Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1 Ratte
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Hannover 2015 Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1 Dissertation ISBN 978-3-86345-299-5 Katharina Schulz Ratte - Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell - Katharina Schulz Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375 E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de em1Ztm - Hannover 2015 - Medizinische Hochschule Hannover Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar. 1. Auflage 2015 © 2015 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN 978-3-86345-299-5 Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen 0641/24466 [email protected] www.dvg.de Tierärztliche Hochschule Hannover Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte - Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell - INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Katharina Schulz Neustadt am Rübenberge Hannover 2015 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. André Bleich, PhD Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium, Medizinische Hochschule Hannover 1. Gutachter: Univ.-Prof. André Bleich, PhD 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Gerhard Breves Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2015 Diese Arbeit wurde durch das Exzellenzcluster REBIRTH gefördert. Für Biene Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................. V Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................. IX Tabellenverzeichnis .................................................................................................................XII 1 Einleitung ................................................................................................................................ 1 1.1 Hintergrund ....................................................................................................................... 1 1.2 Ziele der Arbeit ................................................................................................................. 2 2 Theoretische Grundlagen ........................................................................................................ 3 2.1 Immunsystem.................................................................................................................... 3 2.1.1 B- und T-Zellreifung .................................................................................................. 5 2.1.2 Rag1 und V(D)J-Rekombination ............................................................................... 8 2.2 Primäre Immundefizienzerkrankungen .......................................................................... 10 2.2.1 Schwere kombinierte Immundefizienzerkrankungen .............................................. 10 2.2.2 Omenn Syndrom ...................................................................................................... 13 2.3 Immundefiziente Tiermodelle ........................................................................................ 15 2.3.1 Rag1 und Rag2 defiziente Mäuse ............................................................................ 15 2.3.2 Rag1 defiziente Ratten ............................................................................................. 17 3 Material und Methoden ......................................................................................................... 20 3.1 Versuchstiere .................................................................................................................. 20 3.1.1 Haltung ..................................................................................................................... 21 3.1.2 Gesundheitsüberwachung ........................................................................................ 21 3.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien ............................................................ 22 3.3 Anfertigung histologischer Präparate ............................................................................. 22 3.3.1 Histologische Auswertung ....................................................................................... 23 3.3.1.1 Immunsystem .................................................................................................... 23 3.3.1.2 Gastrointestinaltrakt .......................................................................................... 23 3.3.1.3 Leber.................................................................................................................. 24 3.3.1.4 Herz ................................................................................................................... 25 3.3.1.5 Haut ................................................................................................................... 25 I Inhaltsverzeichnis 3.3.1.6 Speicheldrüsen .................................................................................................. 25 3.3.1.7 Lunge ................................................................................................................. 25 3.4 Bestimmung der Leukozytenzahlen in verschiedenen Lymphknoten und der Milz ...... 26 3.4.1 Lebend-Tot-Färbung der Lymphozyten ................................................................... 26 3.5 Erfassung physiologischer Parameter ............................................................................. 26 3.6 Erfassung pathologischer Symptome ............................................................................. 27 3.7 Gemischte Leukozytenkultur .......................................................................................... 28 3.8 Fluoreszenzbasierte durchflusszytometrische Analysen ................................................ 30 3.8.1 Blut ........................................................................................................................... 31 3.8.2 Milz und Lymphknoten............................................................................................ 32 3.8.3 Thymus .................................................................................................................... 33 3.8.4 Intrazelluläre Färbung .............................................................................................. 33 3.8.5 Auswertung der FACS-Daten mit CellQuest Pro® .................................................. 33 3.9 Aufarbeitung der Blutproben .......................................................................................... 34 3.9.1 EDTA-Vollblut ........................................................................................................ 35 3.9.2 Blutserum ................................................................................................................. 35 3.9.2.1 Serumchemie ..................................................................................................... 35 3.9.2.2 Multiplex Assay ................................................................................................ 36 3.9.2.3 ELISA................................................................................................................ 36 3.10 Statistische Auswertungen ............................................................................................ 37 4 Ergebnisse ............................................................................................................................. 38 4.1 Klinische Befunde .......................................................................................................... 38 4.1.1 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome der LEW-Rag1 Ratte ................ 38 4.1.1.1 Wachstum .......................................................................................................... 42 4.1.1.2 Reproduktionsparameter ................................................................................... 42 4.1.2 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome an den Organen ......................... 44 4.2 Histologische Befunde .................................................................................................... 45 4.2.1 Histologische Befunde an den Organen des Immunsystems ................................... 46 4.2.2 Histologische Befunde am Gastrointestinaltrakt ..................................................... 51 4.2.3 Histologische Befunde an der Leber ........................................................................ 54 4.2.4 Histologische Befunde am Herzen........................................................................... 54 II Inhaltsverzeichnis 4.2.5 Histologische Befunde an der Haut ......................................................................... 54 4.2.6 Histologische Befunde an den Speicheldrüsen ........................................................ 58 4.2.7 Histologische Befunde an der Lunge ....................................................................... 59 4.2.8 Histologische Befunde an den heterozygoten Merkmalsträgern ............................. 60 4.2.9 Gesamtergebnis der histologischen Auswertung ..................................................... 62 4.3 Blut- und Serumanalysen................................................................................................ 64 4.3.1 Kleines und Großes Blutbild .................................................................................... 64 4.3.2 Chemische Parameter im Blut ................................................................................. 68 4.3.3 IgE und IgG im Serum ............................................................................................. 68 4.3.4 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren im Serum ...................................... 69 4.4 In vitro Proliferation der T-Lymphozyten nach Antigenstimulation.............................. 70 4.4.1 Verhalten der Lymphozyten in Kultur ..................................................................... 72 4.4.2 Absolute Zellzahlen in den Lymphknoten und der Milz ......................................... 73 4.5 Zusammensetzung der Lymphozytenpopulation ............................................................ 75 4.5.1 Lymphozytenpopulation im Blut ............................................................................. 75 4.5.2 Lymphozytenpopulation in den lymphatischen Organen ........................................ 81 4.5.3 T-Zellrezeptorrepertoire ........................................................................................... 92 4.6 Analyse antibiotisch vorbehandelter Rag1 defizienter Ratten ....................................... 93 5 Diskussion ............................................................................................................................. 96 5.1 Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungen ...... 97 5.1.1 Physiologische Parameter und Organmorphologie .................................................. 97 5.1.2 Unterschiede in der Leukozytenpopulation und damit zusammenhängende Effekte ......................................................................................................................................... 103 5.1.3 Unterschiede der homozygoten und heterozygoten Träger des Gendefektes ........ 110 5.2 Vergleich der LEW-Rag1 Ratte mit anderen Maus- und Rattenmodellen ................... 111 5.3 Übertragbarkeit des LEW-Rag1 Phänotyps auf das Omenn Syndrom......................... 115 5.4 Ausblick ........................................................................................................................ 117 6 Zusammenfassung ............................................................................................................... 119 7 Summary ............................................................................................................................. 121 8 Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 123 9 Anhang ................................................................................................................................ 133 III Inhaltsverzeichnis 9.1 Material und Methoden ................................................................................................ 133 9.1.1 Geräte ..................................................................................................................... 133 9.1.2 Reagenzien ............................................................................................................. 134 9.1.3 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................... 135 9.1.4 Verwendete Kits..................................................................................................... 135 9.1.5 Computerprogramme ............................................................................................. 136 9.1.6 Protokolle der histologischen Arbeiten .................................................................. 136 9.1.7 Antikörper .............................................................................................................. 138 9.1.8 Lösungen und Reagenzien für ELISA ................................................................... 140 9.1.9 Befundbogen des Tierpflegepersonals ................................................................... 141 9.2 Ergebnisse ..................................................................................................................... 142 9.2.1 Reproduktionsparameter ........................................................................................ 142 9.2.2 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren ..................................................... 144 Danksagung ............................................................................................................................ 146 IV Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis % Prozent °C Grad Celsius µCi Mikrocurie µl Mikroliter µm Mikrometer Abb. Abbildung AIRE Autoimmun-Regulator Protein ALT Alanin-Aminotransferase ANOVA analysis of variance Aqua dest. destilliertes Wasser AST Aspartat-Aminotransferase bcl-2 B-cell lymphoma 2 bp Basenpaare BSA bovines Serumalbumin ca. circa CD Cluster of differentiation CI Colony Index cm Centimeter CO2 Kohlenstoffdioxid ConA Concanavalin A cpm counts per minute DN doppelt negativ DNA deoxyribonucleic acid DP doppelt positiv DSB Doppelstrangbruch EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay EPO Erythropoetin FACS Fluorescence-Activated-Cell-Sorter V Abkürzungsverzeichnis FCS fetales Kälberserum FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations FITC Fluoreszeinisothiocyanat Foxp3 Forkhead-Box-Protein P3 FSC Forward Scatter g Gramm G-CSF Granulocyte-Colony Stimulating Factor GM-CSF Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor GRO/KC Growth-related Oncogene Gy Gray H2SO4 Schwefelsäure IFN Interferon Ig Immunglobulin IL Interleukin ILC innate lymphoid cell Kap. Kapitel KO Knockout l Liter Ln./Lnn. Lymphonodus/Lymphonodi M molar Max. Maximum MCP-1α Monocyte Chemotactic Protein-1 Alpha M-CSF Macrophage colony-stimulating Factor mg Milligramm MHC major histocompatibility complex MHH Medizinische Hochschule Hannover min Minute(n) Min. Minimum MIP-3α Macrophage Inflammatory Protein-3 Alpha ml Milliliter VI Abkürzungsverzeichnis MLC Mixed Leucocyte Culture mM millimolar NaCl Natriumchlorid NKT-Zelle natürliche Killer T-Zelle NK-Zelle natürliche Killerzelle nm Nanometer ns nicht signifikant OS Omenn Syndrom PALS periarterioläre lymphatische Scheide PBS phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerase chain reaction PE Phycoerythrin pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration PID primäre Immundefizienz RAG humanes Recombination activating gene Rag murines Recombination activating gene RAG Protein, welches durch das murine Rag oder das humane RAG codiert wird RANTES Chemokin mit folgenden Eigenschaften: regulated on activation, normal T cell expressed and secreted RITA Registry of Industrial Toxicology Animal-data rpm revolutions per minute RSS Recombination Signal Sequence RT Raumtemperatur SA-PE Streptavidin- Phycoerythrin SCID Severe Combined Immunodeficiency SD Sprague-Dawley SPF spezifisch pathogenfrei SSC Side Scatter Tab. Tabelle TCR T-Zell-Rezeptor VII Abkürzungsverzeichnis TNF-α Tumornekrosefaktor Alpha Treg Regulatorische T-Zelle VEGF Vascular Endothelial Growth Factor WT Wildtyp xg mal der Erdbeschleunigung ZFN Zink-finger Nuklease ZTL Zentrales Tierlaboratorium VIII Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: T-Zellreifung im Thymus..................................................................................... 7 Abbildung 2: Schematische Darstellung der RAG Proteine in voller Länge ............................. 8 Abbildung 3: Strukturen unreifer und reifer B- und T-Zell-Antigenrezeptoren ........................ 9 Abbildung 4: Pipettierschema MLC ........................................................................................ 29 Abbildung 5: Lymphozytengate ............................................................................................... 33 Abbildung 6: Gatingstrategie der durchgeführten FACS Färbungen ....................................... 34 Abbildung 7: Klinisches Bild der LEW-Rag1 Ratte ................................................................ 38 Abbildung 8: Prävalenz der Erkrankungen der LEW-Rag1 Tiere ........................................... 39 Abbildung 9: Inzidenz der klinischen Symptome bei den LEW-Rag1 Ratten ........................ 40 Abbildung 10: Gewichtsverläufe ............................................................................................. 42 Abbildung 11: Colony Index .................................................................................................... 43 Abbildung 12: Gewichte der Lebern und Milzen der LEW und LEW-Rag1 Ratten in Relation zu deren Körpergewicht ........................................................................................................... 45 Abbildung 13: Entzündungszellinfiltrationen der Milzen von LEW und LEW-Rag1 Ratten . 47 Abbildung 14: Pathohistologische Veränderungen der Organe des Immunsystems ............... 49 Abbildung 15: Histologischer Vergleich der Lymphknotenmorphologie von LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 50 Abbildung 16: Vergleich der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt von LEW und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 51 Abbildung 17: Pathohistologische Befunde am Magen-Darm-Trakt der LEW-Rag1 Ratten . 52 Abbildung 18: Haltungsabhängigkeit der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt der LEW-Rag1 Ratten ............................................................................ 53 Abbildung 19: Pathohistologische Veränderungen der Leber und des Herzens der LEW-Rag1 Ratten ....................................................................................................................................... 55 Abbildung 20: Einfluss des Gesundheitszustands und der Haltungseinheit auf den histologischen Score der Haut bei LEW-Rag1 Ratten im Vergleich zu LEW Kontrolltieren . 56 Abbildung 21: Pathohistologische Veränderungen der Speicheldrüsen und der Haut ............ 57 Abbildung 22: Histologische Unterschiede der Speicheldrüsen von LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen .......................................................................................................... 59 IX Abbildungsverzeichnis Abbildung 23: Vergleich der Lungen gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungseinheiten ............................................................................................. 60 Abbildung 24: Histologische Präparate der Lungen von LEW und LEW-Rag1 Ratten .......... 61 Abbildung 25: Vergleich der histologischen Scores gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten mit LEW und LEW-Rag1 +/- Ratten ............................................................................ 63 Abbildung 26: Vergleich der histologischen Scores erkrankter und gesunder LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungseinheiten ............................................................................. 63 Abbildung 27: Subjektive Krankheitsstärke ............................................................................ 64 Abbildung 28: Vergleich der Anzahl der Leukozyten im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten ....................................................................................................................................... 66 Abbildung 29: Zusammensetzung der Leukozyten bei LEW und bei gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................... 67 Abbildung 30: Verhältnisse von Lymphozyten zu neutrophilen Granulozyten ....................... 68 Abbildung 31: Vergleich der Immunglobulinkonzentrationen im Serum von LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 69 Abbildung 32: Ausgewählte Zytokine im Vergleich ............................................................... 70 Abbildung 33: Proliferationsstärke in counts per minute (cpm) der Lymphozyten von LEW und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 72 Abbildung 34: Ergebnisse der Trypan-Blau-Färbung der LEW und LEW-Rag1 Lymphknotenzellen .................................................................................................................. 73 Abbildung 35: Gesamtleukozytenzahlen der Milzen und Lymphknoten von LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 74 Abbildung 36: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten ......... 75 Abbildung 37: Vergleich der Anteile reifer T-Lymphozyten im Blut bei gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinheiten ................................................. 76 Abbildung 38: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten ....................................................................................................................................... 77 Abbildung 39: Vergleich der Anteile αβTCR tragender T-Zellen zwischen LEW und LEWRag1 Ratten .............................................................................................................................. 78 Abbildung 40: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................... 79 X Abbildungsverzeichnis Abbildung 41: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................................................. 80 Abbildung 42: Vergleich der Anzahlen nachweisbarer NKT- und NK-Zellen im Lymphozytengate von LEW und LEW-Rag1 Ratten .............................................................. 81 Abbildung 43: Vorkommen reifer T-Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ... 82 Abbildung 44: Vorkommen der CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 83 Abbildung 45: Vorkommen der CD4+CD8+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten ....................................................................................................................................... 84 Abbildung 46: Vorkommen der reifen Lymphozyten in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren ................................................................................................... 85 Abbildung 47: Verhältnis der verschiedenen reifen T-Lymphozyten im Lymphknoten zueinander ................................................................................................................................ 86 Abbildung 48: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren ..................................................................... 87 Abbildung 49: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten ............................................................................................................. 88 Abbildung 50: Vorkommen von NK-Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten .................................................................................................................... 89 Abbildung 51: Ergebnisse der FACS Analysen der LEW-Rag1 Thymi .................................. 90 Abbildung 52: FACS Daten des Blutes der heterozygoten LEW-Rag1 Ratten ....................... 92 Abbildung 53: Prozentuale Anteile der verschiedenen Vα- und Vβ-Rezeptortypen ............... 93 Abbildung 54: Unterschiede in der Zytokin- Chemokin und Wachstumsfaktorkonzentration im Serum zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten und LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen ............................................................................................................................... 144 Abbildung 55: Unterschiede der Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen im Serum zwischen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten ........................................ 145 XI Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Klassifizierung verschiedener SCID Formen.......................................................... 12 Tabelle 2: Klassisches und atypisches Omenn Syndrom ......................................................... 14 Tabelle 3: Verwendete Tierstämme ......................................................................................... 20 Tabelle 4: Klinischer Score der histologisch ausgewerteten Tiere .......................................... 27 Tabelle 5: Zellkulturmedium für MLC .................................................................................... 29 Tabelle 6: FACS Puffer ............................................................................................................ 32 Tabelle 7: Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse) ....................................................................... 32 Tabelle 8: Pappenheim Färbung ............................................................................................... 35 Tabelle 9: Zusammenfassung aller beobachteten Symptome .................................................. 41 Tabelle 10: Gruppenzusammensetzung für die histologischen Untersuchungen ..................... 46 Tabelle 11: Histologische Scores der mit Cotrim K behandelten Tiere ................................... 94 Tabelle 12: FACS Ergebnisse der mit Cotrim K behandelten Tiere ........................................ 94 Tabelle 13: Protokoll für die Entwässerung ........................................................................... 136 Tabelle 14: Protokoll der H&E Färbung ................................................................................ 137 Tabelle 15: Antikörper für allgemeine Analysen ................................................................... 138 Tabelle 16: Antikörper für die Analyse des αβTCR Repertoires ........................................... 139 Tabelle 17: Bicarbonat/Carbonat Coating Puffer (100mM) .................................................. 140 Tabelle 18: ELISA Waschlösung ........................................................................................... 140 Tabelle 19: ELISA Blockinglösung ....................................................................................... 140 Tabelle 20: ELISA Proben-/ Konjugatverdünnung ................................................................ 140 Tabelle 21: Reproduktionsparameter der LEW und LEW-Rag1 Ratten................................ 142 XII 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Hintergrund Das Recombination Activating Gene 1 (Rag1) ist für die B- und T-Zellreifung unerlässlich. Sein gleichnamiges Protein wird vorwiegend in B- und T-Zellvorläufern exprimiert und katalysiert zusammen mit dem RAG2 einen wichtigen Teil des Reifungsprozesses dieser Zellen (Tonegawa 1983). Durch die Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen kann es zur Rekombination der T-Zellrezeptoren und der Immunglobulinmoleküle kommen, was zu einer großen Variabilität führt, wodurch eine breit gefächerte Reaktion des adaptiven Immunsystems auf Antigene möglich wird (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994, McBlane et al. 1995). 2012 wurde am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover mittels zinc-finger Nucleasen (ZFN) ein Rag1 defizienter Rattenstamm generiert. Die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm entstand mit dem Ziel, ein effizientes immundefizientes Rattenmodell für die Transplantationsforschung zu entwickeln. Außerdem wurde ihm die Verwendbarkeit in Wiederherstellungsexperimenten des Immunsystems zugeschrieben (Zschemisch et al. 2012). Näher betrachtet, ähnelt der beobachtete Phänotyp der LEW/ZtmRag1em1Ztm einer humanen Immundefizienzerkrankung, dem sogenannten Omenn Syndrom. Hierbei handelt es sich um eine schwere Immundefizienzerkrankung, die in 90 % aller Fälle durch Mutationen des RAG1 oder RAG2 bedingt ist und mit schweren Infektionen des Atmungs- und Gastrointestinaltraktes einhergeht (Corneo et al. 2001, Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010). Des Weiteren werden bei Patienten mit dem Omenn Syndrom variable Anzahlen zirkulierender T-Lymphozyten mit eingeschränktem T-Zellrezeptor Repertoire und ein nahezu vollständiges Fehlen von B-Lymphozyten nachgewiesen. Dazu kommen eine schwere Erythrodermie mit Alopezie, vergrößerte lymphatische Gewebe, Thymusdysplasie und eine Eosinophilie im Blut und Gewebe (Hönig, Schwarz 2006, Kato et al. 2006, Villa et al. 2008). Kinder mit diesem Gendefekt fallen schon früh im Leben, im Alter von wenigen Monaten, mit diesen Symptomen auf. Die einzigen heutzutage angewendeten Therapiemaßnahmen bilden eine Knochenmarktransplantation oder die Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut. Trotzdem liegt die Mortalität der betroffenen Kinder noch immer bei 46 % (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006). 1 1 Einleitung 1.2 Ziele der Arbeit Das Hauptziel dieser Arbeit ist es, die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte phänotypisch zu charakterisieren. Dabei werden nicht nur die Unterschiede dieses Rattenstammes zu seinem Ursprung, der LEW Ratte, untersucht, sondern es erfolgt auch eine differenzierte Betrachtung symptomloser und erkrankter Rag1 defizienter Tiere untereinander. Ein weiterer Fokus liegt auf der Fragestellung, ob die Haltungshygiene einen Einfluss auf den Phänotyp hat. Zur Klärung dieser Fragestellungen werden sowohl das ganze Tier umfassende Methoden angewendet, als auch zahlreiche Untersuchungen auf zellulärer Ebene durchgeführt. Letztendlich wird ein besonderes Augenmerk auf seine Vergleichbarkeit mit dem humanen Omenn Syndrom und anderen murinen Rag1 und Rag2 defizienten Tieren gelegt. 