Importin 13 — Eine Rundreise durch die Kernpore Importin 13 — a

Jahrbuch 2013/2014 | Bono, Fulvia | Importin 13 — Eine Rundreise durch die Kernpore
Importin 13 — Eine Rundreise durch die Kernpore
Importin 13 — a round trip through the nuclear pore
Bono, Fulvia
Max-Planck-Institut für Entw icklungsbiologie, Tübingen
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
In eukaryotischen Zellen befindet sich die DNA im Zellkern, w o auch die RNA-Transkription erfolgt, w ährend die
Protein-Biosynthese im Zytoplasma stattfindet. Zellkern und Zytoplasma sind durch Kernporen miteinander
verbunden und der Transport von Makromolekülen w ird durch spezielle Transport-Proteine, die Karyopherine,
vermittelt. Die meisten Karyopherine befördern ihre Fracht (Kargos) nur in eine Richtung: in den Zellkern
(Importine) oder heraus (Exportine). Importin 13 aber ist ein besonderes Karyopherin, das Kargo im- als auch
exportieren kann; es agiert als bidirektionaler Transporter.
Summary
In eukaryotic cells DNA and transcription of RNAs are separated from protein biosynthesis occurring in the
cytoplasm. Nucleus and cytoplasm are only connected via the nuclear pores. Transport betw een the
compartments is aided by dedicated shuttling proteins, the karyopherins. Most karyopherins carry cargo only
in one direction, either into (importins) or out of the nucleus (exportins), and then return empty handed.
Importin 13 is an unusual karyopherin that can both import and export cargo. Our w ork revealed how Imp13
recognizes its cargoes and functions as a bidirectional transport factor.
Nukleozytoplasmatischer Transport: Regeln und Ausnahmen
In eukaryotischen Zellen organisieren komplexe Prozesse den Transport von Organellen und Makromolekülen
im Zellinneren. Unser Interesse gilt der Erforschung der Mechanismen, die dem Transport von Makromolekülen
zu Grunde liegen. Dazu gehört auch die Beförderung von Proteinen zw ischen Zellkern und Zytoplasma. Die
spezielle makromolekulare Zusammensetzung des Zellkerns w ird durch einen aktiven Transport durch die
Kernporen aufrechterhalten. Dabei w ird die Transportrichtung durch einen molekularen Schalter – das Protein
Ran – definiert. Ran tritt in zw ei Zuständen auf, die durch die Bindung von GTP (RanGTP) oder GDP (RanGDP)
bestimmt w erden. RanGTP ist im Zellkern in hoher Konzentration vertreten, da DNA-gebundene Proteine zum
Austausch von GDP durch GTP führen. Umgekehrt ist die RanGTP-Konzentration im Zytoplasma gering, w eil GTP
direkt beim Austritt aus dem Zellkern zu GDP hydrolysiert w ird [1].
Der Transport zw ischen Zellkern und Zytoplasma erfolgt überw iegend – mit der Ausnahme des mRNA-Exports
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– durch Karyopherine [1]. Sie sind in der Lage, gezielt ihre Fracht (Kargos) zu binden und diese durch
Spaghetti-ähnliche Hindernisse, die die Innenseite der Kernporen auskleiden, zu befördern. Karyopherine
gleiten dabei durch diese Hindernisse w ie durch ölige Spaghetti hindurch, w ährend andere Proteine, die eine
bestimmte
Größe
überschreiten, ausgeschlossen
w erden
- sofern
sie
nicht von
einem Karyopherin
transportiert w erden.
Karyopherine
haben
keine
Richtungspräferenz.
Ihre
Transportrichtung
w ird
vielmehr
durch
RanGTP
vorgegeben. Bei einigen Karyopherinen löst RanGTP die Bindung mit dem Kargo, sobald der Transportkomplex
in den Zellkern eindringt. Solche Karyopherine w erden als Importine bezeichnet. Andere Karyopherine können
nur ihr Kargo binden, w enn sich RanGTP bei der Bindung beteiligt. Diese trimeren Komplexe, bestehend aus
Karyopherin, Kargo und RanGTP, können so den Zellkern verlassen. Im Zytoplasma w ird das gebundene GTP
von Ran zu GDP hydrolisiert, w as zeitgleich den Komplex in seine Einzelteile zerfallen lässt. Karyopherine, die
auf diese W eise funktionieren, w erden als Exportine bezeichnet [1].
Die eindeutige Unterteilung von Karyopherinen in Importine und Exportine w urde allerdings durch die
Entdeckung von bidirektionalen Karyopherinen in Frage gestellt. Verw irrend an dieser Entdeckung w ar die
Tatsache, dass RanGTP Importine und Exportine in entgegengesetzter Weise reguliert. W ie ist es möglich,
dass ein einzelnes Karyopherin mit RanGTP auf zw ei unterschiedliche Arten interagieren kann, indem es
nämlich entw eder seine Kargo-Bindung stimuliert oder aber seine Kargo-Freisetzung initiiert? Nur die
gründliche strukturelle Untersuchung von einem bidirektionalen Karyopherin und dessen Interaktion mit
RanGTP sow ie Import- und Export-Kargo könnte eine Erklärung für dieses Rätsel liefern.
