Dokument_49.

TIP-vermittelte Induktion
Tetrazyklin-abhängiger Transregulatoren
in Saccharomyces cerevisiae
und HeLa Zellen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Christoph Stöckle
aus Oettingen i. Bay.
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
17.02.2012
Vorsitzender der
Prüfungskommission:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Andreas Burkovski
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Yves Muller
Das Studieren lehrt uns die Regel - das Leben die Ausnahmen
Johannes Mario Simmel
Danksagung
Ein großer Dank geht an Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen, nicht nur für die Überlassung des
interessanten Themas, sondern auch für sein Interesse am Fortgang dieser Arbeit, seine
Bereitschaft zur Diskussion und die stets konstruktive Kritik. Ich erinnere mich gerne zurück
an einen besonderen Menschen und herausragenden Wissenschaftler.
Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich besonders herzlich für die reibungslose Übernahme
und Fortführung meiner Betreuung sowie der Möglichkeit meine Arbeit zu vollenden. Von ihm
erhielt ich ehrliches Interesse und tatkräftige Unterstützung bei meiner Arbeit, was für mich
nicht selbstverständlich war und immer noch nicht ist.
Prof. Dr. Yves Muller danke ich dafür, dass er, wie schon bei meiner Diplomarbeit, die
Zweitkorrektur übernahm.
Vielen Dank an Marcus Klotzsche für das Korrekturlesen meiner Arbeit und die vielen
interessanten und konstruktiven Diskussionen.
Ein großer Dank geht an Chris Berens für die stets offene Tür, die unzähligen wertvollen
Antworten auf so viele wissenschaftliche Fragestellungen und sein unerschöpfliches
Literaturwissen.
Ein weiterer herzlicher Dank geht an Prof. Dr. Christian Koch, der schon in meiner
Diplomarbeit viel Zeit darauf verwendet hat, mich in die wunderbare Welt der Hefe
einzuführen. Von ihm stammen nicht nur Materialien und Methoden, sondern vor allem viele
unbezahlbare Erfahrungswerte.
Den Organisatoren der MiBi danke ich für die Vorarbeit, die sie leisten, um unsere Arbeit
überhaupt erst möglich zu machen. Besonders zu erwähnen sind hierbei Donata Wehr,
Gerald Seidel, Markus Müller, Anja Zabel und Manu Hanuschik.
Vielen lieben und herzlichen Dank an alle aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern der MiBi für
die vielen schönen Momente und die unzähligen Dinge, die wir uns im Laufe der Jahre geteilt
haben: Niveau in allen Höhen- und Tiefenlagen, schlechte Witze, gute Witze, dumme
Sprüche, schlaue Sprüche, nützliche und unnütze Materialien und Methoden, nützliches und
unnützes Wissen, Backwaren und gesundes Essen, Getränke mit unterschiedlichem
Alkoholgehalt, aufmunternde Worte, realistische und unrealistische Ansichten, Vorbild und
nicht Vorbild, blaue Müllsäcke und so vieles, vieles mehr!!!
Ein besonders großer Dank geht an so viele Leute rund um die Erde, die meine Arbeit auf
verschiedenste Weise unterstützt und an vielen Stellen erst ermöglicht haben. Dies betrifft
sowohl Materialien wie Plasmide, Stämme, Antikörper, aufgereinigte Proteine als auch
vielfältigen wissenschaftlichen Rat. Diese Personen hier aufzuzählen würde sicherlich den
Rahmen sprengen und vor allem die Gefahr bergen, jemanden zu vergessen. Allerdings
möchte Dr. Peter Palese und Lily Ngai von der Mount Sinai School of Medicine in New York
hervorheben, die mir mehrfach auf freundliche, schnelle, kompetente und unkomplizierte Art
geholfen haben, ohne mich überhaupt zu kennen.
Jorge Cham danke ich für seine völlig an den Haaren herbeigezogenen graphischen
Abstraktion des akademischen Alltags.
Und nicht zuletzt bedanke ich mich bei meiner Frau Sandra, ohne deren Unterstützung so
vieles sicherlich nicht möglich gewesen wäre.
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
1 ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY
1/3
2 EINLEITUNG
4
2.1 Tetrazykline und die Tetrazyklinresistenz
4
2.2 TetR als Transkriptionsregulator für die konditionale Genexpression
5
2.2.1 Vielfalt von TetR Induktoren
7
2.2.2 TIP-Varianten und ihre Eigenschaften
7
2.2.3 Anwendung der peptidischen Induktion in prokaryontischen
Organismen
8
2.2.4 Anwendung der peptidischen Induktion in eukaryontischen Organismen
8
2.3 Der nucleo-cytoplasmatische Transport
8
2.3.1 Die Rolle der Kernporen
8
2.3.2 Zelluläre Mechanismen
9
2.3.2 Methodik zur Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen
11
2.3.3 Bedeutung des nucleo-cytoplasmatischen Transports bei viralen
Infektionen
11
2.3.3.1 DNA Viren
11
2.3.3.2 RNA Viren mit DNA Intermediat
12
2.3.3.4 RNA Viren ohne DNA Intermediat
12
2.4 Das Influenza A Virus
12
2.4.1 Genom und virale Proteine
12
2.4.3 Vermehrungszyklus
14
2.4.4 Bedeutung von Influenza A als Pathogen
15
2.4.4.1 Grippepandemien
15
2.4.4.2 Aktuelle Bedrohung durch Influenza A
15
2.4.4.3 Therapie von Influenza A Infektionen
16
2.5 Motivation und Zielsetzung der Arbeit
17
3 ERGEBNISSE
18
3.1 Proteinvermittelte Induktion des Tet-Repressors in S. Cerevisiae
18
3.1.1 Konzeption des Reportersystems
18
3.1.1.1 Reporter
18
3.1.1.2 Regulator
18
I
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
3.1.1.3 Induktor
19
3.1.2 Funktionsweise des Reportersystems
19
3.1.3 Modifikation des Reportersystems
21
3.1.3.1 Konstruktion des Trägerproteins
21
3.1.3.2 Subzelluläre Lokalisation der Trägerprotein-Varianten
23
3.1.3.3 Einfluss der Trägerprotein-Varianten auf das Wuchsverhalten von
S. cerevisiae
26
3.1.3.4 Expression der Trägerprotein-Varianten
27
3.1.4 Aufbau des Reportersystems mit der Trägerprotein-Variante 7
28
3.1.4.1 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + p425Met25
28
3.1.4.2 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7 (mCherry7)
28
3.1.4.3 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7-TIP2 (mCherry7-TIP2)
29
3.4.1 Simultane Messung der GFP+ und mCherry Fluoreszenz
3.2 Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse des
nucleo-cytoplasmatischen Transports
30
31
3.2.1 Konzeption
31
3.2.2 Aufbau und Funktionsweise des Reportersystems
31
3.2.3 Auswahl des POI
32
3.2.3.1 Das Matrixprotein M1
33
3.2.3.1.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit M1 und M1Mut
34
3.2.3.1.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von M1-EGFP und M1Mut-EGFP
34
3.2.3.2 Das Nichtstrukturprotein NS1
35
3.2.3.2.1 Mutation der 3‘-Spleißsequenzen des ns1 Gens
35
3.2.3.2.2 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NS4 und NS4Mut
37
3.2.3.2.3 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NS4-EGFP und NS4Mut-EGFP
37
3.2.3.3 Das Nucleoprotein NP
38
3.2.3.3.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NP und NPMut
39
3.2.3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NP-EGFP und NPMut-EGFP
39
3.2.4 Konstruktion der Reporterzelllinien
40
3.2.4.1 Die Zelllinie HLF33
40
3.2.4.2 Chromosomale Integration der tTA Expressionskassette
40
3.2.4.3 Charakterisierung der ALF Zelllinien
42
3.2.4.4 Das Nucleoprotein als POI
43
3.2.4.5 TetR-Induktion durch NP-TIP2 in E. coli
43
3.2.4.5.1 Aufbau und Funktionsweise des E. coli Messsystems
43
3.2.4.5.2 Induktion von TetR durch NP-TIP2
45
3.2.4.6 Chromosomale Integration der NP-TIP2 Expressionskassette
II
46
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
3.2.4.6.1 Kontrolle der stabilen Integration durch LacZ in situ Färbung
49
3.2.4.6.2 Charakterisierung der ALF2-NP Zelllinien
49
3.2.4.6.3 Auswahl der ALF2-NP Zelllinien für die weiteren Arbeiten
52
3.2.4.6.4 Sequenzierung des NP-TIP2 Locus der Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31
52
3.2.5 Validierung der Reporterzelllinien
53
3.2.5.1 Inhibition des NP-TIP2 Kernimports durch Nucleozin
53
3.2.5.1.1 Einfluss von DMSO auf die Expression der Luciferase
53
3.2.5.1.2 Wirkung von Nucleozin auf die Reporterzelllinien
54
3.2.5.1.3 Subzelluläre Lokalisation von NP-EGFP in Gegenwart von Nucleozin
56
3.2.5.2 Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz
57
4 DISKUSSION
61
4.1 Optimierung des Reportersystems für S. cerevisiae
61
4.1.1 Verwendung von TIP2 als Induktorpeptid
61
4.1.2 Konstruktion des Trägerproteins
62
4.1.2.1 Austausch der fluoreszierenden Proteinkomponente
62
4.1.2.2 Steuerung des Expressionsniveaus über Codonadaptation
64
4.1.2.3 Kernimport der Trägerprotein-Varianten
64
4.1.2.3.1 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit einteiliger SV40 NLS
65
4.1.2.3.2 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit zweiteiligen NLSs
66
4.1.2.3.3 Charakteristika der Trägerprotein-Variante 6 mit c-Myc NLS
67
4.1.2.4 Regulation des Expressionsniveaus des neuen Trägerproteins
68
4.1.3 TIP2-vermittelte Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante
68
4.1.4 Weitere Einsatz- und Optimierungsmöglichkeiten für das Reportersystem
69
4.2 Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse des
nucleo-cytoplasmatischen Transports
70
4.2.1 Planung und Konstruktion der Reporterzelllinien
71
4.2.2 Auswahl von geeigneten Influenza A Proteinen
73
4.2.2.1 Relevanz der Virusstämme Influenza A/WSN/1933 und A/Rostock/FPV/1934
73
4.2.2.2 Das Matrixprotein 1
73
4.2.2.3 Das Nichtstrukturprotein 1
75
4.2.2.4 Das Nucleoprotein
76
4.2.2.4.1 Funktionalität der NP-TIP2 Fusion in E. coli
77
4.2.3 Konstruktion der Reporterzelllinien und deren Anwendung auf NP
78
4.2.4 Experimentelle Ansätze zur Validierung der Reporterzelllinien
79
4.2.4.1 Nucleozin
79
4.2.4.1.1 Konzentrationsabhängige Stimulation der Luciferaseexpression
III
79
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
durch DMSO
4.2.4.1.2 Interpretation der Experimente mit Nucleozin
4.2.4.2 Validierung der Reporterzelllinien über RNA-Interferenz
4.2.5 Möglichkeiten zur Optimierung des Reportersystems
80
81
82
5 MATERIAL UND METHODEN
83
5.1 Materialien
83
5.1.1 Chemikalien
83
5.1.2 Hilfsmittel und Verbrauchsgüter
85
5.1.3 Verwendete Geräte
86
5.1.4 Kommerziell erhältliche Systeme
87
5.1.5 Enzyme
87
5.1.6 DNA-Größenstandard
87
5.1.7 Verwendete Stämme und Zelllinien
87
5.1.7.1 Verwendete E. coli Stämme
87
5.1.7.2 Verwendeter S: cerevisiae Stamm
88
5.1.7.3 Verwendete Zelllinien
88
5.1.8 Oligonukleotide und Plasmide
88
5.1.8.1 Oligonukleotide
88
5.1.8.1.1 Oligonukleotide für die Konstruktion von Plasmiden
88
5.1.8.1.2 Oligonukleotide für Sequenzierungen
91
5.1.8.1.3 siRNA
92
5.1.8.2 Plasmide
92
5.1.8.2.1 Plasmide, die aus anderen Arbeiten verwendet wurden
92
5.1.8.2.2 Plasmide, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden
94
5.1.9 Medien, Lösungen und Puffer
101
5.1.9.1 Medien
101
5.1.9.1.1 Fakultative Zusätze für Medien
101
5.1.9.1.2 Bakteriennährmedien
101
5.1.9.1.3 Hefenährmedien
102
5.1.9.1.4 Medien für die Zellkultur
102
5.1.9.2 Lösungen und Puffer
103
5.1.9.2.1 Allgemeine Puffer
103
5.1.9.2.2 Lösungen und Puffer für E. coli
103
5.1.9.2.3 Lösungen und Puffer für S. cerevisiae
103
5.1.9.2.4 Lösungen und Puffer für die Zellkultur
104
IV
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
5.2 Methoden
104
5.2.1 Nukleinsäure Methoden
104
5.2.1.1 Plasmidisolierung aus E. coli
104
5.2.1.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA
105
5.2.1.3 Dephosphorylierung von 5’-DNA-Enden
105
5.2.1.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
105
5.2.1.5 Gelelektrophorese
106
5.2.1.6 Präparative Reinigung von DNA Fragmenten
106
5.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten
107
5.2.1.8 Sequenzierung von DNA
107
5.2.1.9 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren
107
5.2.2 Arbeiten mit E. coli
107
5.2.2.1 Anzucht von Bakterien
107
5.2.2.2 Herstellung Calciumchlorid-kompetenter E. coli Zellen
108
5.2.2.3 Transformation von E. coli
108
5.2.2.4 Messung der β-Gal-Aktivität in E. coli im 96-Napfplatten-Format
108
5.2.3 Arbeiten mit S. cerevisiae
110
5.2.3.1 Anzucht von S. cerevisiae
110
5.2.3.2 Herstellung Lithiumacetat-kompetenter S. cerevisiae Zellen
110
5.2.3.3 LiAc-Transformation
111
5.2.3.4 DAPI-Färbung
111
5.2.3.5 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von S. cerevisiae
112
5.2.3.6 Erstellung von Wuchskurven
112
5.2.3.7 Fluoreszenzquantifizierung
113
5.2.4 Arbeiten in der Zellkultur
113
5.2.4.1 Kultivierung von HeLa und HEK293 Zellen
114
5.2.4.2 Kryokonservierung und Auftauen von HeLa und HEK293 Zellen
114
5.2.4.3 Zellzählung
114
5.2.4.4 Stabile Transfektion von HeLa Zellen
115
5.2.4.5 Transiente Transfektion von HeLa und HEK293 Zellen
116
5.2.4.6 Höchst-Färbung
117
5.2.4.7 Herstellung von Lebendbeobachtungskammern
117
5.2.4.8 Fluoreszenzmikroskopische Analyse
117
5.2.4.9 Präparation genomischer DNA aus HeLa Zellen
118
5.2.4.10 Messung der Luciferaseaktivität der ALF und ALF-NP Zelllinien
118
5.2.4.11 siRNA Transfektion
119
V
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
5.2.4.12 LacZ in situ Färbung
119
5.3 Computerprogramme
120
6 ANHANG
121
6.1 Codongebrauch der mcherry Genvarianten
121
6.1.1 Die „relative adaptiveness“ als Maß für die Codonfrequenz
121
6.1.2 Genvariante mcherry(ha)
121
6.1.3 Genvariante mcherry(ya)
121
7 LITERATURVERZEICHNIS
126
8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
142
8.1 Einheiten
142
8.2 Vorsätze
142
8.3 Nomenklatur der Basen und Nukleoside
142
8.4 Aminosäuren-Nomenklatur
142
8.5 Allgemeine Abkürzungen
143
VI
1 Zusammenfassung
_____________________________________________________________________________________________________
1 ZUSAMMENFASSUNG
Aufgrund der hohen Affinität und Spezifität gegenüber Operatorsequenz und Induktor wurde
der Tetrazyklin-Repressor (TetR) in verschiedensten Systemen für die konditionale
Genregulation sowohl in Prokaryonten, als auch in Eukaryonten eingesetzt. Obwohl das
Spektrum von möglichen Applikationen durch die Entdeckung der TetR induzierenden
Peptide (TIPs) noch erweitert wurde, war deren Anwendung bisher auf prokaryontische
Organismen limitiert.
Ein Teilprojekt dieser Arbeit befasste sich mit der Modifikation eines bestehenden
Reportersystems für Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Mit diesem System konnte
bereits die Induktion eines auf der TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierenden
Tetrazyklin-abhängigen „Transsilencers“ (tTS) durch das Peptid W-TIP gezeigt werden. Ziel
dieser Arbeit war es die TIP-vermittelte Regulation einer tTS Variante zu zeigen, die auf
TetR(B) Wildtyp (wt), einer der in eukaryontischen Transregulatoren am häufigsten
verwendeten
TetR
Varianten,
basierte.
Hierzu
wurden
ausgehend
von
mCherry
verschiedene Trägerproteinvarianten für das Induktorpeptid konstruiert, die sich in der
verwendeten Kernlokalisationssequenz, der Linkersequenz zwischen NLS und mCherry
sowie deren Codongebrauch unterschieden. Das Trägerprotein sollte im Zellkern lokalisiert
sein, eine hohes Expressionsniveau aufweisen und einen möglichst geringen Einfluss auf
das Wachstum des Modellorganismus haben. Die Proteinvariante mit der besten
Kombination dieser Eigenschaften enthielt eine N-terminale SV40 NLS mit einer 10 AS
langen „Linkersequenz“ und wurde durch ein an S. cerevisiae adaptiertes mcherry Gen
codiert. Mit einer Fusion dieses Trägerproteins mit dem Induktorpeptid TIP2 konnte
schließlich die konzentrationsabhängige Induktion einer auf TetR(B) wt basierenden tTS
Variante gezeigt werden. Dies stellte den ersten Nachweis TIP-vermittelter Genregulation
eines auf TetR(B) wt basierenden Transregulators in einem eukaryontischen Organismus
dar.
Ein
weiteres
Teilprojekt
der
Arbeit
beschäftigte
sich
mit
der
Herstellung
von
Reporterzelllinien zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports von TIP-Fusionsproteinen. Die Expression aller Komponenten des Reportersystems in den Reporterzelllinien
erfolgte hierbei über unabhängige, stabile Integrationen. Als Reporter diente die Luciferase
aus Photinus pyralis, deren Transkription über einen, auf TetR(B) wt basierenden,
Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (tTA) reguliert wurde. Da eine Induktion der tTA
Variante durch das konstitutiv exprimierte TIP-Fusionsprotein nur dann erfolgen konnte,
wenn sich das TIP-Fusionsprotein im Zellkern befand, wurde die Expression der Luciferase
zum indirekten Indikator für dessen subzelluläre Lokalisation. Für die Anwendung des
Reportersystems wurden drei Proteine aus dem Influenza A Virus auf ihre Eignung hin
überprüft und unter diesen letztlich das Nucleoprotein (NP) ausgewählt. Die Konzentrationsabhängige Induktion von TetR(B) wt durch eine Fusion bestehend aus NP und TIP2 (NP-
-1-
1 Zusammenfassung
_____________________________________________________________________________________________________
TIP2) konnte erfolgreich in Escherichia coli gezeigt werden. Die Überprüfung der
Funktionalität der Reporterzelllinien sollte im nächsten Schritt durch eine Reduktion der
nukleären Konzentration von NP-TIP2 erfolgen. Dies sollte zum Einen durch Blockierung des
NP Kernimports mittels des spezifischen Inhibitors Nucleozin und zum Anderen durch
Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz erreicht werden. Mittels Nucleozin
konnte allerdings weder eine Modulation der Luciferaseexpression der Reporterzelllinien,
noch eine Inhibierung des Kernimports einer Fusion bestehend aus NP und dem
fluoreszierenden Protein EGFP beobachtet werden. Für die Validierung der Reporterzelllinien über RNA-Interferenz wurden die Reporterzelllinien und deren Ausgangszelllinie mit
spezifischer siRNA für NP-TIP2 bzw. einer unspezifischen Kontroll-RNA transfiziert. Mit
diesem Ansatz konnte ein eindeutiger Hinweis auf die Funktionalität der Reporterzelllinien
erbracht werden.
-2-
1 Summary
_____________________________________________________________________________________________________
1 SUMMARY
Due to Tet-repressor’s (TetR) high affinity and specificity for its corresponding operator
sequence and its inducers, it has been used in a wide variety of regulatory systems for
inducible gene control in both procaryotes and eucaryotes. Although the variety of possible
applications was further expanded by the discovery of TetR inducing peptides (TIPs), their
application has so far been limited to prokaryotic organisms.
Therefore, one project of this thesis dealt with modifying a reporter system for
Saccharomyces cerevisiae which had already been successfully used to show induction of a
TetR double-mutant (N82A/F86A) based tetracycline-dependent transsilencer by the peptide
W-TIP. The aim of this project was to show TIP-mediated induction of a corresponding tTS
variant based on wildtype (wt) TetR, the most frequently used TetR variant in gene regulation
systems for eucaryotes. Starting from mCherry, seven versions of the TIP scaffold protein
differing in nuclear localization sequence (NLS), linker-sequence between NLS and mCherry
as well as codon usage were compared to determine the optimal variant. Nuclear
accumulation, high expression and little influence on the growth of the model organism were
the selection criteria. The combination with the best overall properties contained an Nterminal SV40 NLS with a 10 residue linker and a mCherry gene adapted to yeast codon
usage. Combining this scaffold protein with the inducer-peptide TIP2 finally allowed to show
dose-dependent induction of a wt TetR-based tTS variant, demonstrating for the first time
induction of a wt-based tetracycline-dependent transregulator in an eucaryotic organism.
The second project dealt with the construction of reporter cell lines for analyzing nucleocytoplasmic transport of TIP-fused protein which carry all reporter system components stably
integrated into the host genome. Transcription of a luciferase reporter gene was regulated by
a tetracycline-dependent transactivator (tTA). Because the tTA variant is only induced if the
constitutively expressed TIP-fusion localizes to the cell’s nucleus, lucifease expression
serves as an indirect indicator of the TIP-fusion protein’s subcellular localization.
For the application of the reporter system three proteins from the influenza A virus were
tested for their suitability and finally the nucleoprotein (NP) was selected. In a pilot
experiment, dose-dependent induction of tTA by the TIP2-fusion protein NP-TIP2 was
successfully shown in Escherichia coli. In the next step, the reporter cell’s functionality was
tested by reducing the NP-TIP2 nuclear concentration. This should be accomplished on the
one side by nucleozin, a specific inhibitor for the nuclear import of NP and on the other side
through reduction of NP-TIP2 expression by RNA-interference. Nucleozin neither lead to a
change in luciferase expression in the reporter cells, nor to inhibition of nuclear import of a
fusion protein consisting of NP and the green fluorescent protein EGFP. In the RNAinterference approach, the reporter cell lines were transfected with specific siRNA, a nonspecific siRNA served as control. The increased luciferase activity observed with the specific
siRNA is a clear hint for the functionality of the reporter cell line.
-3-
2 Einleitung
_____________________________________________________________________________________________________
2 EINLEITUNG
2.1 Tetrazykline und die Tetrazyklinresistenz
Tetrazykline sind eine von Streptomyceten produzierte Stoffgruppe von antibiotisch aktiven
Substanzen zu denen mehrere therapeutisch relevante Vertreter wie beispielsweise das
Tetrazyklin (Tc), Doxyzyklin (Dox) und Minozyklin gehören. Sie binden an mehreren Stellen
der 30S Untereinheit des bakteriellen Ribosoms und verhindern so die Anlagerung der
Aminoacyl-tRNA an die Akzeptorstelle. Die daraus resultierende Inhibition der Translation ist
der Grund für ihre bakteriostatische Wirkung (Brodersen et al., 2000; Pioletti et al., 2001).
Durch den intensiven Einsatz von Tetrazyklinen, zum Einen als Therapeutika, und zum
Anderen als Wuchsbeschleuniger in der Tiermast (Chopra et al., 2001), schritt die
Verbreitung von Resistenzen schnell voran. Eine der am weitesten verbreiteten Formen der
Tetrazyklinresistenz stellt hierbei der aktive Export der Tetrazykline aus der Zelle mittels
eines membranständiges Transportproteins dar (Yamaguchi et al., 1990). Die genetischen
Komponenten dieser Resistenz sind innerhalb sogenannter Resistenzdeterminanten kodiert,
von denen aktuell 14 verschiedene Klassen beschrieben sind: Tet A - Tet E, Tet G, Tet H,
Tet J, Tet Z, Tet 30, Tet 31, Tet 33 , Tet 39, Tet 41 (Levy et al., 1989; Levy et al., 1999; Luo
et al., 1999; Agerso et al., 2005; Thompson et al., 2007).
Eine dieser Resistenzdeterminanten, die Determinante des Typs Tet B, findet sich in
Enterobakteriaceaen und ist auf dem Transposon Tn10 kodiert (Abb. 1). Tet B setzt sich aus
den zwei divergent angeordneten Genen tetR und tetA sowie einer Promotorregion zwischen
den beiden Genen zusammen. tetR kodiert für den Transkriptionsregulator TetR, und tetA für
das integrales Membranprotein TetA, das Tetrazyklin aktiv aus der Zelle transportiert. Die
Regulation der Transkription dieser beiden Gene erfolgt über TetR in Abhängigkeit von der
intrazellulären Tetrazyklinkonzentration. TetR liegt in der Zelle als Homodimer vor und bindet
in Abwesenheit von Tetrazyklinen an die zwei, mit den Promotoren für tetR und tetA
überlappenden, Tet-Operatoren tetO1 und tetO2, wodurch die Expression der beiden Gene
reprimiert wird. Tetrazykline können passiv aus der Umgebung in die Zelle diffundieren
(Sigler et al., 2000) und bilden dort Komplexe mit zweiwertigen Metallionen. Diese Komplexe
binden innerhalb der Tc-Bindetasche von TetR und induzieren so eine Konformationsänderung, die zu einer Reduktion der Affinität von TetR zu den Tet-Operatoren führt. TetR
dissoziiert von der DNA, wodurch die Repression der Transkription von tetR und tetA
aufgehoben wird. In diesem Zustand findet die Expression von TetR und TetA statt wodurch
die zelluläre Tetrazyklinkonzentration zum Einen durch den von TetA vermittelten Export und
zum Anderen durch Bindung an TetR reduziert wird (Hillen et al., 1994; Schnappinger et al.,
1996).
-4-
2 Einleitung
_____________________________________________________________________________________________________
H+
Tc
Cytoplasmamembran
Tc + Me2+
[Tc--Me2+]+ + H+
tetO1
tetR
tetA
tetO2
Promotorregion
Abb. 1: Regulationsmechanismus und genetische Organisation der Tn10 kodierten TcResistenz
Im oberen Teil der Abbildung sind die Prozesse an der Cytoplasmamembran und im unteren
Teil die genetische Organisation sowie der Regulationsmechanismus der Tn10 kodierten
Tc-Resistenz dargestellt. Hierbei sind Protein-kodierende Bereiche orange, Promotoren blau
und die beiden Tet-Operatoren tetO1 und tetO2 schwarz dargestellt. Tc (gelbe Dreiecke)
gelangt in neutraler Form durch Diffusion über die Cytoplasmamembran in die Zelle und bildet
dort Komplexe mit zweiwertigen Metallkationen (grüne Kreise). Dieser Komplex wird vom
membranständigen Tc-Protonen-Antiporter TetA (mit 12 transmembranen α-Helices in rot
dargestellt) erkannt und ist Induktor des durch tetR kodierten Tet-Repressors TetR. TetR
bildet Homodimere und bindet in Abwesenheit von Tc an die beiden Tet-Operatoren tetO1 und
tetO2, die sich in der Promotorregion zwischen den beiden, divergent angeordneten, Genen
tetA und tetR befinden. In diesem Zustand ist die Transkription von tetA und tetR reprimiert.
Durch die Bindung von Tc an TetR wird eine Konformationsänderung induziert die zur
Dissoziation des Regulators von der DNA führt. Abbildung und Legende modifiziert aus
(Hillen und Berens, 1994).
2.2 TetR als Transkriptionsregulator für die konditionale
Genexpression
TetR ist einer der am besten charakterisierten prokaryontischen Transkriptionsregulatoren
(Berens
et
al.,
2004).
Aufgrund
der
hohen
Affinität
und
Spezifität
gegenüber
Operatorsequenz und Induktor stellt die TetR-vermittelte Genregulation weiterhin ein
leistungsfähiges Werkzeug für die konditionale Genexpression dar. Der Einsatz beschränkt
sich hierbei nicht nur auf prokaryontische Organismen, sondern erstreckt sich auch auf die
Applikation in den verschiedensten eukaryontischen Modellorganismen wie beispielsweise
-5-
2 Einleitung
_____________________________________________________________________________________________________
Trypanosomen (Wirtz et al., 1995), Bäckerhefe (Dingermann et al., 1992), Tabakpflanze
(Gatz et al., 1991), oder mammalischen Zellen (Gossen et al., 1992). Für die Tetrazyklinabhängige, konditionale Genexpression in eukaryontischen Systemen wird der Tet-Operator
zumeist nicht, wie in prokaryontischen Systemen üblich, innerhalb des Promotors, sondern in
Form eines „Tet reponsive element“ (TRE) stromaufwärts des Promotors platziert. Dieses
TRE besteht hierbei vorwiegend aus einer Serie von bis zu sieben tetO2 Operatoren (Gossen
und Bujard, 1992). Da durch die Bindung von TetR an die Tet-Operatoren in einem solchen
System keine Transkriptionsregulation vermittelt wird, werden Translationsfusionen aus TetR
und einer eukaryontischen oder viralen Regulatordomäne eingesetzt. Handelt es sich bei
dieser Regulatordomäne um eine Aktivatordomäne wie beispielsweise VP16 aus dem
Herpes simplex Virus, spricht man bei der Fusion mit TetR von einem Tetrazyklinabhängigen Transaktivator (tTA) (Gossen und Bujard, 1992). Wird TetR stattdessen mit einer
Repressordomäne wie der humanen KRAB-Domäne fusioniert, handelt es sich um einen
Tetrazyklin-abhängigen Transsilencer (tTS) (Deuschle et al., 1995). Abbildung 2 zeigt
exemplarisch die durch eine tTA Variante vermittelte Regulation der Transkription.
A
-Tc
+
Expression
TRE
PMin
Gen X
TRE
PMin
Gen X
B
+Tc
Abb. 2: tTA-vermittelte konditionale Genexpression
Die Transkription eines beliebigen Gens X (orange) erfolgt über einen
Minimalpromotor (PMin in blau). Stromaufwärts des Minimalpromotors
befindet sich ein TRE Sequenzelement (schwarz), bestehend aus einer
Folge von bis zu sieben tetO2 Operatoren. Die tTA Variante setzt sich aus
dem TetR Dimer (dunkelgrau) mit runder DNA Bindedomäne und ovalem
Proteinkörper sowie einer Aktivatordomäne (hellgrau) zusammen.
A) In Abwesenheit des Induktors Tc bindet die tTA Variante an die TetOperatoren des TRE und aktiviert die Transkription über den
Minimalpromotor.
B) In Anwesenheit von Tc [gelbes Dreieck im Komplex mit zweiwertigen
Metallionen (grüner Kreis)] wird die tTA Variante Induziert, wodurch es zur
Dissoziation der tTA Variante von der DNA kommt. Ohne Aktivierung findet
nur eine schwache Basalexpression über den Minimalpromotor statt.
-6-
2 Einleitung
_____________________________________________________________________________________________________
2.2.1 Vielfalt von TetR Induktoren
Für die Anwendung von TetR in der konditionalen Genregulation wurden Induktoren benötigt,
die TetR möglichst effektiv induzieren. Im Zuge der Suche nach solchen Induktoren wurden
beispielsweise das Anhydrotetrazyklin (Atc) und Dox gefunden. Atc besitzt von allen bisher
getesteten Tc-Derivaten die höchste Affinität zu TetR und ist im Gegensatz zu Tc sogar in
Abwesenheit von zweiwertigen Metallionen in der Lage, TetR zu induzieren (Scholz et al.,
2000). Allerdings beschränkt sich der Einsatz von Atc aufgrund der hohen Toxizität auf
Bakterien. Im Gegensatz dazu ist die Toxizität von Dox in mammalischen Zellen deutlich
geringer, weshalb es einen der am häufigsten verwendeten Induktoren in der Zellkultur
darstellt (Gossen et al., 2002).
Im Zuge der Suche nach neuen TetR Induktoren wurden nicht nur niedermolekulare
Substanzen, sondern auch Peptidbanken untersucht. Zu diesem Zweck wurden mit Hilfe
eines „Phage Display“-Ansatzes TetR-bindende Peptide isoliert (Klotzsche et al., 2005).
Diese wurden anschließend als C-terminale Fusion mit dem Trägerprotein Thioredoxin A
(TrxA) auf ihre Fähigkeit hin getestet, TetR zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeiten konnte
das erste TetR-induzierende Peptid identifiziert werden, das später den Namen TIP (TetR
induzierendes Peptid) erhielt.
2.2.2 TIP-Varianten und ihre Eigenschaften
TIP ist sowohl als N-, wie auch als C-terminale TrxA Fusion in der Lage, TetR zu induzieren,
wobei die N-terminale Fusion eine deutlich höhere Induktionseffizienz zeigte (Klotzsche et
al., 2005). Durch die Einführung eines einzelnen Tryptophan-Restes an den N-Terminus von
TIP (Bezeichnung W-TIP) konnte die Induktionseffizienz der C-terminalen TIP Fusion
deutlich gesteigert werden (Klotzsche et al., 2007). Eine weitere Optimierung wurde durch
Einführung der zwei Aminosäureaustausche N82A und F86A in TetR(B) erreicht. Da diese
TetR Mutante nicht mehr mit Tc, Atc oder Dox induziert werden konnte, gelang somit die
Konstruktion einer Peptid-spezifischen TetR Variante. In nachfolgenden Experimenten
wurden mit einem „Yeast Two Hybrid“-System 22 weitere TIPs identifiziert. Unter diesen
befand sich auch pre-TIP2, dessen Induktionseffizienz in der C-terminalen Fusion an TrxA
über der von W-TIP lag. Die Effizienz von pre-TIP2 konnte durch den Aminosäureaustausch
L9A noch weiter gesteigert werden. Das resultierende Peptid TIP2 erreichte in Kombination
mit TetR(B) wt in dem verwendeten Messsystem die gleiche Induktionseffizienz wie Dox und
stellt somit den aktuell effizientesten, peptidischen Induktor am C-Terminus von TrxA dar
(Goeke et al., 2011).
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2 Einleitung
_____________________________________________________________________________________________________
2.2.3 Anwendung der peptidischen Induktion in prokaryontischen
Organismen
Die erste experimentelle Anwendung von TIP stellte die Expressionsanalyse ausgewählter
Proteine in E. coli dar (Schlicht et al., 2006). Zu diesem Zweck wurde ein TIP basiertes
Insertionselement konstruiert, das ungerichtet in das Genom von E. coli integrierte. Auf diese
Weise wurden TIP Fusionen mit fünf verschiedenen endogenen Proteinen erzeugt, deren
Expression im Anschluss mit Hilfe eines TetR regulierten Reportergens analysiert werden
konnte. Die auf diese Weise generierten Daten deckten sich mit vorhergehenden Studien
und validierten somit die Methode. Aktuelle Projekte beschäftigen sich beispielsweise mit der
Expressionsanalyse Virulenz-assoziierter Proteine in Salmonella enterica in der WirtPathogen Interaktion.
2.2.4 Anwendung der peptidischen Induktion in eukaryontischen
Organismen
Die Anwendung der TIPs war bisher auf prokaryontische Systeme beschränkt. Einzig die
W-TIP vermittelte Induktion einer auf der TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierenden
tTS Variante konnte in S. cerevisiae nachgewiesen werden (Stöckle, 2008). Diese tTS
Variante war jedoch aufgrund ihrer schwachen Repressionseigenschaften für weitere
Anwendungen ungeeignet. Eine auf TetR(B) wt basierende tTS Variante zeigte verbesserte
Repressionseigenschaften, jedoch konnte hier mit W-TIP keine Induktion in dem
S. cerevisiae Reportersystem nachgewiesen werden.
Zudem erfordert die Induktion von TetR in Eukaryonten die Lokalisation des Induktorpeptids
im Zellkern. Dadurch beschränkt sich die Anwendung in der Expressionsanalyse auf solche
Proteine, die sich im Zellkern befinden. Allerdings eröffnet diese Einschränkung auch völlig
neuartige Anwendungsmöglichkeiten wie beispielsweise die Analyse nucleo-cytoplasmatischer Transportprozesse.
2.3 Der nucleo-cytoplasmatische Transport
2.3.1 Die Rolle der Kernporen
Die Kernmembran der eukaryontischen Organismen umschließt das genetische Material und
trennt es somit vom Cytoplasma ab. Diese Kompartimentierung ermöglicht auf der einen
Seite die Kontrolle der Verteilung zellulärer Bestandteile zwischen Nukleoplasma und
Cytoplasma, erfordert allerdings auf der anderen Seite effiziente Transportmechanismen für
Moleküle unterschiedlichster Art. Für Moleküle, die nicht durch die Kernmembran
diffundieren können, führt der einzige Weg zwischen Zellkern und Cytoplasma durch die
Kernporenkomplexe. Diese bestehen aus den sogenannten Nucleoporinen und umfassen in
Säugetierzellen eine Masse von rund 125 MDa (Reichelt et al., 1990; Schwartz, 2005).
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2 Einleitung
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Kleine Moleküle können passiv durch die Kernporen diffundieren, ab einem Molekulargewicht von ca. 25 - 40 kDa ist jedoch ein aktiver Transport erforderlich (zusammengefasst
in (Fried et al., 2003)). Aus Versuchen mit Goldpartikeln definierter Größe wurde
geschlossen, dass der Transport von Partikeln bis zu einem maximalen Durchmesser von
39 nm möglich ist (Pante et al., 2002).
2.3.2 Zelluläre Mechanismen
Aufgrund der Vielfalt der nucleo-cytoplasmatischen Transportmechanismen sowie deren
Regulation wird an dieser Stelle nur auf die wohl am besten charakterisierte Form des
aktiven Transports eingegangen (zusammengefasst in (Terry et al., 2007)). Hierbei erfolgt
die Initiation des Transportprozesses durch die Bindung eines Transportrezeptors an
Signalsequenzen der zu transportierenden Proteine (Cargo). Je nach Transportrichtung
handelt es sich hierbei um eine sogenannte Kernlokalisationssequenz (NLS: „nuclear
localization sequence“) (Dingwall et al., 1991) oder eine Kernexportsequenz (NES: „nuclear
export sequence“). Eine einfache, einteilige NLS besteht aus einer Folge von positiv
geladenen Aminosäuren, wie es beispielsweise bei der NLS des large-T Antigens aus dem
SV40 Virus (SV40 NLS: PKKKRKVE) der Fall ist (Kalderon et al., 1984). Findet sich im
Abstand von 10 bis 12 Aminosäuren eine weitere Folge von positiv geladenen Resten,
spricht man von einer zweiteiligen NLS, wie sie im Nucleoplasmin aus Xenopus laevis
(KR-X10-KKKK) vorliegt (Robbins et al., 1991).
Im Falle von NLS-haltigen Proteinen handelt es sich bei den Transportrezeptoren um die
sogenannten α und β Importine (Imamoto et al., 1995). Hierbei binden die β Importine
entweder direkt oder indirekt über die als Adapterproteine fungierende α Importine an die
NLS des Cargos (Goldfarb et al., 2004; Conti et al., 2006). Importin β interagiert mit den
FG-Nucleoporinen der Kernporenkomplexe (Gorlich et al., 1999) und bewerkstelligt
schließlich den Transfer des Transportkomplexes durch die Kernpore in den Zellkern (Radu
1995, Moroianu 1995). Im Kern bindet die GTPase Ran in der GTP gebundenen Form
(Ran-GTP) an den Transportkomplex und bewirkt die Freisetzung des Cargos (Rexach et al.,
1995) (Abb. 3). Importin α und β werden im Anschluss wieder ins Cytoplasma
zurücktransportiert und können dort den nächsten Transportzyklus einleiten.
Der aktive Export aus dem Zellkern wird in vielen Fällen mit Hilfe des Exportrezeptors CRM1
(„chromosome region maintenance factor 1“) bewerkstelligt. CRM1 bindet mit geringer
Spezifität an leucinreiche Kernexportsequenzen (la Cour et al., 2003; Matsuyama et al.,
2006), wobei die Leucine in manchen Fällen durch andere hydrophobe Reste ersetzt werden
können (Hutten et al., 2007). CRM1 bindet an die NES des Cargo und die GTPase Ran in
der GTP gebundenen Form (Ran-GTP) wodurch ein ternärer Transportkomplex gebildet
wird. Der Transport dieses Komplexes ins Cytoplasma durch die Kernporen erfolgt über
einen nicht vollständig aufgeklärten Mechanismus (zusammengefasst in (Hutten und
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2 Einleitung
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Kehlenbach, 2007). Ran-GTP wird im Cytoplasma mit Hilfe des Ran GTPase aktivierenden
Proteins (Ran-GAP) hydrolysiert, was zur Dissoziation des Komplexes führt (Hutten und
Kehlenbach, 2007) (Abb. 3).
NES
Importin β
NLS
Ran-GAP
Cargo
1
Kernpore
NES
NLS
3
Ran-GTP
2
Ran-GDP
Cytoplasma
Kernmembran
Nukleoplasma
2
NES
Ran-GTP
1
Ran-GTP
NLS
CRM1
3
Ran-GTP
NES
Ran-GTP
NLS
Cargo
Abb. 3: Der nucleo-cytoplasmatische Transport über Importin β und CRM1
Die Transportrezeptoren Importin-β bzw. CRM1 (hellgraues bzw. dunkelgraues
Oval) erkennen das Cargo (grüner bzw. gelber Kreis) über Signalsequenzen an
dessen Oberfläche (NLS bzw. NES) und bilden einen Rezeptor-Cargo Komplex (1).
Der Komplex wird durch die Kernpore über die Kernmembran transportiert (2). Auf
der anderen Seite der Kernmembran erfolgt die Dissoziation des Rezeptor-Cargo
Komplexes, wodurch das Cargo freigesetzt wird (3). Im Importin β vermittelten
Kernimport wird die Dissoziation mit der Bindung von Ran-GTP (rotes Rechteck mit
abgerundeten Ecken) an den Rezeptor eingeleitet. Beim CRM1 vermittelten
Kernexport enthält der Rezeptor-Cargo Komplex zusätzlich Ran-GTP. Hier erfolgt
die Dissoziation des Komplexes im Cytoplasma durch Hydrolyse von Ran-GTP zu
Ran-GDP (rotes Rechteck mit abgeschnittenem Eck) mit Hilfe des Ran GTPase
aktivierenden Proteins (Ran-GAP, blaues Rechteck mit abgerundeten Ecken).
Abbildung und Legende modifiziert aus (Terry et al., 2007).
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2 Einleitung
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2.3.2 Methodik zur Analyse der subzellulären Lokalisation von Proteinen
Für die Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transportes von Proteinen ist es erforderlich,
deren subzelluläre Lokalisation detektieren zu können. Hierfür wird in den meisten Fällen
eines von zwei experimentellen Verfahren angewendet.
