Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (A070)

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Abteilung A070
Molekulare Biologie der Mitose
Abteilung Molekulare Biologie der Mitose (A070)
Leiter Prof. Dr. Herwig Ponstingl
Systematische Analyse der
Genexpressionsmuster in Ovarialkarzinomen
Wissenschaftliche Mitarbeiter
Priv.-Doz. Dr. Ralf Bischoff
Dr. Simon Fernandez (BMBF)
Dipl.-Ing Klaus Leibe (BMBF)
Dr. Hans-Peter Zimmermann
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H.-P. Zimmermann, K. Dellas-Kloor, H. Ponstingl
Gastwissenschaftler
Dr. Alexander Marmé, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg
Dr. Mikael Sjölinder, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden
Doktoranden
Katrin Dellas-Kloor
Lilia Schleicher (DFG)
Alexander Nesterov
In Zusammenarbeit mit G.. Moldenhauer, Abt. Molekulare
Immunologie, M. Schorpp-Kistner, Abt. Signaltransduktion und
Wachstumsregulation, Eberhard Spiess, Abt. Modellversuche zur
Invasion und Metastasierung, alle DKFZ; A. Marmé, M. Lindner,
G. Bastert, Universitäts-Frauenklinik Heidelberg.
Ovarialkarzinome sind die gefährlichsten unter den gynäkologischen Tumoren, da sie ohne charakteristische Frühsymptome sind und in der Regel erst in Spätstadien erkannt werden. In Zusammenarbeit mit der UniversitätsFrauenklinik Heidelberg vergleichen wir deshalb die Genexpressionsmuster von Tumorzellen und gesunden Epithelzellen jeweils derselben Patientin. Anhand wiederkehrender Merkmale werden diese Tumoren molekularbiologisch
charakterisiert, mit dem Ziel, neue Kennzeichen von diagnostischer Bedeutung zu finden, die molekularen Ursachen der Tumorentwicklung zu verstehen und der Therapie neue Möglichkeiten zu eröffnen.
Techniker
Claudia Dallner
Antje Koppe
Jürgen Kretschmer
Brigitte Seib (½)
Sekretariat
Sabine Hughes (½)
Die Forschungsarbeiten der Abteilung haben zum Ziel:
• Die Identifizierung neuer Tumormarker, Tumorsuppressoren und therapeutischer Zielmoleküle durch systematische Analyse von Gen-Expressionsprofilen.
• Die Entwicklung hochkomplexer Peptid-Arrays zu diagnostischen Zwecken und zur Suche nach therapeutischen Wirkstoffen.
• Die Aufklärung des Transports von Makromolekülen in
der Zelle, um Transportwege therapeutisch zu nutzen
und um zu verstehen, wie Transportdefekte zur Entwicklung von Tumoren beitragen.
Das Differential Display ist das bisher empfindlichste Verfahren zur systematischen Analyse von Unterschieden in der
Genexpression. Es erlaubt in der Form von cDNA-Fragmenten den Vergleich, die Identifizierung und die Isolierung von mRNAs, die in Tumorzellen erheblich stärker oder
geringer repräsentiert sind als in den entsprechenden gesunden Zellen. Zellen werden aus cystisch wachsenden
Tumoren und aus Normalepithel durch Abstrich aus frischem
Operationsmaterial und durch lasergestützte Mikrodissektion
aus Gewebeschnitten gewonnen. Dann wird die mRNA
aus den Zellen isoliert und in cDNA umgeschrieben, die als
Matrize für die Herstellung von cDNA-Fragmenten durch
PCR dient. Um dabei Fehler auszuschließen, wird parallel
jeder Versuch mehrfach durchgeführt. Die Fragmente werden der Größe nach aufgetrennt und geben einen Überblick über die Gene, die in den verglichenen Zellen exprimiert sind. Fragmente, die im Vergleich zu Normalzellen
reproduzierbar mindestens eine Größenordnung über- oder
unterrepräsentiert sind, werden kloniert und sequenziert.
Die Ergebnisse werden durch unabhängige Kontrollversuche
mit anderen, für das jeweilige Gen spezifischen Primern am
gleichen Ausgangsmaterial beglaubigt. Die anfangs erhaltenen cDNA-Fragmente werden dann zu vollständigen offenen
Leserastern ergänzt. Durch Northern-Blot-Analyse, Cancer
Profiling Arrays mit cDNA aus Tumor- und Epithel-Gewebepaaren derselben Patientin und durch Hybridisierung an
Gewebeschnitten in situ werden die Resultate nochmals
unabhängig kontrolliert. Dabei erwiesen sich einige der so
charakterisierten Gene nicht nur in Ovarialtumoren, sondern
auch in den Karzinomen anderer Epithelien als dereguliert.