Bidirektionaler Transporter: Importin 13
W ir haben uns intensiv mit einem der w enigen bekannten bidirektionalen Transporter, Importin 13 (Imp13),
beschäftigt. Imp13 w urde zuerst in humanen Zellen entdeckt, w o es zw ei Proteine eines dynamischen
Proteinkomplexes, des Exon-Junction-Complex (EJC) [2], importiert und außerdem ein an der Translation
beteiligtes Protein, eIF1A, exportiert. Um zu verstehen, w ie Imp13 als bidirektionaler Transporter arbeiten
kann, haben w ir eine umfassende Strukturanalyse von mehreren seiner Komplexe durchgeführt (Abb. 1).
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A bb. 1: Im p13-Zyk lus. Die sche m a tische Da rste llung ze igt die
dyna m ische n Inte ra k tione n, die zwische n Im p13 und se ine n
P a rtne rprote ine n in de r Ze lle sta ttfinde n. Im p13 nim m t im
Zytopla sm a im unge bunde ne n Zusta nd e ine offe ne
Konform a tion a n, die die Bindung m it de n Im port-Ka rgos
e rle ichte rn k önnte . In de n Im portk om ple x e n m it Ma go-Y14
ode r Ubc9 be hä lt Im p13 e ine re la tiv offe ne Konform a tion und
wa nde rt durch die Ke rnpore in de n Ze llk e rn. Hie r förde rn die
hohe Konze ntra tion und die hocha ffine Bindung von R a nGTP
a n Im p13 die Abga be de r Im port-Ka rgos. Y14-Ma go ist da nn
fre i und k a nn a ls EJC in e in m R NP (messenger ribonucleoprotein
particle) e inge ba ut we rde n, wä hre nd Ubc9 die SUMO ylie rung
vie le r P rote ine im Ze llk e rn förde rt. Im binä re n Kom ple x m it
R a nGTP nim m t Im p13 e ine k om pa k te Konform a tion a n, die
da s Andock e n von e IF1A be günstigt. Eine le ichte Ö ffnung de r
Im p13-Konform a tion a n se ine m C -te rm ina le n Ende e rm öglicht
die Aufna hm e von e IF1A Se ite a n Se ite m it R a nGTP . De r
trim e re Ex portk om ple x pa ssie rt die NP C s und da s Ex portKa rgo wird na ch de r Hydrolyse von R a nGTP im Zytopla sm a
fre ige la sse n.
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--- Trenner --W ir haben die Strukturen von Imp13 zusammen mit zw ei verschiedenen Import-Kargos ermittelt. Zuerst w urde
die Struktur des trimeren Komplex aus Imp13 und dem dimeren Kargo Y14-Mago, die Bestandteile des EJC
sind, gelöst [3]. Imp13 ist für deren Rückführung in den Zellkern zuständig, um dort den Zusammenbau des
EJC auf mRNA-Molekülen zu ermöglichen [1, 3]. Darüber hinaus haben w ir die Struktur von Imp13 mit Ubc9,
einem w eiteren Import-Kargo, aufgeklärt [4]. Ubc9 ist ein w ichtiger Akteur innerhalb eines Signalw egs, der das
Protein Sumo an bestimmte Proteine im Zellkern anheftet (Sumoylierungs-Signalw eg). Schließlich ermittelten
w ir die Struktur von Imp13 im Komplex mit einem seiner Export-Kargos und RanGTP [5].
Konformative Transportsignale
Die Schnappschüsse dieser Komplexe lieferten w ichtige Einblicke in die Arbeitsw eise der Kargo-Erkennung.
Imp13 erkennt seine Kargos durch einen Mechanismus, der sich von anderen Karyopherinen unterscheidet, die
überw iegend lineare Motive als Transportsignale erkennen. Zum Beispiel erkennt Importin-Beta viele seiner
Kargos über ein Adaptorprotein, Importin-Alpha, das kurze lineare Motive basischer Aminosäuren als ZellkernLokalisierungssignal (nuclear localization signals - NLSs) in seinen Kargos erkennt [1].