Im ersten Verfahren wird eine Translationsfusion aus dem Zielprotein und einem
fluoreszierenden Protein wie beispielsweise dem GFP aus Aequorea victoria hergestellt
(Shimomura et al., 1962). Die Lokalisation dieser Fusion kann anschließend am lebenden
Organismus im Fluoreszenzmikroskop analysiert werden (Gerdes et al., 1996). Ein Nachteil
dieser Methode besteht darin, dass fluoreszierende Proteine eine nicht unerhebliche Größe
besitzen. So umfasst beispielsweise GFP mit 238 AS eine Masse von ca. 27 kDa. Aufgrund
dessen kann bei dieser Methode die natürliche Funktion (Thomas et al., 2000), die
Löslichkeit (Lesley et al., 2002) oder auch die subzelluläre Lokalisation (Lisenbee et al.,
2003) des Zielproteins beeinflusst werden.
Die zweite Möglichkeit stellt die immunologische Detektion des Zielproteins innerhalb der
Zelle dar. Hierzu wird die zu untersuchende Zelle fixiert, permeabilisiert und mit einem
Primärantikörper gegen das Zielprotein behandelt. Dieser Primärantikörper kann im
Anschluss über einen mit Goldpartikeln (Faulk et al., 1979) oder Fluorophoren (Coons et al.,
1941) konjugierten Sekundärantikörper im Elektronen- oder Fluoreszenzmikroskop detektiert
werden. Diese Methode erfordert keine Modifikation des Zielproteins, allerdings kann dieses
Verfahren nicht am lebenden Organismus angewandt werden. Ein weiterer Nachteil dieser
Methode besteht darin, dass durch den Fixiervorgang die subzelluläre Lokalisation des zu
untersuchenden Proteins beeinflusst werden kann (Shibata et al., 2009).
2.3.3 Bedeutung des nucleo-cytoplasmatischen Transports bei viralen
Infektionen
Viele Tier- und Pflanzenviren replizieren innerhalb des Zellkerns ihres Wirtes. Dies bietet den
Vorteil, dass die zelluläre DNA-Replikations-, Transkriptions- oder Spleißmaschinerie für die
virale Replikation verwendet werden kann, setzt allerdings den Import des viralen Genoms in
den Zellkern voraus (zusammengefasst in (Whittaker et al., 2000)). In welcher Form das
virale Genom in den Zellkern transportiert wird, entscheidet hierbei oft die Größe des viralen
Kapsids. Dieses ist bei vielen Viren zu groß, um als Ganzes durch die Kernporen zu
gelangen, was ein „Auspacken“ des Genoms vor dem Kernimport erforderlich macht.
2.3.3.1 DNA Viren
Ein Beispiel aus der Gruppe der Viren mit doppelsträngigem DNA Genom stellen die
Herpesviren dar, die zu den größten und komplexesten im Zellkern replizierenden Viren
gehören (zusammengefasst in (Roizman et al., 1996)). Im Falle des Herpes simplex Virus 1,
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2 Einleitung
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eines der am besten charakterisierten Vertreter, bindet das Kapsid am Kernporenkomplex
und entlässt die DNA durch die Pore in den Kern (Batterson et al., 1983; Ojala et al., 2000).
Zu den Viren, deren Kapsid dagegen klein genug ist, um durch die Kernporen zu gelangen,
gehört das Hepatitis B Virus (HBV), ebenfalls mit einem Genom aus doppelsträngiger DNA.
Das Kapsid des HBV hat einen Durchmesser von 32 bis 36 nm und liegt somit nahe an der
maximalen Transportgröße der Kernporen von 39 nm (Pante und Kann, 2002; Rabe et al.,
2003). HBV bedient sich hierbei des zellulären Importin α/β Transportweges, wobei sich die
NLS im HBV Kapsidprotein befindet (Kann et al., 1999).
2.3.3.2 RNA Viren mit DNA Intermediat
Neben den DNA Viren finden sich auch unter den RNA Viren Vertreter, deren
Replikationszyklus Stadien innerhalb des Wirtszellkerns beinhaltet. So ist es für viele
Retroviren essentiell eine Kopie ihres eigenen Genoms in das des Wirtes zu integrieren
(Brown, 1997). Aus dem einzelsträngigen RNA Genom der Retroviren wird hierbei im
Cytoplasma der Wirtszelle mittels einer Virus-kodierten reversen Transkriptase eine
DNA-Kopie erstellt. Die Integration dieser DNA Kopie in das Genom des Wirtes setzt bei
Zellen in der Interphase einen Import in den Zellkern voraus. Die Unfähigkeit, die
Kernmembran zu überwinden, limitiert für viele Retroviren, wie beispielsweise dem murinen
Leukämievirus, das Wirtsspektrum auf proliferierende Zellen (Roe et al., 1993). Während der
Mitose findet eine Fragmentierung des Zellkerns statt, wodurch der Zugang der viralen DNA
zum Wirtsgenom möglich wird.
2.3.3.4 RNA Viren ohne DNA Intermediat
Die meisten RNA Viren ohne DNA Intermediat replizieren im Gegensatz zu den unter 2.3.3.2
erwähnten Vertretern im Cytoplasma der Wirtszelle. Ein möglicher Grund hierfür ist das
Fehlen einer RNA abhängigen RNA Polymerase in der Wirtszelle (zusammengefasst in
(Whittaker et al., 1998)). Allerdings finden sich unter diesen Viren auch Vertreter, deren
Genom im Zellkern repliziert wird. Hierzu gehören beispielsweise die Influenza A Viren, auf
die im Folgenden näher eingegangen wird.
2.4 Das Influenza A Virus
2.4.1 Genom und virale Proteine
Die Influenza A Viren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae, zu der auch die
Influenzaviren der Gattungen B und C gehören. Das Genom der Influenza A Viren besteht
aus 8 verschiedenen Segmenten einzelsträngiger RNA mit negativer Polarität. Die beiden
kleinsten Segmente 7 und 8 codieren für jeweils zwei Proteine, deren mRNAs durch
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2 Einleitung
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alternatives Spleißen entstehen. Hierbei kodiert das Segment 7 für die Matrixproteine 1 und
2 (M1 und M2), und das Segment 8 für die Nichtstrukturproteine 1 und 2 (NS1 und NS2).
Daneben gehören die beiden Proteine PB1 und PB2 („polymerase basic“), das PA Protein
(„polymerase acidic“), das Nucleoprotein (NP), die Neuraminidase (NA) und das
Hämagglutinin (HA) zu den vom Influenza A Genom kodierten Proteinen (zusammengefasst
in (Modrow et al., 2010)). PB1-F2 („polymerase acidic frame 2“) und das erst kürzlich
entdeckte PB1 N40 entstehen aus der für PB1 codierenden mRNA durch die Verwendung
alternativer Startcodons (Chen et al., 2001; Wise et al., 2009).
Das Virion der Influenza A Viren (Abb. 4) trägt auf seiner Oberfläche die NA und
HA Moleküle, deren Subtyp für die Klassifizierung der Influenza A Viren verwendet wird. Das
Hämagglutinin, von dem bisher 16 verschiedene Varianten bekannt (H1-H16) sind, bindet
während der Infektion an N-Acetyl-Neuraminsäuren auf der Oberfläche der Wirtszelle
(zusammengefasst in (Schulze, 1972; Skehel et al., 2000)). Die Neuraminidase mit neun
bekannten Subtypen (N1-N9) katalysiert die Abspaltung der N-Acetyl-Neuraminsäuren in
Glycoproteinen des Wirtes und fördert hierdurch die Freisetzung reifer Viruspartikel
(Varghese et al., 1992). Die Hülle des Virions besteht aus einer von der Wirtszelle
stammenden Lipiddoppelschicht, deren Innenseite mit M1 Molekülen ausgekleidet ist
(Fujiyoshi et al., 1994). M2 bildet einen Protonenkanal, der die Lipiddoppelschicht des
Virions durchspannt (Pinto et al., 1992). Innerhalb der Hülle befinden sich die Nucleocapside,
bestehend aus je einem Segment viraler RNA und den Proteinen NP, PA, PB1 und PB2
(zusammengefasst in (Portela et al., 1999)). Die RNA ist über die gesamte Länge mit
NP Molekülen assoziiert, wobei jedes NP Molekül 24 Nukleotide bedeckt (Ortega et al.,
2000). Die Proteine PA, PB1 und PB2 stellen die Komponenten der RNA-abhängige RNAPolymerase dar (Penhoet et al., 1971) und bilden einen Komplex am 3‘ Ende der RNA (Murti
et al., 1988). Die Nukleokapside sind durch die Interaktion zwischen NP und M1 an der
Virushülle verankert (Schulze, 1972).
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2 Einleitung
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Tamiflu®
Relenza®
NA
HA
Rimantadin
Amantadin
M2
M1
Hüllmembran
PB1-Protein
NP
PA-Protein
PB2-Protein
Nucleocapsid
virale RNA
Abb. 4: Aufbau des Influenza A Virus
Die acht Segmente des viralen Genoms bestehen aus einzelsträngiger RNA, die im Virion als Nucleocapside
im Komplex mit den Proteinen NP, PA, PB1 und PB2 vorliegen. Die Nucleocapside sind von einer Membran
umgeben, in welche die Oberflächenproteine HA, NA und M2 eingelagert sind. M1 bildet eine Proteinschicht
an der Innenseite der Membran aus. Die Wirkorte der unter 2.4.4.4 beschriebenen Therapeutika gegen
Influenza A sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet. Abbildung und Legende modifiziert aus (Modrow et al.,
2010).
2.4.3 Vermehrungszyklus
Nach der HA-vermittelten Bindung des Virion an die Wirtszelle, wird dieses über
rezeptorvermittelte Endocytose in die Zelle aufgenommen (Steinhauer, 1999). Im Endosom
erfolgt eine Ansäuerung des Virions durch die Aktivität von M2, was zur Depolymerisation
von M1 und zur Ablösung des NP von M1 führt (Bui et al., 1996). Durch die Ansäuerung der
Endosomen kommt es zum Verschmelzen der Endosomenmembran mit der Virusmembran
und infolgedessen zur Freisetzung der Nucleocapside in das Cytoplasma der Wirtszelle
(White et al., 1983). Von dort aus erfolgt der Transport der Nucleocapside über die
Kernporen in den Zellkern wo die Transkriptions- und Replikationsschritte stattfinden (Herz et
al., 1981; Whittaker et al., 1996). Obwohl alle Proteinkomponenten der Nucleocapside
(NP, PA, PB1 und PB2) mindestens eine NLS enthalten, wird der Kernimport der
Nucleocapside nur von den beiden NLSs im NP vermittelt (Nath et al., 1990; Mukaigawa et
al., 1991; Nieto et al., 1994; Neumann et al., 1997; Wang et al., 1997; Weber et al., 1998;
Wu et al., 2009). Die Kernlokalisationssequenzen von NP, PA, PB1 und PB2 werden im
weiteren Verlauf der Virusreplikation benötigt, um die neu synthetisierten Proteine in den
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2 Einleitung
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Zellkern zu transportieren. Dies ist erforderlich, da die Assemblierung neuer Nucleocapside
im Zellkern stattfindet (Lamb et al., 2001). Für den Kernexport der Nucleocapside bindet NP
erneut an M1 (Martin et al., 1991; Bui et al., 2000). Der anschließende CRM1-vermittelte
Export ins Cytoplasma erfolgt mit Hilfe von NS2, das aufgrund seiner Funktion auch als NEP
(„nuclear export protein“) bezeichnet wird (O'Neill et al., 1998; Elton et al., 2001; Ma et al.,
2001; Watanabe et al., 2001). Für die Bildung neuer Viruspartikel lagern sich NA, HA und M2
Moleküle in die Zellmembran des Wirtes ein. Diese stülpt sich mit Hilfe von M1 aus und
umschließt die Nucleocapside (Compans et al., 1975; Dubois-Dalcq et al., 1984; Patterson et
al.,
1988).
Die
Neuraminidase
hydrolysiert
die
N-Acetyl-Neuraminsäure
an
der
Virusoberfläche und der infizierten Zelle und verhindert somit ein Verkleben der Viruspartikel
sowie eine erneute Adsorption an die bereits infizierte Zelle (Colman, 1989; Huang et al.,
2008).
2.4.4 Bedeutung von Influenza A als Pathogen
2.4.4.1 Grippepandemien
Influenza A Viren sind hochinfektiöse Krankheitserreger, die beim Menschen die Echte
Grippe, auch Influenza genannt, auslösen (zusammengefasst in (Bouvier et al., 2010)).
Obwohl die Echte Grippe auch durch Infektion mit Influenza B Viren verursacht werden kann,
wurden die Grippepandemien der letzten 100 Jahre ausschließlich durch Influenza A
Subtypen verursacht. Die wohl schwerste Grippewelle in dieser Zeit stellte die Spanische
Grippe der Jahre 1918 - 20 dar. Dieser durch einen H1N1 Virus verursachten Erkrankung
fielen bis zu 50 Millionen Menschen zum Opfer (Johnson et al., 2002). Weitere Pandemien
waren die Asiatische Grippe (1957-58), die Hongkong Grippe (1968), die Russische Grippe
(1977) sowie die Neue Grippe im Jahre 2009 (zusammengefasst in (Modrow et al., 2010)).
2.4.4.2 Aktuelle Bedrohung durch Influenza A
Im Gegensatz zu den, in größeren zeitlichen Abständen auftretenden Pandemien treten
Grippeepidemien global betrachtet jährlich auf (zusammengefasst in (Potter, 2001)). Aktuell
zirkulieren humanadaptierte H1N1 und H3N2 Viren, wobei die Sterblichkeit in den saisonalen
Grippewellen bei der H3N2 Variante im Vergleich zur H1N1 Variante deutlich höher ist.
Neben diesen humanadaptierten Viren können allerdings auch Varianten mit anderer
Wirtsspezifität
eine
Gefahr
für
den
Menschen
darstellen.
Laut
Berichten
der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) infizierten sich im Zeitraum von 2003 bis Oktober 2011
über 550 Menschen mit einem aviären H5N1 Influenza A Virus, wobei annähernd 60 % der
Infektionen tödlich verliefen (WHO, 2011).
- 15 -
2 Einleitung
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2.4.4.3 Therapie von Influenza A Infektionen
Grippeviren sind einer ständigen Veränderung unterworfen (Bragstad et al., 2008) die
hauptsächlich durch zwei Mechanismen bedingt wird. Zum Einen entstehen durch die
Fehlerrate der virale Polymerase bei der Amplifikation des viralen Genoms Mutationen, was
zu einer ständigen Veränderung der viralen Proteine führt (Aggarwal et al., 2010). Zum
Anderen können durch Reassemblierung von RNA Segmenten bei gleichzeitiger Infektion
einer Zelle mit verschiedenen Viren völlig neue Virustypen entstehen (zusammengefasst in
(Ma et al., 2008)). Durch die resultierende Variabilität der Viren wird die auf wenige
Wirkstoffe beschränkte Therapie von Influenza A Infektionen zusätzlich erschwert. Im
Wesentlichen werden durch die verfügbaren Wirkstoffe zwei Proteine der Influenza A Viren
adressiert (siehe Abb. 4). Amantadin und Rimantadin, beides Derivate des Adamantan,
wirken auf das M2 Protein und interferieren auf diesem Weg mit der Invasion des Virus in die
Wirtszelle, können allerdings bereits im Organismus befindliche Viren nicht inaktivieren
(Belshe et al., 1988; Wang et al., 1993). Aufgrund ihrer Toxizität und der schnellen
Entwicklungen von Resistenzen durch Mutationen im M2 Protein sind die Adamantane
jedoch nur bedingt als Therapeutika geeignet (De Clercq, 2006). Daneben werden die
Neuraminidasehemmer Oseltamivir (Handelsname Tamiflu®) und Zanamivir (Handelsname
Relenza®) als Therapeutika eingesetzt, die die Ausbreitung der Influenzaviren im Körper
verhindern und den Krankheitsverlauf somit abschwächen (Monto et al., 1999; Lew et al.,
2000). Resistenzen gegen die Neuraminidasehemmer entstehen ebenfalls durch Mutationen
(zusammengefasst in (Gubareva, 2004)). Während der Grippewellen in den Jahren 2008/09
waren nahezu 100 % der in den USA zirkulierenden saisonalen H1N1 Viren gegen
Oseltamivir und alle H3N2 Isolate gegen Adamantane resistent (Dharan et al., 2009; Layne
et al., 2009). Daneben finden sich global H1N1 Isolate, die sowohl gegenüber Adamantanen,
als auch gegenüber Neuraminidasehemmern resistent sind (zusammengefasst in (Sheu et
al., 2011)). Aus diesen Beobachtungen wird ersichtlich, dass ein großer Bedarf an neuen
Wirkstoffen zur Therapie von Influenza A Infektionen besteht. Hierbei sind besonders solche
Substanzen interessant, die auf bisher nicht adressierte molekulare Komponenten der Viren
wirken. Einen möglichen Ansatzpunkt hierfür stellt der Import der viralen Proteine in den
Zellkern der Wirtszelle dar. Es konnte gezeigt werden, dass beispielsweise eine Inhibition
des NP Kernimports massive Auswirkungen auf die Effizienz der Infektion durch Influenza A
Viren hat (Cros et al., 2005; Kao et al., 2010).
- 16 -
2 Einleitung
_____________________________________________________________________________________________________
2.5 Motivation und Zielsetzung der Arbeit
Teilprojekt 1:
Die Anwendung der peptidischen Induktion von TetR beschränkte sich bisher auf
prokaryontische Organismen. Für eukaryontische Organismen konnte bislang lediglich die
Induktion einer auf der TetR Doppelmutante N82A/F86A basierenden tTS Variante in
S. cerevisiae nachgewiesen werden. Das erste Teilprojekt dieser Arbeit stellte die
Weiterführung dieser Arbeiten dar. Hierbei sollte das Reportersystem so weit modifiziert
werden, dass auch die peptidische Induktion einer auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante
mit im Vergleich zur Doppelmutante besseren Repressionseigenschaften gezeigt werden
kann.
Teilprojekt 2:
Aufbauend auf den Erkenntnissen, die aus dem ersten Teilprojekt gewonnen wurden
befasste sich das zweite Teilprojekt mit der Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse
nucleo-cytoplasmatischer Transportvorgänge. Hierbei sollten humane Zelllinien hergestellt
werden, mit denen die nukleäre Konzentration TIP-fusionierter Proteine über die Induktion
eines Tet-kontrollierten Reportergens analysiert werden kann. Dieses System sollte auf ein
kernlokalisiertes Protein aus dem Influenza A Virus angewendet werden.
Dieses Teilprojekt umfasste die folgenden Arbeitsschritte:
A)
Auswahl eines geeigneten Proteins aus dem Influenza A Virus.
B)
Auswahl geeigneter Komponenten und Konstruktion der humanen Reporterzelllinien.
C)
Anwendung der konstruierten Zelllinien auf das ausgewählte virale Protein und
Validierung des Reportersystems.
- 17 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3 ERGEBNISSE
3.1 Proteinvermittelte Induktion des Tet-Repressors in
S. cerevisiae
Ein Teilprojekt dieser Arbeit basierte auf einem Plasmid-kodierten Reportersystem für
S. cerevisiae, das für die Analyse der proteinvermittelten Induktion von TetR entwickelt
wurde (Stöckle, 2008). Mit Hilfe dieses Systems wurde erstmalig die Induktion einer tTS
Variante in einem eukaryontischen System gezeigt. Hierbei handelte es sich um eine auf der
TetR(B) Doppelmutante N82A/F86A basierende tTS Variante in Kombination mit der TIP
Variante W-TIP. Da diese tTS Variante allerdings nur schwache Repressionseigenschaften
aufwies, konnte nur innerhalb eines kleinen Messfensters gearbeitet werden. Eine auf
TetR(B) wt basierende tTS Variante zeigte verbesserte Repressionseigenschaften, jedoch
konnte hier mit W-TIP keine Induktion nachgewiesen werden. Ziel der Arbeit war es, dieses
System so weit zu modifizieren, dass die peptidische Induktion von TetR in S. cerevisiae
unter Verwendung der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante gezeigt werden kann.
3.1.1 Konzeption des Reportersystems
Das Reportersystem unterteilte sich in die drei Komponenten Reporter, Regulator und
Induktor. Zusammensetzung, Aufbau und Funktionsweise der Komponenten werden im
Folgenden erläutert und sind in Abbildung 5A und B schematisch dargestellt.
3.1.1.1 Reporter
Als Reporter diente GFP+, eine Variante des GFP aus Aequorea victoria (Shimomura et al.,
1962), das sich durch eine höhere Fluoreszenzausbeute und effektivere Faltung auszeichnet
(Scholz et al., 2000). Das gfp+ Gen stand unter transkriptioneller Kontrolle des adh1
Promotors aus Schizosaccharomyces pombe, der eine konstitutive Expression vermittelte
(Russell et al., 1983). Um eine konditionale Genexpression zu ermöglichen befand sich
stromaufwärts des adh1 Promotors eine TRE Sequenz mit sieben Wiederholungen des Tet
Operators tetO2 (Gossen und Bujard, 1992).
3.1.1.2 Regulator
Die TetR-abhängige Regulation des Reportergens wurde durch eine tTS Variante,
bestehend aus einer Translationsfusion von TetR(B) wt oder der Doppelmutante N82A/F86A
mit der Repressordomäne Ssn6 aus S. cerevisiae (Keleher et al., 1992) erzielt. Die
Expression der entsprechenden tTS Variante erfolgte über einen verkürzten cyc1 Promotor
aus S. cerevisiae der eine schwache konstitutive Expression vermittelte (Mumberg et al.,
1995). Die daraus resultierende, niedrige Konzentration des Regulators erhöhte die
- 18 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Sensitivität des Reportersystems. Reporter und Regulator wurden zusammen auf einem
„Shuttlevektor“ für S. cerevisiae und E. coli kodiert. Hierbei handelte es sich um die Vektoren
pWHE711-WT (TetR(B) wt) und pWHE711-N82A/F86A (TetR(B) N82A/F86A). In Abbildung
6A ist der Vektor pWHE711-WT stellvertretend für beide Vektoren dargestellt.
3.1.1.3 Induktor
Das TetR-induzierende Peptid W-TIP wurde am C-Terminus eines Trägerproteins exprimiert.
Dieses Trägerprotein bestand aus dem gelb fluoreszierenden mYFP („monomeric yellow
fluorescent protein“) (Zacharias et al., 2002) mit je einer SV40 NLS am N- und am
C-Terminus (mYFP(NLS)2-W-TIP). Die Expression von mYFP(NLS)2-W-TIP stand unter
transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors aus S. cerevisiae, dessen Aktivität durch
Zugabe von Methionin zum Nährmedium stufenlos reprimiert wird (Sangsoda et al., 1985;
Kerjan et al., 1986; Mumberg et al., 1994). Der Induktor wurde auf dem Plasmid pWHE705,
einem zweiten, mit pWHE711-WT bzw. pWHE711-N82A/F86A kompatiblen „Shuttlevektor“,
kodiert (Abb. 6B).
3.1.2 Funktionsweise des Reportersystems
Bei maximaler Repression des met25 Promotors durch entsprechend hohe Methioninkonzentrationen ist die Konzentration des Induktorpeptids W-TIP minimal. tTS besetzt die
tetO2 Operatoren im TRE und reprimiert den adh1 Promotor des Reportergens. Die Menge
an GFP+ ist daher minimal (Abb. 5A). Befindet sich kein Methionin im Medium, ist die
Aktivität des met25 Promotors und somit auch die Konzentration des Induktorpeptids
W-TIP maximal. W-TIP bindet und induziert tTS, wodurch dieser von der DNA dissoziiert. Die
Repression des adh1 Promotors ist aufgehoben und somit die GFP+ Expression maximal
(Abb. 5B).
- 19 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
A
B
CM
KM
CM
KM
+ Met
- Met
-
+
Pmet25
pWHE705
myfp
W-tip
Pmet25
pWHE705
mYFP(NLS)2-W-TIP
Expression
myfp
SV40 NLS
W-tip
SV40 NLS
tTS
Kernimport
tTS
TRE
pWHE711
Expression
Padh1
gfp+
TRE
pWHE711
Padh1
GFP+
gfp+
Abb. 5: Schematische Darstellung des Reportersystems in S. cerevisiae
Protein-kodierende Bereiche sind orange, eukaryontische Promotoren blau und das TRE, bestehend aus
sieben Wiederholungen des Tet-Operators tetO2, schwarz dargestellt. Die in grau abgebildete tTS Variante
setzt sich aus dem TetR Dimer (wt oder Mutante N82A/F86A, dunkelgrau) mit ovalem Proteinkörper und
runder DNA-Bindedomäne sowie der Ssn6 Repressordomäne (hellgrau) zusammen. mYFP ist als gelbes
Oval mit W-TIP als Anhängsel und GFP+ als grüner Kreis abgebildet. CM = Cytoplasmamembran,
KM = Kernmembran, pWHE711 steht für pWHE711-WT bzw. pWHE711-N82A/F86A.
A) Bei hohen Methioninkonzentrationen ist der met25 Promotor maximal reprimiert und somit die
Konzentration von mYFP(NLS)2-W-TIP minimal. Die tTS Variante besetzt das TRE und übt maximale
Repression auf den Promotor des Reportergens aus.
B) Befindet sich kein Methionin im Medium, ist die Konzentration von mYFP(NLS)2-W-TIP maximal. W-TIP
bindet und induziert TetR, wodurch die tTS Variante von der DNA dissoziiert.
A
B
ARSH4
CEN6
URA3
2µ
LEU2
AmpR
TRE
pMB1
Padh1
Pcyc1
pWHE705
pWHE711-WT
7611 bp
11396 bp
gfp+
tetR(B) wt
Terminatoren
Terminator
W-tip
SV40 NLS
ssn6
AmpR
pMB1
myfp
Pmet25
SV40 NLS
Abb. 6: Schematische Darstellung der Vektoren pWHE711-WT (A) und pWHE705 (B)
Protein-kodierende Bereiche sind orange, Replikationsursprünge grün [2µ, ARSH4/CEN6
(S. cerevisiae), pMB1 (E. coli)], eukaryontische Promotoren blau und das TRE schwarz dargestellt.
Die Positionen von Kernlokalisationssequenzen und Terminatoren sind mittels schwarzer Striche
R
gekennzeichnet. Amp kodiert für die Ampicillinresistenz, URA3 (Orotidin-5’-P-Decarboxylase) und
LEU2 (3-Isopropylmalat-Dehydratase) bezeichnen die Selektionsmarker für S. cerevisiae.
- 20 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.1.3 Modifikation des Reportersystems
Abweichend von dem unter 3.1.1 dargestellten Reportersystem wurde in dieser Arbeit ein
anderes Induktorpeptid eingesetzt und das Trägerprotein neu konstruiert. Als peptidischer
Induktor kam TIP2 zum Einsatz, der im bakteriellen Kontext in Kombination mit TetR(B) wt
eine deutlich höhere Induktionseffizienz verglichen mit W-TIP zeigte (Goeke et al., 2011).
Um Überlagerungen zwischen den Anregungs- und Emissionsspektren des Reporter- und
des Trägerproteins zu vermeiden, wurde als fluoreszierende Proteinkomponente des
Trägerproteins mCherry (Shaner et al., 2004) statt mYFP verwendet,. Alle anderen
Komponenten des Reportersystems wurden beibehalten (siehe unter 3.1.1).
3.1.3.1 Konstruktion des Trägerproteins
Das Trägerprotein für TIP2 musste im Wesentlichen zwei Kriterien erfüllen. Zum Einen ist für
eine effiziente Induktion eine hohe Konzentration des Induktorpeptids nötig, das
Trägerprotein sollte daher möglichst hoch exprimiert werden. Zum Anderen muss das
Trägerprotein für die Interaktion zwischen Induktorpeptid und tTS möglichst stark im Zellkern
angereichert sein. Um die optimale Kombination aus Expression und subzellulärer
Lokalisation zu erhalten, wurden im Rahmen dieser Arbeit sieben verschiedene Varianten
des Trägerproteins konstruiert und miteinander verglichen. Der Aufbau der einzelnen
Varianten wird im Folgenden näher erläutert und ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tab. 1: Übersicht über den Aufbau der Trägerprotein-Varianten
BP SV40 NLS = (KRTADGSEFESPKKKRKVE), SV40 NLS = (PKKKRKVE), c-Myc NLS = (PAAKRVKLDE),
BP SV40 A6 NLS = (KRTADGSEFESPKKKRAVE), X6 = (ASMTGG), Z10 = (ASGLVPRGSH).
Variante
„Leader-
N-terminale
„Linker-
fluoreszierendes Protein
C-terminale
Nr.
Sequenz“
NLS
Sequenz“
(Codonadaptation des Gens)
NLS
1
–
SV40
–
mCherry (human)
–
2
–
SV40
–
mCherry (human)
SV40
3
X6
BP SV40
Z10
mCherry (human)
–
4
–
SV40
Z10
mCherry (human)
–
5
Serin
BP SV40 A6
Z10
mCherry (Hefe)
–
6
Serin
c-Myc
Z10
mCherry (Hefe)
–
7
–
SV40
Z10
mCherry (Hefe)
–
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3 Ergebnisse
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Variante 1
In der Variante 1 wurde die Sequenz der SV40 NLS (Kalderon et al., 1984) direkt an den
N-Terminus von mCherry fusioniert. Das hier verwendete mcherry Gen stammt aus dem
Vektor pE1411 (Danke, 2010) und ist an den humanen Codongebrauch angepasst.
Variante 2
Bei dieser Variante wurde an die Variante 1 zusätzlich eine C-terminale SV40 NLS angefügt.
Da TIP2 ebenfalls an den C-Terminus des Trägerproteins fusioniert wurde, konnte eine
Interferenz von TIP2 mit der Bindung des Kernimportrezeptors an die NLS nicht
ausgeschlossen werden. Um diesen potentiellen Effekt zu adressieren, wurde die
Eigenschaften dieser Variante nicht wie bei den anderen Varianten ohne TIP2, sondern
anhand der TIP2 Fusion untersucht.
Variante 3
Bei der Variante 3 wurde an den N-Terminus von mCherry eine 33 AS lange Sequenz
fusioniert, die aus Hodel et al. übernommen wurde (Hodel et al., 2001). Diese Sequenz
enthält eine zweiteilige SV40 NLS (BP SV40 NLS), die über eine 10 AS lange „Linkersequenz“ an mCherry fusioniert wurde. Diese synthetische, 17 AS umfassende NLS enthält
die SV40 NLS mit zwei weiteren, positiv geladenen Resten im Abstand von neun AS.
Weiterhin befindet sich am N-Terminus der BP SV40 NLS noch eine sechs AS lange
„Leadersequenz“ bei der es sich um einen Teil einer ehemaligen „Linkersequenz“ für einen
„Histidin-Tag“ handelt. Diese wurde bei der Deletion des „Histidin-Tag“ nicht vollständig
entfernt. Wie schon bei den Varianten 1 und 2 wurde das humanadaptierte mcherry Gen aus
pE1411 verwendet. Variante 3 exprimierende Zellen zeigten bei Anzucht auf Festmedium ein
stark verzögertes Wachstum. Üblicherweise waren nach Transformation oder Vereinzelung
des verwendeten Hefestamms K699 nach maximal 48 Stunden Einzelkolonien sichtbar. Im
Falle von Variante 3 waren hierfür etwa 72 Stunden Inkubation notwendig. Aufgrund dieser
Beobachtungen wurde zusätzlich zur Expression und subzellulären Lokalisation auch der
Einfluss der einzelnen Varianten auf das Wachstum von S. cerevisiae untersucht (siehe
unter 3.1.3.3).
Variante 4
Die Variante 4 entspricht im Aufbau der Variante 1, allerdings wurde hier die 10 AS lange
„Linkersequenz“ aus Variante 3 zwischen die SV40 NLS und mCherry eingefügt.
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3 Ergebnisse
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Variante 5
Für die Variante 5 wurde ein an den Codongebrauch von S. cerevisiae adaptiertes mcherry
Gen aus dem Vektor pSB2K3-BBaE2060 (Nevozhay et al., 2009) verwendet. Die
N-terminale BP SV40 A6 NLS unterscheidet sich von der in Variante 3 verwendeten
BP SV40 NLS nur durch den Aminosäureaustausch K6A1 (Hodel et al., 2001). Weiterhin
wurde im Vergleich zu Variante 3 die N-terminale „Leadersequenz“ entfernt. Um eine positiv
geladene Aminosäure am N-Terminus und die damit verbundene kurze Halbwertszeit zu
vermeiden (siehe unter 4.1.2.3.2), wurde ein einzelnes Serin an den N-Terminus angefügt.
Variante 5 zeigte auf Festmedium den gleichen Wachstumsdefekt wie Variante 3.
Variante 6
Variante 6 leitete sich von Variante 5 durch Austausch der BP SV40 A6 NLS gegen die NLS
des humanen Protoonkogens c-Myc ab (Dang et al., 1988).
Variante 7
Die Variante 7 entspricht im Aufbau der Variante 4. Allerdings wurde hier das hefeadaptierte
mcherry Gen aus dem Vektor pSB2K3-BBaE2060 verwendet.
3.1.3.2 Subzelluläre Lokalisation der Trägerprotein-Varianten
Für die Analyse der subzellulären Lokalisation der einzelnen Trägerprotein-Varianten in
S. cerevisiae wurden fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen durchgeführt. Um hierbei
den Kontrast zwischen Zellkern und Cytoplasma zu erhöhen, wurden die mit den
entsprechenden Plasmiden transformierten Zellen mit dem DNA bindenden Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindol) behandelt. DAPI zeigt eine blaue Fluoreszenz
(Emissionsmaximum λem = 453 nm), wenn es mit UV-Licht angeregt wird (Anregungsmaximum λex = 347 nm). In der DNA-gebundenen Form verschieben sich die Anregungsund Emissionsmaxima auf 363 nm und 448 nm und die Fluoreszenzquantenausbeute steigt
mehr als 20-fach an (Kapuscinski, 1995). Eine entsprechende Aufnahme für die Variante 7
findet sich in Abbildung 7. In den hier abgebildeten Zellen ist eine deutliche, subzelluläre
Akkumulation der roten mCherry Fluoreszenz in einem Areal zu erkennen, dass durch die
Färbung mit DAPI als Zellkern identifiziert wird. Eine solche fluoreszenzmikroskopische
Aufnahme zeigt allerdings lediglich einen kleinen Ausschnitt aus der Gesamtpopulation. Für
die fotografische Dokumentation größerer Zellpopulationen muss die Fluoreszenzintensität
der einzelnen Zellen auf einem vergleichbaren Niveau liegen. Aus der Abbildung 7B, die
1
Die Mutation befindet an Position 6 der SV40 NLS, bezogen auf die BP SV40 NLS handelt es sich um die
Position 17.
- 23 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
einen größeren Bildausschnitt als die Abbildung 7A zeigt, geht allerdings hervor, dass die
Fluoreszenzintensität der einzelnen Zellen stark voneinander abweicht. Daneben konnte
beobachtet werden, dass die nukleäre Anreicherung in den einzelnen Zellen unterschiedlich
stark ausgeprägt war. Diese Beobachtungen decken sich mit den Erkenntnissen aus
vergleichbaren Untersuchungen (Hodel et al., 2006). Um eine möglichst umfassende
Aussage über die subzelluläre Lokalisation der einzelnen Trägerprotein-Varianten zu
erstellen, wurden alle, für die einzelnen Varianten kodierenden Plasmide sowie der für
mYFP(NLS)2-W-TIP kodierende Vektor pWHE705 (siehe unter 3.1.1.3) parallel in Hefe
transformiert und im Mikroskop analysiert. Die nukleäre Anreicherung der entsprechenden
Proteine wurde miteinander verglichen und für jedes Konstrukt eine der 4 Wertungen 0, +, ++
und +++ vergeben. Bei 0 wurde keine Zelle mit nukleärer Akkumulation gefunden. Die
Anzahl der Pluszeichen beschreibt den Anteil von Zellen der Gesamtpopulation mit nukleärer
Anreicherung. + bedeutet, dass die Akkumulation bei einigen Zellen, ++ bei der
überwiegenden Anzahl von Zellen und +++ bei allen Zellen zu beobachten war. Weiterhin
war bei steigender Anzahl von Zellen mit Akkumulation im Zellkern auch eine generelle
Abnahme der jeweiligen Restfluoreszenz im Cytoplasma zu erkennen. Eine ausschließlich
Lokalisation im Zellkern konnte in dieser Arbeit nicht beobachtet werden. Die Bewertung der
einzelnen Konstrukte findet sich in Tabelle 2. Bei mYFP(NLS)2-W-TIP wurde aus dem
gleichen Grund wie bei der mCherry Variante 2 die TIP Fusion für die Vergleichsanalysen
verwendet (siehe unter 3.1.3.1 Variante 2).
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3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
A
B
Abb. 7: Subzelluläre Lokalisation der Trägerprotein-Variante 7 in S. cerevisiae
A) Von links: mCherry in rot, Zellkern (DAPI) in blau, Überlagerung mCherry und DAPI,
Hellfeld
B) Größerer Bildausschnitt um die Zellen aus A), diese sind mittels eines weißen
Rechtecks gekennzeichnet.
Tab. 2: Nukleäre Anreicherung der einzelnen Trägerprotein-Varianten in S. cerevisiae
Die Wertungen 0, ++, +++ und +++ beschreiben den Anteil von Zellen an der Gesamtpopulation mit sichtbarer
Anreicherung im Zellkern. 0 ≙ keine Zelle / + ≙ wenige Zellen / ++ ≙ mehr als 50 % der Zellen / +++ ≙ alle Zellen
Anreicherung
Konstrukt
im Zellkern
mCherry Variante 1
0
mCherry Variante 2
+
mCherry Variante 3
+++
mCherry Variante 4
++
mCherry Variante 5
+++
mCherry Variante 6
+
mCherry Variante 7
++
mYFP(NLS)2-W-TIP
++
- 25 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.1.3.3 Einfluss der Trägerprotein-Varianten auf das Wuchsverhalten von
S. cerevisiae
Da die Varianten 3 und 5 ein verlangsamtes Wachstum auf Festmedium zeigten, wurde von
allen Varianten eine Wuchskurve in Minimal-Flüssigmedium für das Wachstum bei 28 °C
erstellt (Abb. 8). Zellen, die mit den für die Varianten 1, 2, 4, 5, 6 oder 7 kodierenden
Plasmiden bzw. dem Leervektor p425Met252 transformiert wurden, zeigten ein vergleichbares Wuchsverhalten ohne signifikante Unterschiede in den einzelnen Wuchsphasen. Im
Gegensatz dazu wurde für die Variante 3 ein deutlich abweichendes Wuchsverhalten mit
einem stark verzögerten Übergang von der Anpassungs- in die logarithmische Phase
beobachtet. Während der logarithmischen Phase hingegen wurde bei der Variante 3 eine,
mit den anderen Ansätzen vergleichbare Wachstumsgeschwindigkeit erreicht.
10
Variante 1
Variante 2
oD600
Variante 3
Variante 4
1
Variante 5
Variante 6
Variante 7
p425Met25
0,1
0
200
400
600
800
1.000
1.200
t [min]
Abb. 8: Einfluss der Trägerprotein-Varianten auf das Wachstum von
S. cerevisiae
Für die Wuchskurven wurden S. cerevisiae Zellen mit den für die
Varianten 1 - 7 kodierenden Plasmiden oder dem Leervektor p425Met25
transformiert. Aus einer stationären Vorkultur dieser Zellen wurden für die
Hauptkultur 100 ml Minimalmedium auf eine oD600 von 0,1 beimpft. In
regelmäßigen Zeitabständen wurden Proben entnommen und die
entsprechende oD600 wurde bestimmt. Die so erhaltenen Werte sind auf
der Ordinate gegen den entsprechenden Zeitpunkt der Probenentnahme
auf der Abszisse aufgetragen. Die Anzucht der Zellen erfolgte bei 28 °C.
2
p425Met25 ist der Ausgangsvektor für die Herstellung der Trägerprotein-Expressionsvektoren.
- 26 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.1.3.4 Expression der Trägerprotein-Varianten
Die Expression der Trägerprotein-Varianten 1, 2, 4, 5, 6 und 7 wurde über die Fluoreszenzintensität entsprechend transformierter S. cerevisiae Kulturen quantifiziert. Die Variante 3
konnte wegen der starken Wachstumsverzögerung in Flüssigkultur im Rahmen des
angewendeten Messprotokolls nicht zu einer ausreichenden Zelldichte angezogen werden.
Die Messergebnisse sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Varianten 1, 4 und 7 zeigten mit
259 ± 24 × 103 cps, 214 ± 26 × 103 cps und 257 ± 9 × 103 cps ein sehr ähnliches Fluoreszenzniveau. Die Werte im Fall von Variante 2 waren im Vergleich dazu mit
79 ± 11 × 103 cps deutlich niedriger und im Fall von Variante 6 mit 349 ± 14 × 103 cps
deutlich höher. Die schwächste Fluoreszenz wurde für die Variante 5 mit 6 ± 2,5 × 103 cps
gemessen.
40
Fluoreszenz
104 [cps]
35
30
25
20
15
10
5
0
Abb. 9: Vergleich der Expressionsniveaus der Trägerprotein-Varianten
S. cerevisiae wurde mit dem für die entsprechende Variante kodierenden
Plasmid transformiert und bei 28 °C in Minimalmedium angezogen. Die
Quantifizierung der Fluoreszenzintensität erfolgte im Spektralfluorimeter bei
den Anregungs- und Emissionsmaxima für mCherry (λex = 587/ λem = 610 nm).
Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus
zwei unabhängigen Messungen mit zwei technischen Replikaten ermittelt.
- 27 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.1.4 Aufbau des Reportersystems mit der Trägerprotein-Variante 7
Die Trägerprotein-Variante 7 hatte keinen negativen Einfluss auf das Wachstum von
S. cerevisiae und zeigte die beste Kombination aus hoher nukleärer Anreicherung und
starker Expression, weshalb sie als neues Trägerprotein für TIP2 eingesetzt wurde. Die
Trägerprotein-Variante 7 wird in den folgenden Ausführungen aus Gründen der Übersichtlichkeit als mCherry7 bezeichnet. Das Induktorpeptid TIP2 wurde über eine SGGA
„Linkersequenz“ an den C-Terminus von mCherry7 (mCherry7-TIP2) fusioniert, als Kontrolle
diente mCherry7 ohne TIP2. Für die im Folgenden beschriebenen Messungen wurden jeweils
zwei Plasmide in S. cerevisiae transformiert und die entsprechende GFP+ bzw. mCherry
Fluoreszenz wurde im Spektralfluorimeter vermessen. Das erste Plasmid war in allen Fällen
der Vektor pWHE711-WT, kodierend für tTS und GFP+ (im Folgenden als tTS + Reporter
bezeichnet). Bei dem zweiten Plasmid handelte es sich entweder um das Plasmid
pWHE705/C7 (mCherry7), pWHE705/C7-TIP2 (mCherry7-TIP2) oder um den Leervektor
p425Met25. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Abbildung 10 und in Tabelle 3
zusammengefasst.