2 2 Theoretische Grundlagen 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Immunsystem Das Immunsystem ist ein interaktives Netzwerk aus Zellen und Molekülen, die spezialisierte Aufgaben in der Infektionsabwehr übernehmen. Dafür setzt es zwei völlig unterschiedliche Mechanismen ein, um den Körper gegen Antigene zu schützen. Dies sind zum einen die angeborenen und zum anderen die erworbenen (adaptiven) Immunantworten. Die angeborenen Mechanismen sorgen mit phagozytierenden Zellen (neutrophile Granulozyten, Monozyten, Makrophagen), Zellen, welche inflammatorische Mediatoren freisetzen (basophile Granulozyten, eosinophile Granulozyten, Mastzellen), natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und weiteren innate lymphoid cells (ILC) für einen sofortigen Schutz. Auch Komplement, Zytokine und Akute-Phase-Proteine spielen hier eine große Rolle. Die adaptive Immunität setzt sich aus Antigen-spezifischen Reaktionen der B- und T-Lymphozyten zusammen. Während die angeborenen Immunmechanismen zwar schnell greifen aber wenig spezifisch sind, arbeitet das adaptive Immunsystem deutlich präziser, benötigt allerdings mehrere Tage oder Wochen um seine komplette Wirkung zu entwickeln (Abbas et al. 2015, Delves, Roitt 2000b, Parkin, Cohen 2001). Alle immunologischen Vorgänge des angeborenen Immunsystems laufen immer in gleicher Weise ab, ohne bei wiederholtem Kontakt mit demselben Antigen eine Anpassungsreaktion auszubilden. Einen zentralen Baustein dieses Anteils bilden die neutrophilen Granulozyten. Nach Freisetzung aus dem Knochenmark zirkulieren sie als mobile Zellen frei in der Blutbahn des Körpers. Erst mit Hilfe proinflammatorischer Mediatoren, Adhäsionsmolekülen und Chemokinen gelangen diese Zellen in infiziertes Gewebe, um dort Erreger durch Phagozytose und anschließende Lyse zu zerstören (Witko-Sarsat et al. 2000). Letztendlich nutzen alle Leukozyten den oben beschriebenen Mechanismus um zum Infektionsherd zu gelangen (Marchesi, Gowans 1964, von Andrian, Mackay 2000). Darüber hinaus exprimieren sowohl Makrophagen als auch neutrophile Granulozyten Rezeptoren für Antikörper und Komplementfaktoren. Dadurch wird die Phagozytose antiköper- oder komplementmarkierter Mikroorganismen zusätzlich forciert (Aderem, Underhill 1999). Die vorwiegende Aufgabe eosinophiler Granulozyten besteht im Schutz des Organismus vor parasitären Infektionen und 3 2 Theoretische Grundlagen auch im Verlauf von Allergien wird ihnen eine Funktion zugeschrieben. Im Gegensatz zu neutrophilen Granulozyten und Makrophagen sind eosinophile Granulozyten nicht in der Lage, Erreger zu phagozytieren. Anstatt dessen sezernieren sie zytotoxisch wirkende Substanzen in den Extrazellularraum und setzen zusätzlich Leukotriene, Prostaglandine und zahlreiche Zytokine frei (Wardlaw, Moqbel & Kay 1995). Basophile Granulozyten und Mastzellen weisen ähnliche funktionelle Charakteristika auf (Abraham, Arock 1998). Während basophile Granulozyten im Blut zu finden sind, kommen Mastzellen vor allem im Bindegewebe und in Schleimhäuten vor. Beide Zelltypen besitzen hoch-affine IgE Rezeptoren (FcεR) (Kinet 1999). Binden Antikörper-markierte Antigene daran, werden Entzündungsmediatoren von der Zelle freigesetzt. Eine große Rolle spielen diese beiden Zelltypen auch in der Entstehung von Allergien, wie zum Beispiel Ekzemen, Heuschnupfen und Asthma (Cruse, Bradding 2015, Knol et al. 1996). NK-Zellen und weitere ILCs ähneln morphologisch den Lymphozyten, besitzen allerdings keinen spezifischen Antigenrezeptor. Ihre Aufgabe ist es, infizierte oder maligne entartete Zellen zu zerstören und spezifische Zytokine zu produzieren (Biron et al. 1999, Walker, Barlow & McKenzie 2013). Neben den zellulären Bestandteilen des angeborenen Immunsystems kommen auch zahlreiche lösliche Faktoren vor. Dazu zählt zum einen das Komplementsystem, welches unter anderem zur Lyse von Mikroorganismen beiträgt, Antigene für Phagozyten markiert und so die Phagozytose erleichtert (Reid, Porter 1981). Zum anderen assistieren Akute-Phase-Proteine und Zytokine bei der Immunantwort. Während die Akute-Phase-Proteine proinflammatorisch wirken und dadurch die Resistenz des Organismus verstärken und die Reparatur von geschädigtem Gewebe vorantreiben (Cid et al. 1993, Gabay, Kushner 1999), agieren Zytokine als Vermittler innerhalb des Immunsystems und zwischen dem Immunsystem und anderen Organsystemen des Körpers (Thorpe et al. 1992). Antigen-spezifische Rezeptoren auf B- und T-Lymphozyten bilden das Charakteristikum der adaptiven Immunität. Obwohl sehr ähnliche Gensegmente für die Entstehung der verschiedenen Rezeptoren zuständig sind, unterscheiden sich diese beiden Zelltypen in ihrer Spezifität grundlegend. B-Zellen exprimieren Serumimmunglobulin Moleküle auf der Außenseite ihrer Zellmembran, welche lösliche Antigene direkt binden. Im Gegensatz dazu nutzen T-Zellen ein Heterodimer, das bestimmte Kombinationen von Antigenproteinen mit „major histokompatibility complexen“ (MHC Klasse I, MHC Klasse II) auf der Oberfläche 4 2 Theoretische Grundlagen anderer Zellen erkennt (Germain 1986). Damit es zu einer spezifischen Immunantwort kommen kann, muss das Antigen den antigenspezifischen B- und T-Zellen präsentiert und von ihnen erkannt werden. Das führt dann zur Zellvorbereitung, -aktivierung und differenzierung in den lymphatischen Organen, worauf hin eine spezifische Immunantwort erfolgt. Hierbei verlassen aktivierte T-Lymphozyten das lymphatische Gewebe und gelangen durch homing zum Infektionsherd, aktivierte B-Lymphozyten (Plasmazellen) setzen Antikörper in Blut und Gewebsflüssigkeit frei (Parkin, Cohen 2001). Die Antigene werden mit der Lymphe oder gebunden (endozytiert) an Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, B-Zellen), in lymphatisches Gewebe transportiert. Endogen produziertes (z.B. virales) Antigen wird als Komplex mit MHC I Molekülen exprimiert, exogene und daraufhin phagozytierte Antigene dagegen als Komplex mit MHC Klasse II (Germain 1986, Morrison et al. 1986). Eben beschriebene Komplexe sind nötig, um eine spezifische Immunantwort auszulösen. Diese äußert sich in direkter Zytotoxizität, der Generierung spezifischer Antikörper oder in der Produktion und Freisetzung von Zytokinen, die weitere Zellen aktivieren (Parkin, Cohen 2001). Diese Tatsachen machen klar, dass das Immunsystem ein hoch komplexes Gebilde ist, welches sich ständig moduliert und auch mit anderen Organsystemen des Körpers eng verflochten ist (Ottaway, Husband 1994). Allein die Dysfunktion eines kleinen Anteils kann schwerwiegende Folgen für den Organismus haben. Zudem bietet es jedoch auch viele Ansatzmöglichkeiten für verschiedene Therapieformen wie zum Beispiel Stammzelltransplantationen, Vakzinationen oder die Immunmodulation mittels Zytokinen oder deren Antagonisten (Ibrahim, Gotch 2000, Parkin, Cohen 2001). 2.1.1 B- und T-Zellreifung Da die Kenntnis des spezifischen Reifungsprozesses der Zellen des adaptiven Immunsystems (B- und T-Lymphozyten) essentiell für das Verständnis dieser Arbeit ist, wird dieser Vorgang in diesem Kapitel genauer beschrieben. Beide Zelltypen durchlaufen während ihres Reifungsprozesses eine Umordnung der zuständigen Antigenrezeptorgene (Schatz, Oettinger & Schlissel 1992) (Kap. 2.1.2). Sowohl die Vorläuferzellen der B-Lymphozyten als auch die Vorläuferzellen der T-Lymphozyten befinden sich im Knochenmark. Während die B- 5 2 Theoretische Grundlagen Zellreifung komplett im Knochenmark abläuft, findet der größte Teil der T-Zellreifung nach der Migration dieser Zellen in den Thymus statt (Parkin, Cohen 2001). Nach Abschluss der oben angesprochenen Genrekombination gelangen antigenspezifische, naive B-Zellen ins Blut und besiedeln von dort aus die sekundären lymphatischen Organe. Während einer Immunantwort entstehen dort Keimzentren („germinal centers“), die ein gutes Umfeld für die Interaktion zwischen Antigen-präsentierenden und antigenspezifischen Zellen bilden (Tarlinton 1998). Hier kommt es als Erstes zur Antigen stimulierten Proliferation der naiven B-Zellen, verbunden mit dem Vorgang der somatischen Hypermutation, auch „receptor editing“ genannt. Dabei findet ein erneuter Genumbau der variablen Antikörperregionen statt, um Autoreaktivität zu vermeiden und die Rezeptorspezifität zu erhöhen. In dieser Phase tragen die naiven B-Zellen ihre Antikörper als B-Zellrezeptoren auf der Zelloberfläche (Radic, Zouali 1996). Im nächsten Schritt erfolgt die positive Selektion hochaffiner, antigenspezifischer B-Lymphozyten. Allein die Zellen, die in der Lage sind, mit Antigen-Antikörperkomplexen auf follikulären dendritischen Zellen zu interagieren, werden von der Apoptose ausgeschlossen. Diese positiv selektierten Zellen proliferieren und generieren so eine große Masse an hochspezifischen B-Lymphozyten (klonale Proliferation). Diese erzeugen antigenspezifische Antiköper, welche im Falle einer Aktivierung in die Peripherie entlassen werden und dort entweder direkt oder indirekt zur spezifischen Immunantwort beitragen (Delves, Roitt 2000a). Im Thymus findet der dominierende Anteil der T-Zellreifung statt (Abb. 1). Anders als Antikörper sind T-Zellrezeptoren (TCRs) ausschließlich als transmembrane Moleküle vorhanden (Delves, Roitt 2000b). Nach ihrer Ankunft im Thymus verlieren die lymphoiden Vorläuferzellen ihr Potential, sich zu B-Lymphozyten oder NK-Zellen entwickeln zu können. Dadurch erreichen sie das Stadium eines doppelt negativen (DN; CD4-CD8-) T-Zellvorläufers (Michie et al. 2000, Germain 2002). Das bedeutet, sie besitzen weder die Oberflächenmoleküle CD4 und CD8 noch einen TCR. Im Rahmen der Entwicklungsstufen einer DN Zelle ist entweder eine Entwicklung zu einer αβ- oder einer γδTCR exprimierenden T-Zelle möglich (Delves, Roitt 2000b). 6 2 Theoretische Grundlagen Noch im Laufe ihres DN Stadiums entwickeln die Zwischenstufen, Umstellung Rezeptorgene Thymozyten über in eine und denen Neuordnung vonstattengeht, der einen ausgereiften TCR auf ihrer Oberfläche (Germain 2002). Dieser ist stets mit einem weiteren Proteinkomplex assoziiert, dem CD3/ζ-Komplex (van Oers, von Boehmer & Weiss 1995). Zusätzlich beginnen die DN Zellen CoRezeptorproteine (CD4 und CD8) zu exprimieren. Das lässt sie in den doppelt positiven (DP; Entwicklungsabschnitt CD4+CD8+) übertreten (Germain 2002). Nun geben alle DP Abbildung 1: T-Zellreifung im Thymus Aus DN Thymozyten entstehen in der Thymusrinde TCR tragende DP Thymozyten. Im Laufe der Entwicklung kommt es zur Retention von entweder CD4 oder CD8 und Zellen, die mit körpereigenem MHC interagieren können, durchlaufen den weiteren Reifungsprozess (Positive Selektion). Lymphozyten, deren TCR gegen körpereigene Antigene gerichtet ist, werden durch negative Selektion aussortiert. So können nur selbsttolerante, funktionsfähige T-Zellen den Thymus verlassen. Modifiziert nach Parkin, Cohen (2001) Thymozyten, die körpereigene MHC Moleküle erkennen, entweder ihren CD4- oder ihren CD8-Proteinkomplex ab und vermehren sich durch Teilung (positive Selektion) (Jameson, Hogquist & Bevan 1995, Teh et al. 1988). In einem zweiten Schritt werden die Zellen, die gegen körpereigene Antigene gerichtet sind, durch Apoptose am Fortbestehen gehindert (negative Selektion) (Germain 2002). Dadurch entsteht eine Population einfach positiver (CD3+CD4+ oder CD3+CD8+), selbsttoleranter T-Lymphozyten, die körperfremde Antigene, in Kombination mit MHC Molekülen, erkennen können. Diese naiven T-Zellen werden in die Peripherie entlassen. Dort zirkulieren sie im Blut oder der Lymphe und sind in großer Anzahl in den sekundären lymphatischen Organen auffindbar. Treffen sie auf eine antigenpräsentierende 7 2 Theoretische Grundlagen Zelle mit passendem Antigen, dann differenzieren sie sich innerhalb der nächsten 2-3 Tage zu aktivierten T-Lymphozyten (Parkin, Cohen 2001). 2.1.2 Rag1 und V(D)J-Rekombination Das Immunsystem kann eine riesige Bandbreite an Antigenen erkennen und darauf reagieren. Diese extreme Vielschichtigkeit entsteht durch das große Repertoire des Körpers an spezifischen Antigenrezeptoren und Immunglobulinmolekülen (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994). Hierfür sind die von den „Recombination Activating Genes“ produzierten Proteine, RAG1 und RAG2, unerlässlich. Sie sind überwiegend in T- und B-Zellvorläufern exprimiert und katalysieren einen wichtigen Teil ihres Reifungsprozesses, die V(D)JRekombination (Tonegawa 1983). Beide Proteine interagieren miteinander (Ji et al. 2010). In einer Studie konnte Rag1 Transkript auch im zentralen Nervensystem von Mäusen nachgewiesen werden (Chun et al. 1991). Die Struktur des Rag Lokus ist in den meisten Wirbeltiergenomen gleich. Innerhalb dieses Lokus liegen die Gene, die RAG1 und RAG2 kodieren, sehr nah beieinander, kompakte zusammen haben eine Organisation und transkribiert. besonders werden Die Proteinsequenzen der Wirbeltiere gleichen sich zu 50-90 % (Gellert 2002). Beim Menschen befindet sich RAG1 auf dem Chromosom 11p13 (Sherrington et al. 1992), bei der Maus auf Chromosom 2qE2 und auf 3q31 bei der Ratte. Für das murine RAG1 ergibt sich eine Größe von 1040 und für das kürzere RAG2 eine Länge von 527 Abbildung 2: Schematische Darstellung der RAG Proteine in voller Länge NBR stellt die nonamer-binding region dar, welche spezifisch an der Recombination Signal Sequence (RSS) der DNA bindet. D600, D708 und E962 zeigen die mutmaßlichen Areale der aktiven Rückstände. Zusätzlich ist die zinc-binding dimerization domain (ZDD), mit ihren Zink-bindungsmustern, RING finger (RING) und zinc finger A (ZFA), sowie ein zinc finger B (ZFB), eingezeichnet. Modifiziert nach De, Rodgers (2004) Aminosäuren. Da die RAG Proteine relativ groß sind, geht die Mehrheit aller Studien lediglich auf Proteinfragmente ein, welche den sogenannten „Core-Regionen“ zuzuordnen 8 2 Theoretische Grundlagen sind (Abb. 2). Diese Regionen, von RAG1 und RAG2 zusammen, reichen für die komplette DNA Spaltungsaktivität in in vitro und in vivo Assays aus (Cuomo, Mundy & Oettinger 1996, Sadofsky, Hesse & Gellert 1994, Silver et al. 1993). In der Abbildung sind die Proteine schematisch als Balken dargestellt. 1989 wurde RAG1 von Schatz et al. das erste Mal isoliert und mit dem Mechanismus der V(D)J-Rekombination in Verbindung gebracht (Schatz, Oettinger & Baltimore 1989). Sein direkter Einfluss durch die Induktion von Doppelstrangbrüchen wurde 1995 von McBlane et al. nachgewiesen. Bei V (variable), D (diversity) und J (joining) handelt es sich um drei nicht verbundene codierende Segmente der Antigenrezeptorgene. Diese werden während des Vorgangs der sogenannten V(D)JRekombination in verschiedenster Art zusammengefügt. Das Zusammenfügen nach der 12/23 Regel gewährleistet eine sehr große Variabilität der neugenerierten Gene. Damit bilden sie die Grundlage für eine möglichst breite T-Zellrezeptor- und Immunglobulinvariabilität (Bassing, Swat & Alt 2002, De, Rodgers 2004) (Abb. 3). Abbildung 3: Strukturen unreifer und reifer B- und T-Zell-Antigenrezeptoren Modifiziert nach Delves, Roitt 2000 Dieser Vorgang findet an sieben unterschiedlichen Lokalisationen statt: Der schweren Immunglobulinkette und der leichten Kettenloci κ und λ in B-Lymphozyten (Tonegawa 1983) und an den TCR α, β, γ, und δ Kettenloci der T-Lymphozyten (Davis, Bjorkman 1988). Zusätzlich gliedert er sich in zwei Phasen. Als erstes bilden RAG1 und RAG2 einen Multiproteinkomplex durch Interaktion mit einer eigenständigen Recombination Signal Sequence (RSS), welche jedes V, D und J Segment flankiert. Anschließend katalysieren die RAG Proteine einen DNA Doppelstrangbruch an jeder RSS (McBlane et al. 1995). Das führt zu einem Komplex mit vier DNA Enden (zwei 5‘ phosphorylierte 9 2 Theoretische Grundlagen recombination signal Enden und zwei codierende Enden, die in DNA hairpinstructures münden). In der zweiten Phase der V(D)J-Rekombination werden die getrennten DNA Enden mittels „nonhomologous end-joining“ Reparatur wieder zusammengefügt. An den kodierenden Enden geschieht dies sehr unpräzise, so dass dort eine große Variabilität entsteht (Lieber et al. 2003) und später viele verschiedene Antigene vom Organismus erkannt werden können. Frame shift Mutationen in den „non-core regions“ der Rekombinations aktivierenden Gene führen zu ineffizienter V(D)J-Rekombination und dadurch zu Immundefizienz (Noordzij et al. 2000, Santagata et al. 2000). Eine mögliche fehlende oder eingeschränkte Rekombinationsaktivität kann mithilfe eines sogenannten „V(D)J recombination assays“ nachgewiesen werden (Schwarz et al. 1996, Villa et al. 1998). Hierbei werden Fibroblastenkulturen mit Expressionsplasmiden transfiziert, welche Wildtyp- oder mutierte RAG1/2 Proteine kodieren. (Zur genauen Durchführung des Assays siehe: Hesse et al. (1987), Lieber et al. (1987) und Gauss et al. (1998).) (Hesse et al. 1987, Lieber et al. 1987, Gauss et al. 1998) 2.2 Primäre Immundefizienzerkrankungen Die primären Immundefizienzen (primary immunodeficiencies, PIDs) sind angeboren und vererbbar und können sowohl den angeborenen als auch den erworbenen Teil des Immunsystems beeinflussen. Ist letzterer betroffen, dann kommt es zu einem Mangel an Antikörpern oder zu einer fehlerhaften Zusammenarbeit diverser Komponenten des Immunsystems. Daraus differenzieren sich die schweren kombinierten Immundefizienzen (severe combined immunodeficiencies, SCIDs) als eine Gruppe verschiedener angeborener Erkrankungen, welche entweder die zelluläre oder die humorale Immunität betreffen, heraus (Aloj et al. 2012, Fischer et al. 2005). 2.2.1 Schwere kombinierte Immundefizienzerkrankungen Eine (fast) vollständige Insuffizienz der körpereigenen T-Zellen bildet das Hauptcharakteristikum der schweren kombinierten Immundefizienzerkrankungen (SCID Erkrankungen). Zusätzlich ist auch die Antikörperantwort des Organismus, entweder durch 10 2 Theoretische Grundlagen direkte Schädigung des B-Zell-Zyklus oder sekundär, durch inadäquate B-Zell Aktivierung der gestörten T-Helferzellpopulation, gestört (Aloj et al. 2012). Gegenwärtig erfolgt die Klassifizierung der verschiedenen SCID Formen anhand des Auftretens oder Fehlens bestimmter Immunzellen, speziell T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und NK-Zellen (Tab. 1). In den letzten Jahren wurden zahlreiche ursächliche Gendefekte identifiziert und viele neue Formen weisen zudem extrahämatopoetische Veränderungen auf, welche zu komplexen Organveränderungen, auch außerhalb des Immunsystems, führen (Aloj et al. 2012). In Tabelle 1 werden zahlreiche Gene aufgeführt, deren Dysfunktion zu SCID Erkrankungen führen kann. Eines davon ist RAG1. Schwarz et al. identifizierten 1996 beim Menschen eine Mutation in diesem Gen als Auslöser für eine klassische SCID Form, bei der weder T- noch B-Lymphozyten nachgewiesen wurden (Schwarz et al. 1996). Handelt es sich bei der Schädigung des Gens um eine hypomorphe Mutation, kommt es zu „atypischen“ SCID Ausprägungen (de Villartay et al. 2005, Ehl et al. 2005, Schuetz et al. 2008). Dazu zählt unter anderem das klassische Omenn Syndrom (Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010). Die Prävalenz der SCIDs in der Bevölkerung liegt ungefähr bei 1:50.000, mit einem erhöhten Anteil männlicher Individuen (Aloj et al. 2012). Betroffene dieser angeborenen Erkrankungen leiden schon früh im Leben, innerhalb der ersten Lebensmonate, an schweren, lebensbedrohlichen Infektionen bakteriellen, viralen oder mykotischen Ursprungs. Diese äußern sich oft in einer interstitiellen Pneumonie, chronischer Diarrhö und einer mangelnden Gewichtszunahme (Notarangelo et al. 2009). Zusätzlich können Betroffene einen Hautausschlag entwickeln, welcher häufig entweder durch plazentar übergetretene maternale T-Zellen ausgelöst wird, oder durch die Aktivierung autologer T-Zellen bedingt ist, die sich in einer Autoreaktion gegen Hautkomponenten richten (Palmer et al. 2007). Der spezielle Phänotyp des jeweiligen Erkrankten kann Hinweise auf die Lage des Defektes geben und sollte zur Diagnosestellung herangezogen werden. Allerdings können SCID Patienten bei unterschiedlicher Pathogenese und unterschiedlichen zugrunde liegenden genetischen Mechanismen auch einen sehr ähnlichen Phänotyp ausprägen. 11 - + - Phänotyp ZAP70 Defizienz T-B-NK+ CORO 1A Defizienz T-/lowB+NK+ Nude/SCID Tabelle modifiziert nach Aloj et al. (2012). T B NK DOCK8 Defizienz + TlowB+NK+ MHC II Defizienz - + T B NK MHC I Defizienz FOXN1 DOCK8 CORO1A 12 HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DM, HLA-DO TAP1/TAP2, TAPASIN T-B+NK+ Retikuläre Dysgenese + ZAP70 T-B-/+NK- CERNUNNOS/XLF Defizienz + + TlowBlowNK+ CERNUNNOS/XLF AK 2 T B NK ARTEMIS, KU70/80, DNA PKcs, LIG4 RAG1/RAG2 PNP ARTEMIS, KU70/80, DNA PKcs, DNAligaseIV Defizienz + T-B-NK+ RAG1/RAG2 Defizienz - - T B NK PNP Defizienz - ADA T-B-NK- ADA Defizienz - + IL-7Rα T-B+NK+ JAK3, γ c Gendefekt IL-7Rα Defizienz JAK3 Defizienz, γ-Kettendefizienz T B NK SCID Form Tabelle 1: Klassifizierung verschiedener SCID Formen 2 Theoretische Grundlagen Gestörter "cross-link" (Thymus) Defekte Aktin Polymerisation Anormale Aktin Polymerisation Gestörte Antigenpräsentation Gestörte Antigenpräsentation Gestörte TCR Signalgebung Verstärkte Apoptose Gestörte V(D)J-Rekombination und gestörte DSB Reparatur Gestörte V(D)J-Rekombination und gestörte DSB Reparatur Gestörte V(D)J-Rekombination Akkumulation toxischer Metabolite Akkumulation toxischer Metabolite Gestörte Zytokinsignalgebung Gestörte Zytokinsignalgebung Pathogenese 2 Theoretische Grundlagen 2.2.2 Omenn Syndrom Das humane Omenn Syndrom (OS) wurde 1965 als erstes von Gilbert S. Omenn beschrieben. Hier berichtete er über das Auftreten einer Retikuloendotheliose mit Eosinophilie bei mehreren Mitgliedern einer amerikanischen Familie irischen Ursprungs (Omenn 1965). Er beschrieb den Symptomkomplex als Immundefizienzerkrankung mit zusätzlichen Symptomen, welche an eine Graft-versus-Host Reaktion erinnern. Dieses Syndrom schien das Resultat verschiedener genetischer und primär immunologischer Mechanismen zu sein, die zu einem homogenen Krankheitsbild führten (Karol et al. 1983, Omenn 1965, Omenn 1971). Später konnte ein autosomal-rezessiver Erbgang nachgewiesen werden (Villa et al. 1999). Aufgrund des gemeinsamen Auftretens dieser beiden Effekte (Immundefizienz und Graftversus-Host Reaktion) galt das OS lange Zeit als eine rätselhafte Erkrankung, dessen molekulare Grundlagen erst im letzten Jahrzehnt aufgedeckt wurden (Marrella, Maina & Villa 2011). Villa et al. berichteten 1998 das erste Mal von einem Zusammenhang dieses Syndroms mit einer Mutation der Recombination Activating Genes. Genetische Studien haben gezeigt, dass der Omenn Phänotyp eine breite molekulare Heterogenität aufweist und nicht einzig und allein durch Mutationen der Gene RAG1 und RAG2 zustande kommt (Ege et al. 2005, Giliani et al. 2006, Roifman, Gu & Cohen 2006, Roifman et al. 2008, Shibata et al. 2007). Zusätzlich ist es wichtig, zwischen dem „klassischen OS”, in Form einer gestörten V(D)J-Rekombination, und „Omenn-ähnlichen“ SCIDs zu unterscheiden (Tab. 2). Letztere sind durch Genmutationen bedingt, welche direkten Einfluss auf die Reifung der Lymphozyten haben (Marrella, Maina & Villa 2011). Das „klassische OS“ dagegen ist durch hypomorphe Defekte in Genen, welche für die V(D)JRekombination zuständig sind, gekennzeichnet (Marrella, Maina & Villa 2011). Diese schwächen die V(D)J-Rekombination nur ab, anstelle eines kompletten Funktionsverlusts (Villa et al. 1998). Hierbei sind Mutationen der Gene RAG1 und RAG2 für über 90 % aller beschriebenen OS Fälle verantwortlich (Niehues, Perez-Becker & Schuetz 2010, Corneo et al. 2001). Bei den meisten Mutationen handelt es sich um einen Aminosäureaustausch. Des Weiteren wurden aber auch einige kleine in-frame Deletionen beschrieben (Sobacchi et al. 2006). Zusätzlich zu diesen Erkenntnissen gab es auch Patienten mit einem unvollständigen 13 2 Theoretische Grundlagen Omenn Phänotyp aufgrund einer RAG Mutation (Villa et al. 2001). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass das OS als eine kontinuierliche Einheit betrachtet werden sollte, deren meist verbreitete Eigenschaft das Auftreten von Entzündungen und schweren Infektionen darstellt (Villa et al. 2008). Tabelle 2: Klassisches und atypisches Omenn Syndrom Gen Funktion Phänotyp RAG1/RAG2 V(D)J-Rekombination OS; T+ B- NK+ Artemis V(D)J-Rekombination OS; T+ B- NK+ IL7Rα Lymphozyten Entwicklung OS; T+ B+ NK+ IL2Rγ Lymphozyten Entwicklung OS; NK Infiltr. der Haut; T+ B+ CHD7 Chromatin Remodelierung OS; keine Erythrodermie; T- B+ NK+ ADA Purin Metabolismus OS; weniger T-zellen; T+ B- NK+ RMRP Zellzyklus OS; T+ B+ NK+ klassisch atypisch Modifiziert nach Marella, Maina & Villa (2011) und Villa et al. (2008) Kinder mit diesem Gendefekt fallen schon sehr früh im Leben (2. bis 5. Lebensmonat) mit chronischem Durchfall, Pneumonie und gestörtem Wachstum auf. Im Gegensatz zu an SCID erkrankten Menschen kommen noch zahlreiche weitere Symptome dazu. Hierzu zählen zum einen vergrößerte lymphatische Gewebe, schwere Erythrodermie, erhöhte IgE-Level und Eosinophilie im Blut und Gewebe (Villa et al. 2008) und zum anderen Hepatosplenomegalie, Alopezie (Kato et al. 2006) und Thymusdysplasie (Hönig, Schwarz 2006). Alle anderen Immunglobuline sind, laut Villa et al. (1999), in verminderter Konzentration im Serum nachweisbar. Der Anteil an zirkulierenden T-Lymphozyten im peripheren Blut ist sehr variabel. Er kann normal oder erhöht sein (Villa et al. 1999). Bei den vorhandenen T-Zellen handelt es sich um oligoklonale, häufig aktivierte Lymphozyten mit einem eingeschränkten TCR Repertoire (de Saint-Basile et al. 1991, Rieux-Laucat et al. 1998), überwiegend vom Th2-Typ (Schandene et al. 1993). In vitro lassen sich diese aktivierten T-Zellen kaum durch Mitogene zur Proliferation anregen (Villa et al. 1999). Meistens sind B-Lymphozyten im Blut nur in sehr geringem Ausmaß oder gar nicht nachweisbar (Aleman et al. 2001). Die Anzahl an NK- 14 2 Theoretische Grundlagen Zellen dagegen liegt bei uneingeschränkter Funktion im Referenzbereich oder kann auch erhöht sein (Aleman et al. 2001, Villa et al. 2008). Die einzigen heutzutage bekannten und angewendeten Therapiemaßnahmen bilden eine Knochenmarktransplantation oder die Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut. Vorangehend sind myeloablative Maßnahmen, sowie ein Abtöten der autoreaktiven T-Zellen, zum Beispiel mittels Chemotherapie, notwendig. Trotz dieser Therapiemaßnahmen beträgt die Mortalität 46 % (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006). Nach der Diagnostizierung ist übergangsweise eine immunsuppressive Therapie mit Prednison und Cyclosporin A hilfreich, um sowohl die Expansion als auch die Infiltration der T-Lymphozyten einzudämmen (Villa et al. 2008). Zusätzlich gibt es neue Therapieansätze, welche sich mit einer Gentherapie beschäftigen (Pike-Overzet et al. 2011, van Til et al. 2014). 2.3 Immundefiziente Tiermodelle Über das humane RAG1 hinaus werden seit langer Zeit auch die vergleichbaren Gene von Mäusen, Ratten, Zebrafischen (Willett, Cherry & Steiner 1997) und Regenbogenforellen (Hansen, Kaattari 1995) untersucht. Dieses Kapitel soll einen Überblick über Rag defiziente Maus- und Rattenstämme verschaffen. 2.3.1 Rag1 und Rag2 defiziente Mäuse Ein wichtiges Rag1 defizientes Mausmodell wurde 1992 von Mombaerts et al. generiert und analysiert. Die Rag1 Genmutation fand hierbei in pluripotenten, embryonalen Mäusestammzellen statt. Durch homologe Integration des zielgerichteten Vektors erfolgte eine 1356 bp lange Deletion der Coding Sequenz des 5‘ Endes im Rag1. Da die Deletion in etwa die halbe Coding Sequenz des Gens umfasst (incl. wichtiger Strukturen), handelt es sich, bei der daraus resultierenden Mutation, um eine Null-Mutation. Die mittels dieser Technik generierten Mäuse (129/Sv x CD1) weisen sehr kleine, zellarme lymphatische Organe auf, welche keine reifen B- und T-Lymphozyten (CD3+ oder TCRαβ+) beinhalten. In der Milz und im Knochenmark wiesen die Forscher einen geringen Anteil Prä-B-Zellen nach (Mombaerts et al. 1992b, Mombaerts et al. 1992a). 15 2 Theoretische Grundlagen Den gleichen Immunophänotyp beschrieben Shinkai et al. (1992) bei einer von ihnen generierten Rag2 defizienten Maus. Diese weist eine 286 Aminosäuren lange Deletion des Rag2 auf, was zu einem vollständigen Fehlen reifer B- und T-Lymphozyten in diesen Tieren führt. Die von Mombaerts et al. (1992) generierten Mäuse sind vital und fertil und lassen sich adspektorisch bis zur 21. Lebenswoche nicht vom Wildtyp unterscheiden. Der Nachweis des Fehlens von Serum IgM bis zur 16. Lebenswoche dient als Beweis eines „non-leaky“ Phänotyps bis zu diesem Zeitpunkt. Während bei den genannten Mausmodellen eine spezifische Omenn-Symptomatik fehlt, wurden in der Vergangenheit auch einzelne Mausmodelle, die im Phänotyp dem OS ähneln, entdeckt. Dazu zählt zum einen die 2007 von Khiong et al. beschriebene spontane Rag1 Mutante (memory mutant; MM) einer C57BL/10 Maus mit partieller Rag1 Aktivität. Die beschriebenen Tiere zeigen, zusätzlich zu einer geröteten Haut, sowohl eine Hepatosplenomegalie und Eosinophilie als auch erhöhte IgE Serumlevel, oligoklonal expandierte CD4+ T-Zellen und unnatürlich hohe Anzahlen an „memory-phenotype“ TZellen. Durch ein Beseitigen der IL-4 und IL-6 produzierenden CD4+ T-Zellen konnten die Autoren den Anstieg des IgE’s im Serum verhindern. Diese Tatsache weist auf eine Dysfunktion dieser Zellpopulation als Ursache für die OS-artigen Symptome dieses Mausstammes hin (Khiong et al. 2007). Zum anderen wurde von Marella et al. ein Rag2 mutierter Mausstamm generiert (R229Q), welchem es an AIRE Expression im Thymus fehlt und welcher zusätzlich eine starke Reduktion der Forkhead box P3+ Treg Zellen und der NKT-Zellen aufweist. Zusätzlich zeigen diese Tiere ein oligoklonales T-Zellrepertoire, periphere Eosinophilie und ein völliges Fehlen zirkulierender B-Zellen. Darm und Haut sind mit aktivierten T-Zellen infiltriert, was zu Durchfall, Alopezie und, in manchen Fällen, zu schwerer Erythrodermie führt (Marrella et al. 2007, Marrella et al. 2008). Diese Modelle unterstützen die Hypothese, dass sowohl eine verminderte zentrale Toleranz und eine gestörte Entwicklung der regulatorischen T-Zellen als auch eine homöostatische T-Lymphozytenproliferation in die Pathogenese des OS involviert sein könnten (Villa et al. 2008). 