Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1 Ratte

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Hannover 2015
Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1
Dissertation
ISBN 978-3-86345-299-5
Katharina Schulz
Ratte
- Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell -
Katharina Schulz
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH
35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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em1Ztm
- Hannover 2015 -
Medizinische Hochschule
Hannover
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1. Auflage 2015
© 2015 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-299-5
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte
- Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell -
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Katharina Schulz
Neustadt am Rübenberge
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. André Bleich, PhD
Institut für Versuchstierkunde und Zentrales
Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover
1. Gutachter:
Univ.-Prof. André Bleich, PhD
2. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2015
Diese Arbeit wurde durch das Exzellenzcluster REBIRTH gefördert.
Für Biene
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................. V
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................. IX
Tabellenverzeichnis .................................................................................................................XII
1 Einleitung ................................................................................................................................ 1
1.1 Hintergrund ....................................................................................................................... 1
1.2 Ziele der Arbeit ................................................................................................................. 2
2 Theoretische Grundlagen ........................................................................................................ 3
2.1 Immunsystem.................................................................................................................... 3
2.1.1 B- und T-Zellreifung .................................................................................................. 5
2.1.2 Rag1 und V(D)J-Rekombination ............................................................................... 8
2.2 Primäre Immundefizienzerkrankungen .......................................................................... 10
2.2.1 Schwere kombinierte Immundefizienzerkrankungen .............................................. 10
2.2.2 Omenn Syndrom ...................................................................................................... 13
2.3 Immundefiziente Tiermodelle ........................................................................................ 15
2.3.1 Rag1 und Rag2 defiziente Mäuse ............................................................................ 15
2.3.2 Rag1 defiziente Ratten ............................................................................................. 17
3 Material und Methoden ......................................................................................................... 20
3.1 Versuchstiere .................................................................................................................. 20
3.1.1 Haltung ..................................................................................................................... 21
3.1.2 Gesundheitsüberwachung ........................................................................................ 21
3.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien ............................................................ 22
3.3 Anfertigung histologischer Präparate ............................................................................. 22
3.3.1 Histologische Auswertung ....................................................................................... 23
3.3.1.1 Immunsystem .................................................................................................... 23
3.3.1.2 Gastrointestinaltrakt .......................................................................................... 23
3.3.1.3 Leber.................................................................................................................. 24
3.3.1.4 Herz ................................................................................................................... 25
3.3.1.5 Haut ................................................................................................................... 25
I
Inhaltsverzeichnis
3.3.1.6 Speicheldrüsen .................................................................................................. 25
3.3.1.7 Lunge ................................................................................................................. 25
3.4 Bestimmung der Leukozytenzahlen in verschiedenen Lymphknoten und der Milz ...... 26
3.4.1 Lebend-Tot-Färbung der Lymphozyten ................................................................... 26
3.5 Erfassung physiologischer Parameter ............................................................................. 26
3.6 Erfassung pathologischer Symptome ............................................................................. 27
3.7 Gemischte Leukozytenkultur .......................................................................................... 28
3.8 Fluoreszenzbasierte durchflusszytometrische Analysen ................................................ 30
3.8.1 Blut ........................................................................................................................... 31
3.8.2 Milz und Lymphknoten............................................................................................ 32
3.8.3 Thymus .................................................................................................................... 33
3.8.4 Intrazelluläre Färbung .............................................................................................. 33
3.8.5 Auswertung der FACS-Daten mit CellQuest Pro® .................................................. 33
3.9 Aufarbeitung der Blutproben .......................................................................................... 34
3.9.1 EDTA-Vollblut ........................................................................................................ 35
3.9.2 Blutserum ................................................................................................................. 35
3.9.2.1 Serumchemie ..................................................................................................... 35
3.9.2.2 Multiplex Assay ................................................................................................ 36
3.9.2.3 ELISA................................................................................................................ 36
3.10 Statistische Auswertungen ............................................................................................ 37
4 Ergebnisse ............................................................................................................................. 38
4.1 Klinische Befunde .......................................................................................................... 38
4.1.1 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome der LEW-Rag1 Ratte ................ 38
4.1.1.1 Wachstum .......................................................................................................... 42
4.1.1.2 Reproduktionsparameter ................................................................................... 42
4.1.2 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome an den Organen ......................... 44
4.2 Histologische Befunde .................................................................................................... 45
4.2.1 Histologische Befunde an den Organen des Immunsystems ................................... 46
4.2.2 Histologische Befunde am Gastrointestinaltrakt ..................................................... 51
4.2.3 Histologische Befunde an der Leber ........................................................................ 54
4.2.4 Histologische Befunde am Herzen........................................................................... 54
II
Inhaltsverzeichnis
4.2.5 Histologische Befunde an der Haut ......................................................................... 54
4.2.6 Histologische Befunde an den Speicheldrüsen ........................................................ 58
4.2.7 Histologische Befunde an der Lunge ....................................................................... 59
4.2.8 Histologische Befunde an den heterozygoten Merkmalsträgern ............................. 60
4.2.9 Gesamtergebnis der histologischen Auswertung ..................................................... 62
4.3 Blut- und Serumanalysen................................................................................................ 64
4.3.1 Kleines und Großes Blutbild .................................................................................... 64
4.3.2 Chemische Parameter im Blut ................................................................................. 68
4.3.3 IgE und IgG im Serum ............................................................................................. 68
4.3.4 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren im Serum ...................................... 69
4.4 In vitro Proliferation der T-Lymphozyten nach Antigenstimulation.............................. 70
4.4.1 Verhalten der Lymphozyten in Kultur ..................................................................... 72
4.4.2 Absolute Zellzahlen in den Lymphknoten und der Milz ......................................... 73
4.5 Zusammensetzung der Lymphozytenpopulation ............................................................ 75
4.5.1 Lymphozytenpopulation im Blut ............................................................................. 75
4.5.2 Lymphozytenpopulation in den lymphatischen Organen ........................................ 81
4.5.3 T-Zellrezeptorrepertoire ........................................................................................... 92
4.6 Analyse antibiotisch vorbehandelter Rag1 defizienter Ratten ....................................... 93
5 Diskussion ............................................................................................................................. 96
5.1 Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungen ...... 97
5.1.1 Physiologische Parameter und Organmorphologie .................................................. 97
5.1.2 Unterschiede in der Leukozytenpopulation und damit zusammenhängende Effekte
......................................................................................................................................... 103
5.1.3 Unterschiede der homozygoten und heterozygoten Träger des Gendefektes ........ 110
5.2 Vergleich der LEW-Rag1 Ratte mit anderen Maus- und Rattenmodellen ................... 111
5.3 Übertragbarkeit des LEW-Rag1 Phänotyps auf das Omenn Syndrom......................... 115
5.4 Ausblick ........................................................................................................................ 117
6 Zusammenfassung ............................................................................................................... 119
7 Summary ............................................................................................................................. 121
8 Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 123
9 Anhang ................................................................................................................................ 133
III
Inhaltsverzeichnis
9.1 Material und Methoden ................................................................................................ 133
9.1.1 Geräte ..................................................................................................................... 133
9.1.2 Reagenzien ............................................................................................................. 134
9.1.3 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................... 135
9.1.4 Verwendete Kits..................................................................................................... 135
9.1.5 Computerprogramme ............................................................................................. 136
9.1.6 Protokolle der histologischen Arbeiten .................................................................. 136
9.1.7 Antikörper .............................................................................................................. 138
9.1.8 Lösungen und Reagenzien für ELISA ................................................................... 140
9.1.9 Befundbogen des Tierpflegepersonals ................................................................... 141
9.2 Ergebnisse ..................................................................................................................... 142
9.2.1 Reproduktionsparameter ........................................................................................ 142
9.2.2 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren ..................................................... 144
Danksagung ............................................................................................................................ 146
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
%
Prozent
°C
Grad Celsius
µCi
Mikrocurie
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
Abb.
Abbildung
AIRE
Autoimmun-Regulator Protein
ALT
Alanin-Aminotransferase
ANOVA
analysis of variance
Aqua dest.
destilliertes Wasser
AST
Aspartat-Aminotransferase
bcl-2
B-cell lymphoma 2
bp
Basenpaare
BSA
bovines Serumalbumin
ca.
circa
CD
Cluster of differentiation
CI
Colony Index
cm
Centimeter
CO2
Kohlenstoffdioxid
ConA
Concanavalin A
cpm
counts per minute
DN
doppelt negativ
DNA
deoxyribonucleic acid
DP
doppelt positiv
DSB
Doppelstrangbruch
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EPO
Erythropoetin
FACS
Fluorescence-Activated-Cell-Sorter
V
Abkürzungsverzeichnis
FCS
fetales Kälberserum
FELASA
Federation of European Laboratory Animal Science
Associations
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
Foxp3
Forkhead-Box-Protein P3
FSC
Forward Scatter
g
Gramm
G-CSF
Granulocyte-Colony Stimulating Factor
GM-CSF
Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor
GRO/KC
Growth-related Oncogene
Gy
Gray
H2SO4
Schwefelsäure
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
ILC
innate lymphoid cell
Kap.
Kapitel
KO
Knockout
l
Liter
Ln./Lnn.
Lymphonodus/Lymphonodi
M
molar
Max.
Maximum
MCP-1α
Monocyte Chemotactic Protein-1 Alpha
M-CSF
Macrophage colony-stimulating Factor
mg
Milligramm
MHC
major histocompatibility complex
MHH
Medizinische Hochschule Hannover
min
Minute(n)
Min.
Minimum
MIP-3α
Macrophage Inflammatory Protein-3 Alpha
ml
Milliliter
VI
Abkürzungsverzeichnis
MLC
Mixed Leucocyte Culture
mM
millimolar
NaCl
Natriumchlorid
NKT-Zelle
natürliche Killer T-Zelle
NK-Zelle
natürliche Killerzelle
nm
Nanometer
ns
nicht signifikant
OS
Omenn Syndrom
PALS
periarterioläre lymphatische Scheide
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung
PCR
Polymerase chain reaction
PE
Phycoerythrin
pH
negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PID
primäre Immundefizienz
RAG
humanes Recombination activating gene
Rag
murines Recombination activating gene
RAG
Protein, welches durch das murine Rag oder das humane RAG
codiert wird
RANTES
Chemokin mit folgenden Eigenschaften: regulated on
activation, normal T cell expressed and secreted
RITA
Registry of Industrial Toxicology Animal-data
rpm
revolutions per minute
RSS
Recombination Signal Sequence
RT
Raumtemperatur
SA-PE
Streptavidin- Phycoerythrin
SCID
Severe Combined Immunodeficiency
SD
Sprague-Dawley
SPF
spezifisch pathogenfrei
SSC
Side Scatter
Tab.
Tabelle
TCR
T-Zell-Rezeptor
VII
Abkürzungsverzeichnis
TNF-α
Tumornekrosefaktor Alpha
Treg
Regulatorische T-Zelle
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
WT
Wildtyp
xg
mal der Erdbeschleunigung
ZFN
Zink-finger Nuklease
ZTL
Zentrales Tierlaboratorium
VIII
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: T-Zellreifung im Thymus..................................................................................... 7
Abbildung 2: Schematische Darstellung der RAG Proteine in voller Länge ............................. 8
Abbildung 3: Strukturen unreifer und reifer B- und T-Zell-Antigenrezeptoren ........................ 9
Abbildung 4: Pipettierschema MLC ........................................................................................ 29
Abbildung 5: Lymphozytengate ............................................................................................... 33
Abbildung 6: Gatingstrategie der durchgeführten FACS Färbungen ....................................... 34
Abbildung 7: Klinisches Bild der LEW-Rag1 Ratte ................................................................ 38
Abbildung 8: Prävalenz der Erkrankungen der LEW-Rag1 Tiere ........................................... 39
Abbildung 9: Inzidenz der klinischen Symptome bei den LEW-Rag1 Ratten ........................ 40
Abbildung 10: Gewichtsverläufe ............................................................................................. 42
Abbildung 11: Colony Index .................................................................................................... 43
Abbildung 12: Gewichte der Lebern und Milzen der LEW und LEW-Rag1 Ratten in Relation
zu deren Körpergewicht ........................................................................................................... 45
Abbildung 13: Entzündungszellinfiltrationen der Milzen von LEW und LEW-Rag1 Ratten . 47
Abbildung 14: Pathohistologische Veränderungen der Organe des Immunsystems ............... 49
Abbildung 15: Histologischer Vergleich der Lymphknotenmorphologie von LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 50
Abbildung 16: Vergleich der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt von LEW
und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 51
Abbildung 17: Pathohistologische Befunde am Magen-Darm-Trakt der LEW-Rag1 Ratten . 52
Abbildung 18: Haltungsabhängigkeit der Entzündungszellinfiltrationen im
Gastrointestinaltrakt der LEW-Rag1 Ratten ............................................................................ 53
Abbildung 19: Pathohistologische Veränderungen der Leber und des Herzens der LEW-Rag1
Ratten ....................................................................................................................................... 55
Abbildung 20: Einfluss des Gesundheitszustands und der Haltungseinheit auf den
histologischen Score der Haut bei LEW-Rag1 Ratten im Vergleich zu LEW Kontrolltieren . 56
Abbildung 21: Pathohistologische Veränderungen der Speicheldrüsen und der Haut ............ 57
Abbildung 22: Histologische Unterschiede der Speicheldrüsen von LEW-Rag1 Ratten
verschiedener Haltungen .......................................................................................................... 59
IX
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 23: Vergleich der Lungen gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten in
verschiedenen Haltungseinheiten ............................................................................................. 60
Abbildung 24: Histologische Präparate der Lungen von LEW und LEW-Rag1 Ratten .......... 61
Abbildung 25: Vergleich der histologischen Scores gesunder und erkrankter LEW-Rag1
Ratten mit LEW und LEW-Rag1 +/- Ratten ............................................................................ 63
Abbildung 26: Vergleich der histologischen Scores erkrankter und gesunder LEW-Rag1
Ratten in verschiedenen Haltungseinheiten ............................................................................. 63
Abbildung 27: Subjektive Krankheitsstärke ............................................................................ 64
Abbildung 28: Vergleich der Anzahl der Leukozyten im Blut von LEW und LEW-Rag1
Ratten ....................................................................................................................................... 66
Abbildung 29: Zusammensetzung der Leukozyten bei LEW und bei gesunden und kranken
LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................... 67
Abbildung 30: Verhältnisse von Lymphozyten zu neutrophilen Granulozyten ....................... 68
Abbildung 31: Vergleich der Immunglobulinkonzentrationen im Serum von LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 69
Abbildung 32: Ausgewählte Zytokine im Vergleich ............................................................... 70
Abbildung 33: Proliferationsstärke in counts per minute (cpm) der Lymphozyten von LEW
und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 72
Abbildung 34: Ergebnisse der Trypan-Blau-Färbung der LEW und LEW-Rag1
Lymphknotenzellen .................................................................................................................. 73
Abbildung 35: Gesamtleukozytenzahlen der Milzen und Lymphknoten von LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 74
Abbildung 36: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten ......... 75
Abbildung 37: Vergleich der Anteile reifer T-Lymphozyten im Blut bei gesunden und
kranken LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinheiten ................................................. 76
Abbildung 38: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut gesunder und erkrankter LEW-Rag1
Ratten ....................................................................................................................................... 77
Abbildung 39: Vergleich der Anteile αβTCR tragender T-Zellen zwischen LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 78
Abbildung 40: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen im Blut von LEW und
LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................... 79
X
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 41: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten
.................................................................................................................................................. 80
Abbildung 42: Vergleich der Anzahlen nachweisbarer NKT- und NK-Zellen im
Lymphozytengate von LEW und LEW-Rag1 Ratten .............................................................. 81
Abbildung 43: Vorkommen reifer T-Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 82
Abbildung 44: Vorkommen der CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in der Milz von LEW
und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 83
Abbildung 45: Vorkommen der CD4+CD8+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1
Ratten ....................................................................................................................................... 84
Abbildung 46: Vorkommen der reifen Lymphozyten in den peripheren Lymphknoten von
LEW und LEW-Rag1 Tieren ................................................................................................... 85
Abbildung 47: Verhältnis der verschiedenen reifen T-Lymphozyten im Lymphknoten
zueinander ................................................................................................................................ 86
Abbildung 48: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in den peripheren
Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren ..................................................................... 87
Abbildung 49: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW
und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 88
Abbildung 50: Vorkommen von NK-Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und
LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................... 89
Abbildung 51: Ergebnisse der FACS Analysen der LEW-Rag1 Thymi .................................. 90
Abbildung 52: FACS Daten des Blutes der heterozygoten LEW-Rag1 Ratten ....................... 92
Abbildung 53: Prozentuale Anteile der verschiedenen Vα- und Vβ-Rezeptortypen ............... 93
Abbildung 54: Unterschiede in der Zytokin- Chemokin und Wachstumsfaktorkonzentration
im Serum zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten und LEW-Rag1 Ratten verschiedener
Haltungen ............................................................................................................................... 144
Abbildung 55: Unterschiede der Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen
im Serum zwischen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten ........................................ 145
XI
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Klassifizierung verschiedener SCID Formen.......................................................... 12
Tabelle 2: Klassisches und atypisches Omenn Syndrom ......................................................... 14
Tabelle 3: Verwendete Tierstämme ......................................................................................... 20
Tabelle 4: Klinischer Score der histologisch ausgewerteten Tiere .......................................... 27
Tabelle 5: Zellkulturmedium für MLC .................................................................................... 29
Tabelle 6: FACS Puffer ............................................................................................................ 32
Tabelle 7: Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse) ....................................................................... 32
Tabelle 8: Pappenheim Färbung ............................................................................................... 35
Tabelle 9: Zusammenfassung aller beobachteten Symptome .................................................. 41
Tabelle 10: Gruppenzusammensetzung für die histologischen Untersuchungen ..................... 46
Tabelle 11: Histologische Scores der mit Cotrim K behandelten Tiere ................................... 94
Tabelle 12: FACS Ergebnisse der mit Cotrim K behandelten Tiere ........................................ 94
Tabelle 13: Protokoll für die Entwässerung ........................................................................... 136
Tabelle 14: Protokoll der H&E Färbung ................................................................................ 137
Tabelle 15: Antikörper für allgemeine Analysen ................................................................... 138
Tabelle 16: Antikörper für die Analyse des αβTCR Repertoires ........................................... 139
Tabelle 17: Bicarbonat/Carbonat Coating Puffer (100mM) .................................................. 140
Tabelle 18: ELISA Waschlösung ........................................................................................... 140
Tabelle 19: ELISA Blockinglösung ....................................................................................... 140
Tabelle 20: ELISA Proben-/ Konjugatverdünnung ................................................................ 140
Tabelle 21: Reproduktionsparameter der LEW und LEW-Rag1 Ratten................................ 142
XII
1 Einleitung
1 Einleitung
1.1 Hintergrund
Das Recombination Activating Gene 1 (Rag1) ist für die B- und T-Zellreifung unerlässlich.
Sein gleichnamiges Protein wird vorwiegend in B- und T-Zellvorläufern exprimiert und
katalysiert zusammen mit dem RAG2 einen wichtigen Teil des Reifungsprozesses dieser
Zellen (Tonegawa 1983). Durch die Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen kann es zur
Rekombination der T-Zellrezeptoren und der Immunglobulinmoleküle kommen, was zu einer
großen Variabilität führt, wodurch eine breit gefächerte Reaktion des adaptiven
Immunsystems auf Antigene möglich wird (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994,
McBlane et al. 1995). 2012 wurde am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen
Hochschule Hannover mittels zinc-finger Nucleasen (ZFN) ein Rag1 defizienter Rattenstamm
generiert. Die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm entstand mit dem Ziel, ein effizientes immundefizientes
Rattenmodell für die Transplantationsforschung zu entwickeln. Außerdem wurde ihm die
Verwendbarkeit in Wiederherstellungsexperimenten des Immunsystems zugeschrieben
(Zschemisch et al. 2012). Näher betrachtet, ähnelt der beobachtete Phänotyp der LEW/ZtmRag1em1Ztm einer humanen Immundefizienzerkrankung, dem sogenannten Omenn Syndrom.
Hierbei handelt es sich um eine schwere Immundefizienzerkrankung, die in 90 % aller Fälle
durch Mutationen des RAG1 oder RAG2 bedingt ist und mit schweren Infektionen des
Atmungs- und Gastrointestinaltraktes einhergeht (Corneo et al. 2001, Niehues, Perez-Becker
& Schuetz 2010). Des Weiteren werden bei Patienten mit dem Omenn Syndrom variable
Anzahlen zirkulierender T-Lymphozyten mit eingeschränktem T-Zellrezeptor Repertoire und
ein nahezu vollständiges Fehlen von B-Lymphozyten nachgewiesen. Dazu kommen eine
schwere Erythrodermie mit Alopezie, vergrößerte lymphatische Gewebe, Thymusdysplasie
und eine Eosinophilie im Blut und Gewebe (Hönig, Schwarz 2006, Kato et al. 2006, Villa et
al. 2008). Kinder mit diesem Gendefekt fallen schon früh im Leben, im Alter von wenigen
Monaten,
mit
diesen
Symptomen
auf.
Die
einzigen
heutzutage
angewendeten
Therapiemaßnahmen bilden eine Knochenmarktransplantation oder die Transplantation von
Stammzellen aus Nabelschnurblut. Trotzdem liegt die Mortalität der betroffenen Kinder noch
immer bei 46 % (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006).
1
1 Einleitung
1.2 Ziele der Arbeit
Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte phänotypisch zu
charakterisieren. Dabei werden nicht nur die Unterschiede dieses Rattenstammes zu seinem
Ursprung, der LEW Ratte, untersucht, sondern es erfolgt auch eine differenzierte Betrachtung
symptomloser und erkrankter Rag1 defizienter Tiere untereinander. Ein weiterer Fokus liegt
auf der Fragestellung, ob die Haltungshygiene einen Einfluss auf den Phänotyp hat. Zur
Klärung dieser Fragestellungen werden sowohl das ganze Tier umfassende Methoden
angewendet, als auch zahlreiche Untersuchungen auf zellulärer Ebene durchgeführt.
Letztendlich wird ein besonderes Augenmerk auf seine Vergleichbarkeit mit dem humanen
Omenn Syndrom und anderen murinen Rag1 und Rag2 defizienten Tieren gelegt.
2
2 Theoretische Grundlagen
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Immunsystem
Das Immunsystem ist ein interaktives Netzwerk aus Zellen und Molekülen, die spezialisierte
Aufgaben in der Infektionsabwehr übernehmen. Dafür setzt es zwei völlig unterschiedliche
Mechanismen ein, um den Körper gegen Antigene zu schützen. Dies sind zum einen die
angeborenen und zum anderen die erworbenen (adaptiven) Immunantworten. Die
angeborenen Mechanismen sorgen mit phagozytierenden Zellen (neutrophile Granulozyten,
Monozyten, Makrophagen), Zellen, welche inflammatorische Mediatoren freisetzen
(basophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Mastzellen), natürlichen Killerzellen
(NK-Zellen) und weiteren innate lymphoid cells (ILC) für einen sofortigen Schutz. Auch
Komplement, Zytokine und Akute-Phase-Proteine spielen hier eine große Rolle. Die adaptive
Immunität setzt sich aus Antigen-spezifischen Reaktionen der B- und T-Lymphozyten
zusammen. Während die angeborenen Immunmechanismen zwar schnell greifen aber wenig
spezifisch sind, arbeitet das adaptive Immunsystem deutlich präziser, benötigt allerdings
mehrere Tage oder Wochen um seine komplette Wirkung zu entwickeln (Abbas et al. 2015,
Delves, Roitt 2000b, Parkin, Cohen 2001).
Alle immunologischen Vorgänge des angeborenen Immunsystems laufen immer in gleicher
Weise ab, ohne bei wiederholtem Kontakt mit demselben Antigen eine Anpassungsreaktion
auszubilden. Einen zentralen Baustein dieses Anteils bilden die neutrophilen Granulozyten.
Nach Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren sie als mobile Zellen frei in der Blutbahn
des Körpers. Erst mit Hilfe proinflammatorischer Mediatoren, Adhäsionsmolekülen und
Chemokinen gelangen diese Zellen in infiziertes Gewebe, um dort Erreger durch Phagozytose
und anschließende Lyse zu zerstören (Witko-Sarsat et al. 2000). Letztendlich nutzen alle
Leukozyten den oben beschriebenen Mechanismus um zum Infektionsherd zu gelangen
(Marchesi, Gowans 1964, von Andrian, Mackay 2000). Darüber hinaus exprimieren sowohl
Makrophagen als auch neutrophile Granulozyten Rezeptoren für Antikörper und
Komplementfaktoren. Dadurch wird die Phagozytose antiköper- oder komplementmarkierter
Mikroorganismen zusätzlich forciert (Aderem, Underhill 1999). Die vorwiegende Aufgabe
eosinophiler Granulozyten besteht im Schutz des Organismus vor parasitären Infektionen und
3
2 Theoretische Grundlagen
auch im Verlauf von Allergien wird ihnen eine Funktion zugeschrieben. Im Gegensatz zu
neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sind eosinophile Granulozyten nicht in der
Lage, Erreger zu phagozytieren. Anstatt dessen sezernieren sie zytotoxisch wirkende
Substanzen in den Extrazellularraum und setzen zusätzlich Leukotriene, Prostaglandine und
zahlreiche Zytokine frei (Wardlaw, Moqbel & Kay 1995). Basophile Granulozyten und
Mastzellen weisen ähnliche funktionelle Charakteristika auf (Abraham, Arock 1998).
Während basophile Granulozyten im Blut zu finden sind, kommen Mastzellen vor allem im
Bindegewebe und in Schleimhäuten vor. Beide Zelltypen besitzen hoch-affine IgE
Rezeptoren (FcεR) (Kinet 1999). Binden Antikörper-markierte Antigene daran, werden
Entzündungsmediatoren von der Zelle freigesetzt. Eine große Rolle spielen diese beiden
Zelltypen auch in der Entstehung von Allergien, wie zum Beispiel Ekzemen, Heuschnupfen
und Asthma (Cruse, Bradding 2015, Knol et al. 1996). NK-Zellen und weitere ILCs ähneln
morphologisch den Lymphozyten, besitzen allerdings keinen spezifischen Antigenrezeptor.
Ihre Aufgabe ist es, infizierte oder maligne entartete Zellen zu zerstören und spezifische
Zytokine zu produzieren (Biron et al. 1999, Walker, Barlow & McKenzie 2013). Neben den
zellulären Bestandteilen des angeborenen Immunsystems kommen auch zahlreiche lösliche
Faktoren vor. Dazu zählt zum einen das Komplementsystem, welches unter anderem zur Lyse
von Mikroorganismen beiträgt, Antigene für Phagozyten markiert und so die Phagozytose
erleichtert (Reid, Porter 1981). Zum anderen assistieren Akute-Phase-Proteine und Zytokine
bei der Immunantwort. Während die Akute-Phase-Proteine proinflammatorisch wirken und
dadurch die Resistenz des Organismus verstärken und die Reparatur von geschädigtem
Gewebe vorantreiben (Cid et al. 1993, Gabay, Kushner 1999), agieren Zytokine als Vermittler
innerhalb des Immunsystems und zwischen dem Immunsystem und anderen Organsystemen
des Körpers (Thorpe et al. 1992).
Antigen-spezifische Rezeptoren auf B- und T-Lymphozyten bilden das Charakteristikum der
adaptiven Immunität. Obwohl sehr ähnliche Gensegmente für die Entstehung der
verschiedenen Rezeptoren zuständig sind, unterscheiden sich diese beiden Zelltypen in ihrer
Spezifität grundlegend. B-Zellen exprimieren Serumimmunglobulin Moleküle auf der
Außenseite ihrer Zellmembran, welche lösliche Antigene direkt binden. Im Gegensatz dazu
nutzen T-Zellen ein Heterodimer, das bestimmte Kombinationen von Antigenproteinen mit
„major histokompatibility complexen“ (MHC Klasse I, MHC Klasse II) auf der Oberfläche
4
2 Theoretische Grundlagen
anderer Zellen erkennt (Germain 1986). Damit es zu einer spezifischen Immunantwort
kommen kann, muss das Antigen den antigenspezifischen B- und T-Zellen präsentiert und
von ihnen erkannt werden. Das führt dann zur Zellvorbereitung, -aktivierung und differenzierung in den lymphatischen Organen, worauf hin eine spezifische Immunantwort
erfolgt. Hierbei verlassen aktivierte T-Lymphozyten das lymphatische Gewebe und gelangen
durch homing zum Infektionsherd, aktivierte B-Lymphozyten (Plasmazellen) setzen
Antikörper in Blut und Gewebsflüssigkeit frei (Parkin, Cohen 2001). Die Antigene werden
mit der Lymphe oder gebunden (endozytiert) an Antigen-präsentierende Zellen (dendritische
Zellen, B-Zellen), in lymphatisches Gewebe transportiert. Endogen produziertes (z.B. virales)
Antigen wird als Komplex mit MHC I Molekülen exprimiert, exogene und daraufhin
phagozytierte Antigene dagegen als Komplex mit MHC Klasse II (Germain 1986, Morrison et
al. 1986). Eben beschriebene Komplexe sind nötig, um eine spezifische Immunantwort
auszulösen. Diese äußert sich in direkter Zytotoxizität, der Generierung spezifischer
Antikörper oder in der Produktion und Freisetzung von Zytokinen, die weitere Zellen
aktivieren (Parkin, Cohen 2001).
Diese Tatsachen machen klar, dass das Immunsystem ein hoch komplexes Gebilde ist,
welches sich ständig moduliert und auch mit anderen Organsystemen des Körpers eng
verflochten ist (Ottaway, Husband 1994). Allein die Dysfunktion eines kleinen Anteils kann
schwerwiegende Folgen für den Organismus haben. Zudem bietet es jedoch auch viele
Ansatzmöglichkeiten
für
verschiedene
Therapieformen
wie
zum
Beispiel
Stammzelltransplantationen, Vakzinationen oder die Immunmodulation mittels Zytokinen
oder deren Antagonisten (Ibrahim, Gotch 2000, Parkin, Cohen 2001).
2.1.1 B- und T-Zellreifung
Da die Kenntnis des spezifischen Reifungsprozesses der Zellen des adaptiven Immunsystems
(B- und T-Lymphozyten) essentiell für das Verständnis dieser Arbeit ist, wird dieser Vorgang
in diesem Kapitel genauer beschrieben. Beide Zelltypen durchlaufen während ihres
Reifungsprozesses eine Umordnung der zuständigen Antigenrezeptorgene (Schatz, Oettinger
& Schlissel 1992) (Kap. 2.1.2). Sowohl die Vorläuferzellen der B-Lymphozyten als auch die
Vorläuferzellen der T-Lymphozyten befinden sich im Knochenmark. Während die B-
5
2 Theoretische Grundlagen
Zellreifung komplett im Knochenmark abläuft, findet der größte Teil der T-Zellreifung nach
der Migration dieser Zellen in den Thymus statt (Parkin, Cohen 2001).
Nach Abschluss der oben angesprochenen Genrekombination gelangen antigenspezifische,
naive B-Zellen ins Blut und besiedeln von dort aus die sekundären lymphatischen Organe.
Während einer Immunantwort entstehen dort Keimzentren („germinal centers“), die ein gutes
Umfeld für die Interaktion zwischen Antigen-präsentierenden und antigenspezifischen Zellen
bilden (Tarlinton 1998). Hier kommt es als Erstes zur Antigen stimulierten Proliferation der
naiven B-Zellen, verbunden mit dem Vorgang der somatischen Hypermutation, auch
„receptor editing“ genannt. Dabei findet ein erneuter Genumbau der variablen
Antikörperregionen statt, um Autoreaktivität zu vermeiden und die Rezeptorspezifität zu
erhöhen. In dieser Phase tragen die naiven B-Zellen ihre Antikörper als B-Zellrezeptoren auf
der Zelloberfläche (Radic, Zouali 1996). Im nächsten Schritt erfolgt die positive Selektion
hochaffiner, antigenspezifischer B-Lymphozyten. Allein die Zellen, die in der Lage sind, mit
Antigen-Antikörperkomplexen auf follikulären dendritischen Zellen zu interagieren, werden
von der Apoptose ausgeschlossen. Diese positiv selektierten Zellen proliferieren und
generieren so eine große Masse an hochspezifischen B-Lymphozyten (klonale Proliferation).
Diese erzeugen antigenspezifische Antiköper, welche im Falle einer Aktivierung in die
Peripherie entlassen werden und dort entweder direkt oder indirekt zur spezifischen
Immunantwort beitragen (Delves, Roitt 2000a).
Im Thymus findet der dominierende Anteil der T-Zellreifung statt (Abb. 1). Anders als
Antikörper sind T-Zellrezeptoren (TCRs) ausschließlich als transmembrane Moleküle
vorhanden (Delves, Roitt 2000b). Nach ihrer Ankunft im Thymus verlieren die lymphoiden
Vorläuferzellen ihr Potential, sich zu B-Lymphozyten oder NK-Zellen entwickeln zu können.
Dadurch erreichen sie das Stadium eines doppelt negativen (DN; CD4-CD8-) T-Zellvorläufers
(Michie
et
al.
2000,
Germain
2002).
Das
bedeutet,
sie
besitzen
weder
die
Oberflächenmoleküle CD4 und CD8 noch einen TCR. Im Rahmen der Entwicklungsstufen
einer DN Zelle ist entweder eine Entwicklung zu einer αβ- oder einer γδTCR exprimierenden
T-Zelle möglich (Delves, Roitt 2000b).
6
2 Theoretische Grundlagen
Noch im Laufe ihres DN Stadiums
entwickeln
die
Zwischenstufen,
Umstellung
Rezeptorgene
Thymozyten
über
in
eine
und
denen
Neuordnung
vonstattengeht,
der
einen
ausgereiften TCR auf ihrer Oberfläche
(Germain 2002). Dieser ist stets mit
einem
weiteren
Proteinkomplex
assoziiert, dem CD3/ζ-Komplex (van
Oers, von Boehmer & Weiss 1995).
Zusätzlich beginnen die DN Zellen CoRezeptorproteine (CD4 und CD8) zu
exprimieren. Das lässt sie in den doppelt
positiven
(DP;
Entwicklungsabschnitt
CD4+CD8+)
übertreten
(Germain 2002). Nun geben alle DP
Abbildung 1: T-Zellreifung im Thymus
Aus DN Thymozyten entstehen in der Thymusrinde TCR
tragende DP Thymozyten. Im Laufe der Entwicklung kommt
es zur Retention von entweder CD4 oder CD8 und Zellen,
die mit körpereigenem MHC interagieren können,
durchlaufen den weiteren Reifungsprozess (Positive
Selektion). Lymphozyten, deren TCR gegen körpereigene
Antigene gerichtet ist, werden durch negative Selektion
aussortiert. So können nur selbsttolerante, funktionsfähige
T-Zellen den Thymus verlassen.