3.1.4.1 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + p425Met25
In diesem Ansatz wurde die GFP+ Fluoreszenz in An- und Abwesenheit von Dox vermessen.
Hierbei wurde eine Konzentration von 0,24 µg/ml Dox verwendet, die ausreicht, um die hier
verwendete tTS Variante maximal zu induzieren (Stöckle, 2008). Die GFP+ Fluoreszenz in
Anwesenheit von Dox war im Vergleich zum uninduzierten Zustand um Faktor 2,2 höher
(siehe unter 4.1.3). Sowohl der Regulationsfaktor, als auch die gemessenen Absolutwerte
stimmten mit den Ergebnissen aus vorhergehenden Messungen überein (Stöckle, 2008).
3.1.4.2 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7 (mCherry7)
Hier konnte durch Zugabe von 150 mg/l Methionin (maximale Repression des met25
Promotors) eine 6-fache Repression der mCherry Fluoreszenz erreicht werden. Die für die
Regulation des met25 Promotors eingesetzten Methioninkonzentrationen wurden aus
vorhergehenden Titrationsexperimenten (Mumberg et al., 1994; Stöckle, 2008) übernommen
und an das System angepasst. Die GFP+ Fluoreszenz lag unabhängig von der
entsprechenden mCherry Fluoreszenz auf einem konstanten Niveau, das ca. 13 % über dem
Wert lag, der in Abwesenheit von mCherry7 (siehe unter 3.1.4.1 ohne Dox) gemessen wurde.
- 28 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.1.4.3 pWHE711-WT (tTS + Reporter) + pWHE705/C7-TIP2 (mCherry7-TIP2)
In diesem Ansatz wurde durch Zugabe von Methionin eine 11-fache Repression der mCherry
Fluoreszenz erreicht. Der im Vergleich zu den Messungen ohne TIP2 höhere Faktor
resultierte aus einer geringeren mCherry Fluoreszenz bei maximaler Methioninkonzentration.
Im Gegensatz zu den Messungen mit mCherry7 ohne TIP2 wurde hier ein eindeutiger
Anstieg der GFP+ Fluoreszenz in Abhängigkeit von der mCherry7-TIP2 Expression
gemessen. Bei höchster mCherry7-TIP2 Expression wurde sogar die maximale Induktion des
Systems erreicht (siehe unter 3.1.4.1 mit Dox). Mit abnehmender mCherry7-TIP2 Expression
reduzierte sich die GFP+ Fluoreszenz bis auf ca. 75 % des Maximalwertes (siehe unter
4.1.3).
tTS + Reporter +
mCherry7
tTS + Reporter +
mCherry7-TIP2
75.000
50.000
65.000
40.000
55.000
30.000
45.000
20.000
35.000
10.000
25.000
0
Fluoreszenz mCherry [cps]
Fluoreszenz GFP+ [cps]
tTS +
Reporter
Methioninkonzentration [mg/l]
Abb. 10: Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante durch TIP2 in S. cerevisiae
S. cerevisiae wurde mit den entsprechenden Plasmiden transformiert und bei 28 °C in Minimalmedium
angezogen. Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität erfolgte im Spektralfluorimeter bei den Anregungsund Emissionsmaxima für GFP+ (λex = 491/ λem = 512 nm) bzw. mCherry (λex = 587/ λem = 610 nm). Die
GFP+ Fluoreszenz ist durch schwarze Balken mit Skalierung auf der linken Ordinate und die mCherry
Fluoreszenz mit grauen Balken und Skalierung auf der rechten Ordinate dargestellt. Direkt aneinander
grenzende Balken stellen die GFP+ und mCherry Fluoreszenz desselben Ansatzes dar. Durch Zugabe von
Methionin zum Kulturmedium wurde das Expressionsniveau von mCherry 7 bzw. mCherry7-TIP2 eingestellt.
Dox wurde in einer Konzentration von 0,24 mg/l eingesetzt, w/o bezeichnet einen Ansatz ohne Zugabe von
Dox. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus zwei unabhängigen
Messungen mit zwei technischen Replikaten ermittelt.
- 29 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Tab. 3: Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS Variante durch TIP2 in S. cerevisiae
Die Messdaten liegen der in Abbildung 10 gezeigten Messungen zugunde. Die hier dargestellten Mittelwerte
und Standardabweichungen wurden aus zwei unabhängigen Messungen mit zwei technischen Replikaten
ermittelt.
Transformierte
Konstrukte
tTS + Reporter
tTS + Reporter +
mCherry7
tTS + Reporter +
mCherry7-TIP2
Effektor
GFP+ Fluoreszenz
[cps]
mCherry Fluoreszenz
[cps]
–
29010
±
640
–
0,24 mg/l Dox
65220
±
560
–
–
32600
±
2010
27190
±
1990
3 mg/l Met
33280
±
1170
18750
±
390
10 mg/l Met
32500
±
140
8750
±
170
150 mg/l Met
32600
±
140
4540
±
140
–
65670
±
120
24350
±
1630
3 mg/l Met
63700
±
3400
17680
±
1680
10 mg/l Met
59430
±
150
4350
±
1070
150 mg/l Met
49100
±
5440
2260
±
420
3.4.1 Simultane Messung der GFP+ und mCherry Fluoreszenz
Um eine gegenseitige Beeinflussung der fluoreszenzspektroskopischen Eigenschaften von
mCherry und GFP+ auszuschließen, wurden entsprechende Kontrollen durchgeführt. Hierfür
wurde bei Zellen, die jeweils nur eines der beiden fluoreszierenden Proteine in unterschiedlicher Stärke exprimierten, auch die Hintergrundfluoreszenz für das nicht exprimierte
Fluoreszenzprotein gemessen. Dabei konnte im Vergleich mit Zellen, die weder GFP+ noch
mCherry exprimierten, keine signifikante Abweichung festgestellt werden. Aufgrund dieser
Ergebnisse wird ersichtlich, dass in dem hier gezeigten Reportersystem eine unabhängige
Messung der GFP+ und mCherry Fluoreszenz bei gleichzeitiger Expression möglich ist.
- 30 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2 Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse des
nucleo-cytoplasmatischen Transports
3.2.1 Konzeption
Das Ziel des zweiten Projektes dieser Arbeit war die Konstruktion von humanen
Reporterzelllinen zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen Transports viraler Proteine. Die
zu analysierenden Proteine, im Folgenden als POIs („protein of interest“)3 bezeichnet,
wurden als Fusion mit einer TIP Variante konstitutiv in der Reporterzelllinie exprimiert. Diese
POI-TIP Fusion war in der Lage einen, ebenfalls konstitutiv exprimierten, Tetrazyklinabhängigen Transregulator (tTR) zu regulieren. Neben den Expressionskassetten für POITIP und tTR umfasste das System weiterhin ein Reportergen, dessen Transkription durch
tTR kontrolliert wurde. Da die Regulation des tTR-abhängigen Reporters durch die POI-TIP
Fusion nur dann erfolgen konnte, wenn sich diese im Zellkern befand, bestand ein direkter
Zusammenhang zwischen der subzellulären Lokalisation der POI-TIP Fusion und der
Expression des Reportergens. Der Aufbau und die Funktionsweise des Reportersystems
werden im Folgenden erläutert und sind in den Abbildungen 11A und B dargestellt.
3.2.2 Aufbau und Funktionsweise des Reportersystems
Die drei Komponenten des Reportersystems, der Induktor, der Regulator und der Reporter
wurden unabhängig voneinander in das Genom der Reporterzelllinie integriert. Der Reporter
bestand aus dem luc Reportergen4 unter transkriptioneller Kontrolle eines Minimalpromotors.
Der hier verwendete Minimalpromotor stellte eine verkürzte Variante des CMVIE5 Promotors
(Gossen und Bujard, 1992) dar und wird im Folgenden als CMVmin bezeichnet. Die
Tet-abhängige Kontrolle dieses Promotors wurde durch ein stromaufwärts positioniertes
TRE, bestehend aus sieben Kopien des Tet Operators tetO2 erreicht (Gossen und Bujard,
1992). Als tTR Variante wurde ein Tetrazyklin-abhängiger Transaktivator (tTA) gewählt, der
sich aus TetR(B) wt und drei Wiederholungen der F Aktivatordomäne (als FFF bezeichnet)
aus dem VP16 Protein des Herpes simplex Virus zusammensetzte (Baron et al., 1997).
Diese 39 AS umfassende, synthetische Aktivatordomäne wurde an den C-Terminus von
TetR fusioniert (TetR-FFF). Die Expression dieser tTA Variante erfolgte konstitutiv über
einen CMVIE Promotor. Als Induktorkomponente wurde TIP2 (Goeke et al., 2011) an den
C-Terminus des POI fusioniert. Die POI-TIP2 Fusion wurde durch den synthetischen
3
Das für POI kodierende Gen wird als goi („gene of interest“) bezeichnet.
luc kodiert für die Luciferase aus Photinus pyralis (McElroy et al., 1969).
5
CMVIE bezeichnet den starken „major immediate early“ Promotor des humanen Cytomegalievirus. (Akrigg et al.,
4
1985)
- 31 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
hEF1-HTLV6 Promotor (InvivoGen) konstitutiv auf hohem Niveau exprimiert. Befand sich die
POI-TIP2 Fusion im Zellkern, induzierte TIP2 die tTA Variante, die somit nicht mehr an die
Tet-Operatoren des TRE binden konnte. Ohne eine Aktivierung des CMVmin Promotors fand
lediglich eine schwache Basalexpression der Luciferase statt (Abb. 11A). Befand sich die
POI-TIP2 Fusion hingegen im Cytoplasma der Zelle, konnte tTA an die tetO2 Operatoren des
TRE binden und führte, vermittelt durch die FFF-Domäne, zu einer Aktivierung des CMVmin
Promotors, was eine hohen Expression der Luciferase bewirkte (Abb. 11B).
A
B
CM
CM
KM
KM
POI-TIP2
POI-TIP2
Expression
PCMV IE
Expression
tip2
goi
tTA
tip2
goi
PCMV IE
Kernimport
Luciferase
tTA
+
TRE
PCMVmin
luc
TRE
PCMVmin
Expression
luc
Abb. 11: Schematische Darstellung des Reportersystems zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen
Transports
Die hier gezeigten, genetischen Komponenten sind stabil in das Genom der Reporterzelllinie integriert. Proteinkodierenden Bereiche sind orange, Promotoren blau und das TRE schwarz dargestellt. Der in grau dargestellte
tTA setzt sich aus dem TetR Dimer (dunkelgrau) mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne sowie
der FFF Aktivatordomäne (hellgrau) zusammen. Das Gen für die tTA Variante ist ebenfalls chromosomal
integriert und wird über den hEF1-HTLV Promotor konstitutiv exprimiert. Die Luciferase ist als gelber Kreis und
die POI-TIP2 Fusion als rotes Oval mit TIP2 als Anhängsel dargestellt. CM = Cytoplasmamembran,
KM = Kernmembran, das Reportergen luc kodiert für die Luciferase aus Photinus pyralis.
A) Befindet sich die POI-TIP2 Fusion im Zellkern, kann TIP2 tTA induzieren worauf hin dieser von den
Tet-Operatoren des TRE dissoziiert. Der CMV min Promotor des luc Gens wird nicht aktiviert und zeigt somit nur
geringe Aktivität (nicht eingezeichnet).
B) Befindet sich die POI-TIP2 Fusion im Cytoplasma, kann tTA an die Tet-Operatoren des TRE binden und den
CMVmin Promotor aktivieren. Es findet eine hohe Expression der Luciferase statt.
3.2.3 Auswahl des POI
Als potentielle POIs wurden drei Proteine aus dem Influenza A Virus ausgewählt. Hierbei
handelte es sich um das Nucleoprotein (NP), das Nichtstrukturprotein 1 (NS1) und das
Matrixprotein 1 (M1) (siehe unter 2.4.1). Alle drei Proteine zeigen bei Expression in nicht
infizierten humanen Zelllinien eine nukleäre Anreicherung. Daneben existieren von allen drei
Proteinen Mutanten, die eine cytoplasmatische Lokalisation aufweisen (Ye et al., 1995; Li et
6
Der hEF1-HTLV Promotor setzt sich aus dem „core“ Promotor des humanen Elongationsfaktors EF-1α (Kim et
al., 1990) sowie dem R Segement und der R-U5‘ Sequenz des humanen T-Zell Leukämievirus (HTLV) (Takebe
et al., 1988) zusammen.
- 32 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
al., 1998; Cros et al., 2005). Diese Mutanten sollten als Kontrollen für die Funktionalität des
Reportersystems dienen.
3.2.3.1 Das Matrixprotein M1
Das M1 Protein verfügt über eine einteilige NLS mit vier positiv geladenen Resten an den
Positionen 101-105 (101RKLKR105) (Ye et al., 1995). Ye et al. konnten zeigen, dass der
Austausch der geladenen gegen ungeladene Reste (101SNLNS105) zu einer cytoplasmatischen M1 Variante führt. Diese Experimente basierten auf dem M1 Protein aus Influenza
A/WSN/1933 (H1N1), das für diese Arbeiten nicht zur Verfügung stand. Stattdessen wurde
hier die Variante aus dem Virusstamm Influenza A/FPV/Rostock/1934 (H7N1) verwendet.
Ein Sequenzvergleich der beiden M1 Varianten findet sich in Abbildung 12. Die Aminosäuresequenzen stimmen zu 96% überein und die NLS ist identisch. Aufgrund dessen
wurden die gleichen Mutationen wie bei Ye et al. beschrieben in das M1 Protein eingeführt,
um auch hier eine cytoplasmatische Lokalisation zu erreichen. Diese mutierte Variante wird
im Folgenden als M1Mut und das entsprechende Gen als m1mut bezeichnet. Das für diese
Arbeit verwendete m1 Gen aus dem Plasmid pHH-M (Thaa et al., 2009) enthielt die bereits
bekannte Punktmutation an der Position 587 (Austausch von Thymin nach Guanin), die zum
Aminosäureaustausch I196S führte. Diese Punktmutation wurde für die Experimente mit M1
entfernt.
A/FPV/Rostock/1934
A/WSN/1933
A/FPV/Rostock/1934
A/WSN/1933
A/FPV/Rostock/1934
A/WSN/1933
A/FPV/Rostock/1934
A/WSN/1933
A/FPV/Rostock/1934
A/WSN/1933
Abb. 12: Sequenzvergleich der M1 Proteine aus Influenza A/FPV/Rostock/1934 (H7N1) und Influenza
A/WSN/1933 (H1N1)
Die Position der Punktmutation I196S in dem durch pHH-M kodierten M1 Protein (Influenza
A/FPV/Rostock/1934) ist rot und die NLS, deren Mutation in der M1 Variante aus Influenza A/WSN/1933 zu
einer cytoplasmatischen Variante führt (Ye et al., 1995), ist blau gekennzeichnet. Der Sequenzvergleich wurde
mit Hilfe des Blastp Algorithmus (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) erstellt.
- 33 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.3.1.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit M1 und M1Mut
Um die subzelluläre Lokalisation von M1 und M1Mut fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu
können, wurden Fusionen der beiden Proteine mit EGFP („enhanced“ GFP (Cormack et al.,
1996)) konstruiert. EGFP leitet sich vom GFP (Shimomura et al., 1962) ab und besitzt durch
Einführung der Mutationen F64L und S65T eine im Vergleich zum wt GFP deutlich erhöhte
Fluoreszenzausbeute. Die Konstruktion der Fusionen erfolgte über Klonierung der
entsprechenden Gene in die multiple Klonierungsstelle (MCS: „multiple cloning site“) des
Vektors pEGFP-N1 (Clontech, Abbildung 13). Dadurch entstanden Translationsfusionen mit
EGFP am C-Terminus von M1 oder M1Mut unter transkriptioneller Kontrolle des CMVIE
Promotors. Die resultierenden Vektoren wurden pM1-EGFP und pM1Mut-EGFP benannt.
PCMV IE
pUC
Abb. 13:
(Clontech)
MCS
Plasmid
pEGFP-N1
Protein-kodierende Bereiche sind orange,
eukaryontische Promotoren blau, der pUC
Replikationsursprung aus E. coli grün, die
egfp
PolyA Signal
Das
pEGFP-N1
4733 bp
MCS rot und Polyadenylierungssignale
R
schwarz dargestellt. Kan kodiert für die
Kanamycinresistenz.
PolyA Signal
KanR
3.2.3.1.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von M1-EGFP und M1Mut-EGFP
Für die Analyse der subzellulären Lokalisation der M1-EGFP und M1Mut-EGFP Fusionen
wurden HeLa Zellen mit dem Plasmid pM1-GFP bzw. pM1Mut-GFP transient transfiziert. Nach
24 h wurden die Zellen mit dem DNA bindenden Fluoreszenzfarbstoff Höchst 33342
behandelt, um den Kontrast zwischen Zellkern und Cytoplasma zu erhöhen. Dieser Farbstoff
besitzt eine hohe Permeabilität in lebenden Zellen und zeigt im Komplex mit DNA nach
Anregung mit UV-Licht (Anregungsmaximum λex = 355 nm) eine blaue Fluoreszenz
(Emissionsmaximum λem = 465 nm) (Arndt-Jovin et al., 1977). Die anschließende in vivo
Untersuchung der Zellen erfolgte mittels eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops des Typs
Leica SP5. Wie aus entsprechenden Aufnahmen (Abb. 14A und B) hervorgeht, war die
Fluoreszenz sowohl bei M1-EGFP, als auch bei M1Mut-EGFP gleichmäßig in der Zelle
verteilt. Es konnte keine subzelluläre Akkumulation festgestellt werden. Aufgrund dieser
Erkenntnisse wurde das M1 Protein nicht weiter verwendet.
- 34 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
A
B
Abb. 14: Lokalisation von M1-EGFP und M1Mut-EGFP in HeLa Zellen
Von links: Hellfeld, Zellkern (Höchst 33342) in blau, EGFP Fluoreszenz in grün, Überlagerung der
drei Aufnahmen. Die Länge des Skalierungsbalkens entspricht 20 µm.
A) M1-EGFP, Zellen transfiziert mit pM1-GFP
B) M1Mut-EGFP, Zellen transfiziert mit pM1Mut-GFP
3.2.3.2 Das Nichtstrukturprotein NS1
NS1 besitzt neben zwei NLSs (Greenspan et al., 1988) auch eine NES. Die Funktion dieser
NES wird bei Expression in uninfizierten Zellen mittels einer angrenzenden Sequenz
inhibiert, weshalb sich NS1 hier größtenteils im Zellkern befindet. Wird diese inhibierende
Sequenz durch die drei Mutationen R148A, E152A und E153A inaktiviert, befindet sich NS1
größtenteils im Cytoplasma (Li et al., 1998). Diese, von Li et al. konstruierte, Mutante
basierte auf der NS1 Variante aus Influenza A/WSN/1933, die auch in dieser Arbeit
verwendet wurde.
3.2.3.2.1 Mutation der 3‘-Spleißsequenzen des ns1 Gens
Die Gene für die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2 sind auf dem Segment 8 (Abb. 15) des
Influenza Genoms kodiert. NS1 wird von einem durchgehenden Leserahmen kodiert, NS2
hingegen besteht aus zwei Exons und einem Intron, wobei die entsprechende Spleißdonorund Spleißakzeptorstelle innerhalb des Leserahmens für NS1 liegen. Alonso-Caplen et al.
konnten zeigen, dass bei Expression des ns1 Gens in uninfizierten Zellen ein Teil der für
NS1 kodierenden mRNA in der Spleißmaschinerie gebunden und somit nicht ins Cytosol
transportiert wird (Alonso-Caplen et al., 1991). Dies führt zu einer stark reduzierten NS1
Proteinsynthese, was durch Modifikation der 3‘-Spleißsequenzen innerhalb des ns1 Gens
verhindert werden kann. Alonso-Caplen et al. verwendeten das ns1 Gen aus dem
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3 Ergebnisse
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Virusstamm Influenza A/Udorn/1972 (H3N2), dessen Sequenz sich an den mutierten
Positionen nicht von dem hier verwendeten Gen aus Influenza A/WSN/1933 unterscheidet.
Um eine effektive Expression des NS1 Proteins zu gewährleisten, wurden in dieser Arbeit die
gleichen Mutationen in die 3‘-Spleißsequenz des ns1 Gens eingeführt (Abb. 15). Es handelt
sich hierbei um drei stille Mutationen in drei aufeinanderfolgenden Tripletts. Die ersten
beiden Austausche von Uracil nach Alanin an den Positionen 495 und 498 stören die
Poly-Pyrimidinsequenz, der dritte Austausch von Alanin nach Cytosin an der Position
501 betrifft die 3‘ Akzeptorstelle. In Alonso-Caplen et al. wurde das ns1 Gen mit mutierter
3‘-Spleißsequenz ns3ss (ss für „splice sites“) benannt. In Anlehnung daran trägt das hier
verwendete Gen mit den entsprechenden Mutationen die Bezeichnung ns4ss. Die Gene ns1
aus Influenza A/WSN/1933 und ns4ss kodieren für Proteine mit identischer Sequenz, das
Produkt des ns4ss Gens wird allerdings aus Gründen der Übersichtlichkeit als NS4
bezeichnet. Entsprechend trägt das Gen für die Variante mit den Mutationen in der
NES-inhibierenden Sequenz den Namen ns4ssmut und das kodierte Protein die Bezeichnung
NS4Mut.
Konsensus-Sequenz : Yx-N-C A G G
Influenza A/WSN/1933: CCC UCU CUU CCA GG
ns4ss: CCC UCA CUA CCC GG
ns1
ns2:
Exon 1
Intron
Exon 2
3‘-Spleißstelle ns2
Abb. 15: Mutationen in der 3‘-Spleißsequenz des ns1 Gens aus
Influenza A/WSN/1933
Im unteren Teil der Abbildung ist das Segment 8 des Influenza A Genoms
dargestellt. Exons sind in orange und das Intron von ns2 in hellgrau
eingezeichnet. Im oberen Teil der Abbildung sind die Konsensus-Sequenz
für die 3‘-Spleißstelle (Knippers, 2006) sowie die entsprechende Sequenz
des ns1 Gens aus Influenza A/WSN/1933 abgebildet. ns4ss leiten sich
vom ns1 Gen aus Influenza A/WSN/1933 ab und enthält drei
Basenaustausche an den unterstrichenen Positionen. Die Poly-Pyrimidinsequenz ist in den Sequenzen in grün und die erste Base des auf die 3‘Spleißstelle folgenden Exons in orange eingezeichnet.
Yx = Folge von Pyrimidinbasen (C oder U), N = beliebige Nukleobase
(A, C, G, oder U). Alle Nuklebasensequenzen sind als mRNA-Sequenzen
dargestellt.
- 36 -
3 Ergebnisse
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3.2.3.2.2 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NS4 und NS4Mut
Analog zum M1 Protein wurden auch für NS4 und NS4Mut Fusionen mit EGFP durch
Klonierung der Gene ns4ss und ns4ssmut in den Vektor pEGFP-N1 hergestellt (siehe unter
3.2.3.1.1). Die aus dieser Klonierung resultierenden Plasmide wurden pNS4-EGFP und
pNS4Mut-EGFP bezeichnet.
3.2.3.2.3 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NS4-EGFP und NS4Mut-EGFP
Die Rolle von NS1 als pro- oder anti-apoptotischer Faktor bei Expression in uninfizierten
Zellen ist seit mehreren Jahren Gegenstand intensiver Forschung. So konnte beispielsweise
gezeigt werden, dass NS1 Varianten aus H5N9 oder H5N1 Influenza A Virusstämmen in
HeLa und MDCK7 Zellen proapoptotisch (Schultz-Cherry et al., 2001), Varianten aus H1N1
und H3N2 Stämmen in MDCK und Vero8 Zellen hingegen anti-apoptotisch wirken (Zhirnov et
al., 2002; Morris et al., 2005). Der Einfluss des hier verwendeten NS1 Proteins aus dem
H1N1 Stamm Influenza A/WSN/1933 auf die Apoptose in HeLa Zellen ist nicht bekannt.
Aufgrund dessen wurden die fluoreszenzmikroskopischen Analysen von NS4-EGFP und
NS4Mut-EGFP zusätzlich mit HEK2939 Zellen durchgeführt, da in diesem Zelltyp die
konstitutive Expression des NS1 Proteins aus Influenza A/WSN/1933 möglich ist (Kok et al.,
2006). Das weitere experimentelle Vorgehen erfolgte in gleicher Weise, wie für M1
beschrieben (siehe unter 3.2.3.1.2). Entsprechende Aufnahmen sind in den Abbildungen
16A, B, C und D dargestellt. NS4-EGFP zeigte sowohl in HeLa als auch in HEK293 Zellen
eine deutliche Akkumulation im Zellkern mit geringer Restfluoreszenz im Cytoplasma.
NS4Mut-EGFP hingegen konnte in beiden Zelltypen hauptsächlich im Cytoplasma detektiert
werden. Wie in Abbildung 16A im Vergleich zu den Abbildungen 16B, sowie 14A und B zu
erkennen ist, zeigen die NS4-EGFP exprimierenden HeLa Zellen eine veränderte
Zellmorphologie mit abgerundeter Form und rauer Oberfläche. Ob dies durch eine Induktion
der Apoptose zu begründen ist, kann aus diesen Experimenten nicht abgeleitet werden. Ein
vermehrtes Zellsterben konnte in den hier durchgeführten Experimenten jedoch nicht
beobachtet werden.
7
MDCK steht für „Madin Darby canine kidney“, es handelt sich hierbei um eine Nierenepithelzelllinie aus dem
Hund (Gaush et al., 1966).
8
Bei Vero-Zellen handelt es sich um eine Nierenepithelzelllinie aus dem Affen (Yasumura et al., 1963).
9
Bei HEK293 („human embryonic kidney“) Zellen handelt es sich um eine immortalisierte, humane
Nierenzelllinie (Graham et al., 1977).
- 37 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
A
B
C
D
Abb. 16: Lokalisation von NS4-EGFP und NS4Mut-EGFP in HeLa und HEK293 Zellen
Von links: Hellfeld, Zellkern (Höchst 33342) in blau, EGFP Fluoreszenz in grün, Überlagerung der
drei Aufnahmen. Die Länge des Skalierungsbalkens entspricht 20 µm.
A) NS4-EGFP, HeLa Zellen transfiziert mit pNS4-EGFP
B) NS4Mut-EGFP, HeLa Zellen transfiziert mit pNS4Mut-EGFP
C) NS4-EGFP, HEK293 Zellen transfiziert mit pNS4-EGFP
D) NS4Mut-EGFP, HEK293 Zellen transfiziert mit pNS4Mut-EGFP
3.2.3.3 Das Nucleoprotein NP
Das Nucleoprotein enthält zwei NLSs, wovon sich eine innerhalb der ersten 13 AS des
N-Terminus und die andere zwischen den Positionen 198 und 216 befindet (Neumann et al.,
1997; Wang et al., 1997; Weber et al., 1998). Durch Mutation der N-terminalen NLS
(7KR8  7AA8) konnten Cros et al. eine cytoplasmatische NP Variante konstruieren (Cros et
al., 2005). Diese Mutante basierte auf dem NP Protein aus Influenza A/WSN/1933, das auch
in dieser Arbeit verwendet wurde. Die NP Variante mit den Aminosäureaustauschen 7KR8
nach 7AA8 wird im Folgenden NPMut und das hierfür kodierende Gen npmut bezeichnet. Da
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3 Ergebnisse
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sich die subzelluläre Lokalisation von NP bei hoher Zelldichte (konfluente Kultur) vom Kern
ins Cytoplasma verschieben kann (Bui et al., 2002), wurden alle Experimente mit NP
ausschließlich bei geringer Zelldichte (keine Konfluenz) durchgeführt.
3.2.3.3.1 Konstruktion von EGFP Fusionen mit NP und NPMut
Analog wie für die Proteine M1 und NS4 beschreiben (siehe unter 3.2.3.1.1 bzw. 3.2.3.2.2)
wurden auch für NP und NPMut Fusionen mit EGFP hergestellt. Die entsprechenden
Plasmide wurden pNP-EGFP und pNPMut-EGFP bezeichnet.
3.2.3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von NP-EGFP und NPMut-EGFP
Das experimentelle Vorgehen erfolgte in gleicher Weise, wie für M1 beschrieben (siehe unter
3.2.3.1.2). Entsprechende Aufnahmen sind in den Abbildungen 17A und B dargestellt. Im
Falle von NP-EGFP konnte die Fluoreszenz ausschließlich im Zellkern detektiert werden,
wohingegen sich NPMut-EGFP größtenteils im Cytoplasma befand.
A
B
Abb. 17: Lokalisation von NP-EGFP und NPMut-EGFP in HeLa Zellen
Von links: Hellfeld, Zellkern (Höchst 33342) in blau, EGFP Fluoreszenz in grün, Überlagerung der
drei Aufnahmen. Die Länge des Skalierungsbalkens entspricht 20 µm.
A) NP-EGFP, Zellen transfiziert mit pNP-EGFP
B) NPMut-EGFP, Zellen transfiziert mit pNPMut-EGFP
- 39 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.4 Konstruktion der Reporterzelllinien
3.2.4.1 Die Zelllinie HLF33
Die im Rahmen dieser Arbeit konstruierten Reporterzelllinien wurden ausgehend von der
HeLa Zelllinie HLF33 (HeLa Luciferase Flp-In™) hergestellt (Berens et al., 2006). Diese
verfügt über ein chromosomal integriertes luc Gen unter transkriptioneller Kontrolle des
Minimalpromotors CMVmin (siehe unter 3.2.2). Weiterhin enthält die Zelllinie eine singuläre,
stabil integrierte Kopie des Plasmids pFRT/lacZeo (Invitrogen). Dies ermöglicht eine gezielte
Integration genetischer Komponenten durch eine Flp-Rekombinase katalysierte, homologe
Rekombination (Broach et al., 1980). Im Fall der HLF33 erfolgte die Integration des Plasmids
pFRT/lacZeo in einen chromosomalen Locus, der eine hohe Expression des integrierten
genetischen Elements ermöglicht (Drüppel, 2004).
3.2.4.2 Chromosomale Integration der tTA Expressionskassette
Die Konstruktion der unter 3.2.2 beschriebenen Reporterzelllinie erfolgte in zwei Schritten.
Im ersten Schritt wurde die Expressionskassette für die tTA Variante TetR-FFF unter
transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors (siehe unter 3.2.2) ungerichtet in das
Genom von HLF33 integriert. Zu diesem Zweck wurde die TetR-FFF kodierende Sequenz in
den Vektor pIRESPuro2 (Clontech) kloniert. Eine schematische Darstellung des aus dieser
Klonierung resultierenden Vektors pIPRBF findet sich in Abbildung 18. Über den CMVIE
Promotor erfolgt die Transkription einer polycistronischen mRNA, die stromabwärts der
Sequenz für TetR-FFF zusätzlich für die Puromycin-N-acetyl-Transferase kodiert (de la Luna
et al., 1988). Die Initiation der Translation dieses Resistenz gegenüber Puromycin
vermittelnden
Enzyms
erfolgt
über
die
interne
Ribosomen-Eintrittsstelle
IRES
(„internal ribosomal entry site“) aus dem Encephalomyocarditis Virus (ECMV) (Rees et al.,
1996). pIPRBF wurde durch Restriktion mit dem Enzym AhdI linearisiert und in die Zelllinie
HLF33 transfiziert. Die anschließende Selektion erfolgte bei Puromycinkonzentrationen von
0,5 - 2,0 mg/l (0,5; 1,0; 1,5 und 2,0 mg/l). Daneben wurden parallel Selektionsansätze mit
einer Kombination aus den verschiedenen Puromycinkonzentrationen unter Zugabe von
1 mg/l Dox durchgeführt. Dies sollte die physiolgische Belastung der konstitutiven
Luciferase-Expression in den tTA exprimierenden Klonen reduzieren. Die Ergebnisse der
stabilen Transfektion sind in Tabelle 4 dargestellt. Es wurden insgesamt 44 Klone isoliert,
von denen 28 erfolgreich expandiert werden konnten. Hierbei wuchsen bei
gleicher
Puromycinkonzentration in Anwesenheit von Dox tendenziell weniger Klone als in
Abwesenheit von Dox. Dieser Effekt ist möglicherweise auf die Toxizität von Dox
zurückzuführen. Die durch die Integration des Vektors pIPRBF in die Zelllinie HLF33 erzeugten Zelllinien erhielten die Bezeichnung ALFX (X = 1 - 44) (Aktivator Luciferase Flp-in™).
- 40 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
AmpR
Abb. 18: Das Plasmid pIPRBF
PCMV IE
Protein-kodierende Bereiche sind orange, der
CMVIE Promotor blau, der ColE1 Replikationsursprung aus E. coli grün, die IRES rot und das
AhdI
tTA
(tetR-fff)
pIPRBF
ColE1
5952 bp
Poly A
Signal
Polyadenylierungssignal sowie die Position der
Schnittstelle des Restriktionsenzyms AhdI schwarz
R
gekennzeichnet. Amp kodiert für die AmpicillinR
und Puro für die Puromycinresistenz.
IRES
PuroR
Tab. 4: Ergebnis der stabilen Integration des Plasmids pIPRBF in die Zelllinie HLF33
Die Zugabe von Puromycin und/oder Dox erfolgte 48 h nach Transfektion der Zellen mit dem linearisierten
Vektor pIPRBF. Nach 14 Tagen wurden die resistenten Klone isoliert und in Anwesenheit von 0,5 mg/l
Puromycin ohne Zugabe von Dox expandiert. Die Messung der Luciferaseaktivität erfolgte 21 Tage nach der
Isolation der Klone.
Puromycin
[mg/l]
Dox
1 mg/l
Resistente
Klone
Expandierte
Klone
Luciferase
exprimierende
Klone
0,5
–
+
8
8
6
8
ALF12
ALF2, -4, -6, -7
1,0
–
+
5
3
3
2
ALF39
–
1,5
–
+
8
2
3
1
–
–
2,0
–
+
9
1
4
1
–
–
- 41 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.4.3 Charakterisierung der ALF Zelllinien
Alle 28 ALF Zelllinien wurden bezüglich ihrer Luciferaseaktivität in Abwesenheit von Dox
charakterisiert. Hierbei konnte nur bei sechs Zelllinien (ALF2, -4, -6, -7, -12 und -39) eine im
Vergleich zur Ausgangszelllinie HLF33 erhöhte Luciferaseaktivität gemessen werden.
Hierbei ist zu anzumerken, dass bei Puromycinkonzentrationen größer 1 mg/l keine Klone
mit erhöhter Luciferaseaktivität isoliert werden konnten. Durch Zugabe von 1 µg/ml Dox
wurde eine Reduktion der Luciferaseaktivität in allen Zelllinien um das 83- bis 616-fache
erreicht (Abb. 19). Dabei erreichten fünf Zelllinien das Niveau der Ausgangszelllinie HLF33
(< 10 ALU/µg Protein). Lediglich ALF6 zeigte eine schwache Luciferaseaktivität in Anwesenheit von Dox. Die Zelllinien ALF2, -4, -6 und -12 waren im Bezug auf ihre Wachstumsgeschwindigkeit vergleichbar mit der Ausgangszelllinie HLF33, die Linien ALF7 und -39
hingegen wuchsen langsamer und zeigten ein vermehrtes Zellsterben (Abb. 19). Aufgrund
des höchsten Regulationsfaktors, der geringen Luciferase-Basalexpression und der Vitalität
wurde die Zelllinie ALF2 für die weiteren Arbeiten ausgewählt.
Luciferaseaktivität
ALU/µg [ALU/µg
Protein Protein]
100.000
10.000
1.000
+ Dox
- Dox
100
10
1
ALF2
ALF2
ALF4
ALF4
ALF6
ALF6
ALF7
ALF7
ALF12
ALF12
ALF39
ALF39
Faktor
616 x
110 x
366 x
547 x
83 x
420 x
Vitalität
++
++
++
+
++
+
Abb. 19: Luciferaseaktivität und Vitalität der Zelllinien ALF2, -4, -6, -7, -12, und -39
Die Luciferseaktivität wurde in An- und Abwesenheit von 1 µg/ml Dox gemessen und ist
in absoluten Lichteinheiten pro µg Gesamtprotein im Zelllysat (ALU/µg Protein)
angegeben. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus
drei biologischen Replikaten ermittelt. Die entsprechenden Regulationsfaktoren sowie
die Bewertung der Vitalität der einzelnen Zelllinien sind unterhalb des Diagramms
angegeben.
++ ≙ Wuchsgeschwindigkeit entspricht HLF33
+ ≙ verminderte Wuchsgeschwindigkeit und erhöhtes Zellsterben
- 42 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.4.4 Das Nucleoprotein als POI
Da M1 aufgrund der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen (siehe unter 3.2.3.1.2)
nicht als POI in Frage kam, blieben NP und NS1 als potentielle Kandidaten. Die NP-EGFP
Fusion zeigte eine quantitative Anreicherung im Zellkern wohingegen NPMut-EGFP nahezu
vollständig im Cytoplasma lokalisiert war (siehe unter 3.2.3.3.2). Weiterhin stand für NP
Nucleozin als spezifischer Inhibitor des Kernimports (Kao et al., 2010) zur Verfügung und
konnte somit für die Validierung der Reporterzelllinie eingesetzt werden. Aus diesen
Gründen und wegen der nicht vollständig aufgeklärten Rolle des NS1 Proteins in der
Regulation der Apoptose in HeLa Zellen wurde NP für die weiteren Arbeiten ausgewählt. Für
die Herstellung der Fusion aus NP und TIP2 wurde die TIP2-Peptidsequenz über die
4 AS lange „Linkersequenz“ SGGA an den C-Terminus von NP fusioniert. Dieses
Fusionsprotein wird im Folgenden als NP-TIP2 bezeichnet.
3.2.4.5 TetR-Induktion durch NP-TIP2 in E. coli
Um zu überprüfen, ob die peptidische Induktion von TetR(B) wt durch das NP-TIP2
Fusionsprotein grundsätzlich möglich ist, wurden Vorversuche in E. coli durchgeführt. Für
diese Arbeiten wurde ein Reportersystem verwendet, das für die Identifizierung peptidischer
Induktoren konstruiert wurde (Klotzsche et al., 2005). Aufbau und Funktionsweise dieses
Systems werden im Folgenden erläutert und sind in Abbildung 20 dargestellt.
3.2.4.5.1 Aufbau und Funktionsweise des E. coli Messsystems
Das System besteht aus einem E. coli Messstamm mit chromosomaler Integration des lacZ
Reportergens unter Tet-Kontrolle sowie zwei kompatiblen Plasmiden. Die Tet-Kontrolle von
lacZ wird durch einen Tet-Operator in der lacZ Promotorregion bewerkstelligt und ermöglicht
eine Quantifizierung der TetR-Induktion über die Aktivität der β-Galaktosidase. Abweichend
von Klotzsche et al. (Klotzsche et al., 2005) wurde hier nicht der Messstamm DH5α(λtet50),
sondern der analog aufgebaute Stamm WH207(λtet50) (Wissmann et al., 1991) verwendet.
Die Expression von TetR erfolgte konstitutiv auf niedrigem Niveau über das Plasmid
pWH527. Das zweite Plasmid pWH2101/NP-TIP2 kodiert für die NP-TIP2 Fusion unter
transkriptioneller Kontrolle des tac10 Promotors. Als Kontrolle diente NP ohne TIP2, das auf
dem Vektor pWH2101/NP kodiert ist. Der tac Promotor wird durch Bindung des von pWH527
konstitutiv exprimierten lac Repressors (LacI) bis auf ein Basalniveau reprimiert. Somit kann
10
Beim tac Promotor handelt es sich um einen synthetischen Hybridpromotor, der sich aus Teilen der trp und lac
Promotoren zusammensetzt. Der tac Promotor vermittelt eine starke Transkription, die durch Bindung von LacI
an den lac Operator reprimiert wird (de Boer et al., 1983).
- 43 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
die Expression von NP-TIP2 bzw. NP durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid
(IPTG) stufenlos reguliert werden. Hierfür wurde IPTG in Konzentrationen bis 90 µM
eingesetzt, bei höheren Konzentrationen wurde ein reduziertes Wachstum der Zellen
beobachtet.
CM
Ptac
lacI
AmpR
tetR(B) wt
np-tip2
pWH527
pWH2101/NP-TIP2
6325 bp
5676 bp
pMB1
KanR
p15A
NP-TIP2
Expression
Genom
tetO2
lacZ
β-Galaktosidase
Abb. 20: Schematische Darstellung des E. coli Reportersystems zur Analyse der peptidischen
Induktion von TetR
Protein-kodierende Bereiche sind orange, Promotoren blau, die p15A und pMB1 Replikationsursprünge aus
R
R
E. coli grün und tetO2 schwarz dargestellt. Amp kodiert für die Ampicillin- und Kan für die Kanamycinresistenz. Das TetR Dimer ist in grau mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne dargestellt. Die
β-Galaktosidase ist als roter Kreis und NP als schwarzes Oval mit TIP2 als Anhängsel abgebildet.
CM = Cytoplasmamembran.
E. coli WH207(λtet50) enthält chromosomal integriert lacZ unter Tet-Kontrolle. TetR wird konstitutiv exprimiert
und bindet an den Tet Operator tetO2 innerhalb der lacZ Promotorregion wodurch die Expression der
β-Galaktosidase reprimiert wird. LacI, ebenfalls konstitutiv exprimiert, verhindert die Transkription des unter
Ptac-Kontrolle stehenden NP-TIP2 Fusionsproteins. Wird IPTG zugegeben dissoziiert LacI von seiner
Bindestelle innerhalb des tac Promotors und es kommt zur Expression von NP-TIP2. Wird TetR induziert,
kann das Reportergen lacZ transkribiert werden. Abbildung und Legende wurden aus (Klotzsche et al., 2005)
entnommen und modifiziert.
- 44 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.4.5.2 Induktion von TetR durch NP-TIP2
Für die Messung der β-Galaktosidase-Aktivität (β-Gal-Aktivität) in Abwesenheit von TetR
wurde E. coli WH207(λtet50) mit den beiden Leervektoren pWH120011 (Wissmann et al.,
1991) und pWH80612 (Altschmied et al., 1988) transformiert. Die in diesem Ansatz
gemessene β-Gal-Aktivität wurde als 100 % definiert. Für die Messung der β-Gal-Aktivität bei
maximaler Repression sowie bei Induktion von TetR wurde E. coli WH207(λtet50) mit den
Plasmiden pWH527 und pWH1200 transformiert. Hierbei konnte eine β-Gal-Aktivität von 7 %
bei Repression (Abwesenheit von Dox) sowie 76 % bei Induktion des Systems
(in Anwesenheit von 0,1 mg/l Dox) erreicht werden. Die Kontrollmessung mit NP ohne TIP2
erfolgte durch Transformation des Messtamms mit den Plasmiden pWH527 und
pWH2101/NP bei IPTG Konzentrationen von 0, 30, 60 und 90 µM. Die β-Gal-Aktivität in
diesen Ansätzen lag, unabhängig von der verwendeten IPTG Konzentration, bei ca. 7 %,
was dem Niveau der maximalen Repression durch TetR entsprach. Die Messung der
Induktion von TetR durch NP-TIP2 erfolgte durch Transfektion des Messtamms mit den
Plasmiden pWHE527 und pWH2101/NP-TIP2, ebenfalls bei IPTG Konzentrationen von
0, 30, 60 und 90 µM. Hier konnte mit steigender IPTG Konzentration eine kontinuierlich
Zunahme
der
β-Gal-Aktivität
gemessen
und
somit
die
konzentrationsabhängige,
TIP2-vermittelte Induktion von TetR gezeigt werden. Die NP-TIP2 Fusion ist daher in E. coli
funktional. Eine graphische Darstellung aller Ergebnisse findet sich in Abbildung 21.
