Einführung in die enzymatische Diagnostik (2

1/23/2017
Vom Molekül zur Zelle
Block 3
Seminar / Praktikum 2
Die 2. Übung findet im Übungssaal I, Währingerstraße 10 1. Stock, rechts statt.
Georg Weitzer, Ernst Müllner
Department für Medizinische Biochemie
Medizinische Universität Wien, Jan 2017
2016
Enzymatische Reaktionen
https://www.google.at/search?q=model+enzymatic+reaction&biw=1498&bih=916&tbm=isch&tbo=u&source=univ&sa=X&ved=0ahUKEwjt1ZCxn6vKAhVH1hQKHeeACYkQsAQIJg#imgrc=FhjOKoBeaEkxJM%3A
Laktose
Glukose
Galaktose
ß-Galaktosidase vom Lac Z Gen in E. coli
https://www.google.at/search?q=model+enzymatic+reaction&biw=1498&bih=916&tbm=isch&imgil=FhjOKoBeaEkxJM%253A%253BXAx8mf-ucQSvPM%253Bhttps%25253A%25252F%25252Fcommons.
wikimedia.org%25252Fwiki%25252FFile%25253AInduced_fit_diagram.svg&source=iu&pf=m&fir=FhjOKoBeaEkxJM%253A%252CXAx8mf-ucQSvPM%252C_&usg=__WhKzyJoUP4X8vdYrPh0v5v7iZPc
%3D&ved=0ahUKEwjt1ZCxn6vKAhVH1hQKHeeACYkQyjcIMA&ei=GZmYVq3lOcesU-eBpsgI#imgrc=FTxBeIzOO7jiMM%3A&usg=__WhKzyJoUP4X8vdYrPh0v5v7iZPc%3D
https://www.google.at/search?q=model+enzymatic+reaction&biw=1498&bih=916&tbm=isch&imgil=FhjOKoBeaEkxJM%253A%253BXAx8mf-ucQSvPM%253Bhttps%25253A%25252F%25252Fcommons.wikimedia.org%25252Fwiki%25252FFile%25253AInduced_fit_diagram.svg&source=iu&pf=m&fir=FhjOKoBeaEkxJ
M%253A%252CXAx8mf-ucQSvPM%252C_&usg=__WhKzyJoUP4X8vdYrPh0v5v7iZPc%3D&ved=0ahUKEwjt1ZCxn6vKAhVH1hQKHeeACYkQyjcIMA&ei=GZmYVq3lOcesU-eBpsgI#imgrc=P7ne2Qfvv8hYRM%3A&usg=__WhKzyJoUP4X8vdYrPh0v5v7iZPc%3D
Georg Weitzer, MUW
2016
1
1/23/2017
Enymatische Methoden
Enzymatische Reaktionen
•
•
•
•
Enzym
=
E
Substrat =
S
Produkt =
P
Coenzym (Cosubstrat) =
E +S
ES
E + S + CoE
EP
ES-CoE
Langsamste = geschwindigkeitsbestimmende
Teilreaktion
CoE
E+P
EP-CoE´
E + P + CoE´
Coenzym wird verändert (CoE, CoE’), wird aber in einer anderen
Reaktion recyclet, daher auch der Name “Cosubstrat
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2017
Was Sie wissen sollten:
Aktivität von Enzymen (Biokatalysatoren)
wird beeinflusst durch
• pH- Wert (Optimum, aber auch Denaturierung)
• Temperatur (Optimum, aber auch Denaturierung)
• Hemmstoffe (in der Medizin: Medikamente!)
– kompetitive (erhöhen den Km Wert)
– nicht-kompetitive
Anmerkung: bei der kompetitiven Hemmung konkurrieren ein Agonist
(Substrat) und ein Antagonist (Hemmstoff) um die Bindungsstelle an
einem Enzym. Bei der nicht-kompetitiven Hemmung bindet der
Antagonist nicht an der Substrat-Bindungsstelle.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2013
2
1/23/2017
Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit mit der Substratkonzentration
einer enzymatische katalysierten Reaktion
Unkompetitive Hemmung
Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor
außerhalb des aktiven Zentrums, wie bei der nichtkompetitiven Hemmung, aber nur dann, wenn bereits ein
Substrat an das Enzym gebunden ist.
Quelle: http://www3.hhu.de/biodidaktik/Steuerung_Regelung/enzyme/enzy2_2.html
Georg Weitzer, MUW
2017
2016
Für die Reaktionsgeschwindigkeit v einer
enzymatischen Reaktion gilt:
Gleichgewichtskonstante für die vereinfachte enzymatische Reaktion
[E] x [S]
vmax x [S]
Km =
v=
[ES]
[S] + Km
Km entspricht der SubstratKonzentration, bei der das Enzym
mit der Hälfte der maximalen
Geschwindigkeit arbeitet.