Modifiziert nach Parkin, Cohen (2001)
Thymozyten, die körpereigene MHC
Moleküle erkennen, entweder ihren
CD4- oder ihren CD8-Proteinkomplex
ab und vermehren sich durch Teilung
(positive Selektion) (Jameson, Hogquist
& Bevan 1995, Teh et al. 1988). In
einem zweiten Schritt werden die
Zellen,
die
gegen
körpereigene
Antigene gerichtet sind, durch Apoptose am Fortbestehen gehindert (negative Selektion)
(Germain 2002). Dadurch entsteht eine Population einfach positiver (CD3+CD4+ oder
CD3+CD8+), selbsttoleranter T-Lymphozyten, die körperfremde Antigene, in Kombination
mit MHC Molekülen, erkennen können. Diese naiven T-Zellen werden in die Peripherie
entlassen. Dort zirkulieren sie im Blut oder der Lymphe und sind in großer Anzahl in den
sekundären lymphatischen Organen auffindbar. Treffen sie auf eine antigenpräsentierende
7
2 Theoretische Grundlagen
Zelle mit passendem Antigen, dann differenzieren sie sich innerhalb der nächsten 2-3 Tage zu
aktivierten T-Lymphozyten (Parkin, Cohen 2001).
2.1.2 Rag1 und V(D)J-Rekombination
Das Immunsystem kann eine riesige Bandbreite an Antigenen erkennen und darauf reagieren.
Diese extreme Vielschichtigkeit entsteht durch das große Repertoire des Körpers an
spezifischen Antigenrezeptoren und Immunglobulinmolekülen (Fugmann et al. 2000, Gellert
2002, Lewis 1994). Hierfür sind die von den „Recombination Activating Genes“ produzierten
Proteine, RAG1 und RAG2, unerlässlich. Sie sind überwiegend in T- und B-Zellvorläufern
exprimiert und katalysieren einen wichtigen Teil ihres Reifungsprozesses, die V(D)JRekombination (Tonegawa 1983). Beide Proteine interagieren miteinander (Ji et al. 2010). In
einer Studie konnte Rag1 Transkript auch im zentralen Nervensystem von Mäusen
nachgewiesen werden (Chun et al. 1991).
Die Struktur des Rag Lokus ist in den
meisten
Wirbeltiergenomen
gleich.
Innerhalb dieses Lokus liegen die Gene, die
RAG1 und RAG2 kodieren, sehr nah
beieinander,
kompakte
zusammen
haben
eine
Organisation
und
transkribiert.
besonders
werden
Die
Proteinsequenzen der Wirbeltiere gleichen
sich zu 50-90 % (Gellert 2002). Beim
Menschen befindet sich RAG1 auf dem
Chromosom 11p13 (Sherrington et al.
1992), bei der Maus auf Chromosom 2qE2
und auf 3q31 bei der Ratte. Für das murine
RAG1 ergibt sich eine Größe von 1040 und
für das kürzere RAG2 eine Länge von 527
Abbildung 2: Schematische Darstellung der RAG
Proteine in voller Länge
NBR stellt die nonamer-binding region dar, welche
spezifisch an der Recombination Signal Sequence (RSS)
der DNA bindet. D600, D708 und E962 zeigen die
mutmaßlichen Areale der aktiven Rückstände.
Zusätzlich ist die zinc-binding dimerization domain
(ZDD), mit ihren Zink-bindungsmustern, RING finger
(RING) und zinc finger A (ZFA), sowie ein zinc finger
B (ZFB), eingezeichnet.
Modifiziert nach De, Rodgers (2004)
Aminosäuren. Da die RAG Proteine relativ groß sind, geht die Mehrheit aller Studien
lediglich auf Proteinfragmente ein, welche den sogenannten „Core-Regionen“ zuzuordnen
8
2 Theoretische Grundlagen
sind (Abb. 2). Diese Regionen, von RAG1 und RAG2 zusammen, reichen für die komplette
DNA Spaltungsaktivität in in vitro und in vivo Assays aus (Cuomo, Mundy & Oettinger 1996,
Sadofsky, Hesse & Gellert 1994, Silver et al. 1993). In der Abbildung sind die Proteine
schematisch als Balken dargestellt.
1989 wurde RAG1 von Schatz et al. das erste Mal isoliert und mit dem Mechanismus der
V(D)J-Rekombination in Verbindung gebracht (Schatz, Oettinger & Baltimore 1989). Sein
direkter Einfluss durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen wurde 1995 von McBlane et
al. nachgewiesen.
Bei V (variable), D (diversity) und J
(joining) handelt es sich um drei nicht
verbundene
codierende
Segmente
der
Antigenrezeptorgene. Diese werden während
des Vorgangs der sogenannten V(D)JRekombination
in
verschiedenster
Art
zusammengefügt. Das Zusammenfügen nach
der 12/23 Regel gewährleistet eine sehr
große Variabilität der neugenerierten Gene.
Damit bilden sie die Grundlage für eine
möglichst
breite
T-Zellrezeptor-
und
Immunglobulinvariabilität (Bassing, Swat &
Alt 2002, De, Rodgers 2004) (Abb. 3).
Abbildung 3: Strukturen unreifer und reifer B- und
T-Zell-Antigenrezeptoren
Modifiziert nach Delves, Roitt 2000
Dieser
Vorgang
findet
an
sieben
unterschiedlichen Lokalisationen statt: Der
schweren Immunglobulinkette und der leichten Kettenloci κ und λ in B-Lymphozyten
(Tonegawa 1983) und an den TCR α, β, γ, und δ Kettenloci der T-Lymphozyten (Davis,
Bjorkman 1988). Zusätzlich gliedert er sich in zwei Phasen. Als erstes bilden RAG1 und
RAG2 einen Multiproteinkomplex durch Interaktion mit einer eigenständigen Recombination
Signal Sequence (RSS), welche jedes V, D und J Segment flankiert. Anschließend
katalysieren die RAG Proteine einen DNA Doppelstrangbruch an jeder RSS (McBlane et al.
1995). Das führt zu einem Komplex mit vier DNA Enden (zwei 5‘ phosphorylierte
9
2 Theoretische Grundlagen
recombination signal Enden und zwei codierende Enden, die in DNA hairpinstructures
münden). In der zweiten Phase der V(D)J-Rekombination werden die getrennten DNA Enden
mittels „nonhomologous end-joining“ Reparatur wieder zusammengefügt. An den
kodierenden Enden geschieht dies sehr unpräzise, so dass dort eine große Variabilität entsteht
(Lieber et al. 2003) und später viele verschiedene Antigene vom Organismus erkannt werden
können.
Frame shift Mutationen in den „non-core regions“ der Rekombinations aktivierenden Gene
führen zu ineffizienter V(D)J-Rekombination und dadurch zu Immundefizienz (Noordzij et al.
2000,
Santagata
et
al.
2000).
Eine
mögliche
fehlende
oder
eingeschränkte
Rekombinationsaktivität kann mithilfe eines sogenannten „V(D)J recombination assays“
nachgewiesen werden (Schwarz et al. 1996, Villa et al. 1998). Hierbei werden
Fibroblastenkulturen mit Expressionsplasmiden transfiziert, welche Wildtyp- oder mutierte
RAG1/2 Proteine kodieren. (Zur genauen Durchführung des Assays siehe: Hesse et al. (1987),
Lieber et al. (1987) und Gauss et al. (1998).) (Hesse et al. 1987, Lieber et al. 1987, Gauss et
al. 1998)
2.2 Primäre Immundefizienzerkrankungen
Die primären Immundefizienzen (primary immunodeficiencies, PIDs) sind angeboren und
vererbbar und können sowohl den angeborenen als auch den erworbenen Teil des
Immunsystems beeinflussen. Ist letzterer betroffen, dann kommt es zu einem Mangel an
Antikörpern oder zu einer fehlerhaften Zusammenarbeit diverser Komponenten des
Immunsystems. Daraus differenzieren sich die schweren kombinierten Immundefizienzen
(severe combined immunodeficiencies, SCIDs) als eine Gruppe verschiedener angeborener
Erkrankungen, welche entweder die zelluläre oder die humorale Immunität betreffen, heraus
(Aloj et al. 2012, Fischer et al. 2005).
2.2.1 Schwere kombinierte Immundefizienzerkrankungen
Eine
(fast)
vollständige
Insuffizienz
der
körpereigenen
T-Zellen
bildet
das
Hauptcharakteristikum der schweren kombinierten Immundefizienzerkrankungen (SCID
Erkrankungen). Zusätzlich ist auch die Antikörperantwort des Organismus, entweder durch
10
2 Theoretische Grundlagen
direkte Schädigung des B-Zell-Zyklus oder sekundär, durch inadäquate B-Zell Aktivierung
der gestörten T-Helferzellpopulation, gestört (Aloj et al. 2012). Gegenwärtig erfolgt die
Klassifizierung der verschiedenen SCID Formen anhand des Auftretens oder Fehlens
bestimmter Immunzellen, speziell T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und NK-Zellen (Tab. 1).
In den letzten Jahren wurden zahlreiche ursächliche Gendefekte identifiziert und viele neue
Formen weisen zudem extrahämatopoetische Veränderungen auf, welche zu komplexen
Organveränderungen, auch außerhalb des Immunsystems, führen (Aloj et al. 2012).
In Tabelle 1 werden zahlreiche Gene aufgeführt, deren Dysfunktion zu SCID Erkrankungen
führen kann. Eines davon ist RAG1. Schwarz et al. identifizierten 1996 beim Menschen eine
Mutation in diesem Gen als Auslöser für eine klassische SCID Form, bei der weder T- noch
B-Lymphozyten nachgewiesen wurden (Schwarz et al. 1996). Handelt es sich bei der
Schädigung des Gens um eine hypomorphe Mutation, kommt es zu „atypischen“ SCID
Ausprägungen (de Villartay et al. 2005, Ehl et al. 2005, Schuetz et al. 2008). Dazu zählt unter
anderem das klassische Omenn Syndrom (Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010).
Die Prävalenz der SCIDs in der Bevölkerung liegt ungefähr bei 1:50.000, mit einem erhöhten
Anteil männlicher Individuen (Aloj et al. 2012). Betroffene dieser angeborenen Erkrankungen
leiden schon früh im Leben, innerhalb der ersten Lebensmonate, an schweren,
lebensbedrohlichen Infektionen bakteriellen, viralen oder mykotischen Ursprungs. Diese
äußern sich oft in einer interstitiellen Pneumonie, chronischer Diarrhö und einer mangelnden
Gewichtszunahme (Notarangelo et al. 2009). Zusätzlich können Betroffene einen
Hautausschlag entwickeln, welcher häufig entweder durch plazentar übergetretene maternale
T-Zellen ausgelöst wird, oder durch die Aktivierung autologer T-Zellen bedingt ist, die sich in
einer Autoreaktion gegen Hautkomponenten richten (Palmer et al. 2007).
Der spezielle Phänotyp des jeweiligen Erkrankten kann Hinweise auf die Lage des Defektes
geben und sollte zur Diagnosestellung herangezogen werden. Allerdings können SCID
Patienten bei unterschiedlicher Pathogenese und unterschiedlichen zugrunde liegenden
genetischen Mechanismen auch einen sehr ähnlichen Phänotyp ausprägen.
11
- +
-
Phänotyp
ZAP70 Defizienz
T-B-NK+
CORO 1A Defizienz
T-/lowB+NK+
Nude/SCID
Tabelle modifiziert nach Aloj et al. (2012).
T B NK
DOCK8 Defizienz
+
TlowB+NK+
MHC II Defizienz
- +
T B NK
MHC I Defizienz
FOXN1
DOCK8
CORO1A
12
HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ,
HLA-DM, HLA-DO
TAP1/TAP2, TAPASIN
T-B+NK+
Retikuläre Dysgenese
+
ZAP70
T-B-/+NK-
CERNUNNOS/XLF Defizienz
+ +
TlowBlowNK+ CERNUNNOS/XLF
AK 2
T B NK
ARTEMIS, KU70/80, DNA PKcs, LIG4
RAG1/RAG2
PNP
ARTEMIS, KU70/80, DNA PKcs, DNAligaseIV Defizienz
+
T-B-NK+
RAG1/RAG2 Defizienz
- -
T B NK
PNP Defizienz
-
ADA
T-B-NK-
ADA Defizienz
- +
IL-7Rα
T-B+NK+
JAK3, γ c
Gendefekt
IL-7Rα Defizienz
JAK3 Defizienz, γ-Kettendefizienz T B NK
SCID Form
Tabelle 1: Klassifizierung verschiedener SCID Formen
2 Theoretische Grundlagen
Gestörter "cross-link" (Thymus)
Defekte Aktin Polymerisation
Anormale Aktin Polymerisation
Gestörte Antigenpräsentation
Gestörte Antigenpräsentation
Gestörte TCR Signalgebung
Verstärkte Apoptose
Gestörte V(D)J-Rekombination und
gestörte DSB Reparatur
Gestörte V(D)J-Rekombination und
gestörte DSB Reparatur
Gestörte V(D)J-Rekombination
Akkumulation toxischer Metabolite
Akkumulation toxischer Metabolite
Gestörte Zytokinsignalgebung
Gestörte Zytokinsignalgebung
Pathogenese
2 Theoretische Grundlagen
2.2.2 Omenn Syndrom
Das humane Omenn Syndrom (OS) wurde 1965 als erstes von Gilbert S. Omenn beschrieben.
Hier berichtete er über das Auftreten einer Retikuloendotheliose mit Eosinophilie bei
mehreren Mitgliedern einer amerikanischen Familie irischen Ursprungs (Omenn 1965). Er
beschrieb
den
Symptomkomplex
als
Immundefizienzerkrankung
mit
zusätzlichen
Symptomen, welche an eine Graft-versus-Host Reaktion erinnern. Dieses Syndrom schien das
Resultat verschiedener genetischer und primär immunologischer Mechanismen zu sein, die zu
einem homogenen Krankheitsbild führten (Karol et al. 1983, Omenn 1965, Omenn 1971).
Später konnte ein autosomal-rezessiver Erbgang nachgewiesen werden (Villa et al. 1999).
Aufgrund des gemeinsamen Auftretens dieser beiden Effekte (Immundefizienz und Graftversus-Host Reaktion) galt das OS lange Zeit als eine rätselhafte Erkrankung, dessen
molekulare Grundlagen erst im letzten Jahrzehnt aufgedeckt wurden (Marrella, Maina & Villa
2011). Villa et al. berichteten 1998 das erste Mal von einem Zusammenhang dieses Syndroms
mit einer Mutation der Recombination Activating Genes.
Genetische Studien haben gezeigt, dass der Omenn Phänotyp eine breite molekulare
Heterogenität aufweist und nicht einzig und allein durch Mutationen der Gene RAG1 und
RAG2 zustande kommt (Ege et al. 2005, Giliani et al. 2006, Roifman, Gu & Cohen 2006,
Roifman et al. 2008, Shibata et al. 2007). Zusätzlich ist es wichtig, zwischen dem
„klassischen OS”, in Form einer gestörten V(D)J-Rekombination, und „Omenn-ähnlichen“
SCIDs zu unterscheiden (Tab. 2). Letztere sind durch Genmutationen bedingt, welche
direkten Einfluss auf die Reifung der Lymphozyten haben (Marrella, Maina & Villa 2011).
Das „klassische OS“ dagegen ist durch hypomorphe Defekte in Genen, welche für die V(D)JRekombination zuständig sind, gekennzeichnet (Marrella, Maina & Villa 2011). Diese
schwächen die V(D)J-Rekombination nur ab, anstelle eines kompletten Funktionsverlusts
(Villa et al. 1998). Hierbei sind Mutationen der Gene RAG1 und RAG2 für über 90 % aller
beschriebenen OS Fälle verantwortlich (Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010, Corneo et al.
2001). Bei den meisten Mutationen handelt es sich um einen Aminosäureaustausch. Des
Weiteren wurden aber auch einige kleine in-frame Deletionen beschrieben (Sobacchi et al.
2006). Zusätzlich zu diesen Erkenntnissen gab es auch Patienten mit einem unvollständigen
13
2 Theoretische Grundlagen
Omenn Phänotyp aufgrund einer RAG Mutation (Villa et al. 2001). Daraus lässt sich
schlussfolgern, dass das OS als eine kontinuierliche Einheit betrachtet werden sollte, deren
meist verbreitete Eigenschaft das Auftreten von Entzündungen und schweren Infektionen
darstellt (Villa et al. 2008).
Tabelle 2: Klassisches und atypisches Omenn Syndrom
Gen
Funktion
Phänotyp
RAG1/RAG2 V(D)J-Rekombination
OS; T+ B- NK+
Artemis
V(D)J-Rekombination
OS; T+ B- NK+
IL7Rα
Lymphozyten Entwicklung
OS; T+ B+ NK+
IL2Rγ
Lymphozyten Entwicklung
OS; NK Infiltr. der Haut; T+ B+
CHD7
Chromatin Remodelierung
OS; keine Erythrodermie; T- B+ NK+
ADA
Purin Metabolismus
OS; weniger T-zellen; T+ B- NK+
RMRP
Zellzyklus
OS; T+ B+ NK+
klassisch
atypisch
Modifiziert nach Marella, Maina & Villa (2011) und Villa et al. (2008)
Kinder mit diesem Gendefekt fallen schon sehr früh im Leben (2. bis 5. Lebensmonat) mit
chronischem Durchfall, Pneumonie und gestörtem Wachstum auf. Im Gegensatz zu an SCID
erkrankten Menschen kommen noch zahlreiche weitere Symptome dazu. Hierzu zählen zum
einen vergrößerte lymphatische Gewebe, schwere Erythrodermie, erhöhte IgE-Level und
Eosinophilie im Blut und Gewebe (Villa et al. 2008) und zum anderen Hepatosplenomegalie,
Alopezie (Kato et al. 2006) und Thymusdysplasie (Hönig, Schwarz 2006). Alle anderen
Immunglobuline sind, laut Villa et al. (1999), in verminderter Konzentration im Serum
nachweisbar.
Der Anteil an zirkulierenden T-Lymphozyten im peripheren Blut ist sehr variabel. Er kann
normal oder erhöht sein (Villa et al. 1999). Bei den vorhandenen T-Zellen handelt es sich um
oligoklonale, häufig aktivierte Lymphozyten mit einem eingeschränkten TCR Repertoire (de
Saint-Basile et al. 1991, Rieux-Laucat et al. 1998), überwiegend vom Th2-Typ (Schandene et
al. 1993). In vitro lassen sich diese aktivierten T-Zellen kaum durch Mitogene zur
Proliferation anregen (Villa et al. 1999). Meistens sind B-Lymphozyten im Blut nur in sehr
geringem Ausmaß oder gar nicht nachweisbar (Aleman et al. 2001). Die Anzahl an NK-
14
2 Theoretische Grundlagen
Zellen dagegen liegt bei uneingeschränkter Funktion im Referenzbereich oder kann auch
erhöht sein (Aleman et al. 2001, Villa et al. 2008).
Die einzigen heutzutage bekannten und angewendeten Therapiemaßnahmen bilden eine
Knochenmarktransplantation oder die Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut.
Vorangehend sind myeloablative Maßnahmen, sowie ein Abtöten der autoreaktiven T-Zellen,
zum Beispiel mittels Chemotherapie, notwendig. Trotz dieser Therapiemaßnahmen beträgt
die Mortalität 46 % (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006). Nach der Diagnostizierung
ist übergangsweise eine immunsuppressive Therapie mit Prednison und Cyclosporin A
hilfreich, um sowohl die Expansion als auch die Infiltration der T-Lymphozyten
einzudämmen (Villa et al. 2008). Zusätzlich gibt es neue Therapieansätze, welche sich mit
einer Gentherapie beschäftigen (Pike-Overzet et al. 2011, van Til et al. 2014).
2.3 Immundefiziente Tiermodelle
Über das humane RAG1 hinaus werden seit langer Zeit auch die vergleichbaren Gene von
Mäusen, Ratten, Zebrafischen (Willett, Cherry & Steiner 1997) und Regenbogenforellen
(Hansen, Kaattari 1995) untersucht. Dieses Kapitel soll einen Überblick über Rag defiziente
Maus- und Rattenstämme verschaffen.
2.3.1 Rag1 und Rag2 defiziente Mäuse
Ein wichtiges Rag1 defizientes Mausmodell wurde 1992 von Mombaerts et al. generiert und
analysiert.
Die
Rag1
Genmutation
fand
hierbei
in
pluripotenten,
embryonalen
Mäusestammzellen statt. Durch homologe Integration des zielgerichteten Vektors erfolgte
eine 1356 bp lange Deletion der Coding Sequenz des 5‘ Endes im Rag1. Da die Deletion in
etwa die halbe Coding Sequenz des Gens umfasst (incl. wichtiger Strukturen), handelt es sich,
bei der daraus resultierenden Mutation, um eine Null-Mutation. Die mittels dieser Technik
generierten Mäuse (129/Sv x CD1) weisen sehr kleine, zellarme lymphatische Organe auf,
welche keine reifen B- und T-Lymphozyten (CD3+ oder TCRαβ+) beinhalten. In der Milz und
im Knochenmark wiesen die Forscher einen geringen Anteil Prä-B-Zellen nach (Mombaerts
et al. 1992b, Mombaerts et al. 1992a).
15
2 Theoretische Grundlagen
Den gleichen Immunophänotyp beschrieben Shinkai et al. (1992) bei einer von ihnen
generierten Rag2 defizienten Maus. Diese weist eine 286 Aminosäuren lange Deletion des
Rag2 auf, was zu einem vollständigen Fehlen reifer B- und T-Lymphozyten in diesen Tieren
führt.
Die von Mombaerts et al. (1992) generierten Mäuse sind vital und fertil und lassen sich
adspektorisch bis zur 21. Lebenswoche nicht vom Wildtyp unterscheiden. Der Nachweis des
Fehlens von Serum IgM bis zur 16. Lebenswoche dient als Beweis eines „non-leaky“
Phänotyps bis zu diesem Zeitpunkt.
Während bei den genannten Mausmodellen eine spezifische Omenn-Symptomatik fehlt,
wurden in der Vergangenheit auch einzelne Mausmodelle, die im Phänotyp dem OS ähneln,
entdeckt. Dazu zählt zum einen die 2007 von Khiong et al. beschriebene spontane Rag1
Mutante (memory mutant; MM) einer C57BL/10 Maus mit partieller Rag1 Aktivität. Die
beschriebenen
Tiere
zeigen,
zusätzlich
zu
einer
geröteten
Haut,
sowohl
eine
Hepatosplenomegalie und Eosinophilie als auch erhöhte IgE Serumlevel, oligoklonal
expandierte CD4+ T-Zellen und unnatürlich hohe Anzahlen an „memory-phenotype“ TZellen. Durch ein Beseitigen der IL-4 und IL-6 produzierenden CD4+ T-Zellen konnten die
Autoren den Anstieg des IgE’s im Serum verhindern. Diese Tatsache weist auf eine
Dysfunktion dieser Zellpopulation als Ursache für die OS-artigen Symptome dieses
Mausstammes hin (Khiong et al. 2007).
Zum anderen wurde von Marella et al. ein Rag2 mutierter Mausstamm generiert (R229Q),
welchem es an AIRE Expression im Thymus fehlt und welcher zusätzlich eine starke
Reduktion der Forkhead box P3+ Treg Zellen und der NKT-Zellen aufweist. Zusätzlich zeigen
diese Tiere ein oligoklonales T-Zellrepertoire, periphere Eosinophilie und ein völliges Fehlen
zirkulierender B-Zellen. Darm und Haut sind mit aktivierten T-Zellen infiltriert, was zu
Durchfall, Alopezie und, in manchen Fällen, zu schwerer Erythrodermie führt (Marrella et al.
2007, Marrella et al. 2008). Diese Modelle unterstützen die Hypothese, dass sowohl eine
verminderte zentrale Toleranz und eine gestörte Entwicklung der regulatorischen T-Zellen als
auch eine homöostatische T-Lymphozytenproliferation in die Pathogenese des OS involviert
sein könnten (Villa et al. 2008).
16
2 Theoretische Grundlagen
2.3.2 Rag1 defiziente Ratten
„Die Ratte ist eine physiologisch und experimentell wichtige Spezies. Jedoch gibt es für sie
erst wenige genetische Modifizierungsmöglichkeiten, was sie gegenüber Mäusen nicht nur für
genetische Studien ins Hintertreffen geraten lässt, sondern auch bei der Generierung anderer
nützlicher Forschungsmodelle“ (Aitman et al. 2008).
Diese Arbeit basiert auf dem 2012 am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen
Hochschule Hannover generierten Rattenstamm LEW/Ztm-Rag1em1Ztm. Dieser ist auf dem
Hintergrund des Inzuchtstammes LEW/Ztm entstanden. Das Ziel war es, mittels Zink-finger
Nukleasen (ZFN) einen Rag1 knockout (KO) zu kreieren (Zschemisch et al. 2012).
ZFN bilden eine sehr effiziente Möglichkeit, spezifische Genmodifikationen herbei zu führen.
Es handelt sich dabei um Hybridproteine, die aus polymeren Zink-finger Proteinen
zusammengesetzt und an die Endonuklease Domäne des Restriktionsenzyms FokI gebunden
sind. Ein ZFN Paar bindet an zwei angrenzende Target Sequenzen jedes DNA Stranges im
Abstand von 6 bp und spaltet sie. Eine anschließende Dimerisierung der FokI Domäne
verursacht den Doppelstrangbruch (DSB) und initiiert den endogenen Reparaturprozess.
Erfolgt letzterer fehlerhaft, kann es zu Deletionen und Insertionen kommen und darüber
hinaus zur Generierung eines inaktiven Proteins (Aitman et al. 2008, De, Rodgers 2004).
Um den spezifischen Genknockout herbeizuführen, wurde Rag1 spezifische ZFN mRNA in
Zygoten ingezüchteter LEW/Ztm Ratten mikroinjiziert. Von 59 geborenen Nachkommen trug
ein Weibchen („founder 58“) auf einem Allel eine Mutation im Rag1. Verschiedene
Untersuchungen der Arbeitsgruppe wiesen nach, dass es sich dabei um eine 4 bp Deletion
handelte, welche in einem verfrühten Stopcodon resultierte und dadurch zu einer verkürzten
Version des RAG1 Proteins führte.
Die Homozygoten Nachkommen des Foundertieres 58 zeigten einen deutlich veränderten
Phänotyp zu den Wildtypen (WT). Es konnte ein komplettes Fehlen von B-Lymphozyten im
peripheren Blut nachgewiesen werden, zudem einige wenige reife T-Zellen (4,6 %) und eine
deutlich vergrößerte NK-Zellpopulation. Des Weiteren wiesen die untersuchten Milzen der
Nachkommen einen reduzierten Anteil weißer Pulpa auf, sowie fehlende PALS. Die Thymi
der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm waren hypoplastisch, ohne follikuläre Strukturen und beinhalteten
17
2 Theoretische Grundlagen
kaum RAG1 Protein. Die Lymphknoten zeigten ein lymphozytenarmes Bild. An weiteren
Organen außerhalb des Lymphatischen Systems wurden sowohl makroskopisch als auch
histologisch keine Veränderungen nachgewiesen (Zschemisch et al. 2012).
Außer dem in dieser Arbeit verwendeten Rattenmodell, sind in der Literatur noch wenige
andere Rag1 defiziente Rattenstämme beschrieben. Einen davon bildet die SD-Rag1tm1sage.
Dieses Rattenmodell entstand aus dem Auszuchtstamm Sprague-Dawley (SD) und wurde mit
derselben ZFN Technik wie oben beschrieben erstellt. Sie weist eine 29 bp Deletion im Exon
2 auf Chromosom 3 auf. Bei homozygoten Knockoutträgern kann kein RAG1 Protein per
Western Blot im Milzgewebe nachgewiesen werden und durchflusszytometrische Analysen
zeigen einen nahezu kompletten B-Zellverlust. Einige wenige reife T-Zellen lassen sich auch
bei diesem Rattenstamm noch nachweisen. Diese Ratte ist kommerziell erhältlich und wird
von der Firma SAGE Labs als Tiermodell für Xenotransplantationen und immunologische
Studien angepriesen. Allerdings ist sie bisher kaum phänotypisch charakterisiert (SAGE Labs
2015).
Des Weiteren haben Ménoret et al. (2013) eine immundefiziente Rag1-KO Ratte mittels
„engineered meganucleases“ erschaffen. In ihrer Studie wenden sie als erste Gruppe
Meganukleasen an, um das Genom in Säugetierzygoten zu modifizieren. Zudem bezeichnen
sie sich als die erste Forschungsgruppe, die einen immundefizienten Rag1-KO Rattenstamm
generiert und diesen vollständig phänotypisch charakterisiert hat. Nach erfolgreicher
Genmodifikation wies ein Tier (4 %) eine 5 bp Deletion im Rag1 auf (Ménoret et al. 2013).
Meganukleasen werden ähnlich den ZFN angewendet und produzieren auch DSB der DNA.
Sie verhalten sich jedoch spezifischer, wodurch unerwünschte Effekte weniger häufig
auftreten. Humanes RAG1 wurde damit schon früher detektiert (Grizot et al. 2009, Redondo et
al. 2008).
Für ihre Untersuchungen haben Ménoret et al. Ratten der Linie Sprague-Dawley verwendet.
Alle Untersuchungen zur Immunophänotypisierung fanden an 8 Wochen alten Tieren statt.
Die KO-Tiere wiesen verkleinerte lymphatische Organe (Milz, Thymus, Lymphknoten) auf,
deren totale Zellzahlen signifikant vermindert waren. Zudem zeigten sich im Vergleich zum
WT deutliche Abweichungen in den Lymphozytenpopulationen. Die Forscher detektierten
18
2 Theoretische Grundlagen
kleinere und in ihrer Anzahl verminderte, unreife und reife B- und T-Lymphozyten im
peripheren Blut, Thymus, Milz und Lymphknoten. Das Knochenmark zeigte einen deutlichen
Verlust an Prä-B-Zellen und reifen B-Zellen. Die Makrophagen- und NK-Zellpopulation
stellte sich normal dar. Des Weiteren konnte kein RAG1 Protein im Thymus der KO-Tiere
nachgewiesen werden und die IgG, IgA und IgE Immunglobulinlevel im Serum waren
vermindert. Letztendlich wurde die Immunantwort der KO-Ratten in vivo bestimmt. Dazu
erfolgte die Transplantation von MHCI/II inkompatiblen Spenderherzen (LEW.1A),
woraufhin die Abstoßung durch die immundefizienten Tiere deutlich verzögert verlief.
19
3 Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Rattenstämme, deren verwendete
Abkürzungen und die Hygieneeinheiten, in denen sie gezüchtet und gehalten werden,
aufgelistet. KF steht hier für eine keimfreie Haltung, SPF3/4 beschreibt zwei voneinander
unabhängige spezifisch pathogenfreie Haltungseinheiten mit unterschiedlichen Keimstatus.
Diese werden in Kapitel 3.1.2 näher beschrieben.
Tabelle 3: Verwendete Tierstämme
Stamm
Abkürzung
LEW
Hygieneeinheit
LEW/Ztm
LEW/Ztm-Rag1em1Ztm
LEW-Rag1
KF1, SPF31, SPF41
LEW.1F/TCRA (black hooded)
LEW.1F
Konventionell2
LEW.1W/7B
LEW.1U
Konventionell1
Konventionell2, SPF31
1
Zentrales Tierlaboratorium, MHH
2
Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie, MHH
In der gesamten Arbeit wurden ausnahmslos LEW/Ztm Ratten als Kontrolltiere zu den
LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratten verwendet. Einige wenige Daten wurden auch an heterozygoten
Trägern des Rag1 Gendefektes erhoben (Kap. 4.2.8 und 4.5.2). Diese werden vereinfacht als
LEW-Rag1+/- benannt. Als LEW-Rag1 Ratten werden ausschließlich die homozygoten
Träger dieses Gendefektes bezeichnet.
Die
gesamte
Studie
wurde
entsprechend
den
Bestimmungen
des
Deutschen
Tierschutzgesetzes und der Richtlinien 86/609/EEC und 2010/63/EU der Europäischen
Gemeinschaft zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke
verwendeten Tiere durchgeführt. Die Zucht der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm wurde vom
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit gemäß § 8
Abs. 1 des Tierschutzgesetzes genehmigt (33.14-42502-04-14/1492).
20
3 Material und Methoden
Um die Vergleichbarkeit der erhobenen Daten zu gewährleisten, wurden in allen folgenden
Untersuchungen vergleichbare Probenanzahlen junger (<60 Tage alt), mittelalter (60-120
Tage alt) und alter (>120 Tage alt) Ratten analysiert.
3.1.1 Haltung
Die Tiere der Stämme LEW, LEW-Rag1 und LEW.1U wurden im Zentralen Tierlaboratorium
(ZTL) der MHH gehalten. Der Stamm LEW.1F und die LEW Kontrolltiere für die in vitro
Proliferationstests wurden im Tierhaltungsraum an der Klinik für Allgemein-, Visceral- und
Transplantationschirurgie der MHH gehalten. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2°C, die
Luftfeuchtigkeit lag bei 55 ± 5% und die Beleuchtung der Räume mit Kunstlicht erfolgte
täglich über 14 Stunden, gefolgt von einer 10 stündigen Dunkelphase. Die Ratten wurden in
Typ IVs Makrolon®-Käfigen [Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Deutschland] in
unterschiedlichen Hygienebereichen gehalten und die Einstreu aus Weichholzgranulat wurde
ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Wasser und pelletiertes Alleinfutter (ssniff®, M-Z), mit
22 % Protein, 4,5 % Fett und 3,9 % Rohfaser, standen den Tieren ad libitum zur Verfügung.
Die Keimfreien Ratten wurden in Überdruck-Plastikfilm-Isolatoren [Metall + Plastik GmbH,
Radolfzell-Stahringen, Deutschland] gehalten. Wasser und Einstreu wurden autoklaviert
(134°C, 60 min), das Futter wurde mit 50 kGy bestrahlt. In den spezifisch pathogenfreien
Haltungen wurde die Einstreu zuvor autoklaviert (134°C, 10 min), das Wasser steril filtriert
und autoklaviert (134°C, 10 min) und das Futter bestrahlt (SPF4; 50 kGy) oder autoklaviert
(SPF3; 134°C, 10 min).
Zu den unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen geführten Tierräumen hatte nur
eine begrenzte Anzahl von Personen Zutritt. Das strikte Hygienemanagement umfasste eine
Dusche mit anschließendem Kleidungswechsel (Nassbarriere). Auch die konventionellen
Tierräume
durften
nur
mit
Schutzkleidung
und
nach
entsprechenden
Rahmen
vierteljährlicher
Desinfektionsmaßnahmen betreten werden.
3.1.2 Gesundheitsüberwachung
Die
Gesundheitsüberwachung
der
Tiere
wurde
im
Routineuntersuchungen gemäß den FELASA-Empfehlungen (Mähler et al. 2014, Nicklas et
21
3 Material und Methoden
al. 2002) am ZTL durchgeführt. Hierbei wurden bei den LEW-Rag1 Ratten der SPF3
Staphylococcus aureus und Klebsiella oxytoca als fakultativ pathogene Erreger nachgewiesen.
Ergänzt wurde die Überwachung durch PCR basierte Tests auf Kilham rat virus, Toolhan’s H1 virus, Pneumocystis spp., Mycoplasma pulmonis, Chlostridium piliforme, Helicobacter spp.
und Streptobacillus moniliformis an auffälligen LEW-Rag1 Tieren aller Hygienestatus, die
sich jedoch auch als negativ erwiesen.
Bei der in Kapitel 3.1 als „Konventionell“ bezeichneten Haltungseinheit handelt es sich um
einen experimentellen Haltungsbereich, dessen Hygienestatus regelmäßig überwacht wird.
3.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien
Eine vollständige Liste aller verwendeten Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien, Reagenzien,
Kits und Computerprogramme befindet sich im Anhang.