11
pWH1200 enthält den p15A Replikationsursprung und kodiert für die Kanamycinresistenz, jedoch nicht für
TetR.
12
pWH806 enthält den pMB1 Replikationsursprung und kodiert für die Ampicillinresistenz, jedoch nicht für die
Expressionskassette unter transkriptioneller Kontrolle des tac Promotors.
- 45 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
TetR
TetR + NP
TetR + NP-TIP2
90
80
β-Gal-Aktivität [%]
70
60
50
40
30
20
10
0
IPTG Konzentration [µM]
Abb. 21: Induktion von TetR durch NP-TIP2 in E. coli
Die Messung erfolgte in E. coli WH207(λtet50). Die β-Gal-Aktivität in
Abwesenheit von TetR entspricht 100 %. Dox wurde in einer Konzentration
von 0,1 mg/l zugegeben. Das Expressionsniveau von NP bzw. NP-TIP2
wurde durch Zugabe von IPTG eingestellt. w/o bezeichnet einen Ansatz ohne
Zugabe von Dox oder IPTG. Die hier dargestellten Mittelwerte und
Standardabweichungen wurden aus vier biologischen Replikaten ermittelt.
3.2.4.6 Chromosomale Integration der NP-TIP2 Expressionskassette
Die gezielte Integration der NP-TIP2 Expressionskassette stellte den zweiten Schritt in der
Konstruktion der Reporterzelllinie dar. Das Prinzip und der Ablauf der Integration ist in
Abbildung 22 schematisch dargestellt. Durch die ungerichtete Integration des Vektors
pFRT/lacZeo (Invitrogen) entstehen sogenannte Flp-In™ Zelllinien wie HLF33, die eine
gezielte Integration genetischer Elemente über die FRT Sequenzen („Flp recognition target“)
ermöglichen. Aufgrund der konstitutiven Expression des lacZ-Zeocin™ Gens sind
Flp-In™ Zelllinien resistent gegenüber Zeocin™ und LacZ positiv13. Durch die Integration des
Vektors pcDNA5/FRT in die FRT Sequenz wird die Expression des lacZ-Zeocin™ Gens
terminiert und die pcDNA5/FRT kodierte Resistenz gegenüber Hygromycin exprimiert. Somit
kann der Erfolg der Integration durch Resistenz gegenüber Hygromycin, Sensibilität
gegenüber Zeocin™ und die LacZ in situ Färbung kontrolliert werden. Die Integration eines
13
LacZ positive Zelllinien färben sich bei der LacZ in situ Färbung blau (siehe unter 3.2.4.6.1).
- 46 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
geeigneten Konstruktes in die FRT Sequenz einer Flip-In™ Zelllinie erfolgt über gleichzeitige
Transfektion
der
Zellen
mit
dem
zu
integrierenden
Konstrukt
und
dem
Vektor
pOG44 (Invitrogen). pOG44 kodiert für eine Variante der Flp-Rekombinase, die durch den
Aminosäureaustausch F70L im Vergleich zum Wildtyp eine erhöhte Instabilität bei 37 °C
aufweist (Buchholz et al., 1996). Die Flp-Rekombinase Reaktion erfolgt deshalb bei 30 °C
und wird durch Erhöhung der Temperatur auf 37 °C terminiert. Der Integrationsvektor
pcDNA5/FRT enthält eine Expressionskassette unter transkriptioneller Kontrolle des CMVIE
Promotors, der in den ALF Zelllinien bereits in der tTA Expressionskassette vewendet wurde.
Da bei gleichzeitiger Expression zweier Gene über den CMVIE Promotor eine reduzierte
Expression eines oder beider Gene beobachtet wurde (persönliche Mitteilung Dr. C. Berens),
wurde für die Expression von NP-TIP2 ein alternativer Promotor verwendet. Zu diesem
Zweck wurde der CMVIE Promotor in pcDNA/FRT gegen den starken, synthetischen
hEF1-HTLV Promotor ausgetauscht. Das resultierende Konstrukt wurde als pEF1-HTLV/FRT
bezeichnet. Aus der Klonierung des für NP-TIP2 kodierenden Gens in pEF1-HTLV/FRT
resultierte der Integrationsvektor pEF1-HTLV/NP-TIP2, der in Abbildung 22 dargestellt ist.
Nach Transfektion der Zelllinie ALF2 mit den Vektoren pEF1-HTLV/NP-TIP2 und pOG44
wurden die Zellen für 72 Stunden bei 30 °C ohne Selektion und anschließend bei 37 °C in
Gegenwart von 250 mg/l Hygromycin kultiviert. Nach zwei Wochen wurden insgesamt 34
resistente Klone isoliert, von denen 28 erfolgreich expandiert werden konnten. Die durch die
Integration von pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die Zelllinie ALF2 erzeugten Zelllinien erhielten die
Bezeichnung ALF2-NPX (X = 1-34).
- 47 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Expression
PolyA Signal
FRT
ALF2
lacZ-Zeocin™
PSV40
pUC
AmpR
Flp-Rekombinase
PolyA Signal
FRT
HygR
np-tip2
pEF1-HTLV/NP-TIP2
PolyA Signal
6228 bp
pUC
PhEF1-HTLV
AmpR
Expression
PolyA Signal
PolyA Signal
FRT
ALF2-NP
Expression
AmpR
HygR
pUC
PSV40
AmpR
np-tip2
FRT
PhEF1-HTLV
EF1seq1
lacZ-Zeocin™
pUC
HK64
Abb. 22: Stabile Integration von pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die Zelllinie ALF2
Protein-kodierende Bereiche sind orange, Promotoren blau, die pUC Replikationsursprünge aus E. coli
grün und die Position von Polyadenylierungssignalen schwarz dargestellt. Die Positionen der beiden
Oligonukleotide EF1seq1 und HK64, die für die unter 3.2.4.6.4 beschriebenen Amplifikation der NPTIP2 Expressionskassette verwendet wurden, sind in rot eingezeichnet.
Die stabile Integration des Vektors pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die FRT Sequenz der Zelllinie ALF2 erfolgte
über Flp-Rekombinase-vermittelte, homologe Rekombination. Im oberen Teil der Abbildung ist der
Locus der Integration von pFRT/lacZeo in der Zellinie ALF2 abgebildet. Durch die Expression des lacZ™
™
Zeocin Gens ist die Zelllinie ALF2 Zeocin resistent und LacZ positiv. Die ortsspezifische Integration
™
des Vektors über das Flp-In System erfolgte durch gleichzeitige Transfektion der Zellen mit den
Plasmiden pEF1-HTLV/NP-TIP2 und pOG44. Hierbei katalysiert die auf pOG44 kodierte FlpRekombinase die homologe Rekombination zwischen der FRT Sequenz der Zelllinie ALF2 und dem
Integrationsvektor pEF1-HTLV/NP-TIP2. Die aus der Reaktion resultierende Zelllinie ALF2-NP
™
exprimiert NP-TIP2 sowie die Hygromycin Resistenz, jedoch nicht das lacZ-Zeocin Gen. Somit ist
™
ALF2-NP resistent gegenüber Hygromycin, sensitiv gegenüber Zeocin und LacZ negativ.
- 48 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.4.6.1 Kontrolle der stabilen Integration durch LacZ in situ Färbung
Nach Integration des Vektors pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die FRT Sequenz der ALF2 Zelllinie
exprimiert die resultierende Zelllinie im Gegensatz zur Ausgangszelllinie ALF2 keine
β-Galaktosidase mehr, was zur Kontrolle der erfolgreichen Integration verwendet wurde. Die
Visualisierung der β-Galaktosidase Expression erfolgte über eine LacZ in situ Färbung mit
dem Farbstoff X-Gal. Dieser ist im Ausgangszustand gelb und wird durch die
β-Galaktosidase in ein blaues Produkt umgesetzt. Somit färben sich β-Galaktosidase
exprimierende Zellen in der LacZ in situ Färbung blau, wohingegen Zellen ohne Expression
der
β-Galaktosidase
farblos
bleiben.
Um
die
korrekte
Integration
des
Vektors
pEF1-HTLV/NP-TIP2 in die FRT Sequenz der ALF2 Zelllinie zu überprüfen wurde die
β-Galaktosidase Expression aller 28 erfolgreich expandierten ALF2-NP Zelllinien charakterisiert. Hierbei zeigten 24 dieser Zelllinien ausschließlich farblose Zellen und wurden
deshalb für die weiteren Arbeiten verwendet. Bei der Zelllnie ALF2, die zu Kontrollzwecken
mitgeführt wurde, färbten sich nahezu alle Zellen blau. Die Ursache für das Aufteten
farbloser Zellen bei der Zelllinie ALF2 wurde nicht weiter untersucht. In den Abbildungen 23A
und B sind beispielhaft mikroskopische Aufnahmen einer LacZ positiven und einer LacZ
negativen Zellline abgebildet.
A
B
Abb. 23: LacZ in situ Färbung
Die Abbildung zeigt beispielhaft eine LacZ positive Zelllinie ALF2 (A), bei der sich die Zellen in der
LacZ in situ Färbung blau einfärben wohingegen die Zellen einer LacZ negativen Linie wie
ALF2-NP19 (B) farblos bleiben.
3.2.4.6.2 Charakterisierung der ALF2-NP Zelllinien
Die ALF2-NP Zelllinien enthalten alle Komponenten des unter 3.2.2 beschriebenen
Reportersystems. Demnach befindet sich das konstitutiv exprimierte Fusionsprotein NP-TIP2
im Zellkern und kann dort die tTA Variante induzieren. Daher sollte das Niveau der
Luciferaseexpression in den ALF2-NP Zelllinien unter dem Niveau der Ausgangszelllinie
- 49 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
ALF2 liegen. Wird die Expression der Luciferase aufgrund einer unvollständigen Induktion
der tTA Variante durch NP-TIP2 nicht auf das Niveau der Zelllinie HLF33 reduziert, kann dies
durch Zugabe von Dox erreicht werden. Um dies zu überprüfen, wurde die Luciferaseaktivität
aller 24 LacZ negativen ALF-NP Zellinien in An- und Abwesenheit von 1 mg/l Dox vermessen
(Abb. 24). Das Ergebnis dieser Messungen erwies sich, trotz der zielgerichteten,
einheitlichen Integration der NP-TIP2 Expressionskassette in die FRT Sequenz, als
heterogen. Die Luciferaseaktivität lag bei sieben Zelllinien über 1.000 ALU/µg Protein, bei
13 Zelllinien zwischen 100 und 1.000 ALU/µg Protein und bei vier Zelllinien zwischen 10 und
100 ALU/µg Protein. Durch Zugabe von 1 mg/l Dox konnte die Luciferaseaktivität bei allen
Zelllinien gesenkt werden. Hierbei wurde bei 16 Zelllinien ein Wert kleiner 10 ALU/µg Protein
erreicht, was dem Niveau der Ausgangszelllinie HLF33 entsprach. Die heterogene
Luciferaseaktivität der ALF2-NP Zelllinien wurde auf Unterschiede in der NP-TIP2
Expression zurückgeführt. Die ursprüngliche, experimentelle Planung beinhaltete die Konstruktion einer Zelllinie, die eine cytoplasmatische Variante des NP exprimiert (siehe unter
3.2.3). Hierbei sollte TIP2 als Fusion mit der cytoplasmatischen Mutante (NPMut-TIP2) statt
der nukleären NP wt Variante stabil integriert werden. Der Vergleich der Luciferaseaktivität
dieser beiden Zelllinien sollte Rückschlüsse auf die Funktionalität des Systems ermöglichen.
Um anhand dieses Kontrollansatzes zuverlässige Aussagen treffen zu können, ist allerdings
eine vergleichbare Expression von NPMut-TIP2 und NP-TIP2 erforderlich, die durch
Integration in die FRT Sequenz gewährleistet werden sollte. Jedoch wurde aus der
Heterogenität der Luciferaseexpression der ALF2-NP Zelllinien geschlossen, dass trotz der
ortsspezifischen
Integration
nicht
von
einem
gleichmäßigen
Expressionsniveau
ausgegangen werden kann. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde von diesem Kontrollansatz
abgesehen.
- 50 -
- 51 -
1
10
100
1.000
1
2
4
5
6
7
8
10
15
16
18
19
ALF2-NP
17
20
21
22
26
27
28
29
30
31
32
34
ALF2
+ Dox
- Dox
Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt.
(ALU/µg Protein) angegeben. Auf der rechten Seite ist zum Vergleich das Ergebnis einer entsprechenden Messung mit der Zellllinie ALF2 angegeben.
Die Luciferseaktivität wurde in An- und Abwesenheit von 1 mg/l Dox gemessen und ist in absoluten Lichteinheiten pro µg Gesamtprotein des Zelllysats
Abb. 24: Regulation der Luciferaseaktivität der ALF2-NP Zelllinien
Luciferaseaktivität [ALU/µg Protein]
10.000
_____________________________________________________________________________________________________
3 Ergebnisse
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
3.2.4.6.3 Auswahl der ALF2-NP Zelllinien für die weiteren Arbeiten
Für die weiteren Arbeiten wurden die vier Zelllinien ALF2-NP19, -NP20, -NP22 und -NP31,
die eine Luciferaseaktivität kleiner 100 ALU/µg Protein aufwiesen, ausgewählt. Bei der
weiteren Kultivierung der Zelllinien wurde bei ALF2-NP20 verlangsamtes Wachstum sowie
eine erhöhte Zellsterblichkeit beobachtet, weshalb die Zelllinie nicht weiter verwendet wurde.
Bei den restlichen Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 wurde eine 14-tägige
Nachselektion mit 250 mg/l Hygromycin in Kombination mit 0,5 mg/l Puromycin durchgeführt,
um eine homogene Zellpopulation zu gewährleisten.
3.2.4.6.4 Sequenzierung des NP-TIP2 Locus der Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und
-NP31
Im nächsten Schritt sollte die Sequenz der NP-TIP2 Expressionskassette in den Zelllinien
ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 verifiziert werden. Hierzu wurde ein 2261 bp großes
Fragment, das den hEF1-HTLV Promotor und die für NP-TIP2 kodierende Sequenz
umfasste, mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) aus gereinigter, chromosomaler DNA
amplifiziert. Die Positionen der für diese Reaktion verwendeten Oligonukleotide EFseq1 und
HK64 sind in Abbildung 22 eingezeichnet. Als Kontrolle wurde die PCR auch mit dem
Integrationsvektor pEF1-HTLV/NP-TIP2 und mit chromosomaler DNA aus der Zelllinie ALF2
durchgeführt. Die Kontrolle der Fragmentgröße erfolgte mittels DNA Gelelektrophorese
wobei die Amplifikate aus den Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 und dem Vektor
pEF1-HTLV/NP-TIP2 die gleiche Mobilität im Agarosegel zeigten und sich im erwarteten
Größenbereich bewegten (Abb. 25). Da das amplifizierte Sequenzelement im Genom der
Zelllinie ALF2 nicht enthalten ist, konnte folglich in der PCR kein Produkt erzeugt werden.
Anschließend wurde die Nukleotidsequenz des Amplifikats bestimmt und mit der des
Integrationsplasmids pEF1-HTLV/NP-TIP2 verglichen. Die erhaltene Sequenz stimmte bei
allen drei Zelllinien mit der erwarteten Sequenz überein.
- 52 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Spur:
Größe [bp]
10.000
8.000
6.000
5.000
4.000
3.500
3.000
2.500
2.000
1.500
1.200
1.000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
1 2 3 4 5 6
Abb. 25: Kontrolle der PCR Amplifikate aus ALF2-NP19,
-NP22 und -NP31
Die Größe des 2261 bp umfassenden Fragments wurde auf einem
1 % Agarosegel kontrolliert.
Von links: Längenstandard (Spur 1), Amplifikate aus: ALF2-NP19
(Spur 2), ALF2-NP22 (Spur 3), ALF2-NP31 (Spur 4), ALF2
(Spur 5, Negativkontrolle) und pEF1-HTLV/NP-TIP2 (Spur 6,
Positivkontrolle).
3.2.5 Validierung der Reporterzelllinien
Die hier konstruierten Zelllinien sollten durch einen Anstieg der Luciferaseexpression bei
sinkender NP-TIP2 Konzentration im Zellkern charakterisiert sein (siehe unter 3.2.2). Um die
Zelllinien auf dieses Kriterium hin zu testen, wurden zwei unterschiedliche experimimentelle
Ansätze verfolgt. Im ersten Ansatz sollte die nukleäre Konzentration von NP-TIP2 durch
Nucleozin, einen Inhibitor des NP Kernimports, reduziert werden (Kao et al., 2010). Hierbei
verschiebt sich bei konstanter zellulärer Konzentration von NP-TIP2 die Verteilung zwischen
Zellkern und Cytoplasma. Der zweite Ansatz basierte auf einer Reduktion der NP-TIP2
Expression mittels RNA-Interferenz (Fire et al., 1998). Hierdurch sollte bei konstanter
subzellulärer Verteilung von NP-TIP2 sowohl die Konzentration im Cytoplasma, als auch im
Zellkern verringert werden. In beiden Fällen sollte folglich ein Anstieg der Luciferaseexpression durch die verringerte NP-TIP2 Konzentration im Zellkern erfolgen.
3.2.5.1 Inhibition des NP-TIP2 Kernimports durch Nucleozin
3.2.5.1.1 Einfluss von DMSO auf die Expression der Luciferase
Die Löslichkeitseigenschaften von Nucleozin wurden bisher ausschließlich für das
Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) publiziert ((Kao et al., 2010) und Hersteller Sigma,
München (DE)). Für DMSO wurden allerdings unspezifische Effekte unter anderem auch auf
die Expression verschiedener Gene beschrieben (siehe unter 3.2.5.1.1) (Chang et al., 2001;
Su et al., 2004; Wang et al., 2007). Aufgrund dessen wurden Titrationsexperimente mit der
Zelllinie ALF2 durchgeführt, um den Einfluss von DMSO auf deren Luciferaseexpression zu
- 53 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
überprüfen. Hierbei wurde DMSO in Konzentrationen von 0,1 bis 1 % zum Zellkulturmedium
zugegeben und die jeweilige Luiferaseaktivität nach 24 h bestimmt. Wie aus den in
Abbildung 26 dargestellten Messwerten hervorgeht, stieg die Luciferaseaktivität bei
zunehmender DMSO Konzentration kontinuierlich an. In Gegenwart von 1 % DMSO war die
gemessene Luciferaseaktivität mehr als doppelt so hoch wie in Abwesenheit von DMSO.
Wurde zum Ansatz mit 1 % DMSO zusätzlich Dox in einer Konzentration von 1 mg/l
zugegeben, sank die Luciferaseaktivität auf den gleichen Wert wie in einem Ansatz mit Dox
Luciferaseaktivität
[ALU/µg
ALU/µg
ProteinProtein]
ohne Zugabe von DMSO.
6.000
Abb. 26: Einfluss von DMSO auf die
5.000
Expression der Luciferase in der HeLa
Zelllinie ALF2
4.000
+ Dox
- Dox
3.000
Die Luziferseaktivität wurde bei verschiedenen DMSO Konzentrationen in An- und
Abwesenheit von 1 mg/l Dox gemessen und
ist in absoluten Lichteinheiten pro µg
Gesamtprotein des Zelllysats (ALU/µg
Protein) angegeben. Die jeweilige DMSO
Konzentration ist unter dem Diagramm
angegeben. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden
aus drei biologischen Replikaten ermittelt.
2.000
1.000
10
5
0
DMSO Konzentration
3.2.5.1.2 Wirkung von Nucleozin auf die Reporterzelllinien
Da die cytotoxische Wirkung von Nucleozin auf HeLa Zellen nicht bekannt ist, wurden die
Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 sowie ALF2 in Gegenwart von Nucleozin bis zu
einer Konzentration von 100 µM kultiviert und nach 24 h im Mikroskop untersucht. Hierbei
wurde bei Nucleozinkonzentrationen größer 30 µM eine starke Zunahme an abgestorbenen
Zellen beobachtet. Bei Konzentrationen größer 50 µM bildeten sich Nucleozin-Präzipitate im
Zellkulturmedium. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde Nucleozin in den nachfolgenden
Experimenten nur bis zu einer Konzentration von 30 µM eingesetzt. Im nächsten Schritt
erfolgte die Messung der Luciferaseaktivität in Abhängigkeit von der Nucleozinkonzentration.
Hierzu wurden die Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 sowie ALF2 für 24 h in
Gegenwart von 0 bis 30 µM Nucleozin inkubiert. Bei hohen Nucleozinkonzentrationen zeigte
sich in der anschließenden Luciferasemessung eine Abnahme der Konzentration an
Gesamtprotein in den hierfür hergestellten Zellysaten (Abb. 27). Da für den Konzentrations-
- 54 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
bereich bis 30 µM Nucleozin keine erhöhtes Zellsterben beobachtet wurde, kann dies als
Grund für diese Beobachtung ausgeschlossen werden. Eine mögliche Erklärungen stellt eine
nucleozinabhängige Verzögerung des Zellwachstums dar. Betrachtet man hingegen die
entsprechenden Luciferaseaktivitäten konnte kein Zusammenhang zwischen Luciferaseaktivität und Nucleozinkonzentration gefunden werden (Abb. 28). Die Zugabe von
0,5 % DMSO bewirkte bei den ALF2-NP Zelllinien, wie schon bei ALF2 beobachtet eine
ca. 1,5-fache Erhöhung der Luciferaseaktivität (siehe unter 3.2.5.1.1).
0,9
0,7
0,6
0,5
ALF2-NP19
0,8
µg Protein/µl
µg Protein/µl
0,9
ALF2
0,8
0,4
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,3
w/o
0
5
10
15
20
25
30
w/o
0
Konzentration Nucleozin [µM]
0,9
15
20
25
30
0,7
0,6
0,5
ALF2-NP31
0,8
µg Protein/µl
µg Protein/µl
10
0,9
ALF2-NP22
0,8
5
Konzentration Nucleozin [µM]
0,4
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,3
w/o
0
5
10
15
20
25
30
w/o
Konzentration Nucleozin [µM]
0
5
10
15
20
25
30
Konzentration Nucleozin [µM]
Abb. 27: Einfluss von Nucleozin auf die Proteinkonzentration der Zelllysate
Die hier gezeigten Daten liegen den Berechnungen der Luciferaseaktivität in Abbildung 28 zugrunde. Die
jeweilige Nucleozinkonzentration ist auf der Abszisse angegeben. Alle mit 0 bis 30 µM bezeichnten Ansätze
enthielten 0,5 % DMSO, w/o enthielt weder DMSO noch Nucleozin. Die Quantifizierung der Proteinkonzentration erfolgte photometrisch nach der Methode von Bradford (Bradford, 1976). Die hier dargestellten
Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt.
- 55 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Luciferaseaktivität [ALU/µg Protein]
10.000
1.000
ALF2-NP19
100
ALF2-NP22
ALF2-NP31
ALF2
10
1
w/o
0
5
10
15
20
25
30
Konzentration Nucleozin [µM]
Abb. 28: Einfluss von Nucleozin auf die Luciferaseexpression der
Reporterzelllinien
Die Luziferseaktivität wurde bei steigenden Nucleozinkonzentrationen gemessen
und ist in absoluten Lichteinheiten pro µg Gesamtprotein des Zelllysats (ALU/µg
Protein) angegeben. Die jeweilige Nucleozinkonzentration ist unter dem
Diagramm angegeben. Alle mit 0 bis 30 µM Nucleozin bezeichneten Ansätze
enthielten 0,5 % DMSO, w/o enthielt weder DMSO noch Nucleozin. Die hier
dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei
biologischen Replikaten ermittelt.
3.2.5.1.3 Subzelluläre Lokalisation von NP-EGFP in Gegenwart von Nucleozin
Da bei den Reporterzelllinien keine erhöhte Luciferaseexpression nach Zugabe von
Nucleozin beobachtet werden konnte (siehe 3.2.5.1.2), wurde die subzelluläre Lokalisation
der NP-EGFP Fusion in Gegenwart von 1, 5 und 10 µM Nucleozin fluoreszenzmikroskopisch
untersucht. In diesem Konzentrationsbereich wurde bei keiner der getesteten Zelllinien eine
nennenswerte Reduktion des Proteingehalts in den Zelllysaten festgestellt. Die Zugabe von
Nucleozin zum Zellkulturmedium erfolgte im Anschluss an die Transfektion der Zellen mit
dem für NP-EGFP kodierenden Plasmid pNP-EGFP. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse
wurde 24 h nach der Zugabe von Nucleozin durchgeführt (experimentelles Vorgehen siehe
unter 3.2.3.3.2 bzw. 3.2.3.1.2). Unabhängig von der eingesetzten Nucleozinkonzentration
konnte die Fluoreszenz von NP-EGFP ausschließlich im Zellkern detektiert werden. In
Abbildung 29 ist beispielhaft eine Aufnahme mit 10 µM Nucleozin gezeigt. Demnach hatte
Nucleozin in den hier angeführten Experimenten keinen Einfluss auf die subzelluläre
Lokalisation von NP.
- 56 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Abb. 29: Subzelluläre Lokalisation von NP-EGFP in Gegenwart von Nucleozin
HeLa Zellen wurden mit dem für NP-EGFP kodierenden Plasmid pNP-EGFP transfiziert und für
24 h in Gegenwart von 10 µM Nucleozin kultiviert. Die Länge des Skalierungsbalkens entspricht
20 µm. Von links: Hellfeld, DNA Färbung (Höchst 33342) in blau, EGFP Fluoreszenz in grün,
Überlagerung der drei Aufnahmen.
3.2.5.2 Reduktion der NP-TIP2 Expression über RNA-Interferenz
Durch die Transfektion einer humanen Zelle mit sogenannter siRNA („small interfering“ RNA)
kann die Degradation einer spezifischen mRNA induziert und somit die Expression des
entsprechenden Proteins reduziert werden (Elbashir et al., 2001; Elbashir et al., 2001).
Dieses Prinzip wurde in der hier vorliegenden Arbeit verwendet, um die Expression und
somit auch die nukleäre Konzentration von NP-TIP2 zu reduzieren. Hierfür wurden zwei
jeweils 21 Nukleotide umfassende siRNAs verwendet. Diese wurden mit dem Programm
siMAX Design (MWG) ausgewählt und als siNP-1 und siNP-2 bezeichnet. Als Kontrolle
diente zum Einen eine unspezifische siRNA (uspRNA) ohne Zielsequenz in den ALF oder
ALF-NP Zelllinien, zum Anderen so genannte Leertransfektionen (LTF) ohne Zugabe von
RNA. Für die Transfektionen wurden die Zelllinien ALF2, ALF2-NP19, -NP22 und -NP31
verwendet und die Luciferaseaktivität wurde nach 24, 48 und 72 h vermessen. Die
Ergebnisse der Messungen finden sich in Abbildung 30 und in Tabelle 5. Die bei der LTF
ermittelte Luciferaseaktivität entsprach bei allen Zelllinien und zu allen Messzeitpunkten
einem konstanten Niveau, das mit den Werten aus vorhergehenden Messungen vergleichbar
war (siehe unter 3.2.4.3, 3.2.4.6.2, 3.2.5.1.1 bzw. 3.2.5.1.2). In der Messung nach 24 h
wurde unabhängig von der transfizierten RNA kein Einfluss auf die Luciferaseaktivität der
analysierten Zelllinien gefunden. Aufgrund dessen beschränken sich die folgenden
Ausführungen auf die Messung nach 48 bzw. 72 h. Hierbei war die Luciferaseaktivität in allen
LTF und siNP-2 Ansätzen kleiner oder gleich dem ermittelten Wert für den uspRNA Ansatz.
Die höchste Luciferaseaktivität wurde jeweils in den Transfektionsansätzen mit siNP-1
gemessen. Dies traf allerdings auch für die Transfektionen der Ausgangszellline ALF2 zu,
die keine Zielsequenz für siNP-1 und siNP-2 enthielt. Aus diesen Beobachtungen kann man
schließen, dass alle hier verwendeten RNAs einen unspezifischen Effekt in den getesteten
Zelllinien hervorrufen. Daher beschränken sich die folgenden Ausführungen ausschließlich
- 57 -
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
auf den Vergleich der mit uspRNA und siNP-1 ermittelten Messwerte. Vergleicht man hierbei
die Luciferaseaktivität nach 48 h, so ist der jeweilige Wert für die mit siNP-1 transfizierten
Ansätze im Falle von ALF2 bzw. ALF2-NP31 um Faktor 3 und im Falle von ALF2-NP19 bzw.
ALF2-NP22 um Faktor 8 höher als der entsprechende Wert für die mit uspRNA transfizierten
Ansätze. In der Messung nach 72 h ergab sich bei ALF2 erneut ein 3-fach, bei ALF2-NP19
ein 16-fach, bei ALF2-NP22 ein 33-fach und bei ALF2-NP31 ein 38-fach höherer Wert. Somit
war der Anstieg der Luciferaseexpression bei den Transfektionen mit siNP-1 nach 48 h für
ALF2-NP19 und -NP22 und nach 72 h für alle getesteten ALNF-NP Zelllinien im Vergleich
zur
Ausgangszelllinie
ALF2
deutlich
höher.
Demnach
hat
siNP-1
neben
einem
unspezifischen Effekt auch eine spezifische Wirkung auf die ALF2-NP Zellinien. Somit kann
die beobachtete Zunahme der Luciferaseexpression in den ALF2-NP Zelllinien zumindest
teilweise durch eine Reduktion der Expression von NP-TIP2 erklärt werden.
- 58 -
- 59 -
1
10
100
1.000
10.000
24h
3x
8x
48h
8x
3x
3x
33x
38x
LTF
uspRNA
siNP-2
siNP-1
Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt.
der Transfektion mit siNP-1 im Vergleich zu der Transfektion mit uspRNA (gestrichelte Pfeile) in Form von Faktoren angegeben. Die hier dargestellten
Zelllinien und LTF stellt eine Leetransfektion ohne Zugabe von RNA dar. Bei den Messungen nach 48 bzw. 72 h ist die Steigerung der Luciferaseaktivität bei
Zelllysats (ALU/µg Protein) angegeben. siNP-1 und siNP-2 sind zwei, für NP-TIP2 spezifische siRNAs, uspRNA besitzt keine Zielsequenz in den einzelnen
Die Messungen wurden zu den Zeitpunkten 24, 48 und 72 h durchgeführt. Die Luciferseaktivität ist in absoluten Lichteinheiten pro µg Gesamtprotein des
16x
72h
Abb. 30: Transfektion der Zelllinien ALF2, ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 mit den siRNAs siNP-1 und siNP-2
Luciferaseaktivität [ALU/µg Protein]
100.000
_____________________________________________________________________________________________________
3 Ergebnisse
3 Ergebnisse
_____________________________________________________________________________________________________
Tab. 5: Transfektion der Zelllinien ALF2, ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 mit den siRNAs siNP-1 und siNP-2
Die Daten liegen der in Abb. 30 gezeigten Messung zugrunde. Die hier dargestellten Mittelwerte und Standardabweichungen wurden aus drei biologischen Replikaten ermittelt.
Luciferaseaktivität [ALU/µg Protein]
t
Zelllinie
ALF2
24‫ ‏‏‬h
48 h
72 h
siNP-1
2102
± 255
siNP-2
1353
± 254
uspRNA
2780
± 586
LTF
1771
± 333
ALF2-NP19
37
± 9
30
± 5
35
± 6
21
± 3
ALF2-NP22
50
± 21
30
± 3
61
± 20
23
± 3
ALF2-NP31
74
± 12
64
± 5
80
± 9
54
± 19
ALF2
9821
± 1653
699
± 102
3903
± 194
1963
ALF2-NP19
3267
± 549
220
ALF2-NP22
2600
± 363
ALF2-NP31
815
± 237
± 35
426
± 134
46
± 8
133
± 41
321
± 33
31
± 15
± 289
57
± 27
304
± 87
33
± 9
ALF2
19645
± 1049
504
± 105
7797
± 971
1732
ALF2-NP19
11154
± 1606
486
± 136
684
± 125
34
± 2
ALF2-NP22
24924
± 2554
895
± 534
752
± 86
24
± 6
ALF2-NP31
14458
± 754
93
± 41
381
± 84
30
± 2
- 60 -
± 43
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
4 DISKUSSION
Die Möglichkeit die TetR-regulierte Genexpression nicht nur über niedermolekulare
Substanzen, sondern auch über Interaktionen mit anderen Proteinen zu steuern, eröffnet ein
neuartiges Spektrum von Applikationen. Dies beinhaltet beispielsweise die Expressionsanalyse von TIP-fusionierten Proteinen in Prokaryonten (Schlicht et al., 2006) oder auch
einen Ansatz für die Konstruktion von Reportersystemen zur Analyse des nucleocytoplasmatischen Transports in Eukaryonten (siehe unter 2.2.4). Da die TetR-vermittelte
Genregulation schon in unterschiedlichsten Systemen eingesetzt wurde, kann hierbei zum
Einen
auf
einen
enormen
Erfahrungsschatz und
zum
Anderen
auf
bestehende
Systemkomponenten mit gut charakterisierten Eigenschaften zurückgegriffen werden. Auch
für die peptidische Induktion stehen mittlerweile eine Reihe von Peptiden mit unterschiedlicher Induktionseffizienz gegenüber einer Reihe von TetR Varianten zur Verfügung.
Dennoch beschränkte sich die Anwendung der peptidischen Induktion von TetR bisher auf
prokaryontische Organismen.
4.1 Optimierung des Reportersystems für S. cerevisiae
Um die Funktionalität der peptidischen Induktion von TetR in einem eukaryontischen
Organismus zu überprüfen, wurde in einer vorhergehenden Arbeit ein Plasmid-kodiertes
Reportersystem für den Einsatz in der Bäckerhefe konstruiert (Stöckle, 2008) (siehe unter
3.1). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das bestehende Reportersystem so weit zu
modifizieren, dass die peptidvermittelte Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS
Variante gezeigt werden konnte. Hierdurch sollte der Einsatz der bereits etablierten, auf
TetR(B) wt basierenden tTS und tTA Varianten für die Anwendung der TIPs in Eukaryonten
ermöglicht werden.
4.1.1 Verwendung von TIP2 als Induktorpeptid
Die erste Modifikation des Reportersystems betraf das Induktorpeptid W-TIP. Da TIP2 in
E. coli das mittlerweile effizienteste Induktorpeptid in Kombination mit TetR(B) wt darstellte,
wurde dieses statt W-TIP verwendet. In Abbildung 31A findet sich eine Vergleichsmessung
der vier TetR induzierenden Peptide TIP, W-TIP, pre-TIP2 und TIP2 in E. coli (Goeke et al.,
2011). Diese Messung wurde von Goeke et al. mit dem gleichen Messsystem erstellt, das
auch in dieser Arbeit verwendet wurde (siehe unter 3.2.4.5.1). Die Expression der Peptide
erfolgte als C-terminale Fusionen an das Trägerprotein TrxA in An- und Abwesenheit von
60 µM IPTG. Aus dieser Vergleichsmessung werden die Unterschiede in der Induktionseffizienz der beiden in S. cerevisiae eingesetzten Peptide W-TIP und TIP2, sowie deren
Vorläufer TIP und pre-TIP2 in Kombination mit TetR(B) wt ersichtlich. Mit TIP2 konnte in
- 61 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
diesem Messsystem sogar die Induktionseffizienz von Dox erreicht werden. Die
Aminosäuresequenzen der einzelnen Peptide sind in Abbildung 31B dargestellt.
A
w/o
+ Dox
+ IPTG
β-Gal-Aktivität [%]
100
Abb. 31: Die TIP Varianten TIP, W-TIP,
pre-TIP2 und TIP2
A) Induktionseffizienz der einzelnen TIP
Varianten gegenüber TetR(B) wt.
Die β-Gal-Aktivität in Abwesenheit von
TetR entspricht 100 %. Dox wurde in einer
Konzentration von 0,1 mg/l zugegeben.
80
60
40
20
0
Translationfusionen mit TrxA
B
TIP
W-T-W-N-A-Y-A-F-A-A-P-S-G-G-G-S
W-TIP
W-W-T-W-N-A-Y-A-F-A-A-P-S-G-G-G-S
pre-TIP2
D-D-S-V-L-A-A-R-L-R-M-W-M-W-H-W
TIP2
D-D-S-V-L-A-A-R-A-R-M-W-M-W-H-W
Die Peptide wurden über eine SGGA
„Linker-sequenz“ mit dem C-Terminus von
TrxA verbunden. Die Induktion von TetR
durch die Peptide wurde bei der
Basalexpression in Abwesenheit von IPTG
und bei Induktion durch 60 µM IPTG
gemessen. w/o bezeichnet einen Ansatz
ohne Zugabe von Dox oder IPTG.
B) Aminosäuresequenz der einzelnen TIP
Varianten im 1-Buchstaben Kode. W-TIP
leitet sich von TIP durch ein zusätzliches
Tryptophan am N-Terminus und TIP2 von
pre-TIP2 durch den Aminosäureaustausch
L9A ab (Positionen jeweils fett gedruckt
und unterstrichen).
Die Abbildung 31A wurde aus (Goeke et
al., 2011) entnommen und modifiziert.
4.1.2 Konstruktion des Trägerproteins
4.1.2.1 Austausch der fluoreszierenden Proteinkomponente
Im ursprünglichen Reportersystem wurde mYFP als fluoreszierende Proteinkomponente des
Trägerproteins verwendet, dessen Anregungs- und Emissionsspektren stark mit denen des
Reporterproteins GFP+ überlappten. Aufgrund dessen war es nicht möglich die reale
Fluoreszenz von GFP+ bei paralleler Expression mit dem Trägerprotein zu messen. Diese
musste durch Abzug eines aus der entsprechenden mYFP Fluoreszenz errechneten
Korrekturwertes von der gemessenen GFP+ Fluoreszenz ermittelt werden. Aus diesem
Grund sollte hier ein alternatives fluoreszierendes Protein verwendet werden, dessen
Absorptions- und Emissionsspektren im Vergleich zu denen von mYFP im langwelligeren
Bereich liegen. Die damit verbundene, geringere Überschneidung mit den Spektren von
GFP+ sollte die direkte Messung der GFP+ Fluoreszenz bei gleichzeitiger Expression des
Trägerproteins ermöglichen. Die Wahl fiel hierbei auf das rot fluoreszierende Protein
mCherry, das sich vom dsRed aus Discosoma sp. ableitet (Shaner et al., 2004). Dieses faltet
- 62 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
sich
im
Vergleich
zu
dsRed
ca.
40-fach
schneller
und
die
Absorptions-
und
Emissionsmaxima von mCherry liegen mit λex = 587 und λem = 610 nm noch weiter im
langwelligen Bereich als die von dsRed mit λex = 558 und λem = 583 nm. Daneben liegt
mCherry im Gegensatz zum tetrameren dsRed als Monomer in der Zelle vor. Es wurde
davon ausgegangen, dass für die Bindung von TIP2 an TetR im Falle eines monomeren
Trägerproteins geringere sterische Hindernisse zu erwarten sind, als für eine oligomere
Variante. Zusätzlich sollte der für die Induktion von TetR erforderliche Transport durch die
Kernporen bei der kleineren monomeren Variante effizienter ablaufen. Diese Gründe waren
auch im ursprünglichen Reportersystem für die Wahl der monomerisierten Variante von YFP
ausschlaggebend. Eine weitere Anforderung an das Trägerprotein für TIP2 stellte die
Exposition des N- und C-Terminus an der Oberfläche des fluoreszierenden Proteins dar. An
diesen Positionen befanden sich in der Trägerprotein-TIP2 Fusion die NLS bzw. die Sequenz
von TIP2, die für die Interaktion mit dem Kernimportrezeptor bzw. TetR zugänglich sein
mussten. Dieses Kriterium wurde anhand der Kristallstruktur von mCherry überprüft, die in
der Abbildung 32 dargestellt ist. Hier ist eine deutliche Exposition sowohl des N-, als auch
des C-Terminus an der Oberfläche von mCherry zu erkennen.
Abb. 32: Kristallstruktur von mCherry
N-Terminus
C-Terminus
Bänder in Pfeilform kennzeichnen Sekundärstrukturmotive.
Leicht gebogene Pfeilbänder stellen β-Faltblätter und
gewendelte Pfeilbänder stellen α-Helices dar. Die restliche,
nicht in Sekundärstrukturmotiven organisierte, Aminosäurekette ist als dicke Schnur eingezeichnet. Die Farben der
Aminosäurekette beginnen mit Blau am N-Terminus und
ändern sich nach Vorgabe des Farbspektrums von lang- zu
kurzwelligem Licht bis zum C-Terminus (Rot). Die Abbildung
wurde mit dem Programm „RCSB - Protein Workshop
Viewer“ (www.pdb.org) aus der Kristallstruktur von mCherry
(Zugangsnummer 2H5Q) erstellt (Shu et al., 2006).
- 63 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
4.1.2.2 Steuerung des Expressionsniveaus über Codonadaptation
Um eine vollständige Induktion der tTS Variante zu erreichen, sollte die Fusion aus TIP2 und
dem Trägerprotein auf hohem Niveau exprimiert werden. Aufgrund dessen wurde die
Expressionskassette für das Trägerprotein bereits in der ursprünglichen Variante des
Reportersystems für eine möglichst hohe Expression konstruiert. Jedoch hat auch die
Codonverteilung innerhalb eines Gens Einfluss auf die Expressionsrate des entsprechenden
Proteins (zusammengefasst in (Gustafsson et al., 2004)). So konnten beispielsweise
Hoekema et al. für die Phosphoglyceratkinase aus S. cerevisiae zeigen, dass der
systematische Austausch von Codons mit hoher Frequenz im Modellorganismus gegen
solche mit geringer Frequenz eine deutliche Reduktion des Expressionsniveaus zur Folge
haben kann (Hoekema et al., 1987). Dies gilt sowohl für die Expressionsrate eines
endogenen Proteins, als auch für die heterologe Expression von Proteinen. Um eine
möglichst effiziente Expression zu gewährleisten, wurden in dieser Arbeit zwei verschiedene
mcherry Gene verwendet, die sich im Codongebrauch unterschieden. Die Varianten 1 - 4
basierten auf einer humanadaptierten mcherry Genvariante und die Varianten 5 - 7 auf einer
für S. cerevisiae adaptierten Variante. Diese Genvarianten werden im Folgenden als
mcherry(ha) (humanadaptiert) und mcherry(ya) („yeast adapted“) bezeichnet. Eine
ausführliche Beschreibung der Adaptation der beiden Genvarianten findet sich unter 6.1.