16 2 Theoretische Grundlagen 2.3.2 Rag1 defiziente Ratten „Die Ratte ist eine physiologisch und experimentell wichtige Spezies. Jedoch gibt es für sie erst wenige genetische Modifizierungsmöglichkeiten, was sie gegenüber Mäusen nicht nur für genetische Studien ins Hintertreffen geraten lässt, sondern auch bei der Generierung anderer nützlicher Forschungsmodelle“ (Aitman et al. 2008). Diese Arbeit basiert auf dem 2012 am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover generierten Rattenstamm LEW/Ztm-Rag1em1Ztm. Dieser ist auf dem Hintergrund des Inzuchtstammes LEW/Ztm entstanden. Das Ziel war es, mittels Zink-finger Nukleasen (ZFN) einen Rag1 knockout (KO) zu kreieren (Zschemisch et al. 2012). ZFN bilden eine sehr effiziente Möglichkeit, spezifische Genmodifikationen herbei zu führen. Es handelt sich dabei um Hybridproteine, die aus polymeren Zink-finger Proteinen zusammengesetzt und an die Endonuklease Domäne des Restriktionsenzyms FokI gebunden sind. Ein ZFN Paar bindet an zwei angrenzende Target Sequenzen jedes DNA Stranges im Abstand von 6 bp und spaltet sie. Eine anschließende Dimerisierung der FokI Domäne verursacht den Doppelstrangbruch (DSB) und initiiert den endogenen Reparaturprozess. Erfolgt letzterer fehlerhaft, kann es zu Deletionen und Insertionen kommen und darüber hinaus zur Generierung eines inaktiven Proteins (Aitman et al. 2008, De, Rodgers 2004). Um den spezifischen Genknockout herbeizuführen, wurde Rag1 spezifische ZFN mRNA in Zygoten ingezüchteter LEW/Ztm Ratten mikroinjiziert. Von 59 geborenen Nachkommen trug ein Weibchen („founder 58“) auf einem Allel eine Mutation im Rag1. Verschiedene Untersuchungen der Arbeitsgruppe wiesen nach, dass es sich dabei um eine 4 bp Deletion handelte, welche in einem verfrühten Stopcodon resultierte und dadurch zu einer verkürzten Version des RAG1 Proteins führte. Die Homozygoten Nachkommen des Foundertieres 58 zeigten einen deutlich veränderten Phänotyp zu den Wildtypen (WT). Es konnte ein komplettes Fehlen von B-Lymphozyten im peripheren Blut nachgewiesen werden, zudem einige wenige reife T-Zellen (4,6 %) und eine deutlich vergrößerte NK-Zellpopulation. Des Weiteren wiesen die untersuchten Milzen der Nachkommen einen reduzierten Anteil weißer Pulpa auf, sowie fehlende PALS. Die Thymi der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm waren hypoplastisch, ohne follikuläre Strukturen und beinhalteten 17 2 Theoretische Grundlagen kaum RAG1 Protein. Die Lymphknoten zeigten ein lymphozytenarmes Bild. An weiteren Organen außerhalb des Lymphatischen Systems wurden sowohl makroskopisch als auch histologisch keine Veränderungen nachgewiesen (Zschemisch et al. 2012). Außer dem in dieser Arbeit verwendeten Rattenmodell, sind in der Literatur noch wenige andere Rag1 defiziente Rattenstämme beschrieben. Einen davon bildet die SD-Rag1tm1sage. Dieses Rattenmodell entstand aus dem Auszuchtstamm Sprague-Dawley (SD) und wurde mit derselben ZFN Technik wie oben beschrieben erstellt. Sie weist eine 29 bp Deletion im Exon 2 auf Chromosom 3 auf. Bei homozygoten Knockoutträgern kann kein RAG1 Protein per Western Blot im Milzgewebe nachgewiesen werden und durchflusszytometrische Analysen zeigen einen nahezu kompletten B-Zellverlust. Einige wenige reife T-Zellen lassen sich auch bei diesem Rattenstamm noch nachweisen. Diese Ratte ist kommerziell erhältlich und wird von der Firma SAGE Labs als Tiermodell für Xenotransplantationen und immunologische Studien angepriesen. Allerdings ist sie bisher kaum phänotypisch charakterisiert (SAGE Labs 2015). Des Weiteren haben Ménoret et al. (2013) eine immundefiziente Rag1-KO Ratte mittels „engineered meganucleases“ erschaffen. In ihrer Studie wenden sie als erste Gruppe Meganukleasen an, um das Genom in Säugetierzygoten zu modifizieren. Zudem bezeichnen sie sich als die erste Forschungsgruppe, die einen immundefizienten Rag1-KO Rattenstamm generiert und diesen vollständig phänotypisch charakterisiert hat. Nach erfolgreicher Genmodifikation wies ein Tier (4 %) eine 5 bp Deletion im Rag1 auf (Ménoret et al. 2013). Meganukleasen werden ähnlich den ZFN angewendet und produzieren auch DSB der DNA. Sie verhalten sich jedoch spezifischer, wodurch unerwünschte Effekte weniger häufig auftreten. Humanes RAG1 wurde damit schon früher detektiert (Grizot et al. 2009, Redondo et al. 2008). Für ihre Untersuchungen haben Ménoret et al. Ratten der Linie Sprague-Dawley verwendet. Alle Untersuchungen zur Immunophänotypisierung fanden an 8 Wochen alten Tieren statt. Die KO-Tiere wiesen verkleinerte lymphatische Organe (Milz, Thymus, Lymphknoten) auf, deren totale Zellzahlen signifikant vermindert waren. Zudem zeigten sich im Vergleich zum WT deutliche Abweichungen in den Lymphozytenpopulationen. Die Forscher detektierten 18 2 Theoretische Grundlagen kleinere und in ihrer Anzahl verminderte, unreife und reife B- und T-Lymphozyten im peripheren Blut, Thymus, Milz und Lymphknoten. Das Knochenmark zeigte einen deutlichen Verlust an Prä-B-Zellen und reifen B-Zellen. Die Makrophagen- und NK-Zellpopulation stellte sich normal dar. Des Weiteren konnte kein RAG1 Protein im Thymus der KO-Tiere nachgewiesen werden und die IgG, IgA und IgE Immunglobulinlevel im Serum waren vermindert. Letztendlich wurde die Immunantwort der KO-Ratten in vivo bestimmt. Dazu erfolgte die Transplantation von MHCI/II inkompatiblen Spenderherzen (LEW.1A), woraufhin die Abstoßung durch die immundefizienten Tiere deutlich verzögert verlief. 19 3 Material und Methoden 3 Material und Methoden 3.1 Versuchstiere Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Rattenstämme, deren verwendete Abkürzungen und die Hygieneeinheiten, in denen sie gezüchtet und gehalten werden, aufgelistet. KF steht hier für eine keimfreie Haltung, SPF3/4 beschreibt zwei voneinander unabhängige spezifisch pathogenfreie Haltungseinheiten mit unterschiedlichen Keimstatus. Diese werden in Kapitel 3.1.2 näher beschrieben. Tabelle 3: Verwendete Tierstämme Stamm Abkürzung LEW Hygieneeinheit LEW/Ztm LEW/Ztm-Rag1em1Ztm LEW-Rag1 KF1, SPF31, SPF41 LEW.1F/TCRA (black hooded) LEW.1F Konventionell2 LEW.1W/7B LEW.1U Konventionell1 Konventionell2, SPF31 1 Zentrales Tierlaboratorium, MHH 2 Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie, MHH In der gesamten Arbeit wurden ausnahmslos LEW/Ztm Ratten als Kontrolltiere zu den LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratten verwendet. Einige wenige Daten wurden auch an heterozygoten Trägern des Rag1 Gendefektes erhoben (Kap. 4.2.8 und 4.5.2). Diese werden vereinfacht als LEW-Rag1+/- benannt. Als LEW-Rag1 Ratten werden ausschließlich die homozygoten Träger dieses Gendefektes bezeichnet. Die gesamte Studie wurde entsprechend den Bestimmungen des Deutschen Tierschutzgesetzes und der Richtlinien 86/609/EEC und 2010/63/EU der Europäischen Gemeinschaft zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt. Die Zucht der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit gemäß § 8 Abs. 1 des Tierschutzgesetzes genehmigt (33.14-42502-04-14/1492). 20 3 Material und Methoden Um die Vergleichbarkeit der erhobenen Daten zu gewährleisten, wurden in allen folgenden Untersuchungen vergleichbare Probenanzahlen junger (<60 Tage alt), mittelalter (60-120 Tage alt) und alter (>120 Tage alt) Ratten analysiert. 3.1.1 Haltung Die Tiere der Stämme LEW, LEW-Rag1 und LEW.1U wurden im Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der MHH gehalten. Der Stamm LEW.1F und die LEW Kontrolltiere für die in vitro Proliferationstests wurden im Tierhaltungsraum an der Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie der MHH gehalten. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2°C, die Luftfeuchtigkeit lag bei 55 ± 5% und die Beleuchtung der Räume mit Kunstlicht erfolgte täglich über 14 Stunden, gefolgt von einer 10 stündigen Dunkelphase. Die Ratten wurden in Typ IVs Makrolon®-Käfigen [Bayer MaterialScience AG, Leverkusen, Deutschland] in unterschiedlichen Hygienebereichen gehalten und die Einstreu aus Weichholzgranulat wurde ein- bis zweimal pro Woche erneuert. Wasser und pelletiertes Alleinfutter (ssniff®, M-Z), mit 22 % Protein, 4,5 % Fett und 3,9 % Rohfaser, standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Keimfreien Ratten wurden in Überdruck-Plastikfilm-Isolatoren [Metall + Plastik GmbH, Radolfzell-Stahringen, Deutschland] gehalten. Wasser und Einstreu wurden autoklaviert (134°C, 60 min), das Futter wurde mit 50 kGy bestrahlt. In den spezifisch pathogenfreien Haltungen wurde die Einstreu zuvor autoklaviert (134°C, 10 min), das Wasser steril filtriert und autoklaviert (134°C, 10 min) und das Futter bestrahlt (SPF4; 50 kGy) oder autoklaviert (SPF3; 134°C, 10 min). Zu den unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen geführten Tierräumen hatte nur eine begrenzte Anzahl von Personen Zutritt. Das strikte Hygienemanagement umfasste eine Dusche mit anschließendem Kleidungswechsel (Nassbarriere). Auch die konventionellen Tierräume durften nur mit Schutzkleidung und nach entsprechenden Rahmen vierteljährlicher Desinfektionsmaßnahmen betreten werden. 3.1.2 Gesundheitsüberwachung Die Gesundheitsüberwachung der Tiere wurde im Routineuntersuchungen gemäß den FELASA-Empfehlungen (Mähler et al. 2014, Nicklas et 21 3 Material und Methoden al. 2002) am ZTL durchgeführt. Hierbei wurden bei den LEW-Rag1 Ratten der SPF3 Staphylococcus aureus und Klebsiella oxytoca als fakultativ pathogene Erreger nachgewiesen. Ergänzt wurde die Überwachung durch PCR basierte Tests auf Kilham rat virus, Toolhan’s H1 virus, Pneumocystis spp., Mycoplasma pulmonis, Chlostridium piliforme, Helicobacter spp. und Streptobacillus moniliformis an auffälligen LEW-Rag1 Tieren aller Hygienestatus, die sich jedoch auch als negativ erwiesen. Bei der in Kapitel 3.1 als „Konventionell“ bezeichneten Haltungseinheit handelt es sich um einen experimentellen Haltungsbereich, dessen Hygienestatus regelmäßig überwacht wird. 3.2 Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien Eine vollständige Liste aller verwendeten Laborgeräte, Verbrauchsmaterialien, Reagenzien, Kits und Computerprogramme befindet sich im Anhang. 3.3 Anfertigung histologischer Präparate Die Tiere wurden mittels CO2-Inhalation betäubt. Die nachfolgende Tötung erfolgte durch Blutentzug mittels Herzpunktion. Danach wurde auf einer Waage ihr Körpergewicht bestimmt, um später ihre Körpergewichte und Organgewichte in Relation zum Gesamtgewicht zu vergleichen. Alle Organe wurden auf ihre Lage, Form, Farbe und Konsistenz hin untersucht und der Sektionsgang verlief bei allen untersuchten Tieren nach demselben Schema. Alle präparierten Organe wurden umgehend nach ihrer Entnahme in ein formaldehydhaltiges Fixans (4 %iges Formalin) überführt und darin 3 Tage zur Fixierung belassen. Der Zuschnitt erfolgte nach der Registry of Industrial Toxicology Animal-data (RITA). Die zugeschnittenen Organteile wurden danach in Standardeinbettkassetten verbracht und über Nacht entwässert (Tab. 13). Anschließend erfolgte das Einbetten in Paraffin, danach wurden mit dem Mikrotom 2-3 µm dicke Organschnitte angefertigt. Nach dem Aufziehen auf Glasobjektträger wurden die Schnitte im Färbeautomaten mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) nach dem in Tabelle 14 im Anhang dargestellten Protokoll gefärbt und danach luftdicht eingedeckt. 22 3 Material und Methoden Das Farbergebnis ist folgendes: Zellkerne – blau; Zytoplasma – rot; Knorpel – blau-violett; Erythrozyten – rot; Muskulatur – rot. 3.3.1 Histologische Auswertung Alle für die Charakterisierung dieses Tiermodells notwendigen Organe wurden histologisch ausgewertet. Das Vorgehen richtete sich dabei nach der Stärke und Komplexität der Veränderungen. Im Folgenden werden die Bewertungsmaßstäbe und Scores der einzelnen Organe detailliert beschrieben. Zur Vereinfachung der Auswertung steht die Zahl 0 für ein nicht vorhandenes Merkmal, bzw. für ein Merkmal, welches auch bei den Kontrolltieren zu finden ist. Eine Einteilung in 0 und 1 bedeutet lediglich, dass das Kriterium vorhanden ist oder nicht. Weiterführend kommen die Einteilungen 0-2, 0-3 und 0-5 vor. Je höher die zugeordnete Zahl ist, desto stärker ist das zu bewertende Merkmal ausgeprägt. Bei allen bewerteten Zellinfiltrationen fand auch immer eine Bestimmung des Zelltyps statt. 3.3.1.1 Immunsystem Die Infiltration mit Entzündungszellen wurde in der Milz mithilfe einer Skala von 0-3 bewertet. An den Mesenteriallymphknoten wurden folgende Befunde bewertet: Größe (klein/groß bzw. 0/1), Mastozytose (0/1), Nekrose (0/1), Hämosiderinspeicherung (0/1) und Entzündungszellinfiltration (0-3). Anschließend wurden die Zahlen addiert. Eine gesonderte Beurteilung der Unterkieferlymphknoten fand gepaart mit der Bewertung der Speicheldrüsen statt. Da sich die Veränderungen an den Thymi der Rag1-Ratten im Vergleich zu den LEW Ratten glichen, erfolgte hier nur eine Beschreibung des Befundes. Eine Einteilung in verschiedene Ausprägungsgrade war nicht möglich. 3.3.1.2 Gastrointestinaltrakt Die Scores für die verschiedenen Anteile des Verdauungstraktes gleichen sich im Wesentlichen. Leichte Unterschiede in der Schichtverteilung der Entzündungszellen ergaben sich nach den Vergleichen mit den Kontrollorganen. Alle zugehörigen Organe wurden zum 23 3 Material und Methoden einen hinsichtlich der Verbreitung der Entzündungszellen über das gesamte Organ beurteilt und zum anderen hinsichtlich der Schichttiefe, in welche sie hinein reichen. Abschließend erfolgte auch hier eine allgemeine pathologische Bewertung, um die Gesamterscheinung des Organs zu klassifizieren. Konkret für den Magen wurde folgender Bewertungsscore angelegt. Schichtausbreitung (0: Übergang Tunica Mukosa/ Tela Submukosa; 1: Nur Tunica Mukosa; 2: Tela Submukosa; 3: Tunica Muskularis). Ausbreitung über das gesamte Organ (0: Ganzes Organ, vereinzelt und nicht in jedem Blickfeld; 1: Geringgradig vermehrte Entzündungszellen; 2: Mittelgradig vermehrte Entzündungszellen; 3: Hochgradig vermehrte Entzündungszellen). Die allgemeine pathologische Bewertung beurteilte das Organ nochmals nach seinem Gesamteindruck und der Schwere der Veränderungen (0-3). In den Dünndärmen der Kontrolltiere befinden sich vereinzelt Entzündungszellen in der Mukosa. Das führte dazu, dass für dieses Bild 0 Punkte vergeben wurden. Vermehrte Zellen in der Mukosa bekamen 1 Punkt, Zellen in der Submukosa wurden mit 2 und in der Tunica Muskularis mit 3 Punkten beziffert. Sollte es im Zuge dieser Veränderungen schon zu einer Peritonitis gekommen sein, wurde die gegebene Punktzahl um 1 erhöht. Die Bewertung der Zellverbreitung über das gesamte Organ und die allgemeine pathologische Bewertung erfolgten wie oben für den Magen beschrieben. Die Bewertung der Blinddärme und Dickdärme erfolgte analog zur Bewertung der Dünndärme. Für das Pankreas der LEW-Rag1 Ratten wurde kein Bewertungsschema erarbeitet, da in diesem Organ keine auf den Gendefekt zurückzuführenden Veränderungen auffielen. 3.3.1.3 Leber An den Lebern der Ratten fand in erster Linie eine Bewertung der Zellinfiltrationen rund um die Gallengänge statt. Hierbei fand eine Einteilung in die Stufen „keine, geringgradig, mittelgradig, hochgradig“ (0-3) statt. Zusätzlich wurden vereinzelt sichtbare Nekroseareale aufgenommen (0/1). 24 3 Material und Methoden 3.3.1.4 Herz Die Herzen wurden hinsichtlich des Vorhandenseins und der Stärke der Myokardinfiltrationen beurteilt (0-3). 3.3.1.5 Haut Der entnommene Teil Bauchhaut wurde anhand der Parameter Hyperkeratose (0-2), Entzündungszellinfiltration (0-3), deren Schichtausbreitung (1: Epidermis, 2: Corium, 3: Subkutis) und vorhandener Epithelschädigung (1: Erosion, 2: Exkoriation, 3: Ulzeration) beurteilt. Die Einzelwerte wurden addiert und ergaben eine Gesamtbeurteilung der Schwere der Hautschädigung in diesem Körperbereich (0-11). 3.3.1.6 Speicheldrüsen Zur Beurteilung der Gesamtheit der Speicheldrüsenveränderungen wurden ihre drei paarigen Anteile (Glandula parotis, mandibularis und sublingualis) sowie die sich in diesem Bereich befindlichen Lymphknoten bewertet. Infiltrate im Binde- und Fettgewebe der Drüsen erhielten bei vereinzeltem Auftreten den Wert 1 und bei diffusem Auftreten den Wert 2. Erstreckten diese sich bis ins Drüsengewebe, erhielten sie für milde Infiltration den Wert 3 und bei mittelgradigem Auftreten eine 4. Für fibrotischen Umbau des Drüsenkörpers gab es eine 5. Die Lymphknoten wurden hinsichtlich einer auftretenden Lymphadenitis mit den Werten 0-4 bewertet. 1-3 bilden die Stärke der Entzündungszellinfiltration ab. Traten zusätzlich Nekrosen auf, wurde der Wert um 1 erhöht. Nach Addition beider Werte ergibt sich mit diesem Scoringsystem ein Maximalwert von 9. 3.3.1.7 Lunge Das Beurteilungsschema für die entnommenen Lungen gliedert sich wie folgt in: Verdickte Alveolarwände (0-2), Infiltration mit Entzündungszellen (0-3), vermehrte Mukusproduktion/ Clarazellhyperplasie (0-2) und Vorkommen von Herzfehlerzellen (0-2). Zuletzt erfolgte eine allgemeine pathologische Bewertung, welche die Ausmaße der Veränderungen als Gesamteindruck zusammenfasst (0-5). Nach anschließender Aufsummierung der Einzelwerte ergaben sich Gesamtwerte für die Lungen zwischen 0 und 14. 25 3 Material und Methoden 3.4 Bestimmung der Leukozytenzahlen in verschiedenen Lymphknoten und der Milz Da schon im Vorfeld besondere Veränderungen an den lymphatischen Organen festgestellt werden konnten, wurde, zusätzlich zur histologischen Untersuchung, die absolute Leukozytenzahl in der Milz, dem linken Kniefalten Lymphknoten (Ln. subiliacus) und dem linken medial gelegenen Ln. mandibularis bestimmt. Dazu wurden die entsprechenden Organe während der Sektion entnommen und in PBS aufbewahrt. Nachfolgend wurden sie mit Hilfe zweier Pinzetten in ihrem Medium in einem Zellsieb zerzupft und mit leichtem Druck durch das Sieb gespült. Die gesamten Organe wurden standardmäßig in 5 ml Medium aufgenommen und dann die Zellzahl pro µl mit dem „SCIL Vet abcTM“ bestimmt. Der erhaltene Wert konnte dann auf das gesamte Organ in der 5 ml Suspension hochgerechnet werden. 3.4.1 Lebend-Tot-Färbung der Lymphozyten Zusätzlich zur Zählung der Leukozyten, wurden die Lymphknotenzellen von LEW und LEWRag1 Ratten in einer Lebend-Tot-Färbung beurteilt. Hierzu erfolgte ein Anfärben der Zellsuspension mit einer 1:2,5 mit 0,9 % NaCl verdünnten Trypan Blau Lösung [Sigma Aldrich, #T8154]. Danach wurden die Zellen bei 100-facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop, mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer, hinsichtlich ihrer Vitalität und ihres Verhältnisses zueinander beurteilt. 3.5 Erfassung physiologischer Parameter Aufgrund des klinischen Bildes, welches sich bei der LEW-Rag1 Ratte zeigt, wurden weitere physiologische Parameter mit denen der LEW Ratten verglichen. Zum einen wurden Tiere unterschiedlicher Haltungen, unterschiedlichen Geschlechts und unterschiedlichen Alters gewogen und ihre Gewichte notiert. Zusätzlich wurde dabei zwischen erkrankten und gesund erscheinenden Tieren unterschieden. Aus diesen Daten wurden dann Rückschlüsse auf die Gewichtsentwicklung bei steigendem Alter gezogen. 26 3 Material und Methoden Zum anderen wurden die Reproduktionsdaten der letzten zwei Jahre, rückblickend mit Hilfe der jeweiligen Zuchtkarten, zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten verglichen. Dabei wurde Wert auf folgende Parameter gelegt: Wurfgröße, Wurfanzahl, Absetzer und Zwischenwurfzeiten. Zusätzlich fand eine Berechnung des „Colony Index“ für jede separate Haltungseinrichtung statt. Dieser errechnet sich aus Absetzern pro Weibchen pro Woche. 3.6 Erfassung pathologischer Symptome Schon im Vorfeld dieser Arbeit ist aufgefallen, dass die LEW-Rag1 Ratte im Laufe ihres Lebens einige unbestimmte klinische Krankheitssymptome entwickelt. Deshalb wurde im Laufe der Studie zu jedem Tier wöchentlich ein eigener Befundbogen von geschultem Tierpflegepersonal ausgefüllt. Dieser ist im Anhang (Kap. 9.9) dargestellt. Mithilfe dieses Bogens war es möglich, die Symptome zu quantifizieren und ihr Entstehen sowie ihren Verlauf zeitlich einzuordnen. Zusätzlich dazu wurden alle histologisch untersuchten Tiere vor der Sektion mit einem klinischen Score (Tab. 4) bewertet. Die klinischen und histologischen Daten wurden korreliert, um nachweisen zu können, wie gut geeignet die Gruppeneinteilung in „gesund“ und „krank“ nach den in Tabelle 4 genannten Kriterien ist. Tabelle 4: Klinischer Score der histologisch ausgewerteten Tiere Kriterium Adspektion des Tieres von außen, klinische Symptome Allgemeinbefinden gestört, Gewichtsverlust Gesamt Score 0-3 0-3 0-6 Zusätzlich zu diesem allgemeinen Studienabschnitt wurden sechs gesunde, weibliche LEWRag1 Ratten im Alter von 9 (1 Tier) und 5 Wochen (5 Tiere) aus der SPF4 Haltung in eine keimreichere Umgebung verbracht und die gesamte Zeit einer antimikrobiellen Therapie unterzogen. In der veränderten Haltungsumgebung wurden sie in individuell belüfteten Käfigen gehalten, um eine übermäßige Kontamination zu vermeiden. Wöchentliches Umsetzen fand unter der Laminar-Flow statt. Direkt nach dem Verlassen der SPF Haltung wurden die Tiere täglich antibiotisch behandelt. Dies geschah oral mit 5 ml Cotrim K (240 mg/5 ml Sulfamethoxazol und Trimethoprim 5:1) pro Liter Tränke über das Trinkwasser bis zum Lebensende der Tiere. Der Gesundheitszustand der Ratten wurde täglich kontrolliert und 27 3 Material und Methoden ihre Körpergewichte wurden im Abstand von 7 Tagen dokumentiert. Hiermit sollte herausgefunden werden, ob eine dauerhafte antibiotische Therapie vor der Entstehung klinischer Symptome schützt. 3.7 Gemischte Leukozytenkultur Die gemischte Leukozytenkultur (Mixed Leucocyte Culture, MLC) ist ein in vitro Verfahren zur Überprüfung der Gewebeverträglichkeit zwischen einem Transplantationskandidaten (Responder) und prospektiven Spendern (Stimulatoren) und wird zum Beispiel im Rahmen einer allogenen Knochenmarktransplantation durchgeführt (Bein et al. 1998). Dabei werden Lymphozyten des Responders mit Zellen des Stimulators zusammen in Kultur gehalten und später die Stärke der Immunantwort des Responders bestimmt. Im Zuge dieser Studie wurden die Lymphozyten mehrerer LEW und LEW-Rag1 Ratten in MLC-Tests untersucht und ihre Reaktion verglichen, um herauszufinden, ob es sich bei den beobachteten klinischen Symptomen der LEW-Rag1 Tiere um eine autoimmune Reaktion handelt. Gleichzeitig wurde die Reaktion der LEW-Rag1 Lymphozyten auf die Stimulation durch Allo- und Xenoantigene im Vergleich zu LEW untersucht. Die Responderzellen stellten in diesem Fall Zellen aus den peripheren Lymphknoten der LEW und der LEW-Rag1 Ratten dar. Als Stimulatorzellen dienten Milzzellen der Stämme LEW, LEW.1F und LEW.1U und zusätzlich der porzine B-Zellklon L23. Hierbei dienten die LEW-Milzzellen als Isoantigen, die LEW.1F- und 1U-Zellen als Alloantigen und die L23-Zellen als Xenoantigen. Die beiden Alloantigene weisen unterschiedliche MHCs auf. So konnte die Reaktion der LEW-Rag1 Lymphozyten auf zwei verschiedene Alloantigene getestet werden. Um eine Proliferation der Stimulatorzellen ausschließen zu können, wurden diese zuvor bei 30 Gy bestrahlt. So konnte die später gemessene Zellproliferation sicher den Responderzellen zugewiesen werden. Die zur Analyse notwendige Methode wird hier am Beispiel einer LEW Ratte und einer LEWRag1 Ratte dargestellt. Einer frisch getöteten LEW Ratte wurden die Milz und einige periphere Lymphknoten (Lnn. subiliaci, Lnn. axillares, Lnn. mandibulares) entnommen. Einer LEW.1F und einer LEW.1U Ratte wurde die Milz entnommen und einer LEW-Rag1 Ratte wurden einige periphere Lymphknoten entnommen. Die Organe wurden kurze Zeit in PBS + 5 % FCS in Petrischalen 28 3 Material und Methoden gelagert, bevor sie mit Hilfe zweier gebogener Pinzetten zerzupft und durch ein Zellsieb gegeben wurden. Nachdem die Erythrozyten in der Milzzellsuspension lysiert waren, mussten die übrigen Milzzellen bei 30 Gy bestrahlt werden, damit keine Proliferation mehr stattfinden kann. Aus der Lymphknotenzellsuspension des LEW Tieres wurden mittels einer Nylonsäule die B-Zellen herausgefiltert, sodass sich später fast nur noch T-Lymphozyten in der Zellsuspension befanden (Julius, Simpson & Herzenberg 1973). Das führte zu einer besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen LEW und LEW-Rag1. Tabelle 5: Zellkulturmedium für MLC Substanz RPMI 1640 FCS (inaktiviert) PS/Glutamine Menge 500 ml 10% 5 ml Firma BioWhittaker, #LO 12-167Q Biochrom Superior, #S 0615 Sigma, #G1146 SLBR9280 Nach dem Waschen und Zählen der Zellsuspensionen wurden die Zellen laut Plattenplänen in 96-well Mikrotiterplatten im Dreifachansatz ausgesät (Abb. 4). Hierbei kamen 2x105 Zellen in 100 µl Zellkulturmedium pro Zelltyp in ein Well. Abbildung 4: Pipettierschema MLC Links sind die Positiv- und Negativ-Kontrollen dargestellt, wobei die Zellen nach der Zugabe von Zellkulturmedium kaum Proliferation zeigen sollen. Nach der Zugabe des ConA sollten alle Zellen proliferieren. Im rechten Abschnitt sind die Tests der LEW- und LEW-Rag1-Lymphozyten im Dreifachansatz dargestellt. Exemplarisch für beide Alloantigene ist hier nur LEW.1F angegeben. Die Platten inkubierten durchgängig im CO2 begasten Brutschrank bei einer Temperatur von 37 °C und einer Luftfeuchte von 95 %. Den Positiv-Kontrollen wurde gleich zu Beginn das T- 29 3 Material und Methoden Zell Mitogen Concanavalin A (ConA) zugesetzt, um die Zellen zur Proliferation anzuregen. Die Inkubationszeit betrug für diese Proben 48 Stunden. Die restlichen Proben blieben für 74 und 92 Stunden im Brutschrank. Dann erfolgte die Isotopenmarkierung durch Zugabe von radioaktivem Methyl-3H-Thymidin (1 µCi in 50 µl RPMI pro well) sowohl auf die Kontrollen als auch auf die Analyseproben. Hierbei handelt es sich um einen radioaktiv markierten DNA Baustein, der bei der Vervielfältigung der DNA vor der Zellteilung in den Zellkern der vitalen Zellen eingebaut wird (Taylor, Woods & Hughes 1957). Nach einer weiteren Inkubationszeit von 16 Stunden wurden die Zellen mit dem „Filter Mate Harvester“ [Perkin Elmer] von der Platte geerntet und auf eine Filtermatte überführt, auf derer nach dem Trocknen die Menge des eingebauten 3H-Thymidins in counts per minute (cpm) pro MLC-Kultur erfasst wurde [„Wallac Trilux 1450 Microbeta“, Perkin Elmer]. Die Menge des eingebauten 3H-Thymidins stellt die Stärke der Zellstimulation und -proliferation dar. Aus den Dreifachwerten wurde der jeweilige Medianwert errechnet und als Ergebnis registriert. 3.8 Fluoreszenzbasierte durchflusszytometrische Analysen Durchflusszytometer ermöglichen die simultane Messung mehrerer physikalischer Charakteristika einzelner Zellen. Dazu gehören die relative Zellgröße, die Granularität und die relative Fluoreszenzintensität. Das macht es möglich, mehrere Zellpopulationen voneinander abzugrenzen. Bei der Messung wird die Zellsuspension durch einen Hüllstrom verdünnt, um anschließend Einzelzellen im rechten Winkel an einer monochromatischen Lichtquelle (Laser) vorbeizuführen. Lichtsignale verschiedener an Antikörper gebundener Farbstoffe unterscheiden sich spektral und werden durch Photomultipler detektiert. Diese wandeln das Licht in elektrische Signale um (Rothe 2007). „FACS” bedeutet Fluorescence-Activated-Cell-Sorter. Im Anhang sind alle verwendeten fluoreszenzmarkierten Antikörper dargestellt. FITC steht für Fluoreszeinisothiocyanat und PE für Phycoerythrin. Diese Farben werden mit der 488 nm-Hauptlinie eines Argon-Lasers angeregt. Die Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:100 mit FACS-Puffer eingesetzt. Alle Messungen fanden, wenn nicht anders beschrieben, mit dem „FACS Calibur“ von Becton Dickinson statt und wurden am PC mit dem Programm CellQuest Pro ® von BD ausgewertet. Die Färbung fand immer im FACS-Röhrchen (5 ml) statt und es wurde 30 3 Material und Methoden kontinuierlich auf einer Eisplatte gearbeitet. Alle Zentrifugationsschritte der Probenröhrchen liefen 4 Minuten lang bei 200 g und 4 °C [Multifuge 3SR+, Heraeus]. Die Zellen sammelten sich daraufhin am Röhrchenboden und die Überstände konnten abgegossen werden. Für die durchflusszytometrischen Analysen wurden Vollblut, Milz- und Lymphknotenzellen sowie Thymusgewebe verwendet. Mit einer Doppelfärbung von CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen erfolgte der Nachweis von reifen T-Lymphozyten. Diese tragen gleichzeitig auch einen αβ- oder γδTCR. Bei den CD3+CD4+ Lymphozyten handelt es sich um T-Helferzellen und bei den CD3+CD8+ T-Zellen handelt es sich um zytotoxische T-Zellen. Tragen diese Zellen zusätzlich das Molekül CD25 auf ihrer Oberfläche, dann handelt es sich um aktivierte/ regulatorische T-Lymphozyten. Regulatorische Zellen weisen zusätzlich noch den intrazellulären Marker Forkhead box protein 3 (Foxp3) auf. Zu den Zellfraktionen, die gleichzeitig CD4 und CD8 auf ihrer Oberfläche tragen, gehören zum einen die DP Lymphozyten und zum anderen die Fraktion der Monozyten und Makrophagen. CD161 als spezifisches Molekül für einen NKZellrezeptor lässt sich vorwiegend auf NK-Zellen finden. Zusätzlich trägt auch die kleine Fraktion der NKT-Zellen dieses Oberflächenmolekül. Das Molekül CD45RA wird in dieser Arbeit als detektierbares spezifisches Merkmal der B-Lymphozyten genutzt. 3.8.1 Blut Das entnommene Blut wurde in EDTA-Blutsammelgefäßen aufgefangen und die Anzahl der weißen Blutkörperchen mit Hilfe des „SCIL Vet abcTM“ bestimmt. Im nächsten Schritt folgte die Aufteilung in die FACS-Proben-Röhrchen. Pro Färbung wurden 20 µl Blut eingesetzt. Dieses wurde einmalig mit 2 ml Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse) gemischt und dann zentrifugiert, um den Großteil der roten Blutkörperchen aus der Probe zu entfernen. Darauf folgte ein Waschschritt mit FACS-Puffer. Anschließend wurden die vorverdünnten zu untersuchenden Antikörper auf die Proben gegeben und durch vorsichtiges auf und ab Pipettieren mit der Zellsuspension vermischt. Darauf folgte eine 45-60 minütige Inkubation bei 4 °C im Dunkeln. Danach wurde überschüssiger, nicht gebundener Antikörper in zwei Waschschritten mit FACS-Puffer entfernt und es folgte die Analyse. 31 3 Material und Methoden Tabelle 6: FACS Puffer Substanz PBS NaN3 Menge 1l 0,3 g Firma Biochrom, #L182-05 Merck, #8.22335.0100 BSA 1,0 g Sigma, #A9647-50G Tabelle 7: Erythrozyten Lysis Puffer (Erylyse) Substanz EDTA NaHCO3 Menge 0,037 g 1,0 g Firma Carl Roth, #8043.2 Sigma, #S5761-500G NH4Cl 8,34 g Merck, #1.01145.1000 H2O dest. pH 1l 7,3 3.8.2 Milz und Lymphknoten Milz und periphere Lymphknoten wurden in toto, ohne umliegendes Fettgewebe, aus dem Tierkörper entnommen und in gekühlten FACS-Puffer überführt. Mit Hilfe zweier gebogener Pinzetten wurde das Organgewebe vorsichtig zerzupft und mit FACS-Puffer durch ein 40 µm Zellsieb gegeben. Die Suspension wurde in einem 15 ml Kunststoffgefäß mit Schraubverschluss und konischem Boden [Cellstar® Tubes, Greiner Bio-One] aufgefangen und danach 7 Minuten lang bei 1100 rpm zentrifugiert [Multifuge 3SR+, Heraeus]. Der Überstand wurde durch Abgießen von dem Zellpellett getrennt. Weiterhin fand in der Milzzellsuspension eine Lyse der Erythrozyten mittels 6 ml Erylyse statt und danach ein Waschgang mit 6 ml FACS-Puffer. Je nach Menge der isolierten Zellen, wurden sie in einem bestimmten Volumen FACS-Puffer aufgenommen und dann auf FACS-Röhrchen verteilt (200.000-1.000.000 Zellen pro Probenröhrchen). Die Färbung, Inkubation der Antikörper und anschließenden Waschschritte erfolgten wie oben beschrieben. 32 3 Material und Methoden 3.8.3 Thymus Die Aufarbeitung der Thymi erfolgte in gleicher Weise wie die Aufarbeitungen der Milzen und Lymphknoten. Allerdings waren die entnommenen Proben häufig sehr fettgewebsreich, da die, zum Teil nur rudimentär vorhandenen, Thymi der LEW-Rag1 Ratten sehr schwer zu lokalisieren waren. Aufgrund dieses probenweise sehr geringen Gehaltes an Leukozyten in der Zellsuspension, war eine Auswertung häufig nicht möglich. 