3.3 Anfertigung histologischer Präparate
Die Tiere wurden mittels CO2-Inhalation betäubt. Die nachfolgende Tötung erfolgte durch
Blutentzug mittels Herzpunktion. Danach wurde auf einer Waage ihr Körpergewicht
bestimmt, um später ihre Körpergewichte und Organgewichte in Relation zum
Gesamtgewicht zu vergleichen. Alle Organe wurden auf ihre Lage, Form, Farbe und
Konsistenz hin untersucht und der Sektionsgang verlief bei allen untersuchten Tieren nach
demselben Schema. Alle präparierten Organe wurden umgehend nach ihrer Entnahme in ein
formaldehydhaltiges Fixans (4 %iges Formalin) überführt und darin 3 Tage zur Fixierung
belassen.
Der Zuschnitt erfolgte nach der Registry of Industrial Toxicology Animal-data (RITA). Die
zugeschnittenen Organteile wurden danach in Standardeinbettkassetten verbracht und über
Nacht entwässert (Tab. 13). Anschließend erfolgte das Einbetten in Paraffin, danach wurden
mit dem Mikrotom 2-3 µm dicke Organschnitte angefertigt. Nach dem Aufziehen auf
Glasobjektträger wurden die Schnitte im Färbeautomaten mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) nach
dem in Tabelle 14 im Anhang dargestellten Protokoll gefärbt und danach luftdicht eingedeckt.
22
3 Material und Methoden
Das Farbergebnis ist folgendes: Zellkerne – blau; Zytoplasma – rot; Knorpel – blau-violett;
Erythrozyten – rot; Muskulatur – rot.
3.3.1 Histologische Auswertung
Alle für die Charakterisierung dieses Tiermodells notwendigen Organe wurden histologisch
ausgewertet. Das Vorgehen richtete sich dabei nach der Stärke und Komplexität der
Veränderungen. Im Folgenden werden die Bewertungsmaßstäbe und Scores der einzelnen
Organe detailliert beschrieben. Zur Vereinfachung der Auswertung steht die Zahl 0 für ein
nicht vorhandenes Merkmal, bzw. für ein Merkmal, welches auch bei den Kontrolltieren zu
finden ist. Eine Einteilung in 0 und 1 bedeutet lediglich, dass das Kriterium vorhanden ist
oder nicht. Weiterführend kommen die Einteilungen 0-2, 0-3 und 0-5 vor. Je höher die
zugeordnete Zahl ist, desto stärker ist das zu bewertende Merkmal ausgeprägt. Bei allen
bewerteten Zellinfiltrationen fand auch immer eine Bestimmung des Zelltyps statt.
3.3.1.1 Immunsystem
Die Infiltration mit Entzündungszellen wurde in der Milz mithilfe einer Skala von 0-3
bewertet.
An den Mesenteriallymphknoten wurden folgende Befunde bewertet: Größe (klein/groß bzw.
0/1),
Mastozytose
(0/1),
Nekrose
(0/1),
Hämosiderinspeicherung
(0/1)
und
Entzündungszellinfiltration (0-3). Anschließend wurden die Zahlen addiert. Eine gesonderte
Beurteilung der Unterkieferlymphknoten fand gepaart mit der Bewertung der Speicheldrüsen
statt.
Da sich die Veränderungen an den Thymi der Rag1-Ratten im Vergleich zu den LEW Ratten
glichen, erfolgte hier nur eine Beschreibung des Befundes. Eine Einteilung in verschiedene
Ausprägungsgrade war nicht möglich.
3.3.1.2 Gastrointestinaltrakt
Die Scores für die verschiedenen Anteile des Verdauungstraktes gleichen sich im
Wesentlichen. Leichte Unterschiede in der Schichtverteilung der Entzündungszellen ergaben
sich nach den Vergleichen mit den Kontrollorganen. Alle zugehörigen Organe wurden zum
23
3 Material und Methoden
einen hinsichtlich der Verbreitung der Entzündungszellen über das gesamte Organ beurteilt
und zum anderen hinsichtlich der Schichttiefe, in welche sie hinein reichen. Abschließend
erfolgte auch hier eine allgemeine pathologische Bewertung, um die Gesamterscheinung des
Organs zu klassifizieren.
Konkret für den Magen wurde folgender Bewertungsscore angelegt. Schichtausbreitung (0:
Übergang Tunica Mukosa/ Tela Submukosa; 1: Nur Tunica Mukosa; 2: Tela Submukosa; 3:
Tunica Muskularis). Ausbreitung über das gesamte Organ (0: Ganzes Organ, vereinzelt und
nicht in jedem Blickfeld; 1: Geringgradig vermehrte Entzündungszellen; 2: Mittelgradig
vermehrte Entzündungszellen; 3: Hochgradig vermehrte Entzündungszellen). Die allgemeine
pathologische Bewertung beurteilte das Organ nochmals nach seinem Gesamteindruck und
der Schwere der Veränderungen (0-3).
In den Dünndärmen der Kontrolltiere befinden sich vereinzelt Entzündungszellen in der
Mukosa. Das führte dazu, dass für dieses Bild 0 Punkte vergeben wurden. Vermehrte Zellen
in der Mukosa bekamen 1 Punkt, Zellen in der Submukosa wurden mit 2 und in der Tunica
Muskularis mit 3 Punkten beziffert. Sollte es im Zuge dieser Veränderungen schon zu einer
Peritonitis gekommen sein, wurde die gegebene Punktzahl um 1 erhöht. Die Bewertung der
Zellverbreitung über das gesamte Organ und die allgemeine pathologische Bewertung
erfolgten wie oben für den Magen beschrieben.
Die Bewertung der Blinddärme und Dickdärme erfolgte analog zur Bewertung der
Dünndärme.
Für das Pankreas der LEW-Rag1 Ratten wurde kein Bewertungsschema erarbeitet, da in
diesem Organ keine auf den Gendefekt zurückzuführenden Veränderungen auffielen.
3.3.1.3 Leber
An den Lebern der Ratten fand in erster Linie eine Bewertung der Zellinfiltrationen rund um
die Gallengänge statt. Hierbei fand eine Einteilung in die Stufen „keine, geringgradig,
mittelgradig, hochgradig“ (0-3) statt. Zusätzlich wurden vereinzelt sichtbare Nekroseareale
aufgenommen (0/1).
24
3 Material und Methoden
3.3.1.4 Herz
Die Herzen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins und der Stärke der Myokardinfiltrationen
beurteilt (0-3).
3.3.1.5 Haut
Der entnommene Teil Bauchhaut wurde anhand der Parameter Hyperkeratose (0-2),
Entzündungszellinfiltration (0-3), deren Schichtausbreitung (1: Epidermis, 2: Corium, 3:
Subkutis) und vorhandener Epithelschädigung (1: Erosion, 2: Exkoriation, 3: Ulzeration)
beurteilt. Die Einzelwerte wurden addiert und ergaben eine Gesamtbeurteilung der Schwere
der Hautschädigung in diesem Körperbereich (0-11).
3.3.1.6 Speicheldrüsen
Zur Beurteilung der Gesamtheit der Speicheldrüsenveränderungen wurden ihre drei paarigen
Anteile (Glandula parotis, mandibularis und sublingualis) sowie die sich in diesem Bereich
befindlichen Lymphknoten bewertet. Infiltrate im Binde- und Fettgewebe der Drüsen
erhielten bei vereinzeltem Auftreten den Wert 1 und bei diffusem Auftreten den Wert 2.
Erstreckten diese sich bis ins Drüsengewebe, erhielten sie für milde Infiltration den Wert 3
und bei mittelgradigem Auftreten eine 4. Für fibrotischen Umbau des Drüsenkörpers gab es
eine 5. Die Lymphknoten wurden hinsichtlich einer auftretenden Lymphadenitis mit den
Werten 0-4 bewertet. 1-3 bilden die Stärke der Entzündungszellinfiltration ab. Traten
zusätzlich Nekrosen auf, wurde der Wert um 1 erhöht. Nach Addition beider Werte ergibt sich
mit diesem Scoringsystem ein Maximalwert von 9.
3.3.1.7 Lunge
Das Beurteilungsschema für die entnommenen Lungen gliedert sich wie folgt in: Verdickte
Alveolarwände (0-2), Infiltration mit Entzündungszellen (0-3), vermehrte Mukusproduktion/
Clarazellhyperplasie (0-2) und Vorkommen von Herzfehlerzellen (0-2). Zuletzt erfolgte eine
allgemeine pathologische Bewertung, welche die Ausmaße der Veränderungen als
Gesamteindruck zusammenfasst (0-5). Nach anschließender Aufsummierung der Einzelwerte
ergaben sich Gesamtwerte für die Lungen zwischen 0 und 14.
25
3 Material und Methoden
3.4 Bestimmung der Leukozytenzahlen in verschiedenen Lymphknoten und
der Milz
Da schon im Vorfeld besondere Veränderungen an den lymphatischen Organen festgestellt
werden konnten, wurde, zusätzlich zur histologischen Untersuchung, die absolute
Leukozytenzahl in der Milz, dem linken Kniefalten Lymphknoten (Ln. subiliacus) und dem
linken medial gelegenen Ln. mandibularis bestimmt. Dazu wurden die entsprechenden
Organe während der Sektion entnommen und in PBS aufbewahrt. Nachfolgend wurden sie
mit Hilfe zweier Pinzetten in ihrem Medium in einem Zellsieb zerzupft und mit leichtem
Druck durch das Sieb gespült. Die gesamten Organe wurden standardmäßig in 5 ml Medium
aufgenommen und dann die Zellzahl pro µl mit dem „SCIL Vet abcTM“ bestimmt. Der
erhaltene Wert konnte dann auf das gesamte Organ in der 5 ml Suspension hochgerechnet
werden.
3.4.1 Lebend-Tot-Färbung der Lymphozyten
Zusätzlich zur Zählung der Leukozyten, wurden die Lymphknotenzellen von LEW und LEWRag1 Ratten in einer Lebend-Tot-Färbung beurteilt. Hierzu erfolgte ein Anfärben der
Zellsuspension mit einer 1:2,5 mit 0,9 % NaCl verdünnten Trypan Blau Lösung [Sigma
Aldrich, #T8154]. Danach wurden die Zellen bei 100-facher Vergrößerung unter dem
Lichtmikroskop, mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer, hinsichtlich ihrer Vitalität und ihres
Verhältnisses zueinander beurteilt.
3.5 Erfassung physiologischer Parameter
Aufgrund des klinischen Bildes, welches sich bei der LEW-Rag1 Ratte zeigt, wurden weitere
physiologische Parameter mit denen der LEW Ratten verglichen.
Zum einen wurden Tiere unterschiedlicher Haltungen, unterschiedlichen Geschlechts und
unterschiedlichen Alters gewogen und ihre Gewichte notiert. Zusätzlich wurde dabei
zwischen erkrankten und gesund erscheinenden Tieren unterschieden. Aus diesen Daten
wurden dann Rückschlüsse auf die Gewichtsentwicklung bei steigendem Alter gezogen.
26
3 Material und Methoden
Zum anderen wurden die Reproduktionsdaten der letzten zwei Jahre, rückblickend mit Hilfe
der jeweiligen Zuchtkarten, zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten verglichen. Dabei wurde
Wert
auf
folgende
Parameter
gelegt:
Wurfgröße,
Wurfanzahl,
Absetzer
und
Zwischenwurfzeiten. Zusätzlich fand eine Berechnung des „Colony Index“ für jede separate
Haltungseinrichtung statt. Dieser errechnet sich aus Absetzern pro Weibchen pro Woche.
3.6 Erfassung pathologischer Symptome
Schon im Vorfeld dieser Arbeit ist aufgefallen, dass die LEW-Rag1 Ratte im Laufe ihres
Lebens einige unbestimmte klinische Krankheitssymptome entwickelt. Deshalb wurde im
Laufe der Studie zu jedem Tier wöchentlich ein eigener Befundbogen von geschultem
Tierpflegepersonal ausgefüllt. Dieser ist im Anhang (Kap. 9.9) dargestellt. Mithilfe dieses
Bogens war es möglich, die Symptome zu quantifizieren und ihr Entstehen sowie ihren
Verlauf zeitlich einzuordnen. Zusätzlich dazu wurden alle histologisch untersuchten Tiere vor
der Sektion mit einem klinischen Score (Tab. 4) bewertet. Die klinischen und histologischen
Daten wurden korreliert, um nachweisen zu können, wie gut geeignet die Gruppeneinteilung
in „gesund“ und „krank“ nach den in Tabelle 4 genannten Kriterien ist.
Tabelle 4: Klinischer Score der histologisch ausgewerteten Tiere
Kriterium
Adspektion des Tieres von außen, klinische Symptome
Allgemeinbefinden gestört, Gewichtsverlust
Gesamt
Score
0-3
0-3
0-6
Zusätzlich zu diesem allgemeinen Studienabschnitt wurden sechs gesunde, weibliche LEWRag1 Ratten im Alter von 9 (1 Tier) und 5 Wochen (5 Tiere) aus der SPF4 Haltung in eine
keimreichere Umgebung verbracht und die gesamte Zeit einer antimikrobiellen Therapie
unterzogen. In der veränderten Haltungsumgebung wurden sie in individuell belüfteten
Käfigen gehalten, um eine übermäßige Kontamination zu vermeiden. Wöchentliches
Umsetzen fand unter der Laminar-Flow statt. Direkt nach dem Verlassen der SPF Haltung
wurden die Tiere täglich antibiotisch behandelt. Dies geschah oral mit 5 ml Cotrim K (240
mg/5 ml Sulfamethoxazol und Trimethoprim 5:1) pro Liter Tränke über das Trinkwasser bis
zum Lebensende der Tiere. Der Gesundheitszustand der Ratten wurde täglich kontrolliert und
27
3 Material und Methoden
ihre Körpergewichte wurden im Abstand von 7 Tagen dokumentiert. Hiermit sollte
herausgefunden werden, ob eine dauerhafte antibiotische Therapie vor der Entstehung
klinischer Symptome schützt.
3.7 Gemischte Leukozytenkultur
Die gemischte Leukozytenkultur (Mixed Leucocyte Culture, MLC) ist ein in vitro Verfahren
zur Überprüfung der Gewebeverträglichkeit zwischen einem Transplantationskandidaten
(Responder) und prospektiven Spendern (Stimulatoren) und wird zum Beispiel im Rahmen
einer allogenen Knochenmarktransplantation durchgeführt (Bein et al. 1998). Dabei werden
Lymphozyten des Responders mit Zellen des Stimulators zusammen in Kultur gehalten und
später die Stärke der Immunantwort des Responders bestimmt.
Im Zuge dieser Studie wurden die Lymphozyten mehrerer LEW und LEW-Rag1 Ratten in
MLC-Tests untersucht und ihre Reaktion verglichen, um herauszufinden, ob es sich bei den
beobachteten klinischen Symptomen der LEW-Rag1 Tiere um eine autoimmune Reaktion
handelt. Gleichzeitig wurde die Reaktion der LEW-Rag1 Lymphozyten auf die Stimulation
durch Allo- und Xenoantigene im Vergleich zu LEW untersucht. Die Responderzellen stellten
in diesem Fall Zellen aus den peripheren Lymphknoten der LEW und der LEW-Rag1 Ratten
dar. Als Stimulatorzellen dienten Milzzellen der Stämme LEW, LEW.1F und LEW.1U und
zusätzlich der porzine B-Zellklon L23. Hierbei dienten die LEW-Milzzellen als Isoantigen,
die LEW.1F- und 1U-Zellen als Alloantigen und die L23-Zellen als Xenoantigen. Die beiden
Alloantigene weisen unterschiedliche MHCs auf. So konnte die Reaktion der LEW-Rag1
Lymphozyten auf zwei verschiedene Alloantigene getestet werden. Um eine Proliferation der
Stimulatorzellen ausschließen zu können, wurden diese zuvor bei 30 Gy bestrahlt. So konnte
die später gemessene Zellproliferation sicher den Responderzellen zugewiesen werden. Die
zur Analyse notwendige Methode wird hier am Beispiel einer LEW Ratte und einer LEWRag1 Ratte dargestellt.
Einer frisch getöteten LEW Ratte wurden die Milz und einige periphere Lymphknoten (Lnn.
subiliaci, Lnn. axillares, Lnn. mandibulares) entnommen. Einer LEW.1F und einer LEW.1U
Ratte wurde die Milz entnommen und einer LEW-Rag1 Ratte wurden einige periphere
Lymphknoten entnommen. Die Organe wurden kurze Zeit in PBS + 5 % FCS in Petrischalen
28
3 Material und Methoden
gelagert, bevor sie mit Hilfe zweier gebogener Pinzetten zerzupft und durch ein Zellsieb
gegeben wurden. Nachdem die Erythrozyten in der Milzzellsuspension lysiert waren, mussten
die übrigen Milzzellen bei 30 Gy bestrahlt werden, damit keine Proliferation mehr stattfinden
kann. Aus der Lymphknotenzellsuspension des LEW Tieres wurden mittels einer Nylonsäule
die B-Zellen herausgefiltert, sodass sich später fast nur noch T-Lymphozyten in der
Zellsuspension befanden (Julius, Simpson & Herzenberg 1973). Das führte zu einer besseren
Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen LEW und LEW-Rag1.
Tabelle 5: Zellkulturmedium für MLC
Substanz
RPMI 1640
FCS (inaktiviert)
PS/Glutamine
Menge
500 ml
10%
5 ml
Firma
BioWhittaker, #LO 12-167Q
Biochrom Superior, #S 0615
Sigma, #G1146 SLBR9280
Nach dem Waschen und Zählen der Zellsuspensionen wurden die Zellen laut Plattenplänen in
96-well Mikrotiterplatten im Dreifachansatz ausgesät (Abb. 4). Hierbei kamen 2x105 Zellen
in 100 µl Zellkulturmedium pro Zelltyp in ein Well.
Abbildung 4: Pipettierschema MLC
Links sind die Positiv- und Negativ-Kontrollen dargestellt, wobei die Zellen nach der Zugabe von
Zellkulturmedium kaum Proliferation zeigen sollen. Nach der Zugabe des ConA sollten alle Zellen proliferieren.
Im rechten Abschnitt sind die Tests der LEW- und LEW-Rag1-Lymphozyten im Dreifachansatz dargestellt.
Exemplarisch für beide Alloantigene ist hier nur LEW.1F angegeben.
Die Platten inkubierten durchgängig im CO2 begasten Brutschrank bei einer Temperatur von
37 °C und einer Luftfeuchte von 95 %. Den Positiv-Kontrollen wurde gleich zu Beginn das T-
29
3 Material und Methoden
Zell Mitogen Concanavalin A (ConA) zugesetzt, um die Zellen zur Proliferation anzuregen.
Die Inkubationszeit betrug für diese Proben 48 Stunden. Die restlichen Proben blieben für 74
und 92 Stunden im Brutschrank. Dann erfolgte die Isotopenmarkierung durch Zugabe von
radioaktivem Methyl-3H-Thymidin (1 µCi in 50 µl RPMI pro well) sowohl auf die Kontrollen
als auch auf die Analyseproben. Hierbei handelt es sich um einen radioaktiv markierten DNA
Baustein, der bei der Vervielfältigung der DNA vor der Zellteilung in den Zellkern der vitalen
Zellen eingebaut wird (Taylor, Woods & Hughes 1957).
Nach einer weiteren Inkubationszeit von 16 Stunden wurden die Zellen mit dem „Filter Mate
Harvester“ [Perkin Elmer] von der Platte geerntet und auf eine Filtermatte überführt, auf derer
nach dem Trocknen die Menge des eingebauten 3H-Thymidins in counts per minute (cpm) pro
MLC-Kultur erfasst wurde [„Wallac Trilux 1450 Microbeta“, Perkin Elmer]. Die Menge des
eingebauten 3H-Thymidins stellt die Stärke der Zellstimulation und -proliferation dar. Aus
den Dreifachwerten wurde der jeweilige Medianwert errechnet und als Ergebnis registriert.
3.8 Fluoreszenzbasierte durchflusszytometrische Analysen
Durchflusszytometer
ermöglichen
die
simultane
Messung
mehrerer
physikalischer
Charakteristika einzelner Zellen. Dazu gehören die relative Zellgröße, die Granularität und
die relative Fluoreszenzintensität. Das macht es möglich, mehrere Zellpopulationen
voneinander abzugrenzen. Bei der Messung wird die Zellsuspension durch einen Hüllstrom
verdünnt, um anschließend Einzelzellen im rechten Winkel an einer monochromatischen
Lichtquelle (Laser) vorbeizuführen. Lichtsignale verschiedener an Antikörper gebundener
Farbstoffe unterscheiden sich spektral und werden durch Photomultipler detektiert. Diese
wandeln das Licht in elektrische Signale um (Rothe 2007).
„FACS” bedeutet Fluorescence-Activated-Cell-Sorter. Im Anhang sind alle verwendeten
fluoreszenzmarkierten Antikörper dargestellt. FITC steht für Fluoreszeinisothiocyanat und PE
für Phycoerythrin. Diese Farben werden mit der 488 nm-Hauptlinie eines Argon-Lasers
angeregt. Die Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:100 mit FACS-Puffer eingesetzt.
Alle Messungen fanden, wenn nicht anders beschrieben, mit dem „FACS Calibur“ von
Becton Dickinson statt und wurden am PC mit dem Programm CellQuest Pro ® von BD
ausgewertet. Die Färbung fand immer im FACS-Röhrchen (5 ml) statt und es wurde
30
3 Material und Methoden
kontinuierlich auf einer Eisplatte gearbeitet. Alle Zentrifugationsschritte der Probenröhrchen
liefen 4 Minuten lang bei 200 g und 4 °C [Multifuge 3SR+, Heraeus]. Die Zellen sammelten
sich daraufhin am Röhrchenboden und die Überstände konnten abgegossen werden.
Für die durchflusszytometrischen Analysen wurden Vollblut, Milz- und Lymphknotenzellen
sowie Thymusgewebe verwendet.
Mit einer Doppelfärbung von CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen erfolgte der Nachweis von
reifen T-Lymphozyten. Diese tragen gleichzeitig auch einen αβ- oder γδTCR. Bei den
CD3+CD4+ Lymphozyten handelt es sich um T-Helferzellen und bei den CD3+CD8+ T-Zellen
handelt es sich um zytotoxische T-Zellen. Tragen diese Zellen zusätzlich das Molekül CD25
auf ihrer Oberfläche, dann handelt es sich um aktivierte/ regulatorische T-Lymphozyten.
Regulatorische Zellen weisen zusätzlich noch den intrazellulären Marker Forkhead box
protein 3 (Foxp3) auf. Zu den Zellfraktionen, die gleichzeitig CD4 und CD8 auf ihrer
Oberfläche tragen, gehören zum einen die DP Lymphozyten und zum anderen die Fraktion
der Monozyten und Makrophagen. CD161 als spezifisches Molekül für einen NKZellrezeptor lässt sich vorwiegend auf NK-Zellen finden. Zusätzlich trägt auch die kleine
Fraktion der NKT-Zellen dieses Oberflächenmolekül. Das Molekül CD45RA wird in dieser
Arbeit als detektierbares spezifisches Merkmal der B-Lymphozyten genutzt.
3.8.1 Blut
Das entnommene Blut wurde in EDTA-Blutsammelgefäßen aufgefangen und die Anzahl der
weißen Blutkörperchen mit Hilfe des „SCIL Vet abcTM“ bestimmt. Im nächsten Schritt folgte
die Aufteilung in die FACS-Proben-Röhrchen. Pro Färbung wurden 20 µl Blut eingesetzt.
Dieses wurde einmalig mit 2 ml Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse) gemischt und dann
zentrifugiert, um den Großteil der roten Blutkörperchen aus der Probe zu entfernen. Darauf
folgte ein Waschschritt mit FACS-Puffer. Anschließend wurden die vorverdünnten zu
untersuchenden Antikörper auf die Proben gegeben und durch vorsichtiges auf und ab
Pipettieren mit der Zellsuspension vermischt. Darauf folgte eine 45-60 minütige Inkubation
bei 4 °C im Dunkeln. Danach wurde überschüssiger, nicht gebundener Antikörper in zwei
Waschschritten mit FACS-Puffer entfernt und es folgte die Analyse.
31
3 Material und Methoden
Tabelle 6: FACS Puffer
Substanz
PBS
NaN3
Menge
1l
0,3 g
Firma
Biochrom, #L182-05
Merck, #8.22335.0100
BSA
1,0 g
Sigma, #A9647-50G
Tabelle 7: Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse)
Substanz
EDTA
NaHCO3
Menge
0,037 g
1,0 g
Firma
Carl Roth, #8043.2
Sigma, #S5761-500G
NH4Cl
8,34 g
Merck, #1.01145.1000
H2O dest.
pH
1l
7,3
3.8.2 Milz und Lymphknoten
Milz und periphere Lymphknoten wurden in toto, ohne umliegendes Fettgewebe, aus dem
Tierkörper entnommen und in gekühlten FACS-Puffer überführt. Mit Hilfe zweier gebogener
Pinzetten wurde das Organgewebe vorsichtig zerzupft und mit FACS-Puffer durch ein 40 µm
Zellsieb gegeben. Die Suspension wurde in einem 15 ml Kunststoffgefäß mit
Schraubverschluss und konischem Boden [Cellstar® Tubes, Greiner Bio-One] aufgefangen
und danach 7 Minuten lang bei 1100 rpm zentrifugiert [Multifuge 3SR+, Heraeus]. Der
Überstand wurde durch Abgießen von dem Zellpellett getrennt. Weiterhin fand in der
Milzzellsuspension eine Lyse der Erythrozyten mittels 6 ml Erylyse statt und danach ein
Waschgang mit 6 ml FACS-Puffer. Je nach Menge der isolierten Zellen, wurden sie in einem
bestimmten Volumen FACS-Puffer aufgenommen und dann auf FACS-Röhrchen verteilt
(200.000-1.000.000 Zellen pro Probenröhrchen). Die Färbung, Inkubation der Antikörper und
anschließenden Waschschritte erfolgten wie oben beschrieben.
32
3 Material und Methoden
3.8.3 Thymus
Die Aufarbeitung der Thymi erfolgte in gleicher Weise wie die Aufarbeitungen der Milzen
und Lymphknoten. Allerdings waren die entnommenen Proben häufig sehr fettgewebsreich,
da die, zum Teil nur rudimentär vorhandenen, Thymi der LEW-Rag1 Ratten sehr schwer zu
lokalisieren waren. Aufgrund dieses probenweise sehr geringen Gehaltes an Leukozyten in
der Zellsuspension, war eine Auswertung häufig nicht möglich.
3.8.4 Intrazelluläre Färbung
Um den Anteil der regulatorischen T-Lymphozyten an der gesamten Lymphozytenpopulation
bestimmen zu können, wurde für alle oben genannten Organe, außer dem Thymus, eine
intrazelluläre Färbung des Foxp3, kombiniert mit dem Oberflächenantigen CD25,
durchgeführt. Nach der Oberflächenfärbung erfolgte die Zellaufbereitung mit dem „FOXP3
Fix/Perm Buffer Set“ [BioLegend] nach dem beiliegenden Protokoll. Nach Inkubation der
Zellen im „Fixation and Permeabilisation Buffer“ und anschließendem Waschen mit
„Permeabilisation Buffer“ (beides im Set von BioLegend) konnte der im „Permeabilisation
Buffer“ vorverdünnte Foxp3-Antikörper dazugegeben werden. Es folgte eine weitere
Inkubation, um dem Antikörper Zeit zu geben, in die permeabilisierten Zellen zu gelangen
und dort zu binden. Nach den anschließenden Waschschritten konnten die Proben am
Durchflusszytometer [Gallios TM Flow Cytometer] gemessen werden.
3.8.5 Auswertung der FACS-Daten mit CellQuest Pro®
Die gemessenen Farbintensitäten der Proben wurden
mit Hilfe dieses PC Programms und sogenannter DotPlots (Punktwolken Diagramme) ausgewertet. Als
allererstes
wurde
ein
Gate
um
die
gesamte
Lymphozytenpopulation der Probe gelegt. Nur Zellen
aus diesem Gate gehen dann in die weitere Auswertung
Abbildung 5: Lymphozytengate
ein. Der Forward Scatter (FSC), hier auf der X-Achse,
beschreibt die Zellgröße. Der Side Scatter (SSC), hier auf der Y-Achse, beschreibt die
Granularität der Zellen (Abb. 5).
33
3 Material und Methoden
Als nächstes erfolgte die Beurteilung der ungefärbten Kontrolle hinsichtlich etwaiger falsch
positiv gefärbter Zellen und dann folgte die Beurteilung der einzeln eingesetzten
Antikörperfärbungen. Daran wurden die positiven und negativen Bereiche im Box Plot
festgelegt. Im Folgenden ist in Abbildung 6 exemplarisch eine Doppelfärbung mit CD3 FITC
und CD4 PE dargestellt.
Abbildung 6: Gatingstrategie der durchgeführten FACS Färbungen
Links ist die ungefärbte Kontrolle dargestellt, rechts exemplarisch die Färbung von CD3 + und CD4+ Zellen.
Nach richtigem Positionieren des Kreuzes errechnet das Programm die Anteile der
verschieden gefärbten Zellpopulationen am vorher bestimmten Lymphozytengate. Diese
Werte wurden abschließend miteinander verglichen.
3.9 Aufarbeitung der Blutproben
Die Blutprobengewinnung für diese Arbeit erfolgte mit Hilfe unterschiedlicher Methoden
vom lebenden und narkotisierten Tier. Das war zum einen die Herzpunktion nach Eröffnung
des Thorax, einer Sektion vorangehend, und zum anderen die Punktion des retrobulbären
Plexus mit einer Mikrohämatokritkapillare. Wenn die Tiere wiedererwachen sollten, wurde
die Narkose mit Ether durchgeführt, vor der Tötung mit CO2. Das gewonnene Blut wurde
entweder in 1,3 ml Sammelröhrchen mit EDTA oder in 1,5 ml Kunststoffreagiergefäßen
aufgefangen.
34
3 Material und Methoden
3.9.1 EDTA-Vollblut
Ein Teil der Blutproben wurde in mit EDTA versetzten Probengefäßen aufgefangen, um ein
Koagulieren des Blutes zu verhindern. Dadurch war es über längere Zeit möglich, die
einzelnen Blutzellpopulationen anhand ihrer Morphologie und Quantität zu beurteilen.
Ein sogenanntes kleines Blutbild wurde mit Hilfe des „SCIL Vet abc TM“, einem
Blutzellanalysegerät
für die Veterinärmedizin,
erstellt.
Die
Ergebnisse beinhalten
Informationen über die Häufigkeiten der einzelnen Zellfraktionen im Vollblut (Leukozyten,
Erythrozyten, Thrombozyten), sowie Hämatokrit und Hämoglobingehalt. Zur besseren
morphologischen Beurteilung der Blutzellen und zur Differenzierung der Leukozyten in
Lymphozyten, Monozyten, neutrophile-, eosinophile- und basophile Granulozyten wurden
Blutausstriche angefertigt, mittels Pappenheim Färbung gefärbt und später unter dem
Lichtmikroskop beurteilt.
Tabelle 8: Pappenheim Färbung
1.
2.
3.
Chemikalie
Dauer (Min)
May-Grünwaldlösung
3:00
May-Grünwaldlösung : Aqua dest. (1:1)
1:00
Giemsa Gebrauchslösung (1:20)
20:00
3.9.2 Blutserum
Nach dem Auffangen des Blutes in einem 1,5 ml Kunststoffreagiergefäß hatte es mindestens
eine halbe Stunde Zeit, bei Raumtemperatur zu koagulieren. Danach fand die Trennung des
Blutserums von den festen Bestandteilen durch Zentrifugation statt und das Serum konnte
vorsichtig abpipettiert und in ein weiteres Gefäß überführt werden. Darin wurden die Proben
bei -20 °C eingefroren.
3.9.2.1 Serumchemie
Die chemische Analyse der Blutseren wurde vom Institut für klinische Chemie der
Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Nach dem Auftauen wurden die 1 bis 7
Wochen bei -20 °C eingefrorenen Proben mit dem „AU5400“ [Olympus] auf folgende
Parameter hin untersucht: Natrium, Kalium, Chlorid, Calzium, Phosphat, Magnesium,
Kreatinin, Harnstoff, Creatinkinase, AST, ALT, Alkalische Phosphatase, GammaGT,
35
3 Material und Methoden
Amylase, Lipase, Glucose, Gesamt Bilirubin, Gesamt Protein, Albumin, Cholesterin, HDLCholesterin, LDL-Cholesterin.
3.9.2.2 Multiplex Assay
Serumproben von 85 Studientieren wurden 2-18 Monate lang bei -20 °C eingefroren und nach
dem Auftauen mit Hilfe eines Magnetic Bead Assays analysiert. Dabei fiel die Betrachtung
auf folgende Parameter: EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, GRO/KC, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-18, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α,
MIP-3α, RANTES, VEGF.
Es wurde das „Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 24-plex Assay“- Kit benutzt, welches alle
nötigen Reagenzien beinhaltete. Die Durchführung des Assays verlief nach dem Protokoll des
Herstellers [Bio-Rad; Instruction manual #10014905] und die Messung erfolgte im „Bio-Plex
TM
200“ mit dem Computerprogramm „Bio-Plex ManagerTM 6.1“ [alles Bio-Rad Laboratories,
Inc.]. Nachdem die vorbereiteten Beads auf der Platte verteilt wurden, konnten die Standards
und verdünnten Proben dazu gegeben werden. Nach der Inkubation und Waschschritten
wurden die Detection Antikörper auf die Proben gegeben. Nach anschließender erneuter
Inkubation und erneutem Waschen wurden die Proben nach Zugabe von SA-PE analysiert.
3.9.2.3 ELISA
Nach einer Einfrierzeit von 2-18 Monaten wurde die Konzentration von Immunglobulin E
(IgE) und Immunglobulin G (IgG) im Blutserum mittels ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) bestimmt. Die Proben wurden anhand der Gebrauchsanweisung des
Herstellers [Rat IgE ELISA Quantitation Set und Rat IgG ELISA Quantitation Set; Bethyl
Laboratories, Inc.] aufgearbeitet und die Absorption bei 450 nm im „Victor
TM
X3, 2030
Multilabel Reader“ mit der Software „WorkOut 2.5“ [beides Perkin Elmer] gemessen. Nach
dem Coaten der Elisa Platte mit dem entsprechenden Antikörper folgte ein Blockschritt.
Danach konnten die Standards und Proben auf die Platte gegeben werden. Im Anschluss fand
die Zugabe des HRP detection Antikörpers und darauf die Reaktion mit dem TMB Substrat
[BD, #555214] statt. Mit H2SO4 (0,18 M) wurde die Reaktion gestoppt. Zwischen den
einzelnen oben angeführten Arbeitsschritten erfolgten Inkubationen und Waschschritte laut
Protokoll. Im Anhang sind die Zusammensetzungen der benötigten Lösungen angegeben.
36
3 Material und Methoden
3.10 Statistische Auswertungen
Die statistische Auswertung und die Erstellung der Graphen erfolgte mit dem
Computerprogramm GraphPad Prism 5.0 und 6.0. In allen Abbildungen wurden für die zu
untersuchenden Hypothesen die exakten P-Werte des gewählten Signifikanztests angegeben.