Ein Vergleich der Expressionsraten für mcherry(ha) und mcherry(ya) ist anhand der für die
Varianten 4 und 7 gemessen Fluoreszenzintensität möglich. Diese beiden Varianten sind
analog aufgebaut und unterscheiden sich lediglich im Codongebrauch. Wie in der Abbildung
9 unter 3.1.3.4 zu sehen ist, lag die Fluoreszenzintensität im Falle der Variante 7
(mcherry(ya)) ca. 18 % über dem, für Variante 4 (mcherry(ha)) gemessenen Wert. Somit
hatte die Adaptation des mcherry Gens an den Codongebrauch von S. cerevisiae einen nur
geringen Effekt auf die Expressionsrate.
4.1.2.3 Kernimport der Trägerprotein-Varianten
Um eine möglichst hohe Konzentration des Trägerproteins im Zellkern zu erreichen, wurden
vier verschiedene NLSs, an den N-Terminus von mCherry fusioniert. Hierbei handelte es
sich um zwei natürlich vorkommende, einteilige NLSs aus dem Large-T Antigen des
Simianen Virus 40 (SV40 NLS) (Kalderon et al., 1984) und aus dem humanen c-Myc Protein
(c-Myc NLS) (Dang und Lee, 1988) sowie zwei synthetische zweiteilige NLSs (Hodel et al.,
2001). Die beiden zweiteiligen Varianten BP SV40 NLS und BP SV40 A6 NLS wurden von
Hodel et al. ausgehend von der SV40 NLS konstruiert und besitzen eine enorm hohe Affinität
zum Importin α, was mit einer starken Anreicherung im Zellkern korreliert. Die Dissoziationskonstanten mit Importin α liegen bei beiden NLSs im nanomolaren Bereich, wobei die der
BP SV40 NLS im Vergleich zur BP SV40 A6 NLS ca. 30-fach kleiner ist. Die Dissoziations-
- 64 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
konstante der einteiligen SV40 NLS mit Importin α ist dagegen ca. 300-fach größer als die
der BP SV40 NLS. Im Zuge dieser Messungen untersuchten Hodel et al. auch den Einfluss
verschiedener NLSs auf die Verteilung von Proteinen zwischen Zellkern und Cytoplasma.
Hierzu wurden GFP-Tandem Konstrukte (GFP-GFP) mit der entsprechenden NLSs am NTerminus konstruiert. Im Falle der beiden zweiteiligen Sequenzen wurde eine deutlich
stärkere Akkumulation im Zellkern gemessen als bei der einteiligen SV40 NLS. Hierbei
zeigte die BP SV40 A6 Variante trotz der geringeren Affinität zum Importin α eine im
Vergleich zur BP SV40 Variante minimal höhere Anreicherung im Zellkern.
4.1.2.3.1 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit einteiliger SV40 NLS
Die Varianten 1, 2, 4 und 7 trugen jeweils eine SV40 NLS am N-Terminus von mCherry. Bei
der Variante 2 wurde eine weitere SV40 NLS am N-Terminus zwischen mCherry und TIP2
eingefügt. Die Variante 2 entsprach somit im Aufbau dem mYFP(NLS)2 Trägerprotein in der
ursprünglichen Variante des Reportersystems. Allerdings zeigte die TIP2 Fusion der Variante
2 im Vergleich zu mYFP(NLS)2-W-TIP eine geringere Anreicherung im Zellkern (siehe unter
3.1.3.2). Eine mögliche Ursache für diese Beobachtung könnten Unterschiede in der
Zugänglichkeit der NLSs für die Transportrezeptoren der Zelle sein. Der direkte Vergleich
wird jedoch durch die beiden unterschiedlichen Peptidsequenzen für W-TIP und TIP2 am
C-Terminus der mYFP und mCherry Trägerproteine erschwert. Ein Einfluss der jeweiligen
TIP-Sequenz auf die benachbarte, C-terminale SV40 NLS kann hierbei nicht ausgeschlossen
werden. Ein direkter Vergleich ist dagegen zwischen der Variante 1 und 4 möglich, da diese
sich nur durch eine 10 AS lange „Linkersequenz“ zwischen mCherry und der SV40 NLS
unterscheiden. Die Einführung dieser „Linkersequenz“ führte zu einer deutlichen Steigerung
der Akkumulation im Zellkern. Die „Linkersequenz“ sollte den Abstand zwischen mCherry
und der NLS erhöhen und dadurch deren Exposition verbessern. Die stärkere Akkumulation
im Zellkern im Falle der Variante 4 könnte somit auf eine verbesserte Interaktion der NLS mit
den Transportrezeptoren zurückzuführen sein.
Die Expression der Varianten mit SV40 NLS hatte keinen Einfluss auf das Wachstum von
S. cerevisiae (siehe unter 3.1.3.3). Auch die Fluoreszenzintensität der Varianten 1, 4 und 7
mit jeweils einer SV40 NLS unterschied sich nur geringfügig (siehe unter 3.1.3.4). Nur für die
TIP2-Fusion der Variante 2 wurde eine geringere Fluoreszenzintensität gemessen (siehe
unter 3.1.3.4). Ein möglicher Grund für diese Beobachtung könnte die 28 AS lange,
synthetische Sequenz bestehend aus der NLS und TIP2 am C-Terminus von mCherry
darstellen. Diese Sequenz könnte sich beispielsweise negativ auf die Stabilität oder Faltung
des Proteins auswirken.
- 65 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
4.1.2.3.2 Charakteristika der Trägerprotein-Varianten mit zweiteiligen NLSs
Die Varianten 3 und 5 trugen am N-Terminus jeweils eine zweiteilige NLS mit der gleichen
10 AS „Linkersequenz“, die in Variante 4 verwendet wurde. Hierbei enthielt die Variante 3 die
BP SV40 NLS und die Variante 5 die BP SV40 A6 NLS. Am N-Terminus der NLS befand
sich in der Variante 3 eine Folge von sechs AS (ASMTGG), die bei der Variante 5 gegen ein
einzelnes Serin ausgetauscht wurde. In beiden Fällen dienten diese Reste in erster Linie der
Stabilisierung des Proteins. Würde die Proteinsequenz direkt mit der BP SV40 NLS oder der
BP SV40 A6 NLS beginnen, wäre die erste AS am N-Terminus jeweils ein Lysin. Proteine
mit einem am N-terminalen Lysin besitzen nach der „N-end rule“ eine geringe Halbwertszeit,
da sie schnell der Degradation über den Ubiquitin-Weg zugeführt werden (Varshavsky,
1996). Die N-terminalen Reste der Varianten 3 (Alanin) und 5 (Serin) werden hingegen als
stabilisierende Reste eingeordnet, was eine lange Halbwertszeit und somit eine höhere
zelluläre Konzentration zur Folge hat. Es wurde davon ausgegangen, dass diese Sequenzen
aufgrund ihrer geringen Größe und Zusammensetzung keinen Einfluss auf die Effizienz der
jeweiligen NLS haben. Wie die mikroskopische Analyse zeigte, vermittelten beide
Sequenzen eine starke Anreicherung im Zellkern mit geringer Restfluoreszenz im
Cytoplasma (siehe unter 3.1.3.2), was mit den Ergebnissen von Hodel et al. übereinstimmte
(Hodel et al., 2006).
Sowohl die Expression der Variante 3 als auch der Variante 5 verursachte ein verzögertes
Wachstum von S. cerevisiae auf Festmedium. Eine mögliche Erklärung hierfür stellt die
Affinität der jeweiligen NLS zu Importin α dar. Die Höhe dieser Affinität hat nicht nur
Auswirkungen auf die Effizienz der Bindung der Interaktionspartner im Cytoplasma und somit
den Kernimport des entsprechenden Proteins, sondern auch auf die Dissoziation des
Transportkomplexes im Zellkern. Solange das transportierte Protein nicht von Importin α
abgelöst wird, kann dieses nicht an seinen Exportfaktor CseI binden um wieder in das
Cytoplasma transportiert zu werden (Solsbacher et al., 1998; Gilchrist et al., 2002; Matsuura
et al., 2004). Wird die Dissoziation des Transportkomplexes im Zellkern aufgrund der hohen
Affinität einer NLS zu Importin α erschwert, kann dies die Menge an Importin α im
Cytoplasma reduzieren und zu verzögertem Wachstum führen (Hodel et al., 2006). Die hier
beobachteten Wachstumsverzögerungen traten bei Variante 3 und 5 auf Festmedium und
bei Variante 3 auch in Flüssigmedium auf. In Flüssigmedium sind die Zufuhr von Nähstoffen,
sowie der Abtransport von Stoffwechselprodukten im Vergleich zu Festmedium deutlich
erleichtert. Möglicherweise hat die BP SV40 A6 NLS einen geringeren Einfluss auf die
Physiologie der Zelle als die BP SV40 NLS, der unter optimalen Bedingungen im
Flüssigmedium, nicht aber auf Festmedium ausgeglichen werden kann. Eine mögliche
Begründung hierfür stellt die im Vergleich zur BP SV40 NLS niedrigere Affinität der
BP SV40 A6 NLS zu Importin α dar. Der Einfluss der BP SV40 NLS auf das Wachstum von
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4 Diskussion
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S. cerevisiae auf Festmedium wurde auch in den Arbeiten von Hodel et al. untersucht. Hier
wurde neben dem S. cerevisiae Laborstamm ACY192 auch mit einem Stamm gearbeitet, der
sich durch eine reduzierte Fähigkeit zur Dissoziation des Importin α-NLS Komplexes im
Zellkern auszeichnete. Eine Wachstumsverzögerung konnte in diesen Untersuchungen zwar
für die Mutante, nicht aber für den Stamm ACY192 beobachtet werden. Der Einfluss der
BP SV40 A6 NLS wurde in diesen Experimenten nicht getestet. Die abweichenden Beobachtungen in der hier vorliegenden Arbeit könnten durch die Verwendung eines anderen Hefestamms (K699 statt AYC192) und eine abweichende Anzuchttemperatur (28 °C statt 25 °C)
begründet sein. Interessanterweise wich die Wuchsgeschwindigkeit der Variante 3 in
Flüssigmedium während der logarithmischen Phase nicht signifikant von dem für die anderen
Varianten ermittelten Wert ab. Möglicherweise hat ein Eingriff in das Regulationsnetzwerk
des nucleo-cytoplasmatischen Transportes während der Anpassungsphase drastischere
Folgen für die Wachstumsgeschwindigkeit, als es während der logarithmischen Phase der
Fall ist.
Die für die Variante 3 gemessene Fluoreszenzintensität lag deutlich unter dem Niveau der
anderen Varianten (siehe unter 3.1.3.4). Ein möglicher Grund hierfür könnte ein negativer
Einfluss der 30 AS langen, N-terminalen Sequenz, auf Stabilität oder Faltungseffizienz des
Proteins sein.
4.1.2.3.3 Charakteristika der Trägerprotein-Variante 6 mit c-Myc NLS
Die Variante 6 enthielt als einzige Trägerprotein-Variante weder eine SV40 NLS, noch eine
Sequenz, die aus dieser abgeleitet wurde. Stattdessen wurde die c-Myc NLS verwendet, die
nicht wie die SV40 NLS fünf, sondern lediglich drei positiv geladene Reste enthält. Zwischen
NLS und mCherry befand sich wie in den Varianten 3, 4, 5 und 7 eine 10 AS lange
„Linkersequenz“ und am N-Terminus analog zu Variante 5 ein einzelnes Serin. Die SV40
NLS und die c-Myc NLS zeigten in den Experimenten von Hodel et al. eine vergleichbare
Affinität zu Importin α, jedoch vermittelte die SV40 NLS am N-Terminus des GFP-Tandem
Konstrukts (siehe unter 4.1.2.3) im Vergleich zur c-Myc NLS eine stärkere Akkumulation im
Zellkern. In den Expressionsanalysen wurde von allen getesteten Varianten im Falle der
Variante 6 die höchste Fluoreszenzintensität erreicht (siehe unter 3.1.3.4). Die Begründung
hierfür liegt möglicherweise in der stabilisierenden Wirkung N-terminalen Serin Restes (siehe
unter 4.1.2.3.2). Die Anreicherung der Variante 6 im Zellkern von S. cerevisiae war hingegen
schwächer als bei den analog aufgebauten Varianten 4 und 7 mit SV40 NLS, was mit den
Beobachtungen von Hodel et al. übereinstimmte.
- 67 -
4 Diskussion
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4.1.2.4 Regulation des Expressionsniveaus des neuen Trägerproteins
Die Variante 7 (mCherry7) stellte die beste Kombination aus hoher Expression und nukleärer
Anreicherung dar und hatte keinen negativen Einfluss auf das Wachstum von S. cerevisiae,
weshalb sie als Trägerprotein für TIP2 eingesetzt wurde. Wie auch im ursprünglichen
Reportersystem erfolgte die Expression von mCherry7 bzw. des Fusionsproteins aus
mCherry7 und TIP2 (mCherry7-TIP2) über den Methionin-abhängigen met25 Promotors aus
S. cerevisiae. Mumberg et al. beobachteten in ihren Experimenten mit dem met25 Promotor
eine Methionin-vermittelte Repression der Proteinexpression um Faktor 10 - 100 in
Abhängigkeit von der Halbwertszeit des exprimierten Proteins. In den hier durchgeführten
Experimenten konnte eine Methionin-abhängige Reduktion der mCherry Fluoreszenz um
Faktor 6 für mCherry7 und um Faktor 11 für mCherry7-TIP2 gemessen werden. Ob der
Unterschied der Regulationsfaktoren durch abweichende Halbwertszeiten begründet wird, ist
aus diesen Experimenten nicht ersichtlich. Jedoch enthielt mCherry7-TIP2 im Gegensatz zu
mCherry7 eine 20 AS umfassende Sequenz bestehend aus TIP2 und der SGGA
„Linkersequenz“ am C-Terminus, die sich durchaus auf die die Halbwertszeit des Proteins
auswirken könnte.
4.1.3 TIP2-vermittelte Induktion der auf TetR(B) wt basierenden tTS
Variante
Obwohl die auf TetR(B) wt basierende tTS Variante im Vergleich zu der auf der
Doppelmutante basierenden tTS Variante bessere Repressionseigenschaften aufwies,
konnte die GFP+ Expression nur um Faktor 2,2 reprimiert werden. Ein möglicher Grund für
diesen geringen Regulationsfaktor stellt das niedrige Expressionsniveau der tTS Variante
dar. Von einer Steigerung der tTS Expression zur Vergrößerung des Messfensters wurde
abgesehen um die Sensitivität des Systems zu erhalten. Es wurde davon ausgegangen,
dass
aufgrund
der
Reproduzierbarkeit
der
Messwerte
auch mit
diesem kleinen
Regulationsfaktor zuverlässige Messungen möglich sind. In den Kontrollmessungen mit
mCherry7 lag die GFP+ Fluoreszenz konstant ca. 13 % über dem Wert, der in Abwesenheit
des Trägerproteins gemessen wurde. Der Grund für diesen erhöhten Wert ist nicht bekannt.
Da kein Zusammenhang zwischen erhöhtem Hintergrund und der entsprechenden mCherry
Fluoreszenz bestand, wurde davon ausgegangen, dass die mit dem Reportersystem
gewonnenen Daten hierdurch nicht beeinflusst wurden. Bei der höchsten mCherry7-TIP2
Expression in Abwesenheit von Methionin konnte die maximale Expression von GFP+
erreicht werden. Wurde die Expression von mCherry7-TIP2 durch Zugabe von Methionin
verringert, sank die GFP+ Fluoreszenz auf ca. 75 % des Maximalwertes ab. Eine Absenkung
der GFP+ Expression auf das Niveau der Messungen mit mCherry7 war nicht möglich. Es
wird davon ausgegangen, dass hierfür eine weitere Reduktion der mCherry7-TIP2
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4 Diskussion
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Expression erforderlich gewesen wäre. Dies könnte beispielsweise durch Modifikation der
Sequenzumgebung des Startcodons, destabilisierende Reste am N-Terminus oder auch
durch Veränderung des Codongebrauchs erreicht werden (Hamilton et al., 1987; Hoekema
et al., 1987; Varshavsky, 1996).
Unabhängig davon konnte hier eine zunehmende Induktion des tTS durch steigende
Expression von mCherry7-TIP2 gezeigt werden, die in diesem System sogar das Niveau der
Induktion durch Dox erreichte. Im Gegensatz dazu bestand kein Zusammenhang zwischen
dem Expressionsniveau des Trägerproteins mCherry7 und der GFP+ Expression. Somit
wurde das Ziel dieses Teilprojektes, der Nachweis der peptidischen Induktion einer auf
TetR(B) wt basierenden tTS Variante in S. cerevisiae, erreicht.
4.1.4 Weitere Einsatz- und Optimierungsmöglichkeiten für das
Reportersystem
Das hier beschriebene Reportersystem wurde in erster Linie für den prinzipiellen Nachweis
der peptidischen Induktion von tTS Varianten konstruiert. Ein weiterer, möglicher
Einsatzbereich des Systems stellt beispielsweise die Expressionsanalyse TIP-fusionierter
Proteine dar, die entweder konstitutiv im Zellkern lokalisiert sind oder frei durch die
Kernporen diffundieren können. Um die Aussagekraft der Daten zu erhöhen, wäre hierfür
allerdings eine Vergrößerung des Messfensters erforderlich. Dies könnte wie schon unter
4.1.3 erwähnt durch eine Erhöhung des Expressionsniveaus der tTS Variante beispielsweise
durch Verwendung eines stärkeren Promotors erfolgen. Um die Sensitivität des
Reportersystems
zu
Reportergenkassette
erhalten
müsste
allerdings
modifiziert
werden.
Eine
im
Zuge
verbesserte
dessen
Regulation
auch
die
könnte
hier
möglicherweise über alternative Promotoren in Kombination mit anderen TRE Varianten
erzielt werden.
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4 Diskussion
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4.2 Konstruktion eines Reportersystems zur Analyse des
nucleo-cytoplasmatischen Transports
In eukaryontischen Organismen erfordert die Regulation TetR-kontrollierter Genexpression
die Lokalisation des Effektors im Zellkern. Da niedermolekulare Effektoren wie Tetrazykline
passiv durch Membranen diffundieren können (Sigler et al., 2000) stellt die Kernmembran für
solche Effektoren höchstwahrscheinlich kein Hindernis dar. Im Gegensatz dazu führt der
einzige Weg für eine Trägerprotein-TIP Fusion in den Zellkern durch die Kernporen, wodurch
die TetR-kontrollierte Genexpression zum Indikator dieses Transportvorgangs wird. Daraus
ergibt sich die Möglichkeit der Konstruktion von Reportersystemen zur Analyse des nucleocytoplasmatischen Transports ausgewählter Proteine. Die Bedeutung solcher Reportersysteme wird aus der Vielzahl von Erkrankungen ersichtlich, die mit einer gestörten nucleocytoplasmatischen Verteilung verschiedener Proteine assoziiert sind (zusammen-gefasst in
(Chahine et al., 2009)). So konnte beispielsweise eine Fehllokalisation der Transkriptionsfaktoren NF-κB („nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells“), HIF1-α
(„hypoxia-inducible factor 1“) oder auch NFAT („nuclear factor of activated T-cells”) mit der
Entstehung von Krebserkrankungen in Zusammenhang gebracht werden. Jedoch spielt der
nucleo-cytoplasmatische Transport nicht nur bei der Entstehung von Krebserkrankungen,
sondern auch bei der Infektion durch verschiedene Viren eine wichtige Rolle (siehe unter
2.3.3). Wie am Beispiel des NP aus dem Influenza A Virus gezeigt wurde, stellt die Inhibition
des Kerntransports viraler Proteine einen vielversprechenden Ansatzpunkt für die
Identifizierung neuer Therapeutika dar (Cros et al., 2005; Kao et al., 2010). Für die Suche
nach entsprechenden Wirkstoffen werden allerdings leistungsfähige Reportersysteme
benötigt, welche die Analyse großer Substanzenbanken im Hochdurchsatzverfahren (HTSVerfahren „high throughput screening“) erlauben. Die verfügbare Methodik zur Analyse des
nucleo-cytoplasmatischen Transports ausgewählter Proteine ist gut etabliert und wurde
ständig verbessert (siehe unter 2.3.2). In den beiden gängigsten Methoden wird die
subzelluläre Lokalisation des zu untersuchenden Proteins anhand von Translationsfusionen
mit fluoreszierenden Proteinen oder durch Immunolokalisation untersucht. Allerdings
unterliegen diese Methoden klaren Limitationen und eignen sich nicht für den Einsatz in
HTS-Verfahren. Das hier vorgestellte System vereint die Vorteile dieser beiden Systeme
ohne den gleichen Einschränkungen zu unterliegen. Im Vergleich zu dem experimentellen
Ansatz, der auf der Fusion des zu untersuchenden Zielproteins mit einem fluoreszierenden
Proteins basiert, wird hier nur eine kurze Sequenz an das zu untersuchende Protein
angefügt. So umfasst beispielsweise das Induktorpeptid TIP2 inklusive der SGGA
„Linkersequenz“ lediglich 20 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 2,3 kDa. Es ist
davon auszugehen, dass die Eigenschaften des zu untersuchenden Proteins durch die
Fusion mit TIP2 in geringerem Maße beeinflusst werden, als durch die Fusion mit einem, im
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4 Diskussion
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Falle von GFP 238 AS und 27 kDa umfassenden Protein. Durch die Verwendung eines
entsprechenden Reporters wie beispielsweise der Luciferase aus Photinus pyralis kann die
Quantifizierung der Reportergenaktivität sowohl in vitro aus Zelllysaten, als auch in vivo
erfolgen (zusammengefasst in (Greer et al., 2002)). Dies erlaubt die Untersuchung einer
einzelnen Zelle oder einer Zellpopulation über einen längeren Zeitraum und unter
wechselnden Bedingungen. Die Detektion der subzellulären Lokalisation des Zielproteins
erfolgt im hier vorgestellten System nicht wie in den gängigen Systemen über die visuelle
Erfassung eines Fluoreszenzsignals im Mikroskop, sondern über die Quantifizierung der
Reportergenaktivität. Diese Form der Detektion erlaubt die Automatisierung der Messung,
wodurch die Anwendung in HTS-Verfahren ermöglicht wird.
4.2.1 Planung und Konstruktion der Reporterzelllinien
Die hier konstruierten Reporterzelllinien stellen die erste Version eines auf der peptidischen
Induktion von TetR basierenden Reportersystems zur Analyse des nucleo-cytoplasmatischen
Transports viraler Proteine dar. Die Konzeption der Reporterzelllinien (siehe unter 3.2.2) sah
hierbei eine stabile Integration aller Komponenten des Reportersystems vor. Hierdurch sollte
eine höhere Reproduzierbarkeit der Daten erreicht werden als dies bei transienten
Transfektionen einer oder mehrerer Komponenten der Fall wäre. Die stabile Integration
erleichtert weiterhin den Einsatz der Zelllinien in HTS-Verfahren, da der zeitliche und
finanzielle Aufwand bei transienten Ansätzen deutlich größer wäre. Die Reporterzelllinien
sollten auf virale Proteine angewendet werden, die während der Virusreplikation im Zellkern
lokalisiert sind. Aufgrund dessen wurde das Reportersystem so konzipiert, dass bei
nukleärer Lokalisation der POI-TIP2 Fusion keine oder nur geringe Expression des
Reportergens erfolgt. Die Reduktion der nukleären Konzentration der POI-TIP2 Fusion
hingegen sollte in einem Anstieg der Reportergenexpression resultieren. Dieser Ansatz
wurde gewählt, um die Reporterzelllinien im Ausgangszustand nicht durch eine hohe
konstitutive Expression des Reportergens zu belasten. Für den Aufbau eines solchen unter
Tet-Kontrolle befindlichen Systems sind zwei verschiedene Konstruktionsansätze möglich,
die in Abbildung 33 dargestellt sind. Die erste Version (Abb. 33A) entspricht dem hier
konstruierten System und besteht aus einem Tet-kontrollierten Minimalpromotor in
Kombination mit einer tTA Variante. In der zweiten Version (Abb. 33B) erfolgt die Regulation
des Reportergens über einen starken Tet-kontrollierten Promotor in Kombination mit einer
sogenannten reversen tTS (rtTS) Variante (Hayakawa et al., 2006). rtTS Varianten basieren
auf reversen TetR Mutanten (revTetR), die im Gegensatz zu TetR wt nicht in Ab-, sondern
nur in Anwesenheit eines Induktors an DNA binden können (Kamionka et al., 2004; Scholz et
al., 2004). Bisher konnte allerdings kein Peptid mit der Fähigkeit zur Korepression einer rtTS
Variante in Eukaryonten isoliert werden, weshalb hier nur die erste Version konstruiert
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4 Diskussion
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wurde. Aufgrund der Ergebnisse des ersten Teilprojektes dieser Arbeit konnte hierfür die tTA
Variante bestehend aus TetR(B) wt und der FFF Aktivatordomäne verwendet werden (Baron
et al., 1997). Die Kombination aus dieser tTA Variante, einem CMVmin Minimalpromotor und
einem TRE bestehend aus sieben Wiederholungen von tetO2 zeichnet sich durch eine
geringe Hintergrundaktivität sowie ein großes Messfenster aus (Baron et al., 1997). Um eine
hohe Reportergenexpression im induzierten Zustand und somit ein großes Messfenster zu
erreichen, erfolgte die tTA Expression auf hohem Niveau über einen CMVIE Promotor. Für
eine möglichst vollständige Induktion der tTA Variante durch TIP2 erfolgte die Expression der
POI-TIP2 Fusion ebenfalls auf hohem Niveau unter transkriptioneller Kontrolle des
hEF1-HTLV Promotors.
A
B
tTA
TRE
rtTS
PMin
TRE
Reportergen
TRE
-
PStark
Reportergen
Abb. 33: Reportersystemvarianten für konstitutiv kernlokalisierte POIs
Protein-kodierende Bereiche sind orange und eukaryontische Promotoren blau dargestellt. Stromaufwärts der
Promotoren befindet sich jeweils ein TRE, bestehend aus mehreren Wiederholungen des Tet-Operators tetO2. Es
ist jeweils der Ausgangszustand des Reportersystems für kernlokalisierte POI-TIP Fusionen dargestellt.
A) Ein Reportergen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines Minimalpromotors, dessen Aktivität durch eine
tTA Variante gesteuert wird. Die tTA Variante ist in grau dargestellt und setzt sich aus dem TetR Dimer
(dunkelgrau) mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne sowie einer Aktivatordomäne (hellgrau)
zusammen. Im Ausgangszustand des Reportersystems wird die tTA Variante durch die POI-TIP Fusion induziert
und kann somit nicht an die Tet-Operatoren des TRE binden. Es erfolgt keine oder nur geringe Basalexpression
des Reportergens.
B) Ein Reportergen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines starken Promotors, dessen Aktivität durch eine
rtTS Variante gesteuert wird. Die rtTS Variante ist in grün dargestellt und setzt sich aus dem revTetR Dimer
(hellgrün) mit ovalem Proteinkörper und runder DNA-Bindedomäne sowie einer Aktivatordomäne (dunkelgrün)
zusammen. Im Ausgangszustand des Reportersystems wird die rtTS Variante durch die POI-TIP Fusion
koreprimiert und bindet dadurch an die Tet-Operatoren des TRE. Somit erfolgt keine oder nur geringe Expression
des Reportergens.
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4 Diskussion
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4.2.2 Auswahl von geeigneten Influenza A Proteinen
Wie aus dem jährlichen Auftreten von Grippeepidemien sowie einer Pandemie im Jahre
2009 hervorgeht, stellt das Influenza A Virus ein ernst zu nehmendes gesundheitspolitisches
Problem dar. Die therapeutischen Möglichkeiten für die Behandlung von Influenza A
Infektionen sind dagegen begrenzt und Resistenzen gegenüber den verfügbaren Wirkstoffen
weit verbreitet (siehe unter 2.4.4.3). Aus diesen Gründen wurden Proteine aus dem Influenza
A Virus für die Anwendung des hier konstruierten Reportersystems gewählt. Da die
Expression dieser Proteine in uninfizierten Zellen erfolgen sollte wurden Proteine
ausgewählt, die nicht nur während der Infektion, sondern auch bei heterologer Expression im
Zellkern lokalisiert sind. Hierbei sollte die natürliche Physiologie der Zelle durch die
Expression der Proteine nach Möglichkeit nicht beeinträchtigt sein. Ein weiteres Kriterium für
die Auswahl des POI war die Verfügbarkeit von im Cytoplasma lokalisierten Varianten, da
diese als Kontrollen eingesetzt werden sollten. Aufgrund dieser Auswahlkriterien wurden die
Influenza A Proteine NP, M1 und NS1 als potentielle POIs ausgewählt.
4.2.2.1 Relevanz der Virusstämme Influenza A/WSN/1933 und
A/Rostock/FPV/1934
In dieser Arbeit wurden die Varianten der Proteine NS1 und NP aus dem Virusstamm
Influenza A/WSN/1933 (H1N1) sowie das M1 Protein aus Influenza A/FPV/Rostock/1934
(H7N1) verwendet. Bei Influenza A/WSN/1933 handelt es sich um einen der in der
Forschung am häufigsten verwendeten Influenza A Virusstämme (Bouvier und Lowen,
2010). Der Stamm leitet sich vom ersten, im Jahre 1933 isolierten Virusstamm A/WS/1933
ab und unterscheidet sich von diesem durch sechs Mutationen im ns Gen (Ward et al.,
1993). Influenza A/WSN/1933 ist weiterhin einer der wenigen, in Mausmodell neurovirulenten
Influenza A Stämme (Francis et al., 1940). Hierbei sind die meisten Zuchtstämme
hochgradig suszeptibel, wohingegen Wildstämme auch gegenüber hohen Dosen resistent
sind (Bouvier und Lowen, 2010). Daneben dienten die einzelnen Komponenten von Influenza
A/WSN/1933 in einer Vielzahl Studien als Modell für die Erforschung der molekularen
Mechanismen der Influenza A Viren. Influenza A/FPV/Rostock/1934 stellt ein aviäres Isolat
dar, aus dem beispielsweise M1 und NP als Modellproteine für aviäre Influenzaviren dienten
(Mandler et al., 1989; Thaa et al., 2009).
4.2.2.2 Das Matrixprotein 1
Das Protein M1 aus dem Influenza A Virus besteht aus 252 Aminosäuren und hat eine
molekulare Masse von ca. 28 kDa (Modrow et al., 2010). M1 ist mit etwa 3.000 Kopien das
häufigste Protein im Virion und erfüllt hier vor allem strukturelle Aufgaben in der
Aufrechterhaltung der Virusarchitektur (Lamb, 1989). Daneben besitzt M1 verschiedene
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4 Diskussion
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Funktionen während der Virusreplikation, wobei für mindestens zwei dieser Aufgaben eine
nukleäre Lokalisation erforderlich ist. So ist M1 ist zum Einen an der Regulation der
Transkription viraler RNA beteiligt und stellt zum Anderen einen essentiellen Faktor für den
Export neu synthetisierter Nucleocapside dar (Hankins et al., 1990; Watanabe et al., 1996;
Bui et al., 2000). Der Kernimport von M1 erfolgt mittels einer einteiligen, palindromischen
NLS bestehend aus den Resten 101 bis 105 (101RKLKR105). Ye et al. untersuchten den
Einfluss von Mutationen innerhalb dieser NLS auf die subzelluläre Lokalisation von M1 (Ye et
al., 1995). Hierzu exprimierten sie das M1 Protein aus Influenza A/WSN/1933 sowie
verschiedene Mutanten in uninfizierten CV114 Zellen und detektierten deren subzelluläre
Lokalisation mit immunologischen Methoden. Die wt Variante war im Zellkern lokalisiert,
wohingegen der Austausch der vier positiv geladenen Reste der NLS gegen ungeladene
Reste (101SNLNS105) zur Lokalisation im Cytoplasma führte. Die nukleäre Lokalisation von
M1 wurde auch von Thaa et al. beobachtet, die mit YFP Fusionen am N-Terminus des M1
Proteins aus Influenza A/FPV/Rostock/1934 in uninfizierten CHO-K115 Zellen arbeiteten
(Thaa et al., 2009). Im Gegensatz dazu zeigten Bui et al. eine gleichmäßige Verteilung des
M1 Proteins aus Influenza A/WSN/1933 in CHO Zellen bei immunologischer Detektion (Bui
et al., 1996). Das gleiche wurde von Sato et al. mit einer EGFP Fusion am N-Terminus des
M1 Proteins (EGFP-M1) aus Influenza A/PR/8/34 in uninfizierten MDCK und HeLa Zellen
beobachtet (Sato et al., 2003). Wurden diese EGFP-M1 exprimierenden Zellen allerdings mit
dem Influenza A/PR/8/34 Virus infiziert, konzentrierte sich die Fluoreszenz im Zellkern. Die in
der vorliegenden Arbeit beobachtete, gleichmäßige Verteilung von M1-EGFP innerhalb der
Zelle stimmten sich mit den Ergebnissen von Sato et al überein, wobei zu beachten ist, dass
es sich hier um eine EGFP Fusion am C-Terminus, und nicht wie bei Sato et al. am
N-Terminus des M1 Proteins handelte. Des Weiteren arbeiteten Sato et al. mit einer M1
Variante aus einem anderen Virusstamm. Bei Thaa et al. handelte es sich zwar um die
gleichen M1 Variante wie in der vorliegenden Arbeit, allerdings wurde mit einer N-terminalen
YFP Fusion sowie einem anderen Zelltyp gearbeitet. Ein Einfluss der Punktmutation (siehe
unter 3.2.3.1) im von Thaa et al. verwendeten M1 Protein auf dessen subzelluläre
Lokalisation ist nicht bekannt. Die subzelluläre Lokalisation des POI bei Expression in
uninfizierten Zellen stellte ein wichtiges Kriterium für die Anwendung in den Reporterzelllinien
dar, da auch hier mit uninfizierten Zellen gearbeitet werden sollte. Da die M1-EGFP Fusion in
den hier durchgeführten Experimenten keine Anreicherung im Zellkern zeigte, wurde M1
nicht weiter verwendet.
14
Bei CV1 Zellen handelt es sich um eine Nierenzelllinie aus dem Affen (Jensen et al., 1964).
15
CHO-K1 Zellen wurden durch Subklonierung aus CHO Zellen („chinese hamster ovary“) abgeleitet, bei denen
es sich um eine Ovarzelllinie aus dem Hamster handelt (Puck et al., 1958; Tjio et al., 1958).
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4 Diskussion
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4.2.2.3 Das Nichtstrukturprotein 1
NS1 aus Influenza A hat je nach Virusstamm eine Länge von 230 - 237 AS und eine molekulare Masse von ca. 26 kDa (Palese et al., 2007). Bei NS1 handelt es sich um einen
Virulenzfaktor, der die Immunantwort des Wirtes auf mehreren Wegen beeinflusst
(zusammengefasst in (Modrow et al., 2010)). So reduziert NS1 beispielweise die Expression
der Interferon Gene durch Bindung an den Transkriptionsfaktor NF-κB (Wang et al., 2000).
Daneben interagiert NS1 mit CPSF („cleavage and polyadenylation factor“) wodurch die
Reifung der mRNAs des Wirtes, darunter auch die für Interferon-β (IFN-β) blockiert wird
(Nemeroff et al., 1998; Krug et al., 2003; Noah et al., 2003). Die Ausübung der hier
genannten Funktionen erfordert eine nukleäre Lokalisation des NS1 Proteins. In
verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass im Falle von cytoplasmatischen NS1
Varianten eine erhöhte IFN-β Produktion stattfindet, was zu mindestens teilweise auf die
subzelluläre Lokalisation von NS1 zurückzuführen war (Ludwig et al., 2002; Donelan et al.,
2003; Min et al., 2006). Allerdings bleibt zu erwähnen, dass NS1 in infizierten Zellen auch im
Cytoplasma zu finden ist, wo es beispielsweise in der selektiven Translation viraler mRNAs
mitwirkt (de la Luna et al., 1995). Für die Steuerung der subzellulären Lokalisation enthält
NS1 je eine NLS in der Nähe des N- und des C-Terminus (35RLRR38 und
216PKQKRK221)
16
sowie eine leucinreiche Kernexportsequenz (138FDRLETLILL147)16 (Greenspan et al., 1988; Li
et al., 1998). Bei Expression von NS1 in uninfizierten Zellen wird die Funktion der NES durch
eine angrenzende Sequenz inhibiert, weshalb NS1 hier im Zellkern akkumuliert. Li et al.
konnten zeigen, dass durch drei Aminosäureaustausche (R148A, E152A und E153A)
innerhalb dieser inhibierenden Sequenz eine cytoplasmatische Variante entsteht (Li et al.,
1998).
In einer Reihe von Zelltypen konnte eine NS1-vermittelte Induktion der Apoptose beobachtet
werden (zusammengefasst in (Schultz-Cherry et al., 2001)). Hierbei handelt es sich sowohl
um permissive Zelltypen wie Makrophagen, MDCK und Mv1Lu 17 Zellen, als auch um nicht
permissive Zelltypen wie HeLa oder Lymphozyten. In Lymphozyten und HeLa Zellen wurde
gezeigt, dass bereits die Expression von NS1 für die Induktion der Apoptose ausreicht. In
den hier durchgeführten Experimenten führte die transienten Expression der NS1-EGFP
Fusion über 24 h nicht zu einem vermehrten Zellsterben, längere Zeiträume wurden nicht
getestet. Die in diesen Experimenten beobachtete, nukleäre Lokalisation von NS1-EGFP
stimmte mit den Beobachtungen von Kok at al. überein, die ebenfalls die subzelluläre
Lokalisation des NS1 Proteins aus Influenza A/WSN/1933 in HeLa Zellen, allerdings mittels
immunologischer Methoden untersuchten (Kok und Jin, 2006). Das hier konstruierte System
16
17
Die Positionen beziehen sich auf das NS1 Protein aus A/WSN/1933 mit 231 AS.
Bei Mv1Lu Zellen („mink lung epithelial“) handelt es sich um eine Lungenepithelzelllinie aus dem Nerz
(Henderson et al., 1974).
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4 Diskussion
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sah eine konstitutive Expression der POI-TIP2 Fusion vor, weshalb NS1 nur in Zelltypen
ohne NS1-vermittelte Induktion der Apoptose eingesetzt werden könnte. Eine solche Linie
stellt die HEK293 Linie dar, die bereits erfolgreich für die Herstellung einer stabilen, NS1exprmierenden Zelllinie verwendet wurde (Kok und Jin, 2006). Da das hier konstruierte
System allerdings auf HeLa Zellen basierte, wurde NS1 nicht als POI ausgewählt. Aufgrund
der Korrelation zwischen der IFN-β Produktion und der subzellulären Lokalisation von NS1
stellt dieses Protein dennoch ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung neuer
antiviraler Wirkstoffe dar. Der nucleo-cytoplasmatische Transport von NS1 könnte hierfür
beispielsweise in einem analogen, auf HEK293 Zellen basierenden Reportersystem
untersucht werden. Aus diesem Grund wurden hier auch die subzelluläre Lokalisation des
NS1-EGFP Fusionsproteins in HEK293 Zellen untersucht.
4.2.2.4 Das Nucleoprotein
Alle Viren mit einem Genom bestehend aus einzelsträngiger RNA mit negativer Polarität
besitzen ein RNA-bindendes Protein, das oft als NP bezeichnet wird (Tordo et al., 1992).
Gemeinsame Aufgabe dieser RNA bindenden Proteine ist die Funktion als Strukturproteine
bei der Verpackung des viralen Genoms. Das 498 AS und 56 kDa umfassende NP der
Influenza A Viren steuert zudem den Import der Nucleocapside in den Zellkern sowie deren
Export aus dem Zellkern. Des weiteren ist NP an der Umschaltung von der Synthese viraler
mRNAs zur Replikation der genomischen RNA beteiligt (Krug, 1989).
In NP aus Influenza A konnten zwei NLSs identifiziert werden, davon eine sogenannte
unkonventionelle NLS innerhalb der ersten 13 AS des N-Terminus und eine klassische
zweiteilige zwischen den Positionen 198 und 216 (Neumann et al., 1997; Wang et al., 1997;
Weber et al., 1998). Die N-terminale NLS trägt die Bezeichnung unkonventionell, da sie sich
mit nur zwei positiv geladenen Resten (7KR8) im Aufbau von den klassischen ein- oder
zweiteiligen NLSs unterscheidet. Der Kernimport der Nucleocapside hängt von beiden NLSs
ab, wobei die unkonventionelle NLS den größeren Beitrag leistet (Wu et al., 2007; Wu und
Pante, 2009). Diese Aussage wird durch die Experimente von Cros et al. bestärkt, deren
cytoplasmatische NP Variante nur durch Mutationen in der unkonventionellen NLS entstand
(Cros et al., 2005). Die klassische NLS musste hierfür nicht verändert werden. Während der
Infektion einer Zelle ist NP im frühen Stadium der Virusreplikation im Zellkern und im späten
Stadium, während der Assemblierung und Reifung neuer Viren, im Cytoplasma lokalisiert
(Wu und Pante, 2009). Wu und Pante konnten weiterhin zeigen, dass diese Umverteilung
durch selektive Exposition der NLSs erreicht wird. Bei Expression in uninfizierten Zellen ist
NP hingegen größtenteils im Zellkern lokalisiert (Cros et al., 2005), was auch in den
mikroskopischen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit beobachtet wurde (siehe unter
3.2.3.3.2).
- 76 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
Der Kernimport von NP stellt einen entscheidenden Prozess für die Infektion einer Zelle dar.
Dies wurde in verschiedenen Studien deutlich, in denen der nucleo-cytoplasmatische
Transport von NP gezielt inhibiert wurde. Cros et al. konnten zeigen, dass die Kompetition
zwischen NP und einem membranpermeablen Peptid mit der unkonventionelle NLS um die
Bindung an Importin α die virale Replikation reduziert (Cros et al., 2005). In einer anderen
Studie isolierten Kao et al. die niedermolekulare Substanz Nucleozin (Abb. 34), die den
Kernimport von NP verhindert (siehe unter 4.2.4.1.2) (Kao et al., 2010). Eine Nucleozinvermittelte Reduktion der Virusreplikation konnte sowohl in MDCK Zellen, als auch im
Mausmodell gezeigt werden. Hierbei erhöhte die Verabreichung von Nucleozin die
Überlebensrate von Mäusen, die mit letalen Dosen des aviären Influenza A/Vietnam/1194/04
(H5N1) Virus infiziert wurden auf 50 %. Sowohl die Effekte in MDCK Zellen, als auch im
Mausmodell wurden hierbei bereits mit nanomolaren Nucleozinkonzentrationen erreicht.
Allerdings vermittelt bereits ein einziger Aminosäureaustausch (Y289H) in NP Resistenz
gegenüber Nucleozin. Diese Mutation fand sich auch in natürlich vorkommenden
Virusisolaten, die hauptsächlich aus Schweinen stammten.