3.8.4 Intrazelluläre Färbung Um den Anteil der regulatorischen T-Lymphozyten an der gesamten Lymphozytenpopulation bestimmen zu können, wurde für alle oben genannten Organe, außer dem Thymus, eine intrazelluläre Färbung des Foxp3, kombiniert mit dem Oberflächenantigen CD25, durchgeführt. Nach der Oberflächenfärbung erfolgte die Zellaufbereitung mit dem „FOXP3 Fix/Perm Buffer Set“ [BioLegend] nach dem beiliegenden Protokoll. Nach Inkubation der Zellen im „Fixation and Permeabilisation Buffer“ und anschließendem Waschen mit „Permeabilisation Buffer“ (beides im Set von BioLegend) konnte der im „Permeabilisation Buffer“ vorverdünnte Foxp3-Antikörper dazugegeben werden. Es folgte eine weitere Inkubation, um dem Antikörper Zeit zu geben, in die permeabilisierten Zellen zu gelangen und dort zu binden. Nach den anschließenden Waschschritten konnten die Proben am Durchflusszytometer [Gallios TM Flow Cytometer] gemessen werden. 3.8.5 Auswertung der FACS-Daten mit CellQuest Pro® Die gemessenen Farbintensitäten der Proben wurden mit Hilfe dieses PC Programms und sogenannter DotPlots (Punktwolken Diagramme) ausgewertet. Als allererstes wurde ein Gate um die gesamte Lymphozytenpopulation der Probe gelegt. Nur Zellen aus diesem Gate gehen dann in die weitere Auswertung Abbildung 5: Lymphozytengate ein. Der Forward Scatter (FSC), hier auf der X-Achse, beschreibt die Zellgröße. Der Side Scatter (SSC), hier auf der Y-Achse, beschreibt die Granularität der Zellen (Abb. 5). 33 3 Material und Methoden Als nächstes erfolgte die Beurteilung der ungefärbten Kontrolle hinsichtlich etwaiger falsch positiv gefärbter Zellen und dann folgte die Beurteilung der einzeln eingesetzten Antikörperfärbungen. Daran wurden die positiven und negativen Bereiche im Box Plot festgelegt. Im Folgenden ist in Abbildung 6 exemplarisch eine Doppelfärbung mit CD3 FITC und CD4 PE dargestellt. Abbildung 6: Gatingstrategie der durchgeführten FACS Färbungen Links ist die ungefärbte Kontrolle dargestellt, rechts exemplarisch die Färbung von CD3 + und CD4+ Zellen. Nach richtigem Positionieren des Kreuzes errechnet das Programm die Anteile der verschieden gefärbten Zellpopulationen am vorher bestimmten Lymphozytengate. Diese Werte wurden abschließend miteinander verglichen. 3.9 Aufarbeitung der Blutproben Die Blutprobengewinnung für diese Arbeit erfolgte mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vom lebenden und narkotisierten Tier. Das war zum einen die Herzpunktion nach Eröffnung des Thorax, einer Sektion vorangehend, und zum anderen die Punktion des retrobulbären Plexus mit einer Mikrohämatokritkapillare. Wenn die Tiere wiedererwachen sollten, wurde die Narkose mit Ether durchgeführt, vor der Tötung mit CO2. Das gewonnene Blut wurde entweder in 1,3 ml Sammelröhrchen mit EDTA oder in 1,5 ml Kunststoffreagiergefäßen aufgefangen. 34 3 Material und Methoden 3.9.1 EDTA-Vollblut Ein Teil der Blutproben wurde in mit EDTA versetzten Probengefäßen aufgefangen, um ein Koagulieren des Blutes zu verhindern. Dadurch war es über längere Zeit möglich, die einzelnen Blutzellpopulationen anhand ihrer Morphologie und Quantität zu beurteilen. Ein sogenanntes kleines Blutbild wurde mit Hilfe des „SCIL Vet abc TM“, einem Blutzellanalysegerät für die Veterinärmedizin, erstellt. Die Ergebnisse beinhalten Informationen über die Häufigkeiten der einzelnen Zellfraktionen im Vollblut (Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten), sowie Hämatokrit und Hämoglobingehalt. Zur besseren morphologischen Beurteilung der Blutzellen und zur Differenzierung der Leukozyten in Lymphozyten, Monozyten, neutrophile-, eosinophile- und basophile Granulozyten wurden Blutausstriche angefertigt, mittels Pappenheim Färbung gefärbt und später unter dem Lichtmikroskop beurteilt. Tabelle 8: Pappenheim Färbung 1. 2. 3. Chemikalie Dauer (Min) May-Grünwaldlösung 3:00 May-Grünwaldlösung : Aqua dest. (1:1) 1:00 Giemsa Gebrauchslösung (1:20) 20:00 3.9.2 Blutserum Nach dem Auffangen des Blutes in einem 1,5 ml Kunststoffreagiergefäß hatte es mindestens eine halbe Stunde Zeit, bei Raumtemperatur zu koagulieren. Danach fand die Trennung des Blutserums von den festen Bestandteilen durch Zentrifugation statt und das Serum konnte vorsichtig abpipettiert und in ein weiteres Gefäß überführt werden. Darin wurden die Proben bei -20 °C eingefroren. 3.9.2.1 Serumchemie Die chemische Analyse der Blutseren wurde vom Institut für klinische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Nach dem Auftauen wurden die 1 bis 7 Wochen bei -20 °C eingefrorenen Proben mit dem „AU5400“ [Olympus] auf folgende Parameter hin untersucht: Natrium, Kalium, Chlorid, Calzium, Phosphat, Magnesium, Kreatinin, Harnstoff, Creatinkinase, AST, ALT, Alkalische Phosphatase, GammaGT, 35 3 Material und Methoden Amylase, Lipase, Glucose, Gesamt Bilirubin, Gesamt Protein, Albumin, Cholesterin, HDLCholesterin, LDL-Cholesterin. 3.9.2.2 Multiplex Assay Serumproben von 85 Studientieren wurden 2-18 Monate lang bei -20 °C eingefroren und nach dem Auftauen mit Hilfe eines Magnetic Bead Assays analysiert. Dabei fiel die Betrachtung auf folgende Parameter: EPO, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, GRO/KC, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-18, TNF-α, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, MIP-3α, RANTES, VEGF. Es wurde das „Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 24-plex Assay“- Kit benutzt, welches alle nötigen Reagenzien beinhaltete. Die Durchführung des Assays verlief nach dem Protokoll des Herstellers [Bio-Rad; Instruction manual #10014905] und die Messung erfolgte im „Bio-Plex TM 200“ mit dem Computerprogramm „Bio-Plex ManagerTM 6.1“ [alles Bio-Rad Laboratories, Inc.]. Nachdem die vorbereiteten Beads auf der Platte verteilt wurden, konnten die Standards und verdünnten Proben dazu gegeben werden. Nach der Inkubation und Waschschritten wurden die Detection Antikörper auf die Proben gegeben. Nach anschließender erneuter Inkubation und erneutem Waschen wurden die Proben nach Zugabe von SA-PE analysiert. 3.9.2.3 ELISA Nach einer Einfrierzeit von 2-18 Monaten wurde die Konzentration von Immunglobulin E (IgE) und Immunglobulin G (IgG) im Blutserum mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) bestimmt. Die Proben wurden anhand der Gebrauchsanweisung des Herstellers [Rat IgE ELISA Quantitation Set und Rat IgG ELISA Quantitation Set; Bethyl Laboratories, Inc.] aufgearbeitet und die Absorption bei 450 nm im „Victor TM X3, 2030 Multilabel Reader“ mit der Software „WorkOut 2.5“ [beides Perkin Elmer] gemessen. Nach dem Coaten der Elisa Platte mit dem entsprechenden Antikörper folgte ein Blockschritt. Danach konnten die Standards und Proben auf die Platte gegeben werden. Im Anschluss fand die Zugabe des HRP detection Antikörpers und darauf die Reaktion mit dem TMB Substrat [BD, #555214] statt. Mit H2SO4 (0,18 M) wurde die Reaktion gestoppt. Zwischen den einzelnen oben angeführten Arbeitsschritten erfolgten Inkubationen und Waschschritte laut Protokoll. Im Anhang sind die Zusammensetzungen der benötigten Lösungen angegeben. 36 3 Material und Methoden 3.10 Statistische Auswertungen Die statistische Auswertung und die Erstellung der Graphen erfolgte mit dem Computerprogramm GraphPad Prism 5.0 und 6.0. In allen Abbildungen wurden für die zu untersuchenden Hypothesen die exakten P-Werte des gewählten Signifikanztests angegeben. Hierbei wird ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von α ≤ 0,05 von einem signifikanten Befund gesprochen. P-Werte größer als 0,05 wurden somit als nicht signifikant aufgefasst und auch nicht in die Graphen eingefügt. Alle signifikanten Unterschiede wurden optisch in den Abbildungen dargestellt, Ausnahmen davon werden in der Unterschrift explizit erwähnt. Der Vergleich zweier Stichproben parametrischer Daten fand mit Hilfe eines einfachen t-Tests statt. Wiesen diese Proben signifikant unterschiedliche Varianzen auf, wurde ein t-Test mit Welch Korrektur durchgeführt. Wurden die parametrischen Daten von mehr als zwei Gruppen miteinander verglichen, erfolgte dies durch eine one-way analysis of variance (ANOVA) mit dem Tukey’s multiple comparison Test als anschließendem post-hoc Test. Die Auswertung nicht parametrischer Daten erfolgte für zwei zu vergleichende Stichproben mit Hilfe des Mann-Whitney Tests. Wurden mehr als zwei Gruppen nicht parametrischer Daten auf signifikante Unterschiede hin überprüft, kam der Kruskal-Wallis Test mit anschließendem Dunn’s multiple comparison Test zur Anwendung. Die Balkendiagramme in den Analysen stellen die Mittelwerte der Daten mit ihren Standardabweichungen dar. Eine Ausnahme bildet die Auswertung der histologischen Proben. Aufgrund der teilweise sehr großen Heterogenität der errechneten Scores erfolgte die graphische Darstellung mittels Box-Whisker-Plots (Min.-Max.). Somit konnte die große Streuung der Daten am besten dargestellt werden. Befanden sich nur wenige Ausreißer in den jeweiligen Gruppen, wurden die Daten als Scatter-Plots mit ihren Standardabweichungen aufgezeichnet, um die Verteilung noch deutlicher darstellen zu können. Erstere Begründung kommt auch bei der Darstellung der Blutwerte zum Tragen. 37 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Klinische Befunde Die LEW-Rag1 Ratten entwickeln im Laufe ihres Lebens ein umfangreiches Repertoire an pathologischen Symptomen. Dazu zählen sowohl makroskopische Krankheitsanzeichen, die der Betrachter von außen am Tier erkennen kann, als auch erst histologisch erkennbare Veränderungen der Organe. Eine detaillierte Auflistung aller auftretenden pathomorphologischen Veränderungen liefert Tabelle 9. 4.1.1 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome der LEW-Rag1 Ratte Die im Untersuchungszeitraum am häufigsten aufgetretenen Veränderungen der immundefizienten Tiere sind Alopezie und eine gerötete, im späteren Stadium auch schuppige Haut. In der keimfreien Haltung zeigten 83 % der erkrankten Tiere einen Verlust ihres Fells und zusätzlich gerötete Hautpartien. In der SPF4 waren es 48 % mit Alopezie und 70 % mit Hautrötungen und in der SPF3 77 % und 69 %. Hierbei waren vor allem der Kopf und die Gliedmaßen betroffen. Bei voranschreitender Krankheitsdauer wurden auch alle anderen Körperpartien in Mitleidenschaft gezogen. Helle Schuppen und teilweise braun-rötliche Krusten traten bei 43 % der erkrankten keimfreien Ratten auf, bei 41 % der erkrankten Tiere in der SPF4 und bei 48 % in der SPF3. Abbildung 7: Klinisches Bild der LEW-Rag1 Ratte Die Ratte in diesem Bild zeigt eine gerötete, schuppige Haut, mit starkem Fellverlust an Nase und Rücken. 38 4 Ergebnisse Ein weiterer in regelmäßigen Abständen auftretender Befund waren nasse oder verklebte Fellareale im Bereich des vorderen Gesichts, am Unterkiefer, im Brustbereich und an den Vorderpfoten. Eine Adspektion des Maul- und Rachenbereiches betroffener Tiere lieferte keine pathologischen Befunde. In Abbildung 8 ist die Verteilung kranker und gesunder LEW-Rag1 Tiere mit zunehmendem Alter in den drei verschiedenen Haltungen dargestellt. Insgesamt erkrankten in der keimfreien Haltung 74 % aller Ratten im Laufe ihres Lebens. In der SPF4 erkrankten 79 % der Gesamtpopulation und in der SPF3 waren es 99 %. Vergleichend zwischen männlichen und weiblichen Tieren zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Erkrankungshäufigkeit. Abbildung 8: Prävalenz der Erkrankungen der LEW-Rag1 Tiere An der schwarzen Linie ist jeweils die Abnahme des Anteils der gesunden Tiere mit zunehmendem Alter an der Population zu erkennen. Die graue Linie zeigt die Zunahme der kranken Tiere als gegenteiligen Effekt. (n=43-131) Erste Symptome zeigten sich bei den betroffenen Ratten meistens mit einem Alter von 7 bis 14 Lebenswochen. Im Durchschnitt lag das Maximum der Neuerkrankungen bei den Tieren aus der SPF3 zeitlich vor den anderen beiden Haltungseinrichtungen. Hier erkrankten 62,9 % der Tiere zwischen der 7. und 9. Lebenswoche. Bei den keimfreien Tieren erkrankten im Gegensatz dazu nur 25,6 % in diesem Zeitraum. Der Großteil erkrankte später, in der 10.-12. Lebenswoche (34,8 %). Die Ratten der SPF4 zeigten mit 30,3 % (7.-9. LW) und 28,9 % (1012 LW) ein ähnliches Bild. Die Kurvenverläufe der beiden letztgenannten Haltungen gestalten sich in diesem Fall etwas flacher als der Verlauf der Neuerkrankungen der Gruppe SPF3. Die Verteilungen der Neuerkrankungen pro Lebenswoche sind für alle drei Gruppen in Abbildung 9 dargestellt. 39 4 Ergebnisse Abbildung 9: Inzidenz der klinischen Symptome bei den LEWRag1 Ratten Dargestellt sind die Häufigkeiten der Neuerkrankungen pro Lebenswoche in Prozent. Hierbei zeigt sich, dass der Großteil der Tiere in der SPF3 deutlich früher erkrankt als in den anderen beiden Haltungen. (n=43-131) 40 Verdickte Alveolen Peribronchioläre Infiltrationen von Lymphozyten und Granulozyten Einblutungen Lappenspitzen dunkel verfärbt Dunkel verfärbte Bereiche über gesamtes Organ Atelektatisches Gewebe Helle Stippen über gesamtes Organ verteilt - - Vergrößert / verkleinert Dilatiert / sehr klein und fest Schlecht gefüllt, schaumiger Inhalt, derbe Wand Vergrößert / verkleinert Sehr klein, schlecht abgegrenzt Haut Lunge Herz Leber Milz Magen Darm Lymphknoten Thymus 41 Hyperkeratose Infiltrationen von Mastzellen, Granulozyten und Lymphozyten Degenerierte Haarfollikel Rötung Lichtes Fell Schorf/ Krusten Schuppen Kompartimentierung fehlt Zellarm Infiltrationen von Mastzellen und Granulozyten Infiltration der Zotten, Krypten und Muskelschichten mit Lymphozyten und Granulozyten Infiltrationen der Mukosa, Submukosa und Muskelschicht mit Lymphozyten und Granulozyten Keine Unterscheidung von Roter und Weißer Pulpa möglich Mononukleäre Zellinfiltrate um die Gallengänge herum Mononukleäre Zellinfiltrationen des Myokards Bindegewebig durchsetzt/ fibrotisch Infiltate von Lymphozyten, Granulozyten und Mastzellen Speicheldrüsen Histologisch Lymphknoten dunkel/ blutgefüllt Nasses/ verklebtes Fell an Kinn, Hals, Brust, Vorderbeinen Makroskopisch Tabelle 9: Zusammenfassung aller beobachteten Symptome 4 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1.1.1 Wachstum Zusätzlich zur Dokumentation des Krankheitsverlaufes fand eine Dokumentation der Gewichtsentwicklung gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten statt, um eine Aussage über eventuelle Störungen in der Entwicklung und im Wachstum treffen zu können. Die Gewichtsverläufe gesunder und kranker Tiere sind für Böcke und Weibchen getrennt in Abbildung 10 dargestellt. Bei der Betrachtung der männlichen Tiere zeigt sich ein deutlich niedrigeres Niveau der Verlaufskurve der kranken Tiere. Sowohl die gesunden LEW-Rag1 Männchen als auch die gesunden und kranken LEW-Rag1 Weibchen nähern sich der Gewichtskurve der LEW Kontrolltiere an. Abbildung 10: Gewichtsverläufe Dargestellt sind die durchschnittlichen Körpergewichte von LEW und LEW-Rag1 Ratten in unterschiedlichen Altersgruppen. (n=3-20) 4.1.1.2 Reproduktionsparameter Durch den Vergleich verschiedener Parameter wie Wurfgröße, Anzahl abgesetzter Jungtiere, Zwischenwurfzeiten und der Wurfanzahl pro Weibchen können Rückschlüsse im Hinblick auf die Fruchtbarkeit und Zuchtleistung eines Stammes gezogen werden. Alle im Folgenden dargestellten Ergebnisse beziehen sich auf Dauerverpaarungen eines Bockes mit einem Weibchen. Die Größe der Würfe lag sowohl bei den LEW Ratten als auch bei den LEW-Rag1 Tieren zwischen 3-11 Jungtieren pro Wurf. Zudem weisen die durchschnittlichen Jungtierzahlen dieser beiden Stämme keine signifikanten Unterschiede auf. Ähnlich verhält es sich auch mit den durchschnittlichen Zwischenwurfzeiten der Weibchen dieser beiden Stämme. Sie umfassen hauptsächlich einen Zeitraum von 25 bis 60 Tagen, wobei die durchschnittlichen Zwischenwurfzeiten der LEW Weibchen mit 51 Tagen tendenziell etwas 42 4 Ergebnisse höher sind, als die der LEW-Rag1 Ratten mit 43 Tagen. Betrachtet man all diese Parameter einzeln für sich, dann zeigen sich die größten Unterschiede in der Anzahl der Würfe, die ein Weibchen im Laufe ihres Lebens zur Welt bringt. Eine LEW-Rag1 Ratte bringt durchschnittlich 0,9-1,9 (Max. 3,4) Würfe zur Welt, eine LEW Ratte dagegen 2,7 (Max. 4,4). In der SPF3 erreicht zudem ein deutlich geringerer Anteil der Jungtiere das Absetzalter von ca. 21 Tagen als in den drei anderen Zuchtpopulationen. Die Daten aller erhobenen Reproduktionsparameter sind in Tabelle 21 im Anhang aufgelistet. Um all diese Parameter standardisiert darstellen und vergleichen zu können, wurde zusätzlich der „Colony Index“ (CI) für die Zeitspanne eines Kalenderjahres für jede Population berechnet (Absetzer pro Weibchen pro Woche). Das Ergebnis ist in Abbildung 11 dargestellt. Standardisiert betrachtet, zeigt sich hier, dass, alle LEW-Rag1 Populationen zusammengenommen, diese einen deutlich geringeren CI als LEW aufweisen. Betrachtet man jede Haltungseinheit für sich, fällt auf, dass die Tiere, welche in der SPF3 gehalten werden, die wenigsten Absetzer pro Weibchen in einer Woche produzieren, gefolgt von den keimfrei Gehaltenen im Isolator. Die Colony Indizes der LEW Ratten und der Ratten aus der SPF4 Haltung gleichen sich. Abbildung 11: Colony Index Das arithmetische Mittel der Colony Indizes der LEW-Rag1 Ratten liegt mit 0,17 deutlich unter dem CI der LEW Ratten mit 0,26. (n=12-32) 43 4 Ergebnisse 4.1.2 Makroskopisch erkennbare Krankheitssymptome an den Organen Es wurden gesunde und erkrankte LEW-Rag1 Tiere unterschiedlicher Altersgruppen seziert und ihre Organe hinsichtlich ihrer Morphologie (Größe, Farbe, Konsistenz) beurteilt. Vorrangig traten besonders häufig Veränderungen an den Organen des Immunsystems auf, aber auch häufig an der Lunge, seltener am Gastrointestinaltrakt und den Speicheldrüsen. Bei augenscheinlich gesunden LEW-Rag1 Tieren erschienen die peripheren Lymphknoten meist hell und deutlich kleiner als bei den Kontrolltieren. Die Mesenteriallymphknoten waren bräunlich und auch kleiner als die der Kontrolltiere. Besonders kleine Lymphknoten, mit Durchmessern von teilweise weniger als 1 mm, kamen bei den keimfreien Tieren vor. Erkrankte LEW-Rag1 Ratten aller Haltungseinheiten dagegen wiesen eher deutlich größere Lymphknoten als LEW auf. Ihre Farbe variierte zwischen hell, gelblich, bräunlich und rötlich. Teilweise waren sie von derber Konsistenz oder zeigten eine höckerige Struktur. Deutliche makroskopische Veränderungen, wie eine höckerige Oberfläche, Verfärbungen oder eine abnorme Größe wiesen 27 % der beurteilten Milzen von Tieren aus der SPF3 auf. Die Tiere aus den Isolatoren und der SPF4 zeigten solche Symptome nur in 5-6 % aller Fälle. Da in vielen Studien zum humanen Omenn Syndrom eine Hepatosplenomegalie bei den Patienten beschrieben wird, wurden die Gewichte der Lebern und Milzen von gesunden und kranken Tieren aufgenommen und in Relation zu ihrem Körpergewicht gesetzt. Im Vergleich mit den Werten von LEW konnte daraus gefolgert werden, dass die LEW-Rag1 Ratten im Gesamtdurchschnitt keine Splenomegalie sowie keine Hepatomegalie zeigen. 44 4 Ergebnisse Abbildung 12: Gewichte der Lebern und Milzen der LEW und LEW-Rag1 Ratten in Relation zu deren Körpergewicht Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Somit weisen die LEW-Rag1 Ratten keine Hepatosplenomegalie auf. (n=10-83) Durchtrennt man während der Sektion die Rippen und entfernt das Brustbein, hat man einen freien Blick auf die Brusthöhle, an deren oberer Begrenzung über dem Herzen der Thymus liegt. Dieses für die T-Zell Reifung essentielle Organ ist bei sehr jungen Tieren am größten ausgeprägt und verringert seine Größe im Laufe des Lebens. Bei LEW Ratten ist er noch bis in die Adoleszenz hinein klar erkennbar. Die LEW-Rag1 Ratten dagegen weisen an dieser Stelle schon in jungen Jahren nur einen sehr kleinen Gewebsanteil auf, welcher optisch nicht klar vom umliegenden Fettgewebe abgegrenzt werden kann. Bei Tieren, die vor der Sektion eine gerötete Haut aufwiesen, zeigten sich deutlich injizierte Unterhautgefäße und teilweise erschien die Haut leicht derb. Auch angrenzende Lymphknoten waren häufig mit in das Geschehen involviert. Ein anderes, relativ häufig von makroskopischen Veränderungen betroffenes Organ, war die Lunge. Hier zeigten sich bei rund 17 % aller sezierten LEW-Rag1 Tiere braun-rote, dunkle Veränderungen der Lungenlappen. Diese traten vor allem an den Lappenspitzen auf. 4.2 Histologische Befunde Zusätzlich zur adspektorischen Untersuchung und Beurteilung der Tiere wurden histologische Proben zahlreicher Organe genommen. Wie in der nachfolgenden Tabelle dargestellt ist, wurden hierfür verschiede Gruppen mit vergleichbarer Tierzahl zusammengestellt, um die 45 4 Ergebnisse Ergebnisse miteinander vergleichen zu können. Die Zahlen beschreiben die jeweilige Gruppengröße (n). Tabelle 10: Gruppenzusammensetzung für die histologischen Untersuchungen LEW-Rag1 LEW Alter < 60 Tage 60-120 Tage > 120 Tage 4 6 4 KF 7 6 5 gesund SPF3 5 3 5 SPF4 5 5 5 KF 4 5 7 krank SPF3 5 5 5 SPF4 5 6 6 4.2.1 Histologische Befunde an den Organen des Immunsystems Makroskopisch deutete sich bereits an, dass der Thymus der LEW-Rag1 Ratten nur in sehr geringer Größe vorhanden ist. Im histologischen Schnitt präsentierten sich vereinzelte Thymusanteile, eingebettet in Fett- und Bindegewebe. Mengenmäßig dominierte letzteres deutlich. Zusätzlich konnte nicht bei jedem Tier ein Teil des Thymus heraus präpariert werden, beziehungsweise wurde nicht bei jedem Tier ein Teil des Thymus angeschnitten. In den beurteilbaren Präparaten zeigte sich durchweg das gleiche, in Abbildung 14 dargestellte Bild: Anteile rudimentären Thymusgewebes, dem der physiologische Organaufbau in großen Teilen fehlt. Während die lobuläre Struktur dieses Organs noch deutlich zu erkennen ist, fehlt die Läppchengliederung in Cortex und Medulla vollständig. Der gesamte Thymus erscheint einheitlich und beherbergt größtenteils mononukleäre Zellen, welche einen deutlich helleren, größeren und aufgelockerten Zellkern aufweisen als vergleichbare Lymphozyten in den Thymi der LEW Kontrolltiere. Zusätzlich lassen sich in einigen Thymusrudimenten der LEW-Rag1 Ratten vermehrt Mastzellen finden. Auch die Milzen der Rag1 defizienten Tiere bieten auf den ersten Blick ein sehr homogenes Bild (Abb. 14). Es hat den Anschein, als seien weiße und rote Pulpa nicht klar voneinander abgegrenzt, sondern vermischt. Milzfollikel mit ihrem klassischen Aufbau aus Marginalzone, Marginalsinus und periarteriolärer lymphatischer Scheide (PALS) rund um die Trabekelarterien und -arteriolen sind nicht zu erkennen. Eine weitere Beobachtung stellt die häufige diffuse Infiltration des Organs mit polymorphkernigen Zellen (Granulozyten) dar. 46 4 Ergebnisse Dieser Befund erstreckt sich von geringgradig bis äußerst hochgradig und kann bei keinem einzigen Kontrolltier nachgewiesen werden. Unterschiede zwischen kranken und gesunden LEW-Rag1 Tieren zeigen sich in dieser Hinsicht nicht, jedoch unterscheiden sich die einzelnen Haltungseinrichtungen in der Ausprägung dieses Symptoms voneinander. Während 53 % der keimfreien Tiere in dieser Hinsicht unauffällige Milzen aufweisen, sind es bei den Tieren aus der SPF4 nur 30 %. Tiere der SPF3 zeigten nur zu 10 % nicht infiltrierte Milzen, der restliche Anteil war mindestens geringgradig betroffen (Abb. 13). Abbildung 13: Entzündungszellinfiltrationen der Milzen von LEW und LEW-Rag1 Ratten LEW Ratten waren von diesem Befund ausnahmslos nicht betroffen. Kruskal-Wallis-Test: P=0,0109 (n=14-95) Exemplarisch für die peripheren Lymphknoten des Körpers wurden in dieser Studie die Lnn. mandibulares histologisch beurteilt. Zudem fand eine Beurteilung der Mesenteriallymphknoten statt. Während sich die Lymphknoten dieser beiden Lokalisationen, wie in Kapitel 4.1.2 beschrieben, makroskopisch zum Teil deutlich unterscheiden, zeigen sie unter dem Mikroskop doch ein eher einheitliches Bild. Ähnlich den anderen lymphatischen Organen fehlt auch den Lymphknoten der LEW-Rag1 Tiere ihre organtypische Struktur (Abb. 14). 47 4 Ergebnisse A B C D E F G H 48 4 Ergebnisse I J K L M N Abbildung 14: Pathohistologische Veränderungen der Organe des Immunsystems A, B: Thymus LEW. Cortex und Medulla sind deutlich voneinander abgrenzbar; C, D: Thymus LEW-Rag1. Die organtypische Kompartimentierung fehlt und die Zellkerne der Thymozyten erscheinen deutlich größer und weniger chromatindicht; E, F: Milz LEW; G, H: Milz LEW-Rag1. Es ist keine Unterscheidung von roter und weißer Milzpulpa möglich und es sind keine PALS sichtbar. Die Milz ist mit Entzündungszellen infiltriert; I, J: Mesenteriallymphknoten LEW; K-N: Mesenteriallymphknoten LEW-Rag1. Diese sind deutlich zellärmer und zeigen Infiltrationen mit Mastzellen (N) und Granulozyten (M) und Hämosiderineinlagerungen (K, L). 49 4 Ergebnisse Erkennbar sind eine Kapsel mit ins Parenchym ziehenden Trabekeln und teilweise Strukturen eines Marksinus. Übergänge von Cortex, Paracortex und Medulla sind kaum (nicht) erkennbar und auch Sekundärfollikel fehlen. Bei einzelnen Tieren treten zusätzlich nekrotische Areale auf. Insgesamt erscheinen die Lymphknoten eher zellarm, mit wenigen Lymphozyten und vielen leeren, vakuoligen Bereichen. Teilweise fallen Infiltrationen von Mastzellen und Hämosiderineinlagerungen auf, häufig sind die Lymphknoten mit Entzündungszellen (Granulozyten) infiltriert. Wie in Kapitel 4.1.2 beschrieben, wurden eine deutliche Organvergrößerung, eine Mastozytose, Nekrose, verstärkte Hämosiderineinlagerungen und die Infiltration mit Entzündungszellen in einem Score berücksichtigt. Das Ergebnis ist in Abbildung 15 dargestellt. Dort sieht man, dass sich die Mesenteriallymphknoten von LEW-Rag1 sehr deutlich von LEW Ratten unterscheiden. Die wenigen erhöhten Werte der Kontrolltiere sind hierbei auf einzelne geringgradig vergrößerte Lymphknoten zurückzuführen oder auf eine geringgradige Infiltration mit Mastzellen. Betrachtet man die einzelnen Haltungseinrichtungen untereinander, zeigen sich keine signifikanten Unterschiede. Auch die Lymphknoten der als erkrankt eingestuften LEW-Rag1 Ratten weisen im Hinblick auf die Schwere der Veränderungen keine signifikanten Unterschiede zu ihren gesunden Gegenspielern auf. Eine Ausnahme bilden hier die keimfreien Tiere. Bei ihnen weisen die Lymphknoten der gesunden Tiere signifikant schwächere Veränderungen auf als die Lymphknoten der Erkrankten (P=0,04). Abbildung 15: Histologischer Vergleich der Lymphknotenmorphologie von LEW und LEW-Rag1 Ratten (n=14-92) 50 4 Ergebnisse 4.2.2 Histologische Befunde am Gastrointestinaltrakt Alle vier Abschnitte des Magen-Darm-Traktes (Magen, Dünndarm, Zäkum, Dickdarm) der LEW-Rag1 Ratten zeigen Infiltrationen mit Entzündungszellen, teilweise in unterschiedlich starker Ausprägung (Abb. 16 und Abb. 17). Es kommen sowohl mononukleäre Zellen als auch polymorphkernige Zellen vor, deren Infiltrationen sich von der Tunica mucosa ausgehend bis in die Tunica muscularis der Organwand erstrecken können. In sehr schweren Einzelfällen wurde ein Darmwanddurchbruch mit Peritonitis festgestellt. Nach dem Scoring aller vier Abschnitte des Magen-Darm-Traktes sieht man deutliche Unterschiede zwischen den LEW und LEW-Rag1 Ratten. Magen und Darm der LEW-Rag1 Tiere sind signifikant stärker mit Entzündungszellen infiltriert, als die Kontrollgruppe. Am deutlichsten ist dieser Unterschied an den Mägen zu beobachten. Abbildung 16: Vergleich der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt von LEW und LEW-Rag1 Ratten (LEW n=13-14; LEW-Rag1 n=103-108) 51 4 Ergebnisse A B C D E F Abbildung 17: Pathohistologische Befunde am Magen-Darm-Trakt der LEW-Rag1 Ratten A: Übergang von Mukosa zu Submukosa bei dem Magen einer LEW Ratte; B: Infiltrierte Schichten des Drüsenmagens einer LEW-Rag1 Ratte; C, D: Gesunder Dünndarm einer LEW Ratte. E, F: Stark mit Entzündungszellen infiltrierter Dünndarm einer LEW-Rag1 Ratte. 52 4 Ergebnisse Zusätzlich lässt sich zwischen den gesunden und kranken LEW-Rag1 Tieren die Tendenz erkennen, dass die Verdauungsorgane der gesunden Tiere weniger stark infiltriert sind als die der erkrankten. Diese Aussage stellt sich aber nur in Einzelfällen signifikant dar. Ein weiterer Unterschied zeigt sich in den Daten der verschiedenen Haltungseinheiten. In allen drei Haltungseinrichtungen der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden sich die Mediane der gescorten Veränderungen signifikant. In den Mägen und Dünndärmen ist dies am stärksten der Fall. Zusätzlich ist konstant die SPF3 Haltung am stärksten betroffen (Abb. 18). Abbildung 18: Haltungsabhängigkeit der Entzündungszellinfiltrationen im Gastrointestinaltrakt der LEW-Rag1 Ratten Die Organe der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 sind am stärksten verändert. Kruskal-Wallis Test: Magen: P<0,0001; Dünndarm: P<0,0001; Zäkum: ns; Dickdarm: P=0,0069. (n=27-35) 53 4 Ergebnisse 4.2.3 Histologische Befunde an der Leber In Abbildung 19 ist zu sehen, dass Infiltrationen um die Gallengänge herum, vor allem mit mononukleären Zellen, die einzigen Veränderungen der Lebern der LEW-Rag1 Ratten bilden. Dazu gesellen sich in schwereren Verläufen auch Granulozyten und die Infiltrationen dehnen sich zudem in perivaskuläre Bereiche aus. Es sind 71 % der LEW-Rag1 Lebern von diesem Symptom betroffen, wiederum 30 % davon zeigen mittelgradige bis hochgradige Veränderungen dieses Typs. Im Gegensatz dazu weisen lediglich 20 % der Lebern der LEW Tiere geringgradige periductuläre Infiltrationen mononukleärer Zellen auf. 4.2.4 Histologische Befunde am Herzen Einige wenige Herzen der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden sich im histologischen Bild deutlich von denen der LEW Ratten. Hier fallen die typischen Zellinfiltrationen mit zwei unterschiedlichen Zelltypen (mononukleär, polymorphkernig) im Kammermyokard sowie im Myokard der Vorhöfe auf (Abb. 19). Von den LEW-Rag1 Tieren zeigen 11 % solche Veränderungen, viele davon mindestens mittelgradig. Dagegen war lediglich bei einem Kontrolltier solch eine Veränderung in milder Ausprägung zu beobachten. Der Gesundheitszustand der Tiere, die nur diese Veränderungen aufwiesen, war unauffällig. 4.2.5 Histologische Befunde an der Haut Die Haut der LEW-Rag1 Tiere erscheint nicht nur makroskopisch deutlich verändert sondern, wie in Abbildung 21 zu sehen ist, auch histologisch. Im H&E-Schnitt sind Zellinfiltrationen der Epidermis, des Coriums und der darunter liegenden Subkutis zu finden sowie Hyperkeratosen und Erosionen, die sich in seltenen Fällen bis zu einer Ulzeration ausbreiten können. Hauptsächlich sind hier mononukleäre Zellen und Mastzellen erkennbar, seltener Granulozyten. Wie in Abbildung 20 zu erkennen ist, hat der Gesundheitszustand der LEWRag1 Tiere einen großen Einfluss auf die Stärke der Symptome. Als gesund eingestufte Tiere sind zum einen sehr viel seltener betroffen, zum anderen fallen ihre Veränderungen deutlich milder aus. Unter den Bauchhautproben der gesunden LEW-Rag1 Ratten weisen 17 % der Proben mehr als geringgradige Infiltrationen auf, wohingegen 68 % der kranken Tiere 54 4 Ergebnisse mindestens mittelgradig betroffen sind. Die Haltungseinheit hat sowohl bei erkrankten als auch bei gesunden Tieren keinen Einfluss auf die Symptomstärke (Abb. 20). A B C D E F Abbildung 19: Pathohistologische Veränderungen der Leber und des Herzens der LEW-Rag1 Ratten A, B: Physiologische Leber einer LEW Ratte; C, D: Entzündungszellinfiltrationen im Bereich der Gallengänge (LEW-Rag1); E: Unverändertes Herz (LEW); F: Infiltration des Kammermyokards mit Lymphozyten bei einer LEW-Rag1 Ratte. 