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Dagegen haben unsere Struktur- und Mutationsanalysen ergeben, dass Imp13 seine Kargos durch Interaktion
mit etlichen geladenen und polaren Aminosäuren erkennt, die über die Kargo-Oberfläche verteilt sind und so
die gesamte Faltung des Proteins feststellen können. Die besondere Erkennung von Kargos durch Imp13
stützt sich also auf eine Kombination aus Form und Ladung, die mit speziellen Kontakten an konservierten
Positionen verbunden sind. Das gilt sow ohl für die Import-Kargos Ubc9 und Mago-Y14 als auch für das ExportKargo eIF1A [3, 4, 5]. Diese komplexen Lokalisierungssignale unterscheiden sich deutlich von den linearen
NLS- und NES- (nukleäre Exportsignale) Sequenzen, die von anderen Karyopherinen w ie Importin-Beta,
Transportin und Crm1 erkannt w erden.
Importin 13: Zwei-Wege-Zyklus
W ir haben außerdem die Struktur von Imp13 allein [5] und im Komplex mit RanGTP aufgeklärt [3]. Mit Hilfe
dieser Strukturen konnte der gesamte Transportzyklus von Imp13, einschließlich eines Import- und eines
Exportschrittes rekonstruiert w erden. Imp13 bindet zunächst im Zytoplasma ein Import-Kargo mit seiner
konkaven Innenseite. Nach dem Transport in den Zellkern trifft der Komplex auf eine hohe Konzentration von
RanGTP. Aufgrund der hohen Affinität zu Imp13 bindet RanGTP effizient und verdrängt dabei das Import-Kargo
aus dem Komplex. Das Import-Kargo und RanGTP sind aufgrund sterischer Hinderung nicht in der Lage,
gleichzeitig zu binden. Der Imp13-RanGTP-Komplex kann dann ein eIF1A-Molekül aufnehmen, das im
Gegensatz zu einem Import-Kargo klein genug ist, an Imp13 zu binden, ohne mit RanGTP zu kollidieren.
RanGTP bildet sogar komplementär geladene Interaktionen mit eIF1A, die den Komplex stabilisieren. Im
Zytoplasma resultiert die Umw andlung von RanGTP in RanGDP in der Dissoziation des Komplexes. Jetzt ist
freies Imp13 bereit, ein w eiteres Import-Kargo aufzunehmen.
Die fünf Schnappschüsse der unterschiedlichen Zustände, die w ir erhielten, haben den Transportzyklus
vervollständigt und gezeigt, dass Imp13 w ährend des gesamten Zyklus markante Konformationsänderungen
durchläuft. Im ungebundenen, zytoplasmatischen Zustand nimmt Imp13 eine offene Konformation ein. Imp13
w eist auch bei der Bindung von Mago-Y14 und Ubc9 eine erw eiterte Konformation auf. Die Bindung von
RanGTP führt zu einer kompakten, ringartigen Konformation von Imp13. Im Komplex mit RanGTP und eIF1A
bew egen sich lediglich beide Enden von Imp13 leicht auseinander, w odurch das Export-Kargo binden kann
und die relativ kompakte Konformation von Imp13 erhalten bleibt.
Diese konformative Flexibilität und die Verw endung von unterschiedlichen Oberflächen für die Bindung von
verschiedenen Kargos liefern eine Erklärung dafür, w ie Imp13 verschiendene Kargos aufnehmen kann und
dabei in entgegengesetzter Weise durch RanGTP reguliert w ird, w odurch es sow ohl beim Im- als auch beim
Export fungieren kann.
Ausblick
Zusammenfassend kann festgehalten w erden, dass Imp13 ein vielseitiges Transportprotein ist, das durch
komplexe konformative Signale sehr unterschiedliche Kargos erkennt. Die Bindung seiner Kargos ist entw eder
gleichzeitig oder antagonistisch mit RanGTP, w odurch Imp13 als bidirektionaler Transportfaktor agieren kann.
Die Kombination aus konformativer Flexibilität und komplexer Kargo-Erkennung ist ein Mechanismus, der von
anderen Karyopherinen ebenfalls genutzt w erden könnte. Dies deutet darauf hin, dass das Spektrum an
bidirektionalen Karyopherinen vielleicht größer ist als bisher angenommen.
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Literaturhinweise
[1] Cook, A.; Bono, F.; Jinek, M.; Conti, E.
Structural biology of nucleo-cytoplasmic transport
Annual Review of Biochemistry 76, 647-671 (2007)
[2] Bono F.; Gehring N.
Assembly, disassembly and recycling: The dynamics of exon junction complexes
RNA Biology 8, 1-6 (2011)
[3] Bono, F.; Cook, A.; Grünwald, M.; Ebert, J.; Conti, E.
Nuclear import mechanism of the EJC components Mago-Y 14 revealed by structural studies of Importin
13
Molecular Cell 37, 211-222 (2010)
[4] Grünwald M.; Bono F.
Structure of Importin13-Ubc9 complex: nuclear import and release of a key regulator of sumoylation
The EMBO Journal 30, 427-438 (2011)
[5] Grünwald, M.; Lazzaretti, D.; Bono, F.
Structural basis for the nuclear export activity of Importin13
The EMBO Journal 32, 899-913 (2013)
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