Hierbei wird ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α ≤ 0,05 von einem signifikanten Befund
gesprochen. P-Werte größer als 0,05 wurden somit als nicht signifikant aufgefasst und auch
nicht in die Graphen eingefügt. Alle signifikanten Unterschiede wurden optisch in den
Abbildungen dargestellt, Ausnahmen davon werden in der Unterschrift explizit erwähnt. Der
Vergleich zweier Stichproben parametrischer Daten fand mit Hilfe eines einfachen t-Tests
statt. Wiesen diese Proben signifikant unterschiedliche Varianzen auf, wurde ein t-Test mit
Welch Korrektur durchgeführt. Wurden die parametrischen Daten von mehr als zwei Gruppen
miteinander verglichen, erfolgte dies durch eine one-way analysis of variance (ANOVA) mit
dem Tukey’s multiple comparison Test als anschließendem post-hoc Test.
Die Auswertung nicht parametrischer Daten erfolgte für zwei zu vergleichende Stichproben
mit Hilfe des Mann-Whitney Tests. Wurden mehr als zwei Gruppen nicht parametrischer
Daten auf signifikante Unterschiede hin überprüft, kam der Kruskal-Wallis Test mit
anschließendem Dunn’s multiple comparison Test zur Anwendung.
Die Balkendiagramme in den Analysen stellen die Mittelwerte der Daten mit ihren
Standardabweichungen dar. Eine Ausnahme bildet die Auswertung der histologischen Proben.
Aufgrund der teilweise sehr großen Heterogenität der errechneten Scores erfolgte die
graphische Darstellung mittels Box-Whisker-Plots (Min.-Max.). Somit konnte die große
Streuung der Daten am besten dargestellt werden. Befanden sich nur wenige Ausreißer in den
jeweiligen Gruppen, wurden die Daten als Scatter-Plots mit ihren Standardabweichungen
aufgezeichnet, um die Verteilung noch deutlicher darstellen zu können. Erstere Begründung
kommt auch bei der Darstellung der Blutwerte zum Tragen.
37
4 Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Klinische Befunde
Die LEW-Rag1 Ratten entwickeln im Laufe ihres Lebens ein umfangreiches Repertoire an
pathologischen Symptomen. Dazu zählen sowohl makroskopische Krankheitsanzeichen, die
der Betrachter von außen am Tier erkennen kann, als auch erst histologisch erkennbare
Veränderungen
der
Organe.
Eine
detaillierte
Auflistung
aller
auftretenden
pathomorphologischen Veränderungen liefert Tabelle 9.
4.1.1 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome der LEW-Rag1 Ratte
Die
im
Untersuchungszeitraum
am
häufigsten
aufgetretenen
Veränderungen
der
immundefizienten Tiere sind Alopezie und eine gerötete, im späteren Stadium auch schuppige
Haut. In der keimfreien Haltung zeigten 83 % der erkrankten Tiere einen Verlust ihres Fells
und zusätzlich gerötete Hautpartien. In der SPF4 waren es 48 % mit Alopezie und 70 % mit
Hautrötungen und in der SPF3 77 % und 69 %. Hierbei waren vor allem der Kopf und die
Gliedmaßen betroffen. Bei voranschreitender Krankheitsdauer wurden auch alle anderen
Körperpartien in Mitleidenschaft gezogen. Helle Schuppen und teilweise braun-rötliche
Krusten traten bei 43 % der erkrankten keimfreien Ratten auf, bei 41 % der erkrankten Tiere
in der SPF4 und bei 48 % in der SPF3.
Abbildung 7: Klinisches Bild der LEW-Rag1 Ratte
Die Ratte in diesem Bild zeigt eine gerötete, schuppige Haut,
mit starkem Fellverlust an Nase und Rücken.
38
4 Ergebnisse
Ein weiterer in regelmäßigen Abständen auftretender Befund waren nasse oder verklebte
Fellareale im Bereich des vorderen Gesichts, am Unterkiefer, im Brustbereich und an den
Vorderpfoten. Eine Adspektion des Maul- und Rachenbereiches betroffener Tiere lieferte
keine pathologischen Befunde.
In Abbildung 8 ist die Verteilung kranker und gesunder LEW-Rag1 Tiere mit zunehmendem
Alter in den drei verschiedenen Haltungen dargestellt. Insgesamt erkrankten in der keimfreien
Haltung 74 % aller Ratten im Laufe ihres Lebens. In der SPF4 erkrankten 79 % der
Gesamtpopulation und in der SPF3 waren es 99 %. Vergleichend zwischen männlichen und
weiblichen
Tieren
zeigten
sich
keine
signifikanten
Unterschiede
in
der
Erkrankungshäufigkeit.
Abbildung 8: Prävalenz der Erkrankungen der LEW-Rag1 Tiere
An der schwarzen Linie ist jeweils die Abnahme des Anteils der gesunden Tiere mit zunehmendem Alter an der
Population zu erkennen. Die graue Linie zeigt die Zunahme der kranken Tiere als gegenteiligen Effekt.
(n=43-131)
Erste Symptome zeigten sich bei den betroffenen Ratten meistens mit einem Alter von 7 bis
14 Lebenswochen. Im Durchschnitt lag das Maximum der Neuerkrankungen bei den Tieren
aus der SPF3 zeitlich vor den anderen beiden Haltungseinrichtungen. Hier erkrankten 62,9 %
der Tiere zwischen der 7. und 9. Lebenswoche. Bei den keimfreien Tieren erkrankten im
Gegensatz dazu nur 25,6 % in diesem Zeitraum. Der Großteil erkrankte später, in der 10.-12.
Lebenswoche (34,8 %). Die Ratten der SPF4 zeigten mit 30,3 % (7.-9. LW) und 28,9 % (1012 LW) ein ähnliches Bild. Die Kurvenverläufe der beiden letztgenannten Haltungen
gestalten sich in diesem Fall etwas flacher als der Verlauf der Neuerkrankungen der Gruppe
SPF3. Die Verteilungen der Neuerkrankungen pro Lebenswoche sind für alle drei Gruppen in
Abbildung 9 dargestellt.
39
4 Ergebnisse
Abbildung 9: Inzidenz der klinischen Symptome bei den LEWRag1 Ratten
Dargestellt sind die Häufigkeiten der Neuerkrankungen pro
Lebenswoche in Prozent. Hierbei zeigt sich, dass der Großteil der
Tiere in der SPF3 deutlich früher erkrankt als in den anderen beiden
Haltungen. (n=43-131)
40
Verdickte Alveolen
Peribronchioläre Infiltrationen von Lymphozyten und
Granulozyten
Einblutungen
Lappenspitzen dunkel verfärbt
Dunkel verfärbte Bereiche über gesamtes Organ
Atelektatisches Gewebe
Helle Stippen über gesamtes Organ verteilt
-
-
Vergrößert / verkleinert
Dilatiert / sehr klein und fest
Schlecht gefüllt, schaumiger Inhalt, derbe Wand
Vergrößert / verkleinert
Sehr klein, schlecht abgegrenzt
Haut
Lunge
Herz
Leber
Milz
Magen
Darm
Lymphknoten
Thymus
41
Hyperkeratose
Infiltrationen von Mastzellen, Granulozyten und
Lymphozyten
Degenerierte Haarfollikel
Rötung
Lichtes Fell
Schorf/ Krusten
Schuppen
Kompartimentierung fehlt
Zellarm
Infiltrationen von Mastzellen und Granulozyten
Infiltration der Zotten, Krypten und Muskelschichten mit
Lymphozyten und Granulozyten
Infiltrationen der Mukosa, Submukosa und Muskelschicht
mit Lymphozyten und Granulozyten
Keine Unterscheidung von Roter und Weißer Pulpa
möglich
Mononukleäre Zellinfiltrate um die Gallengänge herum
Mononukleäre Zellinfiltrationen des Myokards
Bindegewebig durchsetzt/ fibrotisch
Infiltate von Lymphozyten, Granulozyten und Mastzellen
Speicheldrüsen
Histologisch
Lymphknoten dunkel/ blutgefüllt
Nasses/ verklebtes Fell an Kinn, Hals, Brust,
Vorderbeinen
Makroskopisch
Tabelle 9: Zusammenfassung aller beobachteten Symptome
4 Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1.1.1 Wachstum
Zusätzlich zur Dokumentation des Krankheitsverlaufes fand eine Dokumentation der
Gewichtsentwicklung gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten statt, um eine Aussage über
eventuelle Störungen in der Entwicklung und im Wachstum treffen zu können. Die
Gewichtsverläufe gesunder und kranker Tiere sind für Böcke und Weibchen getrennt in
Abbildung 10 dargestellt. Bei der Betrachtung der männlichen Tiere zeigt sich ein deutlich
niedrigeres Niveau der Verlaufskurve der kranken Tiere. Sowohl die gesunden LEW-Rag1
Männchen als auch die gesunden und kranken LEW-Rag1 Weibchen nähern sich der
Gewichtskurve der LEW Kontrolltiere an.
Abbildung 10: Gewichtsverläufe
Dargestellt sind die durchschnittlichen Körpergewichte von LEW und LEW-Rag1 Ratten in unterschiedlichen
Altersgruppen. (n=3-20)
4.1.1.2 Reproduktionsparameter
Durch den Vergleich verschiedener Parameter wie Wurfgröße, Anzahl abgesetzter Jungtiere,
Zwischenwurfzeiten und der Wurfanzahl pro Weibchen können Rückschlüsse im Hinblick auf
die Fruchtbarkeit und Zuchtleistung eines Stammes gezogen werden. Alle im Folgenden
dargestellten Ergebnisse beziehen sich auf Dauerverpaarungen eines Bockes mit einem
Weibchen. Die Größe der Würfe lag sowohl bei den LEW Ratten als auch bei den LEW-Rag1
Tieren zwischen 3-11 Jungtieren pro Wurf. Zudem weisen die durchschnittlichen
Jungtierzahlen dieser beiden Stämme keine signifikanten Unterschiede auf. Ähnlich verhält es
sich auch mit den durchschnittlichen Zwischenwurfzeiten der Weibchen dieser beiden
Stämme. Sie umfassen hauptsächlich einen Zeitraum von 25 bis 60 Tagen, wobei die
durchschnittlichen Zwischenwurfzeiten der LEW Weibchen mit 51 Tagen tendenziell etwas
42
4 Ergebnisse
höher sind, als die der LEW-Rag1 Ratten mit 43 Tagen. Betrachtet man all diese Parameter
einzeln für sich, dann zeigen sich die größten Unterschiede in der Anzahl der Würfe, die ein
Weibchen im Laufe ihres Lebens zur Welt bringt. Eine LEW-Rag1 Ratte bringt
durchschnittlich 0,9-1,9 (Max. 3,4) Würfe zur Welt, eine LEW Ratte dagegen 2,7 (Max. 4,4).
In der SPF3 erreicht zudem ein deutlich geringerer Anteil der Jungtiere das Absetzalter von
ca. 21 Tagen als in den drei anderen Zuchtpopulationen. Die Daten aller erhobenen
Reproduktionsparameter sind in Tabelle 21 im Anhang aufgelistet. Um all diese Parameter
standardisiert darstellen und vergleichen zu können, wurde zusätzlich der „Colony Index“
(CI) für die Zeitspanne eines Kalenderjahres für jede Population berechnet (Absetzer pro
Weibchen pro Woche). Das Ergebnis ist in Abbildung 11 dargestellt. Standardisiert
betrachtet, zeigt sich hier, dass, alle LEW-Rag1 Populationen zusammengenommen, diese
einen deutlich geringeren CI als LEW aufweisen. Betrachtet man jede Haltungseinheit für
sich, fällt auf, dass die Tiere, welche in der SPF3 gehalten werden, die wenigsten Absetzer
pro Weibchen in einer Woche produzieren, gefolgt von den keimfrei Gehaltenen im Isolator.
Die Colony Indizes der LEW Ratten und der Ratten aus der SPF4 Haltung gleichen sich.
Abbildung 11: Colony Index
Das arithmetische Mittel der Colony Indizes der LEW-Rag1
Ratten liegt mit 0,17 deutlich unter dem CI der LEW Ratten
mit 0,26. (n=12-32)
43
4 Ergebnisse
4.1.2 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome an den Organen
Es wurden gesunde und erkrankte LEW-Rag1 Tiere unterschiedlicher Altersgruppen seziert
und ihre Organe hinsichtlich ihrer Morphologie (Größe, Farbe, Konsistenz) beurteilt.
Vorrangig traten besonders häufig Veränderungen an den Organen des Immunsystems auf,
aber auch häufig an der Lunge, seltener am Gastrointestinaltrakt und den Speicheldrüsen.
Bei augenscheinlich gesunden LEW-Rag1 Tieren erschienen die peripheren Lymphknoten
meist hell und deutlich kleiner als bei den Kontrolltieren. Die Mesenteriallymphknoten waren
bräunlich und auch kleiner als die der Kontrolltiere. Besonders kleine Lymphknoten, mit
Durchmessern von teilweise weniger als 1 mm, kamen bei den keimfreien Tieren vor.
Erkrankte LEW-Rag1 Ratten aller Haltungseinheiten dagegen wiesen eher deutlich größere
Lymphknoten als LEW auf. Ihre Farbe variierte zwischen hell, gelblich, bräunlich und rötlich.
Teilweise waren sie von derber Konsistenz oder zeigten eine höckerige Struktur.
Deutliche makroskopische Veränderungen, wie eine höckerige Oberfläche, Verfärbungen
oder eine abnorme Größe wiesen 27 % der beurteilten Milzen von Tieren aus der SPF3 auf.
Die Tiere aus den Isolatoren und der SPF4 zeigten solche Symptome nur in 5-6 % aller Fälle.
Da in vielen Studien zum humanen Omenn Syndrom eine Hepatosplenomegalie bei den
Patienten beschrieben wird, wurden die Gewichte der Lebern und Milzen von gesunden und
kranken Tieren aufgenommen und in Relation zu ihrem Körpergewicht gesetzt. Im Vergleich
mit den Werten von LEW konnte daraus gefolgert werden, dass die LEW-Rag1 Ratten im
Gesamtdurchschnitt keine Splenomegalie sowie keine Hepatomegalie zeigen.
44
4 Ergebnisse
Abbildung 12: Gewichte der Lebern und Milzen der LEW und LEW-Rag1 Ratten in Relation zu
deren Körpergewicht
Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Somit weisen die LEW-Rag1 Ratten keine
Hepatosplenomegalie auf. (n=10-83)
Durchtrennt man während der Sektion die Rippen und entfernt das Brustbein, hat man einen
freien Blick auf die Brusthöhle, an deren oberer Begrenzung über dem Herzen der Thymus
liegt. Dieses für die T-Zell Reifung essentielle Organ ist bei sehr jungen Tieren am größten
ausgeprägt und verringert seine Größe im Laufe des Lebens. Bei LEW Ratten ist er noch bis
in die Adoleszenz hinein klar erkennbar. Die LEW-Rag1 Ratten dagegen weisen an dieser
Stelle schon in jungen Jahren nur einen sehr kleinen Gewebsanteil auf, welcher optisch nicht
klar vom umliegenden Fettgewebe abgegrenzt werden kann.
Bei Tieren, die vor der Sektion eine gerötete Haut aufwiesen, zeigten sich deutlich injizierte
Unterhautgefäße und teilweise erschien die Haut leicht derb. Auch angrenzende
Lymphknoten waren häufig mit in das Geschehen involviert. Ein anderes, relativ häufig von
makroskopischen Veränderungen betroffenes Organ, war die Lunge. Hier zeigten sich bei
rund 17 % aller sezierten LEW-Rag1 Tiere braun-rote, dunkle Veränderungen der
Lungenlappen. Diese traten vor allem an den Lappenspitzen auf.
4.2 Histologische Befunde
Zusätzlich zur adspektorischen Untersuchung und Beurteilung der Tiere wurden histologische
Proben zahlreicher Organe genommen. Wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt ist,
wurden hierfür verschiede Gruppen mit vergleichbarer Tierzahl zusammengestellt, um die
45
4 Ergebnisse
Ergebnisse miteinander vergleichen zu können. Die Zahlen beschreiben die jeweilige
Gruppengröße (n).
Tabelle 10: Gruppenzusammensetzung für die histologischen Untersuchungen
LEW-Rag1
LEW
Alter
< 60 Tage
60-120 Tage
> 120 Tage
4
6
4
KF
7
6
5
gesund
SPF3
5
3
5
SPF4
5
5
5
KF
4
5
7
krank
SPF3
5
5
5
SPF4
5
6
6
4.2.1 Histologische Befunde an den Organen des Immunsystems
Makroskopisch deutete sich bereits an, dass der Thymus der LEW-Rag1 Ratten nur in sehr
geringer Größe vorhanden ist. Im histologischen Schnitt präsentierten sich vereinzelte
Thymusanteile, eingebettet in Fett- und Bindegewebe. Mengenmäßig dominierte letzteres
deutlich. Zusätzlich konnte nicht bei jedem Tier ein Teil des Thymus heraus präpariert
werden, beziehungsweise wurde nicht bei jedem Tier ein Teil des Thymus angeschnitten. In
den beurteilbaren Präparaten zeigte sich durchweg das gleiche, in Abbildung 14 dargestellte
Bild: Anteile rudimentären Thymusgewebes, dem der physiologische Organaufbau in großen
Teilen fehlt. Während die lobuläre Struktur dieses Organs noch deutlich zu erkennen ist, fehlt
die Läppchengliederung in Cortex und Medulla vollständig. Der gesamte Thymus erscheint
einheitlich und beherbergt größtenteils mononukleäre Zellen, welche einen deutlich helleren,
größeren und aufgelockerten Zellkern aufweisen als vergleichbare Lymphozyten in den
Thymi der LEW Kontrolltiere. Zusätzlich lassen sich in einigen Thymusrudimenten der
LEW-Rag1 Ratten vermehrt Mastzellen finden.
Auch die Milzen der Rag1 defizienten Tiere bieten auf den ersten Blick ein sehr homogenes
Bild (Abb. 14). Es hat den Anschein, als seien weiße und rote Pulpa nicht klar voneinander
abgegrenzt, sondern vermischt. Milzfollikel mit ihrem klassischen Aufbau aus Marginalzone,
Marginalsinus
und
periarteriolärer
lymphatischer
Scheide
(PALS)
rund
um
die
Trabekelarterien und -arteriolen sind nicht zu erkennen. Eine weitere Beobachtung stellt die
häufige diffuse Infiltration des Organs mit polymorphkernigen Zellen (Granulozyten) dar.
46
4 Ergebnisse
Dieser Befund erstreckt sich von geringgradig bis äußerst hochgradig und kann bei keinem
einzigen Kontrolltier nachgewiesen werden. Unterschiede zwischen kranken und gesunden
LEW-Rag1 Tieren zeigen sich in dieser Hinsicht nicht, jedoch unterscheiden sich die
einzelnen Haltungseinrichtungen in der Ausprägung dieses Symptoms voneinander. Während
53 % der keimfreien Tiere in dieser Hinsicht unauffällige Milzen aufweisen, sind es bei den
Tieren aus der SPF4 nur 30 %. Tiere der SPF3 zeigten nur zu 10 % nicht infiltrierte Milzen,
der restliche Anteil war mindestens geringgradig betroffen (Abb. 13).
Abbildung 13: Entzündungszellinfiltrationen der Milzen von LEW und LEW-Rag1 Ratten
LEW Ratten waren von diesem Befund ausnahmslos nicht betroffen.
Kruskal-Wallis-Test: P=0,0109 (n=14-95)
Exemplarisch für die peripheren Lymphknoten des Körpers wurden in dieser Studie die Lnn.
mandibulares
histologisch
beurteilt.
Zudem
fand
eine
Beurteilung
der
Mesenteriallymphknoten statt. Während sich die Lymphknoten dieser beiden Lokalisationen,
wie in Kapitel 4.1.2 beschrieben, makroskopisch zum Teil deutlich unterscheiden, zeigen sie
unter dem Mikroskop doch ein eher einheitliches Bild. Ähnlich den anderen lymphatischen
Organen fehlt auch den Lymphknoten der LEW-Rag1 Tiere ihre organtypische Struktur (Abb.
14).
47
4 Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
G
H
48
4 Ergebnisse
I
J
K
L
M
N
Abbildung 14: Pathohistologische Veränderungen der Organe des Immunsystems
A, B: Thymus LEW. Cortex und Medulla sind deutlich voneinander abgrenzbar; C, D: Thymus LEW-Rag1. Die
organtypische Kompartimentierung fehlt und die Zellkerne der Thymozyten erscheinen deutlich größer und
weniger chromatindicht; E, F: Milz LEW; G, H: Milz LEW-Rag1. Es ist keine Unterscheidung von roter und
weißer Milzpulpa möglich und es sind keine PALS sichtbar. Die Milz ist mit Entzündungszellen infiltriert; I, J:
Mesenteriallymphknoten LEW; K-N: Mesenteriallymphknoten LEW-Rag1. Diese sind deutlich zellärmer und
zeigen Infiltrationen mit Mastzellen (N) und Granulozyten (M) und Hämosiderineinlagerungen (K, L).
49
4 Ergebnisse
Erkennbar sind eine Kapsel mit ins Parenchym ziehenden Trabekeln und teilweise Strukturen
eines Marksinus. Übergänge von Cortex, Paracortex und Medulla sind kaum (nicht)
erkennbar und auch Sekundärfollikel fehlen. Bei einzelnen Tieren treten zusätzlich
nekrotische Areale auf. Insgesamt erscheinen die Lymphknoten eher zellarm, mit wenigen
Lymphozyten und vielen leeren, vakuoligen Bereichen. Teilweise fallen Infiltrationen von
Mastzellen und Hämosiderineinlagerungen auf, häufig sind die Lymphknoten mit
Entzündungszellen (Granulozyten) infiltriert. Wie in Kapitel 4.1.2 beschrieben, wurden eine
deutliche
Organvergrößerung,
eine
Mastozytose,
Nekrose,
verstärkte
Hämosiderineinlagerungen und die Infiltration mit Entzündungszellen in einem Score
berücksichtigt. Das Ergebnis ist in Abbildung 15 dargestellt. Dort sieht man, dass sich die
Mesenteriallymphknoten von LEW-Rag1 sehr deutlich von LEW Ratten unterscheiden. Die
wenigen erhöhten Werte der Kontrolltiere sind hierbei auf einzelne geringgradig vergrößerte
Lymphknoten zurückzuführen oder auf eine geringgradige Infiltration mit Mastzellen.
Betrachtet man die einzelnen Haltungseinrichtungen untereinander, zeigen sich keine
signifikanten Unterschiede. Auch die Lymphknoten der als erkrankt eingestuften LEW-Rag1
Ratten weisen im Hinblick auf die Schwere der Veränderungen keine signifikanten
Unterschiede zu ihren gesunden Gegenspielern auf. Eine Ausnahme bilden hier die
keimfreien Tiere. Bei ihnen weisen die Lymphknoten der gesunden Tiere signifikant
schwächere Veränderungen auf als die Lymphknoten der Erkrankten (P=0,04).
Abbildung
15:
Histologischer
Vergleich
der
Lymphknotenmorphologie von LEW und LEW-Rag1
Ratten
(n=14-92)
50
4 Ergebnisse
4.2.2 Histologische Befunde am Gastrointestinaltrakt
Alle vier Abschnitte des Magen-Darm-Traktes (Magen, Dünndarm, Zäkum, Dickdarm) der
LEW-Rag1 Ratten zeigen Infiltrationen mit Entzündungszellen, teilweise in unterschiedlich
starker Ausprägung (Abb. 16 und Abb. 17). Es kommen sowohl mononukleäre Zellen als
auch polymorphkernige Zellen vor, deren Infiltrationen sich von der Tunica mucosa
ausgehend bis in die Tunica muscularis der Organwand erstrecken können. In sehr schweren
Einzelfällen wurde ein Darmwanddurchbruch mit Peritonitis festgestellt. Nach dem Scoring
aller vier Abschnitte des Magen-Darm-Traktes sieht man deutliche Unterschiede zwischen
den LEW und LEW-Rag1 Ratten. Magen und Darm der LEW-Rag1 Tiere sind signifikant
stärker mit Entzündungszellen infiltriert, als die Kontrollgruppe. Am deutlichsten ist dieser
Unterschied an den Mägen zu beobachten.
Abbildung 16: Vergleich der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt von LEW
und LEW-Rag1 Ratten
(LEW n=13-14; LEW-Rag1 n=103-108)
51
4 Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abbildung 17: Pathohistologische Befunde am Magen-Darm-Trakt der LEW-Rag1 Ratten
A: Übergang von Mukosa zu Submukosa bei dem Magen einer LEW Ratte; B: Infiltrierte Schichten des
Drüsenmagens einer LEW-Rag1 Ratte; C, D: Gesunder Dünndarm einer LEW Ratte. E, F: Stark mit
Entzündungszellen infiltrierter Dünndarm einer LEW-Rag1 Ratte.
52
4 Ergebnisse
Zusätzlich lässt sich zwischen den gesunden und kranken LEW-Rag1 Tieren die Tendenz
erkennen, dass die Verdauungsorgane der gesunden Tiere weniger stark infiltriert sind als die
der erkrankten. Diese Aussage stellt sich aber nur in Einzelfällen signifikant dar. Ein weiterer
Unterschied zeigt sich in den Daten der verschiedenen Haltungseinheiten. In allen drei
Haltungseinrichtungen der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden sich die Mediane der gescorten
Veränderungen signifikant. In den Mägen und Dünndärmen ist dies am stärksten der Fall.
Zusätzlich ist konstant die SPF3 Haltung am stärksten betroffen (Abb. 18).
Abbildung 18: Haltungsabhängigkeit der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt der
LEW-Rag1 Ratten
Die Organe der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 sind am stärksten verändert.
Kruskal-Wallis Test: Magen: P<0,0001; Dünndarm: P<0,0001; Zäkum: ns; Dickdarm: P=0,0069. (n=27-35)
53
4 Ergebnisse
4.2.3 Histologische Befunde an der Leber
In Abbildung 19 ist zu sehen, dass Infiltrationen um die Gallengänge herum, vor allem mit
mononukleären Zellen, die einzigen Veränderungen der Lebern der LEW-Rag1 Ratten bilden.
Dazu gesellen sich in schwereren Verläufen auch Granulozyten und die Infiltrationen dehnen
sich zudem in perivaskuläre Bereiche aus. Es sind 71 % der LEW-Rag1 Lebern von diesem
Symptom betroffen, wiederum 30 % davon zeigen mittelgradige bis hochgradige
Veränderungen dieses Typs. Im Gegensatz dazu weisen lediglich 20 % der Lebern der LEW
Tiere geringgradige periductuläre Infiltrationen mononukleärer Zellen auf.
4.2.4 Histologische Befunde am Herzen
Einige wenige Herzen der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden sich im histologischen Bild
deutlich von denen der LEW Ratten. Hier fallen die typischen Zellinfiltrationen mit zwei
unterschiedlichen Zelltypen (mononukleär, polymorphkernig) im Kammermyokard sowie im
Myokard der Vorhöfe auf (Abb. 19). Von den LEW-Rag1 Tieren zeigen 11 % solche
Veränderungen, viele davon mindestens mittelgradig. Dagegen war lediglich bei einem
Kontrolltier solch eine Veränderung in milder Ausprägung zu beobachten. Der
Gesundheitszustand der Tiere, die nur diese Veränderungen aufwiesen, war unauffällig.
4.2.5 Histologische Befunde an der Haut
Die Haut der LEW-Rag1 Tiere erscheint nicht nur makroskopisch deutlich verändert sondern,
wie in Abbildung 21 zu sehen ist, auch histologisch. Im H&E-Schnitt sind Zellinfiltrationen
der Epidermis, des Coriums und der darunter liegenden Subkutis zu finden sowie
Hyperkeratosen und Erosionen, die sich in seltenen Fällen bis zu einer Ulzeration ausbreiten
können. Hauptsächlich sind hier mononukleäre Zellen und Mastzellen erkennbar, seltener
Granulozyten. Wie in Abbildung 20 zu erkennen ist, hat der Gesundheitszustand der LEWRag1 Tiere einen großen Einfluss auf die Stärke der Symptome. Als gesund eingestufte Tiere
sind zum einen sehr viel seltener betroffen, zum anderen fallen ihre Veränderungen deutlich
milder aus. Unter den Bauchhautproben der gesunden LEW-Rag1 Ratten weisen 17 % der
Proben mehr als geringgradige Infiltrationen auf, wohingegen 68 % der kranken Tiere
54
4 Ergebnisse
mindestens mittelgradig betroffen sind. Die Haltungseinheit hat sowohl bei erkrankten als
auch bei gesunden Tieren keinen Einfluss auf die Symptomstärke (Abb. 20).
A
B
C
D
E
F
Abbildung 19: Pathohistologische Veränderungen der Leber und des Herzens der LEW-Rag1 Ratten
A, B: Physiologische Leber einer LEW Ratte; C, D: Entzündungszellinfiltrationen im Bereich der Gallengänge
(LEW-Rag1); E: Unverändertes Herz (LEW); F: Infiltration des Kammermyokards mit Lymphozyten bei einer
LEW-Rag1 Ratte.
55
4 Ergebnisse
Abbildung 20: Einfluss des Gesundheitszustands und der Haltungseinheit auf den histologischen Score
der Haut bei LEW-Rag1 Ratten im Vergleich zu LEW Kontrolltieren
Nur 17 % der gesunden LEW-Rag1 Ratten weisen mittelgradig bis hochgradig veränderte Hautproben auf. Bei
den erkrankten Ratten sind es dagegen 68 % mit mittelgradigen bis hochgradigen Veränderungen.
Die Unterschiede zwischen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Tieren sind für jede Haltungseinheit
signifikant. (n=14-17)
56
4 Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abbildung 21: Pathohistologische Veränderungen der Speicheldrüsen und der Haut
A: Gesunde Glandula parotis und regionaler Lymphknoten einer LEW Ratte. B: Fibrotisch umgebaute,
hochgradig mit Mastzellen infiltrierte Speicheldrüse einer LEW-Rag1 Ratte. C: Glandula parotis einer LEWRag1 Ratte mit mittelgradigen Lymphozyten- und Mastzellinfiltrationen im Bindegewebe. D: Gesunder
Bauchhautabschnitt einer LEW Ratte. E, F: Hochgradig mit Entzündungszellen infiltrierte Haut einer LEWRag1 Ratte. Zusätzlich sind eine verdickte Epidermis und eine geringgradige Hyperkeratose zu sehen.
57
4 Ergebnisse
4.2.6 Histologische Befunde an den Speicheldrüsen
Die Speicheldrüsen vieler LEW-Rag1 Ratten zeigen Veränderungen, welche bei LEW nicht,
bzw. nur in wenigen Fällen schwach zu sehen sind. Die Veränderungen sind bedingt durch
lokale bis diffuse Infiltrationen des Bindegewebes und des Drüsengewebes mit Mastzellen,
Granulozyten und mononukleären Zellen, welche teilweise sogar einen fibrotischen Umbau
des Gewebes nach sich ziehen. Zugleich sind auch die Unterkieferlymphknoten in direkter
Organnachbarschaft verändert (Abb. 21). Ihr Bild gleicht dem in Kapitel 4.2.1 beschriebenen
Symptomkomplex der Mesenteriallymphknoten. Häufig sind, besonders in schwereren Fällen,
alle drei Speicheldrüsenanteile betroffen. Ist jedoch nur ein Anteil betroffen, handelt es sich
immer um die Glandula parotis oder die Glandula sublingualis. In den Bewertungsscore
flossen sowohl die Zellinfiltrationen und der fibrotische Umbau des Drüsengewebes als auch
die Veränderungen der Lymphknoten mit ein. Bei einem maximal erreichbaren Score von 9
erreichen die LEW Tiere (n=14) durchschnittlich einen Wert von 0,3, wobei ein Tier mit einer
2 bewertet wurde und zwei Tiere mit einer 1. LEW-Rag1 Tiere dagegen erreichten einen
Durchschnittswert von 3,0 mit Höchstwerten bis zu 9. Hier zeigt sich ein signifikanter
Unterschied zwischen den beiden Stämmen (P<0,0001). Die Werte gesunder und erkrankter
Tiere der einzelnen Haltungseinrichtungen unterscheiden sich nicht signifikant voneinander,
jedoch ist ein Trend dahingehend erkennbar, dass als krank eingestufte Tiere leicht höhere
Werte aufweisen als klinisch unauffällige Tiere. Zudem weisen die Speicheldrüsen der
erkrankten LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 signifikant höhere Scores auf als die der anderen
beiden Haltungen (Abb. 22).
58
4 Ergebnisse
Abbildung 22: Histologische Unterschiede der Speicheldrüsen von LEW-Rag1 Ratten verschiedener
Haltungen
Erkrankte Ratten aus der SPF3 Haltung erreichen signifikant höhere Scorewerte als Ratten der anderen
beiden Haltungen.
Kruskal-Wallis Test: P=0,0016 (n=12-19)
4.2.7 Histologische Befunde an der Lunge
Zu einem der am deutlichsten sowohl makroskopisch als auch histologisch veränderten
Organe zählt die Lunge der LEW-Rag1 Ratte. Zusätzlich zu den in vielen Organen präsenten
Entzündungszellinfiltrationen
kommen
hier
verdickte
Alveolarwände
bis
hin
zu
atelektatischem Gewebe, vermehrte Mukusansammlungen und eine erhöhte Anzahl an
Herzfehlerzellen vor. Der vermehrt vorzufindende Mukus, beruhend auf einer Hyperplasie der
Clarazellen, in Alveolen und Bronchioli wurde zusätzlich zum H&E Schnitt auch mittels
PAS-Färbung nachgewiesen. Die Zellinfiltrationen bestehen aus mononukleären Zellen und
Granulozyten und befinden sich vorrangig multifokal im peribronchialen Gewebe, wo sie bei
ausreichender Anzahl auch zum Untergang der alveolären Struktur des Lungengewebes
führen (Abb. 24). Über ein geringgradiges Infiltrationsstadium hinausgehend sind auch
perivaskuläre Infiltrationen anzutreffen, die sich in das restliche Lungengewebe ausbreiten
und dort zu einer Verdickung der Alveolarwände führen. In diesem Stadium sind zudem auch
mehrkernige Riesenzellen im Parenchym vorhanden. Innerhalb der Alveolen sind bei
betroffenen Lungen zusätzlich vermehrt Alveolarmakrophagen zu beobachten. Während sich
die Scores der LEW Ratten signifikant von denen der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden (Abb.
23), zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den LEW-Rag1 Ratten in den
59
4 Ergebnisse
verschiedenen Haltungen. Tendenziell sind aber die keimfrei gehaltenen LEW-Rag1 Ratten
weniger stark betroffen als die Tiere der SPF3 und der SPF4 Haltung. Dagegen ergeben sich
zwischen den gesunden und erkrankten Tieren aller drei Haltungen deutliche Unterschiede,
wie in Abbildung 23 zu sehen ist. Die Lungen der klinisch kranken Tiere erreichen hier einen
signifikant höheren Gesamtscore als die Gesunden.
Abbildung 23: Vergleich der Lungen gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen
Haltungseinheiten
Kranke LEW-Rag1 Ratten sind signifikant stärker betroffen als gesunde. (n=13-18)
4.2.8 Histologische Befunde an den heterozygoten Merkmalsträgern
Die Ergebnisse der histologischen Auswertung der Organe der heterozygoten Merkmalsträger
(LEW-Rag1+/-) ergab keine Unterschiede zu den LEW Ratten (Abb. 25). Deshalb wurden sie
in den vorangegangenen Kapiteln nicht explizit erwähnt, in der Endzusammenfassung sind sie
jedoch der Vollständigkeit halber mit aufgeführt (Kap. 4.2.9).