Da der Kernimport von NP einen interessanten Angriffspunkt für die Entwicklung neuer
Therapeutika gegen Influenza A Infektionen darstellt und das NP weiterhin alle Kriterien für
die Anwendung in dem zu konstruierenden Reportersystem erfüllte, wurde NP als POI
ausgewählt.
Abb. 34: Chemische Struktur von Nucleozin
Die Struktur wurde aus (Kao et al., 2010) entnommen.
4.2.2.4.1 Funktionalität der NP-TIP2 Fusion in E. coli
Für die Herstellung der NP-TIP2 Fusion wurde die TIP2 Sequenz wie auch im ersten
Teilprojekt der Arbeit über eine 4 AS lange „Linkersequenz“ (SGGA) mit dem C-Terminus
von NP verbunden. Aus den von Ye et al. durchgeführten Experimenten zur Analyse der
Struktur von NP ging hervor, dass NP nicht ausschließlich als Monomer vorliegt, sondern
auch oligomere Komplexe bildet. Die im Zuge dieser Arbeiten erstellte Kristallstruktur der NP
Variante aus Influenza A/WSN/1933 zeigte einen trimeren Komplex. Um eine Beeinflussung
der Interaktion von NP-TIP2 mit TetR durch die Oligomerisierung auszuschließen, wurden
- 77 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
Vorversuche in E. coli durchgeführt (siehe unter 3.2.4.5). Hierbei sollte neben der
grundsätzlichen Funktionalität der NP-TIP2 Fusion auch die Induktion von TetR bei
unterschiedlichen Expressionsniveaus von NP-TIP2 überprüft werden. Dadurch sollte ein
Einfluss der Konzentration von NP-TIP2 auf dessen Aktivität ausgeschlossen werden, was
beispielsweise durch eine verstärkte Oligomerisierung bei höherer Konzentration bedingt
sein könnte. Da in dem hier konstruierten Reportersystem Änderungen in der nukleären
Konzentration von NP-TIP2 detektiert werden sollten, war die konzentrationsabhängige
Induktion von TetR eine wichtige Voraussetzung für die Anwendung von NP-TIP2 in den
Reporterzelllinien. Aus den Experimenten in E. coli geht allerdings eindeutig hervor, dass die
Tet-kontrollierte Reportergenexpression bei zunehmender NP-TIP2 Expression kontinuierlich
ansteigt (siehe unter 3.2.4.5.2). Vergleicht man das hier gemessene Induktionsniveau mit
den Ergebnissen aus Goeke et al. (siehe unter 4.1.1), erreichte NP-TIP2 selbst bei
maximaler Expression in Gegenwart von 90 µM IPTG nicht das Niveau, das mit TrxA-TIP2
bereits durch dessen Basalexpression erreicht wurde. Ein möglicher Grund hierfür könnte
eine geringere Konzentration von „funktionalem“ NP-TIP2 im Vergleich zu TrxA-TIP2 sein.
Bei NP handelt es sich um ein natürlicherweise ausschließlich in Eukaryonten exprimiertes
Protein, weshalb bei heterologer Expression in E. coli die Menge an aktivem Protein durch
eine Reihe von Faktoren reduziert sein könnte. Hierzu zählen beispielsweise Abweichungen
im Codongebrauch, verminderte Faltungseffizienz, geringere Halbwertszeit oder die Bildung
von Proteinaggregaten (zusammengefasst in (Baneyx, 1999)). Bei TrxA handelt es sich
hingegen um ein endogenes Protein, das aufgrund seiner guten Löslichkeit in E. coli in auf
hohem Niveau exprimiert werden kann (LaVallie et al., 1993).
4.2.3 Konstruktion der Reporterzelllinien und deren Anwendung auf NP
Die Zelllinie HLF33 enthält bereits eine stabile Integration der geplanten Reportergenkassette sowie eine FRT Sequenz und stellte somit die ideale Ausgangszelllinie für die
Herstellung der Reporterzelllinien dar (siehe unter 3.2.4.1). Die Konstruktion der Reporterzellinien wurde deshalb mit der ungerichteten Integration der tTA Expressionskassette in die
Zelllinie HLF33 begonnen (siehe unter 3.2.4.2). Hieraus resultierten die ALF Zelllinien, von
denen die Zelllinie ALF2 aufgrund ihrer Regulationseigenschaften und Vitalität für die
weiteren Arbeiten verwendet wurde (siehe unter 3.2.4.3). Im nächsten Schritt erfolgte die
zielgerichtete Integration der NP-TIP2 Expressionskassette in die Zelllinie ALF2 über das
Flp-In™ System (siehe unter 3.2.4.6). Durch die ortsspezifische Integration wurde mit einer
gleichmäßigen Expression von NP-TIP2 und in Folge dessen auch mit einer vergleichbaren
Expression der Luciferase gerechnet. Die resultierenden ALF2-NP Zelllinien zeigten jedoch
wider Erwarten ein heterogenes Expressionsniveau der Luciferase. Diese Beobachtung
wurde auf Unterschiede in der Expression der NP-TIP2 Fusion in den einzelnen ALF2-NP
- 78 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
Zelllinien zurückgeführt. Dies könnte beispielsweise durch eine oder mehrere ungerichtete
Integrationsereignisse neben der ortsspezifischen, Flp-vermittelten Integration des Vektors
pEF1-HTLV/NP-TIP2 bedingt sein, was eine erhöhte Expression von NP-TIP2 zur Folge
hätte. Eine weitere Erklärung stellen Unterschiede in der Expression der tTA Variante dar. In
verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass sich das Expressionsniveau integrierter
Komponenten in mammalischen Zellen während der Kultivierung aufgrund epigenetischer
Veränderungen variieren kann (zusammengefasst in (Kaufman et al., 2008)). Somit könnte
sich die Expression der tTA Variante innerhalb der einzelnen ALF2-NP Klone während des
Selektionsprozesses für die Flp-vermittelte Integration reduziert haben. Allerdings wurde
mittels der Nachselektion der Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 mit Puromycin keine
Erhöhung der Luciferaseexpression in den einzelnen Zelllinien beobachtet. Aufgrund der
Translationskopplung der tTA Variante und der Puromycin-N-acetyl-Transferase wäre hierbei
im Falle schwankender tTA Expression ein Anstieg der Luciferaseexpression oder ein
vollständiges Absterben der Zelllinie zu erwarten gewesen. Da dies nicht zu beobachten war,
wird davon ausgegangen, dass die Heterogenität der ALF2-NP Zelllinien mit hoher
Wahrscheinlichkeit durch Variationen in der NP-TIP2 Expression zu begründen ist.
4.2.4 Experimentelle Ansätze zur Validierung der Reporterzelllinien
Um die Funktionalität der Reporterzelllinien zu testen, sollte die nukleäre Konzentration von
NP-TIP2 in den drei Zelllinien ALF2-NP19, -NP22 und -NP31 durch Nucleozin bzw. RNAInterferenz gezielt reduziert werden (siehe unter 3.2.5). Dies sollte im Falle eines
funktionsfähigen Reportersystems zu einem Anstieg der Luciferaseexpression führen.
4.2.4.1 Nucleozin
4.2.4.1.1 Konzentrationsabhängige Stimulation der Luciferaseexpression durch DMSO
Bei DMSO handelt es sich um eine in der Zellkultur häufig eingesetzte Substanz, die vor
allem für die Kryokonservierung und als Lösungsmittel für wasserunlösliche Substanzen
eingesetzt wird. Allerdings wurde für DMSO in verschiedenen Studien eine Reihe von
unspezifischen
Effekten
auf
Differenzierung,
Zellzyklus
und
Genexpression
in
unterschiedlichen Zelltypen beschrieben (Takase et al., 1992; Su und Waxman, 2004; Wang
et al., 2007). Weiterhin konnte in CHO Zellen auch eine konzentrationsabhängige Stimulation
der Expression heterolog exprimierter Gene durch DMSO gezeigt werden (Liu et al., 2001).
Der kontinuierliche Anstieg der Luciferaseexpression der Zelllinie ALF2 bei zunehmender
DMSO Konzentration (siehe 3.2.5.1.1) stimmte mit den Beobachtungen von Liu et al.
überein. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde bei allen Messungen im Rahmen der
Arbeiten mit Nucleozin eine konstante DMSO Konzentration von 0,5 % eingesetzt. Dies
entsprach auch dem experimentellen Vorgehen in Kao et al. (Kao et al., 2010).
- 79 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
4.2.4.1.2 Interpretation der Experimente mit Nucleozin
In den hier durchgeführten Experimenten konnte kein Anstieg der Luciferaseaktivität durch
die Behandlung der Reporterzelllinien mit Nucleozinkonzentrationen bis 30 µM festgestellt
werden. Aus der Abnahme der Gesamtproteinkonzentration der Zelllysate bei Nucleozinkonzentrationen größer 10 µM (ALF2, ALF2-NP22 und -NP31) bzw. 20 µM (ALF2-NP19)
geht hervor, dass Nucleozin bei höheren Konzentrationen Auswirkungen auf die Physiologie
der Zelle hat. Somit konnten nur im Konzentrationsbereich bis 10 µM zuverlässige Aussagen
getroffen werden. Der Grund für die höhere Toleranz der Zelllinie ALF2-NP19 gegenüber
Nucleozin wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht. Die Ergebnisse aus den
Luciferaseaktivitätsmessungen deckten sich mit den Erkenntnissen aus den mikroskopischen Analysen (siehe unter 3.2.5.1.3). Hier hatte Nucleozin im Konzentrationsbereich
von 1 - 10 µM keine Auswirkungen auf die subzelluläre Lokalisation der NP-EGFP Fusion.
Der Einfluss von Nucleozin auf die subzelluläre Lokalisation der NP Variante aus Influenza
A/WSN/1933 wurde auch in den Experimenten von Kao et al. untersucht. Allerdings wurde
hierbei mit virusinfizierten A54918 Zellen gearbeitet und die Detektion von NP erfolgte mit
immunologischen Methoden. Im Gegensatz zu den Beobachtungen in der vorliegenden
Arbeit wurde von Kao et al. bereits bei einer Nucleozinkonzentration von 1 µM eine
vollständige Inhibition des NP Kernimports festgestellt (Abb. 35). Ein direkter Vergleich der
Experimente ist allerdings aufgrund der Unterschiede in den Versuchsansätzen nicht
möglich. Möglicherweise war die Nucleozinkonzentration nicht ausreichend, um den
Kernimport der jeweils auf hohem Niveau exprimierten NP-TIP2 bzw. NP-EGFP Fusionen zu
inhibieren. Als weiterer Grund wären Zelltyp-spezifische Unterschiede zwischen A594 und
HeLa Zellen zu nennen. Kao et al. postulierten aus in silico Analysen drei potentielle
Bindestellen für Nucleozin an NP, die nicht in der Nähe des C-Terminus liegen. Aufgrund
dessen erscheint ein Einfluss von TIP2 bzw. EGFP auf die Interaktion zwischen Nucleozin
und NP eher unwahrscheinlich. Jedoch wäre eine Beeinträchtigung der Nucleozinvermittelten NP Aggregation durch die TIP2 bzw. EGFP Sequenz denkbar.
18
Bei A549 handelt es sich um humane Lungenepithelzellen (Giard et al., 1973).
- 80 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
A
w/o
B
1 µM Nucleozin
Abb. 35: Inhibition des NP Kernimports in virusinfizierten A549 Zellen durch Nucleozin
A594 Zellen wurden in Ab- (A) und Anwesenheit (B) von Nucleozin mit dem Influenza
A/WSN/1933 Virus infiziert. Drei Stunden nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und die
subzelluläre Lokalisation von NP wurde mit immunologischen Methoden untersucht. Um den
Zellkern anzufärben, wurden die Zellen mit DAPI behandelt.
Jeweils von links: Lokalisation von NP, Überlagerung der Lokalisation von NP mit der DAPI
Färbung.
A) NP befindet sich im frühen Stadium der Infektion im Zellkern.
B) In Gegenwart von Nucleozin akkumuliert NP im Cytoplasma.
Abbildung und Legende wurden aus (Kao et al., 2010) entnommen und modifiziert.
4.2.4.2 Validierung der Reporterzelllinien über RNA-Interferenz
Das sogenannte „gene silencing“ über RNA-Interferenz wurde in einer Vielzahl von Studien
genutzt, um die Expression einzelner Gene spezifisch zu reduzieren (zusammengefasst in
(Dykxhoorn et al., 2005) und (Dykxhoorn et al., 2003)). In mammalischen Zellen kann die
RNA-Interferenz hierbei über die Transfektion einer Zelle mit 21 Nukleotiden umfassenden,
doppelsträngigen siRNA Fragmenten induziert werden (Elbashir et al., 2001). Dieser Ansatz
wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet um die Expression von NP-TIP2 und somit
dessen nukleäre Konzentration zu reduzieren. Wie aus den Ergebnissen dieser Messung
(siehe unter 3.2.5.2) hervorgeht, hatten alle hier verwendeten siRNAs einen unspezifischen
Effekt auf die Luciferaseexpression der getesteten Zelllinien. Diese Beobachtungen sind
möglicherweise auf eine unspezifische Wirkung der siRNAs auf die Expression der einzelnen
Komponenten des Reportersystems zurückzuführen. Persengiev et al. konnten in HeLa
Zellen eine unspezifische Stimulation bzw. Repression der Expression von über 1.000
verschiedenen Genen durch Transfektion mit siRNA zeigen (Persengiev et al., 2004). Die
durch diese Gene codierten Proteine waren in verschiedenste zelluläre Prozesse wie
beispielsweise den Metabolismus, Signalübertragung und auch die Genexpression involviert.
Für ausgewählte Gene wurde zudem gezeigt, dass diese Effekte mit steigender siRNA
Konzentration zunehmen. Persengiev et al. untersuchten hierbei siRNA Konzentrationen bis
200 nM, ein Bereich in dem typischerweise in mammalischen Zellen gearbeitet wird. Für
einzelne Gene wurden allerdings bereits bei einer Konzentration von 25 nM Veränderungen
im Expressionsniveau beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurde mit einer Konzentration
von 50 nM gearbeitet, was der Hälfte der vom Hersteller des Transfektionsreagenz
- 81 -
4 Diskussion
_____________________________________________________________________________________________________
empfohlenen Konzentration entsprach. Aus den Ergebnissen von Persengiev et al. geht
hervor, dass bei dieser Konzentration durchaus unspezifische Effekte auftreten können.
Jedoch ist ein direkter Vergleich der beobachteten Effekte mit den Ergebnissen von
Persengiev et al. aufgrund abweichender Versuchsbedingungen bezüglich des Transfektionsreagenz und der verwendeten siRNA nicht möglich. Desweiteren wurde hier die
heterologe Expression und nicht wie bei Persengiev et al. die Expression endogener Gene
untersucht. Ein Einfluss des Transfektionsreagenz auf die Genexpression einer Zelle, wie sie
beispielsweise von Merkel et al. beschrieben wurde, konnte in der hier vorliegenden Arbeit
durch entsprechende Kontrollen ausgeschlossen werden (Merkel et al., 2011). Durch den
Vergleich der Luciferaseaktivität in den Transfektionen der spezifischen siRNA NP-1 und der
unspezifischen RNA uspRNA ergab sich trotz der angesprochenen, unspezifischen Effekte
ein klarer Hinweis auf die Funktionalität der Reporterzelllinien. Dies wurde aus dem
stärkeren Anstieg der Luciferaseexpression in den drei getesteten Reporterzelllinien im
Vergleich zur Ausgangszelllinie geschlossen (siehe unter 3.2.5.2). Der endgültige Beweis
konnte mit den hier verwendeten Methoden allerdings nicht erbracht werden. Hierzu wäre ein
Ansatz erforderlich, der eine Reduktion der nukleären Konzentration von NP-TIP2 ohne
unspezifische Nebeneffekte ermöglicht.
4.2.5 Möglichkeiten zur Optimierung des Reportersystems
Ein Nachteil des hier konstruierten Reportersystems liegt vermutlich in der hohen Expression
der tTA Variante sowie der NP-TIP2 Fusion. Das hohe Expressionsniveau der tTA Variante
wurde gewählt, um ein großes Messfenster zur erzielen. Dies erforderte jedoch auch die
Expression von NP-TIP2 auf entsprechendem Niveau um eine möglichst vollständige
Induktion der tTA Variante zu erreichen. Durch die hohe zelluläre Konzentration der
heterolog exprimierten Proteine kann zum Einen die natürliche Physiologie der Zelle in
einem nicht kalkulierbaren Maß beeinflusst werden und zum Anderen reduziert sich
hierdurch die Sensitivität des Reportersystems. Folglich wäre eine Optimierung des
Reportersystem durch Reduktion der Expressionsniveaus der POI-TIP2 Fusion bzw. der tTA
Variante denkbar. Dazu sind allerdings konditionale Genregulationssysteme erforderlich, die
auch bei niedriger Expression der tTA Variante ein großes Messfenster ermöglichen. Der
grundsätzliche
Ausgangspunkt
Aufbau
für
der
Reporterzelllinien
Optimierung
des
stellt
Systems
Komponenten dar.
- 82 -
hierbei
über
die
sicherlich
Verwendung
einen
guten
alternativer
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5 MATERIAL UND METHODEN
5.1 Materialien
5.1.1 Chemikalien
Im Folgenden sind die wichtigsten, in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien aufgeführt. Alle
hier nicht aufgelisteten Chemikalien wurden in p.A. Qualität von Merck (Darmstadt (DE)),
Roth (Karlsruhe (DE)) oder Sigma (München (DE)) bezogen.
Substanz
Bezugsquelle
Aceton
Roth, Karlsruhe (DE)
Adenin
Sigma, München (DE)
Agar
Oxoid, Heidelberg (DE)
Agarose
PeqLab, Erlangen (DE)
Ammoniumsulfat
Merck, Darmstadt (DE)
Ampicillin
Sigma, München (DE)
Arginin
Sigma, München (DE)
Bromphenolblau
Roth, Karlsruhe (DE)
Calciumchlorid
Merck, Darmstadt (DE)
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid)
Roth, Karlsruhe (DE)
Dinatriumhydrogenphosphat
Roth, Karlsruhe (DE)
D-Luziferin
P.J.K., Kleinblittersdorf (DE)
DMEM (“Dulbecco's Modified Eagle's Medium”),
4,5 g/l Glucose mit L-Glutamin
PAA, Cölbe (DE)
DMSO (Dimethylsulfoxid)
Roth, Karlsruhe (DE)
dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate)
PeqLab, Erlangen (DE)
Doxyzyklin (Dox)
Sigma, München (DE)
DTT (Dithiothreitol)
Roth, Karlsruhe (DE)
EDTA (Ethylendiamintetraacetat)
Roth, Karlsruhe (DE)
Ethanol, p.A.
Roth, Karlsruhe (DE)
Ethanol, technisch
Roth, Karlsruhe (DE)
Ethidiumbromid
Roth, Karlsruhe (DE)
FKS (Fötales Kälberserum), Fetal Bovine Serum Gold
PAA, Cölbe (DE)
Glucose
Roth, Karlsruhe (DE)
Glutaraldehyd, 8 % wässrige Lösung
Sigma, München (DE)
Glycerin
Roth, Karlsruhe (DE)
Hefeextrakt
Oxoid, Heidelberg (DE)
Heringssperma-DNA
Sigma, München (DE)
Histidin
Sigma, München (DE)
Höchst 33342
Sigma, München (DE)
Hygromycin B
Invitrogen, Karlsruhe (DE)
- 83 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid)
Roth, Karlsruhe (DE)
Isoleucin
Sigma, München (DE)
Isopropanol
Roth, Karlsruhe (DE)
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat
Merck, Darmstadt (DE)
Kaliumhexacyanoferrat(III)
Merck, Darmstadt (DE)
Kanamycin
Sigma, München (DE)
Leucin
Sigma, München (DE)
™
Lipofectamine Transfektionsreagenz
Invitrogen, Karlsruhe (DE)
Lithiumacetat
Roth, Karlsruhe (DE)
Lysin
Sigma, München (DE)
®
METAFECTENE SI Transfektionreagenz
Biontex, Martinsried (DE)
Methionin
Sigma, München (DE)
Natriumacetat
Merck, Darmstadt (DE)
Natriumcarbonat
Merck, Darmstadt (DE)
Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe (DE)
Natriumdihydrogenphosphat
Roth, Karlsruhe (DE)
Natronlauge
Roth, Karlsruhe (DE)
®
NONIDET NP40
Sigma, München (DE)
Nucleozin
Sigma, München (DE)
ONPG (o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid)
Sigma, München (DE)
®
OPTI-MEM
Invitrogen, Karlsruhe (DE)
PEG 3350 (Polyethylenglykol 3350)
Sigma, München (DE)
Penicillin/Streptomycin 100x
PAA, Cölbe (DE)
Pepton aus Fleisch
Roth, Karlsruhe (DE)
Phenylalanin
Sigma, München (DE)
Puromycin
Cayla-InvivoGen, Toulouse (FR)
Salzsäure
Roth, Karlsruhe (DE)
Silikonpaste, Baysilone mittelviskos
Bayer, Leverkusen (DE)
Stickstoff
Linde, München (DE)
Trichlormethan (Chloroform)
Roth, Karlsruhe (DE)
Tris (Tris (hydroxymethyl)-aminomethan)
Roth, Karlsruhe (DE)
Trypsin/EDTA (0,05 %)/(0,02 %)
PAA, Cölbe (DE)
Trypton (tryptisch verdautes Casein)
Oxoid, Heidelberg (DE)
Tryptophan
Merck, Darmstadt (DE)
Tyrosin
Merck, Darmstadt (DE)
Uracil
Sigma, München (DE)
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galaktopyranosid)
PeqLab, Erlangen (DE)
Xylencyanol
Roth, Karlsruhe (DE)
Yeast Nitrogen Base ohne AS und Ammoniumsulfat
BD, Sparks, (US)
β-Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt (DE)
- 84 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.2 Hilfsmittel und Verbrauchsgüter
Bezeichnung
Bezugsquelle
24-Napfplatte
Nalge Nunc, Rochester (US)
8-Kanalpipette, „Research pro“
Eppendorf, Hamburg (DE)
96-, 48-, 12-, 6-Napfplatten
Greiner, Nürtingen (DE)
96-Napf-Flachbodenplatte
Greiner, Nürtingen (DE)
96-Tiefnapfplatte (1,2 und 2,2 ml)
PeqLab, Erlangen (DE)
Abdeckfolie, wasserdicht und atmungsaktiv, „Breathseal“
für 96-Napfplatte
Greiner, Nürtingen (DE)
Becher, Glas (50, 250 ml)
Schott Duran, Jena (DE)
Becher, Kunststoff (0,5; 1,0 und 2;5 l)
Brand, Wertheim (DE)
Kryoröhrchen, „Cryo tube
™“
Nalge Nunc, Rochester (US)
Dispenser, elektrisch
Eppendorf, Hamburg (DE)
Einmalpipetten, Kunststoff (5, 10 und 25 ml)
Greiner, Nürtingen (DE)
Einmalspritzen (25, 50 ml)
BD, Franklin Lakes (US)
Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5 und 2 ml)
Eppendorf, Hamburg (DE)
Filterspitzen, für die Zellkultur
Greiner, Nürtingen (DE)
Gewebekulturschalen, Kunststoff (rund  10 und 15 cm)
TPP, Trasadingen (CH)
Glaspipetten (5, 10, 25 ml)
Brand, Wertheim (DE)
Halbmikroküvette, Kunststoff (10 x 10 x 45 mm)
Greiner, Nürtingen (DE)
Küvette für Fluorimeter, Acryl (10 x 10 x 48 mm)
Sarstedt, Nümbrecht (DE)
LIA 96-Napfplatte
Greiner, Nürtingen (DE)
Macro-Pipettierhelfer
Brand, Wertheim (DE)
Magnetrührstäbe (verschiedene Größen)
VWR, Darmstadt (DE)
Messzylinder, Kunststoff (50, 250, 1000 und 2000 ml)
Brand, Wertheim (DE)
™
Kryocontainer, “Nalgene Cryo 1 °C”
Nalge Nunc, Rochester (US)
Noppenfolie für 96-Napfplatten
PeqLab, Erlangen (DE)
PCR-Reaktionsgefäß (0,2 ml)
PeqLab, Erlangen (DE)
Petrischale, Kunststoff (rund  100 mm)
Greiner, Nürtingen (DE)
Pipettierhelfer elektrisch, „PIPETBOY acu“
Integra, Fernwald (DE)
Mikroliterpipetten, „Pipetman“ (20, 200 und 1000 µl)
Gilson, Limburg-Offheim (DE)
Pipettenspitzen, Kunststoff (200 und 1000 µl)
Greiner, Nürtingen (DE)
Polyethylenröhrchen (PET-Röhrchen), (15 und 50 ml)
Greiner, Nürtingen (DE)
Reagenzglas
Pall, Port Washington (US)
Schikanekolben (100 und 300 ml)
Schott Duran, Jena (DE)
Schraubflaschen (50, 250, 500 und 1000 ml)
Schott Duran, Jena (DE)
Sterilfilter, „Filtropur S 0,2“ (0,2 µm)
Sarstedt, Nümbrecht (DE)
Tablettenmagnetrührstab
VWR, Darmstadt (DE)
- 85 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.3 Verwendete Geräte
Gerät
Bezugsquelle
Autoklav, “Systec 5075 EL”
Systec, Wettenberg (DE)
Brutschrank, 5042 und BBD 6220
Heraeus Christ, Osterode (DE)
Bunsenbrenner
Bochem, Weilburg (DE)
Eismaschine, „Ziegra“
Kurt Hilbinger, Hessdorf (DE)
Elektrophoreseapparaturen, horizontal für Agarose-Gele
Eigenbau Universität Erlangen (DE)
Feinwaage, “Sartorius Analytic”
Sartorius, Göttingen (DE)
Fluoreszenzmikroskop, „Zeiss Axioscope A1“
Zeiss, Oberkochen, (DE)
Geldokumentation, „Video-Geldoku-System Mod. 215“
PeqLab, Erlangen (DE)
Heizblock, „Thermomixer comfort“
Eppendorf, Hamburg (DE)
Inkubator für 96-Napfplatten, TH15
EB Labortechnik, Hechingen (DE)
Konfokales Fluoreszenzmikroskop, SP5
Leica Microsystems, Wetzlar (DE)
Konstanträume (4 °C, 28 °C und 37 °C)
Zimmermann, Nürnberg (DE)
Kühlschrank mit Gefrierfächern (+4 °C/-20 °C)
Liebherr, Schweiz (DE)
Kulturschüttler, G10
New Brunswick, Edison (US)
Magnetrührer/Heizrührer
IKA-Labortechnik, Staufen (DE)
Mikrowelle
AEG, Nürnberg (DE)
pH-Meter, „766 Calimatic“
Knick, Berlin (DE)
Plattenlesegerät, „TECAN Infinite F200 Pro“
TECAN, Männedorf (CH)
Plattenluminometer, „Orion II“
Berthold, Pforzheim (DE)
Reaktionsgefäßeschüttler
Eppendorf, Hamburg (DE)
Rollinkubator
Eigenbau Universität Erlangen (DE)
Spannungsnetzgerät, TN 300-120
Heinzinger, Rosenheim (DE)
Spektralfluorimeter, “Fluorolog 3”
HORIBA Jobin Yvon, Longjumeau (FR)
®
Spektralphotometer, „NanoDrop ND-1000“
PeqLab, Erlangen (DE)
Spektralphotometer,” Ultrospec 2100”
Amersham, Amersham (UK)
Sterilbank, “Clan LAF VFR 1206”
Clan LAF, Humlebaek (DK)
Stickstofftank
Apollo Messer, Griesheim (DE)
Thermocycler „Primus 96“
PeqLab, Erlangen (DE)
Tiefkühltruhe (-80 °C)
New Brunswick, Edison (US)
UV Schirm 254 nm und 366 nm
Vetter, Wiesloch (DE)
Vortexer, VF2
IKA Labortechnik, Staufen (DE)
Waage, „Sartorius universal“
Sartorius, Göttingen (DE)
Wasserbad, 5M und „Eco-PA/ÜK“
Julabo, Seelbach (DE)
Wasservollentsalzungsanlage
Millipore, Billerica (US)
Zellzähler, Z2
Beckman Coulter, Brea (US)
Zentrifugen, “Biofuge A (pico, fresco, primo R),
Megafuge 1.0R”
Heraeus Christ, Osterode (DE)
- 86 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.4 Kommerziell erhältliche Systeme
System
®
NucleoSpin Extract II
Bezugsquelle
Anwendung
Macherey-Nagel, Düren (DE)
DNA-Elution aus Agarosegelen,
Reinigung von PCR-Produkten
®
NucleoSpin Plasmid
®
QIAamp DNA Mini Kit
Macherey-Nagel, Düren (DE)
Plasmidpräparation
Quiagen, Hilden (DE)
Präparation chromosomaler DNA aus
HeLa Zellen
®
Nucleobond Xtra Midi
®
Roti -Quant
Macherey-Nagel, Düren (DE)
Plasmidpräparation
Roth, Karlsruhe (DE)
Proteinquantifizierung nach Bradford
5.1.5 Enzyme
Enzym
Bezugsquelle
DNA-Ligase T4
NEB, Frankfurt a. M. (DE)
DNA-Polymerase Phusion
®
NEB, Frankfurt a. M. (DE)
DNA-Polymerase rTaq
NEB, Frankfurt a. M. (DE)
Phosphatase Antarctic
NEB, Frankfurt a. M. (DE)
Restriktionsendonucleasen
NEB, Frankfurt a. M. (DE)
RNAse A (Ribonuclease A)
Serva, Heidelberg (DE)
5.1.6 DNA-Größenstandard
peqGOLD® DNA-Leiter (PeqLab, Erlangen (DE)) mit den Bandengrößen in bp:
10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.500, 3.000, 2.500, 2.000, 1.500, 1.200,1.031, 900,
800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100
5.1.7 Verwendete Stämme und Zelllinien
5.1.7.1 Verwendete E. coli Stämme
Stamm
DH5α
Genetische Marker
Referenz
recA1, endA1, gyrA96, thi, relA1,
hsdR17(rK ,
+
mK ),
(Hanahan, 1983)
supE44, Φ80dlacZΔ, ΔlacU169
q
RB791
IN[rrnD-rrnE]1, lacI L8
(Brent et al., 1981)
WH207(λtet50)
galK, rpsL, thi, ΔlacX74, recA13, Tn10,
+
(Wissmann et al.,
+
+
+
tetA-lacZ-Transkriptionsfusion, bet , gam , cIII , cI , lacZ
- 87 -
+
1991)
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.7.2 Verwendeter S. cerevisiae Stamm
Name
Genotyp
Referenz
K699
MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3, 112, his3-11, 15,
(Schwob et al., 1994)
+
ura3, GAL, psi
5.1.7.3 Verwendete Zelllinien
Stamm
Stabil in das Genom integrierte
Komponenten, Selektionsmarker
Referenz
HeLa
ATCC*
HEK293
ATCC
HLF33
(Berens et al., 2006)
HeLa, zusätzlich:
pFRT/lacZeo (Invitrogen), pUHC13-2,
pWHE260 (Gossen und Bujard, 1992),
Zeocin
ALFX (X= 2, 4, 6, 7, 12, 39)
™R
R
, Neo
HLF33, zusätzlich:
pIPRBF, Puro
Diese Arbeit
R
ALF2-NPX (X = 1, 2, 4, 5,
ALF2, zusätzlich:
6, 7, 8, 10, 15, 16, 17, 18,
pEF1-HTLV/NP-TIP, Hyg
Diese Arbeit
R
19, 20, 21, 22, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 34)
*ATCC: American Type Culture Collection, Rockville (US)
5.1.8 Oligonukleotide und Plasmide
5.1.8.1 Oligonukleotide
Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Eurofins MWG (Ebersberg (DE))
bezogen und in deionisiertem Wasser zu einer Konzentration von 100 pmol/µl gelöst.
5.1.8.1.1 Oligonukleotide für die Konstruktion von Plasmiden
Eingeführte Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen.
Name
Sequenz von 5‘ nach 3‘
Konstruktion von
CMVForward
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
pEF1-HTLV/NP-TIP2
EF1a-HTLV-fwd
ATGATGAGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCG
pEF1-HTLV/FRT
EF1a-HTLV-rev
ATGATGGCTAGCTAGGCGCCGGTCACAGCTTG
pEF1-HTLV/FRT
IRESPseq
GAGAGGGAGTACTCACCCC
pEF1-HTLV/NP-TIP2
M1-EcoRI-rev
CCGTCGACTGCAGAATTCCCTTGAATCGTTGCATCTGC
pM1-EGFP,
pM1Mut-EGFP
- 88 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
M1-GT-fwd
GAGCAAATGGCTGGGTCAATTGAACAGGCAGCGGAGG
pM1-EGFP,
pM1Mut-EGFP
M1-GT-rev
CCTCCGCTGCCTGTTCAATTGACCCAGCCATTTGCTC
pM1-EGFP,
pM1Mut-EGFP
M1-Mut-fwd
GCCGTCAAACTATACAGCAACCTGAACAGCGAGATAACA
pM1Mut-EGFP
TTCTATGGAGC
M1-Mut-rev
TAGAATGTTATCTCGCTGTTCAGGTTGCTGTATAGTTTGA
pM1Mut-EGFP
CGGCTTTATC
M1-XhoI-fwd
ACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGAGTCTTCTAACCGA
GG
pM1-EGFP,
pM1Mut-EGFP
NP-EcoRI-rev
TCGACTGCAGAATTCCATTGTCGTACTCCTCTGC
pNP-EGFP,
pNPMut-EGFP
NP-MfeI-rev
CATCATCAATTGTTAATTGTCGTACTCCTCTG
pWHE2101/NP
NPMut-fwd1
CCACCATGGCGACCAAAGGCACCGCCGCCTCTTACGAA
pNPMut-EGFP
CAGATGGAGAC
NP-Mut-fwd2
GACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCGACCAAAG
pNPMut-EGFP
NP-Nhe-fwd
GGCCTAGCTAGCCGCCACCATGGCGACCAAAGGC
pIP/NP-TIP2
NP-P5-1
GCTCTGGCGGCCAGCACGCTGTCGTCGGCGCCGCCGC
pIP/NP-TIP2
TATTGTCGTACTCCTCTGCATTG
NP-P5-2
GGATCCGAATTCTTACCAGTGCCACATCCACATTCTGGC
pIP/NP-TIP2
TCTGGCGGCCAGCAC
NPP5-MfeI-rev
CATCATCAATTGTTACCAGTGCCACATCCAC
pWHE2101/NP-TIP2
NP-XhoI-fwd
GACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGCGACCAAAGGCA
pNP-EGFP
CC
NP-XhoI-fwd2
CTCTAGCTCGAGAAGCTTAACAAAAATTAGGAATTAATG
GCGACCAAAGGCACC
NS1-EcoRI-rev
NS1Mut-fwd
ACCGTCGACTGCAGAATTCCAACTTCTGACCTAATTGTT
pWHE2101/NP,
pWHE2101/NP-TIP2
CC
pNS4-EGFP,
pNS4Mut-EGFP
TAATATTACTAGCCGCCTTCACCGCTGCCGGGACAATTG
pNS4Mut-EGFP
TTGGCGAAATT
NS1Mut-rev
CAATTGTCCCGGCAGCGGTGAAGGCGGCTAGTAATATT
pNS4Mut-EGFP
AGAGTCTCCAGC
NS1-XhoI-fwd
CCGGACTCAGATCTCGAGCGCCACCATGGATCCAAACA
CTGTGTC
NS3ss-fwd
CACTACCCGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAATGCAG
TTGGGGTCCTC
NS3ss-rev
R2P5_rev1
TTGACATCCTCATCAGTATGTCCGGGTAGTGAGGGCAG
pNS4-EGFP,
pNS4Mut-EGFP
pNS4-EGFP,
pNS4Mut-EGFP
TGGTGAAATTTC
pNS4-EGFP,
pNS4Mut-EGFP
CACCCGAACCAACCTTTCTCTTTTTCTTTGGCTTGTACAG
pWHE705/C2-TIP2
CTCGTCCATG
- 89 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
R2P5_rev2
GCCCTAGCCGCCAGAACCGAATCATCAGCTCCACCCGA
pWHE705/C2-TIP2
ACCAACCTTTCT
R2P5_rev3
CGATAAGCTTACCAATGCCACATCCACATCCTCGCCCTA
pWHE705/C2-TIP2
GCCGCCAGAAC
R3-fwd1_2
AAGCATCGGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGT
pWHE705/C3
GAGCAAGGGCGAG
R3-fwd2_2
AATTCGAGTCCCCGAAGAAAAAGCGGAAAGTTGAAGCA
pWHE705/C3
TCGGGCCTGGTG
R3-fwd3
CTGGTGGAAAACGGACGGCAGACGGATCCGAATTCGAG
pWHE705/C3
TCCCCGAAGAAA
R3-fwd4
CTCTAGAACTAGTTACACAATGGCTAGCATGACTGGTGG
pWHE705/C3
AAAACGGACGG
R4-fwd1
AAGCATCTGGTTTGGTTCCAAGAGGTTCTCATATGGTGA
pWHE705/C4
GCAAGGGCGAG
R4-fwd2
CCAAAGAAAAAGAGAAAGGTTGAAGCATCTGGTTTGGTT
CCAA
pWHE705/C4,
pWHE705/C7,
pWHE705/C7-TIP2
R4-fwd3
TCTAGAACTAGTTACACAATGCCAAAGAAAAAGAGAAAG
GTTG
pWHE705/C4,
pWHE705/C7,
pWHE705/C7-TIP2
R5delta_rev
ATCGATAAGCTTTTATTATGCGGTACCAGAACC
pWHE705/C5,
pWHE705/C7
R5fwd1
R5fwd2
AGCATCTGGTTTGGTTCCAAGAGGTTCACATATGGCAAC
pWHE705/C5,
TAGCGGCATGG
pWHE705/C6
GAAAGTCCTAAGAAGAAAAGGGCTGTCGAAGCATCTGG
pWHE705/C5
TTTGGTTCCAAG
R5fwd3
TAAAAGAACTGCCGATGGTTCTGAATTTGAAAGTCCTAA
pWHE705/C5
GAAGAAAAGG
R5fwd4
TCTAGAACTAGTTACACAATGTCTAAAAGAACTGCCGAT
pWHE705/C5
GGTTC
R6fwd1
AGCTGCTAAAAGAGTTAAATTGGATGAAGCATCTGGTTT
pWHE705/C6
GGTTCCAAG
R6fwd2
TCTAGAACTAGTTACACAATGTCTCCAGCTGCTAAAAGA
pWHE705/C6
GTTAAATTGG
R7fwd1
R7P5_rev1
AAGCATCTGGTTTGGTTCCAAGAGGTTCTCATATGGTTA
pWHE705/C7,
GTAAAGGAGAAGAAAA
pWHE705/C7-TIP2
CAGCCAAAACAGAATCATCAGCACCACCAGATGCGGTA
pWHE705/C7-TIP2
CCAGAACCTTTG
R7P5_rev2
CCAATGCCACATCCACATTCTAGCTCTAGCAGCCAAAAC
AGAATCATCAG
- 90 -
pWHE705/C7-TIP2
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
R7P5_rev3
ATCGATAAGCTTACCAATGCCACATCCACATTC
pWHE705/C7-TIP2
RBFFF-rev
CATCATGAATTCTTACCCGGGGAGCATGTC
pIPRBF
RB-fwd
ATGATGGAATTCCGCCACCATGTCTAGATTAGATAAAAG
pIPRBF
Red_delta_rev
ATCGATAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG
pWHE705/C1,
pWHE705/C3,
pWHE705/C4
Red_NLS_fwd
YFP_NLS2_fwd2
AAAGAAAAAGAGAAAGGTTGGTGTGAGCAAGGGCGAGG
AG
pWHE705/C1,
ATGCACTAGTTACACAATGCCAAAGAAAAAGAGAAAGGT
pWHE705/C2-TIP2
pWHE705/C2-TIP2
TGG
5.1.8.1.2 Oligonukleotide für Sequenzierungen
Name
Sequenz von 5‘ nach 3‘
190PU
AATGTAAGCGTGACATAAC
CMVForward
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
EF1seq1
GTTATTGTCTCATGAGCGG
HK64
ACGGGCCCTCTAGACTCGAG
IRESPseq
GAGAGGGAGTACTCACCCC
M1seq1
GTATGGGCCTCATATACAAC
M1seq2
CCTGATTAGTGGATTGGTGG
mCherryseq1
CGTGAAGCACCCCGCC
mCherryseq2
GAAGCTGAAGGACGGCG
mCherryseq3
GCCCTCGATCTCGAACTC
Met25_seq1
TTCGTGTAATACAGGGTCG
NPseq1
TATGAAAGAATGTGCAACATTC
NPseq2
ATATGAGTGCAGACCGTGC
Npseq3
GATGAGTTCTCTCCTCCAC
Npseq4
AATAGACCCTTTCAGACTGC
Npseq5
TCAGAATGATCAAACGTGGG
NS1seq1
CATGGCCTCTGTACCTGC
Ns1seq2
CAATTGTCCCCTCTTCGG
Ns1seq3
GTAGAGTTTCAGAGACTCG
pDUALseq4
CATCGCGATGGAGCAAAAG
pDUALseq5
GGCCTTGAATTGATCATATGC
Red_delta_rev
ATCGATAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG
Red_NLS_fwd
AAAGAAAAAGAGAAAGGTTGGTGTGAGCAAGGGCGAGGAG
TetRseq1
AAGGTTTTTCACTAGAGAAC
- 91 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.8.1.3 siRNA
siRNA wurde von der Firma Eurofins MWG (Ebersberg (DE)) bezogen und in 1x siMax
Puffer (MWG, hergestellt aus einem 5x Puffer mit RNAse freiem, sterilem Wasser) zu einer
Konzentration von 100 pmol/µl gelöst.
Name
Sequenz von 5‘ nach 3‘
siNP-1
UCUGGCGCCAAGCUAAUAA
siNP-2
CAUGGAGACUAUGGAAUCA
uspRNA
AGGUAGUGUAAUCGCCUUG
5.1.8.2 Plasmide
Im Falle von Plasmiden, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden, sind nur bei den
Ausgangskonstrukten alle relevanten genetischen Elemente angegeben. Bei abgeleiteten
Konstrukten werden nur die Änderungen im Vergleich zum jeweiligen Ausgangskonstrukt
angeführt.
