, die sich dadurch auszeichnen, die
3`OH Gruppe des Inositolringes in Inositolphospholipid zu phosphorylieren. Die PI3 K
besitzt eine SH2 Domaine, über die sie Phosphotyrosine binden kann und
autokatalytisch aktiviert wird. Die Aktivierung der PI3 Kinase hat die Bildung von
Phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate (PI(3,4)P) und oder Phosphatidylinositol-3,4,5trisphosphate (PI(3,4,5)P) in der Plasmamembran zur Folge. (PI(3,4)P) und
1 Einleitung
18
(PI(3,4,5)P) können an Pleckstrin-Homology-Domaine (PH), z.B. von den Serin /
Threonin Kinasen Akt und die 3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK-1)
binden. PDK-1 und Akt werden an der Membran über ihrer PH Domainen
kolokalisiert, dabei wird Akt von PDK-1 phsphoryliert.
Die PI3 Kinase und Akt werden mit einer Reihe von zellulären Prozessen, wie der
Regulierung des Zellzyklus, der Apoptose und dem zellulärem Wachstum in
Verbindung gebracht.
2 Material und Methode
19
2.Material und Methode
2.1 Material
2.1.1 Grundmedien
2.1.1.1 Medium für polymorph nukleäre Zellen (PMN)
Iscove´s Medium (MDM, Invitromex), 5% Fetales Kälber Serum (FCS) (Vitromex).
2.1.1.2 Test Medium (TM)
Iscove´s Medium (MDM, Invitromex), 1% Penicillin/Streptomycin (Serva), 1% NaPyruvat (Seromed), 1% L-Glutamin (Roth), 5% FCS (TM5) bzw. 10% FCS (TM10)
2.1.1.3 Humaner Tyrode Puffer
5 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 11.9 mM NaHCO3, 1 mM MgCl, 0.1%
BSA, 1% Glucose (Roth)
2.1.1.4 Medium zum Einfrieren von Zellen
90% FCS, 10% DMSO (Sigma)
2.1.1.5 Medium für Hybridomzellen bzw. SP02
Iscove´s Medium (MDM, Invitromex), 1% Penicillin/Streptomycin (Serva, 10mg/ml),
1% Na-Pyruvat (Seromed), 1% L-Glutamin (Roth), 1% low IgG FCS (Sigma)
2 Material und Methode
20
2.1.2 Antikörper
2.1.2.1 Primäre Antikörper
Anti human CD18, PSGL-1, TLT-1, HVEM Klon 122 (zur Verfügung gestellt von
Beyoung S. Kwon, University of Ulsan, Korea), TREM-1 (R+D), anti Phospho Akt,
phospho p38, phospho p44/42, p44/42 (Cell Signaling),
-actin (Sigma)
2.1.2.1.1 Konjugierte Primäre Antikörper
anti human CD66b FITC Coulter Immunotech, CD62L, CD45, CD41a, CD62p, alle
BDBioscience
2.1.2.1.2 Primäre Antikörper aus eigener Herstellung
anti human TREM-1 Klon 1C5, TREM-1 Klon 6B1, Fc Klon 4C9,
humanes IgG (aus Plasma aufgereinigt)
2.1.2.2 sekundäre Antikörper
anti -Hase, -Maus, -Ratte Horse Raddish Peroxidase (HRP) konjugiert (Cell
Signaling), anti human Fc PE/FITC konjugiert, anti Maus Fc PE/FITC konjugiert, anti
Maus IgG1 (Fab)2 (alle Dianova).
2.1.3 ELISA- Standards und Kits
IL-8 detection capture standard (R+D Bioscience)
TREM-1 detection: (Klon 6B1 aus eigener Herstellung), capture: (biotinylierter Klon
6B1), Standard: TREM-1::IgG1 fusions Protein (eigene Herstellung; zur Verfügung
gestellt von Ludger Grosse-Hovest Tübingen), rsTREM-1 (eigene Herstellung)
2 Material und Methode
21
2.1.4 Standard Chemikalien
ß-Mercaptoethanol, DMSO, EDTA, EGTA, Ethanol, Formaldehyd, Glycerol, H2SO4,
Triton-X, Natriumazid, NaCl, MgCl, Saponin, Tris, Tween20, Na2HPO4, HCl, NaOH
(i.d.R. von Fluka, Roth, Merck und Sigma)
2.1.5 Materialien
Triton-X-100
Roth
Tween20
Roth
BSA
Roth
FCS
diverse Hersteller
TMB
Sigma
Trypanblau 0,05%(w/v)
Gibco
Penicillin/Streptomycin
Sigma
Glutamin
PAA
Natriumpyruvat
Sigma
SDS
Roth
Western Lightning Chemiluminescense detection Kit
Pierce
Western Lightning Chemiluminescense detection Kit femto
Pierce
Whole Blood Lysis Puffer
BD Bioscience
Complete Protease Inhibitor Cocktail
Roche
Aprotitnin
Sigma
Leupeptin
Sigma
Pepstatin A
Sigma
NaF
Sigma
Na- Orthovanadat
Fluka
PMSF
Sigma
DTT
Sigma
Protein Assay
BioRad
Roti Nanoquant
Roth
DCFH-DA
Sigma
Protein A Säule
GE Healthcare
Protein G Säule
GE Healthcare
2 Material und Methode
22
Desalting Säule
GE Healthcare
Blotting Papier
Roth
Nitrocellulose Membran
Amersham
Polymorphprep
Nycomed
PE Beads
Polyscience
LP17
Pepscan
LP17 control
Pepscan
Biotin
Sigma
Fluo3-AM
Invivogen
Calcein
Sigma
PKH26
Invitogen
TEMED
Roth
2.1.6 Puffer
Coating Puffer:
0,1mM Na2HPO4 in ddH2O
ELISA Blocking Puffer:
0,05% Tween 20, 1%BSA
ELISA washing Puffer:
0,05% Tween-20 in PBS
Reagent Diluent:
0,1% BSA, 0,05% TWEEN-20,
20mM TRIS, 150mM NaCl, pH
7,3
Western Blocking Puffer:
0,05% Tween 20, 1-5% BSA
bzw. Milchpulver,
Western Washing Puffer:
0,05% Tween-20 in PBS
ACK Puffer: 50mM NH4Cl,
1mM KHCO3, 0,1mM EDTA
FACS Puffer:
1% BSA, 0,02% Natriumazid
Kathodenpuffer:
50mM
Natriumborat,
0,05%
SDS
Anodenpuffer:
50mM
Natriumborat,
20%
Methanol
Nicoletti Puffer:
50μg/ml propidium iodide (PI),
0·1% sodium citrate, 0,1%Triton
X-100, (Sigma)
2 Material und Methode
RIPA Puffer:
23
50 mM Tris/HC,l 1% Triton X100, 300 mM NaCl,
5 mM EDTA, 5mM EGTA
2.1.7 Inhibitoren
TMB-8, MRS1845, LY294002, Manumycin A, SB203580, U73122, PD98059 (alle
Calbiochem),
2.1.8 Stimulantien
Lipopolysaccharide (LPS) from Salmonella typhimurium (Sigma), palmitoyl-3-CysSer-(Lys)4 (Pam3Cys) (EMC), Imiquimod (Invivogen), R848(Invivogen), Phorbol 12myristate 13-acetate (PMA) (Sigma), Thrombin (Sigma), GM-CSF (Immunex)
2.1.9 Verwendete Geräte
TECAN Reader (Genios und SpectraFluor plus(TECAN)), FACS Canto (BD
Bioscience), pH Meter, Wasserbad, Vortexer, Pipetten,Multikanal Pipetten, Pipettierhilfe, Präzisionswaagen, Sterilbank, Inkubator, Elektrophoresekammer, Power
Supply, Zentrifugen, Magnetrührer, Kühlschränke (4° bis -80°C), Stickstofftanks,
Mikroskop, ÄKTA, Apact 4s plus, MINI PROTEAN 3 2-D Elektrophoresekammer.
2.1.10 Plastik und Glas Waren
96-Wellplatten (Rundboden, Flachboden, Spitzboden) transparent (Greiner)
ELISA 96-Well Maxisorb (Nunc)
48-, 12-, 6-Well Platten Greiner
FACS Röhrchen (5ml bzw. 500µl (Greiner))
Eppendorf caps 0,5ml und 1,5ml (Eppendorf)
14ml und 50ml Falcons (Falcon)
Petrischalen (Greiner)
MINI PROTEAN 3 Glasplatten
2 Material und Methode
24
2.2 Methoden
2.2.1 Zellen
2.2.1.1 Zelllinien
Alle Zellen bzw. Zelllinien wurden in der Sterilbank in Kultur gehalten. Um
Kontaminationen zu vermeiden, waren die benutzten Geräte (Pipetten etc.). zuvor
mit Ethanol gereinigt. Alle Zellen kultivierten bei 5% CO2 und 37°C und
feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im Inkubator.
2.2.1.2 Aufreinigen von polymorphnukleären Zellen (PMN) aus humanen Blut
Die Aufreinigung von humanen PMN folgte mittels Dichtegradienten - Zentrifugation.
Gesunden Probanden wurde nach einer Einverständniserklärung maximal 50ml
heparinisiertes bzw. mit NaCitrat (11mM) versetztes Blut durch einen Arzt
abgenommen. Das Blut wurde zu gleichen Anteilen über 37°C warmen
Polymorphprep (in 14ml oder 50ml Falcons) geschichtet und bei 1600 U/min bei RT
für 35minmit möglichst langsamen Beschleunigen bzw. Abbremsen zentrifugiert. Die
Bande mit den PMN wurde vorsichtig präpariert und in ein 50ml „Tube“ überführt und
mit 37°C PBS gewaschen. Es wurde nun 5min RT bei 1700 U/min zentrifugiert und
der Überstand verworfen. Das gereinigte Zellpellet wurde für 5 min in 10ml ACK Lysepuffer aufgenommen, um die verbliebenen Erythrozyten zu lysieren. Danach
wurde für 2min RT bei 1800 U/min zentrifugiert, und die Zellen ins Medium
aufgenommen.
2.2.1.3 Aufreinigen von Thrombozyten aus humanen Blut
Humanes
Blut
wurde
mit
NaCitrat
versetzt
und,
wie
oben
beschrieben,
abgenommen.
Zur Trennung des thrombozytenreichen Plasmas wurden 10 – 50 ml Blut bei 100 G
für 15min. bei geringem Beschleunigen bzw. Abbremsen zentrifugiert. Das Plasma
mit den Thrombozyten wurde entnommen und über 34%iges BSA geschichtet und
bei 500 G bei geringem Beschleunigen bzw Abbremsen zentrifugiert, um die übrigen
2 Material und Methode
25
Erythrocyten von den Thrombozyten zu trennen. Die Thrombozyten, welche sich an
der Interphase zwischen Plasma und 34%igen BSA gesammelt hatten, wurden
präpariert und in humanem Tyrodepuffer plus 5 mM EGTA aufgenommen.
2.2.1.4 Zellzahl Bestimmung
Die Zellzahl wurde bestimmt, um in allen Versuchen mit vergleichbaren Zellanzahlen
bzw. Anzahl an vitalen Zellen zu arbeiten und so Daten vergleichbar zu halten. Zur
Zellzahlbestimmung wurden 20 µl der Zellsuspension mit 180 µl Trypanblau versetzt
und in einer Neubauerkammer ausgezählt (16 Grossquadrate). Die Anzahl der Zellen
wird mit 104 und dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Trypanblau färbt Zellen, deren
Membranen beschädigt sind, tief Blau und infolge dessen ist ein Rückschluss auf
den Erfolg der Zellpräparation gegeben.
2.2.2 Zellstimulation
Zellen oder Thrombozyten wurden mit den angegebenen Konzentrationen an
löslichem Stimulans behandelt. Die Stimulation des TREM-1 Rezeptors oder von
HVEM, welche zur Stimulation kreuzvernetzt werden müssen, erfolgte entweder
durch „coaten“ der Antikörper in PBS oder in coating Puffer bei 4°C über Nacht in
einer 96 Well Flachbodenplatte. Eine weitere Möglichkeit des Kreuzvernetzens der
Antikörper war durch Zugabe eines sekundären Antikörper gegen Fc-Teil des
primären Antikörpers (anti-Maus (Fab)2).
2.2.3 Gewinnung von Antikörpern und Fusionsprotein
2.2.3.1 Überstand von Hybridomazellen sammeln
Hybridomazellen werden zur Produktion von Antikörpern benötigt. Bei diesen Zellen
handelt es sich um eine Fusionierung von B-Lymphoblasten mit Myelomazellen, der
mit dem Antigen immunsiertem Wirt (Maus). Die so erschaffene Hybridomazelle
sezerniert monoklonale Antikörper und hat die Fähigkeit, sich beliebig oft zu teilen.
Die verwendeten Hybridomazellen wurden von Markus Radsak (Mainz) zur
2 Material und Methode
26
Verfügung gestellt. Es handelt sich hierbei um Zellen, die spezifisch für TREM-1
(Klon 1C5 und 6B1) sowie für den humanen Fc-Teil von Antikörpern (Klon 4C9) sind.
Zur Gewinnung des Überstandes wurden die Hybridomazellen in einem Medium mit
1% ultra low IgG FCS kultiviert, um eine Verunreinigung mit anderen Antikörpern so
gering wie möglich zu halten. Die gewonnenen SN wurden gesammelt und auf ihren
Gehalt an Antikörpern mittels ELISA gegen Maus Antikörper getestet.
2.2.3.2 Fusionsprotein
Das Fusionsprotein aus der extrazellulären Domaine von TREM-1 und dem Fc Anteil
von humanem Antikörper wurde aus dem Überstand von SP02 Zellen gewonnen,
welche in 1% ultra low IgG FCS Medium kultiviert wurden.
2.2.3.3 Fällen des Überstandes von Hybridomazellen und SP02 Zellen mit
Ammoniumsulfat
War der Überstand mit Antikörpern reichlich angereichert, so wurde dieser „gefällt“.
Bei der Fällung wurde schubweise Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von
50% hinzugegeben, und das Salz unter Rühren gelöst. Nach kompletter Zugabe des
Salzes wurde noch 1 h weiter gerührt. Anschließend wurde der SN ÜN bei 4°C
gelagert. Der gefällte Überstand wurde bei 6500 U/min 30min RT zentrifugiert, Das
Pellet wurde 2 mal in 0,1M NaHCO3, 50% (NH4)2SO4 pH 8,3 gewaschen, um es
anschließend in PBS oder 0,1M NaHCO3 aufzunehmen.
2.2.3.4 Aufreinigen von Antikörpern und Fusionsproteinen
Die
Antikörper
oder
Fusionsproteine
wurden
durch
Säulenchromatographie
aufgereinigt. Das Prinzip der Aufreinigung beruht auf einer spezifischen Bindung des
Fc-Teils des Antikörpers an Protein A bzw. Protein G, welche durch Senken des pH
Wertes reversibel ist. Welche Säule im Einzelfall zu benutzen ist, kann in der
2 Material und Methode
27
Literatur nachgelesen werden. Bei der Aufreinigung der benutzten Antiköper wurde
eine Protein G Säule verwendet. Zur Aufreinigung des Fusionsproteins wurde eine
mit high affinity ProSepA Beads gefüllte Säule benutzt.
Um eine Aufreinigung durchzuführen, wurde zuerst die gefällte Antikörpersuspension auf pH 7 eingestellt und 0,2 µM steril filtriert. Die Suspension wurde dann
auf die zuvor gereinigte Säule gegeben, wobei sich der Antikörper an diese Säule
band, und der Rest der Suspension zu weiteren Tests bzw. erneutem Aufreinigen
gesammelt wurde. Eluiert wurde der Antikörper oder das Fusionsprotein mit 0,1 M
Glycin bei pH 2,7 und in Fraktionen zu 500 µl gesammelt. In den Fraktionen, welche
Protein beinhalteten, wurde mittels 1 M Tris der pH-Wert auf pH 7 eingestellt.