60
4 Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abbildung 24: Histologische Präparate der Lungen von LEW und LEW-Rag1 Ratten
A, B: Übersicht der Lunge mit Alveolen und einem Bronchus (LEW); C-F: Ausschnitte der Lungen
verschiedener LEW-Rag1 Ratten. Zu sehen sind peribronchioläre Infiltrationen mit Lymphozyten (D),
Granulozyten (E), eine mehrkernige Riesenzelle (E) und ein vermehrtes Vorkommen von
Alveolarmakrophagen (F).
61
4 Ergebnisse
4.2.9 Gesamtergebnis der histologischen Auswertung
Zusammenfassend stellt sich dar, dass alle in den vorherigen Kapiteln aufgelisteten Organe
der LEW-Rag1 Ratten Veränderungen zu Tieren des LEW Stammes aufweisen. Es gibt
sowohl histologische Unterschiede zwischen gesunden und als krank eingestuften LEW-Rag1
Ratten als auch zwischen LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinrichtungen. Diese sind
aber von Organ zu Organ unterschiedlich. Eine Altersabhängigkeit der Stärke der Symptome
wurde auch untersucht, führte allerdings zu keinem aussagekräftigen Ergebnis. Zum
Abschluss wurden alle beurteilten und gescorten histologisch sichtbaren pathologischen
Veränderungen addiert und ihre Summen zu einem Endergebnis, welches in Abbildung 25
und 26 dargestellt ist, zusammengefasst. Sowohl die Gesamtscores der gesunden LEW-Rag1
Ratten als auch die der kranken Ratten weisen signifikant höhere Werte als die LEW Tiere
auf. Zudem unterscheiden sich die Werte der gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten
untereinander deutlich. Auch beim Vergleich der Haltungen in Bezug auf den
Gesundheitsstatus der LEW-Rag1 Tiere sind Unterschiede festzustellen. Sowohl in der
Gruppe der Gesunden als auch in der Gruppe der Kranken unterscheiden sich die
Gesamtscores der Tiere in der SPF4 nicht signifikant von denen der keimfreien Tiere. Im
Gegensatz dazu gibt es zum einen signifikante Unterschiede zwischen den gesunden Tieren in
der keimfreien Haltung und der SPF3 und den gesunden Tieren der SPF4 und der SPF3 und
zum
anderen
signifikante
Unterschiede
zwischen
den
erkrankten
Tieren
dieser
Haltungseinrichtungen. Die Organe der LEW-Rag1 Ratten in der SPF3 weisen
zusammengefasst deutlich stärkere pathologische Veränderungen auf, als die in den beiden
anderen Hygieneeinheiten gehaltenen Tiere (Abb. 26).
62
4 Ergebnisse
Abbildung 25: Vergleich der histologischen Scores gesunder
und erkrankter LEW-Rag1 Ratten mit LEW und LEWRag1 +/- Ratten
Kruskal-Wallis Test: P<0,0001
(LEW/LEW-Rag1+/-: n=8-14; LEW-Rag1: n=47-49)
Abbildung 26: Vergleich der histologischen Scores erkrankter und gesunder LEW-Rag1 Ratten in
verschiedenen Haltungseinheiten
Die LEW-Rag1 Tiere der SPF3 sind sowohl unter den gesunden Tieren als auch unter den kranken Tieren am
stärksten betroffen.
Kruskal-Wallis Test: LEW-Rag1 gesund: P=0,0054; LEW-Rag1 krank: P=0,0006. (n=13-19)
63
4 Ergebnisse
Um die Validität der Gruppeneinteilung in „gesund“ und „krank“ zu überprüfen, wurden auch
die adspektorisch erkennbaren klinischen Symptome mittels eines Scores beurteilt, um
darauffolgend eine Korrelationsanalyse der histologischen Werte mit den adspektorischen
Werten durchzuführen. Abbildung 27 zeigt die subjektiv festgestellte Krankheitsstärke der
einzelnen Tiere, wobei sich nur die als krank eingestuften LEW-Rag1 Ratten signifikant von
den anderen Gruppen unterscheiden. Die Rang-Korrelationsanalyse nach Spearman ergibt
einen Korrelationskoeffizienten mit einer deutlichen Effektstärke von 0,579. Das bedeutet, die
erhobenen Daten korrelieren positiv miteinander, allerdings, wie bei subjektiver
adspektorischer Beurteilung nicht anders zu erwarten, nicht perfekt.
Abbildung 27: Subjektive Krankheitsstärke
Kruskal-Wallis Test: P<0,0001
(LEW/LEW-Rag1+/-: n=8-14; LEW-Rag1: n=47-49)
4.3 Blut- und Serumanalysen
4.3.1 Kleines und Großes Blutbild
Die Analyse der Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten im Rahmen eines kleinen und
großen Blutbildes ergab folgende Ergebnisse: Die Leukozytenanzahl der LEW-Rag1 Ratten
unterscheidet sich in allen drei Haltungseinheiten von der Leukozytenanzahl der LEW Tiere.
64
4 Ergebnisse
In der Summe gleichvieler untersuchter gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Tiere liegt die
Zahl der weißen Blutkörperchen der keimfreien Tiere und der Tiere aus der SPF4 deutlich
unter den Werten der LEW Ratten, bei den LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 verhält es sich
dagegen nicht so. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen dieser Ratten ist leicht erhöht.
Betrachtet man in Abbildung 28 die gesunde und kranke Gruppe der LEW-Rag1 Ratten
einzeln und vergleicht sie mit den Werten der Kontrolltiere, kann man weitere Unterschiede
feststellen. Die Leukozytenzahlen der gesunden Tiere sind deutlich niedriger als die der
kranken. In der SPF4 und der keimfreien Haltung unterscheiden sich zudem die Werte der
gesunden LEW-Rag1 Ratten signifikant von den Werten der LEW Tiere, wohingegen bei
LEW-Rag1 Tieren der SPF3 die Anzahl der weißen Blutkörperchen der erkrankten Tiere
signifikant höher liegt als die Werte der LEW Ratten vorgeben. Vergleicht man schließlich
die gesunden und kranken immundefizienten Tiere im Hinblick auf die unterschiedlichen
Haltungseinheiten miteinander, so kommt man zu dem Schluss, dass die Werte der gesunden
und kranken LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 signifikant höher liegen als die der anderen
beiden Einheiten (Abb. 28A).
65
4 Ergebnisse
Abbildung 28: Vergleich der Anzahl der Leukozyten im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten
Die Leukozytenanzahl im Blut unterscheidet sich deutlich zwischen LEW und LEW-Rag1 Tieren und zwischen
LEW-Rag1 Tieren verschiedener Haltungen. Gesunde LEW-Rag1 Ratten besitzen eine signifikant geringere
Anzahl an Leukozyten im Blut als erkrankte.
ANOVA: A: P<0,0001, P<0,0001; B: P=0,0001, P=0,0004, P=0,0030. (n=15-29)
Andere erhobene Parameter an den Blutproben der LEW-Rag1 Ratten, wie die Anzahl der
Erythrozyten, der Hämatokrit und die Anzahl der Thrombozyten, zeigten weder im Hinblick
auf die Haltung oder den Gesundheitszustand noch im Vergleich zu den LEW Kontrolltieren
Unterschiede.
Die Betrachtung der Differenzialblutbilder der einzelnen Tiere zeigt weitere Unterschiede der
beiden Stämme auf. LEW-Rag1 Ratten besitzen anteilig unter den weißen Blutzellen deutlich
weniger Lymphozyten und deutlich mehr neutrophile und eosinophile Granulozyten als LEW
Ratten (Abb. 29). Zudem weisen ihre Werte eine deutlich größere Streuung auf. Das
Vorkommen weiterer weißer Blutkörperchen, wie basophile Granulozyten und Monozyten, ist
im Vergleich zu den Kontrolltieren nicht verändert. Vergleicht man die gesunde Gruppe der
LEW-Rag1 Ratten mit der Kranken, so zeigt sich, dass erkrankte Tiere einen signifikant
geringeren Anteil an Lymphozyten im Blut aufweisen als gesunde. Bei den neutrophilen
66
4 Ergebnisse
Granulozyten stellt sich dieses Phänomen genau anders herum dar. Diese Zellgruppe ist bei
erkrankten Tieren vermehrt im Blut vorzufinden (Abb. 29). Der Anteil aller anderen
Blutzellen variiert nicht.
Abbildung 29: Zusammensetzung der Leukozyten bei LEW und bei gesunden und kranken LEW-Rag1
Ratten
LEW-Rag1 Ratten besitzen signifikant mehr Granulozyten und weniger Lymphozyten im Blut als LEW Tiere.
Bei erkrankten LEW-Rag1 Tieren ist dieser Unterschied am stärksten ausgeprägt. (n=14-71)
In Bezug auf die verschiedenen Haltungsbedingungen lassen sich lediglich Tendenzen
erkennen. Es zeigt sich, dass keimfreie LEW-Rag1 Tiere den höchsten Lymphozytenanteil im
Blut aufweisen, gefolgt von den Tieren der SPF4. Das Schlusslicht mit dem geringsten Anteil
an Lymphozyten an den weißen Blutkörperchen bilden die LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3.
Die durchschnittlichen Verhältnisse von Granulozyten zu Lymphozyten sind in Abbildung 30
für die drei Haltungen im Vergleich zu LEW Tieren zusammenfassend dargestellt. Das Alter
der Tiere hat keinen signifikanten Einfluss auf die Zellzusammensetzung des Blutes.
67
4 Ergebnisse
Abbildung 30: Verhältnisse von Lymphozyten zu neutrophilen
Granulozyten
LEW-Rag1 Ratten aller drei Haltungseinheiten weisen ein verschobenes
Verhältnis der Leukozyten im Blut auf. (n=18-30)
4.3.2 Chemische Parameter im Blut
Die Analyse der Konzentrationen der in Kapitel 3.9.2.1 angegebenen Elektrolyte, Enzyme
und Stoffwechselprodukte und deren Vergleich mit Werten der Kontrolltiere ergab keine
abweichenden Befunde.
4.3.3 IgE und IgG im Serum
Die mit Hilfe eines ELISA ermittelten Konzentrationen zweier Immunglobuline (IgE und
IgG) im Blutserum der immundefizienten Ratten zeigten teilweise Unterschiede zu den
Kontrollen, wie in Abbildung 31 zu sehen ist. Die nachgewiesenen Mengen an IgE
unterscheiden sich hier nicht signifikant zwischen den LEW und LEW-Rag1 Ratten, wogegen
die Mengen IgG dieser beiden Gruppen deutlich differieren. LEW-Rag1 Ratten besitzen also
signifikant geringere Mengen des Immunglobulins G im Serum als die Kontrolltiere.
Innerhalb der LEW-Rag1 Gruppe waren sowohl bei dem Anteil an IgG als auch IgE keine
Abhängigkeiten von der Haltungseinheit oder dem Gesundheitszustand der Tiere ersichtlich.
68
4 Ergebnisse
Abbildung 31: Vergleich der Immunglobulinkonzentrationen im Serum von LEW und
LEW-Rag1 Ratten
Die IgE Konzentrationen liegen physiologischerweise in einem 10 5-fach niedrigeren Bereich als
die Konzentrationen des IgG. (n=3-22)
4.3.4 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren im Serum
Die Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen im Blutserum der LEWRag1 Ratten unterscheiden sich signifikant von denen der Kontrolltiere (Abb. 32). Vergleicht
man die Werte der LEW-Rag1 Ratten mit den Werten der LEW Tiere, dann sind die
Serumkonzentrationen der LEW-Rag1 Ratten dieser Stoffe mindestens doppelt so hoch,
häufig sogar 3-4 (-5) -fach erhöht (Ausnahme: EPO, RANTES, GM-CSF der keimfreien Tiere
und MCP-1 der Tiere aus der SPF3). Die niedrigsten Werte weisen hierbei die keimfreien
Tiere auf, gefolgt von den Tieren der SPF4 und die höchsten Werte weisen die in der SPF3
gehaltenen Ratten auf. Diese Unterschiede stellen jedoch nur Tendenzen dar. Eine mehr als 5fach erhöhte Konzentration zeigen die Werte für IL-6, G-CSF und IFN-γ der LEW-Rag1
Tiere. Ein Vergleich der als gesund eingestuften LEW-Rag1 Tiere mit den Erkrankten zeigt
für letztere signifikant erhöhte Werte (Abb. 32), die einzige Ausnahme bilden hier GRO/KC
und RANTES. Die vollständigen Daten dieser Analyse sind im Anhang in den Abbildungen
54 und 55 dargestellt.
69
4 Ergebnisse
Abbildung 32: Ausgewählte Zytokine im Vergleich
Dargestellt sind die Unterschiede in den Serumkonzentrationen von IL-6, G-CSF und INF-γ
exemplarisch für die gesamte Analyse. LEW-Rag1 Ratten aller drei Haltungen unterscheiden
sich hier signifikant von den LEW Ratten, während sich die verschiedenen Haltungen
untereinander nicht signifikant unterscheiden. Erkrankte LEW-Rag1 Ratten weisen
signifikant höhere Zytokinkonzentrationen im Blutserum auf als gesunde. (n=6-50)
4.4 In vitro Proliferation der T-Lymphozyten nach Antigenstimulation
Mit Hilfe einer Gemischten Leukozytenkultur konnten Aussagen über das Verhalten der
LEW-Rag1 Lymphozyten gegenüber verschiedenen Antigenen getätigt werden. Bestimmt
wurde die Proliferationsfähigkeit der beeinträchtigten Lymphozyten nach Kontakt mit einem
Isoantigen, zwei verschiedenen Alloantigenen und einem Xenoantigen. Die wichtigsten
Ergebnisse sind in Abbildung 33 dargestellt. Nach Abzug des Wertes der Negativkontrolle
kommt man zu dem Schluss, dass die als Isoantigen genutzten Milzzellen von LEW weder bei
70
4 Ergebnisse
den Zellen der Kontrolltiere noch bei denen der LEW-Rag1 Tiere eine Immunantwort
auslösen. Dagegen ist nach dem Zusammentreffen der Responderzellen mit Milzzellen der
Stämme LEW.1F und LEW.1U (Alloantigen) eine Proliferation der Lymphozyten messbar.
Diese ist jedoch bei den LEW-Rag1 Zellen signifikant geringer als die vergleichbare
proliferative Antwort der LEW Zellen. Zwischen der Antwort auf LEW.1U und LEW.1F
zeigen sich in der Abbildung leichte Unterschiede, diese sind jedoch nicht signifikant. Ein
ähnliches Bild zeigt sich auch bei der proliferativen Antwort auf das gewählte Xenoantigen
(L23). Auch hier proliferieren die LEW-Rag1 Lymphozyten deutlich schwächer als die
Kontrollzellen der LEW. Zusätzlich lässt sich erkennen, dass die Immunantwort der LEWRag1 Zellen in ihrer Stärke zwischen den Allo- und Xenoantigenen nicht variiert, dies bei den
Zellen der LEW Ratten allerdings der Fall ist. Die Reaktion auf ein zugegebenes Xenoantigen
ist bei den LEW Zellen in etwa doppelt so stark, wie die auf ein Alloantigen. Vergleicht man
die Zellen der als gesund eingestuften LEW-Rag1 Ratten mit den Kranken, so ergeben sich
hier keine signifikanten Unterschiede. Ebenso verhält es sich bei dem Vergleich dreier
unterschiedlicher Altersklassen miteinander.
71
4 Ergebnisse
Abbildung 33: Proliferationsstärke in counts per minute (cpm) der Lymphozyten von LEW und LEWRag1 Ratten
Proliferationszahlen nach Stimulierung der Lymphozyten mit einem Isoantigen (A), Alloantigenen (B+C) und
einem Xenoantigen (D). Die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten proliferieren in allen Fällen signifikant
schwächer. Zwischen erkrankten und gesunden Tieren zeigen sich keine Unterschiede. (n=3-11)
Kruskal-Wallis Test (LEW, LEW.1F, LEW.1U): P=0,0042; P=0,0002; P<0,0001. ANOVA (L23): P<0,0001
4.4.1 Verhalten der Lymphozyten in Kultur
Während der eigentlichen Versuche zur in vitro Proliferation als Antwort auf verschiede
Antigene gab es Schwierigkeiten, die aus den Lymphknoten isolierten T-Lymphozyten der
LEW-Rag1 Ratten über mehrere Tage in Kultur zu halten. Ein häufiges Problem war das
frühe Sterben der präparierten LEW-Rag1 Zellen. Bei Betrachtung der Kulturen unter dem
Mikroskop zeigten deren T-Zellen von Tag zu Tag ein inaktiveres, zunehmend
verklumpendes Bild. Weder der Zusatz von Natrium Pyruvat zu dem Zellkulturmedium noch
das Beschränken auf bestimmte Lymphknoten (mesenteriale oder periphere) und weniger
72
4 Ergebnisse
Verunreinigung durch Fett sorgte für Besserung. Lediglich die mit der Zeit routiniertere
Präparation und Aufarbeitung der Zellen führte zu kultivierbaren Lymphozyten der LEWRag1 Tiere. Die Präparation und Kultivierung der Lymphozyten aus den Lymphknoten der
LEW Kontrolltiere wurde analog zu der Präparation der Lymphknoten der LEW-Rag1 Tiere
durchgeführt und bereitete keine Schwierigkeiten. Die Ergebnisse vergleichender LebendTot-Färbungen mit Trypan-Blau, anschließend an die Präparation, sind in Abbildung 34
dargestellt. Aus den LEW Lymphknoten lassen sich 2,7 mal mehr lebende Lymphozyten
isolieren als tote, dagegen ist nahezu die Hälfte der Lymphknotenzellen der LEW-Rag1
Ratten nach der Aufarbeitung nicht mehr lebensfähig.
Abbildung 34: Ergebnisse der Trypan-Blau-Färbung der LEW und LEW-Rag1
Lymphknotenzellen
Aus den Lymphknoten der LEW Ratten konnten deutlich mehr lebende Zellen isoliert
werden als aus den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten. (n=5-10)
4.4.2 Absolute Zellzahlen in den Lymphknoten und der Milz
Dass sich die absoluten Zellzahlen der lymphatischen Organe von LEW und LEW-Rag1
Ratten unterscheiden, wurde zusätzlich in einer weiteren Messung nachgewiesen (Kap. 3.4).
Hierbei zeigt sich, dass Milzen und Lymphknoten des Stammes LEW-Rag1 meistens eine
deutlich geringere Anzahl isolierbarer Leukozyten (39-65 %) beinhalten als Tiere des LEW
Stammes. Dargestellt ist dieses Ergebnis in Abbildung 35. Während die Kontrollmilzen 97104 Mio. Leukozyten pro Organ aufweisen, sind es bei den LEW-Rag1 Milzen nur 27-79
Mio. In den peripheren Lymphknoten (hier am Beispiel des linken Ln. subiliacus und eines
medialen Ln. mandibularis) der LEW-Rag1 Ratten zeigt sich nur teilweise das gleiche Bild.
73
4 Ergebnisse
Ein
isolierter
Unterkieferlymphknoten
beherbergt
0,5-7
Mio.
Zellen
und
ein
Kniefaltenlymphknoten beherbergt 1-22 Mio. isolierbare Zellen. Die angegebenen
Minimalwerte werden nur von gesunden LEW-Rag1 Ratten erreicht und die angegebenen
Maximalwerte werden nur von erkrankten LEW-Rag1 Ratten erreicht. Bei LEW belaufen sich
die Werte auf 5,5-15 Mio. bzw. 0,5-6,5 Mio.
Abbildung
35:
Gesamtleukozytenzahlen
der
Milzen
und
Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten
A: Die lymphatischen Organe der LEW Ratten beherbergen eine
signifikant größere Anzahl an Leukozyten als die lymphatischen
Organe der LEW-Rag1 Ratten. B: Die Lymphknoten erkrankter
LEW-Rag1 Ratten beinhalten mehr Lekuzyten als die gesunder.
(n=4-10)
Beim Vergleich gesunder und kranker LEW-Rag1 Tiere zeigt sich kein Unterschied zwischen
den Zellzahlen ihrer Milzen. Die peripheren Lymphknoten jedoch enthalten bei erkrankten
Ratten tendenziell mehr Zellen als bei Gesunden. Dieser Unterschied erweist sich bei den
Werten der Lnn. mandibulares als signifikant, bei den Lnn. subiliaci fehlt dagegen eine
eindeutige Signifikanz, aber eine deutliche Tendenz ist auch hier zu erkennen (Abb. 35).
74
4 Ergebnisse
4.5 Zusammensetzung der Lymphozytenpopulation
Da das RAG1 Protein essentiell für die korrekte Entwicklung der Lymphozyten ist, wurden
die einzelnen Zellpopulationen mittels Fluoreszenzfarbstoff gekoppelter Antikörper im
Durchflusszytometer genauer charakterisiert. Hierfür wurden die Anteile bestimmter B- und
T-Zellpopulationen an den gesamten Lymphozyten sowohl im Blut als auch in den
lymphatischen Organen bestimmt. Unterschieden werden konnten, wie bereits in Kapitel 3.8
aufgelistet, folgende Zellfraktionen: B-Lymphozyten (CD45RA), T-Lymphozyten (CD3,
CD4, CD8, CD25, CD161, Foxp3, αβTCR, γδTCR) und NK-Zellen (CD161). Zusätzlicher
Wert wurde auf eine differenziertere Analyse des αβTCR Repertoires gelegt (Kap. 4.5.3).
4.5.1 Lymphozytenpopulation im Blut
Abbildung 36 stellt die Anteile der reifen T-Lymphozyten (CD3+CD4+ und CD3+CD8+) an
der Gesamtpopulation der lymphozytären Zellen im Blut dar. Es ist deutlich zu sehen, dass
LEW-Rag1 Ratten einen signifikant geringeren Anteil, sowohl der T-Helferzellen als auch der
zytotoxischen T-Zellen im Blut aufweisen als LEW Ratten. Die Werte der LEW-Rag1 Ratten
erreichen gerade einmal 15 % der Anzahlen der LEW T-Lymphozyten. Die Verhältnisse von
CD4 zu CD8 positiven T-Zellen sind allerdings bei beiden Stämmen im Mittel gleich
(CD4+:CD8+, 2,6:1), wobei die gesunden LEW-Rag1 Ratten mit einem Verhältnis von 2,8:1
geringgradig darüber liegen.
Abbildung 36: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten
Im Blut der LEW Ratten sind signifikant mehr reife T-Zellen nachweisbar. (n=14-26)
75
4 Ergebnisse
Beim Vergleich der gesunden und kranken Gruppen der einzelnen Haltungen miteinander
sind einige Unterschiede wie folgt festzustellen. Die gesunden Tiere der keimfreien Haltung
und die gesunden Tiere der SPF3 besitzen signifikant weniger CD3+CD4+ positive T-Zellen
im Blut, als ihr erkranktes Pendant. Auch in der SPF4 ist dieser Trend zu erkennen, es
ergeben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede. Ähnlich verhält es sich auch bei der
Analyse der CD3+CD8+ T-Lymphozyten. Hier zeigen sich allerdings signifikant geringere
Anzahlen bei den gesunden Ratten der Haltungen KF und SPF4. In der SPF3 Gruppe ist
wiederum ein Trend in diese Richtung zu erkennen (Abb. 37). Außerdem unterscheiden sich
die gesunden und kranken Tiere der verschiedenen Haltungseinheiten teilweise signifikant
voneinander (Abb. 38). Besonders die SPF3 hebt sich hier von den anderen beiden Haltungen
ab, indem deren LEW-Rag1 Ratten signifikant größere Anzahlen reifer T-Zellen im Blut
aufweisen als in den beiden anderen Einheiten.
Abbildung 37: Vergleich der Anteile reifer T-Lymphozyten im Blut bei gesunden und
kranken LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinheiten
Im Sinne der Übersichtlichkeit wurden in dieser und den folgenden Abbildungen nur die
Unterschiede zwischen den gesunden und kranken Tieren derselben Haltung berücksichtigt.
Weitere signifikante Unterschiede sind in Abb. 38 beschrieben. (n=14-26)
76
4 Ergebnisse
Abbildung 38: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten
Die Tiere der SPF3 weisen durchgängig die höchsten Werte auf.
ANOVA CD3+CD4+ gesund und krank: P=0,0062; P=0,0168. Kruskal-Wallis Test CD3+CD8+ gesund und
krank: P<0,0001; P=0,0260. (n=14-26)
77
4 Ergebnisse
Die mit einem Antikörper für den αβTCR gefärbten Zellen weisen vergleichbare Werte auf
(Abb. 39).
Abbildung 39: Vergleich der Anteile αβTCR tragender
T-Zellen zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten
Der nachgewiesene Anteil dieser Zellpopulation stimmt mit
den nachgewiesenen Anteilen CD3+CD4+ und CD3+CD8+
T-Zellen überein. (n=14-126)
Gleichzeitig mit CD4 oder CD8 und CD25 angefärbte Zellen markieren aktivierte oder
regulatorische T-Zellen. Auch hier unterscheiden sich die Anteile der einzelnen Populationen
zwischen den Stämmen LEW und LEW-Rag1 signifikant (Abb. 40). Betrachtet man kranke
und gesunde LEW-Rag1 Tiere gesondert in ihren Haltungsgruppen, dann zeigen sich nur
geringe Differenzen. Hier liegen die Werte der Tiere aus der SPF4 teilweise signifikant unter
denen aus der SPF3, die Werte der keimfreien Tiere liegen dazwischen. Bei den erkrankten
Tieren sind diese Unterschiede etwas auffälliger. Der gezielte Vergleich gesunder und kranker
Ratten einer Haltungseinheit brachte keine signifikanten Unterschiede hervor. Tendenziell
liegen jedoch die prozentualen Werte der kranken Tiere etwas höher als die der Gesunden,
diese Unterschiede sind allerdings nicht signifikant. Es lässt sich sagen, dass etwa 47 % der
reifen T-Zellen der LEW Ratten CD25 auf ihrer Oberfläche tragen. Bei den LEW-Rag1
Ratten sind es deutlich mehr (67 %). Etwa die Hälfte dieser Lymphozyten ließ sich auch mit
Antikörper gegen Foxp3 anfärben und stellt somit, wie in Kapitel 3.8 beschrieben wurde, die
Population der regulatorischen T-Lymphozyten dar.
78
4 Ergebnisse
Abbildung 40: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1
Ratten
LEW Ratten besitzen analog zur den Werten der gesamten Lymphozytenpopulation signifikant mehr CD25 +
Lymphozyten als LEW-Rag1 Ratten. Lediglich die Mittelwerte der CD8+CD25+ Zellen der gesunden LEW-Rag1
Ratten in den drei Haltungseinheiten unterscheiden sich signifikant (Kruskal-Wallis Test: P=0,0297). (n=14-26)
Des Weiteren zeigt die Analyse der doppelt positiven Zellen (CD4+CD8+) im
Lymphozytengate auch einen Unterschied zwischen den beiden Stämmen. Hier sind es die
LEW-Rag1 Tiere, die einen um 69 % höheren Prozentsatz dieser Zellfraktion im Blut
aufweisen. Zudem unterscheiden sich die Anteile dieser Zellfraktion auch zwischen den
gesunden und kranken Tieren dieses Stammes der verschiedenen Haltungseinrichtungen, mit
Ausnahme der SPF3 (Abb. 41). In den anderen beiden Haltungen besitzen erkrankte LEWRag1 Tiere einen signifikant höheren Anteil dieser doppelt positiven Zellen im Blut als die
Gesunden. Die gesunden Ratten aus der SPF3 weisen im Vergleich zu den keimfreien Tieren
und den Tieren aus der SPF4 Haltung eine signifikant erhöhte Anzahl an CD4+CD8+ positiven
Zellen auf.
79
4 Ergebnisse
Abbildung 41: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten
Im rechten oberen Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken
Tieren einer Haltungseinheit dargestellt. Weitere relevante Unterschiede sind im unteren Abschnitt vermerkt.
LEW-Rag1 Ratten besitzen eine größere Anzahl dieser Zellen im Blut als LEW Ratten. Kranke LEW-Rag1
Ratten besitzen eine größere Anzahl dieser Zellen im Blut als gesunde. Die Tiere der SPF3 weisen die höchsten
Werte auf. ANOVA CD4+CD8+ gesund: P<0,0001. (n=14-26)
Bei keinem untersuchten homozygoten Träger des Gendefektes konnten mit Hilfe eines an
CD45RA bindenden Antikörpers reife B-Lymphozyten im Blut nachgewiesen werden. Die
LEW Tiere weisen dagegen durchschnittlich 16 % (12-23 %) positiv markierter Zellen auf.
Zuletzt folgen die Ergebnisse der NKT- und NK-Zellanalysen. Die zu der Gruppe der TZellen gehörenden NKT-Zellen wurden im FACS mit Hilfe einer Doppelfärbung mit CD3
und CD161 nachgewiesen. Die doppelt positiven Zellen bildeten die gesuchte Population.
Dabei zeigte sich, dass LEW-Rag1 Ratten eine signifikant geringere Menge dieser Zellen im
Blut aufweisen als LEW Tiere (Abb. 42). Genau gegenteilig zu diesen Ergebnissen stellt sich
die NK-Zellpopulation der LEW-Rag1 Tiere dar. Während die Kontrolltiere nur einen sehr
80
4 Ergebnisse
geringen Anteil von 4-11 % aufweisen, sind bei den LEW-Rag1 Tieren bis zu 41 % natürliche
Killerzellen im Lymphozytengate nachweisbar. Zwischen kranken und gesunden Tieren und
den Tieren unterschiedlicher Haltungseinheiten zeigen sich dagegen keine Unterschiede.
Abbildung 42: Vergleich der Anzahlen nachweisbarer NKT- und NK-Zellen im
Lymphozytengate von LEW und LEW-Rag1 Ratten
LEW-Rag1 Ratten besitzen signifikant weniger NKT-Zellen und signifikant mehr NK-Zellen im
Blut als LEW Ratten. (n=5-10)
Für alle oben beschriebenen Zellpopulationen wurden auch altersspezifische Analysen
durchgeführt. Hier konnte jedoch für keine einzige Zellpopulation eine tendenzielle oder gar
signifikante Altersabhängigkeit nachgewiesen werden.
4.5.2 Lymphozytenpopulation in den lymphatischen Organen
Die Ergebnisse der Analysen, der aus Milzen der LEW-Rag1 Ratten gewonnenen
Lymphozyten, ähneln in ihrer Verteilung den im Blut erhobenen Werten in großen Teilen.
Obwohl das Verhältnis von CD4 zu CD8 positiven T-Zellen hier ein anderes ist (2:1), so ist es
doch bei LEW und LEW-Rag1 gleich. Betrachtet man allerdings gesunde und kranke Tiere
getrennt, so zeigt sich ein deutlicher Unterschied in der anteilsmäßigen Verteilung dieser
beiden Zelltypen. Während die CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen der gesunden LEW-Rag1
Ratten im Verhältnis 2,4:1 zueinander stehen, so ist es bei den Erkrankten ein Verhältnis von
1,7:1. Die CD8 tragenden Lymphozyten nehmen also bei einer Erkrankung der Tiere
anteilsmäßig zu, wohingegen nicht mehr so viele CD4 positive Lymphozyten im Gate
nachgewiesen werden können. Wie schon für das Blut gezeigt wurde, weisen die LEW-Rag1
81
4 Ergebnisse
Ratten auch in ihren Milzen signifikant weniger reife T-Lymphozyten auf als die
vergleichbaren Kontrolltiere (Abb. 43). Diese besitzen mehr als das Doppelte dieser
Zellpopulation. Die Unterschiede zwischen kranken und gesunden LEW-Rag1 Ratten in den
verschiedenen Haltungen sind in Abbildung 43 dargestellt.
Abbildung 43: Vorkommen reifer T-Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten
Im rechten Teil der Abbildung wurden nur signifikanten Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren
einer Haltungseinheit berücksichtigt. Zusätzlich unterscheidet sich die Anzahl der CD3+CD4+ Zellen bei den
gesunden Tieren nur zwischen KF und SPF3 signifikant (P=0,0282). In der Anzahl der CD3+CD8+ Zellen
unterscheiden sich sowohl die gesunden als auch die erkrankten Tiere der SPF3 signifikant von den anderen
beiden Haltungseinheiten (gesunde KF: P=0,0026; kranke SPF4: P=0,0190). (n=12-22)
Die Anteile der B-Zellen am Lymphozytengate belaufen sich bei den Milzen der LEW Ratten
auf durchschnittlich 30 %, bei den LEW-Rag1 Ratten sind auch dort keine B-Zellen
nachweisbar.
Während die LEW Ratten in der Milz einen geringeren Anteil CD25+ Zellen aufweisen als im
Blut (Abb. 40), gleichen sich diese Werte bei den LEW-Rag1 Ratten. Dennoch zeigt sich, wie
82
4 Ergebnisse
in Abbildung 44 zu erkennen ist, weiterhin ein signifikanter Unterschied dieses
Zellvorkommens zwischen den beiden Stämmen. Die LEW-Rag1 Ratten besitzen sehr viel
weniger CD25+ Lymphozyten in ihren Milzen als die LEW Ratten.
Abbildung 44: Vorkommen der CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in der Milz von LEW und LEWRag1 Ratten
(n=11-22)
Des Weiteren sind keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der CD4+CD25+ Zellen
zwischen erkrankten und gesunden LEW-Rag1 Tieren oder Tieren verschiedener Haltungen
zu beobachten. Der prozentuale Anteil der CD8+CD25+ Zellpopulation dagegen unterscheidet
sich in der keimfreien Haltung und in der SPF3 signifikant zwischen gesunden und kranken
LEW-Rag1 Ratten. Die kranken Tiere haben hier deutlich höhere Werte vorzuweisen.
Insgesamt zeigen ca. 27 % der LEW Lymphozyten in den Milzen einen aktivierten bzw.
regulatorischen Phänotyp, bei LEW-Rag1 dagegen sind es 44 %.
83
4 Ergebnisse
Es sind weniger CD4+CD8+ Zellen in den Milzen der LEW Ratten zu finden als in deren Blut,
während die Anzahl der CD4+CD8+ Zellen bei den LEW-Rag1 Ratten in Milz und Blut
anteilig gleich ist. Trotzdem zeigen sich auch hier signifikant geringere Anzahlen dieser
Zellen in den Organen der Kontrolltiere (Abb. 45). Des Weiteren ist in dieser Abbildung
dargestellt, dass sich vor allem die Tiere aus der SPF3 in dieser Hinsicht von den anderen
beiden Haltungen abheben. Wie auch schon im Blut gezeigt wurde, beherbergen die Milzen
der gesunden Tiere in der keimfreien Haltung und in der SPF4 signifikant geringere Mengen
CD4+CD8+ Zellen.
Abbildung 45: Vorkommen der CD4+CD8+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten
Im rechten oberen Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken
Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. Weitere relevante Unterschiede sind im unteren Abschnitt vermerkt.