55 4 Ergebnisse Abbildung 20: Einfluss des Gesundheitszustands und der Haltungseinheit auf den histologischen Score der Haut bei LEW-Rag1 Ratten im Vergleich zu LEW Kontrolltieren Nur 17 % der gesunden LEW-Rag1 Ratten weisen mittelgradig bis hochgradig veränderte Hautproben auf. Bei den erkrankten Ratten sind es dagegen 68 % mit mittelgradigen bis hochgradigen Veränderungen. Die Unterschiede zwischen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Tieren sind für jede Haltungseinheit signifikant. (n=14-17) 56 4 Ergebnisse A B C D E F Abbildung 21: Pathohistologische Veränderungen der Speicheldrüsen und der Haut A: Gesunde Glandula parotis und regionaler Lymphknoten einer LEW Ratte. B: Fibrotisch umgebaute, hochgradig mit Mastzellen infiltrierte Speicheldrüse einer LEW-Rag1 Ratte. C: Glandula parotis einer LEWRag1 Ratte mit mittelgradigen Lymphozyten- und Mastzellinfiltrationen im Bindegewebe. D: Gesunder Bauchhautabschnitt einer LEW Ratte. E, F: Hochgradig mit Entzündungszellen infiltrierte Haut einer LEWRag1 Ratte. Zusätzlich sind eine verdickte Epidermis und eine geringgradige Hyperkeratose zu sehen. 57 4 Ergebnisse 4.2.6 Histologische Befunde an den Speicheldrüsen Die Speicheldrüsen vieler LEW-Rag1 Ratten zeigen Veränderungen, welche bei LEW nicht, bzw. nur in wenigen Fällen schwach zu sehen sind. Die Veränderungen sind bedingt durch lokale bis diffuse Infiltrationen des Bindegewebes und des Drüsengewebes mit Mastzellen, Granulozyten und mononukleären Zellen, welche teilweise sogar einen fibrotischen Umbau des Gewebes nach sich ziehen. Zugleich sind auch die Unterkieferlymphknoten in direkter Organnachbarschaft verändert (Abb. 21). Ihr Bild gleicht dem in Kapitel 4.2.1 beschriebenen Symptomkomplex der Mesenteriallymphknoten. Häufig sind, besonders in schwereren Fällen, alle drei Speicheldrüsenanteile betroffen. Ist jedoch nur ein Anteil betroffen, handelt es sich immer um die Glandula parotis oder die Glandula sublingualis. In den Bewertungsscore flossen sowohl die Zellinfiltrationen und der fibrotische Umbau des Drüsengewebes als auch die Veränderungen der Lymphknoten mit ein. Bei einem maximal erreichbaren Score von 9 erreichen die LEW Tiere (n=14) durchschnittlich einen Wert von 0,3, wobei ein Tier mit einer 2 bewertet wurde und zwei Tiere mit einer 1. LEW-Rag1 Tiere dagegen erreichten einen Durchschnittswert von 3,0 mit Höchstwerten bis zu 9. Hier zeigt sich ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Stämmen (P<0,0001). Die Werte gesunder und erkrankter Tiere der einzelnen Haltungseinrichtungen unterscheiden sich nicht signifikant voneinander, jedoch ist ein Trend dahingehend erkennbar, dass als krank eingestufte Tiere leicht höhere Werte aufweisen als klinisch unauffällige Tiere. Zudem weisen die Speicheldrüsen der erkrankten LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 signifikant höhere Scores auf als die der anderen beiden Haltungen (Abb. 22). 58 4 Ergebnisse Abbildung 22: Histologische Unterschiede der Speicheldrüsen von LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen Erkrankte Ratten aus der SPF3 Haltung erreichen signifikant höhere Scorewerte als Ratten der anderen beiden Haltungen. Kruskal-Wallis Test: P=0,0016 (n=12-19) 4.2.7 Histologische Befunde an der Lunge Zu einem der am deutlichsten sowohl makroskopisch als auch histologisch veränderten Organe zählt die Lunge der LEW-Rag1 Ratte. Zusätzlich zu den in vielen Organen präsenten Entzündungszellinfiltrationen kommen hier verdickte Alveolarwände bis hin zu atelektatischem Gewebe, vermehrte Mukusansammlungen und eine erhöhte Anzahl an Herzfehlerzellen vor. Der vermehrt vorzufindende Mukus, beruhend auf einer Hyperplasie der Clarazellen, in Alveolen und Bronchioli wurde zusätzlich zum H&E Schnitt auch mittels PAS-Färbung nachgewiesen. Die Zellinfiltrationen bestehen aus mononukleären Zellen und Granulozyten und befinden sich vorrangig multifokal im peribronchialen Gewebe, wo sie bei ausreichender Anzahl auch zum Untergang der alveolären Struktur des Lungengewebes führen (Abb. 24). Über ein geringgradiges Infiltrationsstadium hinausgehend sind auch perivaskuläre Infiltrationen anzutreffen, die sich in das restliche Lungengewebe ausbreiten und dort zu einer Verdickung der Alveolarwände führen. In diesem Stadium sind zudem auch mehrkernige Riesenzellen im Parenchym vorhanden. Innerhalb der Alveolen sind bei betroffenen Lungen zusätzlich vermehrt Alveolarmakrophagen zu beobachten. Während sich die Scores der LEW Ratten signifikant von denen der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden (Abb. 23), zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den LEW-Rag1 Ratten in den 59 4 Ergebnisse verschiedenen Haltungen. Tendenziell sind aber die keimfrei gehaltenen LEW-Rag1 Ratten weniger stark betroffen als die Tiere der SPF3 und der SPF4 Haltung. Dagegen ergeben sich zwischen den gesunden und erkrankten Tieren aller drei Haltungen deutliche Unterschiede, wie in Abbildung 23 zu sehen ist. Die Lungen der klinisch kranken Tiere erreichen hier einen signifikant höheren Gesamtscore als die Gesunden. Abbildung 23: Vergleich der Lungen gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungseinheiten Kranke LEW-Rag1 Ratten sind signifikant stärker betroffen als gesunde. (n=13-18) 4.2.8 Histologische Befunde an den heterozygoten Merkmalsträgern Die Ergebnisse der histologischen Auswertung der Organe der heterozygoten Merkmalsträger (LEW-Rag1+/-) ergab keine Unterschiede zu den LEW Ratten (Abb. 25). Deshalb wurden sie in den vorangegangenen Kapiteln nicht explizit erwähnt, in der Endzusammenfassung sind sie jedoch der Vollständigkeit halber mit aufgeführt (Kap. 4.2.9). 60 4 Ergebnisse A B C D E F Abbildung 24: Histologische Präparate der Lungen von LEW und LEW-Rag1 Ratten A, B: Übersicht der Lunge mit Alveolen und einem Bronchus (LEW); C-F: Ausschnitte der Lungen verschiedener LEW-Rag1 Ratten. Zu sehen sind peribronchioläre Infiltrationen mit Lymphozyten (D), Granulozyten (E), eine mehrkernige Riesenzelle (E) und ein vermehrtes Vorkommen von Alveolarmakrophagen (F). 61 4 Ergebnisse 4.2.9 Gesamtergebnis der histologischen Auswertung Zusammenfassend stellt sich dar, dass alle in den vorherigen Kapiteln aufgelisteten Organe der LEW-Rag1 Ratten Veränderungen zu Tieren des LEW Stammes aufweisen. Es gibt sowohl histologische Unterschiede zwischen gesunden und als krank eingestuften LEW-Rag1 Ratten als auch zwischen LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinrichtungen. Diese sind aber von Organ zu Organ unterschiedlich. Eine Altersabhängigkeit der Stärke der Symptome wurde auch untersucht, führte allerdings zu keinem aussagekräftigen Ergebnis. Zum Abschluss wurden alle beurteilten und gescorten histologisch sichtbaren pathologischen Veränderungen addiert und ihre Summen zu einem Endergebnis, welches in Abbildung 25 und 26 dargestellt ist, zusammengefasst. Sowohl die Gesamtscores der gesunden LEW-Rag1 Ratten als auch die der kranken Ratten weisen signifikant höhere Werte als die LEW Tiere auf. Zudem unterscheiden sich die Werte der gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten untereinander deutlich. Auch beim Vergleich der Haltungen in Bezug auf den Gesundheitsstatus der LEW-Rag1 Tiere sind Unterschiede festzustellen. Sowohl in der Gruppe der Gesunden als auch in der Gruppe der Kranken unterscheiden sich die Gesamtscores der Tiere in der SPF4 nicht signifikant von denen der keimfreien Tiere. Im Gegensatz dazu gibt es zum einen signifikante Unterschiede zwischen den gesunden Tieren in der keimfreien Haltung und der SPF3 und den gesunden Tieren der SPF4 und der SPF3 und zum anderen signifikante Unterschiede zwischen den erkrankten Tieren dieser Haltungseinrichtungen. Die Organe der LEW-Rag1 Ratten in der SPF3 weisen zusammengefasst deutlich stärkere pathologische Veränderungen auf, als die in den beiden anderen Hygieneeinheiten gehaltenen Tiere (Abb. 26). 62 4 Ergebnisse Abbildung 25: Vergleich der histologischen Scores gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten mit LEW und LEWRag1 +/- Ratten Kruskal-Wallis Test: P<0,0001 (LEW/LEW-Rag1+/-: n=8-14; LEW-Rag1: n=47-49) Abbildung 26: Vergleich der histologischen Scores erkrankter und gesunder LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungseinheiten Die LEW-Rag1 Tiere der SPF3 sind sowohl unter den gesunden Tieren als auch unter den kranken Tieren am stärksten betroffen. Kruskal-Wallis Test: LEW-Rag1 gesund: P=0,0054; LEW-Rag1 krank: P=0,0006. (n=13-19) 63 4 Ergebnisse Um die Validität der Gruppeneinteilung in „gesund“ und „krank“ zu überprüfen, wurden auch die adspektorisch erkennbaren klinischen Symptome mittels eines Scores beurteilt, um darauffolgend eine Korrelationsanalyse der histologischen Werte mit den adspektorischen Werten durchzuführen. Abbildung 27 zeigt die subjektiv festgestellte Krankheitsstärke der einzelnen Tiere, wobei sich nur die als krank eingestuften LEW-Rag1 Ratten signifikant von den anderen Gruppen unterscheiden. Die Rang-Korrelationsanalyse nach Spearman ergibt einen Korrelationskoeffizienten mit einer deutlichen Effektstärke von 0,579. Das bedeutet, die erhobenen Daten korrelieren positiv miteinander, allerdings, wie bei subjektiver adspektorischer Beurteilung nicht anders zu erwarten, nicht perfekt. Abbildung 27: Subjektive Krankheitsstärke Kruskal-Wallis Test: P<0,0001 (LEW/LEW-Rag1+/-: n=8-14; LEW-Rag1: n=47-49) 4.3 Blut- und Serumanalysen 4.3.1 Kleines und Großes Blutbild Die Analyse der Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten im Rahmen eines kleinen und großen Blutbildes ergab folgende Ergebnisse: Die Leukozytenanzahl der LEW-Rag1 Ratten unterscheidet sich in allen drei Haltungseinheiten von der Leukozytenanzahl der LEW Tiere. 64 4 Ergebnisse In der Summe gleichvieler untersuchter gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Tiere liegt die Zahl der weißen Blutkörperchen der keimfreien Tiere und der Tiere aus der SPF4 deutlich unter den Werten der LEW Ratten, bei den LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 verhält es sich dagegen nicht so. Die Anzahl der weißen Blutkörperchen dieser Ratten ist leicht erhöht. Betrachtet man in Abbildung 28 die gesunde und kranke Gruppe der LEW-Rag1 Ratten einzeln und vergleicht sie mit den Werten der Kontrolltiere, kann man weitere Unterschiede feststellen. Die Leukozytenzahlen der gesunden Tiere sind deutlich niedriger als die der kranken. In der SPF4 und der keimfreien Haltung unterscheiden sich zudem die Werte der gesunden LEW-Rag1 Ratten signifikant von den Werten der LEW Tiere, wohingegen bei LEW-Rag1 Tieren der SPF3 die Anzahl der weißen Blutkörperchen der erkrankten Tiere signifikant höher liegt als die Werte der LEW Ratten vorgeben. Vergleicht man schließlich die gesunden und kranken immundefizienten Tiere im Hinblick auf die unterschiedlichen Haltungseinheiten miteinander, so kommt man zu dem Schluss, dass die Werte der gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 signifikant höher liegen als die der anderen beiden Einheiten (Abb. 28A). 65 4 Ergebnisse Abbildung 28: Vergleich der Anzahl der Leukozyten im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten Die Leukozytenanzahl im Blut unterscheidet sich deutlich zwischen LEW und LEW-Rag1 Tieren und zwischen LEW-Rag1 Tieren verschiedener Haltungen. Gesunde LEW-Rag1 Ratten besitzen eine signifikant geringere Anzahl an Leukozyten im Blut als erkrankte. ANOVA: A: P<0,0001, P<0,0001; B: P=0,0001, P=0,0004, P=0,0030. (n=15-29) Andere erhobene Parameter an den Blutproben der LEW-Rag1 Ratten, wie die Anzahl der Erythrozyten, der Hämatokrit und die Anzahl der Thrombozyten, zeigten weder im Hinblick auf die Haltung oder den Gesundheitszustand noch im Vergleich zu den LEW Kontrolltieren Unterschiede. Die Betrachtung der Differenzialblutbilder der einzelnen Tiere zeigt weitere Unterschiede der beiden Stämme auf. LEW-Rag1 Ratten besitzen anteilig unter den weißen Blutzellen deutlich weniger Lymphozyten und deutlich mehr neutrophile und eosinophile Granulozyten als LEW Ratten (Abb. 29). Zudem weisen ihre Werte eine deutlich größere Streuung auf. Das Vorkommen weiterer weißer Blutkörperchen, wie basophile Granulozyten und Monozyten, ist im Vergleich zu den Kontrolltieren nicht verändert. Vergleicht man die gesunde Gruppe der LEW-Rag1 Ratten mit der Kranken, so zeigt sich, dass erkrankte Tiere einen signifikant geringeren Anteil an Lymphozyten im Blut aufweisen als gesunde. Bei den neutrophilen 66 4 Ergebnisse Granulozyten stellt sich dieses Phänomen genau anders herum dar. Diese Zellgruppe ist bei erkrankten Tieren vermehrt im Blut vorzufinden (Abb. 29). Der Anteil aller anderen Blutzellen variiert nicht. Abbildung 29: Zusammensetzung der Leukozyten bei LEW und bei gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten LEW-Rag1 Ratten besitzen signifikant mehr Granulozyten und weniger Lymphozyten im Blut als LEW Tiere. Bei erkrankten LEW-Rag1 Tieren ist dieser Unterschied am stärksten ausgeprägt. (n=14-71) In Bezug auf die verschiedenen Haltungsbedingungen lassen sich lediglich Tendenzen erkennen. Es zeigt sich, dass keimfreie LEW-Rag1 Tiere den höchsten Lymphozytenanteil im Blut aufweisen, gefolgt von den Tieren der SPF4. Das Schlusslicht mit dem geringsten Anteil an Lymphozyten an den weißen Blutkörperchen bilden die LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3. Die durchschnittlichen Verhältnisse von Granulozyten zu Lymphozyten sind in Abbildung 30 für die drei Haltungen im Vergleich zu LEW Tieren zusammenfassend dargestellt. Das Alter der Tiere hat keinen signifikanten Einfluss auf die Zellzusammensetzung des Blutes. 67 4 Ergebnisse Abbildung 30: Verhältnisse von Lymphozyten zu neutrophilen Granulozyten LEW-Rag1 Ratten aller drei Haltungseinheiten weisen ein verschobenes Verhältnis der Leukozyten im Blut auf. (n=18-30) 4.3.2 Chemische Parameter im Blut Die Analyse der Konzentrationen der in Kapitel 3.9.2.1 angegebenen Elektrolyte, Enzyme und Stoffwechselprodukte und deren Vergleich mit Werten der Kontrolltiere ergab keine abweichenden Befunde. 4.3.3 IgE und IgG im Serum Die mit Hilfe eines ELISA ermittelten Konzentrationen zweier Immunglobuline (IgE und IgG) im Blutserum der immundefizienten Ratten zeigten teilweise Unterschiede zu den Kontrollen, wie in Abbildung 31 zu sehen ist. Die nachgewiesenen Mengen an IgE unterscheiden sich hier nicht signifikant zwischen den LEW und LEW-Rag1 Ratten, wogegen die Mengen IgG dieser beiden Gruppen deutlich differieren. LEW-Rag1 Ratten besitzen also signifikant geringere Mengen des Immunglobulins G im Serum als die Kontrolltiere. Innerhalb der LEW-Rag1 Gruppe waren sowohl bei dem Anteil an IgG als auch IgE keine Abhängigkeiten von der Haltungseinheit oder dem Gesundheitszustand der Tiere ersichtlich. 68 4 Ergebnisse Abbildung 31: Vergleich der Immunglobulinkonzentrationen im Serum von LEW und LEW-Rag1 Ratten Die IgE Konzentrationen liegen physiologischerweise in einem 10 5-fach niedrigeren Bereich als die Konzentrationen des IgG. (n=3-22) 4.3.4 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren im Serum Die Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen im Blutserum der LEWRag1 Ratten unterscheiden sich signifikant von denen der Kontrolltiere (Abb. 32). Vergleicht man die Werte der LEW-Rag1 Ratten mit den Werten der LEW Tiere, dann sind die Serumkonzentrationen der LEW-Rag1 Ratten dieser Stoffe mindestens doppelt so hoch, häufig sogar 3-4 (-5) -fach erhöht (Ausnahme: EPO, RANTES, GM-CSF der keimfreien Tiere und MCP-1 der Tiere aus der SPF3). Die niedrigsten Werte weisen hierbei die keimfreien Tiere auf, gefolgt von den Tieren der SPF4 und die höchsten Werte weisen die in der SPF3 gehaltenen Ratten auf. Diese Unterschiede stellen jedoch nur Tendenzen dar. Eine mehr als 5fach erhöhte Konzentration zeigen die Werte für IL-6, G-CSF und IFN-γ der LEW-Rag1 Tiere. Ein Vergleich der als gesund eingestuften LEW-Rag1 Tiere mit den Erkrankten zeigt für letztere signifikant erhöhte Werte (Abb. 32), die einzige Ausnahme bilden hier GRO/KC und RANTES. Die vollständigen Daten dieser Analyse sind im Anhang in den Abbildungen 54 und 55 dargestellt. 69 4 Ergebnisse Abbildung 32: Ausgewählte Zytokine im Vergleich Dargestellt sind die Unterschiede in den Serumkonzentrationen von IL-6, G-CSF und INF-γ exemplarisch für die gesamte Analyse. LEW-Rag1 Ratten aller drei Haltungen unterscheiden sich hier signifikant von den LEW Ratten, während sich die verschiedenen Haltungen untereinander nicht signifikant unterscheiden. Erkrankte LEW-Rag1 Ratten weisen signifikant höhere Zytokinkonzentrationen im Blutserum auf als gesunde. (n=6-50) 4.4 In vitro Proliferation der T-Lymphozyten nach Antigenstimulation Mit Hilfe einer Gemischten Leukozytenkultur konnten Aussagen über das Verhalten der LEW-Rag1 Lymphozyten gegenüber verschiedenen Antigenen getätigt werden. Bestimmt wurde die Proliferationsfähigkeit der beeinträchtigten Lymphozyten nach Kontakt mit einem Isoantigen, zwei verschiedenen Alloantigenen und einem Xenoantigen. Die wichtigsten Ergebnisse sind in Abbildung 33 dargestellt. Nach Abzug des Wertes der Negativkontrolle kommt man zu dem Schluss, dass die als Isoantigen genutzten Milzzellen von LEW weder bei 70 4 Ergebnisse den Zellen der Kontrolltiere noch bei denen der LEW-Rag1 Tiere eine Immunantwort auslösen. Dagegen ist nach dem Zusammentreffen der Responderzellen mit Milzzellen der Stämme LEW.1F und LEW.1U (Alloantigen) eine Proliferation der Lymphozyten messbar. Diese ist jedoch bei den LEW-Rag1 Zellen signifikant geringer als die vergleichbare proliferative Antwort der LEW Zellen. Zwischen der Antwort auf LEW.1U und LEW.1F zeigen sich in der Abbildung leichte Unterschiede, diese sind jedoch nicht signifikant. Ein ähnliches Bild zeigt sich auch bei der proliferativen Antwort auf das gewählte Xenoantigen (L23). Auch hier proliferieren die LEW-Rag1 Lymphozyten deutlich schwächer als die Kontrollzellen der LEW. Zusätzlich lässt sich erkennen, dass die Immunantwort der LEWRag1 Zellen in ihrer Stärke zwischen den Allo- und Xenoantigenen nicht variiert, dies bei den Zellen der LEW Ratten allerdings der Fall ist. Die Reaktion auf ein zugegebenes Xenoantigen ist bei den LEW Zellen in etwa doppelt so stark, wie die auf ein Alloantigen. Vergleicht man die Zellen der als gesund eingestuften LEW-Rag1 Ratten mit den Kranken, so ergeben sich hier keine signifikanten Unterschiede. Ebenso verhält es sich bei dem Vergleich dreier unterschiedlicher Altersklassen miteinander. 71 4 Ergebnisse Abbildung 33: Proliferationsstärke in counts per minute (cpm) der Lymphozyten von LEW und LEWRag1 Ratten Proliferationszahlen nach Stimulierung der Lymphozyten mit einem Isoantigen (A), Alloantigenen (B+C) und einem Xenoantigen (D). Die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten proliferieren in allen Fällen signifikant schwächer. Zwischen erkrankten und gesunden Tieren zeigen sich keine Unterschiede. (n=3-11) Kruskal-Wallis Test (LEW, LEW.1F, LEW.1U): P=0,0042; P=0,0002; P<0,0001. ANOVA (L23): P<0,0001 4.4.1 Verhalten der Lymphozyten in Kultur Während der eigentlichen Versuche zur in vitro Proliferation als Antwort auf verschiede Antigene gab es Schwierigkeiten, die aus den Lymphknoten isolierten T-Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten über mehrere Tage in Kultur zu halten. Ein häufiges Problem war das frühe Sterben der präparierten LEW-Rag1 Zellen. Bei Betrachtung der Kulturen unter dem Mikroskop zeigten deren T-Zellen von Tag zu Tag ein inaktiveres, zunehmend verklumpendes Bild. Weder der Zusatz von Natrium Pyruvat zu dem Zellkulturmedium noch das Beschränken auf bestimmte Lymphknoten (mesenteriale oder periphere) und weniger 72 4 Ergebnisse Verunreinigung durch Fett sorgte für Besserung. Lediglich die mit der Zeit routiniertere Präparation und Aufarbeitung der Zellen führte zu kultivierbaren Lymphozyten der LEWRag1 Tiere. Die Präparation und Kultivierung der Lymphozyten aus den Lymphknoten der LEW Kontrolltiere wurde analog zu der Präparation der Lymphknoten der LEW-Rag1 Tiere durchgeführt und bereitete keine Schwierigkeiten. Die Ergebnisse vergleichender LebendTot-Färbungen mit Trypan-Blau, anschließend an die Präparation, sind in Abbildung 34 dargestellt. Aus den LEW Lymphknoten lassen sich 2,7 mal mehr lebende Lymphozyten isolieren als tote, dagegen ist nahezu die Hälfte der Lymphknotenzellen der LEW-Rag1 Ratten nach der Aufarbeitung nicht mehr lebensfähig. Abbildung 34: Ergebnisse der Trypan-Blau-Färbung der LEW und LEW-Rag1 Lymphknotenzellen Aus den Lymphknoten der LEW Ratten konnten deutlich mehr lebende Zellen isoliert werden als aus den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten. (n=5-10) 4.4.2 Absolute Zellzahlen in den Lymphknoten und der Milz Dass sich die absoluten Zellzahlen der lymphatischen Organe von LEW und LEW-Rag1 Ratten unterscheiden, wurde zusätzlich in einer weiteren Messung nachgewiesen (Kap. 3.4). Hierbei zeigt sich, dass Milzen und Lymphknoten des Stammes LEW-Rag1 meistens eine deutlich geringere Anzahl isolierbarer Leukozyten (39-65 %) beinhalten als Tiere des LEW Stammes. Dargestellt ist dieses Ergebnis in Abbildung 35. Während die Kontrollmilzen 97104 Mio. Leukozyten pro Organ aufweisen, sind es bei den LEW-Rag1 Milzen nur 27-79 Mio. In den peripheren Lymphknoten (hier am Beispiel des linken Ln. subiliacus und eines medialen Ln. mandibularis) der LEW-Rag1 Ratten zeigt sich nur teilweise das gleiche Bild. 73 4 Ergebnisse Ein isolierter Unterkieferlymphknoten beherbergt 0,5-7 Mio. Zellen und ein Kniefaltenlymphknoten beherbergt 1-22 Mio. isolierbare Zellen. Die angegebenen Minimalwerte werden nur von gesunden LEW-Rag1 Ratten erreicht und die angegebenen Maximalwerte werden nur von erkrankten LEW-Rag1 Ratten erreicht. Bei LEW belaufen sich die Werte auf 5,5-15 Mio. bzw. 0,5-6,5 Mio. Abbildung 35: Gesamtleukozytenzahlen der Milzen und Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten A: Die lymphatischen Organe der LEW Ratten beherbergen eine signifikant größere Anzahl an Leukozyten als die lymphatischen Organe der LEW-Rag1 Ratten. B: Die Lymphknoten erkrankter LEW-Rag1 Ratten beinhalten mehr Lekuzyten als die gesunder. (n=4-10) Beim Vergleich gesunder und kranker LEW-Rag1 Tiere zeigt sich kein Unterschied zwischen den Zellzahlen ihrer Milzen. Die peripheren Lymphknoten jedoch enthalten bei erkrankten Ratten tendenziell mehr Zellen als bei Gesunden. Dieser Unterschied erweist sich bei den Werten der Lnn. mandibulares als signifikant, bei den Lnn. subiliaci fehlt dagegen eine eindeutige Signifikanz, aber eine deutliche Tendenz ist auch hier zu erkennen (Abb. 35). 74 4 Ergebnisse 4.5 Zusammensetzung der Lymphozytenpopulation Da das RAG1 Protein essentiell für die korrekte Entwicklung der Lymphozyten ist, wurden die einzelnen Zellpopulationen mittels Fluoreszenzfarbstoff gekoppelter Antikörper im Durchflusszytometer genauer charakterisiert. Hierfür wurden die Anteile bestimmter B- und T-Zellpopulationen an den gesamten Lymphozyten sowohl im Blut als auch in den lymphatischen Organen bestimmt. Unterschieden werden konnten, wie bereits in Kapitel 3.8 aufgelistet, folgende Zellfraktionen: B-Lymphozyten (CD45RA), T-Lymphozyten (CD3, CD4, CD8, CD25, CD161, Foxp3, αβTCR, γδTCR) und NK-Zellen (CD161). Zusätzlicher Wert wurde auf eine differenziertere Analyse des αβTCR Repertoires gelegt (Kap. 4.5.3). 4.5.1 Lymphozytenpopulation im Blut Abbildung 36 stellt die Anteile der reifen T-Lymphozyten (CD3+CD4+ und CD3+CD8+) an der Gesamtpopulation der lymphozytären Zellen im Blut dar. Es ist deutlich zu sehen, dass LEW-Rag1 Ratten einen signifikant geringeren Anteil, sowohl der T-Helferzellen als auch der zytotoxischen T-Zellen im Blut aufweisen als LEW Ratten. Die Werte der LEW-Rag1 Ratten erreichen gerade einmal 15 % der Anzahlen der LEW T-Lymphozyten. Die Verhältnisse von CD4 zu CD8 positiven T-Zellen sind allerdings bei beiden Stämmen im Mittel gleich (CD4+:CD8+, 2,6:1), wobei die gesunden LEW-Rag1 Ratten mit einem Verhältnis von 2,8:1 geringgradig darüber liegen. Abbildung 36: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten Im Blut der LEW Ratten sind signifikant mehr reife T-Zellen nachweisbar. (n=14-26) 75 4 Ergebnisse Beim Vergleich der gesunden und kranken Gruppen der einzelnen Haltungen miteinander sind einige Unterschiede wie folgt festzustellen. Die gesunden Tiere der keimfreien Haltung und die gesunden Tiere der SPF3 besitzen signifikant weniger CD3+CD4+ positive T-Zellen im Blut, als ihr erkranktes Pendant. Auch in der SPF4 ist dieser Trend zu erkennen, es ergeben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede. Ähnlich verhält es sich auch bei der Analyse der CD3+CD8+ T-Lymphozyten. Hier zeigen sich allerdings signifikant geringere Anzahlen bei den gesunden Ratten der Haltungen KF und SPF4. In der SPF3 Gruppe ist wiederum ein Trend in diese Richtung zu erkennen (Abb. 37). Außerdem unterscheiden sich die gesunden und kranken Tiere der verschiedenen Haltungseinheiten teilweise signifikant voneinander (Abb. 38). Besonders die SPF3 hebt sich hier von den anderen beiden Haltungen ab, indem deren LEW-Rag1 Ratten signifikant größere Anzahlen reifer T-Zellen im Blut aufweisen als in den beiden anderen Einheiten. Abbildung 37: Vergleich der Anteile reifer T-Lymphozyten im Blut bei gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinheiten Im Sinne der Übersichtlichkeit wurden in dieser und den folgenden Abbildungen nur die Unterschiede zwischen den gesunden und kranken Tieren derselben Haltung berücksichtigt. Weitere signifikante Unterschiede sind in Abb. 38 beschrieben. (n=14-26) 76 4 Ergebnisse Abbildung 38: Vorkommen reifer T-Zellen im Blut gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten Die Tiere der SPF3 weisen durchgängig die höchsten Werte auf. ANOVA CD3+CD4+ gesund und krank: P=0,0062; P=0,0168. Kruskal-Wallis Test CD3+CD8+ gesund und krank: P<0,0001; P=0,0260. (n=14-26) 77 4 Ergebnisse Die mit einem Antikörper für den αβTCR gefärbten Zellen weisen vergleichbare Werte auf (Abb. 39). Abbildung 39: Vergleich der Anteile αβTCR tragender T-Zellen zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten Der nachgewiesene Anteil dieser Zellpopulation stimmt mit den nachgewiesenen Anteilen CD3+CD4+ und CD3+CD8+ T-Zellen überein. (n=14-126) Gleichzeitig mit CD4 oder CD8 und CD25 angefärbte Zellen markieren aktivierte oder regulatorische T-Zellen. Auch hier unterscheiden sich die Anteile der einzelnen Populationen zwischen den Stämmen LEW und LEW-Rag1 signifikant (Abb. 40). Betrachtet man kranke und gesunde LEW-Rag1 Tiere gesondert in ihren Haltungsgruppen, dann zeigen sich nur geringe Differenzen. Hier liegen die Werte der Tiere aus der SPF4 teilweise signifikant unter denen aus der SPF3, die Werte der keimfreien Tiere liegen dazwischen. Bei den erkrankten Tieren sind diese Unterschiede etwas auffälliger. Der gezielte Vergleich gesunder und kranker Ratten einer Haltungseinheit brachte keine signifikanten Unterschiede hervor. Tendenziell liegen jedoch die prozentualen Werte der kranken Tiere etwas höher als die der Gesunden, diese Unterschiede sind allerdings nicht signifikant. Es lässt sich sagen, dass etwa 47 % der reifen T-Zellen der LEW Ratten CD25 auf ihrer Oberfläche tragen. Bei den LEW-Rag1 Ratten sind es deutlich mehr (67 %). Etwa die Hälfte dieser Lymphozyten ließ sich auch mit Antikörper gegen Foxp3 anfärben und stellt somit, wie in Kapitel 3.8 beschrieben wurde, die Population der regulatorischen T-Lymphozyten dar. 78 4 Ergebnisse Abbildung 40: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten LEW Ratten besitzen analog zur den Werten der gesamten Lymphozytenpopulation signifikant mehr CD25 + Lymphozyten als LEW-Rag1 Ratten. Lediglich die Mittelwerte der CD8+CD25+ Zellen der gesunden LEW-Rag1 Ratten in den drei Haltungseinheiten unterscheiden sich signifikant (Kruskal-Wallis Test: P=0,0297). (n=14-26) Des Weiteren zeigt die Analyse der doppelt positiven Zellen (CD4+CD8+) im Lymphozytengate auch einen Unterschied zwischen den beiden Stämmen. Hier sind es die LEW-Rag1 Tiere, die einen um 69 % höheren Prozentsatz dieser Zellfraktion im Blut aufweisen. Zudem unterscheiden sich die Anteile dieser Zellfraktion auch zwischen den gesunden und kranken Tieren dieses Stammes der verschiedenen Haltungseinrichtungen, mit Ausnahme der SPF3 (Abb. 41). In den anderen beiden Haltungen besitzen erkrankte LEWRag1 Tiere einen signifikant höheren Anteil dieser doppelt positiven Zellen im Blut als die Gesunden. Die gesunden Ratten aus der SPF3 weisen im Vergleich zu den keimfreien Tieren und den Tieren aus der SPF4 Haltung eine signifikant erhöhte Anzahl an CD4+CD8+ positiven Zellen auf. 79 4 Ergebnisse Abbildung 41: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen im Blut von LEW und LEW-Rag1 Ratten Im rechten oberen Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit dargestellt. Weitere relevante Unterschiede sind im unteren Abschnitt vermerkt. LEW-Rag1 Ratten besitzen eine größere Anzahl dieser Zellen im Blut als LEW Ratten. Kranke LEW-Rag1 Ratten besitzen eine größere Anzahl dieser Zellen im Blut als gesunde. Die Tiere der SPF3 weisen die höchsten Werte auf. ANOVA CD4+CD8+ gesund: P<0,0001. (n=14-26) Bei keinem untersuchten homozygoten Träger des Gendefektes konnten mit Hilfe eines an CD45RA bindenden Antikörpers reife B-Lymphozyten im Blut nachgewiesen werden. Die LEW Tiere weisen dagegen durchschnittlich 16 % (12-23 %) positiv markierter Zellen auf. Zuletzt folgen die Ergebnisse der NKT- und NK-Zellanalysen. Die zu der Gruppe der TZellen gehörenden NKT-Zellen wurden im FACS mit Hilfe einer Doppelfärbung mit CD3 und CD161 nachgewiesen. Die doppelt positiven Zellen bildeten die gesuchte Population. Dabei zeigte sich, dass LEW-Rag1 Ratten eine signifikant geringere Menge dieser Zellen im Blut aufweisen als LEW Tiere (Abb. 42). Genau gegenteilig zu diesen Ergebnissen stellt sich die NK-Zellpopulation der LEW-Rag1 Tiere dar. Während die Kontrolltiere nur einen sehr 80 4 Ergebnisse geringen Anteil von 4-11 % aufweisen, sind bei den LEW-Rag1 Tieren bis zu 41 % natürliche Killerzellen im Lymphozytengate nachweisbar. Zwischen kranken und gesunden Tieren und den Tieren unterschiedlicher Haltungseinheiten zeigen sich dagegen keine Unterschiede. Abbildung 42: Vergleich der Anzahlen nachweisbarer NKT- und NK-Zellen im Lymphozytengate von LEW und LEW-Rag1 Ratten LEW-Rag1 Ratten besitzen signifikant weniger NKT-Zellen und signifikant mehr NK-Zellen im Blut als LEW Ratten. (n=5-10) Für alle oben beschriebenen Zellpopulationen wurden auch altersspezifische Analysen durchgeführt. Hier konnte jedoch für keine einzige Zellpopulation eine tendenzielle oder gar signifikante Altersabhängigkeit nachgewiesen werden. 