Anschließend wurde der aufgereingte Antikörper über eine „desalting Säule“ entsalzt
in PBS aufgenommen, steril filtriert und aliquotiert und bei -20°C gelagert.
2.2.4 Biotinylierung von Antikörpern bzw. Fusionsproteinen
Die Biotinylierung von Antikörpern dient dazu, den Antikörper sekundär mit
Steptavidin markieren zu können. Diese Markierung kann z.B. mit Streptavidin HRP
oder Fluoreszenz markierten Streptavidin geschehen, um in einem späteren Versuch
für FACS, ELISA, Westernblot verwandt zu werden.
Der zu biotinylierende Antikörper wurde nach seiner Aufreinigung in 0,1 M NaHCO3
zusammen mit Biotin in einem Massenverhältnis von 10/1 für 2 h bei
Raumtemperatur gerührt und inkubiert. Im Anschluß wurde der biotinylierte
Antikörper über eine desalting Säule gegeben und in PBS aufgenommen und
aliquotiert.
2.2.5 „respiratory burst“
Beim „respirtory burst“ handelt es sich um die Produktion von Sauerstoffradikalen.
Die Messung der Sauerstoffradikalproduktion lässt einen Rückschluss auf den
Aktivierungszustand der Zellen zu. Zur Messung wurden 200.000 PMN/well in eine
96-Well Platte gegeben, welche die nötigen Stimuli enthielt. Die Zellen wurden zuvor
mit DCFH inkubiert. DCFH wird durch Sauerstoffradikale ein Wasserstoff Atom
2 Material und Methode
28
abgespalten, woraufhin DCFH anfängt, grün zu fluoreszieren; diese Fluoreszenz
wurde in einem Tecan Reader in einer Kinetik für 35 Zyklen alle 5 min gemessen.
Für die Messung des „respiratory burst“ von PMN in einer Kokultur von PMN und
Thrombozyten, wurden die Thrombozyten in geeigneter Anzahl hinzu gegeben.
2.2.6 IL- 8 Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Zur Bestimmung des Gehaltes von sezernierten Zytokinen in Überständen von
Zellkulturen dient der ELISA. Definierte Zellmengen werden in 96 Well Platten
kultiviert, und die Überstände (SN) nach bestimmten Zeiten genommen und bei 20°C
gelagert.
Zur quantitativen Bestimmung des Zytokins werden Maxisorb 96 Well Platten mit
einem für das Zytokin spezifischen Antikörper (detection AK) über Nacht gecoatet.
Am nächsten Tag wird der SN verworfen und 3-mal mit ELISA washing Puffer
gewaschen. Um unspezifische Bindung zu vermeiden, werden anschließen die
gecoateten Platten mit ELISA blicking Puffer für 1 h bei RT inkubiert. Nach erneutem
verwerfen des SN und 3 maligen Waschen werden die Proben sowie der Standard in
Duplikaten oder Triplikaten in die Platte gegeben. Der Standard wird in eine
Verdünnungsreihe
gegeben
und
dient
der
späteren
Ermittlung
der
Zytokinkonzentration. Nach 2 h Inkubation wird der SN verworfen, 3-mal gewaschen,
und der Sekundärantikörper (detection Antikörper), welcher an Biotin gekoppelt ist, in
die Platte überführt. Erneut wird der Überstand verworfen, 3-mal gewaschen, und es
folgt die Zugabe von an Steptavidin gekoppelter HRP, welche das nach ca. 20 min
und erneutem Waschen hinzugegebene Substrat TMB farbig umsetzt. Die Reaktion
wird von 2MH2SO4 gestoppt, wobei ein erneuter Farbumschlag erfolgt, welcher bei
450 nm im TECAN Reader gemessen werden kann.
2.2.7 Durchflusszytometrie / FACS Analyse
Die Durchflusszytometrie dient dazu, Zellen einzeln im Fluss auf ihre Eigenschaften
zu untersuchen. Dabei werden die Zellen durch eine Kammer geleitet und von einem
oder mehreren Lasern angestrahlt. Das dabei entstehende Streulicht (light scatter)
dient einer ersten Bestimmung von Eigenschaften der Zellen.
2 Material und Methode
29
Das Vorwärtsstreulicht (forward scatter) dient der Bestimmung der Größe der Zellen,
wobei kleine Zellen weniger Vorwärtsstreulicht verursachen als grössere Zellen.
Das Seitwärtsstreulicht (side scatter) dient der Bestimmung der Granularität einer
Zelle. Je mehr Granula (z.B. Lysosomen) eine Zelle hat, desto größer ist sein
Seitwärtsstreulicht.
Eine dritte Möglichkeit der Bestimmung von Eigenschaften einer Zelle, ist die
Markierung mit Antikörpern, welche mit fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelt sind.
Diese Farbstoffe können mit einem geeigneten Laser angeregt werden und
emittieren dann Licht, welches vom FACS Gerät detektiert werden kann. Es besteht
hierbei die Möglichkeit, mehrere Farbstoffe gleichzeitig zu benutzen, da deren
Emissionen nach spektralen Eigenschaften unterschieden werden können und
gegeneinander kompensiert werden können. Je nach Häufigkeit von gebundenen
Antikörpern auf einer Zelle, ändert sich die Intensität des emittierenden Lichtes. Mit
geeigneten Antikörpern lassen sich so Art, Reife, Zustand, sowie unterschiedliche
Aktivitätsmuster einer Zelle unterscheiden.
Mit Hilfe eines FACS lassen sich auch farbmarkierte Beads oder andere Farbstoffe,
welche z.B. in die Membran eingebaut werden, nachweisen.
2.2.8 Phagozytose Assay
Zur Quantifizierung der Anzahl an phagozytierenden Zellen wurden eine definierte
Anzahl von Zellen in einer 96 Well Flachboden Platte mit entsprechenden Stimuli und
PE-Beads
für
15-90
min
inkubiert.
Die
Zellen
wurden
danach
in
eine
Spitzbodenplatte überführt und 3-mal mit 100 µl FACS Puffer gewaschen. Die
gewaschenen Zellen wurden in 200 µl in FACS Röhrchen überführt. Die Menge an
phagozytierenden Zellen wurde im FACS Canto bestimmt, welcher die Menge an
phagozytierten PE-Beads pro Zelle detektieren konnte.
2.2.9 Ca2+ FLUX
Das Ca2+ einer Zelle wurde mit Hilfe des Farbstoffes FLUO3-AM bestimmt. FLUO3AM ist zellgänig und wird bei 488 nm fluoresziert, wenn es mit Ca2+ in Kontakt
kommt; der entstehende Ca2+ Fluss kann im FACS gemessen werden.
2 Material und Methode
30
2.2.10 Apoptose Messung/ Nicoletti Assay
Beim Nicolletti Assay wird mit dem Farbstoff PI DNA markiert, und diese kann dann
im FACS analysiert werden. Die Zellen werden dabei durch eine hypotone Lösung
lysiert, und der Farbstoff in die DNA eingebaut. Je nach Zustand der Zelle, einfacher
oder doppelter Chromosomensatz bzw. in oligonukleosomale Einheiten fragmentierte
DNA, wird die Fluoreszenz intensiver bzw. schwächer ausfallen. Apoptotische Zellen
wurden von vitalen Zellen durch die geringere Intensität des Farbstoffes
unterschieden.
2.2.11 Aggregation von Thrombozyten
Die Aggregation von Thrombozyten wurde in einem Photometer bestimmt, wobei
aggregierte Thrombozyten mehr Licht als nicht aggregierte Zellen durchlassen. Die
Messung erfolgte für 500 s. Als Positivkontrolle wurde Kollagen, welches
Thrombozyten aggregieren lässt, verwandt.
2.2.11 Zelllyse
Die Zellen wurden mit modifiziertem RIPA Puffer lysiert. Der Puffer wurde mit
Proteaseinhibitoren (5xComplete Protease Inhibitor, Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin
und PMSF) und Phosphataseinhibitoren (NaF, NaP2O7, Na3VO4) versetzt.
Zur Lyse wurden die pelletierten, gewaschenen Zellen für 20 Minuten bei 4°C
geschüttelt und dann bei 13000 U/min zentrifugiert, um Zellkerne sowie Membranen
vom Zytoplasma zu trennen. Der Überstand wurde 5-mal mit SDS Ladepuffer
versetzt und 5 min bei 95°C gekocht. Die Proben wurden daraufhin bei - 80°C
eingefroren.
2.2.12 SDS Gel
SDS-Gele dienen zur Auftrennung von Proteinen nach Grösse. Ein SDS - Gel
besteht aus einem Sammelgel, in welches Taschen zum Beladen eingelassen sind
und einem Trenngel, welches je nach prozentualem Anteil von Acrylamidproteinen
2 Material und Methode
31
bestimmte Massen gut von einander unterscheidbar trennt. Es wurden Gele mit
einem
Anteil
8-12%
Acrylamid
verwandt.
Beispielhaft
wird
hier
die
Zusammensetzung eines 10% Gels angeführt.
Zuerst wird das Trenngel gegossen: 10% Trenngel besteht aus 0,375 M TrisS pH
8,6, 0,1% SDS, 10% Acrylamid, 10% APS und 10 µl TEMED aufgefüllt mit ddH2O auf
10 ml.Nach der erfolgten Polymerisation wird das Sammelgel gegossen. Das
Sammelgel besteht aus 0,1M Tris pH 6,8, 0,1% SDS, 4% Acrylamid, 10% APS, 5 µl
TEMED aufgefüllt auf 5 ml mit ddH2O. In das Sammelgel wird ein Kamm für die zu
beladenen Taschen eingelassen.
2.2.13 2D-Elektrophorese
Die 2D-gelelektrophoretische Auftrennung erfolgte in
MINI PROTEAN 3 2-D
Elektrophoresekammern.
2.2.14 Western Blot
Der Transfer des aufgetrennten Proteins auf eine Nitocellulose Membran erfolgte
mittels Western Blot Verfahren. Hierbei werden die Proteine durch einen
elektrischenFluss aus der Gelmatrix auf die Membran transferiert. Die negativ
geladenen Proteine wandern zur Anode (auf die Membran). Gel und Membran
werden zwischen in Puffer getränkte Papiere gebettet.
2.2.15 Proteinbestimmungen
Die Proteinkonzentration von
z.B. Lysaten wurde mit Hilfe des
Bio-Rad
Proteinmengen Bestimmungs – Kit bewerkstelligt. Damit Proben vergleichbar waren,
diente die Proteinkonzentration der Lysate der Kalkulation, wie viel Lysat in die
Taschen von SDS-Gel geladen wurde,.
2.2.16 RAS „activation“ Assay
Der Ras „activation Assay wurde mit Hilfe eines „Kits“ von Cell Biolabs durchgeführt.
Das „Kit“ nutzt die Eigenschaft von Ras aus, dass das aktivierte Ras (GTPgebundenes) an die Ras Bindungsdomaine (RBD) von Raf1, nicht hingegen an GDP
2 Material und Methode
32
gebundenes,nicht aktiviertes Ras bindet: so kann aktiviertes Ras aus dem Lysat
prezipitiert werden. 1x107 Zellen wurden +/-LPS und +/- α-TREM-1 für 0-60 min
stimuliert und anschließend mit dem im Kit enthaltenen Lyse-Puffer lysiert. Danach
wurden die Lysate mit Raf1 RBD (Ras binding domain) Agarose Beads für 1 h bei
4°C inkubiert. Nach Zentrifugation und Waschen der Agarose Beads wurden diese
bei mit 2xSDS Puffer bei 95°C 10 min gekocht, anschließend auf ein 12% SDS-Gel
geladen und im Western Blot analysiert. Vorhandenes Ras konnte mit einem α−Ras
Antikörper, welcher ebenfalls im „Kit“ enthalten war, detektiert werden.
3 Ergebnisse
33
3.Ergebnisse
3.1 Ligation von Herpes Virus Entry Mediator (HVEM) wirkt
synergistisch mit Toll-like Rezeptoren und GM-CSF
in der
Aktivierung neutrophiler Granulozyten.
3.1.1 Der monoklonale Antikörper α-Herpes Virus Entry Mediator (HVEM) Klon
122 aktiviert polymorphnukleäre Neutrophile (PMN).
In Arbeiten von Heo et al. und Jung et al. konnte gezeigt werden, dass HVEM auf
Polymorphnukleären Lymphozyten (PMN) exprimiert ist, und durch Zugabe des
natürlichen Liganden LIGHT PMN ihre antibakterielle Aktivität steigern [121;122]. Mit
dem uns zur Verfügung gestellten Antikörper Klon (HVEM Klon 122) konnten bereits
agonistische Funktionen des Antikörpers in einer „mixed lymphocyte“ Reaktion
gezeigt werden [123]. Dies ermöglicht ein experimentelles Setting, welches die
Funktionen von HVEM unabhängig von seinen natürlichen Liganden untersuchen
kann.
Die folgenden Versuchsansätze sollten die Auswirkungen des monoklonalen
Antikörpers gegen HVEM (α-HVEM Klon 122) allein und im Zusammenspiel mit
verschiedenen, bekannten und definierten Stimulantien auf PMN untersuchen.
In einem ersten Versuch wurde der Antikörper in unterschiedlichen Konzentrationen
auf eine 96-well Platte immobilisiert, Danach wurde analysiert, ob der Antikörper
Auswirkungen auf den „respiratory burst“ von PMN hat.
Beim „respiratory burst“ werden Sauerstoffradikale von den PMN gebildet, welche
dazu führen, von den Zellen aufgenommenes Pathogen (z.B. Bakterien) in
Phagolysosomen oder extrazellulär zu zerstören.
Die PMN wurden aus dem Blut von gesunden Probanden frisch präpariert und
umgehend für die Experimente verwandt. In Abbildung 3.1.1 ist zu erkennen, dass
die Ligation von HVEM mit α-HVEM bei Kreuzvernetzung (diese wird durch das
„coaten“ des Antikörpers auf den Plattenboden erreicht) zu einer Entstehung von
Sauerstoffradikalen führt. Diese ist konzentrationsabhängig und nur bei einer
3 Ergebnisse
34
Konzentration von 30 µg/ml deutlich zu erkennen, hingegen bei 10µg/ml nur leicht
vorhanden.
Abbildung 3.1.1 Der monoklonale Antikörper gegen HVEM (Klon 122) aktiviert den „respiratory
burst“ bei PMN konzentrationabhänig.
Der monoklonale Antikörper α−HVEM wurde in unterschiedlichen Konzentrationen auf eine 96-WellPlatte gecoatet. PMN (2x106 Zellen /ml (2x105/Well) wurden in die Platte gegeben, und eine kinetische
Messung von 145 min über die Entstehung von Sauerstoffradikalen durchgeführt (s. Material und
Methoden). Die Spezifische Fluoreszenz Intensität (SFI) entspricht den gemessenen FluoreszenzUnits abzüglich des Leerwertes (Zellen in Medium). Je mehr spezifische Fluoreszenz-Units gebildet
werden, desto mehr Sauerstoffradikale wurden gebildet. Die Abbildung ist repräsentativ für
mindestens 3 unabhängige Experimente. Für jeden unterschiedlichen Stimulus wurden Triplikate (3
Wells pro Platte) gemessen.
Andere für die Aktivierung von PMN typische Eigenschaften sind die Phagozytose,
die Freisetzung von IL-8, sowie die Hochregulierung des Oberflächenmarkers CD66b
(Degranulation). Diese sollten ebenfalls in Bezug auf den Einfluss von α−HVEM
untersucht werden.
Die Produktion des Chemokins IL-8 dient unter anderem der weiteren Rekrutierung
von Leukozyten, welche entlang eines entstehenden IL-8 Gradienten zum
Infektionsort geleitet werden. IL-8 ist experimentell in den Überständen von PMNKulturen nachzuweisen. Hierfür wurden analog zum „respiratory burst“ 96-Well
Platten mit Antiköpern in unterschiedlichen Konzentration gecoatet und nach 6 - 24 h
der Überstand entnommen, und auf den Gehalt von IL-8 mittels eines ELISA
untersucht.