Dort zeigt sich, dass LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 Haltung die höchsten Anteile dieser Zellfraktion in der
Milz aufweisen. ANOVA: P<0,0001. (n=12-16)
Die NK-Zellen sind in der Milz anteilsmäßig sowohl bei den LEW Ratten als auch bei den
LEW-Rag1 Ratten ähnlich häufig vertreten wie im Blut. Es zeigen sich keine Unterschiede
84
4 Ergebnisse
zwischen gesunden und kranken Tieren in einer Haltungseinheit und zwischen den Tieren
verschiedener Haltungseinheiten.
Die Ergebnisse der FACS-Analysen der peripheren Lymphknoten liefern dem Betrachter, im
Hinblick auf den Anteil der reifen Lymphozyten, ein komplett anderes Bild. Im Gegensatz zu
den vorherigen Analysen besitzen die LEW-Rag1 Ratten signifikant mehr CD3+CD4+ und
CD3+CD8+ Zellen in diesen Organen als LEW. Während sich die Mittelwerte der LEW Tiere
auf 55 % (CD3+CD4+) und 21 % (CD3+CD8+) belaufen, liegen sie bei LEW-Rag1 bei 65 %
und 38 %, streuen allerdings deutlich stärker (Abb. 46).
Abbildung 46: Vorkommen der reifen Lymphozyten in den peripheren Lymphknoten von LEW und
LEW-Rag1 Tieren
Im unteren Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren
einer Haltungseinheit berücksichtigt. (n=12-16)
Des Weiteren gleicht das Verhältnis dieser beiden Zellpopulationen in den Lymphknoten der
LEW Ratten dem festgestellten Verhältnis von 2,6:1 im Blut. Bei den LEW-Rag1 Ratten
85
4 Ergebnisse
dagegen ist eine deutlich größere Anzahl CD3+CD8+ Zellen nachweisbar, was zu einem
Verhältnis von 1,8:1 führt und sich somit deutlich von den Kontrollen unterscheidet.
Betrachtet man die Verhältnisse dieser Zellen gesondert zwischen gesunden und als krank
eingestuften LEW-Rag1 Ratten, so zeigt sich, dass die kranken Tiere deutlich größere
Mengen CD3+CD8+ Lymphozyten im Lymphknoten aufweisen als Gesunde. Die berechneten
Verhältnisse verschieben sich von 2,1:1 bei gesunden Tieren zu 1,3:1 bei den Erkrankten
(Abb. 47). Bei der gesonderten Analyse der CD3+CD4+ Zellen ergeben sich keine weiteren
Unterschiede innerhalb des LEW-Rag1 Stammes, lediglich die erkrankten Ratten aus der
SPF3 zeigten signifikant geringere Werte im Vergleich zu den Gesunden dieser
Haltungseinheit (P=0,0182). Die CD3+CD8+ Population zeigt dagegen in allen drei Haltungen
deutliche Unterschiede zwischen den kranken und gesunden Ratten. Die gesunden Tiere
weisen durchweg signifikant geringere Anteile dieser Zellpopulation am Lymphozytengate
auf als die erkrankten Tiere (Abb. 47). Zwischen Tieren verschiedener Haltungseinrichtungen
sind auch hier keine Unterschiede erkennbar.
Abbildung 47: Verhältnis der verschiedenen reifen T-Lymphozyten im Lymphknoten zueinander
Bei erkrankten LEW-Rag1 Ratten ist das CD4/CD8-Verhältnis am stärksten verschoben. (n=12-16)
Auch in den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten sind keine B-Zellen detektierbar,
wohingegen diese Zellen bei LEW einen Anteil von 25 % einnehmen.
Analog zu den deutlich höheren Werten der reifen T-Zellen weisen auch die CD4+CD25+
Zellen signifikant größere Anteile am Lymphozytengate der Lymphknoten auf als die Zellen
der Kontrolltiere (Abb. 48). Allerdings sind auch hier die LEW-Rag1-Zellen einer größeren
Streuung der Werte unterworfen. Auch beim Vergleich der Haltungseinheiten und
Gesundheitsstatus miteinander ergibt sich ein ähnliches Bild zu dem im vorangegangenen
Absatz beschriebenen. Für die CD4+CD25+ Zellen ergeben sich keine signifikanten
86
4 Ergebnisse
Unterschiede, wogegen die gesunden Ratten in der keimfreien Haltung und der SPF4
signifikant geringere Werte für die CD8+CD25+ Zellen aufweisen als die Erkrankten. Diese
Ergebnisse sind in Abbildung 48 dargestellt. Die aktivierten/ regulatorischen Zellen machen
sowohl bei LEW Ratten als auch bei LEW-Rag1 Ratten einen Anteil von ca. 36 % an den
gesamten reifen T-Lymphozyten der Lymphknoten aus.
Abbildung 48: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von
LEW und LEW-Rag1 Tieren
Im unteren Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren
einer Haltungseinheit berücksichtigt. (n=12-15)
Die Anteile der CD4+CD8+ Zellen am Lymphozytengate der Lymphknoten liegen im selben
Bereich in dem sie auch im Blut und in der Milz vorkommen. Die Werte der LEW-Rag1
Ratten liegen mit einem arithmetischen Mittel von 24 dabei signifikant über denen der
Kontrolltiere (arithmetisches Mittel: 9). Der Vergleich gesunder und kranker LEW-Rag1
Ratten verschiedener Haltungseinheiten miteinander zeigt, wie in Abbildung 49 zu erkennen
ist, einen deutlichen Trend dahingehend, dass diese Zellpopulation in den Lymphknoten
87
4 Ergebnisse
gesunder Tiere seltener vertreten ist als in den Lymphknoten erkrankter Ratten. Die Werte der
einzelnen Haltungen an sich unterscheiden sich nicht nennenswert voneinander.
Abbildung 49: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von
LEW und LEW-Rag1 Ratten
Im rechten Teil der Abbildung wurden nur die signifikanten Unterschiede zwischen gesunden
und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. (n=12-15)
Die einen NK-Zellrezeptor tragende Zellpopulation ist nicht nur im Blut und der Milz der
LEW-Rag1 Ratten erhöht sondern auch in ihren Lymphknoten (Abb. 50). Während die
Kontrolltiere gerade einmal durchschnittlich 1 % dieser Zellen im Lymphozytengate
aufweisen, beläuft sich dieser Wert bei den LEW-Rag1 Ratten auf 9 % (Max. 27 %).
Signifikante Unterschiede zeigen sich zudem auch beim Vergleich der gesunden LEW-Rag1
Ratten aller drei Haltungseinrichtungen miteinander. Die keimfreien Tiere haben hier den
größten NK-Zell Anteil im Lymphknoten, gefolgt von den Tieren der SPF4. Den geringsten
Anteil dieser Zellpopulation weisen die Tiere aus der SPF3 Haltung auf. Diese Ergebnisse
zeigen sich für die erkrankten Ratten nicht. Hier zeigen alle Tiere, unabhängig der Haltung,
annähernd die gleichen Werte. Abbildung 50 zeigt, dass auch die unterschiedlichen
Gesundheitsstatus (gesund/krank) Einfluss auf das Vorkommen dieser Zellen nehmen.
Sowohl in der keimfreien Haltung als auch in der SPF4 besitzen die erkrankten LEW-Rag1
Ratten einen signifikant geringeren Anteil NKR positiver Zellen als die Gesunden. In der
SPF3 zeigt sich dieser Unterschied nicht.
88
4 Ergebnisse
Abbildung 50: Vorkommen von NK-Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1
Ratten
Im rechten oberen Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken
Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. Weitere signifikante Unterschiede sind im unteren Teil dargestellt.
Kruskal-Wallis Test für Lymphknoten NK-Zellen „gesund“: P=0,0020. (n=12-22)
Für den Thymus der LEW-Rag1 Ratten war es sehr schwierig, verlässliche Daten zu
generieren. Das liegt vor allem an der Unterentwicklung dieses Organs, weshalb es schwer
von umliegendem Fett- und Bindegewebe zu differenzieren und isolieren ist. Aufgrund der
wenigen isolierbaren Thymozyten und der schwierigen Organentnahme wurde sich in der
FACS-Analyse auf den Vergleich zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten beschränkt. Ein
Vergleich der verschiedenen Haltungsformen der LEW-Rag1 Tiere, wie er vorher durchweg
durchgeführt wurde, war hier nicht möglich. Trotz alledem konnten deutliche Unterschiede
der Zellpopulationen der Thymi zwischen den LEW und LEW-Rag1 Ratten nachgewiesen
werden. Diese sind in Abbildung 51 zusammenfassend dargestellt. Wie erwartet, befindet sich
nur ein sehr geringer Anteil CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Lymphozyten im Thymus der
89
4 Ergebnisse
immunsupprimierten Ratten. Der durchschnittliche Anteil CD4 positiver Lymphozyten liegt
bei den LEW Ratten bei 52 %, während er bei den LEW-Rag1 Tieren lediglich bei 12 % (0,570 %) liegt. Ein Großteil der Werte befindet sich dabei deutlich unter dem arithmetischen
Mittel. Ein sehr ähnliches Bild ergibt sich auch für die CD8 positiven Lymphozyten. Die
LEW Thymi zeigen hier Werte um 57 %, wogegen es bei LEW-Rag1 nur 6 % (0,2-38 %)
sind. Des Weiteren stehen diese beiden Zellpopulationen bei den Kontrolltieren nahezu in
einem Verhältnis von 1:1 (CD4+:CD8+) zueinander, während sich das Verhältnis bei LEWRag1 dem der Milzen und des Blutes annähert (2:1). Auch bei fast allen anderen Analysen
weisen die Thymozyten der LEW Ratten sehr hohe Werte im Vergleich zu den LEW-Rag1
Ratten auf. Dieser Aussage entgegen steht nur die Färbung des NK-Zellrezeptors. Diese
Zellpopulation ist in den LEW Thymi nahezu nicht vorhanden. Dagegen kann sie in den
Thymi der LEW-Rag1 Ratten mit bis zu 7 % nachgewiesen werden.
Abbildung 51: Ergebnisse der FACS Analysen der LEW-Rag1 Thymi
(n=4-14)
Um einen altersbedingten Einfluss auf die in diesem Kapitel erhobenen Werte ausschließen zu
können, wurden für jeden hier gezeigten Parameter die einzelnen, in Kapitel 3.1 dargestellten
Altersgruppen untereinander verglichen. Hier zeigten sich keine eindeutigen oder
signifikanten Unterschiede. Somit kann ein altersbedingter Einfluss auf die erhobenen Werte
ausgeschlossen werden. Zusätzlich bestanden alle miteinander verglichenen Gruppen zum
90
4 Ergebnisse
gleichen Anteil aus jungen, mittelalten und alten Ratten, was, unabhängig von dem eben
beschriebenen Ergebnis, zu einer guten Vergleichbarkeit der Werte beiträgt.
Die Ergebnisse der FACS Analysen des Blutes einiger Tiere, welche den Gendefekt nur auf
einem Allel tragen (LEW-Rag1 +/-), sind in Abbildung 52 dargestellt. Hier ist sehr deutlich
zu erkennen, dass die heterozygoten Träger des Gendefektes, im Hinblick auf die Anteile der
nachweisbaren T-Lymphozyten, eine Zwischenstellung zwischen LEW und den homozygoten
Trägern (LEW-Rag1) einnehmen. Sowohl ihre nachweisbare Anzahl an reifen als auch an
aktivierten und regulatorischen T-Zellen ist signifikant geringer als bei den LEW Ratten.
Währenddessen liegen diese Werte aber signifikant über denen der LEW-Rag1 Tiere. Die
Population der CD4+CD25+ Zellen bildet hier eine Ausnahme, unterscheidet sich jedoch nicht
vollständig vom Bild der übrigen Ergebnisse. Bei der Analyse der NK-Zellpopulation zeigt
sich ebenfalls eine Zwischenstellung im Vorkommen bei den heterozygoten Merkmalsträgern,
abhängig von der sehr geringen Menge nachweisbarer NK-Zellen im Blut der LEW Ratten.
Die durchschnittliche Anzahl detektierter B-Lymphozyten bei den heterozygoten LEW-Rag1
Ratten beläuft sich auf 9 %, was ebenfalls mittig zwischen LEW (16 %) und LEW-Rag1
(0,1 %) angesiedelt ist. Die einzige, stark vom Gesamtbild abweichende Ausnahme bilden die
gleichzeitig mit Antikörper für CD4 und CD8 anfärbbaren Zellen. Hier unterscheiden sich die
generierten Prozentwerte für die heterozygoten LEW-Rag1 Ratten nicht signifikant von den
LEW Tieren, obwohl ein Trend dahingehend erkennbar ist. Im Vergleich mit den gesunden
und kranken LEW-Rag1 Ratten weisen die LEW-Rag1 +/- Ratten eine signifikant geringere
Menge dieser Zellpopulation auf. Graphisch lässt sich in diesem Fall die Zwischenposition
der heterozygoten Träger des Rag1 Gendefektes nicht klar darstellen.
91
4 Ergebnisse
Abbildung 52: FACS Daten des Blutes der heterozygoten LEW-Rag1 Ratten
Dargestellt sind nur die signifikanten Unterschiede zwischen den heterozygoten Trägern des Gendefektes (LEWRag1 +/-) und den jeweiligen anderen Gruppen. Die übrigen Differenzen wurden im vorherigen Kapitelabschnitt
beschrieben. Es ist deutlich erkennbar, dass die Daten der LEW-Rag1 +/- Ratten eine Zwischenstellung
zwischen den Daten der LEW und LEW-Rag1 Ratten einnehmen.
Kruskal-Wallis Test für jede der sechs Analysen: P<0,0001. (n=4-63)
4.5.3 T-Zellrezeptorrepertoire
Bei allen vorangegangenen FACS Analysen gleichen sich die erhobenen Werte für den
αβTCR mit den Ergebnissen, die die Analysen der reifen T-Zellen (CD3+CD4+ und
CD3+CD8+) lieferten, weshalb diese Ergebnisse nicht noch einmal gesondert dargestellt
wurden. Außerdem wurde der Anteil γδTCR tragender Zellen in den lymphatischen Organen
und im Blut beider Rattenstämme untersucht. Dabei konnte nur ein sehr geringer Anteil,
sowohl bei den LEW-Rag1 Ratten als auch bei den Kontrolltieren, nachgewiesen werden.
Dieser belief sich im Blut auf 2 % (LEW) und 0,6 % (LEW-Rag1), in der Milz auf 2,7 % und
0,9 % und in den Lymphknoten auf 1,6 % und 1 %.
92
4 Ergebnisse
Aufgrund dessen wurde lediglich das αβTCR Repertoire im Blut der LEW-Rag1 Ratten per
FACS-Analyse genauer charakterisiert.
Abbildung 53: Prozentuale Anteile der verschiedenen Vα- und VβRezeptortypen
Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1
Tieren. (n=5-10)
In Abbildung 53 wird deutlich, dass die prozentualen Anteile der verschiedenen Vα- und VβRezeptortypen an den gesamten αβTCR tragenden Zellen bei LEW und LEW-Rag1 nicht
signifikant unterschiedlich sind. Hierbei konnten Vβ16 tragende Zellen am häufigsten
nachgewiesen werden und Vβ10 tragende am seltensten. Zusätzlich streuen die Werte der
LEW-Rag1 Tiere deutlich stärker als die der Kontrollen, was häufig auch schon in vorherigen
Analysen beobachtet wurde. Der Anteil der gesamten αβTCR tragenden Zellen am
Lymphozytengate scheint bei den LEW-Rag1 Ratten in einem Alter von 2 bis 9 Monaten mit
dem Älterwerden leicht anzusteigen, wohingegen er bei LEW stagniert. Aufgrund einer sehr
geringen Gruppengröße können hier aber nur Trends aufgezeigt werden.
4.6 Analyse antibiotisch vorbehandelter Rag1 defizienter Ratten
Der Gesundheitszustand der beim Start dieses Versuches gesunden Tiere wurde in
regelmäßigen Abständen dokumentiert. Ein Tier verstarb unerwartet schon in der ersten
Woche ohne vorherige Anzeichen. Drei weitere Tiere begannen nach 22 Tagen geringgradig
93
4 Ergebnisse
gerötete Ohren zu zeigen, was sich eine Woche später leicht verstärkt hatte. Zusätzlich wies
eines der drei Tiere leicht struppiges Fell auf und musste bald darauf aufgrund zu schlechten
Allgemeinbefindens aus dem Versuch genommen werden. Die anderen beiden auffälligen
Ratten zeigten 5 Wochen nach Versuchsbeginn schon mittelgradig gerötete Ohren und
Gesichter, ihr Fell war an den Vorderbeinen geringgradig verklebt und ihr Fell erschien
geringgradig struppig, so dass auch diese beiden aus dem Versuch ausscheiden mussten. Bei
den beiden verbliebenen Ratten handelte es sich um das ältere Tier und eines der 5 Jüngeren
(Kap. 3.6). Sie zeigten sich bis zur 11. Woche nach Versuchsbeginn gesund und munter.
Danach begann das ältere Weibchen (Alter: 5 Monate) eine geringgradige Alopezie im Kopfund Nackenbereich sowie eine geringgradige Rötung der Nase zu entwickeln. Dieser Zustand
veränderte sich bis zum Versuchsende nicht. Das jüngere Tier zeigte bis zum Ende keine
klinischen Veränderungen. Nach insgesamt 3 Monaten wurden diese beiden Tiere im Alter
von 18 und 22 Wochen seziert und ihre Organe histologisch beurteilt. Während der Sektion
zeigten sich an den Organen des jüngeren und unauffälligen Tieres keine Veränderungen, das
Ältere dagegen wies eine geringgradige stumpfrandige Leber und hochgradig vergrößerte
Unterkieferlymphknoten auf. Außerdem wurden ihre Blutzellen im FACS analysiert. Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 11 und 12 dargestellt.
Tabelle 11: Histologische Scores der mit Cotrim K behandelten Tiere
Tiernr.
268
283
Magen Düda
Zäkum Dida Leber Milz Haut Spdr Lnn. Lunge Herz Gesamt
40
7
7
4
6
2
1
3
2
3
5
0
19
4
3
3
5
1
0
0
1
1
1
0
Tabelle 12: FACS Ergebnisse der mit Cotrim K behandelten Tiere
Tiernr.
CD3+CD4+
CD3+CD8+
CD4+CD25+ CD8+CD25+ CD4+CD8+
NK-Zellen
268
5,1
2,3
3,7
1
18
54,8
283
2,8
0,3
1,4
0,4
5,7
27,4
Die histologischen Gesamtscores der antibiotisch behandelten Tiere (40 krankes Tier, 19
gesundes Tier) unterscheiden sich nicht von den erhobenen Scores der jeweiligen gesunden
und erkrankten LEW-Rag1 Ratten (Kap. 4.2.9). Ebenso verhält es sich mit den Werten der
94
4 Ergebnisse
FACS Analyse (Kap. 4.5.1). Das gesunde und das erkrankte Tier unterscheiden sich in beiden
Ergebnissen deutlich voneinander.
95
5 Diskussion
5 Diskussion
Die Recombination Activating Genes 1 und 2 sind unerlässlich für die Reifung von
Lymphozytenvorläufern zu T- und B-Zellen. Sie bewirken eine effiziente Rekombination der
Gene der Antigenrezeptoren und Immunglobulinmoleküle und sorgen somit für deren große
Diversität und Antigenspezifität (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994, Tonegawa
1983). Sind diese Gene und somit auch die daraus entstehenden Proteine in ihrer Funktion
gestört, hat dies weitreichende Folgen. Abhängig von der Stärke des Funktionsverlustes
verliert das Immunsystem seine Fähigkeit, Erreger mit adaptiven Immunmechanismen zu
bekämpfen, wodurch eine der wichtigsten Waffen des Immunsystems der Wirbeltiere fehlt.
Im
Rahmen
kontrollierter
Genmanipulationen
werden
heutzutage
immundefiziente
Tiermodelle generiert, die Wissenschaftlern als Grundlage für die Forschung an
Erkrankungen und Behandlungsstrategien beim Menschen dienen. Aus diesem Grund wurde
auch die LEW-Rag1 Ratte im Jahr 2012 im Zentralen Tierlabor der Medizinischen
Hochschule Hannover entwickelt. Bis dato standen der Forschung nur sehr wenige
immundefiziente Rattenmodelle und keines mit einem Defekt im Rag1, zur Verfügung.
In der vorliegenden Arbeit wird die Rag1 defiziente LEW Ratte grundlegend charakterisiert.
Der Fokus liegt dabei auf der Phänotypisierung dieser Tiere und beinhaltet sowohl deren
Physiologie als auch deren pathologische Veränderungen. Hierzu wurden Beobachtungen und
Untersuchungen auf Tier- und Organebene sowie auf zellulärer Ebene angestellt, deren
Ergebnisse in den vorherigen Kapiteln vorgestellt wurden. Mit Hilfe dieser Untersuchungen
sollen zum
einen Unterschiede
zwischen
dem
Stamm
LEW-Rag1 und seinem
Hintergrundstamm (LEW) aufgezeigt werden, sowie Unterschiede, die sich durch
verschiedene Haltungseinheiten der LEW-Rag1 Ratten ergeben. Zum anderen wird mit Hilfe
dieser Ergebnisse die Stellung der LEW-Rag1 Ratte im Vergleich zu weiteren Rag defizienten
murinen Tiermodellen und dem humanen Omenn Syndrom diskutiert. Im Folgenden werden
die im Verlauf dieser Studie generierten Daten zusammengefasst und diskutiert, um
schlussendlich eben formulierte Fragestellungen beantworten zu können.
96
5 Diskussion
5.1 Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen
Haltungen
5.1.1 Physiologische Parameter und Organmorphologie
Schon im Vorfeld dieser Arbeit fielen bei den LEW-Rag1 Ratten zahlreiche pathologische
Veränderungen, die hier auch als Krankheitssymptome bezeichnet werden, auf. Da Pathogene
als Auslöser dieser Symptome in Betracht gezogen wurden, erfolgte die Umsiedlung der Tiere
aus einer stärker mit fakultativ pathogenen Mikroorganismen belasteten Haltung in zwei
unterschiedliche spezifisch pathogenfreie Haltungen und eine keimfreie Haltung (Die
Unterschiede dieser verschiedenen Hygienebarrieren sind in Kapitel 3.1.2 beschrieben).
Jedoch auch dort entwickeln die LEW-Rag1 Ratten mit der Zeit die gleichen pathologischen
Symptome. Dazu gehören offensichtliche Symptome wie Alopezie, Hautrötungen und schuppen und ein gestörtes Allgemeinbefinden, erst bei der Sektion des Tieres zu erkennende
Symptome (u. A. Lymphknotenmorphologie) sowie erst im Paraffinschnitt des Organes unter
dem Lichtmikroskop zu identifizierende Veränderungen. Insgesamt erkrankten im
Untersuchungszeitraum in der keimfreien Haltung 74 % aller Ratten im Laufe ihres Lebens.
In der SPF4 erkrankten 79 % der Gesamtpopulation und in der SPF3 waren es fast alle (Abb.
8). Zwischen männlichen und weiblichen Tieren zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede in der Erkrankungshäufigkeit und -stärke, weshalb auf den Unterschied
zwischen Weibchen und Böcken der LEW-Rag1 Ratten in dieser Arbeit nicht näher
eingegangen wird. Zudem hätte ein Vergleich dessen eine größere Tierzahl für die
Probengewinnung erfordert. Vergleicht man die Prävalenzen und Inzidenzen der drei
verschiedenen LEW-Rag1 Populationen miteinander (Abb. 8 und 9), so erhält man ein
deutliches Ergebnis. In der keimfreien Haltung scheint die Morbidität am geringsten zu sein,
während sie in der SPF3 am höchsten ist. Dieses Bild spiegelt sich auch im Beginn der
Krankheitssymptome wieder, welcher seinen Höhepunkt in der SPF3 deutlich früher hat als in
den anderen beiden Haltungen (Abb. 9). Je größer der Infektionsdruck durch Umweltkeime in
der Haltung ist, desto mehr Tiere erkranken und desto früher erkranken diese. Jedoch konnten
in Proben ausgewählter, erkrankter Ratten keinerlei Pathogene nachgewiesen werden. Da die
keimfrei gehaltenen Ratten ebenfalls Krankheitssymptome entwickeln, diese aber signifikant
97
5 Diskussion
später auftreten, können Umweltkeime als direkte Ursache ausgeschlossen werden. Es kann
ihnen aber eine Triggerfunktion in der Krankheitsentwicklung zugesprochen werden.
In der Sektion zeigen nur vereinzelte Organe der LEW-Rag1 Ratten Veränderungen. Dazu
gehören die mesenterialen und peripheren Lymphknoten, die Thymi und die Haut. Weniger
häufig verändert sind der Magen-Darm-Trakt, die Lungen, die Lebern und die Milzen (Tab.
9). Letztere sind durchschnittlich genauso groß wie die Organe der Kontrolltiere, mit wenigen
Ausnahmen, die sich nicht als statistisch signifikant darstellen. Die deutlich stärker injizierten
Blutgefäße der Unterhaut sind als eine Konsequenz der entzündlichen und geröteten
Erscheinung
der
Haut
anzusehen.
Vasoaktive
Substanzen
und
andere
Entzündungsmediatoren, welche bei den LEW-Rag1 Tieren deutlich vermehrt nachgewiesen
wurden (Kap. 4.3.4), führen zu einer gesteigerten Durchblutung in diesem Bereich, zu einer
Auflockerung der Gefäßwände und somit zu einem Austritt von Entzündungszellen ins
umliegende Gewebe (Villa et al. 2008). Diese stellen sich als monozytäre und
polymorphkernige Entzündungszellansammlungen im histologischen Bild der Haut und ihrer
tiefer liegenden Strukturen dar. Die deutliche Dysplasie des Thymus der LEW-Rag1 Ratten
bildet aufgrund der fehlenden T-Lymphozytenreifung eine direkte Folge des Rag1
Gendefektes (Brooks et al. 1999), wobei die makroskopischen sowie zellulären
Veränderungen der Lymphknoten nur teilweise dadurch bedingt sind (Facchetti et al. 1998).
Eine weitere große Rolle werden in diesem Fall die immunologischen Vorgänge im
umliegenden Gewebe spielen, welche zu vermehrter Durchblutung der Lymphknoten und
ihrer Vergrößerung führen. Die Lunge und der Magen-Darm-Trakt sind die Organe, welche
direkt mit Antigenen der Außenwelt eines Tieres in Berührung kommen und müssen
deswegen besonders gute Abwehrmechanismen besitzen und gegenüber ungefährlichen
Antigenen tolerant sein. Diese Mechanismen sind bei der LEW-Rag1 Ratte gestört. Dabei
kommt es zur Ausprägung deutlicher Entzündungssymptome, die die makroskopischen
Veränderungen verursachen. Hierbei kann es sich entweder um eine schwere Infektion
aufgrund eines unzureichend ausgebildeten Abwehrsystems handeln oder um eine
überschießende Immunreaktion auf Auto- oder Fremdantigene. Auch eine Mischform ist
denkbar, da Tiere aller drei Haltungseinheiten diesen Phänotyp zeigen und ganz
unterschiedliche Zelltypen daran beteiligt sind.
98
5 Diskussion
Mit Hilfe der histologischen Untersuchungen sollte geklärt werden, wie sich die
Organsysteme von LEW und LEW-Rag1 histologisch unterscheiden. Außerdem wurde
untersucht, ob sich die Organsysteme von gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten
unterscheiden und ob altersbedingte Unterschiede vorliegen. Zudem sollte geklärt werden, ob
die Haltungshygiene einen Einfluss auf die histologisch erkennbare Ausprägung der
Krankheit ausübt. In fast allen Fällen wurden jeweilige Unterschiede festgestellt. Lediglich
zwischen den verschiedenen Altersgruppen konnten, bei einer Gruppengröße von n=3-5,
hinsichtlich der histologischen Veränderungen keine signifikanten Unterschiede festgestellt
werden.
Das histologische Bild der LEW-Rag1 Thymi offenbart noch weitere Veränderungen, die
über eine einfache Verkleinerung dieses Organs hinausgehen. Ihm fehlt der physiologische
Aufbau in Rinde und Mark, da, wie Khiong et al. (2007) beschrieben, die
Kompartimentierung des Thymus durch den gestörten Lymphozytenreifungsprozess von DN
zu DP Thymozyten ausbleibt. Eine Besiedelung mit Lymphozytenvorläufern hat in den
Thymi der LEW-Rag1 Ratten stattgefunden. Das Organ ist mit großen, mononukleären Zellen
besiedelt, die die typische Morphologie noch nicht endgültig differenzierter Zellen zeigen.
Diese Zellen weisen eine großen, nicht chromatindichten Zellkern und einen deutlich
sichtbaren Zytoplasmasaum auf. Die Thymi der Kontrolltiere hingegen sind dicht gefüllt mit
kleinen, mononukleären Zellen, die einen deutlich kondensierten, chromatindichten Zellkern
und einen sehr schmalen Zytoplasmasaum aufweisen und so die typische Morphologie reifer,
ausdifferenzierter Lymphozyten zeigen. Dieses histologische Bild der Lymphozyten der
LEW-Rag1 Ratten zieht sich durch alle lymphatischen Organe und entzündlich veränderten
Organsysteme. Auch in den untersuchten Blutausstrichen können die beschriebenen
Lymphoblasten gefunden werden. Dieses Phänomen wurde auch von Martin et al. (1995) und
Facchetti et al. (1998) beobachtet. (Martin et al. 1995)
Analog zum fehlenden Aufbau der Thymi, weicht auch die Organstruktur weiterer
lymphatischer Organe von der Norm ab. In den Milzen gibt es keine Abgrenzung von weißer
und roter Milzpulpa und klassische Follikel fehlen. Da die LEW-Rag1 Ratten bis zu 80 %
weniger reife Lymphozyten im Blut und in ihren Organen beherbergen und die B-Zellen
komplett fehlen, kann sich keine deutliche Kompartimentierung dieses Organes ausbilden.
99
5 Diskussion
Ähnlich verhält es sich in den beurteilten Lymphknoten. Auch hier fehlt der organtypische
Aufbau in Cortex, Paracortex und Medulla, und es fehlen Primär- sowie Sekundärfollikel, in
denen bei gesunden Tieren B- und T-Lymphozyten vorzufinden wären. Auch dieses Bild ist
durch einen Mangel reifer Lymphozyten in der LEW-Rag1 Ratte zu erklären. Ein weiterer
Hinweis dafür ist, dass sich fast alle betrachteten Lymphknoten als depletiert, also zellarm,
darstellen. Dieses Phänomen wurde zusätzlich mit der Messung der absoluten
Lymphozytenanzahl in den Milzen und Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 bewiesen
(Abb. 35).
Fast alle histologisch beurteilten Organe der LEW-Rag1 weisen im Mittel mehr oder weniger
starke Infiltrationen mit verschiedenen Entzündungszellen auf (Tab. 9). Dazu zählen sowohl
mononukleäre Zellen, wie Lymphoblasten oder NK-Zellen, als auch polymorphkernige
Zellen, die hier von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten repräsentiert werden und
nicht zuletzt Mastzellen. Von allen betroffenen Organen weisen die Herzen der LEW-Rag1
Ratten nur in wenigen Fällen Infiltrate auf, alle anderen Organe waren häufig betroffen.
Relativ milde Infiltrationen ließen sich in den Herzen, den Lebern und den untersuchten
Hautabschnitten nachweisen, stärkere in den Magen-Darm-Trakten, den Speicheldrüsen und
den Lungen. Sehr starke Infiltrationen mit Granulozyten und Mastzellen befanden sich in den
Lymphknoten und Milzen. Histologisch konnten in den Kontrollorganen der LEW Ratten
keine vergleichbaren Infiltrate gefunden werden. Signifikante Unterschiede beim Scoren der
Organe kranker und gesunder LEW-Rag1 Tiere konnten vor allem bei der Untersuchung der
Mägen, der Hautabschnitte und der Lungen der erkrankten Tiere gefunden werden. Nicht
signifikant, aber als Trend ist dies auch in den Därmen und Speicheldrüsen zu erkennen. Beim
Vergleich der Organe der drei verschiedenen Haltungseinheiten zeigen sich besonders zur
Haltung
der
SPF3
signifikante
Unterschiede
hinsichtlich
der
Bewertung
der
Entzündungssymptome. Diese lassen sich durch das unterschiedliche bakterielle Environment
erklären. Dabei sind signifikant stärkere Infiltrationen in den Magen-Darm-Trakten, den
Milzen und den Speicheldrüsen der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 zu erkennen, während
zwischen den keimfreien Tieren und den Tieren der SPF4 keine deutlichen Unterschiede zu
erkennen sind. Eine Ausnahme bilden hier die Milzen, wo die Anzahlen der Organe mit
deutlichen Infiltraten einen signifikanten Unterschied zwischen allen Haltungseinrichtungen
zeigen, sich dies jedoch nicht im für das Organ angewendeten Score darstellen lässt (Kap.
100
5 Diskussion
4.2.1). Dies liegt aller Wahrscheinlichkeit nach an dem nicht ausreichend sensiblen Score für
die Histologie des Organes. Jedoch zeigt sich deutlich, dass in der keimfreien Haltung
anteilsmäßig die wenigsten Tiere Infiltrationen der Milz aufwiesen (47 %), gefolgt von den
Tieren der Haltung SPF4 (70 %). Am häufigsten betroffen waren auch hier die Ratten aus der
SPF3 (90 %) (Kap. 4.2.1). In den Lungen spiegelt sich nicht exakt das oben beschriebene Bild
wieder. Deutlich wird jedoch, dass die Lungen der Ratten aus beiden spezifisch
pathogenfreien Haltungen häufiger betroffen sind als die Lungen der keimfreien Tiere.
Die fibrotischen Umbauprozesse in den Speicheldrüsen, der Zotten- und Kryptenverlust im
Darmtrakt, das blutreiche oder atelektatische Lungengewebe sowie die teilweise
vorkommenden nekrotischen Areale in den Lymphknoten können als Folgeschäden der
Entzündungszellinfiltrationen und damit einhergehenden Gewebeschädigungen gewertet
werden und deuten auf einen teilweise schon längere Zeit andauernden Prozess hin.
All diese Analyseergebnisse machen deutlich, dass sich die Stämme LEW und LEW-Rag1
phänotypisch, makroskopisch sowie auch histologisch, deutlich voneinander unterscheiden.
Zudem weisen klinisch gesunde Tiere häufig deutlich schwächere Organveränderungen auf
als ihr erkranktes Pendant. Zusätzlich lassen diese Ergebnisse die Vermutung zu, dass das
hygienische Umfeld in der Tierhaltung der LEW-Rag1 Ratten einen Einfluss auf deren
Gesundheitsstatus hat. Sowohl in der SPF4 als auch in der SPF3 Haltung kommen
Mikroorganismen vor. Im Rahmen der Routinehygienediagnostik nach den FELASARichtlinien wurden, abweichend von der SPF4, in Anzeigertieren der SPF3 Klebsiella oxytoca
und Staphylococcus aureus nachgewiesen. Diese beiden fakultativ pathogenen Keime können
bei Tieren mit einem nicht intakten Immunsystem schwere Infektionen der Haut, des
Urogenitaltraktes, der Atemwege und zahlreicher anderer Organsysteme auslösen (Bleich et
al. 2008, Percy, Barthold 2007). Diese Aussage deckt sich mit den Krankheitssymptomen der
LEW-Rag1 Ratten. Jedoch treten diese Veränderungen, wie oben beschrieben, auch bei den
Ratten der SPF4 und sogar in der keimfreien Haltung auf. Außerdem lässt sich ein Erkranken
der Ratten durch eine prophylaktische antibiotische Behandlung nicht verhindern (Kap. 4.6).