Abb. 1 Cancer Profiling Array für Gen 24C/G1/1.
Es wurde jeweils links gesamte cDNA aus dem Normalgewebe
(N)einer Patientin und rechts gleich viel gesamte cDNA aus dem
Tumor (T) derselben Patientin aufgetragen. Mit einer radioaktiven
genspezifischen Sonde wurde die Expression des Gens 24C/G1/1
bestimmt. Es ist in den meisten Ovar- und Lungentumoren
überexprimiert.
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Zell- und Tumorbiologie
Wir haben zunächst sechs Gene für die weitere Analyse
ausgewählt. Um in ihre weitgehend unbekannten Funktionen Einblick zu erhalten, schalten wir sie durch RNAi in
geeigneten Zellinien aus, suchen mit 2-Hybrid-Screens nach
Bindungspartnern, und prüfen rekombinant exprimierte einzelne Proteindomänen auf ihre biochemischen Eigenschaften.
Um diagnostisch brauchbare Marker zu erhalten [1,2],
müssen Expressionsunterschiede rasch und an möglichst
vielen Patientinnen bestimmt und mit den histopathologischen Befunden und dem klinischen Verlauf der Erkrankung
verknüpft werden. Dazu produzieren wir die codierten Proteine rekombinant in Bakterienzellen und gewinnen gegen
sie gerichtete Antikörper, die zur immunhistologischen Färbung von Gewebeschnitten eingesetzt werden.
Hochkomplexe diagnostische Peptidarrays
F. R. Bischoff, S. Fernandez, K. Leibe, A. Nesterov
In Zusammenarbeit mit Frank Breitling; Thomas Felgenhauer,
Mario Beyer, Annemarie Poustka, Volker Stadler, Abteilung
Molekulare Genomanalyse, DKFZ.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung hochkomplexer
Peptidarrays entwickelt, das auf einem modifizierten Laserdrucker beruht, der statt des normalen Farbtoners Partikel
druckt, in welche die aktivierten Aminosäuren für die Peptidsynthese eingebettet sind. Durch Erwärmen werden die
Partikel geschmolzen, die darin eingeschlossenen Monomere
freigesetzt und die Kopplungsreaktion gestartet. Durch
wiederholte Merryfield-Zyklen von Koppeln, Waschen und
Abspalten der Schutzgruppe kann eine große Zahl unterschiedlicher Peptide gleichzeitig auf einer Trägerfolie synthetisiert werden. Die Möglichkeit, alle Teilschritte der Synthese, auch die Verdampfung des Lösungsmittels, kontrollieren zu können, ergibt ein einfaches, robustes, schnelles,
preiswertes und gegenüber dem bisherigen Stand der
Technik bedeutend verbessertes Verfahren zur Herstellung
komplexer Peptidarrays.
Arrays dieser Art können z.B. dazu benutzt werden, den
Antikörperstatus von Patienten zu bestimmen. Durch die
Analyse von Peptidbibliotheken, welche die Proteome von
Krankheitserregern oder das des Menschen repräsentieren, erhoffen wir Färbemuster zu erhalten, die uns Status
und Verlauf von Krankheiten anzeigen. Ferner können mit
den Arrays Substrate von Proteinkinasen gesucht werden,
wobei etwa 100 000 Peptide 1000 menschliche Genprodukte als überlappende Peptide repräsentieren. Sobald
man diese Substrate identifiziert hat, kann ein entsprechender Array von Kinase-Substraten aktive Signalwege in verschiedenen Geweben oder Zellinien nachweisen.
Bisher haben wir 15 Aminosäure-„Toner“ entwickelt, die in
einer Dichte von >100 000 Spots pro 20 x 20 cm auf
Abb. 2: Selektive Toner-Ablagerung auf einem Chip mit Elektroden von 100 x 100 µm
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einen festen Träger aufgedruckt werden können. Zusammen mit dem modifizierten Farb-Laserdrucker, der am Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung
entwickelt wird, sollte die Synthese hochkomplexer
Peptidarrays (>100 000 Peptide pro Blatt von 20 x 20 cm)
demnächst möglich sein.
Als Alternative zum Laserdrucker benutzen wir einen Chip,
um Toner-Partikel selektiv auf definierte Flächen von 100 x
100 µm aufzubringen [3]. Dieses Verfahren sollte es ermöglichen, noch deutlich mehr verschiedene Peptide auf einer
kleinen Fläche zu synthetisieren.