3 Ergebnisse
35
Abb. 3.1.2A zeigt, dass eine Freisetzung von IL-8 durch Stimulation mit α−HVEM
detektiert werden kann. Dieses ist wiederum konzentrationsabhängig und deutlich
nur bei 30 µg/ml zu erkennen. Die gesteigerte Expression von CD66b auf PMN gilt
als ein weiteres Indiz für eine Aktivierung von PMN, insbesondere für die Freisetzung
von spezifischen Granula, welche der Pathogen Bekämpfung dienen [124;125]. Die
Degranulation ist durch FACS-Analyse mit einem entsprechenden Fluoreszenz
markierten Antikörper gegen CD66b nachweisbar. Auf die Stimulation von HVEM mit
α−HVEM (10 µg/ml) erfolgt eine erhöhte Expression von CD66b auf PMN (Abb.
3.1.2B). Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben 1 Stunde stimuliert und dann
analysiert.
Abb. 3.1.2 Die Stimulation von HVEM resultiert in der Sezernierung von IL-8 und Degranulation
von PMN. Eine gesteigerte phagozytische Aktivität ist hingegen nicht erkennbar.
IL-8 (Abb. A) wurde mit einem ELISA nachgewiesen. Die Stimulation folgte analog zu der in Abb.1.
Überstände zur Detektion von IL-8 wurden nach 8h, die Analyse der Degranulation oder der
Phagozytose nach 1h genommen. Es ist zu erkennen, dass IL-8 nach Stimulation von HVEM
konzentrationsabhängig freigesetzt wird. Auch die Degranulation der PMN wird durch HVEM
Stimulation aktiviert. Hier wird exemplarisch die vermehrte Expression von CD66b (Abb. B) nach
HVEM (10 µg/ml) Stimulation (dunkelgrau), im Gegensatz zu einem Kontrollantikörper (hellgrau), der
in der gleichen Konzentration verwendet wurde, gezeigt. In der phagozytischen Aktivität ist hingegen
kein Unterschied zwischen HVEM Stimulation (schwarzer Balken) und dem Kontrollantikörper zu
erkennen.
Die Phagozytose dient der Aufnahme von Pathogenen sowie der folgenden
Zerstörung dieser. Dieses ist durch die Zugabe Fluoreszenz markierter Polysteren
Beads in die Zellkultur
nachweisbar. Nach mehrmaligem Waschen sind diese
Polysteren Beads, welche von Zellen aufgenommen wurden, im FACS nachweisbar.
In diesem experimentellen Ansatz konnte keine phagozytische Aktivität von PMN
3 Ergebnisse
36
nach Stimulation mit α−HVEM (30 - 0,3 µg/ml) (Abb. 3.1.2 C) nachgewiesen werden.
Die Stimulation erfolgte analog zu den zuvor beschriebenen.
3.1.2 α−HVEM stimuliert PMN in Synergie mit TLR Liganden und GM-CSF.
Aufgrund der Erkenntnisse, das eine gesteigerte Aktivität von PMN gegen Listeria
monocytogenes bzw. Staphylococcus aureus bei gleichzeitiger Gabe von LIGHT
vorhanden ist [126;127], werden in den folgenden Experimenten Toll-Like-Receptor (TLR) Liganden bzw. GM-CSF zusätzlich zur HVEM Stimulation verwandt. Diese
Experimente sollten dazu dienen, eine Infektion mit möglichen Pathogen in vitro zu
simulieren, und die Art und Weise, wie HVEM PMN in ihrer antibakteriellen Reaktion
beeinflusst, zu untersuchen.
Zunächst wurde Lipopolysaccharid (LPS), das von PMN über den TLR4 Rezeptor
erkannt wird, im Zusammenspiel mit α−HVEM in der PMN Aktivierung in Bezug auf
den „respiratory burst“ untersucht. LPS ist ein Zellwandbestandteil von Gramnegativen Bakterien.
Gibt man LPS (100 ng/ml) zu titrierten Mengen α-HVEM, so erkennt man, dass die
Stimulation von HVEM bei gleichzeitiger Gabe von LPS zu einem anhaltenden,
synergistischen Signal in der Produktion von Sauerstoffradikalen führt (s. Abb. 3.1.3
A).
Der
verstärkende
Effekt
der
HVEM
Stimulation
ergab
sich
nur
mit
immobilisiertem α−HVEM und nicht bei löslich zugegebenen α−HVEM (Abb. 3.1.3 C).
Die Synergie der beiden Stimuli war auch erkennbar, wenn titrierte Mengen LPS
(1µg-10 ng/ml) zu konstanten Konzentrationen α−HVEM (10µg/ml) gegeben wurden
(Abb. 3.1.3B) Für die folgenden Versuche wurde α−HVEM immer mit einer
Konzentration von 10 µg/ml eingesetzt, da hier der synergistische Effekt am
deutlichsten zum Tragen kam.
3 Ergebnisse
37
Abbildung 3.1.3. Die Titration von HVEM mit konstanten Mengen LPS und Titrationen von LPS
mit konstanten Mengen von α-HVEM bewirkt eine synergistischen Sauerstoffradikalproduktion bei PMN. Zur Stimulation von HVEM wird ein kreuzvernetzender Stimulus benötigt.
A: Es ist zu erkennen, dass die Stimulation von HVEM bereits ab einer Konzentration von 1 µg/ml αHVEM (weisse Dreiecke) eine verstärkte Produktion von Sauerstoffradikalen nach LPS (100 ng/ml)
Stimulation ergibt. Wird mehr α-HVEM gegeben, so steigert sich der respiratorische Burst noch.
Zwischen 10 und 30 µg/ml α−HVEM ist kein Unterschied in der Produktion von Sauerstoffradikalen
mehr erkennbar. B: PMN wurden mit 10 µg/ml a-HVEM und den angegebenen Konzentrationen LPS
Kontrollantikörper stimuliert. LPS steigert mit zunehmender Konzentration den durch HVEM
Stimulation verursachten „respiratory burst“. C: Der verstärkende Effekt der LPS (100 ng/ml)
Stimulation mit α−HVEM ist nur dann zu erkennen, wenn ein kreuzvernetzendes Signal vorliegt, d.h.
der Antikörper auf die 96- Well Platte gecoatet wurde (schwarze Punkte). Es ist kein signifikanter
Unterschied zur Stimulation nur mit LPS (schwarze Dreiecke) bzw. wenn α-HVEM nicht gecoatet (sαHVEM) in die Kultur eingesetzt wird (weiße Punkte), zu erkennen.
Der synergistische Effekt bei der Sauerstoffradikalproduktion ist nicht nur mit dem
TLR4 Liganden LPS, sondern ebenfalls mit dem TLR2 Liganden palmitoyl-3-Cys-ser(Lys)4 (Pam3Cys) (Abb. 3.1.4 A), dem TLR7 Liganden Imiquimod, dem TLR7 und 8
Liganden R-848 (Abb 3.1.4 B), sowie dem inflammatorischen Zytokin granulocytemacrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (Abb. 3.1.4 D) zu erkennen
gewesen .
Pam3Cys ist ein synthetisches Lipopeptid, welches der acetylierten Endung von
bakteriellen Lipopeptiden nachgeahmt ist. Imiquimod ist ein Imidazoquinolines Amin,
ähnlich dem Guanosin, bei welchem antivirale Eigenschaften nachgewiesen wurden.
Es bindet an TLR7. R-848 ist auch ein Imidazoquinolin, es bindet jedoch sowohl an
TLR7, als auch an TLR8. GM-CSF ist ein inflammatorisches Zytokin, welches unter
anderem PMN aktiviert, sowie deren Proliferation im Knochenmark hochreguliert.
3 Ergebnisse
38
Abb. 3.1.4 Synergistische Verstärkung des „respiratory burst“ bei Stimulation von HVEM und
verschieden TLR-Liganden oder GM-CSF.
Die Abbildungen zeigen den Verlauf der Sauerstoffradikalbildung über 145 min von PMN, welche mit
gecoatetem α−HVEM (schwarze Punkte) , Kontollantikörpern (weiße Punkte 10 µg/ml), TLR Liganden
oder GM-CSF stimuliert wurden. In allen Fällen ist zu beobachten, dass die Produktion der
Sauerstoffradikale bei gleichzeitiger Stimulation von HVEM im Gegensatz zu den verschiedenen
Stimuli mit dem Kontrollantikörper deutlich erhöht ist. Die eingesetzten Konzentrationen waren (A)
Pam3Cys 500ng/ml, (B) R-848 100 ng/ml, (C) Imiquimod 1 µg/ml, (D) GM-CSF 100 U/ml. Die
Abbildung ist repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Für jeden unterschiedlichen
Stimulus wurden Triplikate (3 Wells pro Platte) gemessen.
Für alle Stimuli in (Abb. 3.1.4) wurden Titrations-Experimente durchgeführt (analog
zu den Experimenten mit LPS), aus welchen eine Konzentration ermittelt wurde, bei
welcher die Synergie deutlich zu erkennen war (es werden nur Daten mit
synergistischen Effekten gezeigt).
Die synergistische Stimulation von PMN durch HVEM,
den verschiedenen TLR
Liganden oder GM-CSF konnte auch für die Degranulation (Abb. 3.1.5 B) und IL-8
Sezernierung gezeigt werden (Abb. 3.1.5 A).
3 Ergebnisse
A
39
B
Abb. 3.1.5 Synergie in der Sezernierung von IL-8 und Degranulation von α−HVEM und TLR
Liganden oder GM-CSF.
Stimuliert man PMN nur mit LPS, PAM3CYS, Imiquimod, R-848 oder GM-CSF (weisse Balken) und
Kontrollantikörpern, so bewirkt dies unter anderem in der Freisetzung von IL-8 (Abb. A) oder
Degranulation (Abb. B). Die zusätzliche Stimulation von HVEM durch α−HVEM (schwarze Balken mit
TLR Liganden oder GM-CSF resultiert eine deutliche Verstärkung bezüglich der Freisetzung von IL-8
oder der Degranulation (Abb. A und B). Die gezeigten Daten sind bespielhaft für mindestens 3
unabhänige Experimente, welche in Triplikaten angesetzt wurden. Abb. A zeigt die sezernierte Menge
IL-8 von PMN in den Überständen nach 8h. Abb. B zeigt die Expression von CD66b auf der
Oberfläche von PMN nach 1h.
3 Ergebnisse
40
3.1.3. HVEM Ligation resultiert in einer verstärkten phagozytischen Aktivität
von neutrophilen Granulozyten zusammen mit komplementopsonisierten
Partikeln, aber nicht mit TLR Ligand oder GM-CSF.
Zur
Herstellung
der
komplementopsonisierten
Polysteren
Beads
wurden
unterschiedliche Konzentrationen von polysterenen Beads in, durch Hefe aktiviertes
Serum gegeben und 1h inkubiert, anschließend 3 mal gewaschen und zu den PMN
gegeben. Die Hefe diente zur Aktivierung der Komplementkaskade, wobei
opsonisierende Fragmente (C3b) entstehen. Das Komplementsystem wird durch
konservierte Strukturen von Pathogenen direkt oder durch Antikörper bzw.
Immunkomplexe
(opsonisierte
Pathogene)
aktiviert.
Einer
Aktivierung
des
Komplementsystems folgt der Beginn einer Kaskade, infolge derer Proteine gebildet
werden, die entweder als proinflammatorische Moleküle, oder Moleküle zur
Opsonisierung von Pathogenen gebildet werden. Oposonisieung bedeutet, dass sich
Moleküle an ein Pathogen binden und es so Phagozyten ermöglichen, das Pathogen
zu erkennen und es aufzunehmen bzw. zu phagozytieren.
Bei der Phagozytose von PMN konnte keine verstärkende Wirkung von HVEM
Stimulation alleine (Abb 3.16 B), oder mit den verwendeten TLR Liganden bzw. GMCSF zusammen gezeigt werden (Abb 3.1.6 B). Wurden PMN mit α−HVEM und
komplementopsonisierten Polysteren Beads stimuliert, so war eine Verstärkung der
durch Komplement aktivierten, phagozytischen Aktivität der Zellen durch α−HVEM
zu beobachten (Abb. 3.1.6 C).
3 Ergebnisse
41
1
2
3
Abb. 3.1.6 Die Stimulation von HVEM wirkt verstärkend auf komplementopsonisierte Partikel
induzierte Phagozytose. Abbildung A.1 zeigt einen Vorwärts- Seitwärts Streuungs- Dot-Blot einer
FACS Analyse. Jeder Punkt entspricht dabei einer PMN. Die Selben Zellen werden in den
Abbildungen A.2 (unstimuliert) und A.3 (LPS stimuliert 100 ng/ml) ebenfalls in einem Dot-Blot gezeigt.
Die x-Achse entspricht nun der PE-Intensität. Zu erkennen ist, dass zwei Populationen entstanden
sind. Die rechte zeigt die Zellen, welche Polysteren Beads aufgenommen haben, und somit die
phagozytierenden Zellen (schwarze Punkte). Die linke Population stellt die nicht phagozytierenden
Zellen dar (hellgraue Punkte). Diese Zellen lassen sich auszählen und deren prozentueller Anteil von
allen Zellen (A1) errechnen. TLR Liganden und GM-CSF stimulieren PMN zum Phagozytieren (Abb.
B). Es ist kein Unterschied zwischen α-HVEM und den Kontrollantokörpern zu erkennen. Polysteren
Beads, welche mit in Hefe aktiviertem Serum (HAS) inkubiert wurden und komplementopsonisiert
wurden, stimulieren ebenfalls PMN zum Phagozytieren. α− HVEM zeigt hierbei einen verstärkenden
Effekt
auf
die
Kontrollantikörper.
Phagozytose
(schwarze
Balken)
im
Gegensatz
zu
einem
eingesetzten
3 Ergebnisse
42
3.1.4 Die Stimulation von HVEM beeinflusst nicht die Apoptose von
neutrophilen Granulozyten
Die Apoptose ist der programmierte Zelltod. Dieser tritt bei PMN nach ca. 2-3 Tagen
ein. Dieses relativ schnelle Ableben der Zellen dient der Regulierung
der
inflammatorischen Antwort [128]. Einige Stimuli, wie TLR Liganden oder Zytokine,
können jedoch die Apoptose bei PMN hinauszögern. Die so stimulierten Zellen leben
länger (Abb. 3.1.7).
Einige der TNF−α Familie zugehörigen Proteine, wie z.B. TNF-a oder CD95
[129;130] induzieren Apoptose, andere hingegen wirken sich anti-apoptotisch, wie
z.B: CD134 [131], auf PMN aus. Um die Rolle von HVEM bei der Apoptose zu
studieren, wurden die Zellen für 24 – 48 h mit entsprechenden Stimuli kultiviert.
Anschließend wurde ein Nicoletti Assay durchgeführt [132], um den Anteil an
apoptotischen Zellen in der Kultur zu bestimmen. Bei der Apoptosebestimmung nach
Nicolletti werden die Zellen mit Propidium Iodid (PI) gefärbt. Dieser Farbstoff färbt
DNA. Bei apoptotischen Zellen ist die DNA fragmentiert und ergibt so eine
schwächere Intensität als die intakte DNA von nicht apoptotischen Zellen.
Bei diesen Versuchsansätzen wurde kein Einfluss der Stimulation von HVEM durch
α−HVEM erkennbar (Abb. 3.1.7 B). Alle TLR Liganden, außer Imiquimod, führen zu
einer deutlichen Senkung der Apoptoserate bei PMN. Das Gleiche gilt für GM-CSF.
Es
besteht
kein
Unterschied
zwischen
Kontrollantikörpern kultivierten Zellen.
mit
α−HVEM
stimulierten
oder
3 Ergebnisse
1
43
2
3
Abb. 3.1.7 Die Apoptose von PMN bleibt durch eine HVEM Stimulation unbeeinflusst.