Diese Beobachtungen legen nahe, dass nicht nur Mikroorganismen für den von LEW
abweichenden Phänotyp verantwortlich sind.
101
5 Diskussion
Ein Kritikpunkt, der sich aus diesen Analysen ergibt, ist die Subjektivität der
Gruppeneinteilung der LEW-Rag1 Ratten. Es wurde lediglich adspektorisch das lebende Tier
beurteilt und danach die Gruppenzuordnung (gesund/krank) festgelegt. Der im Nachhinein
angefertigte klinische Score aller histologisch beurteilten Ratten zeigt, dass die
durchschnittlichen Werte der kranken LEW-Rag1 Ratten deutlich höher liegen als die Werte
der LEW Tiere. Auch im Vergleich mit den gesunden LEW-Rag1 Ratten zeigt sich dieses
Bild (Abb. 27). Fast alle Tiere in dieser Gruppe wiesen mit LEW Ratten vergleichbare Werte
auf. Um diese visuelle Gruppeneinteilung auf ihre Praktikabilität hin überprüfen zu können,
wurde eine Korrelationsanalyse zwischen den Daten des adspektorisch erkennbaren
klinischen Scorings und dem errechneten histologischen Gesamtscore durchgeführt (Kap
4.2.9). Diese ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,579. Demnach korreliert die
subjektive Bewertung und Gruppeneinteilung mit den histologischen Ergebnissen hoch
positiv, allerdings, wie bei subjektiver adspektorischer Beurteilung nicht anders zu erwarten,
nicht perfekt. Demzufolge ist die Gruppeneinteilung retrospektiv als ausreichend genau zu
bezeichnen. Es gilt: Je kränker die Tiere zu Beginn eingeschätzt wurden, desto stärker stellten
sich auch die Veränderungen ihrer Organe in der Histologie dar. Diese leicht eingeschränkte
Korrelation der Werte könnte dazu geführt haben, dass teilweise keine eindeutigen Ergebnisse
im Vergleich gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten miteinander erzielt werden konnten.
Augenscheinlich konnten, mittels der Einschätzung des klinischen Erscheinungsbildes, mild
erkrankte Tiere oder Tiere, bei denen sich der klinische Zustand gerade zu ändern begann,
nicht korrekt in die „kranke“ Gruppe eingeordnet werden.
Sowohl die weiblichen als auch die männlichen LEW-Rag1 Ratten weisen als Jungtiere mit
einem Alter bis von zu 60 Tagen die gleiche Gewichtsentwicklung wie die gleichalten LEW
Ratten auf. Im weiteren Verlauf ähneln die Gewichte der weiblichen LEW-Rag1 Tiere
weiterhin denen der Kontrollen, während die Gewichtsentwicklung der Böcke mit
zunehmendem Alter weiter auseinander driftet. Die gesunden LEW-Rag1 Böcke erreichen
dabei annähernd das Gewichtsniveau der Kontrolltiere, die erkrankten Tiere dagegen bleiben
deutlich darunter (Abb. 10). Dies ist eine Entwicklung, die durchaus zu erwarten ist, da Tiere,
dessen Allgemeinbefinden gestört ist, weniger Futter aufnehmen und die Energieressourcen
des Körpers für andere Vorgänge als das Wachstum benötigt werden. Ein Grund dafür, dass
102
5 Diskussion
bei den weiblichen Ratten diese Entwicklung nicht so augenscheinlich ist, kann deren
natürlicherweise weniger steile Gewichtszunahmekurve sein.
Bei der Analyse der verschiedenen Reproduktionsparameter ist es sinnvoll, den jeweiligen
Colony Index zu errechnen. Dabei sieht man deutlich die höhere Reproduktionsleistung der
Kontrolltiere im Vergleich mit der mittleren Reproduktionsleistung der LEW-Rag1 Ratten
(Abb. 11). Betrachtet man die drei verschiedenen Haltungseinheiten gesondert, zeigen sich
sehr große Unterschiede. Während die Reproduktivität der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3
weniger als 50 % der Reproduktionsleistung der Kontrolltiere erreicht, gleicht sich dieser
Parameter bei den keimfreien LEW-Rag1 Tieren und den Kontrolltieren. Diese Unterschiede
können zum einen hygienebedingt sein, zum anderen aber auch durch besseres oder
schlechteres Zuchtmanagement zustande kommen. Für ersteres spricht, dass, wie in Kap.
3.1.2
beschrieben,
sich
in
der
SPF3
Haltung
die
meisten
(opportunistischen)
Krankheitserreger befinden, weshalb die immundefizienten Ratten dort einem höheren
Infektionsdruck
ausgesetzt
sind
und
dadurch
ihre
Fruchtbarkeit
sinkt
oder
sie
krankheitsbedingt früher aus der Zucht ausscheiden. Auch der Zuchtmanagementfaktor sollte
nicht außer Acht gelassen werden, da sich in jeder Haltungseinheit anderes Tierpflegepersonal
um die Tiere kümmert und dieses eventuell unterschiedliche Entscheidungen trifft. Zudem
werden die keimfreien Tiere in durchsichtigen Isolatoren gehalten, weshalb sie größerer
Unruhe in ihrer Umgebung ausgesetzt sein könnten. Die zu Beginn der Ergebnisse
beschriebenen etwas längeren Zwischenwurfzeiten der LEW Weibchen lassen sich durch
deren längere Nutzung in der Zucht erklären, da es sich hier um Durchschnittswerte handelt
und sich die physiologische Zwischenwurfzeit mit zunehmendem Alter der Zuchttiere
verlängert.
5.1.2 Unterschiede in der Leukozytenpopulation und damit zusammenhängende Effekte
Betrachtet man die gesamten Leukozytenpopulationen der LEW und LEW-Rag1 Ratten
vergleichend, zeigt sich, dass sich ihre Gesamtanzahlen im Blut unterscheiden (Abb. 28B).
Tiere der keimfreien Haltung und der SPF4 besitzen geringere Anzahlen dieser Zellen als
LEW, die Tiere der SPF3 besitzen geringgradig höhere Anzahlen. Durchweg sind in den
Blutausstrichen der gesunden LEW-Rag1 Ratten deutlich weniger Leukozyten zu finden als
103
5 Diskussion
in
den
Blutausstrichen
der
kranken
Tiere.
Geht
man
bei
den
beobachteten
Krankheitssymptomen von einer generellen Aktivierung des Immunsystems oder einem
infektiösen oder entzündlichen Geschehen aus, so ist dieses Ergebnis nicht verwunderlich, da
eine Aktivierung immunologischer Vorgänge normalerweise eine Expansion der Immunzellen
mit sich bringt. Durch eine größere Anzahl Mikroorganismen in der SPF3 Haltung erklärt sich
die erhöhte Anzahl der Leukozyten in diesen Ratten.
Bei der Auswertung der Differenzialblutbilder zeigen sich weitere Unterschiede. LEW-Rag1
Ratten besitzen anteilig unter den weißen Blutzellen deutlich weniger Lymphozyten und
deutlich mehr neutrophile und eosinophile Granulozyten als LEW Ratten (Abb. 29).
Besonders stark ausgeprägt ist dies bei den erkrankten LEW-Rag1 Tieren. Des Weiteren
zeigen sich auch Unterschiede der Verhältnisse dieser beiden Zelltypen zueinander zwischen
den drei Haltungseinheiten der LEW-Rag1 Ratten. Hierbei besitzen die Keimfreien den
verhältnismäßig größten Anteil an Lymphozyten, mit Abstand gefolgt von den Tieren aus der
SPF4. Am nächsten nähert sich das Zellverhältnis der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 einem
Verhältnis von 1:1 an (Abb. 30). Wie schon an anderer Stelle aufgefallen ist (Kap. 4.1 und
4.2), scheint auch in diesem Punkt die am stärksten keimbelastete Haltung (SPF3) die
deutlichsten Veränderungen hervorzurufen. Je größer der Infektionsdruck auf die
untersuchten Tiere ist, desto weniger Lymphozyten und desto mehr neutrophile Granulozyten
lassen sich in den Blutausstrichen nachweisen. Dies spiegelt sich auch in den beobachteten
Pathologien der Organe wider: Je mehr Neutrophile und weniger Lymphozyten im Blut
vorhanden sind, desto stärker sind die jeweiligen Tiere von den Krankheitssymptomen
betroffen. Offen bleibt die Frage, ob sich in den LEW-Rag1 Ratten primär weniger
Lymphozyten entwickeln konnten und deswegen sekundär bedingt die neutrophilen
Granulozyten einen größeren prozentualen Anteil einnehmen. Oder ob die neutrophilen
Granulozyten aufgrund einer gesteigerten Immunantwort expandiert sind und daraus ein
geringerer Anteil Lymphozyten an der Gesamtzellpopulation resultiert. Betrachtet man die
deutlich höhere Gesamtleukozytenzahl der Tiere aus der SPF3, so scheint letztere die
wahrscheinlichere Möglichkeit zu sein. Diese These bedarf aber noch weiterer Abklärung. Zu
einer Erhöhung der Anzahl der eosinophilen Granulozyten im Blut kommt es bei parasitären
Infektionen oder allergischen Reaktionen (Wardlaw, Moqbel & Kay 1995). Dank strikter
Hygienebarrieren und umfangreicher routinediagnostischer Maßnahmen kann ein parasitär
104
5 Diskussion
bedingter Anstieg dieser Zellpopulation bei den LEW-Rag1 Ratten ausgeschlossen werden.
Symptome einer allergischen Reaktion könnten auch auf ein autoimmunes Geschehen
hindeuten.
Auf die chemische Zusammensetzung des Blutes scheint der Gendefekt der LEW-Rag1
Ratten keinen Einfluss zu haben. Auch einzelne Organe wie die Lebern, Nieren,
Bauchspeicheldrüsen und Herzen sind nicht so stark geschädigt, dass Auswirkungen davon im
Blut messbar sind.
Die Mengen der im Blutserum nachweisbaren Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren
unterscheiden sich deutlich zwischen den Stämmen LEW und LEW-Rag1 (Kap. 4.3.4). Am
stärksten ist diese Entwicklung wieder bei den LEW-Rag1 Tieren aus der SPF3 ausgeprägt,
am schwächsten bei den keimfreien Tieren. Insgesamt sind die Werte aller LEW-Rag1 Ratten
aber hochgradig erhöht, was auf ein allgemein angeregtes Immunsystem hindeutet. Die
analysierten Proteine werden von verschiedenen Zelltypen (Lymphozyten, NK-Zellen,
Monozyten, Makrophagen) und Organen (Niere, Leber, Knochenmark) gebildet. Sie sind für
zahlreiche immunologische Regelkreise verantwortlich und wirken sowohl stimulierend als
auch inhibierend (Dinarello 2000, Mire-Sluis, Thorpe 1998). Besonders stark erhöhte Werte
wurden für die Stoffe IL-6, G-CSF und IFN-γ gemessen. Diese wirken vor allem
proinflammatorisch (Cornish et al. 2009, Willenborg et al. 1999, Wong et al. 2001), was gut
zu dem beobachteten Phänotyp der LEW-Rag1 Ratten passt.
Der Vergleich des Vorkommens der Immunglobuline IgG und IgE im Blutserum der beiden
Stämme zeigt, dass sich die nachgewiesenen Mengen an IgE nicht signifikant unterscheiden.
IgG dagegen ist in deutlich geringerer Konzentration im Blutserum der LEW-Rag1 Ratten
enthalten als in den Kontrolltieren (Kap. 4.3.3). Mit einem Anteil von ca. 75 % an den
gesamten, im Körper vorkommenden Antikörpern macht das IgG den Großteil aus (Nezlin
1998). Da die LEW-Rag1 Ratten keine nachweisbaren reifen B-Zellen besitzen (Kap. 4.5),
fehlt ihnen die antikörperproduzierende Zellfraktion. Somit lässt sich die um 98,6 % geringere
Menge an IgG im Blut der LEW-Rag1 Ratten erklären. Sie besitzen damit gerade einmal 1,4
% des natürlicherweise vorkommenden IgG’s. Dieser Wert kann entweder durch eine sehr
geringe Anzahl an nicht im FACS erfassbaren B-Lymphozyten entstanden sein, oder es
handelt sich hierbei um kleine Ungenauigkeiten in der Analysetechnik. Letzteres könnte auch
105
5 Diskussion
ein Grund für den nicht signifikanten Unterschied der IgE Mengen bei diesen beiden
Stämmen sein. Nur 0,002 % aller im Organismus vorkommenden Antikörper gehören zum
Typ IgE (Nezlin 1998), deshalb ist es denkbar, dass der durchgeführte ELISA nicht sensitiv
genug war, um diese geringen Unterschiede darzustellen. Zu einem erhöhten IgE Spiegel
kommt es beim Vorliegen einer parasitären Infektion oder einer allergischen Reaktion (Jarrett,
Bazin 1974, Nezlin 1998). Dies sind dieselben Gründe, die auch zu einem Anstieg der
eosinophilen Granulozyten im Blut führen, wie es bei den LEW-Rag1 Ratten der Fall ist.
Hinsichtlich einer bei diesen Tieren auftretenden autoimmunen Reaktion wäre ein Anstieg des
IgE’s im Serum bei diesen Tieren zu erwarten gewesen.
Ein weiterer wichtiger Punkt, in dem sich die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten von den
Lymphozyten der LEW Ratten unterscheiden, ist ihr Verhalten in der Zellkultur. Es konnten
deutlich weniger lebende und vermehrt tote Zellen aus den Lymphknoten der LEW-Rag1
Ratten isoliert werden und die Lymphozyten der LEW-Rag1 Tiere überleben deutlich kürzer
im Verlauf der Kultivierung (Kap. 4.4.1 und 4.4.2). Dieses Phänomen wurde auch schon von
Brugnoni et al. (1997) beschrieben. Sie führten es auf eine Hyperaktivierung der
Lymphozyten in vivo zurück, die zu spontaner Apoptose durch reduzierte bcl-2
Genproduktexpression führt. Auch eine derbere Konsistenz einiger veränderter Lymphknoten
der LEW-Rag1 Ratten und die dadurch erschwerte Aufarbeitung mit erhöhter mechanischer
Irritation, kann zu einer erhöhten Zellsterblichkeit geführt haben.
Im Blut und in den sekundären lymphatischen Organen (Milz, Lymphknoten) unterscheiden
sich die Anteile im FACS darstellbarer Leukozytenpopulationen zwischen den Stämmen
LEW und LEW-Rag1 deutlich. Zudem zeigen sich kleinere Unterschiede zwischen diesen
drei in die Analyse einbezogenen Organsystemen. Die Aussage der in Kapitel 4.5
beschriebenen Ergebnisse ist eindeutig in sechs Punkten zusammenfassbar. Erstens: Die
LEW-Rag1 Ratten besitzen 65-85 % weniger reife T-Zellen (CD3+CD4+, CD3+CD8+,
αβTCR, NKT) im Blut und in der Milz als LEW Tiere. In den Lymphknoten der LEW-Rag1
Ratten sind anteilig 50 % mehr reife T-Zellen nachweisbar als bei LEW. Zudem weisen die
LEW-Rag1 Tiere ein verschobenes Verhältnis der zwei Hauptlymphozytentypen zueinander
auf, wobei der Anteil der CD3+CD8+ Zellen (zytotoxische T-Zellen) steigt. Zweitens: Die
LEW-Rag1 Ratten besitzen keine, im FACS mit einem Antikörper für CD45RA
106
5 Diskussion
nachweisbaren, reifen B-Lymphozyten. Drittens: In allen drei Organsystemen zeigt ein
deutlich größerer Anteil der T-Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten einen aktivierten/
regulatorischen Phänotyp (CD25+). Viertens: In den Lymphozytengates der LEW-Rag1
Ratten lassen sich deutlich mehr gleichzeitig für CD4 und CD8 positive Zellen nachweisen als
in den Lymphozytengates der LEW Ratten. Fünftens: In allen drei Organsystemen der LEWRag1 Tiere ist ein deutlich größerer Anteil NK-Zellen zu finden als bei den LEW Ratten.
Sechstens: Erkrankte LEW-Rag1 Ratten weisen meistens höhere Zellanzahlen auf als
Gesunde.
Zusätzlich ist im Blut und in den Milzen eine klare Tendenz dahingehend erkennbar, dass die
Anteile der eben beschriebenen Zelltypen der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 höher sind als
die der anderen beiden Haltungseinheiten. Wie schon in den vorigen Kapiteln beschrieben,
heben sich auch in diesem Punkt die Tiere dieser Haltungseinheit von den anderen beiden ab.
Die FACS-Untersuchung des primären lymphatischen Organsystems anhand der Thymi der
LEW-Rag1 Ratten zeigt ein ähnliches Bild wie die ersten vier beschriebenen Befunde im Blut
und den sekundären lymphatischen Organen.
In der Gruppe der gleichzeitig CD4 und CD8 tragenden Zellen kommen hauptsächlich
Monozyten und Makrophagen vor (Baba et al. 2006), die, aufgrund zu geringer Größe, durch
vorheriges Gaten nicht aus der Analyse exkludiert werden konnten. Da die LEW-Rag1 Ratten
teilweise deutliche Entzündungssymptome zeigen, lässt sich ein vermehrtes Vorkommen
dieser Zellen im Blut und den Organen erklären. Auch DP Lymphozytenvorläufer fallen in
diese Gruppe. Physiologischerweise ist diese Lymphozytenpopulation nur im Thymus
detektierbar (Germain 2002). Addiert man die Werte der CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen in
den Lymphknoten einzelner LEW-Rag1 Tiere, so erhält man Werte, die über 100 %
hinausgehen. Deshalb wird angenommen, dass einige T-Zellvorläufer ins Blut und dadurch in
die lymphatischen Organe gelangt sind.
Bei den in den LEW-Rag1 Ratten nachgewiesenen T-Zellen handelt es sich fast
ausschließlich um αβTCR tragende T-Zellen. Eine Dominanz der γδ-T-Zellen, wie in der
Literatur zu finden ist (Brugnoni et al. 1997), wurde hier nicht festgestellt. Die FACS Analyse
der Vα- und Vβ-Rezeptortypen ergibt leichte Unterschiede zwischen den Anteilen der
verschiedenen Typen am Gesamt-αβTCR, diese Unterschiede liegen allerdings sowohl bei
107
5 Diskussion
LEW-Rag1 als auch bei LEW Ratten in gleichem Maße vor (Abb. 53). Einen Hinweis auf ein
vorliegendes oligoklonales T-Zellrepertoire liefern diese Ergebnisse nicht.
Das mutierte Rag1 scheint den Entwicklungsprozess der B-Lymphozyten weitgehender
einzuschränken als die Entwicklung der T-Lymphozyten. Aufgrund der durch den Rag1
Gendefekt bedingten gestörten Lymphozytenreifung wandern keine reifen B-Lymphozyten
aus dem Knochenmark aus, um die sekundären lymphatischen Organe zu besiedeln. Auf die
T-Lymphozytenpopulation der LEW-Rag1 Ratten wirkt sich der Gendefekt dagegen anders
aus. Einige T-Zellvorläufer durchlaufen den gesamten Reifungsprozess bis zum Ende, sei es
im Thymus oder extrathymisch (Signorini et al. 1999), sodass sie dann als reife, zum Teil
aktivierte T-Lymphozyten im Blut und den sekundären lymphatischen Organen nachweisbar
sind. Grund dafür kann zum einen eine somatische Reversion der Mutation in den TZellprogenitoren sein1. Dies setzt eine Rag1 Nullmutante voraus. Zum anderen könnte es sich
bei der LEW-Rag1 Ratte um eine hypomorphe Mutante handeln, was bedeuten würde, dass
das Rag1 dieser Tiere noch eine gewisse Restaktivität aufweist, wie auch Khiong et al. (2007)
bei ihrem Mausmodell mit unvollständigem Rag1-KO zeigen. In diesen beiden Fällen wären
die nachweisbaren T-Zellen autolog. Eine weitere Erklärung für das Vorhandensein reifer TZellen in den LEW-Rag1 Ratten könnte die materno-fötale Transfusion maternaler T-Zellen
sein. Dieses Phänomen wurde häufig bei Kindern mit Rag1 Defekten beschrieben (Villa et al.
2001) und könnte auch eine Erklärung für die an eine Graft versus Host Erkrankung
erinnernden Krankheitssymptome bieten (Conley et al. 1984, Thompson, O'Connor & Bastian
1984).
Da die somatische Reversion einer Mutation ein Zufallsereignis ist, müssten sich in der
analysierten LEW-Rag1 Population Tiere finden lassen, die weder B- noch T-Zellen
beherbergen. Andere Tiere dieser Population wiederum müssten eine gewisse Anzahl an
reifen T-Lymphozyten aufweisen, die dann oligoklonal wären. Da aber in ausnahmslos allen
analysierten Ratten eine gewisse Anzahl an T-Lymphozyten nachgewiesen wurde, kann eine
T-Zellentwicklung aufgrund somatischer Reversion der Mutation nahezu ausgeschlossen
werden, es sei denn, die somatische Reversion hätte schon in den Gründertieren der LEWRag1 Zucht stattgefunden. Eine materno-fötale Transfusion von T-Zellen ist eher bei
1
Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Dr. K. Schwarz, Prien am 9. Oktober 2014.
108
5 Diskussion
Einzeltieren zu erwarten. Dass T-Zellen von Muttertieren auf ihren Nachwuchs
weitergegeben werden, ist in Einzelfällen möglich. Dass dies aber in einer gesamten
Population durchgängig der Fall sein soll, erscheint sehr unwahrscheinlich und ist aufgrund
der Inzucht über mehrere Generationen hinweg nahezu auszuschließen. Um dieses Phänomen
endgültig
ausschließen
zu
können,
sind
weitere
Tests
nötig
(Kap.
5.4).
Am
Wahrscheinlichsten erscheint die zweite Hypothese, in der angenommen wird, dass es sich,
bei der eigentlich als Rag1 KO generierten LEW-Rag1 Ratte, um eine hypomorphe Mutante
mit einer gewissen Restaktivität im Rag1 handelt. Diese Hypothese belegen zum einen die
durchweg verminderten Mengen nachweisbarer Lymphozyten im FACS und zum anderen die
sowohl im Blutausstrich als auch im histologischen Präparat zu findenden mononukleären
Zellen. Auch die zwar dysplastischen, aber trotzdem vorhandenen Thymi der LEW-Rag1
Ratten spielen hier eine Rolle. Schlussendlich konnten mit den bisherigen Analysen keine
Hinweise auf Oligoklonalität des TCR Repertoires festgestellt werden. Diese Möglichkeit
kann aber zu diesem Zeitpunkt nicht vollständig ausgeschlossen werden und bedarf weiterer
Abklärung.
Die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden sich nicht nur in ihrem Verhalten in
der Zellkultur und in ihrer Ausprägung der Oberflächenmoleküle von den LEW
Lymphozyten, sondern auch in ihrem Verhalten bei Antigenkontakt. Wie Abbildung 33 zu
entnehmen ist, reagieren weder die Lymphozyten der LEW Ratten noch die Lymphozyten der
LEW-Rag1 Ratten auf das in der gemischten Leukozytenkultur substituierte Isoantigen. Den
kompletten Ausschluss einer autoimmunen Beteiligung am Krankheitsgeschehen der LEWRag1
Tiere
rechtfertigt
dieses
Ergebnis
jedoch
nicht.
Bei
den
beobachteten
Krankheitssymptomen kann es sich durchaus teilweise um autoimmune Symptome handeln,
da sie auch in keimfreier Umgebung auftreten. Gegenüber substituiertem Alloantigen und
Xenoantigen zeigen die T-Zellen der LEW-Rag1 Tiere die gleiche proliferative Aktivität.
Diese bleibt jedoch deutlich hinter der Immunantwort der LEW Lymphozyten zurück. Die TZellen der LEW-Rag1 Ratten sind also in der Lage, Antigene zu erkennen und auf diese zu
reagieren. Allerdings erfolgt ihre Reaktion deutlich schwächer, als dies bei einem intakten
Immunsystem der Fall wäre. Dieses Ergebnis könnte laut Brugnoni et al. (1997) auf einen
„Aktivierungs-induzierten Zelltod“ zurückzuführen sein. Einen weiteren Grund könnte eine
verminderte funktionelle Diversität des TCR Repertoires bilden, wodurch es nur wenigen
109
5 Diskussion
Lymphozyten möglich ist, effektiv die substituierten Antigene zu erkennen und darauf zu
reagieren.
Die LEW-Rag1 Ratten weisen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant erhöhte Anteile
der NK-Zellen an der Leukozytenpopulation auf. Deshalb ist es möglich, dass auch weitere
ILCs vermehrt in den LEW-Rag1 Ratten vorkommen und sich dadurch ein Teil der
Pathologie (Organinfiltrationen, graft-versus-host ähnliche Reaktionen) erklären lässt. Diese
dem Knochenmark entspringende Population lymphozytenähnlicher Zellen des angeborenen
Immunsystems produziert für sie charakteristische Zytokine (IFNγ, TNF, IL-5, IL-9, IL-13,
IL-17, IL-22). Außerdem erkennen sie infizierte Zellen und spielen eine Rolle bei
Entzündungsprozessen, allergischen Reaktionen und der intestinalen Homöostase (Abbas et
al. 2015, Walker, Barlow & McKenzie 2013). Ein Beweis für die Involvierung dieser
Zellpopulationen in den Phänotyp der LEW-Rag1 Ratten konnte in dieser Arbeit nicht
erbracht werden, sollte aber in zukünftigen Studien untersucht werden (Kap. 5.4).
5.1.3 Unterschiede der homozygoten und heterozygoten Träger des Gendefektes
Die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen führen zu dem Ergebnis, dass sich nicht nur die
homozygoten Träger des Rag1 Defektes von den LEW Tieren unterscheiden. Nicht ganz so
offensichtlich ist, dass sich auch Ratten, die diesen Gendefekt nur auf einem Allel tragen,
vom LEW Stamm unterscheiden. Wie in Abbildung 27 deutlich wird, entwickeln sie keine
charakteristischen Krankheitssymptome und auch an den Organen sind keine histologischen
Veränderungen sichtbar (Abb. 25). Dennoch unterscheidet sich auch bei ihnen die im FACS
nachweisbare Lymphozytenpopulation von den LEW Tieren. Die durchschnittliche Anzahl
ihrer reifen B-Zellen, reifen T-Zellen, aktivierten/regulatorischen T-Zellen und NK-Zellen
liegt zwischen den Werten von LEW und LEW-Rag1 Ratten. Es scheinen also bei
heterozygoten Trägern des Gendefektes weniger B- und T-Zellen heranreifen zu können als
bei LEW, das Immunsystem bietet diesen Tieren aber in einer spezifisch pathogenfreien
Umgebung einen genügenden Schutz. Makroskopisch und histologisch manifestiert sich keine
Erkrankung.
110
5 Diskussion
5.2 Vergleich der LEW-Rag1 Ratte mit anderen Maus- und Rattenmodellen
In Kapitel 2.3 wurden die wichtigsten Rag defizienten Mausmodelle vorgestellt. Da die Gene
Rag1 und Rag2 nur in Kombination miteinander ihre Funktion erfüllen können, reicht die
Dysfunktion eines dieser beiden Gene aus, um eine Immundefizienz auszulösen. Die von
Mombaerts et al. (1992) generierte Rag1 defiziente Maus weist, analog zu der hier
charakterisierten LEW-Rag1 Ratte, sehr kleine und zellarme lymphatische Organe auf.
Sowohl in diesen als auch im Blut konnten die Wissenschaftler keine reifen B- und TLymphozyten nachweisen. Darin unterscheidet sich das Mausmodell von Mombaerts et al.
(1992) grundlegend von der LEW-Rag1 Ratte. Des Weiteren sind diese Mäuse vital und fertil
und lassen sich während des gesamten Studienzeitraumes visuell nicht von ihrem WT
unterscheiden (Mombaerts et al. 1992a, Mombaerts et al. 1992b). Ganz im Gegenteil zu den
LEW-Rag1 Ratten, bei denen ca. 60 % aller Tiere mit einem Alter von 7-12 Wochen eine
gerötete, schuppige, haarlose Haut entwickeln, gefolgt von Gewichtsabnahme und zahlreichen
weiteren
inflammatorischen
Veränderungen
der
inneren
Organe.
Den
gleichen
Immunophänotyp wie Mombaerts et al. (1992) beschrieben auch Shinkai et al. (1992) bei
einer Rag2 defizienten Maus. Die Mäuse von Mombaerts et al. (1992) wurden in keimfreien
Isolatoren gehalten, um Infektionen vorzubeugen. Die andere Arbeitsgruppe macht dazu keine
Angaben. Der essentielle Unterschied dieser beiden Mausmodelle von der LEW-Rag1 Ratte
liegt darin, dass bei der Genmodifikation der Mäuse ein weitaus größerer Teil des Rag
modifiziert wurde und es dadurch zu einem kompletten Funktionsverlust des Rag1 oder Rag2
kam. Mombaerts et al. (1992) generierten eine 1356 bp große Deletion der Coding Sequenz
des Rag1, was mehr als einem Drittel der gesamten Genlänge entspricht. Dementsprechend
verliert das komplette Gen seine Fähigkeit, ein intaktes RAG1 Protein zu generieren. Ähnlich
verhält es sich auch bei der durch Shinkai et al. (1992) generierten Rag2 Mutation. Bei dem
527 Aminosäuren langen RAG2 Protein erfolgte eine Deletion der für 286 Aminosäuren
codierenden Bereiche, was mehr als der Hälfte des Gens entspricht. Somit handelt es sich bei
beiden Mausmodellen um Nullmutanten und einem daraus resultierenden kompletten Ausfall
der B- und T-Lymphozytenreifung. Dahingegen besitzt die LEW-Rag1 Ratte nur eine 4 bp
lange Deletion an Position 5246-5249. Diese führt zu einem verfrühten Stopcodon, sodass nur
die ersten 198 Aminosäuren des N-Terminus generiert werden können. Der übrig bleibende
Teil gehört nicht zur Core Region (Abb. 2), wodurch kein funktionsfähiges Protein vorhanden
111
5 Diskussion
sein dürfte (Zschemisch et al. 2012). Trotzdem unterscheiden sich die Mausmodelle und die
LEW-Rag1 Ratten deutlich.
Im Gegensatz zu den eben aufgeführten Rag-Nullmutanten sind auch Mausmodelle
vorhanden, die der LEW-Rag1 Ratte weitaus stärker ähneln. Dies ist zum einen eine spontane
Rag1 Mutante einer C57BL/10 Maus mit partieller Rag1 Aktivität. Die von Khiong et al.
(2007) beschriebenen Tiere zeigen, zusätzlich zu einer geröteten Haut, sowohl eine
Hepatosplenomegalie und Eosinophilie als auch erhöhte IgE Serumlevel, oligoklonal
expandierte CD4+ T-Zellen und unnatürlich hohe Anzahlen an „memory-phenotype“ TZellen. Zum anderen generierten Marella et al. (2007) einen Mausstamm mit einem
Aminosäureaustausch im Rag2. Diese Tiere zeigen ein oligoklonales T-Zellrepertoire,
verminderte Zahlen an NKT-Zellen und aktivierten T-Zellen, periphere Eosinophilie und ein
völliges Fehlen zirkulierender B-Zellen. Darm und Haut sind mit aktivierten T-Zellen
infiltriert, was zu Durchfall, Alopezie und, in manchen Fällen, zu schwerer Erythrodermie
führt (Marrella et al. 2007, Marrella et al. 2008). Gemeinsamkeiten mit den LEW-Rag1
Ratten bilden hier die Erythrodermie mit Alopezie, die vermehrte Anzahl von eosinophilen
Granulozyten im Blut, die verminderte Anzahl NKT-Zellen und das völlige Fehlen
zirkulierender B-Zellen. Auch Infiltrate mononukleärer Zellen sind bei den LEW-Rag1 Ratten
im Darm und in der Haut zu finden. Ob es sich dabei allerdings auch um aktivierte T-Zellen
handelt, ist zurzeit noch unklar. Die LEW-Rag1 Ratten beherbergen zudem auch noch
Zellinfiltrationen in vielen anderen Organen, welche zusätzlich auch durch polymorphkernige
Zellen gekennzeichnet sind. Des Weiteren konnten die oben beschriebenen erhöhten IgE
Level und oligoklonalen T-Zellen bei den LEW-Rag1 Tieren nicht bestätigt werden (Kap.
5.1).
Analog zu dem von Marella et al. (2007) beschriebenen Gendefekt liegt auch bei den Mäusen
von Khiong et al. (2007) ein durch eine Punktmutation entstandener Aminosäureaustausch
vor. Durch ein in vitro Rekombinationsassay wiesen diese Wissenschaftler eine Restaktivität
des Rag1 von 12 % nach. Den Phänotyp ihrer Mäuse führen sie auf eine Dysfunktion IL-4
und IL-6 produzierender CD4+ Lymphozyten zurück. Auch die LEW-Rag1 Ratte produziert
abnorm viel IL-6 (Kap. 4.3.4). Villa et al. (2008) führen den Phänotyp dieser Mausmodelle
112
5 Diskussion
zusammenfassend auf eine verminderte zentrale Toleranz, eine gestörte Entwicklung der
regulatorischen T-Zellen und eine homöostatische T-Zellproliferation zurück.
Im Gegensatz zu Mausmodellen gibt es kaum Rag defiziente Rattenmodelle. Das stellte einen
Grund für die Generierung der LEW-Rag1 Ratte dar. Durch ihre größeren Körpermaße eignen
sich Ratten deutlich besser für klinische Studien, die Handling und chirurgische Eingriffe
beinhalten,
als
Mäuse.
Das
lässt
Rag1
defiziente
Ratten,
besonders
für
Transplantationsstudien, gegenüber Mausmodellen in den Vordergrund treten.
Die Firma SAGE stellt Wissenschaftlern eine Rag1 defiziente Sprague-Dawley (SD) Ratte
zur Verfügung. Diese wurde mit derselben Technik generiert wie die LEW-Rag1 Ratte, weist
allerdings eine 29 bp lange Deletion in diesem Gen auf. Durchflusszytometrische Analysen
zeigen einen nahezu kompletten B-Zellverlust, es lassen sich aber noch ca. 5 % CD4+
Lymphozyten und 2,5 % CD8+ Lymphozyten im Blut dieser Ratten nachweisen (SAGE Labs
2015). Dies ist etwas weniger als bei den LEW-Rag1 Ratten (7,2 % und 2,8 %), aber es ist
auch hier eine Differenz zu den Mausnullmutanten zu erkennen. Da eine vollständige
phänotypische Charakterisierung dieses Rattenmodells noch fehlt, sind keine weiteren
Vergleiche möglich. Für Studien mit einer Rag1 defizienten Ratte könnte sich ein auf dem
LEW Stamm basierendes Tiermodell eventuell besser eignen, da es sich hierbei um einen
Inzuchtstamm, und nicht wie bei SD um einen Auszuchtstamm, handelt.