Der Ran-Signalweg im intrazellulären Transport
F.R. Bischoff, M. Sjölinder, L. Schleicher, H. Ponstingl
In Zusammenarbeit mit E. Hurt, Biochemiezentrum der Universität
Heidelberg; C. Granzow und M. Kopun-Granzow, Abt. Molekulare
Toxikologie, DKFZ.
Die kleine GTPase Ran regelt mit ihren Kontrollfaktoren
und Bindungspartnern den Transport von Proteinen und
RNA durch die Porenkomplexe der Kernmembran. Zahlreiche
Proteine binden spezifisch die aktive Form, RanGTP. Wir
haben die Hauptkomponenten des Systems und mehrere
Transportfaktoren aus menschlichen Zellen und aus Hefe
isoliert und die Rolle von Ran bei der Bildung von Transportkomplexen am Ausgangspunkt und ihrer Dissoziation am
Ziel untersucht. Ran liegt auf der cytoplasmatischen Seite
der Kernmembran vorwiegend als inaktives RanGDP vor, im
Kern hingegen als aktives RanGTP. RanGAP, ein Aktivator
der Nukleotidhydrolyse, ist verantwortlich für die Inaktivierung im Cytoplasma, die Aktivierung im Kern bewirkt ein
Nukleotidaustauschfaktor, RCC1.
Die Transportfaktoren reagieren auf die Anwesenheit oder
Abwesenheit von RanGTP, indem sie mit der Fracht beladen werden oder sie durch Dissoziation der Transportkomplexe „abladen“. Importine und Exportine verhalten sich dabei gegensätzlich: Frachtproteine im Cytoplasma mit einem klassischen Kernlokalisations-Signal binden in
Abwesenheit von RanGTP über einen von mehreren
Importin-α-Adaptoren an Importin-β, das für den eigentlichen Import zuständig ist. Die Translokation durch die Kernpore folgt einem bisher ungeklärten Mechanismus, der offenbar ohne Nukleotidhydrolyse auskommt. Im Kern wird
der Import durch Dissoziation des importierten Komplexes
beendet. RanGTP bindet mit hoher Affinität an Importin-β
oder einen der verwandten Importfaktoren und löst dort
eine Konformationsänderung aus, die Importin-α und Substrat freisetzt. Gleichzeitig wird dadurch die Rückbildung
der Import-Komplexe verhindert.
Im Gegensatz zu den Importinen binden Exportine ihre
Frachten im Kern unter Ausbildung eines Komplexes mit
RanGTP. Dieser sehr feste Exportkomplex wird ohne Hydrolyse des gebundenen GTP ins Cytoplasma befördert. Dort
sind exportierte Komplexe zunächst nicht für die Stimulation der GTP-Hydrolyse durch RanGAP1 zugänglich. Hier greifen das kleine cytoplasmatische RanBP1 und das RanBP2
der cytoplasmatischen Fasern an den Kernporen ein: Sie
binden an RanGTP an einer anderen Stelle als die Transportfaktoren und ändern die Gestalt des Exportkomplexes. Nun
erst wird die Hydrolyse des Ran-gebundenen GTP durch
RanGAP1 stimuliert, das frei im Cytoplasma vorkommt oder
über ein Peptid SUMO-1 an RanBP2 gebunden ist. Die GTPHydrolyse verhindert, daß sich der exportierte Komplex
wieder zurückbildet, denn die Transportfaktoren haben nur
eine sehr geringe Affinität für RanGDP. Damit sind die be-
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teiligten Faktoren wieder für eine neue Transportrunde bereit. RanGDP wird durch einen besonderen Importfaktor
NTF2 in den Kern zurückgebracht, um dort durch Nukleotidaustausch an RCC1 aktiviert zu werden.
Publikationen und Patente (* = externer Koautor)
Während RanBP1 und RanBP2 auf der cytoplasmatischen
Seite der Kernpore aktiv sind, haben wir im Zellkern das
RanBP1-ähnliche Protein RanBP3 gefunden, das die Bildung
von Exportkomplexen steuert. Um die Funktion dieses Proteins im Detail zu klären, suchen wir in 2-Hybrid-Screens
nach Bindungspartnern. In S. cerevisiae haben Braunwarth
et al. [4] ein Protein Yrb30p gefunden, das an dieselbe
Stelle von RanGTP bindet, wie RanBP1, aber die RanGAPvermittelte GTP-Hydrolyse hemmt, statt stimuliert. Es könnte sich um einen neuen, hefespezifischen Regulator des
Ran-abhängigen Transports handeln.