Abbildung A zeigt einen DOT Blot von PMN nach 24h in der Kultur: diese wurden in einem weitern
Blot nach ihrer PI Intensität bestimmt (Abb A2 und A3). In A2 sind PMN nur im Medium kultiviert
worden. Es ist zu erkennen, dass 58,4% Zellen fragmentierte DNA aufweisen bzw. apoptotisch sind
(Gate P2). In Blot A3 wurden die Zellen 24h mit 100 ng/ml LPS kultiviert: dies führte zu einer
deutlichen Reduzierung des Anteils an apoptotischen Zellen (19%). Abbildung B zeigt die Auswertung
eines Nicoletti Assays von PMN nach einer 24h Kultur mit den entsprechenden Stimuli. Es ist zu
erkennen, dass die TLR Liganden (außer Imiquimod) und GM-CSF zu einer Reduzierung der
Apoptoserate bei PMN führen. Die HVEM Stimulation hat keine Auswirkung auf die Apoptose der
PMN.
3 Ergebnisse
44
3.2. TREM-1 Ligand ist auf Thrombozyten exprimiert.
3.2.1 Ein Ligand für TREM-1 ist auf humanen Thrombozyten exprimiert.
Das Fusionsprotein besteht aus der extrazellulären Domaine von humanem TREM-1
und humanem IgG (rsTREM-1) und bindet spezifisch und konzentrationsabhängig
auf Thrombozyten. Aufgrund der Annahme, dass ein Ligand für TREM-1
körpereigenen Ursprungs [133] und bei einer Inflammation von Bedeutung ist, wurde
mit der Suche nach einem möglichen Liganden auf hämatopoetischen Zellen
begonnen. Hierfür wurde ein Fusionsprotein benutzt, welches aus der extrazellulären
Domaine von humanem TREM-1 sowie dem Fc-Teil von humanem Immunoglobulin
G bestand. Dieses Fusionsprotein wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Ludger GrosseHovest von der Universität Tübingen hergestellt und zur Verfügung gestellt.
Das Fusionsprotein, welches von Maus Myelomzellen (Sp2/0) exprimiert wurde,
konnte mit Biotin markiert und so mit sekundärem Streptavidin PE in einem FACSGerät detektiert werden.
Abbildung 3.2.1 zeigt, dass das Fusionsprotein (rsTREM-1) an Thrombozyten bindet,
nicht jedoch ein eingesetztes humanes IgG, welches als Kontrolle für eine mögliche
unspezifische Bindung des Fc-Anteiles von rsTREM-1, an Fc gamma Rezeptor II auf
Thrombozyten [134], verwandt wurde. Die Bindung des biotinylierten rsTREM-1
wurde durch die Gabe der gleichen Menge nicht biotinylierten rsTREM-1 nahezu
aufgehoben (Abb. 3.2.1). Die Thrombozyten wurden vor der Färbung zusätzlich mit
Fc-Block inkubiert, was dazu diente, eine
Fusionsproteins
an
Fc-Rezeptoren
zu
mögliche Bindung des Fc-Teils des
verhindern.
Die
Bindung
war
konzentrationsabhänig (Abb. 3.2.4). Dieses Ergebnis war ein erstes Indiz für einen
Liganden von TREM-1, welcher auf Thrombozyten exprimiert ist.
3 Ergebnisse
45
Abb. 3.2.1. rsTREM-1 bindet auf Thrombozyten.
Das biotinylierte Fusionsprotein (rsTREM-1(3µg/ml)) bindet sich mit einer Konzentration von 3 µg/ml
auf Thrombozyten (grau gefüllt). Gibt man die gleiche Menge von nicht biotinyliertem rsTREM-1 dazu,
so wird die Bindungstärke geringer (durchgezogene Linie). Die gestrichelte Linie zeigt die Bindung von
biotinylierten, humanem IgG an Thrombozyten: welches als Kontrolle eingesetzt wurde ,um eine
mögliche Bindung des Fc-Teiles von rsTREM-1 an Thrombozyten zu simulieren. Die Thrombozyten
wurden mit sekundärem Streptavidin-PE markiert
Um die Existenz des TREM-1 Liganden (TREM-1L) bzw. die Bindung des rsTREM-1
auf Thrombozyten zu verifizieren, wurden zusätzlich zum rsTREM-1 kompetitiv nicht
markiertes rsTREM-1 sowie ein Peptid (LP17), welches der extrazelluläre Domaine
von murinem TREM-1 entspricht und experimentell schon beschrieben war [135],
gegeben.
In Abb. 3.2.2 ist eine spezifische Bindung von rsTREM-1 auf Thrombozyten zu
erkennen. Die Bindung von rsTREM-1 wird von unmarkiertem rsTREM-1 in
unterschiedlichen Konzentrationen kompetitiv gehemmt. Dasselbe gilt für das von
Gibot et al. beschriebene Peptid LP17. Hieraus ergibt sich, dass die Bindung von
rsTREM-1 auf Thrombozyten spezifisch ist.
3 Ergebnisse
46
A
B
0
Abb. 3.2.2. Die kompetitive Hemmung der Bindung von rsTREM-1 durch LP17 und rsTREM-1.
Thrombozyten wurden mit 1 µg/ml rsTREM-1-PE gefärbt.
Abbildung
2A
zeigt,
dass
die
Bindung
von
rsTREM-1
durch
unmarkiertes
rsTREM-1
konzentrationsabhängig inhibiert wird (schwarze Punkte). Die Bindung wird jedoch nicht von
humanem IgG inhibiert (graue Punkte). Abbildung B zeigt das gleiche Ergebnis für das Peptid LP17
(schwarze Punkte), nicht jedoch für ein Peptid, welches aus identischen Aminosäuren in beliebiger
Reihenfolge besteht.
In weiteren Versuchen wurde untersucht, ob rsTREM-1 auch auf weiteren Blutzellen
bindet. Wie Abbildung 3.2.3 zeigt, fand sich auf keiner der untersuchten Zellen ein
Hinweis auf eine mögliche Existenz eines Liganden für TREM-1 bzw. einer Bindung
von rsTREM-1.
B
A
C
rsTREM-1 PE
control IgG PE
Abb. 3.2.3. rsTREM-1 bindet nicht auf anderen untersuchten Zellen. Zu sehen ist die Bindung von
rsTREM-1(hellgrau) bzw. humanem IgG (dunkelgrau) auf PMN (A), Lymphozyten (B) und Monozyten
(C). Es ist kein Unterschied zwischen den beiden Proteinen in ihrer Bindung auf den jeweiligen Zellen
festzustellen.
3 Ergebnisse
47
Um zu untersuchen, ob der TREM-1 Ligand nach Aktivierung der Thrombozyten
hochreguliert wird, sind Thrombozyten mit 5 units/ml Thrombin inkubiert worden. In
der FACS Analyse zeigt sich keine Veränderung der Expression von TREM-1L auf
Thrombozyten, wie Abb. 3.2.4. zeigt. In stimulierten sowie unstimulierten
Thrombozyten ist die Bindung von rsTREM-1 und humanen IgG bei allen
untersuchten Konzentrationen nahezu gleich.
Abb. 3.2.4. Der TREM-1 Ligand wird nicht nach Aktivierung von Thrombozyten hochreguliert.
Die Bindung von rsTREM-1 auf Thrombozyten nimmt nach Aktivierung mit Thrombin nicht signifikant
zu. Auch humanes IgG bindet nicht stärker an Thrombozyten. Die Thrombozyten wurden 30 min mit
Fc-Block inkubiert. Gezeigt wird die Bindung als Mittlere Fluoreszenz Intensität.
3.2.2 rsTREM-1 hat keine aktivierenden Auswirkungen auf Thrombozyten.
Um die Eigenschaften des TREM-1 Liganden (TREM-1L) auf Thrombozyten weiter
zu untersuchen, wurden Thrombozyten auf eine mögliche Aktivierung nach der
Ligation mit rsTREM-1 untersucht. Hierfür wurden Thrombozyten mit rsTREM-1
inkubiert und auf ihre Aggregation bzw. die Expression von P-Selektin (CD62P)
untersucht. Mit der Gabe von biotinyliertem rsTREM-1 und sekundärem Streptavidin
wurde
ein
crosslink
des
TREM-1L
simuliert.
Unter
der
Aggregation
von
Thrombozyten versteht man deren Fähigkeit, Fibrinogen mit hoher Affinität zu binden
und so Aggregate untereinander zu bilden. Diese Aggregation kann mit Hilfe eines
Photometers nachgewiesen werden.
Die Expression von CD62P nimmt nach
Aktivierung von Thrombozyten zu. Dies geschieht, indem Granula der Thrombozyten
freigesetzt werden und so CD62P auf die Oberfläche der Thrombozyten gelangt.
3 Ergebnisse
48
Man spicht auch von Degranulation. CD62P spielt eine Rolle bei der Interaktion von
Thrombozyten mit Blutzellen. Die Expression von CD62P wird im FACS
nachgewiesen.
A
B
Abb. 3.2.5. rsTREM-1 kann Thrombozyten nicht aktivieren. Nach der Zugabe von rsTREM-1 bzw.
humanem IgG aggregieren Thrombozyten nicht. Als Kontrolle wurde Kollagen gegeben, welches zu
einer Aggregation von Thrombozyten führt (A). Auch die Expression von CD62P nach rsTREM-1
Stimulation ist unverändert gegenüber dem Medium bzw. der Kontrolle mit humanem IgG. Thrombin
hingegen führt zu einer starken Hochregulierung von CD62P (B).
In Abbildung B wurde humanes Vollblut stimuliert. Um die Thrombozyten zu markieren, wurde mit
CD41a gefärbt, welches exklusiv auf Thrombozyten exprimiert ist. Die CD41a positive Population
wurde dann selektiert, und in dieser Population die Expression von CD62P untersucht.
In Abbildung 3.2.5 ist zu erkennen, dass rsTREM-1 keine Auswirkungen auf die hier
untersuchten Aktivitätszustände von Thrombozyten hat. Gezeigt werden die
Graphen,
bei welchen biotinyliertes rsTREM-1 mit sekundärem Streptavidin
gegeben wurde, um einen “crosslink“ des rsTREM-1 zu bewirken. Die Ergebnisse
ohne crosslink waren die gleichen und werden nicht gezeigt.
3 Ergebnisse
3.2.3
Thrombozyten
49
verstärken
die
Aktivierung
von
LPS
stimulierten
neutrophilen Granulozyten.
Es ist bekannt, dass die Ligation von TREM-1 durch einen monoklonalen Antikörper
auf humanen PMN zu einer Aktivierung führt. Diese Aktivierung ist synergistisch bei
gleichzeitiger Gabe von verschiedenen TLR Liganden [136]. Wenn ein Ligand von
TREM-1 auf Thrombozyten exprimiert ist, so könnte eine ähnliche Stimulation von
PMN erfolgen. Um dies zu untersuchen, wurden Thrombozyten zu PMN und in eine
Kokultur gegeben PMN nach Aktivierungszuständen untersucht. Hierzu wurden der
„respiratory burst“ und die Sezernierung von Interleukin-8 (IL-8) analysiert.
Abb. 3.2.6 Thrombozyten verstärken den durch LPS induzierten „respiratory burst“.
Thrombozyten wurden +/- 5 units Thrombin 10 min stimuliert, anschließend fixiert und in einem
Verhältnis von 30:1 zu PMN gegeben. Die Kokultur wurde dann mit unterschiedlichen Konzentrationen
von LPS stimuliert. PMN
allein (schwarze Balken) werden von LPS aktiviert und erzeugen
Sauerstoffradikale. Die durch LPS induzierte Aktivierung wird durch Thrombozyten verstärkt (weßer
Balken); diese Verstärkung steigert sich noch einmal, wenn die Thrombozyten zuvor mit Thrombin
stimuliert wurden (graue Balken). Gezeigt wird der spezifische Fluoreszenz Index nach 120 min.
In den folgenden Versuchen wurden die Thrombozyten +/- 5 Units/ml Thrombin für
10 Minuten stimuliert. Um lösliche Faktoren wie z.B Platelet activating Factor (PAF)
auszuschließen, wurden die Thrombozyten mit 2% PFA fixiert. Wie Abbildung 3.2.6
zeigt, sind fixierte, stimulierte oder unstimulierte Thrombozyten alleine nicht in der
Lage, PMN zu aktivieren. Die Zugabe von LPS hingegen führt konzentrationsabhänig
3 Ergebnisse
50
zu einer Produktion von Sauerstoffradikalen in PMN. Dieser Effekt wird durch
Thrombozyten verstärkt. Sind die Thrombozyten zuvor aktiviert worden, so steigert
dies die LPS induzierte Sauerstoffradikalproduktion noch zusätzlich. Thrombozyten
verstärken nicht nur die Sauerstoffradikalproduktion, sondern auch die Freisetzung
von IL-8 wird durch aktivierte Thrombozyten (Abb. 3.2.7) bei LPS stimulierten PMN
gesteigert.
3.2.4 Die durch Thrombozyten vermittelte Aktivierung von neutrophilen
Granulozyten ist TREM-1 abhängig.
Die Verstärkung der Aktivierung der PMN durch fixierte Thrombozyten und die
Expression eines Liganden für TREM-1 auf dieselben lässt vermuten, dass eine
Interaktion zwischen den beiden Rezeptoren in den aktivierenden Effekt hineinspielt.
Um dieser Frage auf den Grund zu gehen, werden Thrombozyten wie unter 3.2.3
beschrieben zu den PMN gegeben und versucht,
durch rsTREM-1 und einen
monoklonaler Antikörper (mAk) gegen TREM-1 die durch Thrombozyten vermittelte
Aktivierung der PMN zu hemmen.
Abb. 3.2.7 zeigt, dass der durch LPS induzierte respiratorische burst durch
Thrombozyten verstärkt wird (A und C). Das rsTREM-1 bzw. α−TREM-1 haben keine
Auswirkung auf die Aktivierung von PMN oder die durch LPS induzierte Verstärkung
der Sauerstoffradikalproduktion. Thrombozyten verstärken, wie schon in Abb. 3.2.6
gezeigt, den „respiratory burst“.
Diese Verstärkung durch Thrombozyten werden durch α−TREM-1 (A) oder rsTREM1 (C) inhibiert: der spezifische Fluoreszenzindex fällt wieder auf das
Niveau,
welches von durch LPS stimulierten PMN erreicht wird (A) bzw. darunter (C).
Abbildungen B und D zeigen den gleichen experimentellen Ansatz. Es wurde anstelle
der Produktion von Sauerstoffradikalen die Freisetzung von IL-8 gemessen. LPS
alleine stimuliert PMN zur Freisetzung von LPS, α−TREM-1 oder rsTREM-1 haben
keine Auswirkung auf den „IL-8 release“. Fixierte Thrombozyten führen zu einer
Erhöhung des freigesetzten IL-8 bei gleichzeitiger Stimulation mit LPS, haben aber
allein keine Auswirkungen auf die IL-8 Sezernierung. Durch die Zugabe von
3 Ergebnisse
51
α−TREM-1 (B) oder rsTREM-1 (D) fallen die IL-8 Freisetzungen auf die Niveaus,
welche zuvor durch die alleinige Gabe von LPS erreicht wurden.
*
*
*
*
*
*
*
*
Abb. 3.2.7 rsTREM-1 und α−TREM-1 Klon 6B1 inhibieren die durch Thrombozyten vermittelte
Aktivierung von humanen PMN. Abbildungen A und C zeigen den spezifischen Fluereszenzindex
eines respiratory burst,. Abb. B und D stellt die IL-8 Freisetzung von PMN dar. PMN befinden sich in
allen Ansätzen (PMN Balken), Thrombozyten nur in denen, welche mit dem Balken und PLT (Englisch
platelets) markiert sind. Thrombozyten wurden mit 5 U/ml stimuliert, anschliessend in 2% PFA fixiert
und im Verhältnis 30:1 PLT:PMN in die Kokultur gegeben. Thrombozyten verstärken den durch LPS
induzierten „respiratory burst“ (A und C) bzw. die IL-8 Freisetzung (B und D). In A und B wurde
zusätzlich ein α−TREM-1 gegeben, welcher die durch Thrombozyten erzielte Verstärkung der PMN
Aktivierung inhibiert. Der Kontrollantikörper (mIgG) hatte diesen Effekt nicht. In C und D wurde
rsTREM-1 bzw humanes IgG als Kontrolle in die Kokulturen gegeben. RsTREM-1 hatte ebenfalls die
Auswirkung,
die durch Thrombozyten induzierte Verstärkung zu eliminieren. Mit * markierte
verbundene Balken sind signifikant voneinander Unterschiedlich.