Mit Hilfe von Meganukleasen haben Ménoret et al. (2013) ebenfalls eine Rag1 defiziente
Ratte generiert. Sie beschreiben sie selber als Rag1-KO und haben ihn auch phänotypisch
charakterisiert. Die Tiere weisen eine 5 bp große Deletion, bestehend aus einer 8 bp Deletion
und einer 3 bp Insertion, bei Aminosäure 245 auf, gefolgt von einem Stopcodon an Position
751. Wie es auch bei Zschemisch et al. (2012) der Fall war, konnten Ménoret et al. (2013)
kein RAG1 Protein im Thymus mittels Western Blot nachweisen. Des Weiteren zeigt deren
Rattenmodell signifikant kleinere lymphatische Organe und verminderte totale Zellzahlen
dieser, wie es auch bei der LEW-Rag1 Ratte der Fall ist. Die einzige Ausnahme bildet dabei
die Milzgröße, welche bei LEW-Rag1 annähernd unverändert zu den LEW Ratten ist.
Abgesehen davon, dass die FACS Analysen der WT Ratten von Ménoret et al. (2013) andere
Werte ergeben als die von LEW, gleicht sich die Reduktion der CD4+ und CD8+ T-Zellen in
der Milz und im Thymus dieser beiden Rag1 defizienten Modelle. Im Gegensatz zur LEW-
113
5 Diskussion
Rag1 konnten die Wissenschaftler bei der Rag1 defizienten SD Ratte noch einen, wenn auch
sehr kleinen, Anteil an B-Zellen in der Milz und im Knochenmark nachweisen. Im Blut, in
der Milz und in den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten war dies nicht der Fall, jedoch
gleichen sich die zur Analyse herangezogenen Antikörper und Auswertstrategien zum BZellnachweis in diesen beiden Studien nicht. Des Weiteren beschrieben Ménoret et al. (2013)
ihre NK-Zellpopulation als normal, wohingegen die LEW-Rag1 Ratte eine deutliche
Vergrößerung dieser Population zeigt. Die verminderten Immunglobulinlevel können nur für
IgG bestätigt werden. Ähnlich zu den LEW-Rag1 Ratten zeigen auch die Rag1 defizienten SD
Ratten eine verminderte Reaktion beim Kontakt mit Alloantigenen. Bei beiden
Rattenstämmen ist also noch eine Immunantwort in abgeschwächter Form zu beobachten,
diese lässt sich allerdings bei der LEW-Rag1 Ratte deutlicher auf die T-Lymphozyten
zurückführen. Trotzdem scheint es unbestritten, dass auch die beschriebenen Rag1 defizienten
SD Ratten noch funktionierende T-Zellen besitzen. Aussagen über deren Aktivitätsstaus
fehlen in der Literatur allerdings.
In allen Veröffentlichungen über die in diesem Kapitel beschriebenen Tiermodelle wurden
Angaben über die genauen Veränderungen des Rag oder dessen Protein gemacht. Während
die klinisch gesund erscheinenden Mäuse von Mombaerts et al. (1992) komplett keimfrei
gehalten wurden, lebten die beiden letztgenannten Mausstämme, die Symptome entwickeln,
in spezifisch pathogenfreien Haltungen. Bedauerlicherweise wird der Leser über die
hygienischen Bedingungen der Haltungen der Ratten von Ménoret et al. (2013) und der
Mäuse von Shinkai et al. (1992) im Unklaren gelassen. Es zeigt sich aber bei den keimfrei
gehaltenen LEW-Rag1 Ratten, im Vergleich zu anderen Rag1 defizienten Tieren, ein sehr
schwerer und degenerativer Krankheitssymptomkomplex, welcher nur in Teilen anderen
Modellen gleicht. Zudem könnte die LEW-Rag1 Ratte sich als Modell für klinische Studien,
in denen Handling und chirurgische Eingriffe notwendig sind, besser eignen als Mausmodelle
mit wesentlich geringerer Körpergröße. Dazu zählen vor allem Transplantationsstudien. Zu
guter Letzt handelt es sich bei der LEW-Rag1 Ratte um einen Inzuchtstamm, was ihr
hinsichtlich besserer Standardisierbarkeit von Studien, den anderen beiden Rag1 defizienten
Rattenstämmen gegenüber einen Vorteil verschafft.
114
5 Diskussion
5.3 Übertragbarkeit des LEW-Rag1 Phänotyps auf das Omenn Syndrom
Wie Aitman et al. (2008) feststellen, ist die Ratte eine physiologisch und experimentell
wichtige Spezies, die gegenüber Mausmodellen nicht ins Hintertreffen geraten sollte. So
eignen sich immundefiziente Rattenmodelle aufgrund ihrer größeren Körpergröße besser für
bestimmte
Studien
als
Mäuse.
Beim
OS
handelt
es
sich
um
eine
schwere
Immundefizienzerkrankung (Kap. 2.2.2), deren pathogenetische Mechanismen immer noch
nicht vollständig geklärt sind (Villa et al. 2008) und für die es bis dato, außer einer
Knochenmarktransplantation oder der Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut,
keine erfolgreichen Therapiemaßnahmen gibt (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006). Ob
die LEW-Rag1 Ratte als potentielles Rattenmodell für das OS geeignet ist, soll in diesem
Kapitel diskutiert werden.
Typische Symptome des OS sind chronischer Durchfall, Pneumonien und andere schwere
Infektionen, gefolgt von Entwicklungsstörungen, die sich durch vermindertes Wachstum
bemerkbar machen (Villa et al. 2008). Dabei muss bedacht werden, dass sich die betroffenen
Kinder in einer normalen, mit zahlreichen Keimen belasteten Umwelt aufhalten und deshalb
viele der angesprochenen Symptome infektiöser Natur sein können. Trotzdem werden keine
Zellinfiltrate in weiteren Organen beschrieben, die bei den LEW-Rag1 Ratten einen wichtigen
Teil des Krankheitsbildes ausmachen. Demgegenüber werden bei OS Patienten vergrößerte
lymphatische Gewebe (z.B. Hepatosplenomegalie), Thymusdysplasie, Erythrodermie,
Alopezie und Eosinophilie beobachtet. Alle Immunglobulinlevel stellen sich erniedrigt dar,
nur das IgE ist erhöht (Hönig, Schwarz 2006, Kato et al. 2006, Villa et al. 1999, Villa et al.
2008). Auch die LEW-Rag1 Ratte entwickelt Alopezie, gerötete Haut, eine Eosinophilie des
Blutes und infektionsähnliche Symptome der Atemwege und des Gastrointestinaltraktes.
Dazu kommen vergrößerte Lymphknoten bei erkrankten Tieren sowie bei allen Tieren eine
Thymusdysplasie. Auch die bei der LEW-Rag1 Ratte gefundenen erniedrigten IgG Level
stimmen mit den Symptomen des OS überein, wohingegen erhöhte IgE Level nicht
nachgewiesen werden konnten.
Der Anteil reifer T-Zellen im Blut kann beim OS sowohl normal sein als auch erhöht (Villa et
al. 1999) und es handelt sich dabei um oligoklonale, aktivierte Lymphozyten mit einem
eingeschränkten TCR Repertoire, hauptsächlich vom Th2-Typ und einer verschobenen
115
5 Diskussion
CD4+/CD8+ Ratio (Schandene et al. 1993, Signorini et al. 1999). Diese Zellen zeigen in vitro
eine verminderte proliferative Antwort auf Mitogene. Die einzige Aussage, die bis jetzt für
die T-Zellen der LEW-Rag1 Tiere getroffen werden kann, ist, dass diese Ratten signifikant
geringere T-Zellanzahlen im Blut und der Milz aufweisen, von denen ein größerer Anteil
aktiviert ist und die ähnlich dem OS ein verschobenes Verhältnis von CD4+ zu CD8+
Lymphozyten aufweisen. Ob es sich dabei um oligoklonale Zellen mit eingeschränktem
Rezeptorrepertoire handelt, konnte noch nicht bestätigt werden (Kap. 4.5.3). Die in vitro
Stimulierbarkeit der T-Lymphozyten durch Antigene ist analog zum OS auch bei den LEWRag1 Ratten vermindert. Beide Symptomkomplexe beinhalten ein nahezu komplettes Fehlen
von B-Zellen (Aleman et al. 2001). Während OS Patienten normale bis erhöhte NK-Zellwerte
bei normaler Zellfunktion aufweisen (Aleman et al. 2001, Villa et al. 2008), kommen diese
Zellen anteilsmäßig im Blut der LEW-Rag1 Ratten durchschnittlich um das Dreifache erhöht
vor. Dies muss allerdings keine absolute Erhöhung der NK-Zellanzahl bedeuten, da, wie eben
beschrieben, die Anzahl der Lymphozyten im Blut vermindert ist und somit anteilsmäßig die
NK-Zellen bei den LEW-Rag1 Ratten häufiger vertreten sind. Somit ähneln sich die NKZellpopulationen der an OS erkrankten Patienten und der LEW-Rag1 Ratten.
Die das OS auslösenden Rag Defekte entstehen in den häufigsten Fällen durch
Aminosäureaustausche, seltener durch in-frame Deletionen (Sobacchi et al. 2006). Dadurch
wird das Leseraster nicht verschoben und die V(D)J-Rekombination lediglich abgeschwächt.
Das Gen verliert also nicht seine komplette Funktion und es wird ein zumindest teilweise
funktionsfähiges Protein synthetisiert. Obwohl es sich bei dem Gendefekt der LEW-Rag1
Ratte mit 4 bp um eine Mutation mit Verschiebung des Leserasters handelt (Zschemisch et al.
2012), so scheint auch bei diesem Rattenstamm noch eine verminderte V(D)J-Rekombination
vorzukommen, wodurch noch ein gewisser Anteil reifer T-Zellen in den Tieren nachgewiesen
werden kann.
Das OS und der Symptomkomplex der LEW-Rag1 Ratten gleichen sich in vielen Punkten im
Hinblick auf die funktionellen Eigenschaften der T-Zellpopulationen und die Ausprägung der
Krankheitssymptome. Die LEW-Rag1 Ratten weisen viele der beschriebenen Symptome auch
in einer keimfreien Umwelt auf. Jedoch scheinen vorhandene Umweltkeime das
Krankheitsbild negativ zu beeinflussen. Auch die im Verlauf des OS auftretenden Symptome
116
5 Diskussion
sind teilweise auf (fakultativ) pathogene Erreger im Zusammenspiel mit einem geschwächten
Immunsystem zurückzuführen (Villa et al. 2008). Einen weiteren Anteil machen auch dort
autoimmune Reaktionen aus (Hönig, Schwarz 2006, Villa et al. 2008).
Trotz alledem gleichen sich die Symptomkomplexe der LEW-Rag1 Ratten und der OS
Patienten nicht vollständig. Patienten mit dem OS besitzen deutlich höhere Anzahlen reifer TLymphozyten im Organismus als die LEW-Rag1 Ratten. Auch scheinen aus histologischer
Sicht bei der LEW-Rag1 Ratte deutlich mehr Organe involviert zu sein, als dies bei Menschen
mit dem OS beschrieben ist. Als Modell für das OS eignet sich die LEW-Rag1 Ratte zu
diesem Zeitpunkt von allen verfügbaren Rattenmodellen am besten. Die Mausmodelle mit
unvollständigem Rag-KO weisen allerdings einen ähnlicheren Gendefekt und größere
Gemeinsamkeiten der T-Lymphozytenpopulationen mit OS-Patienten auf.
5.4 Ausblick
Wie schon in den vorherigen Kapiteln angesprochen wurde, bleiben für eine vollständige
Charakterisierung der LEW-Rag1 Ratte noch zahlreiche Fragen, sowohl auf phänotypischer
als auch auf genotypischer Ebene, offen. So ist zum Beispiel laut Zschemisch et al. (2012) das
in der LEW-Rag1 Ratte synthetisierte RAG1 Protein so kurz, dass die komplette Core Region
nicht mehr vorhanden ist und somit das Protein eigentlich seine komplette Funktion verlieren
müsste. Trotzdem sind im Blut und in den sekundären lymphatischen Organen dieser Tiere
reife T-Lymphozyten nachweisbar und auch eine, wenn auch verminderte, Reaktion auf
Antigene lässt sich feststellen. Gründe dafür wurden in Kapitel 5.1.2 diskutiert. Um endgültig
eine Aussage über die Herkunft dieser T-Zellen treffen zu können, sollten zum Ausschluss
einer materno-fötalen Transfusion per FACS gesortete T-Zellen männlicher Tiere auf einen
weiblichen Chromosomensatz überprüft werden (Conley et al. 1984) und funktionelle V(D)JAssays zum Nachweis einer eventuellen Restaktivität des Rag1 durchgeführt werden (Hesse
et al. 1987, Lieber et al. 1987, Gauss et al. 1998). Des Weiteren wäre es hilfreich, über den 4
bp Deletionsbereich in gesorteten T-Zellen mehrerer LEW-Rag1 Ratten der derzeitigen
Generationen zu sequenzieren, um sicher zu gehen, dass keine somatische Reversion
stattgefunden hat. Auch wäre es hilfreich, das ganze Rag1 erneut zu sequenzieren, um
eventuelle kompensatorische Mutationen, die den reading frame wiederherstellen können,
117
5 Diskussion
auszuschließen2. Zur vertiefenden phänotypischen Charakterisierung ist eine genauere
Analyse des TCR Repertoires nötig. Nachdem die Ergebnisse der MLC Hinweise auf eine
verminderte funktionelle Diversität der TCR geben, kann dieses Ergebnis mithilfe
struktureller Analysen gestützt werden. Hinweise zur strukturellen Diversität des TCR
Repertoires kann neben den FACS Analysen auch eine Klonierung mit anschließender PCR
geben (Signorini et al. 1999). Darin wäre ein oligoklonales TCR Repertoire anhand
unterschiedlicher Banden zu erkennen. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit nicht explizit
eine Eosinophilie im Gewebe der Ratten nachgewiesen werden. Hierzu fehlt eine
Unterscheidungsmöglichkeit der im histologischen Bild sehr eosinophil erscheinenden
neutrophilen bzw. eosinophilen Granulozyten in der H&E-Färbung. Unterscheidungshilfen
könnten hier immunhistochemische Färbungen bieten. Auch die FACS Analysen könnten
noch etwas differenzierter betrieben werden. Hierzu würde sich eine Dreifachfärbung von
CD3, CD4 und CD8 anbieten, um eventuell vorkommende DP Lymphozyten sicher zu
erkennen. Auch die Populationen regulatorischer und aktivierter T-Lymphozyten ließen sich
mit Hilfe eines veränderten Färbeprotokolls besser abgrenzen. Zusätzlich könnte eine
differenziertere Betrachtung der mononukleären Zellen und deren Verteilung im
Organgewebe mittels Immunhistochemie durchgeführt werden. Um einen Einfluss der ILCs
auf den Phänotyp der LEW-Rag1 Ratten nachweisen zu können, ist es nötig, ihr Vorkommen
explizit in den betroffenen Organen und im Blut nachzuweisen. Dies könnte mithilfe
durchflusszytometrischer Analysen und dem Nachweis charakteristischer Zytokine in den
Geweben geschehen. Abschließend könnte auch das Knochenmark der LEW-Rag1 Ratten,
sowohl immunhistochemisch als auch durchflusszytometrisch, genauer analysiert werden, um
Aussagen über Vorläufer der B-Zellpopulation treffen zu können, wie es unter anderem auch
Ménoret et al. (2013) getan haben.
2
Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Dr. K. Schwarz, Prien am 9. Oktober 2014.
118
6 Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Katharina Schulz
Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte. Ein neues immunsupprimiertes
Tiermodell.
Die Gene Rag1 und Rag2 sind unerlässlich für die Reifung der Lymphozytenvorläufer zu Tund B-Zellen. Sie bewirken eine effiziente Rekombination der Gene der Antigenrezeptoren
und Immunglobulinmoleküle und sorgen somit für deren große Diversität und
Antigenspezifität. Sind diese Gene in ihrer Funktion gestört, kommt es zur Ausprägung
zahlreicher Immundefizienzerkrankungen, für die es nur wenige Therapiemöglichkeiten gibt.
Zu diesen zählt auch das humane Omenn Syndrom.
Das Hauptziel dieser Arbeit bildet die phänotypische Charakterisierung der Rag1 defizienten
LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte. Weiterführend wurde dieses Rattenmodell mit weiteren Rag
defizienten murinen Tiermodellen verglichen und seine Verwendbarkeit als Modell für das
Omenn Syndrom überprüft. Dazu wurde zum einen die klinische Ausprägung dieses
Gendefektes analysiert und zum anderen dessen Einfluss auf die Lymphozytenpopulation in
dieser Ratte untersucht.
Aus diesen Analysen kann geschlussfolgert werden, dass die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratten im
Alter von 7 bis 12 Wochen zahlreiche klinische Symptome entwickeln. Dazu zählen
Hautrötung
und
–schuppung,
Alopezie,
Durchfall,
Infektionen
der
Atemwege,
Gewichtsverlust und Thymusdysplasie. Im histologischen Bild zeigen sich diffuse
Infiltrationen mit Entzündungszellen in den lymphatischen Organen, den Lungen, Lebern,
Speicheldrüsen, dem Gastrointestinaltrakt und der Haut. Im Blut und den lymphatischen
Organen der Rag1 defizienten Ratten sind keine reifen B-Zellen nachweisbar. Die Anzahl der
T-Lymphozyten ist signifikant vermindert. Diese Zellen weisen einen vermehrt aktivierten
Phänotyp auf und zeigen in vitro eine verminderte Immunreaktion beim Kontakt mit
Antigenen. Der Anteil der NK-Zellen in diesen Tieren ist erhöht. Des Weiteren weisen sie
verminderte IgG Level und erhöhte Zytokinkonzentrationen im Blutserum sowie eine
Eosinophilie im Blut auf.
119
6 Zusammenfassung
Bis auf wenige Ausnahmen nähert sich dieser Phänotyp stark dem des Omenn Syndroms an.
Im Hinblick auf die Verwendbarkeit eines Tiermodells für diese Krankheit eignet sich die
LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte gegenüber den anderen verfügbaren Rattenmodellen am besten.
In der Zukunft sollte der genaue Mechanismus geklärt werden, aufgrund dessen es zu der
Entwicklung einer eingeschränkten T-Zellpopulation in diesem Rattenstamm kommt.
120
7 Summary
7 Summary
Katharina Schulz
Characterization of the LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rat. A new immunodeficient animal
model.
The genes Rag1 and Rag2 are essential for the maturation of immature lymphocytes to mature
B and T cells. They induce an efficient gene recombination of antigen receptors and
immunoglobulin molecules, leading to a large diversity and antigen specificity. Malfunction
of these genes leads to a large number of immune deficiency diseases with a rare number of
therapies. One of these is the human Omenn Syndrome.
The main objective of this work is the phenotypical characterization of the Rag1 deficient
LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rat. Furthermore, this rat model was compared with other murine Rag
deficient animal models and its suitability for modelling the human Omenn Syndrome was
verified. To ensure these points, the clinical manifestation of the gene defect and the influence
of the gene defect on the lymphocyte population of these rats were analyzed.
It can be concluded, that the LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rats develop clinical symptoms like
reddened and scabby skin, alopecia, diarrhea, respiratory tract infections, failure to thrive,
eosinophilia and thymus dysplasia at 7 to 12 weeks of age. The histological analysis shows
diffuse infiltrations with inflammatory cells of the lymphatic organs, the lungs, liver, salivary
glands, the gastrointestinal tract and the skin. The blood and the lymphoid organs reveal a
total lack of B cells and a significantly reduced number of mature T cells. An increased
number of these T cells show an activated phenotype and the T cells show a decreased
immune response to antigens in vitro. The amount of NK cells in these animals is elevated.
Furthermore, they exhibit reduced serum levels of IgG and elevated serum levels of
cytokines.
Apart from a few numbers of exceptions this phenotype resembles tightly the Omenn
Syndrome. The LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rat is therefore seen as the best rat model for Omenn
Syndrome.
121
7 Summary
Prospectively the mechanism should be investigated, which leads to the residual population of
T lymphocytes in this rat.
122
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132
9 Anhang
9 Anhang
9.1 Material und Methoden
9.1.1 Geräte
Beta Plate Scint
Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland
Biofuge fresco
Heraeus, Hanau, Deutschland
Bio-Plex TM 200
BIORAD Laboratories Inc., München,
Deutschland
Chemistry-Immuno Analyzer „AU5400“
Olympus, Melville, NY, USA
CO2- Inkubator „incusafe”
Sanyo, Etten Leur, Niederlande
Combitips versch. Größen
Brand, Wertheim, Deutschland
Counter „Wallac Trilux 1450 Microbeta”
Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland
Entwässerungsautomat „STP120“
ThermoScientific, Braunschweig,
Deutschland
FACS Calibur
Becton Dickinson, Heidelberg,
Deutschland
Färbeautomat „Gemini AS“
ThermoScientific, Braunschweig,
Deutschland
Feinwaage „LA2305“
Sartorius, Göttingen, Deutschland
Filter Mate Harvester
Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland
Gallios TM Flow Cytometer
Beckman Coulter GmbH, Krefeld,
Deutschland
Laborwaage „TE1502S“
Sartorius, Göttingen, Deutschland
Lichtmikroskop
Zeiss, Jena, Deutschland
Lichtmikroskop „Axioscop40“
Zeiss, Jena, Deutschland
Mikroskopkamera „AxioCamMRc”
Zeiss, Jena, Deutschland
133
9 Anhang
Mikrotome „2030 und 2040“
Reichert-Jung, München, Deutschland
Multidispenser „HandyStep“
Brand, Wertheim, Deutschland
Multifuge 3SR+
Heraeus, Hanau, Deutschland
Neubauer Zählkammer
Omnilab, Bremen, Deutschland
pH-Meter „766 Calimatic“
Knick, Berlin, Deutschland
SCIL Vet abcTM, Hämatologiegerät
SCIL animal care company, Viernheim,
Deutschland
Victor TM X3, 2030 Multilabel Reader
Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland
9.1.2 Reagenzien
Eosin
Merck KGaA, #1.15935.0100
Ethanol 99 % (vergällt mit 1 % MEK) - Ethanol
642
Scharr, #001-20385
Formaldehyd säurefrei ≥ 37%, für die Histologie
Carl Roth GmbH, #P733.2
Giemsas Azur-Eosin-Methylenblaulösung für
die Mikroskopie
Merck KGaA, #1.09204.2500
HCl 25 %
Merck KGaA, #1.00316.1000
Mayers Hämalaun
Merck KGaA, #1.09249.2500
May-Grünwalds Eosin-Methylenblaulösung
modifiziert für die Mikroskopie
Merck KGaA, # 1.01424.0500
Methyl-3H-Thymidin
Perkin Elmer, #NET-027A
Paraffin
Medite GmbH, #40-0021-00
Trypan Blue Solution
Sigma Aldrich, #T8154
Xylol
Avantor, #8118
134
9 Anhang
9.1.3 Verbrauchsmaterialien
96-well Platten für ELISA
Nunc, #442404
Cellstar® Tubes (15, 50 ml)
Greiner Bio-One, #188271
Deckgläser
Gerhard Menzel GmbH, #BB024050A1
FACS Röhrchen (5 ml)
Sarstedt, #551578
Injekt® Einmal-Spritzen (1, 2, 5, 10, 20 ml)
Braun, #4606051V
Mikro-Hämatokrit-Kapillaren, Na-hep.
Brand, #749311
Objektträger; geschnitten, Mattrand
Gerhard Menzel GmbH,
#AA00000112E03MNZ10M
Printed Filtermat A
Perkin Elmer, #1450-421
Probengefäß 1,3 ml K3E für hämatologische
Untersuchungen
Sarstedt, #41.1504.005
Standardeinbettkassetten
Medite GmbH, #46-1103-00
Sterican® Einmal-Injektionskanülen
Braun, #4657519
Zellsiebe; 40μm, Nylon
Falcon®, #352340
9.1.4 Verwendete Kits
Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 24-plex Assay
BIORAD Laboratories Inc., München,
Deutschland
Foxp3 Fix/Perm Buffer Set
Biolegend, Fell, Deutschland
Rat IgE ELISA Quantitation Set
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,
TX, USA
Rat IgG ELISA Quantitation Set
Bethyl Laboratories Inc., Montgomery,
TX, USA
135
9 Anhang
9.1.5 Computerprogramme
AxioVision
Zeiss, Jena, Deutschland
Bio-Plex ManagerTM 6.1
BIORAD Laboratories Inc., München,
Deutschland
CellQuest Pro®
BD, Heidelberg, Deutschland
GraphPad Prism5®
GraphPad Software, Inc.; La Jolla, CA,
USA
Kaluza Flow Cytometry Analysis 1.2
Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland
Kaluza for Gallios 1.0
Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland
WorkOut 2.5
Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland
9.1.6 Protokolle der histologischen Arbeiten
Tabelle 13: Protokoll für die Entwässerung
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Chemikalie
Formalin 4 %
Formalin 4 %
Alkohol 70 %
Alkohol 80 %
Alkohol 96 %
Alkohol 100 %
Alkohol 100 %
Alkohol 100 %
Xylol
Xylol
Paraffin
Paraffin
Dauer (h)
01:00
01:00
01:30
01:30
01:30
01:00
01:00
01:00
01:30
01:30
02:00
02:00
136
Temperatur
RT
RT
RT
RT
RT
RT
RT
RT
RT
RT
62 °C
62 °C
9 Anhang
Tabelle 14: Protokoll der H&E Färbung
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Chemikalie
Dauer (Min)
Xylol
03:00
Xylol
03:00
Alkohol 100 %
01:00
Alkohol 90 %
01:00
Alkohol 70 %
01:00
Aqua dest.
00:30
Hämalaun
05:00
H2O dest.
01:00
HCl-Alkohol 1 %
00:10
Aqua dest.
03:00
Eosin
05:00
Aqua dest.
01:00
Alkohol 70 %
00:30
Alkohol 90 %
01:00
Alkohol 100 %
01:00
Xylol
04:30
137
9 Anhang
9.1.7 Antikörper
Tabelle 15: Antikörper für allgemeine Analysen
Antigen und Färbung
Klon
Mouse Anti-Rat CD8a PerCP
Ox-8
Mouse Anti-Rat CD8b FITC
341
Mouse Anti-Rat CD4 FITC
Ox-38
Mouse Anti-Rat TCRα/β FITC
R73
Mouse Anti-Rat CD45RA FITC
Ox-33
Mouse Anti-Rat CD3 FITC
1F4
Mouse Anti-Rat CD161 FITC
10/78
Mouse Anti-Rat CD8a PE
Ox-8
Mouse Anti-Rat CD3 PE
G4.18
Mouse Anti-Rat CD4 PE
Ox-38
Mouse Anti-Rat CD25 PE
Ox-39
Anti-Mouse/Rat Foxp3 FITC
FJK-16s
138
Firma
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
AbD Serotec, Puchheim,
Deutschland
AbD Serotec, Puchheim,
Deutschland
AbD Serotec, Puchheim,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
eBioscience, Frankfurt a.M.,
Deutschland
9 Anhang
Tabelle 16: Antikörper für die Analyse des αβTCR Repertoires
Antigen und Färbung
Mouse Anti-Rat TCRα/β
Bio + SA-PE
Mouse Anti-Rat Vα4
+ Gam-FITC
Mouse Anti-Rat Vα8
+ Gam-FITC
Mouse Anti-Rat Vβ10
+ Gam-FITC
Mouse Anti-Rat Vβ8.2. 8.4
+ Gam-FITC
Mouse Anti-Rat Vβ16
+ Gam-FITC
Mouse Anti-Rat Vβ8.5
+ Gam-FITC
Klon
Mouse Anti-Rat CD3 PE
G4.18
R73
G99
G177
G101
R78
HIS 42
B73
Streptavidin-PE
Gam-FITC
Herkunft
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
**
**
**
**
**
**
BD Pharmingen, Heidelberg,
Deutschland
BD, #349023
Dianova, #115-096-068
** Die Antikörper wurden der Klinik für Allgemein-, Visceral- und
Transplantationschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover von Prof. T.
Hünig (Uni Würzburg) zur Verfügung gestellt. Für weitere Informationen siehe
Torres-Nagel et al. (1994). (Torres-Nagel et al. 1994)
139
9 Anhang
9.1.8 Lösungen und Reagenzien für ELISA
Tabelle 17: Bicarbonat/Carbonat Coating Puffer (100mM)
Substanz
Menge
H2O dest.
1l
Firma
NaHCO3
6,0 g
Sigma, #S5761-500G
Na2CO3
pH
3,03 g
9,6
Merck, #6392
Tabelle 18: ELISA Waschlösung
Substanz
Tris
NaCl
Tween 20
pH
Menge
50 mM
0,14 M
0,05%
8
Firma
Carl Roth, #5429.2
AppliChem, #A2942,5000
Carl Roth, #9127.1
Tabelle 19: ELISA Blockinglösung
Substanz
Tris
NaCl
BSA
pH
Menge
50 mM
0,14 M
1%
8
Firma
Carl Roth, #5429.2
AppliChem, #A2942,5000
Sigma, #A9647-50G
Tabelle 20: ELISA Proben-/ Konjugatverdünnung
Substanz
Tris
NaCl
BSA
Tween 20
Menge
50 mM
0,14 M
1%
0,05%
Firma
Carl Roth, #5429.2
AppliChem, #A2942,5000
Sigma, #A9647-50G
Carl Roth, #9127.1
140
9 Anhang
9.1.9 Befundbogen des Tierpflegepersonals
Datum
Allgemeinbefinden obB
Porphyrrinsekret sichtbar
Gerötete Haut
Nase
Ohren
Kopf
Rücken
Bauch
Gliedmaßen
Schwanz
Haarverlust Kopf
wenig
mittel
viel
Haarverlust Rücken
wenig
mittel
viel
Haarverlust Bauch
wenig
mittel
viel
Haarverlust Gliedmaßen
vorne
hinten
wenig
viel
Schuppen / Krusten
Ohren
Nase
Kopf
Rücken
Bauch
Gliedmaßen
Schwanz
Putzt sich viel
Speichelt stark
Gewichtsverlust
Trinkt viel
Niest
Durchfall
Sonstiges
141
9 Anhang
9.2 Ergebnisse
9.2.1 Reproduktionsparameter
Tabelle 21: Reproduktionsparameter der LEW und LEW-Rag1 Ratten
VerpaarungsWeibchen zeitraum
(Monate)
LEW-Rag1 151/17
KF
152/17
153/17
165/17
163/17
164/17
158/17
183/17
202/17
203/17
188/17
224/17
223/17
109/18
112/18
113/18
114/18
159/18
160/18
152/18
153/18
SPF3
172/28
173/29
196/31
194/32
195/33
179/34
187/35
185/36
188/37
184/38
186/39
193/41
Zwischenwurfzeit ∅
Anzahl
Würfe
8
4
1,5
3
1
2
4,5
4
1
4
1,5
5
1,5
8
5
3
5
2
3,5
3
1
4,5
7
3
6
6
6
1,5
6
6
5
5
8,5
2
1
0
2
0
1
2
2
1
2
1
2
0
1
4
1
3
1
0
2
1
2
2
2
0
4
0
0
1
1
2
0
6
142
Abgesetzte
Jungtiere
pro Wurf
Wurfgröße
∅
56
9
5
9
5
29
6,5
6,5
4
6,5
9
5
8,5
6
8,5
4
6,5
9
5
8,5
6
8,5
5
6,25
5
8
6
5
6,25
4
8
6
30
29
63
8
4
8,5
4,5
9,5
4
4
7,5
4
9,5
40
3,5
2,5
59
7
6
5
7
5
5
39
4,3
4,3
75
39
49
25
41
55
38
9 Anhang
SPF4
LEW
301/44
311/45
317/46
319/47
320/48
308/49
309/50
322/51
323/52
85/14
86/15
161/16
160/17
208/18
206/19
212/20
251/22
252/23
257/24
258/25
232/26
279
273
272
271
V162
V163
274
277
278
275
282
283
279
281
276
280
6
3
6,5
1,5
3
2,5
2,5
2
1,5
12
12
8
8
6
1,5
1
2
4
3
2
1
6
6
6
6
8
8
7
6
6
9
8
8
7
6,5
8,5
6,5
2
1
0
0
0
0
0
0
0
8
4
4
2
1
1
1
0
2
0
1
1
3
4
2
2
2
3
1
1
2
3
3
3
3
3
5
4
143
34
40,3
44,7
48
22
58,3
47,5
47
47
38
70,5
82
49,5
33,5
56,5
60,5
68
46,25
46
4
3
4
3
5,75
6,25
8
11,5
8
5
0
5,4
6,25
8
11,5
8
5
0
8
4
6
9
6,25
5
5,7
7,7
6,5
9,3
10
5
5
7,7
5,7
8,7
9,3
7,7
7,2
7
6
9
6,25
5
5,3
7,7
6,5
9
10
5
5
7
5,7
8,7
9
7,3
7
5,25
144
Abbildung 54: Unterschiede in der Zytokin- Chemokin und Wachstumsfaktorkonzentration im Serum zwischen LEW und
LEW-Rag1 Ratten und LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen (n=6-10)
9.2.2 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren
9 Anhang
145
Abbildung 55: Unterschiede der Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen im Serum zwischen gesunden
und erkrankten LEW-Rag1 Ratten
(n=22-50)
9 Anhang
Danksagung
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei den Menschen bedanken, ohne deren Unterstützung und
Engagement diese Doktorarbeit nie zustande gekommen wäre.
Mein erster Dank gilt Herrn Prof. André Bleich, der mir diese Arbeit zu Teil werden ließ, bei
Problemen immer ansprechbar war und mich während der gesamten Zeit unterstützt hat.
Ganz besonders danken möchte ich Frau Dr. Silke Glage für die angenehme, engagierte
Betreuung meiner Arbeit. Danke, dass du mir so viel Freiraum gelassen hast!
Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Gerhard Breves für die Begutachtung dieser
Arbeit bedanken.
Ein weiterer besonderer Dank gilt Elena Wiebe für die unermüdliche Aufarbeitung meiner
schier endlos erscheinenden Flut an histologischen Proben.
Zudem danke ich den Arbeitsgruppen Genetik und Mikrobiologie für die genetische
Überwachung und mikrobiologischen Untersuchungen meiner Ratten. Besonders danken
möchte ich hier Herrn PD Dr. Dirk Wedekind für seine Unterstützung und Ideen. Dr. Manuela
Büttner danke ich für die Unterstützung am Durchflusszytometer.
Darüber hinaus bedanke ich mich bei den Tierpflegern des ZTL für die Betreuung der
Haltung und der Zucht meiner Ratten. Ein besonderer Dank geht an Petra Meyer und Jasmin
Goralski, die mich sehr unterstützt haben.
Ich danke auch Herrn Dr. Joachim Hundrieser für die vielen Anregungen zu meinem Projekt,
sein großes Engagement und die Bereitstellung seiner Ressourcen für die Zellkulturen. Vielen
Dank auch an Britta Trautewig für die gemeinsame Durchführung der Leukozytenkulturen
und FACS Analysen.
Vielen Dank Sandra, Meike, Anne-Sophie, Inga und Stephi, für fachliche und private
Gespräche, Aufmunterungen, Zusammenhalt und Eisessen.
Mein letzter großer Dank gilt meiner Familie und Jan. Danke für eure Unterstützung und
dafür, dass ihr immer ruhig bleibt, wenn ich es nicht bin!
146
Hannover 2015
Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1
Dissertation
ISBN 978-3-86345-299-5
Katharina Schulz
Ratte
- Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell -
Katharina Schulz
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH
35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de
em1Ztm
- Hannover 2015 -
Medizinische Hochschule
Hannover
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