4.5.2 Lymphozytenpopulation in den lymphatischen Organen Die Ergebnisse der Analysen, der aus Milzen der LEW-Rag1 Ratten gewonnenen Lymphozyten, ähneln in ihrer Verteilung den im Blut erhobenen Werten in großen Teilen. Obwohl das Verhältnis von CD4 zu CD8 positiven T-Zellen hier ein anderes ist (2:1), so ist es doch bei LEW und LEW-Rag1 gleich. Betrachtet man allerdings gesunde und kranke Tiere getrennt, so zeigt sich ein deutlicher Unterschied in der anteilsmäßigen Verteilung dieser beiden Zelltypen. Während die CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen der gesunden LEW-Rag1 Ratten im Verhältnis 2,4:1 zueinander stehen, so ist es bei den Erkrankten ein Verhältnis von 1,7:1. Die CD8 tragenden Lymphozyten nehmen also bei einer Erkrankung der Tiere anteilsmäßig zu, wohingegen nicht mehr so viele CD4 positive Lymphozyten im Gate nachgewiesen werden können. Wie schon für das Blut gezeigt wurde, weisen die LEW-Rag1 81 4 Ergebnisse Ratten auch in ihren Milzen signifikant weniger reife T-Lymphozyten auf als die vergleichbaren Kontrolltiere (Abb. 43). Diese besitzen mehr als das Doppelte dieser Zellpopulation. Die Unterschiede zwischen kranken und gesunden LEW-Rag1 Ratten in den verschiedenen Haltungen sind in Abbildung 43 dargestellt. Abbildung 43: Vorkommen reifer T-Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten Im rechten Teil der Abbildung wurden nur signifikanten Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. Zusätzlich unterscheidet sich die Anzahl der CD3+CD4+ Zellen bei den gesunden Tieren nur zwischen KF und SPF3 signifikant (P=0,0282). In der Anzahl der CD3+CD8+ Zellen unterscheiden sich sowohl die gesunden als auch die erkrankten Tiere der SPF3 signifikant von den anderen beiden Haltungseinheiten (gesunde KF: P=0,0026; kranke SPF4: P=0,0190). (n=12-22) Die Anteile der B-Zellen am Lymphozytengate belaufen sich bei den Milzen der LEW Ratten auf durchschnittlich 30 %, bei den LEW-Rag1 Ratten sind auch dort keine B-Zellen nachweisbar. Während die LEW Ratten in der Milz einen geringeren Anteil CD25+ Zellen aufweisen als im Blut (Abb. 40), gleichen sich diese Werte bei den LEW-Rag1 Ratten. Dennoch zeigt sich, wie 82 4 Ergebnisse in Abbildung 44 zu erkennen ist, weiterhin ein signifikanter Unterschied dieses Zellvorkommens zwischen den beiden Stämmen. Die LEW-Rag1 Ratten besitzen sehr viel weniger CD25+ Lymphozyten in ihren Milzen als die LEW Ratten. Abbildung 44: Vorkommen der CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in der Milz von LEW und LEWRag1 Ratten (n=11-22) Des Weiteren sind keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der CD4+CD25+ Zellen zwischen erkrankten und gesunden LEW-Rag1 Tieren oder Tieren verschiedener Haltungen zu beobachten. Der prozentuale Anteil der CD8+CD25+ Zellpopulation dagegen unterscheidet sich in der keimfreien Haltung und in der SPF3 signifikant zwischen gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten. Die kranken Tiere haben hier deutlich höhere Werte vorzuweisen. Insgesamt zeigen ca. 27 % der LEW Lymphozyten in den Milzen einen aktivierten bzw. regulatorischen Phänotyp, bei LEW-Rag1 dagegen sind es 44 %. 83 4 Ergebnisse Es sind weniger CD4+CD8+ Zellen in den Milzen der LEW Ratten zu finden als in deren Blut, während die Anzahl der CD4+CD8+ Zellen bei den LEW-Rag1 Ratten in Milz und Blut anteilig gleich ist. Trotzdem zeigen sich auch hier signifikant geringere Anzahlen dieser Zellen in den Organen der Kontrolltiere (Abb. 45). Des Weiteren ist in dieser Abbildung dargestellt, dass sich vor allem die Tiere aus der SPF3 in dieser Hinsicht von den anderen beiden Haltungen abheben. Wie auch schon im Blut gezeigt wurde, beherbergen die Milzen der gesunden Tiere in der keimfreien Haltung und in der SPF4 signifikant geringere Mengen CD4+CD8+ Zellen. Abbildung 45: Vorkommen der CD4+CD8+ Zellen in der Milz von LEW und LEW-Rag1 Ratten Im rechten oberen Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. Weitere relevante Unterschiede sind im unteren Abschnitt vermerkt. Dort zeigt sich, dass LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 Haltung die höchsten Anteile dieser Zellfraktion in der Milz aufweisen. ANOVA: P<0,0001. (n=12-16) Die NK-Zellen sind in der Milz anteilsmäßig sowohl bei den LEW Ratten als auch bei den LEW-Rag1 Ratten ähnlich häufig vertreten wie im Blut. Es zeigen sich keine Unterschiede 84 4 Ergebnisse zwischen gesunden und kranken Tieren in einer Haltungseinheit und zwischen den Tieren verschiedener Haltungseinheiten. Die Ergebnisse der FACS-Analysen der peripheren Lymphknoten liefern dem Betrachter, im Hinblick auf den Anteil der reifen Lymphozyten, ein komplett anderes Bild. Im Gegensatz zu den vorherigen Analysen besitzen die LEW-Rag1 Ratten signifikant mehr CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen in diesen Organen als LEW. Während sich die Mittelwerte der LEW Tiere auf 55 % (CD3+CD4+) und 21 % (CD3+CD8+) belaufen, liegen sie bei LEW-Rag1 bei 65 % und 38 %, streuen allerdings deutlich stärker (Abb. 46). Abbildung 46: Vorkommen der reifen Lymphozyten in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren Im unteren Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. (n=12-16) Des Weiteren gleicht das Verhältnis dieser beiden Zellpopulationen in den Lymphknoten der LEW Ratten dem festgestellten Verhältnis von 2,6:1 im Blut. Bei den LEW-Rag1 Ratten 85 4 Ergebnisse dagegen ist eine deutlich größere Anzahl CD3+CD8+ Zellen nachweisbar, was zu einem Verhältnis von 1,8:1 führt und sich somit deutlich von den Kontrollen unterscheidet. Betrachtet man die Verhältnisse dieser Zellen gesondert zwischen gesunden und als krank eingestuften LEW-Rag1 Ratten, so zeigt sich, dass die kranken Tiere deutlich größere Mengen CD3+CD8+ Lymphozyten im Lymphknoten aufweisen als Gesunde. Die berechneten Verhältnisse verschieben sich von 2,1:1 bei gesunden Tieren zu 1,3:1 bei den Erkrankten (Abb. 47). Bei der gesonderten Analyse der CD3+CD4+ Zellen ergeben sich keine weiteren Unterschiede innerhalb des LEW-Rag1 Stammes, lediglich die erkrankten Ratten aus der SPF3 zeigten signifikant geringere Werte im Vergleich zu den Gesunden dieser Haltungseinheit (P=0,0182). Die CD3+CD8+ Population zeigt dagegen in allen drei Haltungen deutliche Unterschiede zwischen den kranken und gesunden Ratten. Die gesunden Tiere weisen durchweg signifikant geringere Anteile dieser Zellpopulation am Lymphozytengate auf als die erkrankten Tiere (Abb. 47). Zwischen Tieren verschiedener Haltungseinrichtungen sind auch hier keine Unterschiede erkennbar. Abbildung 47: Verhältnis der verschiedenen reifen T-Lymphozyten im Lymphknoten zueinander Bei erkrankten LEW-Rag1 Ratten ist das CD4/CD8-Verhältnis am stärksten verschoben. (n=12-16) Auch in den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten sind keine B-Zellen detektierbar, wohingegen diese Zellen bei LEW einen Anteil von 25 % einnehmen. Analog zu den deutlich höheren Werten der reifen T-Zellen weisen auch die CD4+CD25+ Zellen signifikant größere Anteile am Lymphozytengate der Lymphknoten auf als die Zellen der Kontrolltiere (Abb. 48). Allerdings sind auch hier die LEW-Rag1-Zellen einer größeren Streuung der Werte unterworfen. Auch beim Vergleich der Haltungseinheiten und Gesundheitsstatus miteinander ergibt sich ein ähnliches Bild zu dem im vorangegangenen Absatz beschriebenen. Für die CD4+CD25+ Zellen ergeben sich keine signifikanten 86 4 Ergebnisse Unterschiede, wogegen die gesunden Ratten in der keimfreien Haltung und der SPF4 signifikant geringere Werte für die CD8+CD25+ Zellen aufweisen als die Erkrankten. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 48 dargestellt. Die aktivierten/ regulatorischen Zellen machen sowohl bei LEW Ratten als auch bei LEW-Rag1 Ratten einen Anteil von ca. 36 % an den gesamten reifen T-Lymphozyten der Lymphknoten aus. Abbildung 48: Vorkommen von CD4+CD25+ und CD8+CD25+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Tieren Im unteren Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. (n=12-15) Die Anteile der CD4+CD8+ Zellen am Lymphozytengate der Lymphknoten liegen im selben Bereich in dem sie auch im Blut und in der Milz vorkommen. Die Werte der LEW-Rag1 Ratten liegen mit einem arithmetischen Mittel von 24 dabei signifikant über denen der Kontrolltiere (arithmetisches Mittel: 9). Der Vergleich gesunder und kranker LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungseinheiten miteinander zeigt, wie in Abbildung 49 zu erkennen ist, einen deutlichen Trend dahingehend, dass diese Zellpopulation in den Lymphknoten 87 4 Ergebnisse gesunder Tiere seltener vertreten ist als in den Lymphknoten erkrankter Ratten. Die Werte der einzelnen Haltungen an sich unterscheiden sich nicht nennenswert voneinander. Abbildung 49: Vorkommen von CD4+CD8+ Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten Im rechten Teil der Abbildung wurden nur die signifikanten Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. (n=12-15) Die einen NK-Zellrezeptor tragende Zellpopulation ist nicht nur im Blut und der Milz der LEW-Rag1 Ratten erhöht sondern auch in ihren Lymphknoten (Abb. 50). Während die Kontrolltiere gerade einmal durchschnittlich 1 % dieser Zellen im Lymphozytengate aufweisen, beläuft sich dieser Wert bei den LEW-Rag1 Ratten auf 9 % (Max. 27 %). Signifikante Unterschiede zeigen sich zudem auch beim Vergleich der gesunden LEW-Rag1 Ratten aller drei Haltungseinrichtungen miteinander. Die keimfreien Tiere haben hier den größten NK-Zell Anteil im Lymphknoten, gefolgt von den Tieren der SPF4. Den geringsten Anteil dieser Zellpopulation weisen die Tiere aus der SPF3 Haltung auf. Diese Ergebnisse zeigen sich für die erkrankten Ratten nicht. Hier zeigen alle Tiere, unabhängig der Haltung, annähernd die gleichen Werte. Abbildung 50 zeigt, dass auch die unterschiedlichen Gesundheitsstatus (gesund/krank) Einfluss auf das Vorkommen dieser Zellen nehmen. Sowohl in der keimfreien Haltung als auch in der SPF4 besitzen die erkrankten LEW-Rag1 Ratten einen signifikant geringeren Anteil NKR positiver Zellen als die Gesunden. In der SPF3 zeigt sich dieser Unterschied nicht. 88 4 Ergebnisse Abbildung 50: Vorkommen von NK-Zellen in den peripheren Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 Ratten Im rechten oberen Teil der Abbildung wurden nur signifikante Unterschiede zwischen gesunden und kranken Tieren einer Haltungseinheit berücksichtigt. Weitere signifikante Unterschiede sind im unteren Teil dargestellt. Kruskal-Wallis Test für Lymphknoten NK-Zellen „gesund“: P=0,0020. (n=12-22) Für den Thymus der LEW-Rag1 Ratten war es sehr schwierig, verlässliche Daten zu generieren. Das liegt vor allem an der Unterentwicklung dieses Organs, weshalb es schwer von umliegendem Fett- und Bindegewebe zu differenzieren und isolieren ist. Aufgrund der wenigen isolierbaren Thymozyten und der schwierigen Organentnahme wurde sich in der FACS-Analyse auf den Vergleich zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten beschränkt. Ein Vergleich der verschiedenen Haltungsformen der LEW-Rag1 Tiere, wie er vorher durchweg durchgeführt wurde, war hier nicht möglich. Trotz alledem konnten deutliche Unterschiede der Zellpopulationen der Thymi zwischen den LEW und LEW-Rag1 Ratten nachgewiesen werden. Diese sind in Abbildung 51 zusammenfassend dargestellt. Wie erwartet, befindet sich nur ein sehr geringer Anteil CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Lymphozyten im Thymus der 89 4 Ergebnisse immunsupprimierten Ratten. Der durchschnittliche Anteil CD4 positiver Lymphozyten liegt bei den LEW Ratten bei 52 %, während er bei den LEW-Rag1 Tieren lediglich bei 12 % (0,570 %) liegt. Ein Großteil der Werte befindet sich dabei deutlich unter dem arithmetischen Mittel. Ein sehr ähnliches Bild ergibt sich auch für die CD8 positiven Lymphozyten. Die LEW Thymi zeigen hier Werte um 57 %, wogegen es bei LEW-Rag1 nur 6 % (0,2-38 %) sind. Des Weiteren stehen diese beiden Zellpopulationen bei den Kontrolltieren nahezu in einem Verhältnis von 1:1 (CD4+:CD8+) zueinander, während sich das Verhältnis bei LEWRag1 dem der Milzen und des Blutes annähert (2:1). Auch bei fast allen anderen Analysen weisen die Thymozyten der LEW Ratten sehr hohe Werte im Vergleich zu den LEW-Rag1 Ratten auf. Dieser Aussage entgegen steht nur die Färbung des NK-Zellrezeptors. Diese Zellpopulation ist in den LEW Thymi nahezu nicht vorhanden. Dagegen kann sie in den Thymi der LEW-Rag1 Ratten mit bis zu 7 % nachgewiesen werden. Abbildung 51: Ergebnisse der FACS Analysen der LEW-Rag1 Thymi (n=4-14) Um einen altersbedingten Einfluss auf die in diesem Kapitel erhobenen Werte ausschließen zu können, wurden für jeden hier gezeigten Parameter die einzelnen, in Kapitel 3.1 dargestellten Altersgruppen untereinander verglichen. Hier zeigten sich keine eindeutigen oder signifikanten Unterschiede. Somit kann ein altersbedingter Einfluss auf die erhobenen Werte ausgeschlossen werden. Zusätzlich bestanden alle miteinander verglichenen Gruppen zum 90 4 Ergebnisse gleichen Anteil aus jungen, mittelalten und alten Ratten, was, unabhängig von dem eben beschriebenen Ergebnis, zu einer guten Vergleichbarkeit der Werte beiträgt. Die Ergebnisse der FACS Analysen des Blutes einiger Tiere, welche den Gendefekt nur auf einem Allel tragen (LEW-Rag1 +/-), sind in Abbildung 52 dargestellt. Hier ist sehr deutlich zu erkennen, dass die heterozygoten Träger des Gendefektes, im Hinblick auf die Anteile der nachweisbaren T-Lymphozyten, eine Zwischenstellung zwischen LEW und den homozygoten Trägern (LEW-Rag1) einnehmen. Sowohl ihre nachweisbare Anzahl an reifen als auch an aktivierten und regulatorischen T-Zellen ist signifikant geringer als bei den LEW Ratten. Währenddessen liegen diese Werte aber signifikant über denen der LEW-Rag1 Tiere. Die Population der CD4+CD25+ Zellen bildet hier eine Ausnahme, unterscheidet sich jedoch nicht vollständig vom Bild der übrigen Ergebnisse. Bei der Analyse der NK-Zellpopulation zeigt sich ebenfalls eine Zwischenstellung im Vorkommen bei den heterozygoten Merkmalsträgern, abhängig von der sehr geringen Menge nachweisbarer NK-Zellen im Blut der LEW Ratten. Die durchschnittliche Anzahl detektierter B-Lymphozyten bei den heterozygoten LEW-Rag1 Ratten beläuft sich auf 9 %, was ebenfalls mittig zwischen LEW (16 %) und LEW-Rag1 (0,1 %) angesiedelt ist. Die einzige, stark vom Gesamtbild abweichende Ausnahme bilden die gleichzeitig mit Antikörper für CD4 und CD8 anfärbbaren Zellen. Hier unterscheiden sich die generierten Prozentwerte für die heterozygoten LEW-Rag1 Ratten nicht signifikant von den LEW Tieren, obwohl ein Trend dahingehend erkennbar ist. Im Vergleich mit den gesunden und kranken LEW-Rag1 Ratten weisen die LEW-Rag1 +/- Ratten eine signifikant geringere Menge dieser Zellpopulation auf. Graphisch lässt sich in diesem Fall die Zwischenposition der heterozygoten Träger des Rag1 Gendefektes nicht klar darstellen. 91 4 Ergebnisse Abbildung 52: FACS Daten des Blutes der heterozygoten LEW-Rag1 Ratten Dargestellt sind nur die signifikanten Unterschiede zwischen den heterozygoten Trägern des Gendefektes (LEWRag1 +/-) und den jeweiligen anderen Gruppen. Die übrigen Differenzen wurden im vorherigen Kapitelabschnitt beschrieben. Es ist deutlich erkennbar, dass die Daten der LEW-Rag1 +/- Ratten eine Zwischenstellung zwischen den Daten der LEW und LEW-Rag1 Ratten einnehmen. Kruskal-Wallis Test für jede der sechs Analysen: P<0,0001. (n=4-63) 4.5.3 T-Zellrezeptorrepertoire Bei allen vorangegangenen FACS Analysen gleichen sich die erhobenen Werte für den αβTCR mit den Ergebnissen, die die Analysen der reifen T-Zellen (CD3+CD4+ und CD3+CD8+) lieferten, weshalb diese Ergebnisse nicht noch einmal gesondert dargestellt wurden. Außerdem wurde der Anteil γδTCR tragender Zellen in den lymphatischen Organen und im Blut beider Rattenstämme untersucht. Dabei konnte nur ein sehr geringer Anteil, sowohl bei den LEW-Rag1 Ratten als auch bei den Kontrolltieren, nachgewiesen werden. Dieser belief sich im Blut auf 2 % (LEW) und 0,6 % (LEW-Rag1), in der Milz auf 2,7 % und 0,9 % und in den Lymphknoten auf 1,6 % und 1 %. 92 4 Ergebnisse Aufgrund dessen wurde lediglich das αβTCR Repertoire im Blut der LEW-Rag1 Ratten per FACS-Analyse genauer charakterisiert. Abbildung 53: Prozentuale Anteile der verschiedenen Vα- und VβRezeptortypen Es zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1 Tieren. (n=5-10) In Abbildung 53 wird deutlich, dass die prozentualen Anteile der verschiedenen Vα- und VβRezeptortypen an den gesamten αβTCR tragenden Zellen bei LEW und LEW-Rag1 nicht signifikant unterschiedlich sind. Hierbei konnten Vβ16 tragende Zellen am häufigsten nachgewiesen werden und Vβ10 tragende am seltensten. Zusätzlich streuen die Werte der LEW-Rag1 Tiere deutlich stärker als die der Kontrollen, was häufig auch schon in vorherigen Analysen beobachtet wurde. Der Anteil der gesamten αβTCR tragenden Zellen am Lymphozytengate scheint bei den LEW-Rag1 Ratten in einem Alter von 2 bis 9 Monaten mit dem Älterwerden leicht anzusteigen, wohingegen er bei LEW stagniert. Aufgrund einer sehr geringen Gruppengröße können hier aber nur Trends aufgezeigt werden. 4.6 Analyse antibiotisch vorbehandelter Rag1 defizienter Ratten Der Gesundheitszustand der beim Start dieses Versuches gesunden Tiere wurde in regelmäßigen Abständen dokumentiert. Ein Tier verstarb unerwartet schon in der ersten Woche ohne vorherige Anzeichen. Drei weitere Tiere begannen nach 22 Tagen geringgradig 93 4 Ergebnisse gerötete Ohren zu zeigen, was sich eine Woche später leicht verstärkt hatte. Zusätzlich wies eines der drei Tiere leicht struppiges Fell auf und musste bald darauf aufgrund zu schlechten Allgemeinbefindens aus dem Versuch genommen werden. Die anderen beiden auffälligen Ratten zeigten 5 Wochen nach Versuchsbeginn schon mittelgradig gerötete Ohren und Gesichter, ihr Fell war an den Vorderbeinen geringgradig verklebt und ihr Fell erschien geringgradig struppig, so dass auch diese beiden aus dem Versuch ausscheiden mussten. Bei den beiden verbliebenen Ratten handelte es sich um das ältere Tier und eines der 5 Jüngeren (Kap. 3.6). Sie zeigten sich bis zur 11. Woche nach Versuchsbeginn gesund und munter. Danach begann das ältere Weibchen (Alter: 5 Monate) eine geringgradige Alopezie im Kopfund Nackenbereich sowie eine geringgradige Rötung der Nase zu entwickeln. Dieser Zustand veränderte sich bis zum Versuchsende nicht. Das jüngere Tier zeigte bis zum Ende keine klinischen Veränderungen. Nach insgesamt 3 Monaten wurden diese beiden Tiere im Alter von 18 und 22 Wochen seziert und ihre Organe histologisch beurteilt. Während der Sektion zeigten sich an den Organen des jüngeren und unauffälligen Tieres keine Veränderungen, das Ältere dagegen wies eine geringgradige stumpfrandige Leber und hochgradig vergrößerte Unterkieferlymphknoten auf. Außerdem wurden ihre Blutzellen im FACS analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 11 und 12 dargestellt. Tabelle 11: Histologische Scores der mit Cotrim K behandelten Tiere Tiernr. 268 283 Magen Düda Zäkum Dida Leber Milz Haut Spdr Lnn. Lunge Herz Gesamt 40 7 7 4 6 2 1 3 2 3 5 0 19 4 3 3 5 1 0 0 1 1 1 0 Tabelle 12: FACS Ergebnisse der mit Cotrim K behandelten Tiere Tiernr. CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD4+CD25+ CD8+CD25+ CD4+CD8+ NK-Zellen 268 5,1 2,3 3,7 1 18 54,8 283 2,8 0,3 1,4 0,4 5,7 27,4 Die histologischen Gesamtscores der antibiotisch behandelten Tiere (40 krankes Tier, 19 gesundes Tier) unterscheiden sich nicht von den erhobenen Scores der jeweiligen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten (Kap. 4.2.9). Ebenso verhält es sich mit den Werten der 94 4 Ergebnisse FACS Analyse (Kap. 4.5.1). Das gesunde und das erkrankte Tier unterscheiden sich in beiden Ergebnissen deutlich voneinander. 95 5 Diskussion 5 Diskussion Die Recombination Activating Genes 1 und 2 sind unerlässlich für die Reifung von Lymphozytenvorläufern zu T- und B-Zellen. Sie bewirken eine effiziente Rekombination der Gene der Antigenrezeptoren und Immunglobulinmoleküle und sorgen somit für deren große Diversität und Antigenspezifität (Fugmann et al. 2000, Gellert 2002, Lewis 1994, Tonegawa 1983). Sind diese Gene und somit auch die daraus entstehenden Proteine in ihrer Funktion gestört, hat dies weitreichende Folgen. Abhängig von der Stärke des Funktionsverlustes verliert das Immunsystem seine Fähigkeit, Erreger mit adaptiven Immunmechanismen zu bekämpfen, wodurch eine der wichtigsten Waffen des Immunsystems der Wirbeltiere fehlt. Im Rahmen kontrollierter Genmanipulationen werden heutzutage immundefiziente Tiermodelle generiert, die Wissenschaftlern als Grundlage für die Forschung an Erkrankungen und Behandlungsstrategien beim Menschen dienen. Aus diesem Grund wurde auch die LEW-Rag1 Ratte im Jahr 2012 im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover entwickelt. Bis dato standen der Forschung nur sehr wenige immundefiziente Rattenmodelle und keines mit einem Defekt im Rag1, zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit wird die Rag1 defiziente LEW Ratte grundlegend charakterisiert. Der Fokus liegt dabei auf der Phänotypisierung dieser Tiere und beinhaltet sowohl deren Physiologie als auch deren pathologische Veränderungen. Hierzu wurden Beobachtungen und Untersuchungen auf Tier- und Organebene sowie auf zellulärer Ebene angestellt, deren Ergebnisse in den vorherigen Kapiteln vorgestellt wurden. Mit Hilfe dieser Untersuchungen sollen zum einen Unterschiede zwischen dem Stamm LEW-Rag1 und seinem Hintergrundstamm (LEW) aufgezeigt werden, sowie Unterschiede, die sich durch verschiedene Haltungseinheiten der LEW-Rag1 Ratten ergeben. Zum anderen wird mit Hilfe dieser Ergebnisse die Stellung der LEW-Rag1 Ratte im Vergleich zu weiteren Rag defizienten murinen Tiermodellen und dem humanen Omenn Syndrom diskutiert. Im Folgenden werden die im Verlauf dieser Studie generierten Daten zusammengefasst und diskutiert, um schlussendlich eben formulierte Fragestellungen beantworten zu können. 96 5 Diskussion 5.1 Unterschiede zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten in verschiedenen Haltungen 5.1.1 Physiologische Parameter und Organmorphologie Schon im Vorfeld dieser Arbeit fielen bei den LEW-Rag1 Ratten zahlreiche pathologische Veränderungen, die hier auch als Krankheitssymptome bezeichnet werden, auf. Da Pathogene als Auslöser dieser Symptome in Betracht gezogen wurden, erfolgte die Umsiedlung der Tiere aus einer stärker mit fakultativ pathogenen Mikroorganismen belasteten Haltung in zwei unterschiedliche spezifisch pathogenfreie Haltungen und eine keimfreie Haltung (Die Unterschiede dieser verschiedenen Hygienebarrieren sind in Kapitel 3.1.2 beschrieben). Jedoch auch dort entwickeln die LEW-Rag1 Ratten mit der Zeit die gleichen pathologischen Symptome. Dazu gehören offensichtliche Symptome wie Alopezie, Hautrötungen und schuppen und ein gestörtes Allgemeinbefinden, erst bei der Sektion des Tieres zu erkennende Symptome (u. A. Lymphknotenmorphologie) sowie erst im Paraffinschnitt des Organes unter dem Lichtmikroskop zu identifizierende Veränderungen. Insgesamt erkrankten im Untersuchungszeitraum in der keimfreien Haltung 74 % aller Ratten im Laufe ihres Lebens. In der SPF4 erkrankten 79 % der Gesamtpopulation und in der SPF3 waren es fast alle (Abb. 8). Zwischen männlichen und weiblichen Tieren zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Erkrankungshäufigkeit und -stärke, weshalb auf den Unterschied zwischen Weibchen und Böcken der LEW-Rag1 Ratten in dieser Arbeit nicht näher eingegangen wird. Zudem hätte ein Vergleich dessen eine größere Tierzahl für die Probengewinnung erfordert. Vergleicht man die Prävalenzen und Inzidenzen der drei verschiedenen LEW-Rag1 Populationen miteinander (Abb. 8 und 9), so erhält man ein deutliches Ergebnis. In der keimfreien Haltung scheint die Morbidität am geringsten zu sein, während sie in der SPF3 am höchsten ist. Dieses Bild spiegelt sich auch im Beginn der Krankheitssymptome wieder, welcher seinen Höhepunkt in der SPF3 deutlich früher hat als in den anderen beiden Haltungen (Abb. 9). Je größer der Infektionsdruck durch Umweltkeime in der Haltung ist, desto mehr Tiere erkranken und desto früher erkranken diese. Jedoch konnten in Proben ausgewählter, erkrankter Ratten keinerlei Pathogene nachgewiesen werden. Da die keimfrei gehaltenen Ratten ebenfalls Krankheitssymptome entwickeln, diese aber signifikant 97 5 Diskussion später auftreten, können Umweltkeime als direkte Ursache ausgeschlossen werden. Es kann ihnen aber eine Triggerfunktion in der Krankheitsentwicklung zugesprochen werden. In der Sektion zeigen nur vereinzelte Organe der LEW-Rag1 Ratten Veränderungen. Dazu gehören die mesenterialen und peripheren Lymphknoten, die Thymi und die Haut. Weniger häufig verändert sind der Magen-Darm-Trakt, die Lungen, die Lebern und die Milzen (Tab. 9). Letztere sind durchschnittlich genauso groß wie die Organe der Kontrolltiere, mit wenigen Ausnahmen, die sich nicht als statistisch signifikant darstellen. Die deutlich stärker injizierten Blutgefäße der Unterhaut sind als eine Konsequenz der entzündlichen und geröteten Erscheinung der Haut anzusehen. Vasoaktive Substanzen und andere Entzündungsmediatoren, welche bei den LEW-Rag1 Tieren deutlich vermehrt nachgewiesen wurden (Kap. 4.3.4), führen zu einer gesteigerten Durchblutung in diesem Bereich, zu einer Auflockerung der Gefäßwände und somit zu einem Austritt von Entzündungszellen ins umliegende Gewebe (Villa et al. 2008). Diese stellen sich als monozytäre und polymorphkernige Entzündungszellansammlungen im histologischen Bild der Haut und ihrer tiefer liegenden Strukturen dar. Die deutliche Dysplasie des Thymus der LEW-Rag1 Ratten bildet aufgrund der fehlenden T-Lymphozytenreifung eine direkte Folge des Rag1 Gendefektes (Brooks et al. 1999), wobei die makroskopischen sowie zellulären Veränderungen der Lymphknoten nur teilweise dadurch bedingt sind (Facchetti et al. 1998). Eine weitere große Rolle werden in diesem Fall die immunologischen Vorgänge im umliegenden Gewebe spielen, welche zu vermehrter Durchblutung der Lymphknoten und ihrer Vergrößerung führen. Die Lunge und der Magen-Darm-Trakt sind die Organe, welche direkt mit Antigenen der Außenwelt eines Tieres in Berührung kommen und müssen deswegen besonders gute Abwehrmechanismen besitzen und gegenüber ungefährlichen Antigenen tolerant sein. Diese Mechanismen sind bei der LEW-Rag1 Ratte gestört. Dabei kommt es zur Ausprägung deutlicher Entzündungssymptome, die die makroskopischen Veränderungen verursachen. Hierbei kann es sich entweder um eine schwere Infektion aufgrund eines unzureichend ausgebildeten Abwehrsystems handeln oder um eine überschießende Immunreaktion auf Auto- oder Fremdantigene. Auch eine Mischform ist denkbar, da Tiere aller drei Haltungseinheiten diesen Phänotyp zeigen und ganz unterschiedliche Zelltypen daran beteiligt sind. 98 5 Diskussion Mit Hilfe der histologischen Untersuchungen sollte geklärt werden, wie sich die Organsysteme von LEW und LEW-Rag1 histologisch unterscheiden. Außerdem wurde untersucht, ob sich die Organsysteme von gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten unterscheiden und ob altersbedingte Unterschiede vorliegen. Zudem sollte geklärt werden, ob die Haltungshygiene einen Einfluss auf die histologisch erkennbare Ausprägung der Krankheit ausübt. In fast allen Fällen wurden jeweilige Unterschiede festgestellt. Lediglich zwischen den verschiedenen Altersgruppen konnten, bei einer Gruppengröße von n=3-5, hinsichtlich der histologischen Veränderungen keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Das histologische Bild der LEW-Rag1 Thymi offenbart noch weitere Veränderungen, die über eine einfache Verkleinerung dieses Organs hinausgehen. Ihm fehlt der physiologische Aufbau in Rinde und Mark, da, wie Khiong et al. (2007) beschrieben, die Kompartimentierung des Thymus durch den gestörten Lymphozytenreifungsprozess von DN zu DP Thymozyten ausbleibt. Eine Besiedelung mit Lymphozytenvorläufern hat in den Thymi der LEW-Rag1 Ratten stattgefunden. Das Organ ist mit großen, mononukleären Zellen besiedelt, die die typische Morphologie noch nicht endgültig differenzierter Zellen zeigen. Diese Zellen weisen eine großen, nicht chromatindichten Zellkern und einen deutlich sichtbaren Zytoplasmasaum auf. Die Thymi der Kontrolltiere hingegen sind dicht gefüllt mit kleinen, mononukleären Zellen, die einen deutlich kondensierten, chromatindichten Zellkern und einen sehr schmalen Zytoplasmasaum aufweisen und so die typische Morphologie reifer, ausdifferenzierter Lymphozyten zeigen. Dieses histologische Bild der Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten zieht sich durch alle lymphatischen Organe und entzündlich veränderten Organsysteme. Auch in den untersuchten Blutausstrichen können die beschriebenen Lymphoblasten gefunden werden. Dieses Phänomen wurde auch von Martin et al. (1995) und Facchetti et al. (1998) beobachtet. (Martin et al. 1995) Analog zum fehlenden Aufbau der Thymi, weicht auch die Organstruktur weiterer lymphatischer Organe von der Norm ab. In den Milzen gibt es keine Abgrenzung von weißer und roter Milzpulpa und klassische Follikel fehlen. Da die LEW-Rag1 Ratten bis zu 80 % weniger reife Lymphozyten im Blut und in ihren Organen beherbergen und die B-Zellen komplett fehlen, kann sich keine deutliche Kompartimentierung dieses Organes ausbilden. 