3 Ergebnisse
52
3.2.5 Die TREM-1/TREM-1L Wechselwirkungen spielen keine Rolle bei der
Konjugatformierung zwischen neutrophilen Granulozyten und Thrombozyten.
Die Konjugatformierung ist Selektin/Integrin abhängig.
Die TREM-1/TREM-1L abhängigen, verstärkenden Effekte der PMN- aktivierung
werfen
die
Frage
auf,
ob
TREM-1/TREM-1L
Interaktion
auch
bei
der
Konjugatformierung zwischen Thrombozyten und PMN eine Rolle spielen. Dies sollte
in den folgenden Experimenten geklärt werden. Konjugatformierungen wurden in
zwei verschieden Versuchsansetzen untersucht. In einem ersterm Ansatz wurde die
Konjugatformierung ex Vivo in Vollblut untersucht. Das Vollblut wurde mit CD45 und
CD41a gefärbt und in einer FACS Analyse ausgewertet. CD45 diente dazu, die
Zelltypen zu unterscheiden (s. Abb. 3.8A). CD41a ist ein Marker für Thrombozyten.
Waren
Populationen
CD41a
positiv,
so
hatten
sich
Konjugate
zwischen
Thrombozyten und den jeweiligen Zellpopulationen gebildet. In einem zweiten
Versuchsansatz wurden PMN bzw. Thrombozyten isoliert. Die Thrombozyten wurden
mit fluoreszentem Calcein gefärbt und in einer Kokultur zusammen mit PMN und den
angegeben Stimuli gegeben. Calcein dringt ins Cytosol von Zellen ein, kann diese
aber nicht wieder verlassen und fluoresziert grün.
Sofern PMN in einer Kokultur mit Thrombozyten fluoreszierten, konnte daraus
geschlossen werden, dass diese Konjugate mit den gefärbten Thrombocyten gebildet
hatten. Thrombozyten bilden mit PMN und Monozyten Konjugate, deren Anzahl
durch Stimulation noch verstärkt werden kann (Abb. 3.2.8). Lymphozyten hingegen
bilden kaum Konjugate mit Thrombozyten auch die Zugabe von LPS bzw. Thrombin
ändern daran nichts.
3 Ergebnisse
53
PMN
Monozyten
Lymphozyten
Abb. 3.2.8 PMN und Monozyten bilden nach Stimulation mit LPS oder Thrombin verstärkt
Konjugate mit Thrombozyten.
Abbildungen A und B zeigen ex vivo Experimente, in denen Thrombozyten mit CD41a gefärbt wurden.
Konjugatformierung wird in Prozent an CD41a positiven Zellen in der jeweiligen Zellpopulation
angegeben. Die Zellpopulationen werden im Sidescatter/CD45 Dot Plot unterschieden. PMN sowie
Monozyten gehen schon unstimuliert verstärkt Konjugate mit Thrombozyten ein. Lymphozyten
hingegen bilden kaum Konjugate, auch nicht nach Stimulation mit LPS (A) bzw Thrombin (B). PMN
und Monozyten bilden verstärkt nach Stimulation mit LPS (A) bzw. Thrombin (B) Konjugate mit
Thrombozyten.
Sowohl rsTREM-1 als auch α−TREM-1 können die Konjugatbildung nicht
beeinflussen, was gegen einen Einfluss der TREM-1/TREM-1L Rezeptorinteraktion
in der Formierung von Konjugaten zwischen PMN und Thrombozyten spricht (Abb.
3.2.9). Die Konjugatformierung ist von Selektinen (PSGL-1 / P-selectin glycoprotein
ligand 1) und Integrinen (CD18/ Teil des β−2 Integrin Komplexes) abhängig wie
Abbildung 3.2.9 B zeigt. Dies konnte schon in früheren Arbeiten gezeigt werden
[137]. CD18 ist auf PMN, exprimiert und bindet Glycoproteine, wie z.B. GpIbα, auf
Thrombozyten. PSGL-1 auf PMN bindet P-Selektin (CD62P) auf Thrombozyten.
3 Ergebnisse
54
Abb. 3.2.9. Konjugatformation zwischen Thrombozyten und PMN ist Selektin und Integrin
abhänig und wird nicht von TREM-1/TREM-1L beeinflusst. PMN und Thrombozyten wurden isoliert
und mit den Stiumuli in Kokultur gegeben. Die Abbildungen zeigen Konjugatbildungen nach 30 min.
Konjugate werden als Bindung in Prozent an calceinpositiven Zellen angegeben. LPS und Thrombin
bewirken, dass verstärkt Konjugate zwischen Thrombozyten und PMN gebildet werden (A und B).
rsTREM-1 oder α−TREM-1 haben keinen Einfluss auf die Bildung der Konjugate (A). In B ist zu
erkennen, dass α−PSGL-1 und α−CD18 bei der Konjugatformierung beteiligt sind.
3 Ergebnisse
3.2.6
Ohne
55
Konjugatbildung
bleibt
die
Aktivierung
von
PMN
durch
Thrombozyten aus.
Vorausgesetzt, dass für die verstärkende Wirkung von TREM-1/TREM-1 Ligand auf
PMN ein Kontakt zwischen PMN und Thrombozyten erforderlich ist, müsste diese
Verstärkung bei Inhibierung des Kontaktes wie unter 3.2.5 beschrieben auch eine
Erhöhung des „respiratory burst“ nach LPS Stimulation ausbleiben. Hierfür werden
die beiden zuvor benutzten blockierenden Antikörper α−CD18 und α−PSGL-1 zu der
Cokultur gegeben.
Abb. 3.2.10 Konjugatformierung zwischen Thrombozyten und PMN ist Vorrausetzung für die
Verstärkung des „respiratory burst“ von PMN.
Thrombozyten (PLT) und PMN wurden in Kokultur gehalten und der respiratorische burst gemessen
(SFI= spezifischer Fluoreszenzindex). Mit LPS (weiße Balken) ergibt sich die verstärkende Wirkung
der Thrombozyten. Gibt man nun Antikörper hinzu, welche blockierend auf CD18 bzw. PSGL-1 wirken, so wird
die Verstärkung der Thrombozyten egalisiert.
Sowohl α−CD18 wie auch α−PSGL-1 inhibieren die Verstärkung der Saustoffradikal
Produktion (Abb. 3.2.10). Aus diesem Ansatz ist ersichtlich, dass für den
stimulierenden Effekt über TREM-1/TREM-1L auf PMN ein Zellkontakt zwischen
diesen Zellen und Thrombozyten Voraussetzung ist.
3 Ergebnisse
56
3.3. Ras ist essentiell für den LPS vermittelten „respiratory
burst“ von neutrophilen Granulozyten.
3.3.1 Die PI3 Kinase und PLC-γ sind essentiell für den TREM-1/LPS vermittelten
„respiratory burst“ von neutrophilen Granulozyten
Ergebnisse aus früheren Experimenten haben gezeigt, dass TREM-1 mit dem
Adaptormolekühl DAP12 assoziiert und zu einer Ca2+ Mobilisierung sowie zu einer
Phosphorylierung der Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) ERK 1/2 und
Phoslipase C-γ (PLC-γ) führt [138]. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass es zu
einer synergistischen Produktion von Sauerstoffmetaboliten (respiratory burst), sowie
IL-8 bei gleichzeitiger Stimulation von TLR-Rezeptoren und TREM-1 kam [139]. Da
diese Verstärkung der beiden Stimuli zeitlich früh einsetzt, d. h. sie ist bereits nach
40 min zu beobachten (Abb. 4.1), kann die entstandene Synergie nicht durch die
veränderte Oberflächenexpression des TREM-1 Rezeptors oder durch lösliche
Faktoren erklärt werden. Die Ursachen für das Zusammenwirken der beiden Stimuli
sollte in folgenden Versuchen auf intrazellulärer Ebene aufgeklärt werden. Die
Arbeitshypothese war, dass es auf den intrazellulären Signalwegen zu einer
Amplifikation der beiden aktivierten Sginalkaskaden kommt.
In ersten Versuchen mit pharmakologischen Substanzen, welche spezifisch einzelne
Moleküle in ihrer Aktivität bzw. Aktivierung inhibieren, sollten erste Hinweise auf
Moleküle, die an der Signalübertragung beteiligt sind, erlangt werden. Diese
pharmakologischen Substanzen werden im weiteren Verlauf „Inhibitoren“ genannt.
Die Substanzen wurden auf ihre Wirksamkeit im „respiratory burst“ (s. Ergebnisse
Teil I) untersucht. Anschließend sollte versucht werden, die Aktivitätsmuster der
Kandidatenmoleküle, sowie die Auswirkungen der Inhibitoren darauf, in Western
Blots nachzuweisen. Ebenfalls wurde der Ca2+- Flux und ein eventueller Einfluss der
Inhibitoren auf diesen nach TREM-1 Stimulation untersucht.
3 Ergebnisse
57
Abb. 3.3.1 Der „respiratory burst“ bei Stimulation von TREM-1 und LPS.
Zu sehen sind α-TREM-1 (10 µg/ml) Stimulation (schwarze Punkte), LPS (100 ng/ml) Stimulation mit
einem Kontrollantikörper (10 µg/ml) (weisse Dreiecke), Stimualtion mit einem Kontrollantikörper allein
(10µg/ml) (weisse Punkte) sowie die Stimulation mit LPS (100 ng/ml) und α−TREM-1 (10 µg/ml)
gemeinsam (schwarze Dreiecke). Zu erkennen ist, dass sowohl TREM-1 Ligation als auch LPS zur
Produktion von Sauerstoffradikalen führen. Die Gabe beider Stimuli resultiert in einer Verstärkung des
„respiratory burst“. Das Experiment ist beispielhaft für mindestens drei unabhängige Experimente. Der
spezifische Fluoreszenz Index entspricht der gemessenen Fluoreszenz abzüglich der Fluoreszenz von
PMN, welche im Medium gehalten wurden. Die Werte entsprechen dem Mittelwert aus Triplikaten.
Die hier eingesetzten Konzentrationen entsprechen den Konzentrationen welche bei allen folgenden
Experimenten verwandt wurden.
Zunächst musste für den Versuch ein „setting“ gefunden werden, bei welchem
erstens jeder einzelne Stimulus, α-TREM-1 und LPS, zu einer deutlichen
Sauerstoffradikalproduktion, und zweitens die Applikation beider Stimuli zu einem
erkennbaren Unterschied im Gegensatz zu den einzelnen Stimuli führte (s. Abb.
3.3.1). Aus diesem Ansatz ergab sich, dass eine Synergie nicht immer erkennbar war
und es sich lediglich um additive Effekte handeln konnte. Die Ansätze im Folgenden
wurden mit 10 µg/ml immobilisiertem α-TREM-1 bzw. Kontroll IgG und 100 ng/ml
LPS durchgeführt. Jeder Inhibitor wurde über ein weites Spektrum titriert. Um
unspezifische Effekte der Inhibitoren ausschließen zu können, wurden zur Kontrolle
der spezifischen Wirkung die Zellen zusätzlich mit Phorbol Myristate Acetate (PMA)
stimuliert. PMA aktiviert die Proteinkinase C (PKC), welche wiederum essentiell zur
Aktivierung und Etablierung des NADPH Oxidase Komplexes ist: dieser wiederum ist
für die Sauerstoffradikalproduktion beim „respiratory burst“ verantwortlich
[140].
Wurde die Wirkung von PMA durch einen Inhibitor beeinflusst, so war dies ein
3 Ergebnisse
58
Hinweis auf eine unspezifische Wirkung. Es wurden nur Ergebnisse ausgewertet, bei
welchen die Konzentration des jeweiligen Inhibitors keine Auswirkung auf die
Wirkung von PMA hatte, damit von einer spezifischen Wirkung ausgegangen werden
konnte.
In Abbildung 3.3.2 ist zu erkennen, dass der Inhibitor der PI3 Kinase LY294002
sowie der Inhibitor für PLC-γ (U73221) zu einer Inhibition des „respiratory burst“
führte. Sowohl der LPS induzierte respiratorischer burst (RB) und der TREM-1
induzierte RB sind nicht mehr zu detektieren. Auch die durch beide Stimuli induzierte
Sauerstoffradikalproduktion ist nicht mehr vorhanden.
A
B
C
Abb. 3.3.2 PI3 Kinase und PLC-g sind essentiell für den TREM-1/LPS vermittelten „respiratory
burst“.
Abbildung A zeigt den „respiratory burst“ ohne Inhibitor. Deutlich zu erkennen sind die Aktivierung
durch a-TREM-1, LPS sowie die verstärkte Aktivierung des „respiratory burst“ durch gleichzeitige
Gabe beider Stimuli. Die Inhibitoren LY294002 (5 µM Abb. B) und U73221 (0,3 µM) wurden 30 min
vor Beginn des Experimentes in die Kultur gegeben. Beide führen zu einer Inhibition des „respiratory
burst“ bei PMN. Das Experiment ist beispielhaft für mindestens drei unabhängige Experimente. Die
Werte entsprechen dem Mittelwert aus Triplikaten. Die hier eingesetzten Konzentrationen der Stimuli
entsprechen den Konzentrationen, welche in Abb. 3.3.1 angegeben wurden.
TREM-1 Stimulation resultiert bei humanen PMN in einem Ca2+ Einstrom (FLUX) in
die Zellen. Interessanterweise wird dieser Einstrom wesentlich verstärkt, wenn die
Zellen mit LPS vorbehandelt wurden (Abb. 3.3.3). Hieraus ergibt sich eine weitere
Möglichkeit, die zwei verschiedenen Stimuli an unterschiedlichen Eigenschaften zu
untersuchen. Ebenso eignet sich diese Messung zur Untersuchung der Aktivität von
3 Ergebnisse
59
PLC-γ. da das intrazelluläre Ca2+ nach Phosphorylierung von PLC-γ erhöht wird.
TREM-1 Stimulation bewirkt einem messbaren Ca2+ Flux, LPS alleine hingegen nicht.
Werden die Zellen nun zuvor LPS behandelt, so ist der TREM-1 vermittelte Einstrom
von Ca2+ wesentlich stärker. In Abbildung 3.3.3 ist zu erkennen, dass der Inhibitor
der PI3 Kinase (LY294002) sowie der Inhibitor von PLC-γ (U73321) den Ca2+ Flux
von TREM-1 allein sowie den durch LPS verstärkten, vollständig unterbanden.
Abb. 3.3.3. TREM-1 vermittelter Ca2+ Flux wird LPS verstärkt. Der Ca2+ Flux ist sowohl PI3
Kinase und PLC-γ abhängig.
2x106 /ml PMN wurden mit Fluo-3-AM inkubiert. Dieses ist zellgängig und fluoresziert bei Kontakt mit
Ca2+. ZU sehen sind Dot-Blots einer FACS Analyse. Die X-achse entspricht einem konstanten
Zeitintervall, die y-Achse der Fluoreszenzintensität. Links oben ist die Zugabe von a-TREM-1 mit
sekundärem goat-anti-mouse F(ab)2, welches zur Kreuzvernetzung der a-TREM-1 führte, zu sehen.