5.1.8.2.1 Plasmide, die aus anderen Arbeiten verwendet wurden
Plasmid
Charakteristika
Referenz
pcDNA-NS1
Gen für NS1 aus Influenza A/WSN/1933 unter
Keine Referenz bekannt, zur
transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors,
Verfügung gestellt von:
R
Neo unter transkriptioneller Kontrolle des SV40
Dr. Ervin Fodor,
Promotors,
University of Oxford,
pBR322 Replikationsursprung, Amp
pE1411
R
Humanadaptiertes Gen für mCherry unter
Oxford (UK)
(Danke, 2010)
transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors,
pUC Replikationsursprung,
AmpR, Zeocin™R
pEGFP-N1
Vektor zur Herstellung von EGFP
Clontech, Mountain View
Translationsfusionen am C-Terminus eines
(US)
Proteins, Gen für EGFP unter transkriptioneller
Kontrolle des CMVIE Promotors,
pUC Replikationsursprung, KanR/NeoR unter
transkriptioneller Kontrolle des SV40 sowie eines
prokaryontischen Promotors
pHH-M
Gen für M1 aus Influenza A/FPV/Rostock unter
transkriptioneller Kontrolle eines humanen RNAPolymerase I Promotors, AmpR
- 92 -
(Thaa et al., 2009)
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
pIRESPuro2
Integrationsvektor für die Zellkultur,
Clontech, Mountain View
Expressionskassette unter transkriptioneller
R
(US)
R
Kontrolle des CMVIE Promotors, Amp , Puro
pOG44
Expression einer temperatursensitiven
Flp-Rekombinase, Amp
pPolI-A/NP/WSN/33
Invitrogen, Karlsruhe (DE)
R
Gen für NP aus Influenza A/WSN/1933 unter
(Fodor et al., 1999)
transkriptioneller Kontrolle eines RNAPolymerase I Promotors, AmpR
pSB2K3-BBaE2060
Hefeadaptiertes Gen für mCherry, KanR
(Nevozhay et al., 2009)
pTripTTGTK
Lentiviraler Vektor, hEF1-HTLV Promotor, AmpR
(Flurer, 2010)
R
pWH1200
p15A Replikationsursprung, Kan
pWH2101
Gen für TrxA-W-TIP unter transkriptioneller
(Altschmied et al., 1988)
(Klotzsche, 2005)
Kontrolle des tac Promotors,
pMB1 Replikationsursprung, AmpR
pWH527(B)
lacIq, Expression von tetR(B)auf niedrigem
Niveau, p15A Replikationsursprung, Kan
(Klotzsche et al., 2005)
R
pWH806
pMB1 Replikationsursprung, AmpR
(Wissmann et al., 1991)
pWHE120(B)
Gen für tTA (TetR(B) wt-FFF) unter
(Krueger et al., 2003)
transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors,
pUC Replikationsursprung, AmpR
pWHE705
Gen für mYFP(NLS)2-W-TIP unter
(Stöckle, 2008)
transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,
p425Met25 Derivat
pWHE711-WT
Gen für tTS (TetR(B) wt-Ssn6) unter
(Stöckle, 2008)
transkriptioneller Kontrolle des cyc1 Promotors,
gfp+ unter transkriptioneller Kontrolle des adh1Promotors aus S. pombe, TRE mit 7 x tetO2
stromaufwärts des adh1 Promotors, p416CYC1
Derivat
pcDNA5/FRT
Integrationsvektor für das Flp-In™ System,
Invitrogen, Karlsruhe (DE)
Expressionskassette unter transkriptioneller
Kontrolle des CMVIE Promotors, FRT, pUC
Replikationsursprung, HygR, AmpR
p416CYC1
Expressionskassette unter Kontrolle eines
(Mumberg et al., 1995)
gekürzten cyc1 Promotors aus S. cerevisiae,
ARSH4/CEN6 und pMB1 Replikationsursprung,
URA3, AmpR
p425Met25
Expressionskassette unter Kontrolle des met25
Promotors aus S. cerevisiae, 2µ und pMB1
Replikationsursprung, LEU2, AmpR
- 93 -
(Funk et al., 2002)
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.8.2.2 Plasmide, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurden
Plasmid
Charakteristika
pEF1-HTLV/FRT
Abgeleitet von pcDNA5/FRT durch Austausch des CMVIE Promotors gegen den
hEF1-HTLV Promotor
pEF1-HTLV/NP-TIP2
Gen für NP mit C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des
hEF1-HTLV Promotors, pEF1-HTLV/FRT Derivat
pIP/NP-TIP2
Gen für NP mit C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des
CMVIE Promotors, pIRESPuro2 Derivat
pIPRBF
Gen für tTA (TetR-FFF) unter transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors,
pIRESPuro2 Derivat
pM1-EGFP
Gen für Translationsfusion aus EGFP und M1 unter transkriptioneller Kontrolle
des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat
pM1Mut-EGFP
Gen für Translationsfusion aus EGFP und einer M1 Mutante mit den
Aminosäureaustauschen 101RKLKR105 nach 101SNLNS105 (M1Mut) unter
transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat
pNP-EGFP
Gen für Translationsfusion aus EGFP und NP unter transkriptioneller Kontrolle
des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat
pNPMut-EGFP
Gen für Translationsfusion aus EGFP und einer NP Mutante mit den
Aminosäureaustauschen 7KR8 gegen 7AA8 (NPMut) unter transkriptioneller
Kontrolle des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat
pNS4-EGFP
Gen für Translationsfusion aus EGFP und NS4 unter transkriptioneller Kontrolle
des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat
pNS4Mut-EGFP
Gen für Translationsfusion aus EGFP und einer NS4 Mutante mit den
Aminosäureaustauschen R148A, E152A und E153A (NS4Mut) unter
transkriptioneller Kontrolle des CMVIE Promotors, pEGFP-N1 Derivat
pWH2101/NP
Gen für NP unter transkriptioneller Kontrolle des tac Promotors,
pWH2101 Derivat
pWH2101/NP-TIP2
Gen für das NP-Protein mit C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle
des tac Promotors, pWH2101 Derivat
pWHE705/C1
Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 1: Gen für mCherry
(mcherry(ha)) mit N-terminaler SV40 NLS unter transkriptioneller Kontrolle des
met25 Promotors, pWHE705 Derivat
pWHE705/C2-TIP2
Expressionskassette für eine TIP2 Fusion der Trägerprotein-Variante 2: Gen für
mCherry (mcherry(ha)) mit N- und C-terminaler SV40 NLS, sowie C-terminaler
Fusion von TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,
pWHE705 Derivat
pWHE705/C3
Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 3: Gen für mCherry
(mcherry(ha)) mit N- terminaler BP SV40 NLS und 10 AS langer
„Linkersequenz“ unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,
pWHE705 Derivat
- 94 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
pWHE705/C4
Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 4: Gen für mCherry
(mcherry(ha)) mit N- terminaler SV40 NLS und 10 AS langer „Linkersequenz“
unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors, pWHE705 Derivat
pWHE705/C5
Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 5: Gen für mCherry
(mcherry(ya)) mit N- terminaler BP SV40 A6 NLS und 10 AS langer
„Linkersequenz“ unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors,
pWHE705 Derivat
pWHE705/C6
Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 6: Gen für mCherry
(mcherry(ya)) mit N- terminaler c-Myc NLS und 10 AS langer „Linkersequenz“
unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors, pWHE705 Derivat
pWHE705/C7
Expressionskassette für die Trägerprotein-Variante 7: Gen für mCherry
(mcherry(ya)) mit N- terminaler SV 40 NLS und 10 AS langer „Linkersequenz“
unter transkriptioneller Kontrolle des met25 Promotors, pWHE705 Derivat
pWHE705/C7-TIP2
Expressionskassette für die TIP2 Fusion der Trägerprotein-Variante 7: Gen für
mCherry (mcherry(ya)) mit N- terminaler SV 40 NLS und 10 AS langer
„Linkersequenz“ sowie C-terminalem TIP2 unter transkriptioneller Kontrolle des
met25 Promotors, pWHE705 Derivat
Herstellung der Plasmide
Alle Klonierungen erfolgten, wenn nicht anders vermerkt, mit dem E. coli Stamm DH5α.
pWHE705/C1: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N-terminaler SV40 NLS wurde über
eine zweistufige PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte mit dem Plasmid pE1411 als
Matrize und den Oligonukleotiden Red_NLS_fwd und Red_delta_rev. Das hieraus
resultierende, 742 bp lange Amplifikat wurde in der zweiten Stufe N-terminal mit dem
Oligonukleotid YFP_NLS2_fwd2 verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente hierbei erneut
Red_delta_rev. Das 763 bp lange Produkt wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den
gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen,
wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide mCherryseq1, mCherryseq2,
mCherryseq3, Red_delta_rev und Red_NLS_fwd sequenziert.
pWHE705/C2-TIP2: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N- und C-terminaler SV40 NLS
sowie einer für TIP2 kodierenden Sequenz am C-Terminus wurde in einer dreistufigen PCR
hergestellt. Die erste Stufe erfolgte mit dem Plasmid pE1411 als Matrize und den
Oligonukleotiden Red_NLS_fwd und R2P5_rev. Das hieraus resultierende, 758 bp lange
Amplifikat wurde in der zweiten Stufe N- und C-terminal mit den Oligonukleotiden
YFP_NLS2_fwd2 und R2P5_rev2 verlängert. In der dritten Stufe wurde das 810 bp lange
Produkt der zweiten Stufe am C-Terminus mit dem Oligonukleotid R2P5_rev3 verlängert, als
- 95 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
zweites Oligonukleotid diente erneut YFP_NLS2_fwd2. Das in der dritten Stufe erzeugte,
843 bp lange Produkt wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen
geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige
Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids 190PU sequenziert.
pWHE705/C3: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N-terminaler BP SV40 NLS und
10 AS langer „Linkersequenz“ wurde in einer vierstufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe
erfolgte mit dem Plasmid pE1411 als Matrize und den Oligonukleotiden R3fwd1_2 und
Red_delta_rev. Das hieraus resultierende, 755 bp lange Amplifikat wurde in der zweiten,
dritten und vierten Stufe sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R3fwd2_2,
R3-fwd3 und R3-fwd4 verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente hierzu bei allen
Reaktionen Red_delta_rev. Die Amplifikate der zweiten, dritten und vierten Stufe umfassten
788, 818 und 850 bp. Das Produkt der vierten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert
und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu
überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids 190PU sequenziert.
pWHE705/C4: Das Gen für mCherry (mcherry(ha)) mit N-terminaler SV40 NLS und 10 AS
langer „Linkersequenz“ wurde in einer dreistufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte
mit dem Plasmid pE1411 als Matrize und den Oligonukleotiden R4-fwd1 und Red_delta_rev.
Das 755 bp lange Amplifikat aus der ersten Stufe wurde in Stufe zwei und drei mit den
Oligonukleotiden R4-fwd2 und R4-fwd3 auf 777 und 798 bp verlängert. Als zweites
Oligonukleotid diente jeweils Red_delta_rev. Das Produkt der dritten Stufe wurde mit HindIII
und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um
die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids 190PU
sequenziert.
pWHE705/C5: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler BP SV40 A6 NLS und
10 AS langer „Linkersequenz“ wurde in einer vierstufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe
erfolgte mit dem Plasmid pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R5fwd1
und R5delta_rev. In den Stufen zwei, drei und vier wurde das 787 bp lange Amplifikat der
ersten Stufe sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R5fwd2, R5fwd3 und
R5fwd4 auf 816, 844 und 867 bp verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente jeweils
Red_delta_rev. Das Produkt der vierten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in
den gleichermaßen geschnittenen Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu
überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids Met25_seq1
sequenziert.
- 96 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
pWHE705/C6: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler c-Myc NLS und 10 AS
langer „Linkersequenz“ wurde in einer dreistufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte
mit dem Plasmid pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R5fwd1 und
R5delta_rev. In den Stufen zwei und drei wurde das 787 bp lange Amplifikat der ersten Stufe
sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R6fwd1 und R6fwd2 auf 814 und
840 bp verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente jeweils Red_delta_rev. Das Produkt der
dritten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen
Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit
Hilfe des Oligonukleotids Met25_seq1 sequenziert.
pWHE705/C7: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler SV40 NLS und 10 AS
langer „Linkersequenz“ wurde in einer dreistufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte
mit dem Plasmid pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R7fwd1 und
R5delta_rev. In den Stufen zwei und drei wurde das 773 bp lange Amplifikat der ersten Stufe
sukzessive am N-Terminus mit den Oligonukleotiden R4fwd2 und R4fwd3 auf 795 und
816 bp verlängert. Als zweites Oligonukleotid diente jeweils Red_delta_rev. Das Produkt der
dritten Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen
Vektor pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit
Hilfe der Oligonukleotide Met25_seq1 und 190PU sequenziert.
pWHE705/C7-TIP2: Das Gen für mCherry (mcherry(ya)) mit N-terminaler SV40 NLS und
10 AS langer „Linkersequenz“ sowie einer TIP2 kodierenden Sequenz am C-Terminus wurde
in einer dreistufigen PCR hergestellt. Die erste Stufe erfolgte mit dem Plasmid
pSB2K3-BBaE2060 als Matrize und den Oligonukleotiden R7fwd1 und R7P5rev. In der
zweiten und dritten Stufe wurde das 786 bp lange Amplifikat der ersten Stufe am C- und am
N-Terminus sukzessive verlängert. Die zweite Stufe mit den Oligonukleotiden R4fwd2 und
R7P5_rev2 ergab ein 837 bp langes Produkt und die dritte Stufe mit den Oligonukleotiden
R4fwd3 und R7P5_rev3 ergab ein 871 bp umfassendes Amplifikat. Das Produkt der dritten
Stufe wurde mit HindIII und SpeI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor
pWHE705 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der
Oligonukleotide Met25_seq1 und 190PU sequenziert.
pM1-EGFP: Die Punktmutation T587G des m1 Gens aus pHH-M wurde über eine
zweistufige PCR revidiert. In der ersten Stufe wurden über zwei parallele PCR Reaktionen
mit den Olignukleotidpaaren M1-XhoI-fwd und M1-GT-rev sowie M1-EcoRI-rev und
M1-GT-fwd jeweils mit dem Plasmid pHH-M als Matrize zwei Produkte erzeugt. Diese
bestanden aus der M1 Sequenz stromaufwärts und stromabwärts der Mutation und
- 97 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
überlappten im Bereich der Mutation mit der korrekten Sequenz um 37 bp. In der zweiten
Stufe werden die beiden 625 und 208 bp umfassenden Produkte der ersten Stufe mit Hilfe
der Oligonukleotide M1-XhoI-fwd und M1-EcoRI-rev zu einem 796 bp großem Amplifikat
fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und EcoRI restringiert und in den gleichermaßen
geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige
Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide M1seq1 und M1seq2 sequenziert.
pM1Mut-EGFP: Das Gen für M1Mut wurde über eine zweistufige PCR nach dem gleichen
Prinzip wie die Revision der Punktmutation für die Konstruktion von pM1-EGFP hergestellt.
Als Matrize für die erste Stufe diente die zweite Stufe aus der Konstruktion von
pM1-EGFP. Die beiden parallelen Reaktionen der ersten Stufe erfolgten mit den
Oligonukleotiden M1-XhoI-fwd und M1-Mut-rev sowie M1-EcoRI-rev und M1-Mut-fwd. Die
350 und 490 bp großen Produkte der ersten Stufe enthielten eine überlappende Sequenz
von 44 bp und wurden in der zweiten Stufe mit den Oligonukleotiden M1-XhoI-fwd und
M1-EcoRI-rev zu einem 796 bp großen Amplifikat fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und
EcoRI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um
die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide
M1seq1 und M1seq2 sequenziert.
pNP-EGFP: Das Gen für NP wurde in einer PCR mit den Oligonukleotiden NP-XhoI-fwd und
NP-EcoRI-rev aus pPolI-A/NP/WSN/33 amplifiziert. Das 1532 bp große Produkt wurde mit
EcoRI und XhoI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1
kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der
Oligonukleotide NPseq1, NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.
pNPMut-EGFP: Das Gen für NPMut wurde in einer zweistufigen PCR hergestellt. Die erste
Stufe erfolgte mit pPolI-A/NP/WSN/33 als Matrize und den Oligonukleotiden NPMut-fwd1
und NP-EcoRI-rev. Das 1515 bp lange Amplifikat der ersten Stufe wurde in der zweiten Stufe
am N-Terminus mit dem Oligonukleotid NPMut-fwd2 auf 1532 bp verlängert. Als zweites
Oligonukleotid diente erneut NP-EcoRI-rev. Das Produkt der zweiten Stufe wurde mit EcoRI
und XhoI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert.
Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide
NPseq1, NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.
pNS4-EGFP: Das Gen für NS4 wurde in einer zweistufigen PCR nach dem gleichen Prinzip
wie die Revision der Punktmutation für die Konstruktion von pM1-EGFP hergestellt. Die
erste Stufe erfolgte mit den Oligonukleotidpaaren NS1-XhoI-fwd und NS3ss-rev sowie
- 98 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
NS1-EcoRI-rev und NS3ss-fwd und dem Plasmid pcDNA-NS1 als Matrizen. Die 549 und
217 bp großen Produkte der ersten Stufe enthielten eine überlappende Sequenz von 31 bp
und wurden in der zweiten Stufe mit den Oligonukleotiden NS1-Xho-fwd und NS1-EcoRI-rev
zu einem 735 bp großen Amplifikat fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und EcoRI restringiert
und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um die Sequenz zu
überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide NS1seq1 und NS1seq2
sequenziert.
pNS4Mut-EGFP: Das Gen für NS4Mut wurde in einer zweistufigen PCR nach dem gleichen
Prinzip wie die Revision der Punktmutation für die Konstruktion von pM1-EGFP hergestellt.
Die erste Stufe erfolgte mit den Oligonukleotidpaaren NS1-Xho-fwd und NS1Mutrev sowie
NS1-EcoRI-rev und NS1Mutfwd und dem Plasmid pcDNA-NS1 als Matrize. Die 494 und
280 bp großen Produkte der ersten Stufe enthielten eine überlappende Sequenz 39 bp und
wurden in der zweiten Stufe mit den Oligonukleotiden NS1-XhoI-fwd und NS1-EcoRI-rev zu
einem 735 bp großen Amplifikat fusioniert. Dieses wurde mit XhoI und EcoRI restringiert und
in den gleichermaßen verdauten Vektor pEGFP-N1 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen,
wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide NS1seq1 und NS1seq3
sequenziert.
pIPRBF: Das Gen für die tTA Variante TetR-FFF wurde mit den Oligonukleotiden RB-fwd
und RBFFF-rev mit dem Vektor pWHE120(B) als Matrize amplifiziert. Das 561 bp lange
Produkt wurde mit EcoRI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor
pIRESPuro2 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe
der Oligonukleotide CMVForward, IRESPseq, pDUALseq4, pDUALseq5 und TetRseq1
sequenziert.
pEF1-HTLV/FRT:
Die
Sequenz
für
den
hEF1-HTLV
Promotor
wurde
mit
den
Oligonukleotiden EF1a-HTLV-fwd und EF1a-HTLV-rev mit dem Vektor pTripTTGTK als
Matrize amplifiziert. Das 561 bp große Amplifikat wurde per BglII und NheI restringiert und in
den gleichermaßen geschnittenen Vektor pcDNA/FRT kloniert. Um die Sequenz zu
überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe des Oligonukleotids EF1seq1 sequenziert.
pIP/NP-TIP2: Das Gen für NP-TIP2 wurde in einer zweistufigen PCR hergestellt. Die erste
Stufe erfolgte mit pNP-EGFP als Matrize sowie den Oligonukleotiden NP-NheI-fwd und
NP-P5-1. Das 1551 bp lange Produkt der ersten Stufe wurde in der zweiten Stufe C-terminal
mit Hilfe des Oligonukleotids NP-P5-2 auf 1588 bp verlängert. Das Amplifikat der zweiten
Stufe wurde mit NheI und EcoRI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen Vektor
- 99 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
pIRESPuro2 kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe
der Oligonukleotide NPseq1, NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.
pEF1-HTLV/NP-TIP2: Das Gen für NP-TIP2 wurde mit den Oligonukleotiden CMVForward
und IRESPseq und dem Vektor pIP/NP-TIP2 als Matrize amplifiziert. Das 1824 bp lange
Amplifikat wurde per NheI und NotI restringiert und in den gleichermaßen geschnittenen
Vektor pEF1-HTLV/FRT kloniert. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige
Konstrukt mit Hilfe der Oligonukleotide NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.
pWH2101/NP: Die Sequenz für NP wurde per PCR mit den Oligonukleotiden NP-XhoI-fwd2
und NP-MfeI-rev sowie dem Vektor pEF1-HTLV/NP-TIP2 als Matrize amplifiziert. Das
1545 bp lange Produkt wurde per MfeI und XhoI restringiert und in den gleichermaßen
geschnittenen Vektor pWH2101 kloniert. Die Klonierung erfolgte mit dem E. coli Stamm
RB791. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe der
Oligonukleotide NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.
pWH2101/NP-TIP2: Das Gen für NP-TIP2 wurde per PCR mit den Oligonukleotiden
NP-XhoI-fwd2 und NPP5-MfeI-rev mit dem Vektor pEF1-HTLV/NP-TIP2 als Matrize
amplifiziert. Das 1605 bp lange Produkt wurde per MfeI und XhoI restringiert und in den
gleichermaßen geschnittenen Vektor pWH2101 kloniert. Die Klonierung erfolgte mit dem
E. coli Stamm RB791. Um die Sequenz zu überprüfen, wurde das fertige Konstrukt mit Hilfe
der Oligonukleotide NPseq2, NPseq3, NPseq4 und NPseq5 sequenziert.
- 100 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.9 Medien, Lösungen und Puffer
Medien, Lösungen und Puffer wurden mit deionisiertem Wasser angesetzt und bei Bedarf,
wenn nicht anders vermerkt für 25 min bei 121 °C und 2 bar autoklaviert. Lösungen mit
hitzelabilen Substanzen wurden mit einem Filter der Porengröße 0,2 µm steril filtriert. Puffer
für die Gelelektrophorese wurden unsteril verwendet. Die Lagerung von Medien erfolgte bei
4 °C. Lösungen und Puffer wurden, wenn nicht anders vermerkt bei RT gelagert.
5.1.9.1 Medien
5.1.9.1.1 Fakultative Zusätze für Medien
Für Ampicillin, Kanamycin und IPTG wurden Stammlösungen in deionisiertem Wasser
hergestellt und anschließend sterilfiltriert. Hygromycin- und Puromycinlösungen wurden
gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen. Die Konzentrationen der Stammlösungen, die
Endkonzentrationen im Medium und die Lagertemperaturen sind in der unten stehenden
Tabelle angegeben. Die Zugabe der fakultativen Zusätze zum Medium erfolgte unter sterilen
Bedingungen bei Flüssigmedien im kalten Zustand und bei Plattenmedien nach Abkühlen auf
ca. 50 °C (Sambrook, 1989).
Zusatz
Stammlösung
Lagerung
Ampicillin
100 mg/ml
100 mg/l
Kanamycin
50 mg/ml
50 mg/l
Dox
1 mg/ml
1 mg/l für die Zellkultur
-20 °C
Endkonzentration im Medium
0,24 mg/l µM für S. cerevisiae
0,1 mg/l für E.coli
IPTG
60 mM
30, 60, 90 µM
Puromycin
10 mg/ml
0,5; 1,0; 1,5 oder 2,0 mg/l
Hygromycin
50 mg/ml
250 mg/l
4 °C
Methionin
2 mg/ml
3, 10, 150 mg/l
5.1.9.1.2 Bakteriennährmedien
Plattenmedien wurden vor dem Autoklavieren zusätzlich mit 1,2 % (w/v) Agar versetzt.
LB-Medium
10 g/l Trypton
5 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
- 101 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.9.1.3 Hefenährmedien
Hefenährmedien wurden für 15 min bei 121 °C und 2 bar autoklaviert. Plattenmedien wurden
vor dem Autoklavieren zusätzlich mit 1,2 % (w/v) Agar versetzt.
Minimal-/ Selektionsmedien
Aminosäuremix für Hefemedien
2 g/l Yeast Nitrogen Base
2 g/l Arginin
5,5 g/l Ammoniumsulfat
1 g/l Histidin
55 mg/l Uracil
6 g/l Iso-Leucin
55 mg/l Tyrosin
6 g/l Leucin
55 mg/l Adenin
4 g/l Lysin
1 g/l Methionin
6 g/l Phenylalanin
5 g/l Threonin
4 g/l Tryptophan
Für - Ura Selektionsmedien wurde kein Uracil
Nach Einwaage wurden die Substanzen in
zugegeben. Nach dem Autoklavieren wurden
deionisiertem Wasser gelöst, sterilfiltriert und
100 ml einer autoklavierten 20 % (w/v)
bei 4 °C gelagert. Für Selektionsmedien
Glucose-Lösung und 10 ml Aminosäuremix
wurden die entsprechenden Aminosäuren
unter sterilen Bedingungen zugegeben.
nicht zugegeben.
Vollmedium (YPAD)
20 g/l Glukose (w/v)
10 g/l Hefeextrakt
20 g/l Pepton aus Fleisch
100 mg/ml Adenin
5.1.9.1.4 Medien für die Zellkultur
Die Medienkomponenten für die Zellkultur DMEM (4,5 g/l Glucose und L-Glutamin), FKS und
Penicillin/Streptomycin (100x) wurden gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen und unter
sterilen Bedingungen gemischt. Hierbei wurde FKS in einer Endkonzentration von 10 bzw.
15 % und Penicillin/Streptomycin in einer Endkonzentration von 1 % zugegeben.
- 102 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.9.2 Lösungen und Puffer
5.1.9.2.1 Allgemeine Puffer
10 x PBS
50 x TAE Puffer
DNA Auftragepuffer
580 mM Na2HPO4
2 M Tris Base
5 % (v/v) 20x TAE
170 mM NaH2PO4
1 M Na-Acetat
50 % (v/v) Glycerin
680 mM NaCl
62,5 mM EDTA
0,05 % (w/v) Bromphenolblau
0,05 % (w/v) Xylencyanol
Agarosegel
TE-Puffer
0,2 % (w/v) SDS
1-3 % (w/v) Agarose in
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
0,1 mM EDTA
1 x TAE
1 mM EDTA
5.1.9.2.2 Lösungen und Puffer für E. coli
Puffer für die LacZ-Aktivitätsmessung:
5x Z-Puffer
Lyse-Lösung
300 mM Na2HPO4
1x Z-Puffer
200 mM NaH2PO4
50 mM KCl
5 mM MgCl2
250 mM β-Mercaptoethanol
pH 7,0 (eingestellt mit NaOH)
Start-Lösung
1x Z-Puffer
0,8 mg/ml ONPG
Stop-Lösung
1 M Na2CO3
5.1.9.2.3 Lösungen und Puffer für S. cerevisiae
DAPI-Färbelösung
Lösung mit einer DAPI Konzentration von 5 mg/ml in deionisiertem Wasser, Lagerung bei
-20 °C.
Transformation von S. cerevisiae
Träger-DNA: Für die Herstellung der Träger DNA wurden 100 mg Heringssperma-DNA in
deionisiertem Wasser zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml gelöst. Diese wurde
anschließend bei 95 °C für 15 min inkubiert und für 15 min bei Raumtemperatur abgekühlt.
Die Lösung wurde 20 x durch eine 20 ml Spritze mit einer dünnen Kanüle (Nr. 1) gedrückt,
um über die entstehenden Scherkräfte kurze DNA-Fragmente herzustellen. Nach einer
erneuten Inkubation für 15 min bei 95 °C und Abkühlung bei RT wurden 0,5 ml Aliquots
hergestellt, die bei -20 °C gelagert wurden.
- 103 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.1.9.2.4 Lösungen und Puffer für die Zellkultur
Messung der Luciferaseaktivität
Lysepuffer
Messpuffer
25 mM Tris Phosphat pH 7,8
100 mM KH2PO4/K2HPO4 pH 7,8
2 mM EDTA
15 mM MgSO4
5 % Glycerin
5 mM ATP
1 % Triton X-100
2 mM DTT (frisch zugegeben)
Luciferinlösung
0,25 mM D-Luciferin (in Messpuffer)
Puffer und Lösungen für die LacZ in situ Färbung
Färbelösung (50 ml)
Waschlösung
1ml
100 mg/ml X-Gal
2 mM MgCl2
106 mg
K4(Fe(CN)6) x (H2O)3
0,2 % NP 40
82 mg
K3(Fe(CN)6)
0,1 M Phosphatpuffer
48 ml
Waschlösung
Fixierlösung (frisch angesetzt)
0,1 M Phosphatpuffer pH 7,3 (500 ml)
0,2 % Glutaraldehyd
115 ml 0,1 M NaH2PO4
5 mM EGTA pH 7,3
385 ml 0,1 M Na2HPO4
2 mM MgCl2
0,1 M Phosphatpuffer
Höchst 33342 Färbelösung
Lösung mit einer Höchst 33342 Konzentration von 1 mM in deionisiertem Wasser, Lagerung
bei -20 °C
5.2 Methoden
5.2.1 Nukleinsäure Methoden
5.2.1.1 Plasmidisolierung aus E. coli
Die Isolierung des jeweiligen Plasmides erfolgte aus dem Zellniederschlag von 4 bzw. 100 ml
Übernachtkultur mit dem NucleoSpin® Extract II bzw. dem Nucleobond® Xtra Midi Kitsystem
nach Angaben des Herstellers. Die Anzucht der Zellen erfolgte wie unter 5.2.2.1
beschrieben.
- 104 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.2.1.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA
Die Restriktionsspaltung mit Endonukleasen erfolgte unter den vom Hersteller empfohlenen
Reaktionsbedingungen. Die eingesetzte Enzymmenge und Inkubationsdauer richtete sich
nach der eingesetzten DNA-Menge, der Anzahl an vorhandenen Schnittstellen und dem
Volumen des Gesamtansatzes. Die benötigten Einheiten (U) des Enzyms wurden mit der
unten abgebildeten Formel berechnet.
U
l1
l2
n1
n2
Units
λ-Phagen Größe (bp)
Plasmidgröße (bp)
Schnittstellen im λ-Phagen
Schnittstellen im Plasmid
5.2.1.3 Dephosphorylierung von 5’-DNA-Enden
Um die Religation von linearisierten Vektoren mit kompatiblen Enden zu verhindern, wurden
die Phosphatgruppen an deren 5’-Enden mit der „Antarctic Phosphatase“ abgespalten. Die
Durchführung erfolgte nach den Vorgaben des Herstellers.
5.2.1.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
PCR mit gereinigter DNA als Matrize
Für die PCR wurden entsprechende Komponenten, wie in der unten angeführten Tabelle
angegeben, nach Ansatz A für Plasmid-DNA und nach Ansatz B für chromosomale DNA
eingesetzt. Die Hybridisierungstemperatur richtete sich nach den verwendeten Oligonukleotiden und die Extensionsdauer wurde in Abhängigkeit von der Länge des Amplifikats
nach Vorgaben des Herstellers der Polymerase berechnet. DMSO und HF Puffer sind vom
Hersteller der Polymerase geliefertes Zubehör.
Ansatz A: Plasmid-DNA (Gesamt 50 µl)
Ansatz B: Chromosomale DNA (Gesamt 100 µl)
300 ng
Matrize
1000 ng
Matrize
10 pmol
Oligonukleotid 1
100 pmol
Oligonukleotid 1
10 pmol
Oligonukleotid 2
100 pmol
Oligonukleotid 2
1 µl
dNTPs (10mM)
1 µl
dNTPs (10mM)
0,5 µl
Phusion Polymerase (2000 U/ml)
4 µl
DMSO 100 %
10 µl
Puffer HF (5x)
2,5 µl
Phusion Polymerase (2000 U/ml)
ad 50 µl
deionisiertes Wasser
20 µl
Puffer HF (5x)
ad 100 µl
deionisiertes Wasser
- 105 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Temperatur
Deckelheizung
8
Schritt
25 Zyklen
Dauer
110 °C
Initiale Denaturierung
3 min
96 °C
Denaturierung
30 s
94 °C
Hybridisierung
30 s
48 °C - 56 °C
Extension
30 s - 3 min
72 °C
Finale Extension
3 min
72 °C
8
Programm für den Thermocycler
4 °C
Lagerung
5.2.1.5 Gelelektrophorese
Die Analyse der Größe von DNA-Fragmenten erfolgte mittels der DNA-Gelelektrophorese
nach Sambrook (Sambrook, 1989). Dazu wurden je nach Fragmentgröße 1, 2 oder 3 %
Agarosegele verwendet. Die Agarose wurde auf rechteckige Kunststoffplatten bis zu einer
Schichtdicke von 3 - 4 mm gegossen und vor dem Erstarren mit Hilfe eines Kunststoffkammes Taschen ausgespart. Nach vollständigem Erkalten der Agarose wurde der Kamm
entfernt und die Platte mit dem Agarosegel in eine mit Puffer gefüllte horizontale
Gelektrophoresekammer gelegt. Anschließend wurde die mit DNA-Auftragepuffer (DAP)
versetzte DNA-Lösung in die Taschen pipettiert. Um die Fragmentgrößen abschätzen zu
können, wurde in einer Tasche zusätzlich ein DNA-Größenstandard aufgetragen. Die
Auftrennung erfolgte für etwa 1 h bei 100 V. Um die DNA anzufärben, wurden die Gele für
10 min in einer ethidiumbromidhaltige Lösung (5 μg/ml) inkubiert und anschließend unter
UV-Licht (λ = 254 nm) fotografiert.
5.2.1.6 Präparative Reinigung von DNA Fragmenten
Zur präparativen Reinigung von DNA Fragmenten wurden diese elektrophoretisch
aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt (Vorgehen siehe unter 5.2.1.5). Die
Visualisierung erfolgte auf einem UV-Schirm mittels Bestrahlung mit langewelligem UV-Licht
(λ = 366 nm). Die Bande der entsprechenden Größe wurde mit einem Skalpell
ausgeschnitten und die DNA mit Hilfe des NucleoSpin® Extract II Kitsystems gemäß den
Angaben des Herstellers aus der Agarose eluiert.
- 106 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.2.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation kompatibler Enden von DNA-Fragmenten erfolgte mit Hilfe der T4 DNA-Ligase.
Die Reaktionsbedingungen entsprachen den Vorgaben des Herstellers. Das Insertionsfragment wurde in Bezug zur Vektor-DNA in dreifachen molaren Überschuss eingesetzt. Die
Ligation erfolgte für 1 h bei RT. Zur Kontrolle wurden Ansätze ohne Insert sowie ohne Insert
und Ligase durchgeführt, um den Anteil der rückligierten bzw. ungeschnittenen Plasmid-DNA
zu ermitteln.
5.2.1.8 Sequenzierung von DNA
Sequenzierungen wurden von der Firma GATC (Konstanz (DE)) mittels der KettenabbruchMethode mit fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden nach Sanger durchgeführt (Sanger
et al., 1977). Die Ergebnisse der Sequenzierungen wurden mit dem Programm DNASTAR
Lasergene® SeqMan Pro ausgewertet.
5.2.1.9 Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren
Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde mit Hilfe des NanoDrop® ND-1000
Spectrophotometers nach Vorgaben des Herstellers bestimmt.
5.2.2 Arbeiten mit E. coli
5.2.2.1 Anzucht von Bakterien
Anzucht in Flüssigmedium
Die Bakterien wurden in dem gewünschten Volumen an Flüssigmedium (gegebenenfalls
versetzt mit entsprechenden Antibiotika) in Schikanekolben oder Reagenzgläsern bei
gewünschter Temperatur auf einem Kulturschüttler inkubiert (200 - 300 Upm). Vorkulturen
wurden bei 37 °C für 10 - 16 h angezogen. Für Hauptkulturen wurde das Flüssigmedium
1:100 aus einer Vorkultur angeimpft, bis zu einer oD600 von 0,4 - 0,5 inkubiert und die Zellen
anschließend durch Zentrifugation (3400g, 10 min, RT) geerntet.
Anzucht auf Festmedium
Vereinzelungen oder Transformationsansätze von E. coli wurden auf agarhaltigem Medium
(gegebenenfalls versetzt Antibiotika) ausgestrichen bzw. ausplattiert und bei 37 °C für
10 - 16 h inkubiert. Bewachsenen Petrischalen wurden bei 4 °C aufbewahrt.
- 107 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
5.2.2.2 Herstellung Calciumchlorid-kompetenter E. coli Zellen
Die Herstellung Calciumchlorid (CaCl2)-kompetenter Zellen wurde nach (Hanahan, 1983) wie
im Folgenden beschrieben durchgeführt. 4 ml LB-Flüssigmedium in einem Reagenzglas
wurden mit einer frischen E. coli Einzelkolonie beimpft und bei 37 °C über Nacht auf einem
Kulturschüttler inkubiert (Vorkultur). Für die Hauptkultur wurden 2 x 100 ml LB-Flüssigmedium in 300 ml Schikanekolben aus der Vorkultur 1:100 angeimpft und bis zu einer oD600
von 0,6 bei 37 °C inkubiert. Zum Abstoppen des Wachstums wurden die Zellen 10 min auf
Eis aufbewahrt. Anschließend erfolgte die Ernte in 50 ml PET-Röhrchen (10 min, 3400g,
4 °C). Die Zellniederschläge wurden jeweils 50 ml 0,1 M steriler und eisgekühlter CaCl2Lösung resuspendiert, 20 min auf Eis gestellt und unter gleichen Bedingungen nochmals
zentrifugiert. Die daraus resultierenden Niederschläge wurden in 10 ml eiskalter 0,1 M
CaCl2-Lösung aufgenommen und die beiden Suspensionen anschließend vereinigt. Vor
weiterer Verwendung wurden die Zellen mindestens eine Stunde auf Eis gelagert. Zur
dauerhaften Aufbewahrung bei -80 °C wurden die Zellen auf eine Endkonzentration von
15 % Glycerin eingestellt, in 0,5 ml Aliquots portioniert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
5.2.2.3 Transformation von E. coli
Die Transformation wurde nach (Sambrook, 1989) durchgeführt. CaCl2-kompetente Zellen
wurden auf Eis aufgetaut und je 200 µl der Zellsuspension mit 100 - 200 ng DNA oder einem
Ligationsansatz versetzt. Nach 60-minütiger Inkubation bei 4 °C auf Eis erfolgte ein
Hitzeschock für 90 sec auf 42 °C. Im Anschluss wurden jeweils 800 µl LB Medium
zugegeben und die Zellen bei 37 °C im Wasserbad für 1 h inkubiert. Von diesen Ansätzen
wurden Aliquots von 100 µl auf Petrischalen mit LB-Selektionsmedium ausplattiert. Die
restliche Suspension wurde für 3 min bei 3500g bei RT abzentrifugiert, der Überstand
verworfen und das Pellet in 100 µl deionisiertem Wasser resuspendiert. Die Suspension
wurde im Anschluss auf Petrischalen mit LB-Selektionsmedium ausplattiert.
5.2.2.4 Messung der β-Gal-Aktivität in E. coli im 96-Napfplatten Format
Prinzip der Messung
Das Enzym β-Galaktosidase (β-Gal) katalysiert die Spaltung des farblosen Substrats ONPG
in Galaktose und gelbes o-Nitrophenol. Die β-Gal-Aktivität korreliert mit der Konzentration
von o-Nitrophenol im Reaktionsansatz, die photometrisch über die Absorption bei der
Wellenlänge λ = 420 nm quantifiziert werden kann (Miller, 1972; Griffith et al., 2002).
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5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Experimentelles Vorgehen
Für die Messung wurde der E. coli Stamm WH207(λtet50) wie unter 5.2.2.3 beschrieben mit
den entsprechenden Plasmiden transformiert und auf LB Agarplatten mit Selektionsmedium
ausgestrichen.
Vorkultur: Die Anzucht der Vorkultur erfolgte in einer sterilen 2,2 ml 96-Tiefnapfplatte in
jeweils 1 ml LB-Selektionsmedium ohne IPTG oder Dox. Die Vertiefungen wurden mittels
einer sterilen, gelben Pipettenspitze mit einer Einzelkolonie beimpft. Die 96-Tiefnapfplatte
wurde anschließend mit einer wasserdichten, atmungsaktiven Folie verschlossen und bei
37 °C und 800 Upm für 12 - 16 h inkubiert (Inkubator für 96-Napfplatten) Die Vorkultur
erreichte innerhalb dieses Zeitraums die stationäre Wuchsphase.
Hauptkultur: Die Anzucht der Hauptkultur erfolgte ebenfalls in einer sterilen 2,2 ml
96-Tiefnapfplatte in 1 ml LB Selektionsmedium mit entsprechenden Konzentrationen an
IPTG oder Dox. Die Hauptkultur wurde mit 5 µl der Vorkultur beimpft und ebenfalls mit
atmungsaktiver Folie versiegelt. Das Beimpfen der Hauptkultur erfolgte wie alle folgenden
Pipettierschritte mit Hilfe einer automatischen 8-Kanalpipette. Die Inkubation erfolgte unter
den gleichen Bedingungen wie für die Vorkultur beschrieben. Beim Erreichen einer oD600 von
0,4 - 0,5 wurde die 96-Tiefnapfplatte für 10 min in Eiswasser gestellt, um das Wachstum der
Zellen zu unterbrechen. Von jeder Vertiefung wurden anschließend 200 µl in eine 96-NapfFlachbodenplatte überführt und die oD595 der Zellsuspensionen im TECAN Plattenlesegerät
bestimmt.
Lyse der Zellen: Parallel zur Messung der oD595 der Zellsuspensionen wurden die
Vertiefungen einer 1,2 ml 96-Tiefnapfplatte jeweils mit 340 µl Lyselösung und 50 µl
Chloroform befüllt. In diese 96-Tiefnapfplatte wurden anschließend von der Hauptkultur
jeweils 60 µl Suspension transferiert. Anschließend erfolgte die Zelllyse durch zweiminütiges
Schütteln auf einem Reaktionsgefäßeschüttler. Diese Zellysate wurden im Anschluss für
30 min bei 28 °C inkubiert, um die Zellysate auf die Messtemperatur von 28 °C zu
äquilibrieren und eine möglichst vollständige Trennung zwischen Chloroform und der
wässrigen Phase zu ermöglichen.
Start und Stop der β-Gal-Reaktion, Bestimmung der β-Gal-Aktivität: Parallel zur Lyse
der Zellen wurden die Vertiefungen einer 96-Napf-Flachbodenplatte mit 270 µl Start-Lösung
befüllt und ebenfalls für 30 min bei 28 °C äquilibriert. Alle Schritte vom Start bis zum
Abstoppen der β-Gal-Reaktion erfolgten bei einer konstanten Temperatur von 28 °C im
Konstantraum. Der Start der β-Gal-Reaktion erfolgte durch Zugabe von 50 µl des Zelllysates
in die Vertiefungen der mit der Start-Lösung befüllte 96-Napf-Flachbodenplatte. Nach
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5 Material und Methoden
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Durchmischung der Reaktionsansätze durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren wurden
160 µl der Lösung in eine zweite 96-Napf-Flachbodenplatte übertragen. Diese zweite Platte
wurde nach vollständiger Befüllung mit einer Noppenfolie versiegelt, um eine Diffusion des
o-Nitrophenols zu verhindern. Die Reaktionen in der ersten 96-Napf-Flachbodenplatte
wurden nach 10 min und die der zweiten 96-Napf-Flachbodenplatte nach 120 min durch
Zugabe von 75 µl Stop-Lösung terminiert. Unmittelbar nach dem Abstoppen der Reaktionen
wurde die Absorption der Reaktionsansätze bei den Wellenlängen λ = 420 und 550 nm im
TECAN Plattenlesegerät bestimmt. Aus diesen Werten sowie der vorher bestimmten oD595,
der Reaktionszeit und dem Reaktionsvolumen wurde die β-Gal-Aktivität in „Miller-Units“
berechnet.