99 5 Diskussion Ähnlich verhält es sich in den beurteilten Lymphknoten. Auch hier fehlt der organtypische Aufbau in Cortex, Paracortex und Medulla, und es fehlen Primär- sowie Sekundärfollikel, in denen bei gesunden Tieren B- und T-Lymphozyten vorzufinden wären. Auch dieses Bild ist durch einen Mangel reifer Lymphozyten in der LEW-Rag1 Ratte zu erklären. Ein weiterer Hinweis dafür ist, dass sich fast alle betrachteten Lymphknoten als depletiert, also zellarm, darstellen. Dieses Phänomen wurde zusätzlich mit der Messung der absoluten Lymphozytenanzahl in den Milzen und Lymphknoten von LEW und LEW-Rag1 bewiesen (Abb. 35). Fast alle histologisch beurteilten Organe der LEW-Rag1 weisen im Mittel mehr oder weniger starke Infiltrationen mit verschiedenen Entzündungszellen auf (Tab. 9). Dazu zählen sowohl mononukleäre Zellen, wie Lymphoblasten oder NK-Zellen, als auch polymorphkernige Zellen, die hier von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten repräsentiert werden und nicht zuletzt Mastzellen. Von allen betroffenen Organen weisen die Herzen der LEW-Rag1 Ratten nur in wenigen Fällen Infiltrate auf, alle anderen Organe waren häufig betroffen. Relativ milde Infiltrationen ließen sich in den Herzen, den Lebern und den untersuchten Hautabschnitten nachweisen, stärkere in den Magen-Darm-Trakten, den Speicheldrüsen und den Lungen. Sehr starke Infiltrationen mit Granulozyten und Mastzellen befanden sich in den Lymphknoten und Milzen. Histologisch konnten in den Kontrollorganen der LEW Ratten keine vergleichbaren Infiltrate gefunden werden. Signifikante Unterschiede beim Scoren der Organe kranker und gesunder LEW-Rag1 Tiere konnten vor allem bei der Untersuchung der Mägen, der Hautabschnitte und der Lungen der erkrankten Tiere gefunden werden. Nicht signifikant, aber als Trend ist dies auch in den Därmen und Speicheldrüsen zu erkennen. Beim Vergleich der Organe der drei verschiedenen Haltungseinheiten zeigen sich besonders zur Haltung der SPF3 signifikante Unterschiede hinsichtlich der Bewertung der Entzündungssymptome. Diese lassen sich durch das unterschiedliche bakterielle Environment erklären. Dabei sind signifikant stärkere Infiltrationen in den Magen-Darm-Trakten, den Milzen und den Speicheldrüsen der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 zu erkennen, während zwischen den keimfreien Tieren und den Tieren der SPF4 keine deutlichen Unterschiede zu erkennen sind. Eine Ausnahme bilden hier die Milzen, wo die Anzahlen der Organe mit deutlichen Infiltraten einen signifikanten Unterschied zwischen allen Haltungseinrichtungen zeigen, sich dies jedoch nicht im für das Organ angewendeten Score darstellen lässt (Kap. 100 5 Diskussion 4.2.1). Dies liegt aller Wahrscheinlichkeit nach an dem nicht ausreichend sensiblen Score für die Histologie des Organes. Jedoch zeigt sich deutlich, dass in der keimfreien Haltung anteilsmäßig die wenigsten Tiere Infiltrationen der Milz aufwiesen (47 %), gefolgt von den Tieren der Haltung SPF4 (70 %). Am häufigsten betroffen waren auch hier die Ratten aus der SPF3 (90 %) (Kap. 4.2.1). In den Lungen spiegelt sich nicht exakt das oben beschriebene Bild wieder. Deutlich wird jedoch, dass die Lungen der Ratten aus beiden spezifisch pathogenfreien Haltungen häufiger betroffen sind als die Lungen der keimfreien Tiere. Die fibrotischen Umbauprozesse in den Speicheldrüsen, der Zotten- und Kryptenverlust im Darmtrakt, das blutreiche oder atelektatische Lungengewebe sowie die teilweise vorkommenden nekrotischen Areale in den Lymphknoten können als Folgeschäden der Entzündungszellinfiltrationen und damit einhergehenden Gewebeschädigungen gewertet werden und deuten auf einen teilweise schon längere Zeit andauernden Prozess hin. All diese Analyseergebnisse machen deutlich, dass sich die Stämme LEW und LEW-Rag1 phänotypisch, makroskopisch sowie auch histologisch, deutlich voneinander unterscheiden. Zudem weisen klinisch gesunde Tiere häufig deutlich schwächere Organveränderungen auf als ihr erkranktes Pendant. Zusätzlich lassen diese Ergebnisse die Vermutung zu, dass das hygienische Umfeld in der Tierhaltung der LEW-Rag1 Ratten einen Einfluss auf deren Gesundheitsstatus hat. Sowohl in der SPF4 als auch in der SPF3 Haltung kommen Mikroorganismen vor. Im Rahmen der Routinehygienediagnostik nach den FELASARichtlinien wurden, abweichend von der SPF4, in Anzeigertieren der SPF3 Klebsiella oxytoca und Staphylococcus aureus nachgewiesen. Diese beiden fakultativ pathogenen Keime können bei Tieren mit einem nicht intakten Immunsystem schwere Infektionen der Haut, des Urogenitaltraktes, der Atemwege und zahlreicher anderer Organsysteme auslösen (Bleich et al. 2008, Percy, Barthold 2007). Diese Aussage deckt sich mit den Krankheitssymptomen der LEW-Rag1 Ratten. Jedoch treten diese Veränderungen, wie oben beschrieben, auch bei den Ratten der SPF4 und sogar in der keimfreien Haltung auf. Außerdem lässt sich ein Erkranken der Ratten durch eine prophylaktische antibiotische Behandlung nicht verhindern (Kap. 4.6). Diese Beobachtungen legen nahe, dass nicht nur Mikroorganismen für den von LEW abweichenden Phänotyp verantwortlich sind. 101 5 Diskussion Ein Kritikpunkt, der sich aus diesen Analysen ergibt, ist die Subjektivität der Gruppeneinteilung der LEW-Rag1 Ratten. Es wurde lediglich adspektorisch das lebende Tier beurteilt und danach die Gruppenzuordnung (gesund/krank) festgelegt. Der im Nachhinein angefertigte klinische Score aller histologisch beurteilten Ratten zeigt, dass die durchschnittlichen Werte der kranken LEW-Rag1 Ratten deutlich höher liegen als die Werte der LEW Tiere. Auch im Vergleich mit den gesunden LEW-Rag1 Ratten zeigt sich dieses Bild (Abb. 27). Fast alle Tiere in dieser Gruppe wiesen mit LEW Ratten vergleichbare Werte auf. Um diese visuelle Gruppeneinteilung auf ihre Praktikabilität hin überprüfen zu können, wurde eine Korrelationsanalyse zwischen den Daten des adspektorisch erkennbaren klinischen Scorings und dem errechneten histologischen Gesamtscore durchgeführt (Kap 4.2.9). Diese ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,579. Demnach korreliert die subjektive Bewertung und Gruppeneinteilung mit den histologischen Ergebnissen hoch positiv, allerdings, wie bei subjektiver adspektorischer Beurteilung nicht anders zu erwarten, nicht perfekt. Demzufolge ist die Gruppeneinteilung retrospektiv als ausreichend genau zu bezeichnen. Es gilt: Je kränker die Tiere zu Beginn eingeschätzt wurden, desto stärker stellten sich auch die Veränderungen ihrer Organe in der Histologie dar. Diese leicht eingeschränkte Korrelation der Werte könnte dazu geführt haben, dass teilweise keine eindeutigen Ergebnisse im Vergleich gesunder und erkrankter LEW-Rag1 Ratten miteinander erzielt werden konnten. Augenscheinlich konnten, mittels der Einschätzung des klinischen Erscheinungsbildes, mild erkrankte Tiere oder Tiere, bei denen sich der klinische Zustand gerade zu ändern begann, nicht korrekt in die „kranke“ Gruppe eingeordnet werden. Sowohl die weiblichen als auch die männlichen LEW-Rag1 Ratten weisen als Jungtiere mit einem Alter bis von zu 60 Tagen die gleiche Gewichtsentwicklung wie die gleichalten LEW Ratten auf. Im weiteren Verlauf ähneln die Gewichte der weiblichen LEW-Rag1 Tiere weiterhin denen der Kontrollen, während die Gewichtsentwicklung der Böcke mit zunehmendem Alter weiter auseinander driftet. Die gesunden LEW-Rag1 Böcke erreichen dabei annähernd das Gewichtsniveau der Kontrolltiere, die erkrankten Tiere dagegen bleiben deutlich darunter (Abb. 10). Dies ist eine Entwicklung, die durchaus zu erwarten ist, da Tiere, dessen Allgemeinbefinden gestört ist, weniger Futter aufnehmen und die Energieressourcen des Körpers für andere Vorgänge als das Wachstum benötigt werden. Ein Grund dafür, dass 102 5 Diskussion bei den weiblichen Ratten diese Entwicklung nicht so augenscheinlich ist, kann deren natürlicherweise weniger steile Gewichtszunahmekurve sein. Bei der Analyse der verschiedenen Reproduktionsparameter ist es sinnvoll, den jeweiligen Colony Index zu errechnen. Dabei sieht man deutlich die höhere Reproduktionsleistung der Kontrolltiere im Vergleich mit der mittleren Reproduktionsleistung der LEW-Rag1 Ratten (Abb. 11). Betrachtet man die drei verschiedenen Haltungseinheiten gesondert, zeigen sich sehr große Unterschiede. Während die Reproduktivität der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 weniger als 50 % der Reproduktionsleistung der Kontrolltiere erreicht, gleicht sich dieser Parameter bei den keimfreien LEW-Rag1 Tieren und den Kontrolltieren. Diese Unterschiede können zum einen hygienebedingt sein, zum anderen aber auch durch besseres oder schlechteres Zuchtmanagement zustande kommen. Für ersteres spricht, dass, wie in Kap. 3.1.2 beschrieben, sich in der SPF3 Haltung die meisten (opportunistischen) Krankheitserreger befinden, weshalb die immundefizienten Ratten dort einem höheren Infektionsdruck ausgesetzt sind und dadurch ihre Fruchtbarkeit sinkt oder sie krankheitsbedingt früher aus der Zucht ausscheiden. Auch der Zuchtmanagementfaktor sollte nicht außer Acht gelassen werden, da sich in jeder Haltungseinheit anderes Tierpflegepersonal um die Tiere kümmert und dieses eventuell unterschiedliche Entscheidungen trifft. Zudem werden die keimfreien Tiere in durchsichtigen Isolatoren gehalten, weshalb sie größerer Unruhe in ihrer Umgebung ausgesetzt sein könnten. Die zu Beginn der Ergebnisse beschriebenen etwas längeren Zwischenwurfzeiten der LEW Weibchen lassen sich durch deren längere Nutzung in der Zucht erklären, da es sich hier um Durchschnittswerte handelt und sich die physiologische Zwischenwurfzeit mit zunehmendem Alter der Zuchttiere verlängert. 5.1.2 Unterschiede in der Leukozytenpopulation und damit zusammenhängende Effekte Betrachtet man die gesamten Leukozytenpopulationen der LEW und LEW-Rag1 Ratten vergleichend, zeigt sich, dass sich ihre Gesamtanzahlen im Blut unterscheiden (Abb. 28B). Tiere der keimfreien Haltung und der SPF4 besitzen geringere Anzahlen dieser Zellen als LEW, die Tiere der SPF3 besitzen geringgradig höhere Anzahlen. Durchweg sind in den Blutausstrichen der gesunden LEW-Rag1 Ratten deutlich weniger Leukozyten zu finden als 103 5 Diskussion in den Blutausstrichen der kranken Tiere. Geht man bei den beobachteten Krankheitssymptomen von einer generellen Aktivierung des Immunsystems oder einem infektiösen oder entzündlichen Geschehen aus, so ist dieses Ergebnis nicht verwunderlich, da eine Aktivierung immunologischer Vorgänge normalerweise eine Expansion der Immunzellen mit sich bringt. Durch eine größere Anzahl Mikroorganismen in der SPF3 Haltung erklärt sich die erhöhte Anzahl der Leukozyten in diesen Ratten. Bei der Auswertung der Differenzialblutbilder zeigen sich weitere Unterschiede. LEW-Rag1 Ratten besitzen anteilig unter den weißen Blutzellen deutlich weniger Lymphozyten und deutlich mehr neutrophile und eosinophile Granulozyten als LEW Ratten (Abb. 29). Besonders stark ausgeprägt ist dies bei den erkrankten LEW-Rag1 Tieren. Des Weiteren zeigen sich auch Unterschiede der Verhältnisse dieser beiden Zelltypen zueinander zwischen den drei Haltungseinheiten der LEW-Rag1 Ratten. Hierbei besitzen die Keimfreien den verhältnismäßig größten Anteil an Lymphozyten, mit Abstand gefolgt von den Tieren aus der SPF4. Am nächsten nähert sich das Zellverhältnis der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 einem Verhältnis von 1:1 an (Abb. 30). Wie schon an anderer Stelle aufgefallen ist (Kap. 4.1 und 4.2), scheint auch in diesem Punkt die am stärksten keimbelastete Haltung (SPF3) die deutlichsten Veränderungen hervorzurufen. Je größer der Infektionsdruck auf die untersuchten Tiere ist, desto weniger Lymphozyten und desto mehr neutrophile Granulozyten lassen sich in den Blutausstrichen nachweisen. Dies spiegelt sich auch in den beobachteten Pathologien der Organe wider: Je mehr Neutrophile und weniger Lymphozyten im Blut vorhanden sind, desto stärker sind die jeweiligen Tiere von den Krankheitssymptomen betroffen. Offen bleibt die Frage, ob sich in den LEW-Rag1 Ratten primär weniger Lymphozyten entwickeln konnten und deswegen sekundär bedingt die neutrophilen Granulozyten einen größeren prozentualen Anteil einnehmen. Oder ob die neutrophilen Granulozyten aufgrund einer gesteigerten Immunantwort expandiert sind und daraus ein geringerer Anteil Lymphozyten an der Gesamtzellpopulation resultiert. Betrachtet man die deutlich höhere Gesamtleukozytenzahl der Tiere aus der SPF3, so scheint letztere die wahrscheinlichere Möglichkeit zu sein. Diese These bedarf aber noch weiterer Abklärung. Zu einer Erhöhung der Anzahl der eosinophilen Granulozyten im Blut kommt es bei parasitären Infektionen oder allergischen Reaktionen (Wardlaw, Moqbel & Kay 1995). Dank strikter Hygienebarrieren und umfangreicher routinediagnostischer Maßnahmen kann ein parasitär 104 5 Diskussion bedingter Anstieg dieser Zellpopulation bei den LEW-Rag1 Ratten ausgeschlossen werden. Symptome einer allergischen Reaktion könnten auch auf ein autoimmunes Geschehen hindeuten. Auf die chemische Zusammensetzung des Blutes scheint der Gendefekt der LEW-Rag1 Ratten keinen Einfluss zu haben. Auch einzelne Organe wie die Lebern, Nieren, Bauchspeicheldrüsen und Herzen sind nicht so stark geschädigt, dass Auswirkungen davon im Blut messbar sind. Die Mengen der im Blutserum nachweisbaren Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren unterscheiden sich deutlich zwischen den Stämmen LEW und LEW-Rag1 (Kap. 4.3.4). Am stärksten ist diese Entwicklung wieder bei den LEW-Rag1 Tieren aus der SPF3 ausgeprägt, am schwächsten bei den keimfreien Tieren. Insgesamt sind die Werte aller LEW-Rag1 Ratten aber hochgradig erhöht, was auf ein allgemein angeregtes Immunsystem hindeutet. Die analysierten Proteine werden von verschiedenen Zelltypen (Lymphozyten, NK-Zellen, Monozyten, Makrophagen) und Organen (Niere, Leber, Knochenmark) gebildet. Sie sind für zahlreiche immunologische Regelkreise verantwortlich und wirken sowohl stimulierend als auch inhibierend (Dinarello 2000, Mire-Sluis, Thorpe 1998). Besonders stark erhöhte Werte wurden für die Stoffe IL-6, G-CSF und IFN-γ gemessen. Diese wirken vor allem proinflammatorisch (Cornish et al. 2009, Willenborg et al. 1999, Wong et al. 2001), was gut zu dem beobachteten Phänotyp der LEW-Rag1 Ratten passt. Der Vergleich des Vorkommens der Immunglobuline IgG und IgE im Blutserum der beiden Stämme zeigt, dass sich die nachgewiesenen Mengen an IgE nicht signifikant unterscheiden. IgG dagegen ist in deutlich geringerer Konzentration im Blutserum der LEW-Rag1 Ratten enthalten als in den Kontrolltieren (Kap. 4.3.3). Mit einem Anteil von ca. 75 % an den gesamten, im Körper vorkommenden Antikörpern macht das IgG den Großteil aus (Nezlin 1998). Da die LEW-Rag1 Ratten keine nachweisbaren reifen B-Zellen besitzen (Kap. 4.5), fehlt ihnen die antikörperproduzierende Zellfraktion. Somit lässt sich die um 98,6 % geringere Menge an IgG im Blut der LEW-Rag1 Ratten erklären. Sie besitzen damit gerade einmal 1,4 % des natürlicherweise vorkommenden IgG’s. Dieser Wert kann entweder durch eine sehr geringe Anzahl an nicht im FACS erfassbaren B-Lymphozyten entstanden sein, oder es handelt sich hierbei um kleine Ungenauigkeiten in der Analysetechnik. Letzteres könnte auch 105 5 Diskussion ein Grund für den nicht signifikanten Unterschied der IgE Mengen bei diesen beiden Stämmen sein. Nur 0,002 % aller im Organismus vorkommenden Antikörper gehören zum Typ IgE (Nezlin 1998), deshalb ist es denkbar, dass der durchgeführte ELISA nicht sensitiv genug war, um diese geringen Unterschiede darzustellen. Zu einem erhöhten IgE Spiegel kommt es beim Vorliegen einer parasitären Infektion oder einer allergischen Reaktion (Jarrett, Bazin 1974, Nezlin 1998). Dies sind dieselben Gründe, die auch zu einem Anstieg der eosinophilen Granulozyten im Blut führen, wie es bei den LEW-Rag1 Ratten der Fall ist. Hinsichtlich einer bei diesen Tieren auftretenden autoimmunen Reaktion wäre ein Anstieg des IgE’s im Serum bei diesen Tieren zu erwarten gewesen. Ein weiterer wichtiger Punkt, in dem sich die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten von den Lymphozyten der LEW Ratten unterscheiden, ist ihr Verhalten in der Zellkultur. Es konnten deutlich weniger lebende und vermehrt tote Zellen aus den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten isoliert werden und die Lymphozyten der LEW-Rag1 Tiere überleben deutlich kürzer im Verlauf der Kultivierung (Kap. 4.4.1 und 4.4.2). Dieses Phänomen wurde auch schon von Brugnoni et al. (1997) beschrieben. Sie führten es auf eine Hyperaktivierung der Lymphozyten in vivo zurück, die zu spontaner Apoptose durch reduzierte bcl-2 Genproduktexpression führt. Auch eine derbere Konsistenz einiger veränderter Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten und die dadurch erschwerte Aufarbeitung mit erhöhter mechanischer Irritation, kann zu einer erhöhten Zellsterblichkeit geführt haben. Im Blut und in den sekundären lymphatischen Organen (Milz, Lymphknoten) unterscheiden sich die Anteile im FACS darstellbarer Leukozytenpopulationen zwischen den Stämmen LEW und LEW-Rag1 deutlich. Zudem zeigen sich kleinere Unterschiede zwischen diesen drei in die Analyse einbezogenen Organsystemen. Die Aussage der in Kapitel 4.5 beschriebenen Ergebnisse ist eindeutig in sechs Punkten zusammenfassbar. Erstens: Die LEW-Rag1 Ratten besitzen 65-85 % weniger reife T-Zellen (CD3+CD4+, CD3+CD8+, αβTCR, NKT) im Blut und in der Milz als LEW Tiere. In den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten sind anteilig 50 % mehr reife T-Zellen nachweisbar als bei LEW. Zudem weisen die LEW-Rag1 Tiere ein verschobenes Verhältnis der zwei Hauptlymphozytentypen zueinander auf, wobei der Anteil der CD3+CD8+ Zellen (zytotoxische T-Zellen) steigt. Zweitens: Die LEW-Rag1 Ratten besitzen keine, im FACS mit einem Antikörper für CD45RA 106 5 Diskussion nachweisbaren, reifen B-Lymphozyten. Drittens: In allen drei Organsystemen zeigt ein deutlich größerer Anteil der T-Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten einen aktivierten/ regulatorischen Phänotyp (CD25+). Viertens: In den Lymphozytengates der LEW-Rag1 Ratten lassen sich deutlich mehr gleichzeitig für CD4 und CD8 positive Zellen nachweisen als in den Lymphozytengates der LEW Ratten. Fünftens: In allen drei Organsystemen der LEWRag1 Tiere ist ein deutlich größerer Anteil NK-Zellen zu finden als bei den LEW Ratten. Sechstens: Erkrankte LEW-Rag1 Ratten weisen meistens höhere Zellanzahlen auf als Gesunde. Zusätzlich ist im Blut und in den Milzen eine klare Tendenz dahingehend erkennbar, dass die Anteile der eben beschriebenen Zelltypen der LEW-Rag1 Ratten aus der SPF3 höher sind als die der anderen beiden Haltungseinheiten. Wie schon in den vorigen Kapiteln beschrieben, heben sich auch in diesem Punkt die Tiere dieser Haltungseinheit von den anderen beiden ab. Die FACS-Untersuchung des primären lymphatischen Organsystems anhand der Thymi der LEW-Rag1 Ratten zeigt ein ähnliches Bild wie die ersten vier beschriebenen Befunde im Blut und den sekundären lymphatischen Organen. In der Gruppe der gleichzeitig CD4 und CD8 tragenden Zellen kommen hauptsächlich Monozyten und Makrophagen vor (Baba et al. 2006), die, aufgrund zu geringer Größe, durch vorheriges Gaten nicht aus der Analyse exkludiert werden konnten. Da die LEW-Rag1 Ratten teilweise deutliche Entzündungssymptome zeigen, lässt sich ein vermehrtes Vorkommen dieser Zellen im Blut und den Organen erklären. Auch DP Lymphozytenvorläufer fallen in diese Gruppe. Physiologischerweise ist diese Lymphozytenpopulation nur im Thymus detektierbar (Germain 2002). Addiert man die Werte der CD3+CD4+ und CD3+CD8+ Zellen in den Lymphknoten einzelner LEW-Rag1 Tiere, so erhält man Werte, die über 100 % hinausgehen. Deshalb wird angenommen, dass einige T-Zellvorläufer ins Blut und dadurch in die lymphatischen Organe gelangt sind. Bei den in den LEW-Rag1 Ratten nachgewiesenen T-Zellen handelt es sich fast ausschließlich um αβTCR tragende T-Zellen. Eine Dominanz der γδ-T-Zellen, wie in der Literatur zu finden ist (Brugnoni et al. 1997), wurde hier nicht festgestellt. Die FACS Analyse der Vα- und Vβ-Rezeptortypen ergibt leichte Unterschiede zwischen den Anteilen der verschiedenen Typen am Gesamt-αβTCR, diese Unterschiede liegen allerdings sowohl bei 107 5 Diskussion LEW-Rag1 als auch bei LEW Ratten in gleichem Maße vor (Abb. 53). Einen Hinweis auf ein vorliegendes oligoklonales T-Zellrepertoire liefern diese Ergebnisse nicht. Das mutierte Rag1 scheint den Entwicklungsprozess der B-Lymphozyten weitgehender einzuschränken als die Entwicklung der T-Lymphozyten. Aufgrund der durch den Rag1 Gendefekt bedingten gestörten Lymphozytenreifung wandern keine reifen B-Lymphozyten aus dem Knochenmark aus, um die sekundären lymphatischen Organe zu besiedeln. Auf die T-Lymphozytenpopulation der LEW-Rag1 Ratten wirkt sich der Gendefekt dagegen anders aus. Einige T-Zellvorläufer durchlaufen den gesamten Reifungsprozess bis zum Ende, sei es im Thymus oder extrathymisch (Signorini et al. 1999), sodass sie dann als reife, zum Teil aktivierte T-Lymphozyten im Blut und den sekundären lymphatischen Organen nachweisbar sind. Grund dafür kann zum einen eine somatische Reversion der Mutation in den TZellprogenitoren sein1. Dies setzt eine Rag1 Nullmutante voraus. Zum anderen könnte es sich bei der LEW-Rag1 Ratte um eine hypomorphe Mutante handeln, was bedeuten würde, dass das Rag1 dieser Tiere noch eine gewisse Restaktivität aufweist, wie auch Khiong et al. (2007) bei ihrem Mausmodell mit unvollständigem Rag1-KO zeigen. In diesen beiden Fällen wären die nachweisbaren T-Zellen autolog. Eine weitere Erklärung für das Vorhandensein reifer TZellen in den LEW-Rag1 Ratten könnte die materno-fötale Transfusion maternaler T-Zellen sein. Dieses Phänomen wurde häufig bei Kindern mit Rag1 Defekten beschrieben (Villa et al. 2001) und könnte auch eine Erklärung für die an eine Graft versus Host Erkrankung erinnernden Krankheitssymptome bieten (Conley et al. 1984, Thompson, O'Connor & Bastian 1984). Da die somatische Reversion einer Mutation ein Zufallsereignis ist, müssten sich in der analysierten LEW-Rag1 Population Tiere finden lassen, die weder B- noch T-Zellen beherbergen. Andere Tiere dieser Population wiederum müssten eine gewisse Anzahl an reifen T-Lymphozyten aufweisen, die dann oligoklonal wären. Da aber in ausnahmslos allen analysierten Ratten eine gewisse Anzahl an T-Lymphozyten nachgewiesen wurde, kann eine T-Zellentwicklung aufgrund somatischer Reversion der Mutation nahezu ausgeschlossen werden, es sei denn, die somatische Reversion hätte schon in den Gründertieren der LEWRag1 Zucht stattgefunden. Eine materno-fötale Transfusion von T-Zellen ist eher bei 1 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Dr. K. Schwarz, Prien am 9. Oktober 2014. 108 5 Diskussion Einzeltieren zu erwarten. Dass T-Zellen von Muttertieren auf ihren Nachwuchs weitergegeben werden, ist in Einzelfällen möglich. Dass dies aber in einer gesamten Population durchgängig der Fall sein soll, erscheint sehr unwahrscheinlich und ist aufgrund der Inzucht über mehrere Generationen hinweg nahezu auszuschließen. Um dieses Phänomen endgültig ausschließen zu können, sind weitere Tests nötig (Kap. 5.4). Am Wahrscheinlichsten erscheint die zweite Hypothese, in der angenommen wird, dass es sich, bei der eigentlich als Rag1 KO generierten LEW-Rag1 Ratte, um eine hypomorphe Mutante mit einer gewissen Restaktivität im Rag1 handelt. Diese Hypothese belegen zum einen die durchweg verminderten Mengen nachweisbarer Lymphozyten im FACS und zum anderen die sowohl im Blutausstrich als auch im histologischen Präparat zu findenden mononukleären Zellen. Auch die zwar dysplastischen, aber trotzdem vorhandenen Thymi der LEW-Rag1 Ratten spielen hier eine Rolle. Schlussendlich konnten mit den bisherigen Analysen keine Hinweise auf Oligoklonalität des TCR Repertoires festgestellt werden. Diese Möglichkeit kann aber zu diesem Zeitpunkt nicht vollständig ausgeschlossen werden und bedarf weiterer Abklärung. Die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten unterscheiden sich nicht nur in ihrem Verhalten in der Zellkultur und in ihrer Ausprägung der Oberflächenmoleküle von den LEW Lymphozyten, sondern auch in ihrem Verhalten bei Antigenkontakt. Wie Abbildung 33 zu entnehmen ist, reagieren weder die Lymphozyten der LEW Ratten noch die Lymphozyten der LEW-Rag1 Ratten auf das in der gemischten Leukozytenkultur substituierte Isoantigen. Den kompletten Ausschluss einer autoimmunen Beteiligung am Krankheitsgeschehen der LEWRag1 Tiere rechtfertigt dieses Ergebnis jedoch nicht. Bei den beobachteten Krankheitssymptomen kann es sich durchaus teilweise um autoimmune Symptome handeln, da sie auch in keimfreier Umgebung auftreten. Gegenüber substituiertem Alloantigen und Xenoantigen zeigen die T-Zellen der LEW-Rag1 Tiere die gleiche proliferative Aktivität. Diese bleibt jedoch deutlich hinter der Immunantwort der LEW Lymphozyten zurück. Die TZellen der LEW-Rag1 Ratten sind also in der Lage, Antigene zu erkennen und auf diese zu reagieren. Allerdings erfolgt ihre Reaktion deutlich schwächer, als dies bei einem intakten Immunsystem der Fall wäre. Dieses Ergebnis könnte laut Brugnoni et al. (1997) auf einen „Aktivierungs-induzierten Zelltod“ zurückzuführen sein. Einen weiteren Grund könnte eine verminderte funktionelle Diversität des TCR Repertoires bilden, wodurch es nur wenigen 109 5 Diskussion Lymphozyten möglich ist, effektiv die substituierten Antigene zu erkennen und darauf zu reagieren. Die LEW-Rag1 Ratten weisen im Vergleich zu den Kontrolltieren signifikant erhöhte Anteile der NK-Zellen an der Leukozytenpopulation auf. Deshalb ist es möglich, dass auch weitere ILCs vermehrt in den LEW-Rag1 Ratten vorkommen und sich dadurch ein Teil der Pathologie (Organinfiltrationen, graft-versus-host ähnliche Reaktionen) erklären lässt. Diese dem Knochenmark entspringende Population lymphozytenähnlicher Zellen des angeborenen Immunsystems produziert für sie charakteristische Zytokine (IFNγ, TNF, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, IL-22). Außerdem erkennen sie infizierte Zellen und spielen eine Rolle bei Entzündungsprozessen, allergischen Reaktionen und der intestinalen Homöostase (Abbas et al. 2015, Walker, Barlow & McKenzie 2013). Ein Beweis für die Involvierung dieser Zellpopulationen in den Phänotyp der LEW-Rag1 Ratten konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, sollte aber in zukünftigen Studien untersucht werden (Kap. 5.4). 5.1.3 Unterschiede der homozygoten und heterozygoten Träger des Gendefektes Die in dieser Arbeit durchgeführten Analysen führen zu dem Ergebnis, dass sich nicht nur die homozygoten Träger des Rag1 Defektes von den LEW Tieren unterscheiden. Nicht ganz so offensichtlich ist, dass sich auch Ratten, die diesen Gendefekt nur auf einem Allel tragen, vom LEW Stamm unterscheiden. Wie in Abbildung 27 deutlich wird, entwickeln sie keine charakteristischen Krankheitssymptome und auch an den Organen sind keine histologischen Veränderungen sichtbar (Abb. 25). Dennoch unterscheidet sich auch bei ihnen die im FACS nachweisbare Lymphozytenpopulation von den LEW Tieren. Die durchschnittliche Anzahl ihrer reifen B-Zellen, reifen T-Zellen, aktivierten/regulatorischen T-Zellen und NK-Zellen liegt zwischen den Werten von LEW und LEW-Rag1 Ratten. Es scheinen also bei heterozygoten Trägern des Gendefektes weniger B- und T-Zellen heranreifen zu können als bei LEW, das Immunsystem bietet diesen Tieren aber in einer spezifisch pathogenfreien Umgebung einen genügenden Schutz. Makroskopisch und histologisch manifestiert sich keine Erkrankung. 110 5 Diskussion 5.2 Vergleich der LEW-Rag1 Ratte mit anderen Maus- und Rattenmodellen In Kapitel 2.3 wurden die wichtigsten Rag defizienten Mausmodelle vorgestellt. Da die Gene Rag1 und Rag2 nur in Kombination miteinander ihre Funktion erfüllen können, reicht die Dysfunktion eines dieser beiden Gene aus, um eine Immundefizienz auszulösen. Die von Mombaerts et al. (1992) generierte Rag1 defiziente Maus weist, analog zu der hier charakterisierten LEW-Rag1 Ratte, sehr kleine und zellarme lymphatische Organe auf. Sowohl in diesen als auch im Blut konnten die Wissenschaftler keine reifen B- und TLymphozyten nachweisen. Darin unterscheidet sich das Mausmodell von Mombaerts et al. (1992) grundlegend von der LEW-Rag1 Ratte. Des Weiteren sind diese Mäuse vital und fertil und lassen sich während des gesamten Studienzeitraumes visuell nicht von ihrem WT unterscheiden (Mombaerts et al. 1992a, Mombaerts et al. 1992b). Ganz im Gegenteil zu den LEW-Rag1 Ratten, bei denen ca. 60 % aller Tiere mit einem Alter von 7-12 Wochen eine gerötete, schuppige, haarlose Haut entwickeln, gefolgt von Gewichtsabnahme und zahlreichen weiteren inflammatorischen Veränderungen der inneren Organe. Den gleichen Immunophänotyp wie Mombaerts et al. (1992) beschrieben auch Shinkai et al. (1992) bei einer Rag2 defizienten Maus. Die Mäuse von Mombaerts et al. (1992) wurden in keimfreien Isolatoren gehalten, um Infektionen vorzubeugen. Die andere Arbeitsgruppe macht dazu keine Angaben. Der essentielle Unterschied dieser beiden Mausmodelle von der LEW-Rag1 Ratte liegt darin, dass bei der Genmodifikation der Mäuse ein weitaus größerer Teil des Rag modifiziert wurde und es dadurch zu einem kompletten Funktionsverlust des Rag1 oder Rag2 kam. Mombaerts et al. (1992) generierten eine 1356 bp große Deletion der Coding Sequenz des Rag1, was mehr als einem Drittel der gesamten Genlänge entspricht. Dementsprechend verliert das komplette Gen seine Fähigkeit, ein intaktes RAG1 Protein zu generieren. Ähnlich verhält es sich auch bei der durch Shinkai et al. (1992) generierten Rag2 Mutation. Bei dem 527 Aminosäuren langen RAG2 Protein erfolgte eine Deletion der für 286 Aminosäuren codierenden Bereiche, was mehr als der Hälfte des Gens entspricht. Somit handelt es sich bei beiden Mausmodellen um Nullmutanten und einem daraus resultierenden kompletten Ausfall der B- und T-Lymphozytenreifung. Dahingegen besitzt die LEW-Rag1 Ratte nur eine 4 bp lange Deletion an Position 5246-5249. Diese führt zu einem verfrühten Stopcodon, sodass nur die ersten 198 Aminosäuren des N-Terminus generiert werden können. Der übrig bleibende Teil gehört nicht zur Core Region (Abb. 2), wodurch kein funktionsfähiges Protein vorhanden 111 5 Diskussion sein dürfte (Zschemisch et al. 2012). Trotzdem unterscheiden sich die Mausmodelle und die LEW-Rag1 Ratten deutlich. Im Gegensatz zu den eben aufgeführten Rag-Nullmutanten sind auch Mausmodelle vorhanden, die der LEW-Rag1 Ratte weitaus stärker ähneln. Dies ist zum einen eine spontane Rag1 Mutante einer C57BL/10 Maus mit partieller Rag1 Aktivität. Die von Khiong et al. (2007) beschriebenen Tiere zeigen, zusätzlich zu einer geröteten Haut, sowohl eine Hepatosplenomegalie und Eosinophilie als auch erhöhte IgE Serumlevel, oligoklonal expandierte CD4+ T-Zellen und unnatürlich hohe Anzahlen an „memory-phenotype“ TZellen. Zum anderen generierten Marella et al. (2007) einen Mausstamm mit einem Aminosäureaustausch im Rag2. Diese Tiere zeigen ein oligoklonales T-Zellrepertoire, verminderte Zahlen an NKT-Zellen und aktivierten T-Zellen, periphere Eosinophilie und ein völliges Fehlen zirkulierender B-Zellen. Darm und Haut sind mit aktivierten T-Zellen infiltriert, was zu Durchfall, Alopezie und, in manchen Fällen, zu schwerer Erythrodermie führt (Marrella et al. 2007, Marrella et al. 2008). Gemeinsamkeiten mit den LEW-Rag1 Ratten bilden hier die Erythrodermie mit Alopezie, die vermehrte Anzahl von eosinophilen Granulozyten im Blut, die verminderte Anzahl NKT-Zellen und das völlige Fehlen zirkulierender B-Zellen. Auch Infiltrate mononukleärer Zellen sind bei den LEW-Rag1 Ratten im Darm und in der Haut zu finden. Ob es sich dabei allerdings auch um aktivierte T-Zellen handelt, ist zurzeit noch unklar. Die LEW-Rag1 Ratten beherbergen zudem auch noch Zellinfiltrationen in vielen anderen Organen, welche zusätzlich auch durch polymorphkernige Zellen gekennzeichnet sind. Des Weiteren konnten die oben beschriebenen erhöhten IgE Level und oligoklonalen T-Zellen bei den LEW-Rag1 Tieren nicht bestätigt werden (Kap. 5.1). Analog zu dem von Marella et al. (2007) beschriebenen Gendefekt liegt auch bei den Mäusen von Khiong et al. (2007) ein durch eine Punktmutation entstandener Aminosäureaustausch vor. Durch ein in vitro Rekombinationsassay wiesen diese Wissenschaftler eine Restaktivität des Rag1 von 12 % nach. Den Phänotyp ihrer