Der Ca2+ Flux ist nur bei kreuzvernetzendem Signal erkennbar (Daten nicht gezeigt). LPS führt zu
einer Intensivierung des durch TREM-1 Ligation induzierten Ca2+ Fluxes (Links Unten). Sowohl der
PI3 Kinase Inhibitor LY294002 (mitte), sowie der Inhibitor U73221 für PLC-γ (rechts), inhibieren den
TREM-1(oben,) sowie den TREM-1/LPS (unten) induzierten Ca2+ Flux. Die Ergebnisse sind
repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente
In Abbildung 3.3.2 und 3.3.3 konnte gezeigt werden, dass das TREM-1 und LPS
vermittelte intrazelluläre Signal über die PI3 Kinase und PLC-γ verlaufen, und diese
beiden Moleküle unabdingbar für die Induzierung des „respiratory burst“ sind. Es
3 Ergebnisse
60
sollte nun untersucht werden, ob die Aktivität der PI3 Kinase auch auf der
Proteinebene bestätigt werden kann. Hierzu wurde die Phosphorylierung von Akt
untersucht. Akt wird von der PI3 Kinase phosphoryliert und damit aktiviert. Deswegen
eignet sich die Phosphorylierung von Akt dazu, eine Aktivität der PI3 Kinase
nachzuweisen. Abbildung 3.3.4 zeigt, dass sowohl LPS als auch α−TREM-1 in der
Phosphorylierung von Akt resultieren. Die Phosphorylierung nach Stimulation mit
α−TREM-1 ist bereits nach einer Minute zu erkennen und nach 10 Minuten wieder
verschwunden. LPS vermittelte Phosphorylierung von Akt beginnt spät nach der
Stimulation, erkennbar zwischen 30 und 60 min. Werden beide Stimuli gemeinsam
gegeben, so ergibt sich eine biphasische Phosphorylierung von Akt, welche einer
Addition der beiden einzelnen Stimuli entspricht. Der Inhibitor der PI3 Kinase
LY294002 verhindert die Phosphorylierung von Akt durch LPS Stimulation oder
TREM-1 Ligation (Abb. 3.3.5)
Abb. 3.3.4. TREM-1 und LPS Ligation induzieren die Phosphorylierung von Akt. Bei
gleichzeitiger Stimulation entsteht eine biphasische Phosphorylierung.
Die Abbildung zeigt die Phosphorylierung von Akt nach 0-60 min der angegebenen Stimuli. Die
Phosphorylierung wurde im Western Blot nachgewiesen.2x106 PMN/ml wurden mit modifiziertem
RIPA Puffer 100 µl/ml Zellen lysiert. Zur Kontrolle des Proteingehalts in den einzelnen Fraktionen
wurde der Blot ebenfalls mit a-ERK1/2 als Ladekontrolle gefärbt (s. Anhang) sowie eine Analyse der
Proteinkonzentrationen im Zelllysat unternommen. Zu erkennen ist, dass LPS und TREM-1 Ligation
eine Phosphorylierung von Akt induzieren. Nach TREM-1 Ligation erfolgt dies nach 1min und bei 10
min Stimulation nur schwach bzw. gar nicht mehr. LPS induziert die Phosphorylierung von Akt nach
30 min. Sie dauert bis 60 min an. Gibt man beide Stimuli in die Zellkultur,
so ist ein additives
Phosphorylierungsmuster mit biphasischen Erscheinungsbild zu detektieren. Die Abbildung zeigt ein
representatives von 3 unabhängigen Experimenten. Ladekontrollen für Abbildung s. Ende des
Kapitels.
3 Ergebnisse
61
3.3.2 ERK1/2 zeigt ein biphasisches Phosphorylierungsmuster nach TREM-1 /
LPS Stimulation und liegt der PI3 Kinase nachgeschaltet.
Da bekannt ist, dass LPS und TREM-1 Stimulation auch die Phosphorylierung der
MAP Kinase ERK1/2 zur Folge hat, wurde auch untersucht, ob diese in der
Amplifikation der Signale eine Rolle spielt. Ein Inhibitor für die Aktivierung von
ERK1/2 (PD98059) hatte keinerlei Auswirkungen auf die Induktion des „respiratory
burst“ (diese Daten werden nicht gezeigt).
Abb. 3.3.5. Biphasische Phosphorylierung von ERK1/2 und Akt von LPS und TREM-1 sind PI3
Kinase abhängig.
Abbildung A zeigt die Phosphorylierung von ERK1/2 im Western Blots. TLR4 und TREM-1 Ligation
führen zur Phosphorylierung von ERK1/2 (nicht phosphoryliertes ERK1/2 als Kontrolle siehe im
Anhang). TREM-1 Ligation von 1-3 min, LPS Stimulation von 30-60 min. Beide Stimuli gemeinsam
addieren die Phosphorylierung zu einer biphasischen Phosphorylierung von ERK1/2.
Abbildung B zeigt die Phosphorylierung von ERK und Akt sowie unphosphoryliertes ERK1/2 als
Ladekontrolle nach 3 und 30 min. Zu erkennen sind die der TREM-1 Ligation und der LPS Stimulation
folgenden, typischen Phosphorylierungen, welche durch die Inhibition der PI3 Kinase (LY294002),
vollständig verschwinden. Die Abbildung ist representativ für mindestens drei unabhänige
Experminente. Ladekontrollen für linke Abbildung s. Ende des Kapitels.
Auf der Proteinebene lässt sich die Aktivität von ERK 1/2 untersuchen, indem man
mittels eines Western Blots analysiert, ob dieses Molekül phosphoryliert vorliegt. Die
Phosphorylierung von ERK1/2 zeigt das gleiche biphasische Muster, welches schon
bei der Phosphorylierung von Akt zu erkennen war. Auch die Addition von beiden
Stimuli ist zu beobachten (Abb. 3.3.5). Werden die Zellen zuvor mit dem PI3 Kinase
Inhibitor LY294002 inkubiert, so ist keine Phosphorylierung von ERK mehr erkennbar
(Abb. 3.3.5).
3 Ergebnisse
62
3.3.3 p-38 ist essentiell für die LPS/TREM-1 vermittelte Induktion des
„respiratory burst“.
Die MAP Kinase p38 spielt eine wichtige Rolle in vielen zellulären Prozessen; es
konnte kürzlich gezeigt werden, dass sie ebenfalls nach Ligation von TREM-1 in
einer monozytischen Zelllinie phosphoryliert wird [141].
Die Untersuchungen mit einem Inhibitor für p38 (SB203580) ergaben, dass sowohl
der nach TLR4 Ligation induzierte respiratorische burst (RB), sowie der aus der
TREM-1 Ligation resultierende RB blockiert werden (Abb. 3.3.6). Auch die
Kombination
aus
beiden
Stimuli
resultiert
in
einer
deutlich
geringeren
Sauestoffradikalproduktion, wenn p38 inhibiert wurde.
Abb. 3.3.6. p38 ist essentiell für den TREM-1 und LPS induzierten „respiratory burst“ von PMN.
Die Abbildung zeigt die Analyse des „respiratory burst“ nach TREM-1 Ligation, LPS Stiumlation sowie
TREM-1/LPS Stimulation +/- p38 Inhibitor SB203580 (100 nM). SB203580 wurde 30 min vor dem
Start des Experiments zu den Zellen gegeben und führte zur Inhibition des „respiratory burst“ von
PMN bei allen gegebenen Stimuli. Die Abbildung ist representativ für mindestens drei unabhänige
Experminente.
Western Blot Analysen ergeben, dass sowohl nach LPS Stimulation und nach
TREM-1 Ligation p38 phosphoryliert wird. Zu erkennen ist, dass die LPS vermittelte
Phosphorylierung von p38 nach 3 min deutlich erkennbar ist und bis 60 min abnimmt
aber
noch
zu
detektieren
ist.
Die
durch
TREM-1
Ligation
vermittelte
Phosphorylierung von p38 ist nach 10 min zu erkennen und steigt noch weiter bis 60
min nach Stimulation an (Abb. 3.3.7). Die Phosphorylierung von p38 hat keine
deutliche, zeitliche Trennung der beiden Stimuli, wie sie zuvor bei AKT bzw. ERK1/2
3 Ergebnisse
63
gegeben war. Eine Addition der Phosphorylierung von p38 bei der Ligation von
TREM-1 und TLR4 gemeinsam konnte nicht eindeutig festgestellt werden, es
bestehen unterschiede zu den Stimuli wenn sie einzeln gegeben wurden (Abb.
3.3.7).
Bei Inhibition der PI3 Kinase (LY294002) ist zu erkennen, dass die von LPS und
TREM-1 vermittelte Phosphorylierung von p38 nicht beeinflusst wird (Abb. 3.3.7).
Abb. 3.3.7. TREM-1 Ligation und LPS Stimulation führen zur Phosphorylierung von p-38 bei
PMN. Der TREM-1 Ligation folgenden Phosphorylierung von p38 ist PI3 kinase reguliert. Die
LPS induzierte Phosphorylierung ist unabhängig von der PI3 Kinase Regulation.
Links in der Abbildung ist die Phosphorylierung von p38 nach Stimulation von PMN mit den
angegebenen Stimuli im Western Blot zu sehen. P38 wird sowohl nach TREM-1 Ligation sowie nach
LPS Stimulation phosphoryliert. Die Phosphorylierung von p38 nach TREM-1 Ligation ist von 10 bis
60 min erkennbar. Der LPS Stimulation folgenden Phosphorylierung von p38 ist von 3-30 min gut
erkennbar. Die Inhibition der PI3 Kinase führt zu keiner Beeinträchtigung der späten Phosphorylierung
von p38. Die Abbildung ist representativ für mindestens drei unabhänige Experminente.
Ladekontrollen für Linke Abbildung s. Ende des Kapitels.
3 Ergebnisse
64
3.3.4 Ras vermittelt den LPS induzierten „respiratory burst“ „upstream“ der PI3
Kinase.
In kürzlich veröffentlichten Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die GTPase Ras
eine Rolle in der durch TLR4 vermittelten Signaltransduktion spielt [142;143]. Um
Ras zu aktivieren, ist die Farnylisation von Ras wichtig [144]. Um den Einfluss von
Ras auf den „respiratory burst“ nach TREM-1/LPS Stimulation zu studieren, wurde
der Farnylationtransferaseinhibitor Manumycin A eingesetzt [145]. Dieser inhibiert
die Farnesyltransferase und somit eine Aktivierung von Ras.
Manumycin A inhibiert ausschließlich den durch LPS vermittelten „respiratory burst“.
Auch
bei
gleichzeitiger
Gabe
der
beiden
Stimuli
wurde
die
Sauerstoffradikalproduktion inhibiert, dies jedoch nur bis zu dem Maße in dem
TREM-1 alleine den „respiratory burst“ induziert hatte (Abb. 3.3.8).
Abb. 3.3.8.. Manumycin A inhibiert spezifisch den LPS induzierten „respiratory burst“ von
PMN.
Die Abbildung zeigt die Analyse des „respiratory burst“ nach TREM-1 Ligation, LPS Stiumlation sowie
TREM-1/LPS Stimulation +/- Manumycin A (3 µM). Manumycin A wurde 30 min vor Experimentbeginn
zu den Zellen gegeben und führte zur Inhibition des „respiratory burst“ von PMN nach LPS Stimulation
(rechts weiße Dreiecke). Der verstärkende Effekt durch LPS und TREM-1 Stimulation (schwarze
Dreiecke) wurde von Manumycin A auf das Niveau der Ligation von TREM-1 allein reduziert. Der
durch TREM-1 Ligation (schwarze Punkte) induzierte respiratorische burst wurde nicht durch
Manumycin A inhibiert. Die Abbildung ist representativ für mindestens drei unabhänige Experminente
3 Ergebnisse
65
Auch die LPS vermittelte Verstärkung des TREM-1 induzierten Ca2+ Fluxes wurde
von Manumycin A auf den Ausgangswert, welchen TREM-1 alleine vermittelte,
reduziert. Die von LPS verursachte Verstärkung des Ca2+ Fluxes blieb bei
Manumycin A Behandlung der PMN aus (Abb. 3.3.9).
Abb. 3.3.9. Manumycin A inhibiert die durch LPS vermittelte Verstärkung des TREM-1
induzierten Ca2+ Flux.
Die Abbildung zeigt den TREM-1 induzierten Ca2+ Flux (links oben) sowie die LPS vermittelte
Verstärkung von diesem (links unten). Manumycin A inhibierte die LPS vermittlete Verstärkung des
Ca2+ Fluxes (rechts unten) nicht aber den nach TREM-1 Ligation (rechts oben, rechts unten)
folgenden Ca2+ Flux bei PMN. Die Abbildung ist representativ für mindestens drei unabhänige
Experminente.
Wurde mittels Western Blot die Aktivierung von Ras betrachtet, so gab es nach LPS
Stimulation eine Aktivierung, welche bereits nach 1 min detektierbar war und bis 10
min anstieg. TREM-1 Ligation hatte keine Aktivierung von Ras zur Folge. Wurden die
Zellen mit Manumycin A inkubiert, so fand sich auch nach LPS Stimulation keine
Aktivierung von Ras (Abb. 3.3.10).
3 Ergebnisse
66
Abb. 3.3.10.. Manumycin A inhibiert die LPS vermittelte Stimulation von Ras.
. Aktiviertes Ras bindet an GTP, inaktives an GDP. Mithilfe GTP RBD beads wurde somit aktives Ras
aus Zelllysaten von PMN (1x107) prezipitiert. Der monoklonale Antikörper gegen Ras wurde dann im
Western Blot zur Detektion von prezipitiertem Ras benutzt. Die Positivkontrolle entspricht einer
GTPase Positivkontrolle, welche mit dem Ras „activationkit“ geliefert wurde. Zu sehen ist, dass TREM1 Ligation keine Aktivierung von Ras induziert. LPS führt zu einer erkennbaren Aktivierung von Ras
nach 1-10 min, welche durch Manumycin A inhibiert wird. Die Abbildung ist representativ für
mindestens drei unabhänige Experminente.
Manumycin A reduzierte die LPS vermittelte Phophorylierung von ERK1/2 sowie die
Phosphorylierung von Akt. Die der TREM-1 Ligation folgenden Phosphorylierungen
blieb durch Manumycin A hingegen unbeeinflusst (Abb. 3.3.11).
Abb. 3.2.11. Manumycin A inhibiert die LPS vermittelte Phosphorylierung von Akt und ERK1/2.
Die Abbildung zeigt einen Western Blot von PMN Zelllysaten gegen p-Akt, p- ERK1/2 und ERK1/2.
LPS und TREM-1 Stimulation führen zu den üblichen Phosphorylierungen von Akt und ERK.
Manumycin A inhibiert die LPS vermittelte Phosphorylierung beider Moleküle.
3 Ergebnisse
67
3.3.5 Ca2+ ist Essentiell für den TREM-1 LPS induzierten „respiratory burst“
von PMN
TREM-1 Stimulation resultiert in der Ca2+ Einstrom in die Zelle. LPS verstärkt diesen
durch TREM-1 ausgelösten Ca2+ Einstrom in die Zelle (Abb. 3.3.12). Um den Ca2+
Einstrom genauer zu untersuchen wurden die Zellen mit Inhibitoren behandelt,
welche zwei unterschiedliche Herkunftsmöglichkeiten für das Ca2+ Inhibieren. Ca2+
kann Intrazellulär aus dem endoplasmatische Retikulum (ER) ins Zytosol strömen,
oder extrazellulär ins Zytosol gelangen. TMB-8 inhibiert die „transient receptor
potential channels“ (TRPC) welche im ER liegen (intrazellulärer Ca2+ Flux).
MRS1845 inhibiert die „store operated calcium entry“ (SOCE) Kanäle die für den
Einstrom
von
extrazellulärem
Ca2+
verantwortlich
sind.
Die
Inhibition
von
intrazellulärem Ca2+ Einstrom ins Zytosol hat die Inhibierung des TREM-1 und TLR4
induzierten „respiratory burst“ zur Folge. Die Inhibition des SOCE Kanälen verhindert
nur den TREM-1 induzierten „respiratory burst“. Der im FACS gemessene Ca2+ Flux
wird durch beide Inhibitoren verhindert.
3 Ergebnisse
68
Abb. 3.3.12 Inhibition von intrazellulärem und extrazellulären Ca2+ Einstrom.