U
oD420
oD550
oD595
1,754
V
Δt
Miller-Units
Absorption von o-Nitrophenol
Absorption der Zelltrümmer
Zelldichte der Kultur
Korrekturfaktor für die Lichtstreuung durch Zelltrümmer
Probenvolumen in ml
Reaktionszeit in min
(Zeitdifferenz zwischen Reaktionsstart und -stop)
5.2.3 Arbeiten mit S. cerevisiae
5.2.3.1 Anzucht von S. cerevisiae
Anzucht auf Festmedium
Vereinzelungen oder Transformationsansätze von S. cerevisiae wurden auf agarhaltigem
Medium (YPAD oder Minimalmedium) ausgestrichen bzw. ausplattiert und bei 28 °C für
24 - 72 h in einer feuchten Kammer inkubiert. Bewachsenen Petrischalen wurden bei 4 °C
aufbewahrt.
5.2.3.2 Herstellung Lithiumacetat-kompetenter S. cerevisiae Zellen
Kompetente Hefezellen wurden nach (Gietz et al., 1992) hergestellt. Hierzu wurde eine
Übernachtkultur mit 10 ml YPAD in einem 100 ml Schikanekolben beimpft und für 20 h bei
28 °C und 180 Upm auf dem Kulturschüttler inkubiert. Aus dieser Vorkultur wurde eine
Hauptkultur mit 50 ml YPAD in einem 300 ml Schikanekolben auf eine oD600 von 0,125
angeimpft. Die Inkubation der Hauptkultur erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie für
die Vorkultur bis eine oD600 von ca. 0,5 erreicht wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden die
Zellen durch Zentrifugation in PET-Röhrchen geerntet (5 min, 3000g) und der Überstand
wurde verworfen. Der Zellniederschlag wurde anschließend in 25 ml deionisiertem Wasser
resuspendiert und unter den gleichen Bedingungen nochmals abzentrifugiert. Der
Zellniederschlag wurde in 1 ml 100 mM Lithiumacetat (LiAc)-Lösung resuspendiert, in ein
1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß transferiert und für 10 s (Biofuge pico) abzentrifugiert. Das
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5 Material und Methoden
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Pellet wurde mit einer 100 mM LiAc-Lösung auf ein Lösungsvolumen von 0,5 ml (nach
Skalierung Eppendorf Reaktionsgefäß) aufgefüllt und erneut resuspendiert. Die so erhaltene
Zellsuspension wurde in 50 µl Aliquots portioniert und im Kryocontainer in der -80 °C
Gefriertruhe eingefroren.
5.2.3.3 LiAc-Transformation
Die Transformation von S. cerevisiae erfolgte mit der LiAc-Methode nach (Gietz et al., 1992).
Für die Transformation wurden 50 µl kompetente Hefezellen 10 s (Biofuge pico)
abzentrifugiert, der Überstand wurde mit einer Pipette abgezogen und der Zellniederschlag
mit 350 µl Transformationsansatz durch vortexen vermischt. Der Transformationsansatz
setzte sich wie folgt zusammen:
240 µl 50 % PEG 3350
36 µl 1 M LiAc
5 µl Träger-DNA
1.000 ng Plasmid-DNA pro zu transformierendem Konstrukt
ad 350 µl deionisiertes Wasser
Anschließend wurde der Ansatz erst für 15 min bei 30 °C und dann für 20 min bei 42 °C
inkubiert und erneut für 10 s (Biofuge pico) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Pellet in 300 µl deionisiertem Wasser resuspendiert. Jeweils 100 µl dieser
Suspension wurden auf Petrischalen mit Selektionsmedium ausplattiert.
5.2.3.4 DAPI-Färbung
Die Hefezellen wurden von einer Petrischale mit Festmedium abgeschabt und in
Reagenzgläsern mit 5 ml eines entsprechenden Selektionsmediums für 20 h bei 28 °C auf
dem Rollinkubator inkubiert. Von dieser Kultur wurden 1,8 ml in einen 100 ml
Schikanekolben mit 20 ml frischem Selektionsmedium überimpft und für 7 h bei 28 °C auf
dem Kulturschüttler inkubiert. Von dieser Kultur wurde 1 ml entnommen, in ein 1,5 ml
Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und für 30 s bei 1000g abzentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und die pelletierten Hefezellen wurden in 1 ml deionisiertem Wasser
resuspendiert, erneut abzentrifugiert und wiederum in 1 ml deionisiertem Wasser
resuspendiert. Zu der Suspension wurden 3 µl DAPI Färbelösung gegeben und durch
vortexen gemischt. Nach einer Inkubation für 5 min wurde der nicht gebundene Farbstoff
durch zwei Zyklen Zentrifugation (30 s, 1000g) und Resuspension (in 1 ml deionisiertem
Wasser) entfernt. Nach erneuter Zentrifugation unter denselben Bedingungen wurde der
Zellniederschlag in 50 µl deionisiertem Wasser resuspendiert und die gefärbten Zellen im
Fluoreszenzmikroskop analysiert (siehe unter 5.2.3.5).
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5 Material und Methoden
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5.2.3.5 Fluoreszenzmikroskopische Analyse von S. cerevisiae
Um Hefezellen im Mikroskop fotografieren zu können, müssen sie auf dem Objektträger
immobilisiert werden. Ohne Immobilisierung ist die Aufnahme einer Folge desselben
Bildausschnittes mit unterschiedlichen Einstellungen aufgrund der ständigen Bewegung der
Zellen im Flüssigkeitsstrom nicht möglich. Hierzu wurde auf den Objektträger eine dünne
Schicht Agarose (2 % in deionisiertem Wasser) pipettiert und sofort das Deckglas aufgesetzt.
Als Abstandshalter zwischen Deckglas und Objektträger dienten hierbei zwei Stecknadeln
(Abb. 36). Nach dem Erstarren der Agarose wurde das Deckglas mit Hilfe der Stecknadeln
abgehoben und 5 - 15 µl der entsprechenden Hefesuspension auf die Agarose pipettiert. Die
fluoreszenzmikroskopische Analyse erfolgte mit einem Mikroskop des Typs Axio Scope A1
mittels eines 100x Objektiv mit Öl-Immersion. Die Anregung der Fluoreszenz erfolgte mit
entsprechenden Dioden.
Abb. 36: Immobilisierung von Hefezellen für die
Mikroskopie
Agarose
Deckglas
Stecknadeln
Objektträger
Zwischen Deckglas und Objektträger befindet sich
eine dünne Schicht 2 % Agarose. Stecknadeln
dienen als Abstandshalter.
5.2.3.6 Erstellung von Wuchskurven
S. cerevisiae wurde mit den entsprechenden Plasmiden wie unter 5.2.3.3 beschrieben
transformiert und auf Festmedien ausgestrichen. Nach einer Inkubation von 48 h bei 28 °C
wurden 250 µl deionisiertes Wasser auf die bewachsene Petrischale pipettiert und die
Hefezellen mit Hilfe einer Glaspipette und eines Drehtellers gleichmäßig auf der Petrischale
verteilt. Die so behandelte Kultur wurde für weitere 24 h bei 28 °C inkubiert. Durch diese
Behandlung entstand ein gleichmäßiger Rasen einer homogenen Zellpopulation. Von den
Agarplatten wurde mit einer sterilen Glaspipette eine ca. 20 µl entsprechende Menge
abgeschabt und in 10 ml Selektionsmedium in einem 100 ml Schikanekolben resuspendiert.
Diese Vorkultur wurde für 24 h bei 28 °C und 180 Upm auf dem Kulturschüttler inkubiert.
Innerhalb dieses Zeitraums wurde die stationäre Wachstumsphase erreicht. Ausgehend von
dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur mit 100 ml Selektionsmedium in einem 300 ml
Schikanekolben auf eine oD600 von 0,1 beimpft. Die Inkubation der Hauptkultur erfolgte unter
den gleichen Bedingungen wie für die Vorkultur. In regelmäßigen Zeitabständen wurde 1 ml
der Hauptkultur entnommen und die entsprechende oD600 bestimmt.
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5 Material und Methoden
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5.2.3.7 Fluoreszenzquantifizierung
Die Herstellung einer homogenen, mit den entsprechenden Plasmiden transformierten
Zellpopulation erfolgte wie unter 5.2.3.6 beschrieben. Von dieser Kultur wurde mit Hilfe einer
sterilen gelben Pipettenspitze eine ca. 20 µl entsprechende Menge abgeschabt und in einem
Reagenzglas mit 5 ml Selektionsmedium (optional mit Zusätzen) resuspendiert. Nach einer
20-stündigen Inkubation bei 28 °C auf dem Rollinkubator wurden 1,8 ml der Kultur in einen
100 ml Schikanekolben mit 20 ml frischen, identischem Selektionsmedium überimpft. Nach
7 h auf dem Reaktionsgefäßschüttler bei 28 °C und 180 Upm lag die oD600 bei 0,6 - 0,9. Zu
diesem Zeitpunkt wurden 10 ml der Kultur entnommen, in ein PET-Röhrchen überführt, für
5 min bei 1000g abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Zellniederschlag wurde in
10 ml 1 x PBS resuspendiert, erneut bei 1000g für 5 min zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Die pelletierten Hefezellen wurden in 5 ml 1 x PBS resuspendiert und die oD600
der Suspension bestimmt. Für die Fluoreszenzmessung wurden zwei oD600 Einheiten
eingesetzt und auf 2 ml Gesamtvolumen mit 1 x PBS aufgefüllt (oD600 der Suspension für die
Fluoreszenzmessung = 1). Die Zellsuspension wurde jeweils vor der Messung mit Hilfe eines
Tablettenrührstabes in der Küvette für 30 s gemischt. Die Quantifizierung der Fluoreszenz
erfolgte in einem Spektralfluorimeter des Typs Fluorolog 3. Die entsprechenden
Einstellungen des Spektralfluorimeters finden sich in der unten stehenden Tabelle.
Einstellungen des Spektralfluorimeters:
Anregungswellenlänge GFP+: λex = 491 nm
Spaltbreite: 1,1 mm
Detektionswellenlänge GFP+: λem = 512 nm
(Messung in 3.1.4.3)
(Scholz et al., 2000)
oder Spaltbreite 2,0 mm
(Messung in 3.1.3.4)
Anregungswellenlänge mCherry: λex = 587 nm
Maximal drei Versuche
Detektionswellenlänge mCherry: λem = 610 nm
Standardabweichung: 1,5 %
(Shaner et al., 2004)
Integrationszeit: 5 s
Detektorspannung: 950 V
5.2.4 Arbeiten in der Zellkultur
Alle Arbeiten in der Zellkultur wurden, wenn nicht anders vermerkt, unter einer Sterilbank
durchgeführt. Bei den beiden verwendeten Zelllinien handelte um die jeweils adhärent
wachsenden Zelllinien HeLa und HEK293. Die verwendeten Medien und Lösungen wurden
entweder gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen oder autoklaviert. Die Inkubationsschritte
erfolgten, wenn nicht anders vermerkt, bei 37 °C unter 7,5 % CO2 Atmosphäre.
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5 Material und Methoden
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5.2.4.1 Kultivierung von HeLa und HEK293 Zellen
Die Kultivierung von humanen Zelllinien erfolgte in Gewebekulturschalen (∅ 10 bzw. 15 cm)
in 10 bzw. 20 ml DMEM (10 % FKS). Je nach Wuchsgeschwindigkeit wurden die Kulturen im
Zwei- bis Dreitagesrhythmus bei Erreichen von 80 - 90 % Konfluenz abgelöst, verdünnt und
in frisches Medium umgesetzt. Hierzu wurde das Zellkulturmedium mittels einer
Membranpumpe abgesaugt, die Zellen einmalig mit 10 ml PBS gewaschen und
anschließend mit 5 ml Trypsin/EDTA für 10 min inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden in
ein 15 ml PET-Röhrchen überführt und bei RT für 5 min bei 100g sedimentiert. Nach
Absaugen des Überstandes wurden die Zellen in 10 ml DMEM (10 % FKS) resuspendiert
und jeweils 0,5 - 3 ml dieser Suspension auf eine frische Zellkulturschale mit 10 ml DMEM
(10 % FKS) überführt.
5.2.4.2 Kryokonservierung und Auftauen von HeLa und HEK293 Zellen
Für die Kryokonservierung wurden pro Kryoröhrchen mindestens 5 x 106 Zellen eingesetzt.
Hierzu wurden die Zellen wie unter 5.2.4.1 beschrieben, kultiviert und geerntet. Allerdings
erfolgte hier die Resuspension nicht in DMEM, sondern in 1 ml Einfriermedium (90 % FKS,
10 % DMSO). Anschließend wurde die Suspension in Kryoröhrchen überführt und in einem
Kryocontainer im -80 °C Gefrierschrank eingefroren. Die Lagerung der Kryokulturen erfolgte
anschließend bei -80 °C oder im Stickstofftank. Um die Kulturen wieder aufzutauen, wurden
die Kryoröhrchen im Wasserbad auf 37 °C erwärmt und die Zellsuspension wurde
anschließend in 10 ml DMEM (10 % FKS) in einer 10 cm Schale überführt. Nach 24 h wurde
das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden einmalig mit PBS gewaschen und
mittels 3 ml Trypsin/EDTA bei 37 °C für 10 min abgelöst. Alle weiteren Schritte entsprachen
dem unter 5.2.4.1 beschriebenen Vorgehen.
5.2.4.3 Zellzählung
Die Bestimmung des Titers einer Zellsuspension erfolgte mittels eines Zellzählers. Die
Zellzählung erfolgte stets mit Zellen die frisch geerntet, abzentrifugiert und in 10 ml DMEM
(10 % FKS) resuspendiert wurden (Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1). Von der so
hergestellten Suspension wurde 1 ml in ein Eppendorf Reaktionsgefäß überführt und die
Zellen für 5 min bei 300g sedimentiert. Nach Abziehen des Überstandes wurde das Zellpellet
in 1 ml Elektrolyt (1 % NaCl) resuspendiert und in einem Zählgefäß mit weiteren 9 ml
Elektrolyt gemischt. Der Titer dieser Suspension wurde im Zellzähler (100 µm Kapillare)
bestimmt und auf die ursprüngliche Zellsuspension umgerechnet. Die hier beschriebenen
Schritte erfolgten ab der Umfüllung in ein Eppendorf Reaktionsgefäß unter unsterilen
Bedingungen. Die für die Zählung verwendeten Zellen wurden im Anschluss verworfen.
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5 Material und Methoden
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5.2.4.4 Stabile Transfektion von HeLa Zellen
Für die stabile Transfektion wurden die Zellen in 6-Napfplatten umgesetzt. Hierzu wurde eine
Zellsuspension hergestellt und der Titer bestimmt (Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1 bzw.
5.2.4.3). Für die Aussaat der Zellen wurde die Suspension auf 1 x 105 Zellen/ml eingestellt
und 2 ml pro Vertiefung einer 6-Napfplatte ausgebracht. Nach 24-stündiger Inkubation
erfolgte die Transfektion. Als Kontrolle dienten hierbei Zellen der Ausgangszelllinie, die einer
Leertransfektion ohne Zugabe von DNA unterzogen wurden. Der Ablauf der Transfektion
erfolgte in Abhängigkeit vom transfizierten Konstrukt:
Stabile Transfektion von pIPRBF
Das Plasmid pIPRBF wurde mit dem Restriktionsenzym AhdI geschnitten und das
linearisierte Produkt gelelektrophoretisch gereinigt (Vorgehen beschrieben unter 5.2.1.6). Pro
Transfektionsansatz wurde 1 µg der auf diese Weise hergestellten DNA mit 12,5 µl
OPTI-MEM® gemischt und zu einer Lösung aus 2 µl Lipofektamine™ in 18 µl OPTI-MEM®
gegeben. Nach einer Inkubation von 20 min bei RT wurde diese Lösung mit 1 ml OPTIMEM®
vermischt, das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt und durch die
Transfektionslösung ersetzt. Nach Inkubation für 4 h wurde die Transfektionsreaktion durch
Zugabe von 1 ml DMEM (20 % FKS) mit oder ohne Zugabe von Dox (2 mg/l) terminiert.
Nach Inkubation für 24 h wurde das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen wurden einmalig
mit PBS gewaschen und für 10 min mit 600 µl Trypsin inkubiert. Die abgelösten Zellen
wurden auf 15 cm Schalen mit 20 ml DMEM (10 % FKS) ausgebracht und für 24 h inkubiert.
Anschließend wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und gegen Selektionsmedium
bestehend aus DMEM (10 % FKS) mit entsprechender Konzentration an Puromycin
(0,5; 1,0; 1,5 oder 2,0 µg/ml) je einmal in Ab- und Anwesenheit von 1 mg/l Dox ausgetauscht.
Die Selektion erfolgte für 14 Tage wobei das Zellkulturmedium im 48 h Rhythmus gegen
neues Selektionsmedium ausgetauscht wurde. Innerhalb dieses Zeitraums wuchsen
resistente Klone zu Zellhaufen mit 1 - 2 mm Durchmesser heran. Diese wurden mit Trypsin
abgelöst und jeder Klon in eine mit 1 ml DMEM (15 % FKS) angefüllte Vertiefung einer 24Napfplatte überführt (Isolation der Klone). Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Medium
von den Klonen abgesaugt und jeweils gegen Selektionsmedium aus DMEM (10 % FKS) mit
0,5 mg/l Puromycin ausgetauscht. Während der ca. 14 Tage dauernden Expansionsphase
wurden die Zellen bei Erreichen von 80 - 90 % Konfluenz von 24-Napfplatten über
6-Napfplatten auf 10 cm und 15 cm Schalen umgesetzt. Als Zellkulturmedium diente hier
jeweils Selektionsmedium aus DMEM (10 % FKS) mit 0,5 mg/l Puromycin.
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5 Material und Methoden
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Stabile Transfektion von pEF1-HTLV/NP-TIP
Für die chromosomale Integration über das Flp-In™ System (Invitrogen) wurden die Zellen
gleichzeitig mit den Plasmiden pEF1-HTLV/NP-TIP2 und pOG44 im molaren Verhältnis von
1:9 transfiziert. Hierfür wurden pro Transfektionsatz 100 ng pEF1-HTLV/NP-TIP2 und 850 ng
pOG44 mit 12,5 µl OPTI-MEM® gemischt und zu einer Lösung aus 2 µl Lipofektamine™ in
18 µl OPTI-MEM® gegeben. Nach einer Inkubation von 20 min bei RT wurde diese Lösung
mit 1 ml OPTI-MEM® vermischt. Nun wurde das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt
und durch die Transfektionslösung ersetzt. Nach einer Inkubation von 4 h wurde die
Transfektionsreaktion durch Zugabe von 1 ml DMEM (20 % FKS) terminiert. Nach
72-stündiger Inkubation bei 30 °C unter 7,5 % CO2 Atmosphäre wurde das Zellkulturmedium
abgesaugt, die Zellen wurden einmalig mit PBS gewaschen und für 10 min mit 600 µl Trypsin
inkubiert. Die abgelösten Zellen wurden auf 15 cm Schalen mit 20 ml DMEM (10 % FKS)
ausgebracht und für weitere 24 h inkubiert. Anschließend wurde das Zellkulturmedium
abgesaugt und gegen Selektionsmedium bestehend aus DMEM (10 % FKS) und 250 mg/l
Hygromycin ausgetauscht. Die Selektion erfolgte für 14 Tage wobei das Zellkulturmedium im
48-stündigen Rhythmus gegen neues Selektionsmedium ausgetauscht wurde. Die Isolation
der Klone sowie deren Expansion erfolgte wie für die stabile Transfektion von pIPRBF
beschrieben. Als Selektionsmedium diente hierbei jeweils DMEM (10 % FKS) mit 250 mg/l
Hygromycin.
5.2.4.5 Transiente Transfektion von HeLa und HEK293 Zellen
Für die fluoreszenzmikroskopische Analyse wurden transiente Transfektionen durchgeführt.
Die Anzucht der Zellen erfolgte hierbei auf einem runden 15 mm Deckglas in einer 12Napfplatte. Die Deckgläser wurden für diesen Zweck autoklaviert und unter sterilen
Bedingungen in den Vertiefungen der 12-Napfplatte vorgelegt. Von den zu transfizierenden
Zellen wurde eine Zellsuspension hergestellt und der Titer bestimmt (Vorgehen beschrieben
unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3). Für die Aussaat der Zellen wurde die Suspension auf
2,5 x 104 Zellen/ml eingestellt und 1 ml der Suspension pro Vertiefung der vorbereiteten
12-Napfplatte ausgebracht. Nach 24-stündiger Inkubation der Zellen erfolgte die Transfektion
mit den entsprechenden Plasmiden. Hierzu wurden pro Transfektionsansatz 400 ng PlasmidDNA mit 50 µl OPTI-MEM® gemischt und zu einer Lösung aus 2 µl Lipofektamine™ mit 50 µl
OPTI-MEM® gegeben. Nach einer Inkubation für 20 min bei RT wurde die Lösung mit 500 µl
OPTI-MEM® vermischt. Nun wurde das Kulturmedium von den Zellen abgesaugt und durch
die Transfektionslösung ersetzt. Nach Inkubation für 4 h wurde die Transfektionsreaktion
durch Zugabe von 500 µl DMEM (20 % FKS) terminiert. Nach 24-stündiger Inkubation
erfolgte die fluoreszenzmikroskopische Analyse. Für die Experimente mit Nucleozin wurde
dieses bei der Termination der Transfektionsreaktion zugegeben.
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5 Material und Methoden
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5.2.4.6 Höchst-Färbung
Um den Kontrast zwischen Zellkern und Cytoplasma zu erhöhen, wurde die DNA der Zellen
mit dem Fluoreszenzfarbstoff Höchst 33342 angefärbt. Hierzu wurden 10 µl der HöchstFärbelösung zum Zellkulturmedium gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation wurde das
Zellkulturmedium abgesaugt und der überschüssige Farbstoff in drei Waschschritten mit je
300 µl PBS entfernt.
5.2.4.7 Herstellung von Lebendbeobachtungskammern
Die fluoreszenzmikroskopische Analyse von humanen Zellen erfolgte in allen Fällen in vivo
unter der Verwendung von Lebendbeobachtungskammern. Hierzu wurde auf einen
Objektträger mittels einer Spritze ein Ring aus Silikonpaste mit einem Durchmesser von
ca. 13 mm und einer Höhe von ca. 1 mm aufgebracht. In diesen Ring wurden 20 µl DMEM
(10 % FKS) pipettiert und das Deckglas mit den Zellen nach unten auf den Ring gelegt (Abb.
37). Im Anschluss daran erfolgte die mikroskopische Analyse. Die Herstellung von
Lebendbeobachtungskammern erfolgte unter unsterilen Bedingungen.
Abb. 37 Lebendbeobachtungskammer für die
Mikroskopie
Die Kammer enthält 20 µl DMEM (10 % FKS) und
wurde durch einen Ring aus Silikonpaste abgedichtet.
Die Zellen sind auf der Unterseite des Deckglases
adhäriert und tauchen in das Zellkulturmedium ein.
Aufsicht (A) und Seitenansicht (B)
5.2.4.8 Fluoreszenzmikroskopische Analyse
Die fluoreszenzmikroskopische Analyse erfolgte in Lebendbeobachtungskammern (siehe
unter 5.2.4.7) mit einem konfokalen „laser-scanning“-Mikroskop. Alle Aufnahmen wurden
hierbei mit einem 40x Objektiv mit Öl-Immersion erstellt. Die Scanfrequenz betrug 400 Hz,
die jeweiligen Anregungswellenlängen und Detektionsbereiche für EGFP und Höchst 33342
finden sich in der unten stehenden Tabelle.
Detektion
Anregung
Detektionsbereich
EGFP
488 nm (Laser)
503-560 nm
Höchst 33342
405 nm (UV-Lampe)
420-480 nm
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5 Material und Methoden
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5.2.4.9 Präparation genomischer DNA aus HeLa Zellen
Die Präparation genomischer DNA erfolgte mit dem QIAamp® DNA Mini Kit aus jeweils
5 x 106 Zellen nach Vorgabe des Herstellers. Die Herstellung einer Zellsuspension sowie die
Bestimmung des Titers erfolgten wie unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3 beschrieben.
5.2.4.10 Messung der Luciferaseaktivität der ALF und ALF-NP Zelllinien
Prinzip
In der vorliegenden Arbeit wurde das luc Reportergen aus Photinus pyralis verwendet.
Dieses kodiert für das Enzym Luciferase, das die Oxidation von D-Luziferin in Gegenwart
von ATP, Sauerstoff und Mg2+ katalysiert. Bei dieser Reaktion wird Licht der Wellenlänge
λ = 562 nm emittiert, was zur Quantifizierung der Luciferaseaktivität verwendet wird (de Wet
et al., 1987).
Experimentelles Vorgehen
Von den zu vermessenden Zellen wurde eine Zellsuspension hergestellt und der Titer
bestimmt (Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3). Für die Aussaat der Zellen
wurde die Suspension auf 2 x 104 Zellen/ml eingestellt und jeweils 1 ml in die Vertiefungen
einer 24-Napfplatte gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurden Dox, Nucleozin bzw.
DMSO in entsprechenden Konzentrationen zugegeben und die Luciferaseaktivität wurde
nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation gemessen.
Herstellung der Zelllysate: Die folgenden Schritte erfolgten unter unsterilen Bedingungen.
Zum entsprechenden Messzeitpunkt wurde das Zellkulturmedium abgesaugt, die Zellen
wurden einmal mit 300 µl PBS gewaschen und anschließend mit 50 µl Lysepuffer für 10 min
bei RT lysiert.
Bestimmung der Proteinkonzentration im Zelllysat: Um die Gesamtproteinmenge der
Zelllysate zu bestimmen, wurden jeweils 10 µl des Zelllysats mit 190 µl deionisiertem Wasser
in einer 48-Napfplatte gemischt. Als Referenz diente ein Ansatz mit 10 µl Lysepuffer. Von
dieser Verdünnung wurden 20 - 80 µl in einer 96-Napf-Flachbodenplatte mit 170 - 230 µl
deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 µl aufgefüllt und mit 50 µl
Roti®-Quant gemischt. Nach 15-minütiger Inkubation bei RT wurde die Absorption bei
λ = 595 nm im TECAN Plattenlesegerät bestimmt. Die Ermittlung der Proteinkonzentration
erfolgte aus dem Vergleich der gemessenen Werte mit einer Kalibriergerade, die mit
definierten Konzentrationen von BSA und der jeweiligen Menge an Lysepuffer erstellt wurde.
- 118 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Messung der Luciferaseaktivität: Für die Messung der Luciferaseaktivität wurden jeweils
10 µl Zelllysat in die Vertiefungen einer weißen LIA 96-Napfplatten pipettiert. Die Messung
der emittierten Lichtquanten bei 562 nm nach Zugabe von 100 µl Messpuffer (Messdauer
10 s) erfolgte in einem Orion II Plattenluminometer. Die auf diese Weise gemessenen Werte
wurden als absolute Lichteinheiten (ALU „absolute light units“) bezeichnet. Die Normierung
der ALU Werte erfolgte durch Division mit der entsprechenden Konzentration an Gesamtprotein des Zelllysates (ALU/µg Protein).
5.2.4.11 siRNA Transfektion
Als Transfektionsreagenz für siRNA diente METAFECTENE® SI wobei die Transfektion
zeitgleich mit der Aussaat der Zellen erfolgt. Die Herstellung der Zellsuspensionen und die
Titerbestimmung erfolgten wie unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3 beschrieben. Je nach Messzeitpunkt der Luciferaseaktivität wurden die Zellsuspensionen auf 4 x 104 Zellen/ml (24 h
Messung), 3 x 104 Zellen/ml (48 h Messung) und 2 x 104 Zellen/ml (72 h Messung) verdünnt.
Im Anschluss erfolgte die Herstellung des Transfektionsansatzes. Hierzu wurde in die
Vertiefungen einer 24-Napfplatte jeweils 60 µl 1x SI Puffer (Biontex, hergestellt aus einem
10x SI Puffer mit RNAse freiem, sterilem Wasser), 2 µl Transfektionsreagenz und
30 pmol siRNA pipettiert und vermischt. Nach 15-minütiger Inkubation wurden 500 µl der
entsprechenden Zellsuspension zum Transfektionsansatz gegeben. Die Messung der
Luciferaseaktivität zum jeweiligen Messzeitpunkt erfolgte wie unter 5.2.4.10 beschrieben.
5.2.4.12 LacZ in situ Färbung
Prinzip
Die LacZ in situ Färbung ermöglicht die mikroskopische Identifizierung β-Galaktosidase
exprimiernder Zellen in einer adhärenten Kultur. Hierbei werden die Zellen fixiert und
anschließend mit dem Farbstoff X-Gal behandelt. Dieser wird von der β-Galaktosidase zu
Galactose und 5-Brom-4-chlor-3-hydroxyindol umgesetzt, das spontan dimerisiert und mit
Sauerstoff zum wasserunlöslichen, blauen 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlor-indigo oxidiert. Somit
färben sich β-Galaktosidase exprimierende Zellen (LacZ positiv) blau, Zellen ohne
Expression der β-Galaktosidase (LacZ negativ) bleiben hingegen farblos (Horwitz et al.,
1964).
Experimentelles Vorgehen
Von den zu testenden Zellen wurde eine Zellsuspension hergestellt und der Titer bestimmt
(Vorgehen beschrieben unter 5.2.4.1 bzw. 5.2.4.3). Für die Aussaat wurde die Suspension
auf 4 x 104 Zellen/ml eingestellt und jeweils 1 ml in die Vertiefungen einer 24-Napfplatte
gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und die
- 119 -
5 Material und Methoden
__________________________________________________________________________
Zellen einmal mit 1 ml PBS gewaschen. Alle folgenden Schritte erfolgten unter unsterilen
Bedingungen. Die Zellen wurden jeweils bei RT für 10 min mit 1 ml Fixierlösung fixiert und
anschließend dreimal mit 500 µl Waschlösung für jeweils 30 min gewaschen. Die Färbung
erfolgte für 16 h bei RT mit 1 ml Färbelösung in einer feuchten Kammer. Die so gefärbten
Zellen wurden anschließend in einem Mikroskop des Typs Axio Scope A1 analysiert und
fotografisch dokumentiert.
5.3 Computerprogramme
Programm
®
Anwendung
®
Adobe Photoshop CS2
®
Microsoft Office Home and Student 2007
Bildbearbeitung
Erstellung von Dokumenten, Graphiken und
Durchführung von Tabellenkalkulationen
pBLAST
Vergleich von Proteinsequenzen
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
siMAX
Auswahl von siRNAs
http://www.eurofinsdna.com
RCSB - Protein Workshop Viewer
Betrachtung von Kristallstrukturen
http://www.pdb.org
GCUA “graphical codon usage analyser”
Analyse des Codongebrauchs von Genen
http://gcua.schoedl.de
®
EndNote X3
Literaturverwaltung
®
Bearbeitung von DNA-Sequenzen
®
Analyse von DNA-Sequenzierungen
DNASTAR Lasergene EditSeq 7.1.0
DNASTAR Lasergene SeqMan Pro 7.1.0
®
Vector NTI Suite 10.3.0
Erstellung von Plasmidkarten und Verwaltung von
Clone Manager 5
Plasmid-Datenbanken sowie
Oligonukleotiddatenbanken
- 120 -
6 Anhang
__________________________________________________________________________
6 ANHANG
6.1 Codongebrauch der mcherry Genvarianten
6.1.1 Die „relative adaptiveness“ als Maß für die Codonfrequenz
Die Frequenz eines Codons in einer Codongebrauchstabelle wird durch dessen
prozentualen Anteil an der Gesamtheit der für eine AS codierenden Codons angegeben. Da
die Anzahl der für eine AS codierenden Codons jedoch nicht konstant ist, können die so
erhaltenen Werte der Codons für verschiedene AS nicht direkt miteinander verglichen
werden. Vor allem bei der Analyse des Codongebrauchs von Gensequenzen ist es von
Vorteil auf einfache Art entscheiden zu können, ob ein Codon mit hoher oder niedriger
verwendet wurde. Aus diesem Grund wurde die „relative adaptiveness“ eingeführt (Sharp et
al., 1987). Hierbei wird dem jeweils häufigsten Codon der Wert 100 % zugeordnet und die
Häufigkeit der anderen, für die gleiche AS kodierenden Codons nach diesem Wert skaliert.
6.1.2 Genvariante mcherry(ha)19
Die Anpassung von mcherry(ha) an den humanen Codongebrauch erfolgte nach der
Vorgabe, dass nach Möglichkeit nur Codons mit der höchsten Frequenz in der humanen
Codongebrauchstabelle verwendet wurden. In der Abbildung 38 findet sich eine grafische
Auswertung des Vergleichs der mcherry(ha) Sequenz mit der humanen Codongebrauchstabelle. Wurde die Sequenz von mcherry(ha) mit der entsprechenden Codongebrauchstabelle für S. cerevisiae verglichen, zeigte sich eine im Durchschnitt mittlere Frequenz der
Codons (Abb. 39). Weiterhin finden sich in mchehrry(ha) nur wenige Codons, die in
S. cerevisiae eine sehr hohe oder sehr niedrige Frequenz besitzen.
6.1.3 Genvariante mcherry(ya)20
Die Anpassung von mcherry(ya) an S. cerevisiae erfolgte im Gegensatz zu mcherry(ha) nicht
durch die Verwendung möglichst häufiger Codons. Stattdessen wurde die Frequenz der
einzelnen Codons in mcherry(ya) an die entsprechende Frequenz im Genom von
S. cerevisiae angepasst (Abb. 40). Durch diese Form der Anpassung entstand eine
Genvariante, die im Vergleich zu mcherry(ha) eine größere Anzahl der in S. cerevisiae
häufigsten Codons sowie eine geringere Anzahl an seltenen Codons beinhaltet (Abb. 41).
Eine Genvariante, die nach der gleichen Vorgabe an S. cerevisiae angepasst wurde wie
mcherry(ha) an den humanen Codongebrauch stand für diese Arbeit nicht zur Verfügung.
19
20
Humanadaptierte Genvariante
An S. cerevisiae adaptierte Genvariante
- 121 -
6 Anhang
__________________________________________________________________________
Abb. 38: Vergleich des
Codongebrauchstabelle
mcherry(ha)
Auf der Ordinate ist die Frequenz
N-Terminus mit dem ersten Codon
Abszisse) als „relative adaptiveness“
Programm GCUA („graphical codon
Gens
mit
der
humanen
der einzelnen Codons beginnend am
nach dem Startcodon (Wert 1 auf der
aufgetragen. Die Grafik wurde mit dem
usage analyser“, http://gcua.schoedl.de)
erstellt.
- 122 -
6 Anhang
__________________________________________________________________________
Abb. 39: Vergleich des mcherry(ha) Gens mit der Codongebrauchstabelle
für S. cerevisiae
Auf der Ordinate ist die Frequenz der einzelnen Codons beginnend am
N-Terminus mit dem ersten Codon nach dem Startcodon (Wert 1 auf der
Abszisse) als „relative adaptiveness“ aufgetragen. Werte ≥ 20 % sind mit
schwarzen Balken, Werte < 20 % sowie ≥ 10 % mit grauen Balken und ein Wert
< 10 % ist mit einem roten Balken dargestellt. Die Grafik wurde mit dem
Programm GCUA („graphical codon usage analyser“, http://gcua.schoedl.de)
erstellt.
- 123 -
6 Anhang
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Abb. 40: Vergleich des Codongebrauchs
Codongebrauchstabelle von S. cerevisiae
in
mcherry(ya)
mit
der
Auf der Ordinate ist der prozentuale Anteil („frequency“) des jeweiligen Codons im
Vergleich zur Gesamtheit aller, für eine AS codierenden Codons in mcherry(ha) (rote
Balken) bzw. dem Genom von S. cerevisiae (schwarze Balken) aufgetragen. Die
Grafik wurde mit dem Programm GCUA („graphical codon usage analyser“,
http://gcua.schoedl.de) erstellt.
- 124 -
6 Anhang
__________________________________________________________________________
Abb. 41: Vergleich des mcherry(ya) Gens mit der Codongebrauchstabelle für
S. cerevisiae
Auf der Ordinate ist die Frequenz der einzelnen Codons beginnend am
N-Terminus mit dem ersten Codon nach dem Startcodon (Wert 1 auf der
Abszisse) als „relative adaptiveness“ aufgetragen. Werte ≥ 20 % sind mit
schwarzen Balken und Werte < 20 % mit grauen Balken dargestellt. Die Grafik
wurde mit dem Programm GCUA („graphical codon usage analyser“,
http://gcua.schoedl.de) erstellt.
- 125 -
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- 141 -
8 Abkürzungsverzeichnis
__________________________________________________________________________
8 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
8.1 Einheiten
8.2 Vorsätze
bp
Basenpaar
M
Mega (10 )
°C
Grad Celsius
k
Kilo (10 )
Da
Dalton
m
Milli (10 )
g
Gramm
µ
Mikro (10 )
h
Stunde
n
Nano (10 )
l
Liter
p
Piko (10 )
m
Meter
f
Femto (10 )
M
molar (mol/l)
mol
Mol
min
Minute
s
Sekunde
U
Einheit der Enzymaktivität
Upm
Umdrehungen pro Minute
V
Volt
W
6
3
-3
-6
-9
-12
-15
8.3 Nomenklatur der Basen und
Nukleoside
Base
Nukleosid
A
Adenin
Adenosin
Watt
C
Cytosin
Cytidin
g
Erdbeschleunigung
G
Guanin
Guanosin
cps
counts per second
T
Thymin
Thymdin
ALU
absolute light units
U
Uracil
Uridin
8.4 Aminosäuren-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarung (1969)
Alanin
Arginin
Ala
Arg
A
R
Asparagin
Aspartat (Asparaginsäure)
Asn
Asp
N
D
Cystein
Cys
C
Glutamin
Glutamat (Glutaminsäure)
Gln
Glu
Q
E
Glycin
Histidin
Gly
His
G
H
Isoleucin
Leucin
Ile
Leu
I
L
Lysin
Lys
K
Methionin
Phenylalanin
Met
Phe
M
F
Prolin
Serin
Pro
Ser
P
S
Threonin
Tryptophan
Thr
Trp
T
W
Tyrosin
Tyr
Y
Valin
Val
V
- 142 -
8 Abkürzungsverzeichnis
__________________________________________________________________________
8.5 Allgemeine Abkürzungen
(E)GFP
(enhanced) green fluorescent
(m)YFP
protein
(monomeric) yellow fluorescent
protein
Abb.
Abbildung
adh1
ALF
Aktivator Luciferase Flp-in™
Amp
AS
Aminosäure
Atc
Anhydrotetrazyklin
ATP
Adenosintriphosphat
BP
bipartite
BSA
Rinderserumalbumin
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
CHO
chinese hamster ovary
CMVIE
immediate early Promotor des
CMVmin
CMV Minimalpromotor
CRM1
chromosome region maintenance
Gen für die
Alkoholdehydrogenase
R
Ampicillinresistenz
Cytomegalie Virus
c-Myc NLS
Kernlokalisationssequenz aus
dem c-Myc Protein
cyc1
factor
Gen für die Cytochrom-C-
DAPI
Oxidase
DMEM
4',6-Diamidino-2phenylindoldihydrochlorid
Dulbecco's Modified Eagle's
DMSO
Dimethylsulfoxid
Medium
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
Dox
Doxyzyklin
DTT
Dithiothreitol
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
et al.
et alii (und andere)
F
Aktivatordomäne aus dem
Herpes simplex Virus
FKS
Fötales Kälberserum
FRT
Flp recognition target
GDP
Guanosindiphosphat
goi
gene of interest
GTP
Guanosintriphosphat
HA
Hämagglutinin
HBV
Hepatitis B Virus
hEF1-HTLV
synthetischer Promotor
HEK293
Human embryonic kidney 293
HLF33
HeLa Luciferase Flp-In™ 33
R
HTS
high throughput screening
Hyg
Hygromycinresistenz
IFN-β
Interferon-β
IPTG
Isopropyl-β-Dthiogalaktopyranosid
R
IRES
internal ribosomal entry site
Kan
Kanamycinresistenz
LacI
lac Repressor
lacZ
Gen für die β-Galaktosidase
LB
Luria-Bertani-Medium
LiAc
Lithiumacetat
LTF
Leertransfektion
luc
Gen für die Luciferase aus
Photinus pyralis
M1, 2
Matrixprotein 1, 2
mCherry7
Trägerprotein-Variante 7
MCS
multiple cloning site
MDCK
Madin Darby canine kidney
met25
Gen für die Homoserin-Synthase
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
Mut
Mutante
NA
Neuraminidase
Neo
Neomycinresistenz
NES
nuclear export sequence
NF-κB
nuclear factor kappa-light-chain-
NP
Nucleoprotein
R
enhancer of activated B cells
ns
Gen für NS1 und NS2
NS1, 2 & 4
Nichtstrukturprotein 1, 2 und 4
ns4ss
Gen für NS4
oDx
optische Dichte bei x nm
- 143 -
8 Abkürzungsverzeichnis
__________________________________________________________________________
ONPG
o-Nitrophenyl-β-D-
P
Promotor
galaktopyranosid
p.A.
pro Analysis
PA
polymerase acidic
PB1 & 2
polymerase basic 1 und 2
PCR
polymerase chain reaction
PEG
Polyethylenglykol
POI
protein of interest
R
PolyA
Polyadenylierung
Puro
Ran-GAP
Ran GTPase aktivierenden
Protein
rev
revers
RNA
Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
rtTS
reverser Tetrazyklin-abhängiger
Transsilencer
S. cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
siRNA
small interfering Ribonukleinsäure
ss
splice site
Ssn6
Repressordomäne aus S.
SV40 NLS
Kernlokalisationssequenz aus
cerevisiae
Puromycinresistenz
dem Simianen Virus 40
Tab.
Tabelle
Tc
Tetrazyklin
TetR
Tetrazyklin-Repressor
TIP
TetR-induzierendes Peptid
Tn
Transposon
TRE
Tet responsive element
Tris
Tris(hydroxymethyl)-
tRNA
transfer Ribonukleinsäure
aminomethan
TrxA
Thioredoxin A
tTA
Tetrazyklin-abhängiger
Transaktivator
tTR
Tetrazyklin-abhängiger
tTS
Tetrazyklin-abhängiger
Transregulator
Transsilencer
uspRNA
unspezifische RNA
UV
ultraviolett
v
Volumen
w
Gewicht, Masse
w/o
without
WHO
Weltgesundheitsorganisation
wt
Wildtyp
X-Gal
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-βgalaktopyranosid
Zeocin
λem
™R
Zeocinresistenz
β-Gal
β-Galaktosidase
Emissionswellenlänge
λex
Anregungswellenlänge
- 144 -