Mäuse führen sie auf eine Dysfunktion IL-4 und IL-6 produzierender CD4+ Lymphozyten zurück. Auch die LEW-Rag1 Ratte produziert abnorm viel IL-6 (Kap. 4.3.4). Villa et al. (2008) führen den Phänotyp dieser Mausmodelle 112 5 Diskussion zusammenfassend auf eine verminderte zentrale Toleranz, eine gestörte Entwicklung der regulatorischen T-Zellen und eine homöostatische T-Zellproliferation zurück. Im Gegensatz zu Mausmodellen gibt es kaum Rag defiziente Rattenmodelle. Das stellte einen Grund für die Generierung der LEW-Rag1 Ratte dar. Durch ihre größeren Körpermaße eignen sich Ratten deutlich besser für klinische Studien, die Handling und chirurgische Eingriffe beinhalten, als Mäuse. Das lässt Rag1 defiziente Ratten, besonders für Transplantationsstudien, gegenüber Mausmodellen in den Vordergrund treten. Die Firma SAGE stellt Wissenschaftlern eine Rag1 defiziente Sprague-Dawley (SD) Ratte zur Verfügung. Diese wurde mit derselben Technik generiert wie die LEW-Rag1 Ratte, weist allerdings eine 29 bp lange Deletion in diesem Gen auf. Durchflusszytometrische Analysen zeigen einen nahezu kompletten B-Zellverlust, es lassen sich aber noch ca. 5 % CD4+ Lymphozyten und 2,5 % CD8+ Lymphozyten im Blut dieser Ratten nachweisen (SAGE Labs 2015). Dies ist etwas weniger als bei den LEW-Rag1 Ratten (7,2 % und 2,8 %), aber es ist auch hier eine Differenz zu den Mausnullmutanten zu erkennen. Da eine vollständige phänotypische Charakterisierung dieses Rattenmodells noch fehlt, sind keine weiteren Vergleiche möglich. Für Studien mit einer Rag1 defizienten Ratte könnte sich ein auf dem LEW Stamm basierendes Tiermodell eventuell besser eignen, da es sich hierbei um einen Inzuchtstamm, und nicht wie bei SD um einen Auszuchtstamm, handelt. Mit Hilfe von Meganukleasen haben Ménoret et al. (2013) ebenfalls eine Rag1 defiziente Ratte generiert. Sie beschreiben sie selber als Rag1-KO und haben ihn auch phänotypisch charakterisiert. Die Tiere weisen eine 5 bp große Deletion, bestehend aus einer 8 bp Deletion und einer 3 bp Insertion, bei Aminosäure 245 auf, gefolgt von einem Stopcodon an Position 751. Wie es auch bei Zschemisch et al. (2012) der Fall war, konnten Ménoret et al. (2013) kein RAG1 Protein im Thymus mittels Western Blot nachweisen. Des Weiteren zeigt deren Rattenmodell signifikant kleinere lymphatische Organe und verminderte totale Zellzahlen dieser, wie es auch bei der LEW-Rag1 Ratte der Fall ist. Die einzige Ausnahme bildet dabei die Milzgröße, welche bei LEW-Rag1 annähernd unverändert zu den LEW Ratten ist. Abgesehen davon, dass die FACS Analysen der WT Ratten von Ménoret et al. (2013) andere Werte ergeben als die von LEW, gleicht sich die Reduktion der CD4+ und CD8+ T-Zellen in der Milz und im Thymus dieser beiden Rag1 defizienten Modelle. Im Gegensatz zur LEW- 113 5 Diskussion Rag1 konnten die Wissenschaftler bei der Rag1 defizienten SD Ratte noch einen, wenn auch sehr kleinen, Anteil an B-Zellen in der Milz und im Knochenmark nachweisen. Im Blut, in der Milz und in den Lymphknoten der LEW-Rag1 Ratten war dies nicht der Fall, jedoch gleichen sich die zur Analyse herangezogenen Antikörper und Auswertstrategien zum BZellnachweis in diesen beiden Studien nicht. Des Weiteren beschrieben Ménoret et al. (2013) ihre NK-Zellpopulation als normal, wohingegen die LEW-Rag1 Ratte eine deutliche Vergrößerung dieser Population zeigt. Die verminderten Immunglobulinlevel können nur für IgG bestätigt werden. Ähnlich zu den LEW-Rag1 Ratten zeigen auch die Rag1 defizienten SD Ratten eine verminderte Reaktion beim Kontakt mit Alloantigenen. Bei beiden Rattenstämmen ist also noch eine Immunantwort in abgeschwächter Form zu beobachten, diese lässt sich allerdings bei der LEW-Rag1 Ratte deutlicher auf die T-Lymphozyten zurückführen. Trotzdem scheint es unbestritten, dass auch die beschriebenen Rag1 defizienten SD Ratten noch funktionierende T-Zellen besitzen. Aussagen über deren Aktivitätsstaus fehlen in der Literatur allerdings. In allen Veröffentlichungen über die in diesem Kapitel beschriebenen Tiermodelle wurden Angaben über die genauen Veränderungen des Rag oder dessen Protein gemacht. Während die klinisch gesund erscheinenden Mäuse von Mombaerts et al. (1992) komplett keimfrei gehalten wurden, lebten die beiden letztgenannten Mausstämme, die Symptome entwickeln, in spezifisch pathogenfreien Haltungen. Bedauerlicherweise wird der Leser über die hygienischen Bedingungen der Haltungen der Ratten von Ménoret et al. (2013) und der Mäuse von Shinkai et al. (1992) im Unklaren gelassen. Es zeigt sich aber bei den keimfrei gehaltenen LEW-Rag1 Ratten, im Vergleich zu anderen Rag1 defizienten Tieren, ein sehr schwerer und degenerativer Krankheitssymptomkomplex, welcher nur in Teilen anderen Modellen gleicht. Zudem könnte die LEW-Rag1 Ratte sich als Modell für klinische Studien, in denen Handling und chirurgische Eingriffe notwendig sind, besser eignen als Mausmodelle mit wesentlich geringerer Körpergröße. Dazu zählen vor allem Transplantationsstudien. Zu guter Letzt handelt es sich bei der LEW-Rag1 Ratte um einen Inzuchtstamm, was ihr hinsichtlich besserer Standardisierbarkeit von Studien, den anderen beiden Rag1 defizienten Rattenstämmen gegenüber einen Vorteil verschafft. 114 5 Diskussion 5.3 Übertragbarkeit des LEW-Rag1 Phänotyps auf das Omenn Syndrom Wie Aitman et al. (2008) feststellen, ist die Ratte eine physiologisch und experimentell wichtige Spezies, die gegenüber Mausmodellen nicht ins Hintertreffen geraten sollte. So eignen sich immundefiziente Rattenmodelle aufgrund ihrer größeren Körpergröße besser für bestimmte Studien als Mäuse. Beim OS handelt es sich um eine schwere Immundefizienzerkrankung (Kap. 2.2.2), deren pathogenetische Mechanismen immer noch nicht vollständig geklärt sind (Villa et al. 2008) und für die es bis dato, außer einer Knochenmarktransplantation oder der Transplantation von Stammzellen aus Nabelschnurblut, keine erfolgreichen Therapiemaßnahmen gibt (Aleman et al. 2001, Hönig, Schwarz 2006). Ob die LEW-Rag1 Ratte als potentielles Rattenmodell für das OS geeignet ist, soll in diesem Kapitel diskutiert werden. Typische Symptome des OS sind chronischer Durchfall, Pneumonien und andere schwere Infektionen, gefolgt von Entwicklungsstörungen, die sich durch vermindertes Wachstum bemerkbar machen (Villa et al. 2008). Dabei muss bedacht werden, dass sich die betroffenen Kinder in einer normalen, mit zahlreichen Keimen belasteten Umwelt aufhalten und deshalb viele der angesprochenen Symptome infektiöser Natur sein können. Trotzdem werden keine Zellinfiltrate in weiteren Organen beschrieben, die bei den LEW-Rag1 Ratten einen wichtigen Teil des Krankheitsbildes ausmachen. Demgegenüber werden bei OS Patienten vergrößerte lymphatische Gewebe (z.B. Hepatosplenomegalie), Thymusdysplasie, Erythrodermie, Alopezie und Eosinophilie beobachtet. Alle Immunglobulinlevel stellen sich erniedrigt dar, nur das IgE ist erhöht (Hönig, Schwarz 2006, Kato et al. 2006, Villa et al. 1999, Villa et al. 2008). Auch die LEW-Rag1 Ratte entwickelt Alopezie, gerötete Haut, eine Eosinophilie des Blutes und infektionsähnliche Symptome der Atemwege und des Gastrointestinaltraktes. Dazu kommen vergrößerte Lymphknoten bei erkrankten Tieren sowie bei allen Tieren eine Thymusdysplasie. Auch die bei der LEW-Rag1 Ratte gefundenen erniedrigten IgG Level stimmen mit den Symptomen des OS überein, wohingegen erhöhte IgE Level nicht nachgewiesen werden konnten. Der Anteil reifer T-Zellen im Blut kann beim OS sowohl normal sein als auch erhöht (Villa et al. 1999) und es handelt sich dabei um oligoklonale, aktivierte Lymphozyten mit einem eingeschränkten TCR Repertoire, hauptsächlich vom Th2-Typ und einer verschobenen 115 5 Diskussion CD4+/CD8+ Ratio (Schandene et al. 1993, Signorini et al. 1999). Diese Zellen zeigen in vitro eine verminderte proliferative Antwort auf Mitogene. Die einzige Aussage, die bis jetzt für die T-Zellen der LEW-Rag1 Tiere getroffen werden kann, ist, dass diese Ratten signifikant geringere T-Zellanzahlen im Blut und der Milz aufweisen, von denen ein größerer Anteil aktiviert ist und die ähnlich dem OS ein verschobenes Verhältnis von CD4+ zu CD8+ Lymphozyten aufweisen. Ob es sich dabei um oligoklonale Zellen mit eingeschränktem Rezeptorrepertoire handelt, konnte noch nicht bestätigt werden (Kap. 4.5.3). Die in vitro Stimulierbarkeit der T-Lymphozyten durch Antigene ist analog zum OS auch bei den LEWRag1 Ratten vermindert. Beide Symptomkomplexe beinhalten ein nahezu komplettes Fehlen von B-Zellen (Aleman et al. 2001). Während OS Patienten normale bis erhöhte NK-Zellwerte bei normaler Zellfunktion aufweisen (Aleman et al. 2001, Villa et al. 2008), kommen diese Zellen anteilsmäßig im Blut der LEW-Rag1 Ratten durchschnittlich um das Dreifache erhöht vor. Dies muss allerdings keine absolute Erhöhung der NK-Zellanzahl bedeuten, da, wie eben beschrieben, die Anzahl der Lymphozyten im Blut vermindert ist und somit anteilsmäßig die NK-Zellen bei den LEW-Rag1 Ratten häufiger vertreten sind. Somit ähneln sich die NKZellpopulationen der an OS erkrankten Patienten und der LEW-Rag1 Ratten. Die das OS auslösenden Rag Defekte entstehen in den häufigsten Fällen durch Aminosäureaustausche, seltener durch in-frame Deletionen (Sobacchi et al. 2006). Dadurch wird das Leseraster nicht verschoben und die V(D)J-Rekombination lediglich abgeschwächt. Das Gen verliert also nicht seine komplette Funktion und es wird ein zumindest teilweise funktionsfähiges Protein synthetisiert. Obwohl es sich bei dem Gendefekt der LEW-Rag1 Ratte mit 4 bp um eine Mutation mit Verschiebung des Leserasters handelt (Zschemisch et al. 2012), so scheint auch bei diesem Rattenstamm noch eine verminderte V(D)J-Rekombination vorzukommen, wodurch noch ein gewisser Anteil reifer T-Zellen in den Tieren nachgewiesen werden kann. Das OS und der Symptomkomplex der LEW-Rag1 Ratten gleichen sich in vielen Punkten im Hinblick auf die funktionellen Eigenschaften der T-Zellpopulationen und die Ausprägung der Krankheitssymptome. Die LEW-Rag1 Ratten weisen viele der beschriebenen Symptome auch in einer keimfreien Umwelt auf. Jedoch scheinen vorhandene Umweltkeime das Krankheitsbild negativ zu beeinflussen. Auch die im Verlauf des OS auftretenden Symptome 116 5 Diskussion sind teilweise auf (fakultativ) pathogene Erreger im Zusammenspiel mit einem geschwächten Immunsystem zurückzuführen (Villa et al. 2008). Einen weiteren Anteil machen auch dort autoimmune Reaktionen aus (Hönig, Schwarz 2006, Villa et al. 2008). Trotz alledem gleichen sich die Symptomkomplexe der LEW-Rag1 Ratten und der OS Patienten nicht vollständig. Patienten mit dem OS besitzen deutlich höhere Anzahlen reifer TLymphozyten im Organismus als die LEW-Rag1 Ratten. Auch scheinen aus histologischer Sicht bei der LEW-Rag1 Ratte deutlich mehr Organe involviert zu sein, als dies bei Menschen mit dem OS beschrieben ist. Als Modell für das OS eignet sich die LEW-Rag1 Ratte zu diesem Zeitpunkt von allen verfügbaren Rattenmodellen am besten. Die Mausmodelle mit unvollständigem Rag-KO weisen allerdings einen ähnlicheren Gendefekt und größere Gemeinsamkeiten der T-Lymphozytenpopulationen mit OS-Patienten auf. 5.4 Ausblick Wie schon in den vorherigen Kapiteln angesprochen wurde, bleiben für eine vollständige Charakterisierung der LEW-Rag1 Ratte noch zahlreiche Fragen, sowohl auf phänotypischer als auch auf genotypischer Ebene, offen. So ist zum Beispiel laut Zschemisch et al. (2012) das in der LEW-Rag1 Ratte synthetisierte RAG1 Protein so kurz, dass die komplette Core Region nicht mehr vorhanden ist und somit das Protein eigentlich seine komplette Funktion verlieren müsste. Trotzdem sind im Blut und in den sekundären lymphatischen Organen dieser Tiere reife T-Lymphozyten nachweisbar und auch eine, wenn auch verminderte, Reaktion auf Antigene lässt sich feststellen. Gründe dafür wurden in Kapitel 5.1.2 diskutiert. Um endgültig eine Aussage über die Herkunft dieser T-Zellen treffen zu können, sollten zum Ausschluss einer materno-fötalen Transfusion per FACS gesortete T-Zellen männlicher Tiere auf einen weiblichen Chromosomensatz überprüft werden (Conley et al. 1984) und funktionelle V(D)JAssays zum Nachweis einer eventuellen Restaktivität des Rag1 durchgeführt werden (Hesse et al. 1987, Lieber et al. 1987, Gauss et al. 1998). Des Weiteren wäre es hilfreich, über den 4 bp Deletionsbereich in gesorteten T-Zellen mehrerer LEW-Rag1 Ratten der derzeitigen Generationen zu sequenzieren, um sicher zu gehen, dass keine somatische Reversion stattgefunden hat. Auch wäre es hilfreich, das ganze Rag1 erneut zu sequenzieren, um eventuelle kompensatorische Mutationen, die den reading frame wiederherstellen können, 117 5 Diskussion auszuschließen2. Zur vertiefenden phänotypischen Charakterisierung ist eine genauere Analyse des TCR Repertoires nötig. Nachdem die Ergebnisse der MLC Hinweise auf eine verminderte funktionelle Diversität der TCR geben, kann dieses Ergebnis mithilfe struktureller Analysen gestützt werden. Hinweise zur strukturellen Diversität des TCR Repertoires kann neben den FACS Analysen auch eine Klonierung mit anschließender PCR geben (Signorini et al. 1999). Darin wäre ein oligoklonales TCR Repertoire anhand unterschiedlicher Banden zu erkennen. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit nicht explizit eine Eosinophilie im Gewebe der Ratten nachgewiesen werden. Hierzu fehlt eine Unterscheidungsmöglichkeit der im histologischen Bild sehr eosinophil erscheinenden neutrophilen bzw. eosinophilen Granulozyten in der H&E-Färbung. Unterscheidungshilfen könnten hier immunhistochemische Färbungen bieten. Auch die FACS Analysen könnten noch etwas differenzierter betrieben werden. Hierzu würde sich eine Dreifachfärbung von CD3, CD4 und CD8 anbieten, um eventuell vorkommende DP Lymphozyten sicher zu erkennen. Auch die Populationen regulatorischer und aktivierter T-Lymphozyten ließen sich mit Hilfe eines veränderten Färbeprotokolls besser abgrenzen. Zusätzlich könnte eine differenziertere Betrachtung der mononukleären Zellen und deren Verteilung im Organgewebe mittels Immunhistochemie durchgeführt werden. Um einen Einfluss der ILCs auf den Phänotyp der LEW-Rag1 Ratten nachweisen zu können, ist es nötig, ihr Vorkommen explizit in den betroffenen Organen und im Blut nachzuweisen. Dies könnte mithilfe durchflusszytometrischer Analysen und dem Nachweis charakteristischer Zytokine in den Geweben geschehen. Abschließend könnte auch das Knochenmark der LEW-Rag1 Ratten, sowohl immunhistochemisch als auch durchflusszytometrisch, genauer analysiert werden, um Aussagen über Vorläufer der B-Zellpopulation treffen zu können, wie es unter anderem auch Ménoret et al. (2013) getan haben. 2 Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Dr. K. Schwarz, Prien am 9. Oktober 2014. 118 6 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Katharina Schulz Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte. Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell. Die Gene Rag1 und Rag2 sind unerlässlich für die Reifung der Lymphozytenvorläufer zu Tund B-Zellen. Sie bewirken eine effiziente Rekombination der Gene der Antigenrezeptoren und Immunglobulinmoleküle und sorgen somit für deren große Diversität und Antigenspezifität. Sind diese Gene in ihrer Funktion gestört, kommt es zur Ausprägung zahlreicher Immundefizienzerkrankungen, für die es nur wenige Therapiemöglichkeiten gibt. Zu diesen zählt auch das humane Omenn Syndrom. Das Hauptziel dieser Arbeit bildet die phänotypische Charakterisierung der Rag1 defizienten LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte. Weiterführend wurde dieses Rattenmodell mit weiteren Rag defizienten murinen Tiermodellen verglichen und seine Verwendbarkeit als Modell für das Omenn Syndrom überprüft. Dazu wurde zum einen die klinische Ausprägung dieses Gendefektes analysiert und zum anderen dessen Einfluss auf die Lymphozytenpopulation in dieser Ratte untersucht. Aus diesen Analysen kann geschlussfolgert werden, dass die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratten im Alter von 7 bis 12 Wochen zahlreiche klinische Symptome entwickeln. Dazu zählen Hautrötung und –schuppung, Alopezie, Durchfall, Infektionen der Atemwege, Gewichtsverlust und Thymusdysplasie. Im histologischen Bild zeigen sich diffuse Infiltrationen mit Entzündungszellen in den lymphatischen Organen, den Lungen, Lebern, Speicheldrüsen, dem Gastrointestinaltrakt und der Haut. Im Blut und den lymphatischen Organen der Rag1 defizienten Ratten sind keine reifen B-Zellen nachweisbar. Die Anzahl der T-Lymphozyten ist signifikant vermindert. Diese Zellen weisen einen vermehrt aktivierten Phänotyp auf und zeigen in vitro eine verminderte Immunreaktion beim Kontakt mit Antigenen. Der Anteil der NK-Zellen in diesen Tieren ist erhöht. Des Weiteren weisen sie verminderte IgG Level und erhöhte Zytokinkonzentrationen im Blutserum sowie eine Eosinophilie im Blut auf. 119 6 Zusammenfassung Bis auf wenige Ausnahmen nähert sich dieser Phänotyp stark dem des Omenn Syndroms an. Im Hinblick auf die Verwendbarkeit eines Tiermodells für diese Krankheit eignet sich die LEW/Ztm-Rag1em1Ztm Ratte gegenüber den anderen verfügbaren Rattenmodellen am besten. In der Zukunft sollte der genaue Mechanismus geklärt werden, aufgrund dessen es zu der Entwicklung einer eingeschränkten T-Zellpopulation in diesem Rattenstamm kommt. 120 7 Summary 7 Summary Katharina Schulz Characterization of the LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rat. A new immunodeficient animal model. The genes Rag1 and Rag2 are essential for the maturation of immature lymphocytes to mature B and T cells. They induce an efficient gene recombination of antigen receptors and immunoglobulin molecules, leading to a large diversity and antigen specificity. Malfunction of these genes leads to a large number of immune deficiency diseases with a rare number of therapies. One of these is the human Omenn Syndrome. The main objective of this work is the phenotypical characterization of the Rag1 deficient LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rat. Furthermore, this rat model was compared with other murine Rag deficient animal models and its suitability for modelling the human Omenn Syndrome was verified. To ensure these points, the clinical manifestation of the gene defect and the influence of the gene defect on the lymphocyte population of these rats were analyzed. It can be concluded, that the LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rats develop clinical symptoms like reddened and scabby skin, alopecia, diarrhea, respiratory tract infections, failure to thrive, eosinophilia and thymus dysplasia at 7 to 12 weeks of age. The histological analysis shows diffuse infiltrations with inflammatory cells of the lymphatic organs, the lungs, liver, salivary glands, the gastrointestinal tract and the skin. The blood and the lymphoid organs reveal a total lack of B cells and a significantly reduced number of mature T cells. An increased number of these T cells show an activated phenotype and the T cells show a decreased immune response to antigens in vitro. The amount of NK cells in these animals is elevated. Furthermore, they exhibit reduced serum levels of IgG and elevated serum levels of cytokines. Apart from a few numbers of exceptions this phenotype resembles tightly the Omenn Syndrome. The LEW/Ztm-Rag1em1Ztm rat is therefore seen as the best rat model for Omenn Syndrome. 121 7 Summary Prospectively the mechanism should be investigated, which leads to the residual population of T lymphocytes in this rat. 122 8 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. & Baker, D.L. 2015, Cellular and molecular immunology, 8 , internat edn, Elsevier, Saunders, Philadelphia, Pa. Abraham, S.N. & Arock, M. 1998, "Mast cells and basophils in innate immunity", Seminars in immunology, vol. 10, no. 5, pp. 373-381. Aderem, A. & Underhill, D.M. 1999, "Mechanisms of phagocytosis in macrophages", Annual Review of Immunology, vol. 17, pp. 593-623. 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Größen Brand, Wertheim, Deutschland Counter „Wallac Trilux 1450 Microbeta” Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland Entwässerungsautomat „STP120“ ThermoScientific, Braunschweig, Deutschland FACS Calibur Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland Färbeautomat „Gemini AS“ ThermoScientific, Braunschweig, Deutschland Feinwaage „LA2305“ Sartorius, Göttingen, Deutschland Filter Mate Harvester Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland Gallios TM Flow Cytometer Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Deutschland Laborwaage „TE1502S“ Sartorius, Göttingen, Deutschland Lichtmikroskop Zeiss, Jena, Deutschland Lichtmikroskop „Axioscop40“ Zeiss, Jena, Deutschland Mikroskopkamera „AxioCamMRc” Zeiss, Jena, Deutschland 133 9 Anhang Mikrotome „2030 und 2040“ Reichert-Jung, München, Deutschland Multidispenser „HandyStep“ Brand, Wertheim, Deutschland Multifuge 3SR+ Heraeus, Hanau, Deutschland Neubauer Zählkammer Omnilab, Bremen, Deutschland pH-Meter „766 Calimatic“ Knick, Berlin, Deutschland SCIL Vet abcTM, Hämatologiegerät SCIL animal care company, Viernheim, Deutschland Victor TM X3, 2030 Multilabel Reader Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland 9.1.2 Reagenzien Eosin Merck KGaA, #1.15935.0100 Ethanol 99 % (vergällt mit 1 % MEK) - Ethanol 642 Scharr, #001-20385 Formaldehyd säurefrei ≥ 37%, für die Histologie Carl Roth GmbH, #P733.2 Giemsas Azur-Eosin-Methylenblaulösung für die Mikroskopie Merck KGaA, #1.09204.2500 HCl 25 % Merck KGaA, #1.00316.1000 Mayers Hämalaun Merck KGaA, #1.09249.2500 May-Grünwalds Eosin-Methylenblaulösung modifiziert für die Mikroskopie Merck KGaA, # 1.01424.0500 Methyl-3H-Thymidin Perkin Elmer, #NET-027A Paraffin Medite GmbH, #40-0021-00 Trypan Blue Solution Sigma Aldrich, #T8154 Xylol Avantor, #8118 134 9 Anhang 9.1.3 Verbrauchsmaterialien 96-well Platten für ELISA Nunc, #442404 Cellstar® Tubes (15, 50 ml) Greiner Bio-One, #188271 Deckgläser Gerhard Menzel GmbH, #BB024050A1 FACS Röhrchen (5 ml) Sarstedt, #551578 Injekt® Einmal-Spritzen (1, 2, 5, 10, 20 ml) Braun, #4606051V Mikro-Hämatokrit-Kapillaren, Na-hep. Brand, #749311 Objektträger; geschnitten, Mattrand Gerhard Menzel GmbH, #AA00000112E03MNZ10M Printed Filtermat A Perkin Elmer, #1450-421 Probengefäß 1,3 ml K3E für hämatologische Untersuchungen Sarstedt, #41.1504.005 Standardeinbettkassetten Medite GmbH, #46-1103-00 Sterican® Einmal-Injektionskanülen Braun, #4657519 Zellsiebe; 40μm, Nylon Falcon®, #352340 9.1.4 Verwendete Kits Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 24-plex Assay BIORAD Laboratories Inc., München, Deutschland Foxp3 Fix/Perm Buffer Set Biolegend, Fell, Deutschland Rat IgE ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA Rat IgG ELISA Quantitation Set Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA 135 9 Anhang 9.1.5 Computerprogramme AxioVision Zeiss, Jena, Deutschland Bio-Plex ManagerTM 6.1 BIORAD Laboratories Inc., München, Deutschland CellQuest Pro® BD, Heidelberg, Deutschland GraphPad Prism5® GraphPad Software, Inc.; La Jolla, CA, USA Kaluza Flow Cytometry Analysis 1.2 Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland Kaluza for Gallios 1.0 Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland WorkOut 2.5 Perkin Elmer, Baesweiler, Deutschland 9.1.6 Protokolle der histologischen Arbeiten Tabelle 13: Protokoll für die Entwässerung 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Chemikalie Formalin 4 % Formalin 4 % Alkohol 70 % Alkohol 80 % Alkohol 96 % Alkohol 100 % Alkohol 100 % Alkohol 100 % Xylol Xylol Paraffin Paraffin Dauer (h) 01:00 01:00 01:30 01:30 01:30 01:00 01:00 01:00 01:30 01:30 02:00 02:00 136 Temperatur RT RT RT RT RT RT RT RT RT RT 62 °C 62 °C 9 Anhang Tabelle 14: Protokoll der H&E Färbung 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Chemikalie Dauer (Min) Xylol 03:00 Xylol 03:00 Alkohol 100 % 01:00 Alkohol 90 % 01:00 Alkohol 70 % 01:00 Aqua dest. 00:30 Hämalaun 05:00 H2O dest. 01:00 HCl-Alkohol 1 % 00:10 Aqua dest. 03:00 Eosin 05:00 Aqua dest. 01:00 Alkohol 70 % 00:30 Alkohol 90 % 01:00 Alkohol 100 % 01:00 Xylol 04:30 137 9 Anhang 9.1.7 Antikörper Tabelle 15: Antikörper für allgemeine Analysen Antigen und Färbung Klon Mouse Anti-Rat CD8a PerCP Ox-8 Mouse Anti-Rat CD8b FITC 341 Mouse Anti-Rat CD4 FITC Ox-38 Mouse Anti-Rat TCRα/β FITC R73 Mouse Anti-Rat CD45RA FITC Ox-33 Mouse Anti-Rat CD3 FITC 1F4 Mouse Anti-Rat CD161 FITC 10/78 Mouse Anti-Rat CD8a PE Ox-8 Mouse Anti-Rat CD3 PE G4.18 Mouse Anti-Rat CD4 PE Ox-38 Mouse Anti-Rat CD25 PE Ox-39 Anti-Mouse/Rat Foxp3 FITC FJK-16s 138 Firma BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland AbD Serotec, Puchheim, Deutschland AbD Serotec, Puchheim, Deutschland AbD Serotec, Puchheim, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland eBioscience, Frankfurt a.M., Deutschland 9 Anhang Tabelle 16: Antikörper für die Analyse des αβTCR Repertoires Antigen und Färbung Mouse Anti-Rat TCRα/β Bio + SA-PE Mouse Anti-Rat Vα4 + Gam-FITC Mouse Anti-Rat Vα8 + Gam-FITC Mouse Anti-Rat Vβ10 + Gam-FITC Mouse Anti-Rat Vβ8.2. 8.4 + Gam-FITC Mouse Anti-Rat Vβ16 + Gam-FITC Mouse Anti-Rat Vβ8.5 + Gam-FITC Klon Mouse Anti-Rat CD3 PE G4.18 R73 G99 G177 G101 R78 HIS 42 B73 Streptavidin-PE Gam-FITC Herkunft BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland ** ** ** ** ** ** BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland BD, #349023 Dianova, #115-096-068 ** Die Antikörper wurden der Klinik für Allgemein-, Visceral- und Transplantationschirurgie der Medizinischen Hochschule Hannover von Prof. T. Hünig (Uni Würzburg) zur Verfügung gestellt. Für weitere Informationen siehe Torres-Nagel et al. (1994). (Torres-Nagel et al. 1994) 139 9 Anhang 9.1.8 Lösungen und Reagenzien für ELISA Tabelle 17: Bicarbonat/Carbonat Coating Puffer (100mM) Substanz Menge H2O dest. 1l Firma NaHCO3 6,0 g Sigma, #S5761-500G Na2CO3 pH 3,03 g 9,6 Merck, #6392 Tabelle 18: ELISA Waschlösung Substanz Tris NaCl Tween 20 pH Menge 50 mM 0,14 M 0,05% 8 Firma Carl Roth, #5429.2 AppliChem, #A2942,5000 Carl Roth, #9127.1 Tabelle 19: ELISA Blockinglösung Substanz Tris NaCl BSA pH Menge 50 mM 0,14 M 1% 8 Firma Carl Roth, #5429.2 AppliChem, #A2942,5000 Sigma, #A9647-50G Tabelle 20: ELISA Proben-/ Konjugatverdünnung Substanz Tris NaCl BSA Tween 20 Menge 50 mM 0,14 M 1% 0,05% Firma Carl Roth, #5429.2 AppliChem, #A2942,5000 Sigma, #A9647-50G Carl Roth, #9127.1 140 9 Anhang 9.1.9 Befundbogen des Tierpflegepersonals Datum Allgemeinbefinden obB Porphyrrinsekret sichtbar Gerötete Haut Nase Ohren Kopf Rücken Bauch Gliedmaßen Schwanz Haarverlust Kopf wenig mittel viel Haarverlust Rücken wenig mittel viel Haarverlust Bauch wenig mittel viel Haarverlust Gliedmaßen vorne hinten wenig viel Schuppen / Krusten Ohren Nase Kopf Rücken Bauch Gliedmaßen Schwanz Putzt sich viel Speichelt stark Gewichtsverlust Trinkt viel Niest Durchfall Sonstiges 141 9 Anhang 9.2 Ergebnisse 9.2.1 Reproduktionsparameter Tabelle 21: Reproduktionsparameter der LEW und LEW-Rag1 Ratten VerpaarungsWeibchen zeitraum (Monate) LEW-Rag1 151/17 KF 152/17 153/17 165/17 163/17 164/17 158/17 183/17 202/17 203/17 188/17 224/17 223/17 109/18 112/18 113/18 114/18 159/18 160/18 152/18 153/18 SPF3 172/28 173/29 196/31 194/32 195/33 179/34 187/35 185/36 188/37 184/38 186/39 193/41 Zwischenwurfzeit ∅ Anzahl Würfe 8 4 1,5 3 1 2 4,5 4 1 4 1,5 5 1,5 8 5 3 5 2 3,5 3 1 4,5 7 3 6 6 6 1,5 6 6 5 5 8,5 2 1 0 2 0 1 2 2 1 2 1 2 0 1 4 1 3 1 0 2 1 2 2 2 0 4 0 0 1 1 2 0 6 142 Abgesetzte Jungtiere pro Wurf Wurfgröße ∅ 56 9 5 9 5 29 6,5 6,5 4 6,5 9 5 8,5 6 8,5 4 6,5 9 5 8,5 6 8,5 5 6,25 5 8 6 5 6,25 4 8 6 30 29 63 8 4 8,5 4,5 9,5 4 4 7,5 4 9,5 40 3,5 2,5 59 7 6 5 7 5 5 39 4,3 4,3 75 39 49 25 41 55 38 9 Anhang SPF4 LEW 301/44 311/45 317/46 319/47 320/48 308/49 309/50 322/51 323/52 85/14 86/15 161/16 160/17 208/18 206/19 212/20 251/22 252/23 257/24 258/25 232/26 279 273 272 271 V162 V163 274 277 278 275 282 283 279 281 276 280 6 3 6,5 1,5 3 2,5 2,5 2 1,5 12 12 8 8 6 1,5 1 2 4 3 2 1 6 6 6 6 8 8 7 6 6 9 8 8 7 6,5 8,5 6,5 2 1 0 0 0 0 0 0 0 8 4 4 2 1 1 1 0 2 0 1 1 3 4 2 2 2 3 1 1 2 3 3 3 3 3 5 4 143 34 40,3 44,7 48 22 58,3 47,5 47 47 38 70,5 82 49,5 33,5 56,5 60,5 68 46,25 46 4 3 4 3 5,75 6,25 8 11,5 8 5 0 5,4 6,25 8 11,5 8 5 0 8 4 6 9 6,25 5 5,7 7,7 6,5 9,3 10 5 5 7,7 5,7 8,7 9,3 7,7 7,2 7 6 9 6,25 5 5,3 7,7 6,5 9 10 5 5 7 5,7 8,7 9 7,3 7 5,25 144 Abbildung 54: Unterschiede in der Zytokin- Chemokin und Wachstumsfaktorkonzentration im Serum zwischen LEW und LEW-Rag1 Ratten und LEW-Rag1 Ratten verschiedener Haltungen (n=6-10) 9.2.2 Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren 9 Anhang 145 Abbildung 55: Unterschiede der Zytokin-, Chemokin- und Wachstumsfaktorkonzentrationen im Serum zwischen gesunden und erkrankten LEW-Rag1 Ratten (n=22-50) 9 Anhang Danksagung Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei den Menschen bedanken, ohne deren Unterstützung und Engagement diese Doktorarbeit nie zustande gekommen wäre. Mein erster Dank gilt Herrn Prof. André Bleich, der mir diese Arbeit zu Teil werden ließ, bei Problemen immer ansprechbar war und mich während der gesamten Zeit unterstützt hat. Ganz besonders danken möchte ich Frau Dr. Silke Glage für die angenehme, engagierte Betreuung meiner Arbeit. Danke, dass du mir so viel Freiraum gelassen hast! Des Weiteren möchte ich mich bei Herrn Prof. Gerhard Breves für die Begutachtung dieser Arbeit bedanken. Ein weiterer besonderer Dank gilt Elena Wiebe für die unermüdliche Aufarbeitung meiner schier endlos erscheinenden Flut an histologischen Proben. Zudem danke ich den Arbeitsgruppen Genetik und Mikrobiologie für die genetische Überwachung und mikrobiologischen Untersuchungen meiner Ratten. Besonders danken möchte ich hier Herrn PD Dr. Dirk Wedekind für seine Unterstützung und Ideen. Dr. Manuela Büttner danke ich für die Unterstützung am Durchflusszytometer. Darüber hinaus bedanke ich mich bei den Tierpflegern des ZTL für die Betreuung der Haltung und der Zucht meiner Ratten. Ein besonderer Dank geht an Petra Meyer und Jasmin Goralski, die mich sehr unterstützt haben. Ich danke auch Herrn Dr. Joachim Hundrieser für die vielen Anregungen zu meinem Projekt, sein großes Engagement und die Bereitstellung seiner Ressourcen für die Zellkulturen. Vielen Dank auch an Britta Trautewig für die gemeinsame Durchführung der Leukozytenkulturen und FACS Analysen. Vielen Dank Sandra, Meike, Anne-Sophie, Inga und Stephi, für fachliche und private Gespräche, Aufmunterungen, Zusammenhalt und Eisessen. Mein letzter großer Dank gilt meiner Familie und Jan. Danke für eure Unterstützung und dafür, dass ihr immer ruhig bleibt, wenn ich es nicht bin! 146 Hannover 2015 Charakterisierung der LEW/Ztm-Rag1 Dissertation ISBN 978-3-86345-299-5 Katharina Schulz Ratte - Ein neues immunsupprimiertes Tiermodell - Katharina Schulz Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375 E-Mail: [email protected] · Internet: www.dvg.de em1Ztm - Hannover 2015 - Medizinische Hochschule Hannover