Die Inhibition des Intrazellulären Ca2+ Einstromes (TMB-8) hat die Inhibierung des respiratoryburst
zur Folge. Auch der Ca2+ Flux nach TREM-1 und die Amplifikation von diesem werden durch TMB-8
verhindert Werden TREM-1 und TLR4 stimuliert bleibt eine Sauerstoffradikalproduktion detektierbat ist
aber deutlich reduziert. Wird der Extrazelluläre Ca2+ Flux Inhibiert, so ist der TREM-1 induzierte
„respiratory burst“ nicht oder nur gering beeinträchtig, die LPS vermittelte Sauerstoffradikalproduktion
ist nur leicht beeinträchtigt.
3 Ergebnisse
69
Abb. 3.3.13 Ladekontrolle für Abb. 3.3.4, 3.3.5, 3.3.7
Zu sehen ist eine Western Blot mit von ERK1/2. Das Gel wurde mit den Selben Mengen an Protein
beladen wie in den Abbildungen, 3.3.4, 3.3.5, 3.3.7. Die Mengen an vorhandenem ERK1/2 sind
vergleichbar,
4 Diskussion
70
4. Diskussion
4.1 HVEM aktiviert humane PMN synergistisch mit Toll like
Rezeptoren und GM-CSF
Neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung
mikrobieller Infektionen [146;147]. Sie können schnell mobilisiert werden und haben
ein großes Spektrum an Möglichkeiten, eingedrungene Erreger zu erkennen und zu
beseitigen. In einer solchen frühen
Phase
der
Inflammation
könnte
von
Thrombozyten freigesetztes LIGHT [148] dazu beitragen, PMN verstärkt zu
aktivieren. Die Aktivierung von Monozyten durch LIGHT konnte im Fall von
Monozyten bereits gezeigt werden [149]. Die Interaktion von LIGHT und HVEM kann
dazu beitragen, die Beseitigung und Bekämpfung von bakteriellen Infektionen zu
verbessern [59]. In einem späteren Verlauf einer Infektion, wenn das adaptive
Immunsystem und somit T-Zellen zur Bekämpfung von Erregern am Infektionsort
sind, kann man sich eine Interaktion zwischen membranständigem LIGHT auf TZellen oder sezerniertem LTα [150] und HVEM auf PMN zur Stimulation der PMN
vorstellen. Die kürzlich entdeckten Th17 Zellen [151], welche sich durch die
Produktion von IL-17, das der Mobilisierung von PMN dient [152], auszeichnen [153],
unterstützen eine solche Hypothese einer Interaktion von T-Zellen und neutrophilen
Granulozyten, eines „Link“ zwischen adaptiver und angeborener Immunität [154].
Ebenfalls ist eine Interaktion von BTLA mit HVEM [155] auf PMN denkbar.
Für diese Arbeit wurde ein monoklonaler Antikörper zur Stimulation von HVEM
benutzt, um eine Stimulation von HVEM zu untersuchen und Interaktionen von
LIGHT und LTα mit anderen Rezeptoren auszuschließen [156]. Die Ergebnisse aus
Kapitel 3.1 zeigen, dass eine Stimulation von humanen PMN durch α−HVEM nur bei
einer sehr hohen Konzentration (30 µg/ml) erfolgt (s. Abb. 3.1.1 und 3.1.2). Die
Produktion von Sauerstoffradikalen, die Sezernierung von IL-8 und die Degranulation
erfolgt nur bei kreuzvernetzendem Signal (s. Abb. 3.1.1, 3.1.2 und 3.1.3).
Wird HVEM in der Gegenwart von TLR Liganden und GM-CSF stimuliert, so ist ein
starkes Ansteigen des „respiratory burst“ (Abb. 3.1.3. und 3.1.4) zu erkennen,
welches über eine Addition der beiden Signale hinausgeht. Diese verstärkenden
Effekte sind auch für die Produktion von IL-8 und die Degranulation zu beobachten
(Abb 3.1.5).
4 Diskussion
71
Bei der mittels Antikörper erzeugten Stimulation von HVEM konnte keine Wirkung auf
den Apoptosezyklus der neutrophilen Granulozyten beobachtet werden. Im
Gegensatz zu anderen Rezeptoren
der TNF Rezeptorfamilie [157;158] scheint
HVEM nicht an der Regulation dieses Zykluses beteiligt zu sein (s.Abb 3.1.7). HVEM
wirkt nicht pro- oder antiapoptotisch.
Die Phagozytose von PMN war durch Stimulation mit α-HVEM nicht zu aktivieren
(Abb. 3.1.6). Hier zeigte sich auch keine verstärkende Wirkung zusammen mit TLR
Liganden oder GM-CSF (Abb. 3.1.6). Wurden allerdings komplementopsonisierte
Beads zusätzlich zur Stimulation von HVEM gegeben, so war ein verstärkender
Effekt der beiden Stimuli erkennbar (Abb. 3.1.6). Diese Beobachtung stimmt mit der
von Heo. et al. überein, die eine verstärkte Phagozytose von Bakterien bei
Stimulation mit LIGHT beobachteten, diese aber nicht durch alternative Gabe von
LPS erklären, bzw. voneinander separieren konnten [59].
Die verstärkenden Effekte bei Stimulation
von HVEM könnten auf zweierlei Weisen
T-Zelle
erklärt werden. Zum einen besteht die
Möglichkeit, dass durch Stimulation mit
LIGHT
HVEM
α−HVEM
LTα
Aktivierung
PMN
HVEM
Mediatoren
von
den
PMN
freigesetzt werden, welche wiederum zu
einer
stärkeren
Aktivierung
im
Zusammenspiel mit GM-CSF und TLR
Liganden führt. Kandidaten hierfür wären IL8 oder TNF-α. Die produzierten Mengen von
IL-8 oder TNF-α sind in den ersten Minuten
Bakterium
opsonisiertes
Bakterium
nach
Stimulation
gesteigerte
noch
Degranulation
gering,
die
bzw.
der
Abb. 4.1 Stimulation von HVEM auf
beginnende „respiratory burst“ sind bereits
neutrophilen Granulozyten
nach 15-20 min zu beobachten. Somit kann
eine Freisetzung dieser beiden Zytokine für die frühe Amplifizierung ausgeschlossen
werden.
Es gibt eine zweite Möglichkeit, die Synergie in der Aktivierung von PMN zwischen
zwei Stimuli zu erklären. Die Verstärkung kann durch intrazelluläre Signalkaskaden
entstehen. Aus der Stimulation mit LIGHT resultiert die Aktivierung von NFκB, PLCγ1 sowie die Mobilisierung von Ca2+ bei Monozyten [159;160]. TLR Liganden können
4 Diskussion
72
zur Aktivierung von NFκB, MAPK, PI3-Kinase und PLC−γ führen [161-164]. Ob die
Synergie durch die Aktivierung unterschiedliche Signalwege oder in einer stärkeren
und zeitlich voneinander getrennten Aktivierung derselben Signalwege ausgelöst
wird, und diese Signalwege auch für neutrophile Granulozyten bestehen, bedarf
weiterer Untersuchungen.
HVEM und LIGHT sind in einer Reihe von immunologischen Krankheiten involviert.
In Asteriosklerose [165], beim „graft versus host diasease“ (GVHD) [166;167] und bei
Autoimmunerkrankungen [168]. Studien bei Knockout Mäusen ergaben, dass LIGHT/-
Mäuse Defekte in der Aktivierung von T-Zellen hatten [169;170]. Bei konstitutiver
Expression
von
LIGHT
auf
Gewebsschädigungen [171].
T-Zellen
kam
es
zur
Inflammation
und
zu
4 Diskussion
73
4.2 Ein Ligand für TREM-1 ist auf der Oberfläche von Thrombozyten
expremiert
Die Entdeckung eines Liganden für TREM-1 auf der Oberfläche von Thrombozyten
(Abb 3.2.1 - 3.2.4) und der TREM-1 – TREM-1 Ligandinteraktion von PMN und
Thrombozyten und der daraus resultierenden verstärkten Aktivierung nach LPS
Stimulation (3.2.6 und 3.2.7) ist ein weiterer Puzzelstein, um Krankheiten wie z.B.
Sepsis behandeln zu können.
Die Interaktion von Thrombozyten und Leukozyten bei bestehender Sepsis wurde
1995 von Gawaz et al. bereits beschrieben [172]. TREM-1, ist in den Verlauf von
experimentellen Modellen des septischen Schocks bei Mäusen involviert. Durch
kompetitive Hemmung der TREM-1 Ligation konnte die Sterberate der Mäuse
verringert werden [99;173]. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass der verstärkende
Effekt der TREM-1 Ligation auf Monozyten und PMN [76;174] ausbleibt. Die
Entdeckung eines TREM-1 Liganden und die Verstärkung der Aktivierung von
neutrophilen Granulozyten durch TREM-1- TREM-1 ligandabhängige Interaktion
vereint diese Erkenntnisse.
Thrombozyten scheinen zwar bevorzugt in experimentalen Konditionen an
Monozyten zu binden (Abb.3.2.8) [175;176]. Diese PSGL-1 und β1- und β2 - integrin
abhängige Interaktion ist auch zwischen PMN und Thrombozyten experimentell
sowie bei Sepsis und schwerem Trauma zu beobachten (Abb. 3.2.8). [177;178]. In
Mausmodellen der „acid induced Lung injury“ (ALI) und Zymosan oder LPS
induzierter Sepsis scheint die Interaktion zwischen PMN und Thrombozyten
Voraussetzung für die Entwicklung bzw. Etablierung der Krankheiten zu sein [179].
Die Interaktion von Thrombozyten und Leukozyten und deren Aktivierung wurde
bisher der Interaktion von Intergrinen und Selektinen zugeschrieben ([180-183]). Die
Ergebnisse aus Kapitel 3.2 zeigen, dass die Aktivierung von PMN, wie in dem in
dieser
Arbeit
beschriebenen
experimentellen
„setting“,
TREM-1
-
TREM-1
ligandabhängig ist (Abb 3.2.7). Die Bindung zwischen Monozyten und PMN mit
Thrombozyten jedoch von Selektinen (PSGL-1) Integrinen (CD18) gesteuert werden,
und die Bindung von der TREM-1 – TREM-1 Ligand Interaktion unabhänig ist (Abb.
3.2.8).
Die Bindung der Thrombozyten mit PMN über Selektine und Integrine ist Bedingung
für die in unserem experimentellen Verlauf beobachtete Verstärkung des LPS
4 Diskussion
74
induzierten „respiratory burst“, da blockierende Antikörper für PSGL-1 und CD18
diesen verhinderten (Abb. 3.2.10). Das die verstärkende Wirkung von Thrombozyten
auf PMN durch einen monoklonalen Antikörper gegen TREM-1 oder das
Fusionsprotein aus humanem TREM-1 und Fc-Teil von humanem IgG inhibiert wird,
lässt darauf schließen, dass natürlich vorkommendes sTREM-1 als eine Art „decoy“
Rezeptor fungieren kann, um eine ausufernde Reaktion von Leukozyten zu
vermeiden, wie es Gibot bereits vorgeschlagen hat [184].
Das die Thrombozyten nicht in der Lage sind, PMN ohne LPS zu aktivieren, wie es
bei der Stimulation von TREM-1 mit einem monoklonalen Antikörper der Fall ist, kann
daran liegen, dass ohne LPS nur wenige Konjugate zwischen Thrombozyten und
PMN gebildet werden, (Abb.3.2.9) und so ein kreuzvernetzendes Signal nicht
gegeben ist. Eine Verstärkung durch die Hochregulation von TREM-1 auf PMN oder
TREM-1 Ligand auf Thrombozyten nach deren Aktivierung liegt nicht vor (Abb. 3.2.4)
und kann die ausbleibende Aktivität von PMN in einer Kokultur mit Thrombozyten
ohne LPS nicht erklären.
Abb. 5.2 Interaktion PMN mit Thrombozyte nach LPS Stimulation
Selektine und Integrine sorgen für eine Bindung zwischen PMN und Thrombozyt nach
Aktivierung. TREM-1 und TREM-1L Interaktion sind für die verstärkte Aktivierung der PMN nach
LPS Stimulation verantwortlich.
Die Beobachtung, dass das Fusionsprotein aus humanem Fc-Teil und extrazellulärer
Domaine von humanen TREM-1 den „respiratory burst“ nach LPS Stimulation in
einer Kokultur von Thrombozyten und PMN über die Stimulation von LPS alleine
hinaus inhibiert (Abb. 3.2.7) und fast keine Sauerstoffradikalbildung mehr zu
detektieren ist, könnte auf eine Interaktion zwischen Fc-Teil des Fusionsproteins mit
4 Diskussion
75
Fc-Rezeptoren auf den PMN zurückzuführen sein. Auf PMN existieren FcRezeptoren, welche inhibierend auf die Aktivierung von PMN wirken können [185].
Die Entdeckung des TREM-1 Liganden auf Thrombozyten zeigt einen neuen Aspekt
der Interaktionen zwischen Thrombozyten und Leukozyten bei inflammatorischen
Krankheiten. Versuche, den TREM-1 Liganden zu identifizieren sind bisher nicht
gelungen und werden zurzeit im Labor durchgeführt. Die Interaktion von
Thrombozyten mit Monozyten und die Rolle von TREM-1 und TREM-1 Ligand
werden ebenfalls untersucht.
Die kürzliche Entdeckung, dass die von PMN produzierten „neutrophil extracellular
Traps“ (Nets), welche über TLR4 stimulierte Thrombozyten ausgelöst werden können
[186] und in septischen Plasma gefundenen wurden, lässt ebenfalls auf eine
mögliche wichtige Rolle der TREM-1-TREM-1-Ligand-Interaktion schließen. Diese
These wird dadurch unterstützt, dass die Produktion von Nets, durch einen nach
hoher Sauerstoffradikalproduktion, induzierten Tod der Zellen, ausgelöst wird [187].
Das Vorhandensein eines weiteren Liganden für TREM-1 auf Marburg und Ebola
Viren [188] schließt nicht die Existenz eines körpereigenen Liganden aus. Dass ein
körpereigener Ligand existiert, haben die Experimente mit Mausmodellen des
septischen Schocks mit LPS gezeigt. Bei diesen Modellen sind keine körperfremden
Organismen involviert. Die Existenz mehrerer Liganden für einen Rezeptor ist in der
Immunologie weit verbreitet. Ein ähnliches Beispiel hierfür ist HVEM, bei welchem
ebenfalls ein Virus sowie körpereigene Liganden binden können.
4 Diskussion
76
4.3 Amplifikation des „respiratory burst“ nach TREM-1 und TLR4
Stimulation
TREM-1 und TLR4 Ligation resultieren beide nach Stimulation in der Aktivierung von
neutrophilen Granulozyten. Wie eine Synergie der Aktivierung von PMN nach
Stimulation beider Rezeptoren entsteht, ist bisher nicht abschließend geklärt.
Beobachtungen, dass TLR4 und TREM-1 nach Stimulation in „Lipid Rafts“ [189]
kolokalisiert sind und die zwei Signalwege dazu führen, dass Makrophagen bzw.
PMN synergistisch aktiviert werden, konnten nicht klären, wie die intrazellulären
Signalkaskaden miteinander verwoben sind. Erkenntnisse aus Experimenten mit
siRNA „gene silencing“ Methoden für TREM-1 konnten zeigen, dass es zu einer
geringeren Transkriptionsrate von Schlüsselproteinen im TLR4 Signalweg kam [190],
wenn TREM-1 „knock down“ vorlag. Diese Regulierung auf Transkriptionsebene
erklärt jedoch nicht die synergistischen Effekte, welche kurze Zeit nach Stimulation
eintreten. Um diese unmittelbaren Effekte auf PMN zu in der Signalkaskade der
beiden Rezeptoren zu untersuchen, wurde der „respiratory burst“ als Modellsystem
gewählt. Er ist bereits nach ca. 20 min detektierbar und kann somit als ein
Detektionssystem für direkt in der Signalkaskade auftretende Ursachen für die
Synergie dienen.
Aus der TREM-1 Stimulation resultiert ein Ca2+ Einstrom [76] in die Zelle. Dieser
Ca2+ Einstrom wird verstärkt, wenn die Zellen zuvor mit LPS vorbehandelt wurden
(Abb. 3.3.3). LPS Stimulation resultierte hingegen nicht in einem messbaren Ca2+
Einstrom. Hieraus ergab sich eine zweite Möglichkeit, TLR4 von TREM-1 Effekte zu
unterscheiden und zu untersuchen.