[2] Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A. , Moldenhauer,
G., *Bastert, G., Kurek, R., Wallwiener, D. DROP1, a novel
marker for carcinomas. Europäische Patentanmeldung 03 007
680.6 03.04.2003
RanGTP wird nur durch chromatingebundenes RCC1 im Kern
regeneriert. Auf der Suche nach einem weiteren Nukleotidaustauschfaktor identifizierten wir DelGEF, ein humanes
Homologes zu RCC1. Es wird im Chromosomenabschnitt
11p14 codiert, auf dem man ein Gen für erbliche Formen
von Taubheit und Retinitis pigmentosa vermutet. Trotz der
ähnlichen Struktur kann es Ran nicht aktivieren. Statt dessen
bindet es an das Protein Sec5 des Exocysten und reguliert
die Sekretion von Proteinen aus der Zelle [5]. Einen weiteren Bindungspartner, der offenbar an demselben Vorgang
beteiligt ist, haben wir in DelGIP1, einem sauren Protein
von nur 82 Aminosäureresten identifiziert [6]. Es ist anscheinend in allen Eukaryonten vorhanden, seine Struktur ist
hoch konserviert.
RCC1 und RanGTP spielen auch in der Zellteilung beim Aufbau der Mitosespindel unabhängig vom Kerntransport eine
Rolle. Die Hauptkomponenten der Mitosespindel, die Tubuline, binden Cytostatika vom Typ der klinisch verwendeten
Vinca-Alkaloide und der Taxane. Erstere stören den Aufbau der Mikrotubuli und leiten den Zelltod durch Apoptose
ein. Häufig entwickeln Tumoren Chemoresistenz gegen
diese Substanzen, die dann von Pumpen in der Zellmembran sofort wieder ausgeschleust werden. Wir haben einen Weg gefunden, diesen Typ der Resistenz aufzuheben,
indem wir einen lichtempfindlichen Abkömmling der VincaCytostatika, NAPAVIN, synthetisierten, der in den Zellen
nach Belichtung mit einem Laser an den Zielmolekülen fest
verankert wird und für die Membranpumpen unzugänglich
bleibt. Nach einem Verfahren von C. Granzow und M.
Granzow-Kopun [7-9] werden die Pumpen vor der Belichtung blockiert, sodaß nach einmaliger Behandlung für längere Zeit ein hoher intrazellulärer Spiegel des Cytostatikums
erhalten bleibt.
[1] Dellas-Kloor, K., Ponstingl, H., Zimmermann, H.-P., Marmé, A.
DHHC1, a novel marker for epithelial tumors. Europäische
Patentanmeldung 02 005 445.8 vom 08.03. 2002
[3] Breitling, F. , Breitling, F., Felgenhauer, Th., Fernandez, S.,
Leibe, K., Beyer, M., Stadler, V., Bischoff, F.R. & Poustka, A.
(2002) Hochkomplexe Peptidarrays auf Computerchips.
Transkript Laborwelt 2002/ III, p.4-6.
[4] Braunwarth, A., Fromont-Racine, M., Legrain, P., Bischoff,
F.R., Gerstberger, T., Hurt, E. & Künzler, M. (2003) Identification
and characterization of a novel RanGTP-binding protein in the
yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 278, 1539715405.
[5] Sjölinder, M., Uhlmann, J. & Ponstingl, H. (2002) DelGEF, a
homologue of the Ran guanine nucleotide exchange factor
RanGEF, binds to the exocyst component Sec5 and modulates
secretion. FEBS L. 532, 211-215.
[6] Sjölinder, M., Uhlmann, J. & Ponstingl, H. (2004)
Characterisation of an evolutionary conserved protein interacting with the putative guanine nucleotide exchange factor DelGEF
and modulating secretion. Exper. Cell Res. 294, 68-76.
[7] Granzow, C., Ponstingl, H. Hefft, I., Kopun-Granzow, M.,
Gros, G., Stöhr. M. Pharmaceutical composition for eliminating
membrane mediated cell resistance. US-Patent 6,376,224 erteilt
am 23.04.2002.
[8] Granzow, C., Ponstingl, H. Hefft, I., Kopun-Granzow, M.,
Gros, G., Stöhr. M. Pharmaceutical composition for eliminating
membrane mediated cell resistance. Patentanmeldung Japan
10_540033 (2003).
[9] Granzow, C., Ponstingl, H. Hefft, I., Kopun-Granzow, M.,
Gros, G., Stöhr. M. Pharmazeutische Zusammensetzung zur
Aufhebung der membranvermittelten Resistenz von Zellen.
Europäisches Patent 0 967 997 erteilt am 19.11.2003
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