PLC-γ ist in der Lage, die PKC zu aktivieren. Diese ist mitverantwortlich für die
Aktivierung der NADPH Oxidase, welche den „respiratory burst“ injiziert [191;192].
Erste Versuche mit einem Inhibitor für PLC-γ konnten zeigen, dass die Inhibition von
PLC-γ das Ausbleiben des „respiratory burst“ nach Stimulation beider Rezeptoren
verursachte (s.Abb. 3.3.2).PLC-γ ist somit essentiell für den „respiratory burst“ von
PMN nach LPS und TREM-1 Stimulation. Weiter oben („upstream“) in der
Signalkaskade liegt die PI3 Kinase, deren Aktivierung unter anderem in der
Aktivierung von PLC-γ resultiert. Die Inhibition der PI3 Kinase war ebenso essentiell
für den durch beide Rezeptoren ausgelösten „respiratory burst“ (s. Abb. 3.3.2). Bei
Inhibition beider Moleküle (PI3 Kinase und PLC-γ) war kein Ca2+ Einstrom ins Zytosol
4 Diskussion
77
mehr erkennbar (Abb. 3.3.3). Aus der Aktivierung der PI3 Kinase resultiert unter
anderem die Phosphorylierung von Akt, welche in Western Blots analysiert wurde.
Interessanterweise zeigt die aus der Stimulation von TREM-1 und TLR4
resultierende Phosphorylierung von Akt ein biphasisches Signal. TREM-1 resultiert in
einer „frühen“, LPS in einer „späten“ Phosphorylierung von Akt (Abb. 3.3.4). Dies
deutet darauf hin, dass TLR4 und TREM-1 unterschiedliche Wege in der
Signalkaskade nehmen, um die PI3 Kinase zu aktivieren.
Ein weiterer Kandidat in der Signalkaskade, welcher zur Amplifikation der beiden
Signale beitragen könnte, war die MAPK ERK1/2, bei welcher schon bekannt war,
dass es nach Aktivierung von TREM- 1 und TLR4 zu einer Phosphorylierung und
Aktivierung der von ERK1/2 kommt [76;193]. Die Inhibition von ERK1/2 hatte keine
Auswirkungen auf den „respiratory burst“ (Daten werden nicht gezeigt). Das
Phosphorylierungsmuster von ERK1/2 hatte denselben biphasischen Charakter,
welcher schon bei der Phosphorylierung von Akt zu erkennen war (Abb. 3.3.5
(TREM-1 früh / TLR4 spät)). Die Inhibition der PI3 Kinase resultierte in dem
Ausbleiben der Phosphorylierung von ERK1/2, was darauf deutet, dass ERK1/2
unterhalb („downstream“) der PI3 Kinase in den Signalkaskaden beider Rezeptoren
liegt (Abb. 3.3.5).
p38 ist in eine weitere MAPK, welche in eine Reihe von zellulären Prozessen
involviert ist. Unter anderem wird p38 nach TLR4 Ligation aktiviert (48), und es
konnte gezeigt werden, dass p38 Phosphorylierung nach TREM-1 Ligation auftritt
[194]. p38 ist zusätzlich an der Regulation des „respiratory burst“ beteiligt [195].
Auch in dem in dieser Arbeit verwandten experimentellen „setting“ wird p38 nach
TLR4 oder TREM-1 Stimulation aktiviert (Abb 3.3.7). Die Aktivierung von p38 hatte
kein eindeutiges, zeitliches Muster wie es zuvor bei Akt und ERK1/2 beschrieben
wurde. Die Inhibierung von p38 führt zu einer starken Reduzierung des „respiratory
burst“, wenn mit beiden Agonisten stimuliert wurde. Wurde mit nur jeweils einem
Liganden stimuliert, so führte die Inhibition zu einem vollständigen Ausbleiben des
„respiratory burst“ (Abb 3.3.6). Die Aktivierung von p38 war unabhängig von der
Aktivität der PI3 Kinase (Abb. 3.3.7).
Nach Studien, in denen gezeigt wurde, dass TLR4 Stimulation unter anderem in der
Aktivierung von Ras resultiert [196;197], wurde auch die Inhibition von Ras und die
Auswirkung
auf
den
„respiratory
burst“
untersucht.
Die
Inhibierung
der
Farnesyltransferase mit Manumycin A (aus der Inhibierung der Farnesyltransferase
4 Diskussion
78
resultiert das Ausbleiben der Farnesylierung von Ras, und somit wird Ras nicht an
die Membran gebunden) bewirkt das Ausbleiben des LPS induzierten „respiratory
burst“. Manumycin A hat keinen Einfluss auf den TREM-1 Induzierten „respiratory
burst“ (Abb. 3.3.8).
Ras scheint somit essentiell für den durch LPS induzierten „respiratory burst“ zu sein.
Auch der durch LPS verstärkte Ca2+ Einstrom nach TREM-1 Ligation bleibt nach
Behandlung der PMN mit Manumycin A aus (Abb. 3.3.9). LPS Stimulation aktivierte
Ras (Abb. 3.3.10), was durch Manumycin A unterbunden werden konnte. (Abb.
3.3.10). Aus der TREM-1 Stimulation resultierte keine Aktivierung von Ras (Abb
3.3.10). Die einer LPS Stimulation folgende Phosphorylierung von Akt wird durch die
Behandlung der PMN mit Manumycin A inhibiert. Daraus lässt sich folgern, dass die
PI3 Kinase nach LPS Stimulation durch Ras aktiviert wird. Die PI3 Kinase besitzt
eine Bindungsstelle für Ras, und eine Regulierung der PI3 Kinase durch Ras wurde
ebenfalls beschrieben [198]. Die Phosphorylierung von ERK1/2 wird nur teilweise
inhibiert, was auf eine alternative Regulierung von ERK1/2 (von Ras unabhängigen)
nach LPS Stimulation, oder auf eine unvollständige Inhibiton von Ras durch
Manumycin A hindeutet. Turnbull und Colonna haben nach TREM-1 Stimulation
ebenfalls eine Aktivierung von Ras beschrieben [199]. Die hier aufgezeigten
Untersuchungen wurden nur an humanen PMN vorgenommen, welche zuvor nicht
untersucht wurden. Die Schlussfolgerung, dass DAP12 in allen Fällen in einer
Aktivierung von Ras resultiert, muss nicht für alle Zelltypen stimmen, zumal in
Makrophagen die Aktivierung von DAP12 sowohl in einer Aktivierung und als auch in
einer Inhibierung der Zellen resultieren kann [200]. Dies ist für PMN (noch) nicht
beschrieben.
Untersuchungen des Ca2+ Einstroms in die Zelle ergaben, dass bei Inhibition mit
einer den intrazellulären Ca2+ Einstrom ins Zytosol (aus dem endoplasmatischen
Retikulum (ER)) inhibierenden Substanz (TMB-8) [201], sowohl der LPS sowie der
TREM-1 induzierte „respiratory burst“ ausblieben (Abb. 3.3.12). Wurde nur der
extrazelluläre Ca2+ Einstrom inhibiert (MRS1845 inhibiert “store operated calcium
entry” (SOCE)), war nur der, der TREM-1 Ligation folgende, „respiratory burst“
deutlich reduziert (Abb. 3.3.12). Der Ca2+ Einstrom selber war nach Gabe beider
Substanzen nicht mehr detektierbar (Abb.3.3.12). LPS scheint hauptsächlich
intrazelluläres Ca2+ zu mobilisieren. Nach TREM-1 Ligation ist sowohl intrazelluläres
sowie extrazelluläres Ca2+ wichtig für die Regulation des „respiratory burst“. Das der
4 Diskussion
79
LPS induzierte Ca2+ Einfluss nicht detektierbar war, kann an der Methodik zur
Untersuchung des Ca2+ Einstroms liegen, die nicht sensibel genug war, um die
geringen Mengen an intrazellulärem Ca2+ den LPS auslöst, zu messen. Das auch die
Inhibition des extrazellulären Ca2+, den LPS induzierten „respiratory burst“
beeinträchtigt, kann daran liegen, dass LPS in sehr geringem Maße auch
extrazelluläres Ca2+ mobilisiert. Extrazellulärer Ca2+ Einstrom wird auch von einen
reduzierten Ca2+ Level im ER ausgelöst [202], somit kann ein extrazellulärer Ca2+
Einstrom bei LPS Stimulation nicht ausgeschlossen werden.
Abb. 4.3 TLR4 - TREM-1 Signalkaskade für den „respiratory burst“
Die Untersuchung der Signalwege von TREM-1 und TLR4 sind nicht abschließend
vollständig aufgeklärt worden. Die Rolle der MAPK p38 gibt immer noch Rätsel auf,
z.B. wie sie genau in die Regulierung des „respiratory burst“ eingreift. Die Inhibition
von Ras hatte keine deutlichen Auswirkungen auf das Phosphorylierungsmuster von
p38 (Daten nicht gezeigt). Dies lässt darauf schließen, dass durch p38 eine
alternative Regulierung des „respiratory burst“ stattfindet. Der Ca2+ Einsrom ins
Zytosol und die biphasischen Phosphorylierungsmuster sind Kandidaten für die
durch TREM-1 und LPS induzierten synergistischen Effekte auf den „respiratory
burst“. Durch biphasische Signale kann es zu einer lange andauernden Aktivierung
der PI3 Kinase kommen, welches in einer stärkeren Aktivierung von PLC−γ und in
4 Diskussion
80
deren Folge von der PKC und NADPH Oxidase kommt. Ca2+ ist unter bestimmten,
physiologischen Umständen in der Lage, die PKC zu regulieren [203]. Der verstärkte
Einstrom von Ca2+ nach LPS und TREM-1 Stimulation kann eine Amplifikation der
NADPH Oxidasenaktivität zur Folge haben [204].
Da LPS und TREM-1 in unterschiedlichen Signalkaskaden reguliert werden, bietet
sich die Möglichkeit, therapeutisch in eine der beiden Kaskaden einzugreifen, ohne
die komplette Antwort von PMN auf z.B. eine bakterielle Infektion zu verhindern. Bei
Krankheiten wie z.B. Sepsis ist es wichtig, die Immunantwort zu regulieren und ein
„Ausufern“ dieser zu verhindern. Gleichzeitig sollte das Immunsystem, in unserem
Fall representiert durch neutrophilen Granulozyten, nicht vollständig ihr Wirken
einstellen, welches eine rasche Zunahme und ein Streuen der Bakterienkolonien zur
Folge hätte.
Manumycin A und MRS1845 sind Kandidaten für eine solche, teilweise Inhibierung
der Immunantwort. Manumycin A und MRS1845 können auch Auswirkungen auf
andere Zelltypen haben, da Ras und Ca2+ in zahlreichen Zellen vorkommen und in
deren Regulierung eine Rolle spielen. Untersuchungen für ein Wirken der
Substanzen im Organismus müsste in Tierversuchen mit experimentellen Modellen
zu Krankheiten wie Sepsis und Endotoxischemschock untersucht werden.
5 Zusammenfassung
81
5. Zusammenfassung
In Verlauf der Arbeit sollten die Rezeptoren, „Herpes Virus entry mediator“ (HVEM)
und „triggering receptor expressed on myloid cells-1“ (TREM-1) auf ihre Aktivität
unter inflammatorischen Konditionen auf humanen neutrophilen Granulozyten
untersucht werden.
Die Ligation des „Herpes Virus entry mediator“ (HVEM) mit einem monoklonaler
Antiköper gegen HVEM (α−HVEM) wurde im Zusammenspiel mit verschiedenen
Stimulatien auf die Aktivität neutrophilen Granulozyten untersucht. Die Stimulation
von HVEM mit α−HVEM resultierte nur in einer sehr geringen proinflammatorischen
Aktivität der PMN. Die Stimulation von HVEM gemeinsam mit TLR Liganden oder
GM-CSF hatte Amplifikation von „respiratory burst, IL-8 Sekretion und Degranulation
zur Folge. Die Phagozytose der PMN wurde verstärkt wenn HVEM mit Komplement
opsonisierten „polysterene beads“ Stimuliert wurde. Es konnte gezeigt werden, das
HVEM ein kostimulatorischer Rezeptor, für die Amplifikation von durch „pattern
recognition receptors“ (PRRs), ausgelöste Aktivierung von neutrophilen Granulozyten
ist.
Für TREM-1 wurde dies bereits in vorangegangen arbeiten gezeigt. Im Gegensatz zu
HVEM sind aber die natürlichen Liganden von TREM-1 bisher unbekannt geblieben.
Es gelang währen der Untersuchungen einen Liganden für TREM-1 auf
Thrombozyten zu entdecken, welcher, wie zuvor mit monoklonalen Antikörpern
gegen TREM-1 gezeigt werden konnte, ebenfalls die Amplifikation des „respiratory
burst“ und IL-8 Sekretion auf neutrophilen Granulozyten zur Folge hatte.
Im dritten Teil der Arbeit sollte eine Erklärung für die Amplifikation des „respiratory
burst“ nach TREM-1 und TLR4 Stimulation gefunden werden. Hierfür wurden die
intrazellulären Signalkaskaden untersucht. Es zeigte sich einige Unterschiede in den
beiden Signalkaskaden. Der LPS induzierte „respiratory burst“ war von Ras
abhängig, der TREM-1 induzierte nicht. Aktivitäten von essentiellen Molekülen (PI3
Kinase) in beiden Signalkaskaden zeigten unterschiedliche zeitliche Verläufe. Dies
führt zu länger anhaltende Aktivitäten der Moleküle bei gleichzeitiger Stimulation mit
beiden Liganden, was eine Erklärung für eine Amplifikation sein kann. Auch ein
verstärkter Ca2+ Einstrom in die Zellen, nach Stimulation mit beiden Liganden kann
für die verstärkte Aktivität in der Sauerstoffradikalproduktion von PMN verantwortlich
sein.
6 Abkürzungen
82
6. Abkürzungen
Ak
Antikörper
APC
Allophycocyanin
APCs
Antigen-presenting cells
BSA
Bovine serum albumin
CD
Cluster of differentiation
DMSO
Dimethylsulfoxide
DNA
Desoxyribonucleic acid
EDTA
Ethylenediamine tetraacetate
ELISA
Enzyme-linked immunosorbant assay
ER
Endoplasmatic reticulum
ERK
Extracellular-signal regulated kinase
F(ab´)2
Antigen binding fragment
Fc
Crystallizing fragment
FACS
Fluorescence-assisted cell sorting
FCS
Fetal calf serum
FITC
Fluorescein-isothiocyanate
FSC
Forward scatter
GM-CSF
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
HVEM
Herpes virus entry mediator
Ig
Immunoglobulin
IP3
Inositol-1,4,5-trisphosphate
JNK
c-Jun N-terminal Kinase
IRAK
IL-1R-associated protein kinase
ITAM
Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
ITIM
Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif
LPS
Lipopolysaccharide
LT
Lymphotoxin
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
MHC
Major Histocompatibility Complex
MPO
Myeloperoxidase
NF-κB
Nuclear Factor κB
6 Abkürzungen
83
PAF
Platelet activating factor
PAMP
Pathogen-associated molecular patterns
PBS
Phosphate buffered saline
PE β-
Phycoerythrin
PFA
Paraformaldehyde
PH
Pleckstrin-homology
PI
Propidium iodide
Pam3Cys
palmitoyl-3-Cys-ser-(Lys)4
PI3K
Phosphoinositide 3-OH kinase
PIP2
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
PKC
Protein Kinase C
PLC
Phospholipase C
PRR
Pattern recognition receptor
ROI
Reactive oxygen intermediates
ROS
Reactive oxygen species
SAPK
Stress-activated protein kinase
SH2
Src-homology 2
TEMED
Tetraetylmethylendiamine
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF
Tumor necrosis factor
TREM
Triggering receptor expressed on myeloid cells
Tris
Tris(hydroxymethyl)-methylamine
vWF
von Willebrandt Faktor
84
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