Michaelis-Menten
Gleichung
Die Michaelis-Menten Gleichung gilt nur unter der Annahme eines Fließgleichgewichtes,
also [ES] = konstant.
Die Reaktionsgeschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration [S] nach der
Michaelis-Menten Gleichung kann auch grafisch dargestellt werden. 
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW
2016
3
1/23/2017
Graphische Darstellung der Geschwindigkeit
einer enzymatischen Reaktion
v
Bestimmung der
Substratkonzentration
Bestimmung der
Enzymmenge
v... Umsatzgeschwindigkeit
vmax ... Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
Km = [S] bei vmax / 2
(Km = Michaelis-Menten Konstante)
([S] = Substratkonzentration)
Abbildung aus: Ergänzung der theoretischen
Grundlagen und biochemisches Praktikum im
Block 3 - Vom Molekül zur Zelle, Facultas Verlag,
Hans Goldenberg (Hg.)
[S]
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
... daher Km in mol/l
es gilt bei Vmax/2: [E] = [ES]
01/2007
Lineweaver-Burk Diagramm
y = kxx + d

y = d + kxx
Geradengleichung
k = Steigung
Ordinate
1 / v = 1 / vmax + (Km / vmax) x 1 / [S]
Durch Umformung der MichaelisMenten Gleichung in eine doppeltreziproke Form kann die
Reaktionsgeschwindigkeit einer
enzymatischen Reaktion in einem
Linweaver-Burk Diagramm
dargestellt werden.
Dies hat vor allem für die
Auswerung der Daten Vorteile.
Wikipedia
k = (1 / vmax) / (1 / Km)
Abszisse
k wie , eine Material-spezifische Konstante
Georg Weitzer, Ernst Müllner,
01/2015
4
1/23/2017
Beispiel 1
Kinetische Untersuchung der Lactatdehydrogenase:
Bestimmung der Km
Bestimmung der
Substratkonzentration
v
modiziert nach
„Ergänzung“, H.
Goldenberg
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
[S]
01/2007
Was macht die Lactatdehydrogenase?
Coenzym
CH3CO-COOH + NADH + H+
Pyruvat
Gemessene
Reaktionsrichtung
C2H5OH-COOH + NAD+
Lactat
COO-
COO-
C O
HO C H
CH3
CH3
Die rasche Diagnose des Herzinfarktes wird durch die
Aktivitätsbestimmung von herzspezifischen Enzymen im
Blut ermöglicht.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
2016
5
1/23/2017
Was macht
NAD+?
Nicotinamid-AdeninDinucleotid ist ein Elektronen
transportierendes Coenzym,
das an zahlreichen RedoxReaktionen des Stoffwechsels
beteiligt ist. Dabei kann es
reduziert werden und maximal
zwei Elektronen (dann
geschrieben als NADH)
aufnehmen. Hier gezeigt am
Beispiel der Umwandlung
(Oxidation) von Ethanol zu
Acetaldehyd.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
-H
01/2007
Absorptionsspektrum von NAD+ und NADH
Im Gegensatz zu NAD+
zeigt NADH ein starkes
Absorptionsmaximum
bei 340 nm (langwelliges
UV-Licht).
Im Zuge der Reaktion
von Pyruvat zu Lactat
nimmt (durch gleichzeitige Umwandlung von
NADH in NAD+) die
Absorption von UV-Licht
ab.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
340
01/2007
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1/23/2017
Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität ...
... und Darstellung der Ergebnisse in einem
Lineweaver-Burk Diagramm
LDH spielt eine (Neben)rolle
bei der Glykolyse im
Citratzyklus.
Durch die Umwandlung von
Lactat in Pyruvat wird NADH
produziert, das seinerseits
als energielieferndes Coenzym der Atmungskette zur
ATP Bildung beiträgt.
Im Praktikum wird hingegen
die Umwandlung von Pyruvat
in Lactat gemessen, wobei
NAD+ gebildet wird.
-1 / Kapp
Siehe Milchsäuregärung in der Vorlesung
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
2016
Messen der Umsatzgeschwindigkeít bei
verschiedenen Substratkonzentrationen
[S] = Pyruvat
nochmals: gemessen wird die Reaktion in der Richtung vom
Pyruvat zum Lactat, wobei NADH in NAD+ umgewandelt wird.
zunächst Herstellung einer Verdünnungsreihe
„Ergänzung“, H. Goldenberg
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
7
1/23/2017
Probenvorbereitung
alle Volumina in µl
„Ergänzung“, H.
Goldenberg
Durch Zugabe von 20 µl Lactatdehydrogenase wird die
Reaktion gestartet
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Arbeitsplatz
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
8
1/23/2017
Photometer
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Lambert-Beersches Gesetz
E=
x
cxd
E = Extinktion
c = Konzentration
E = log (1/T) = log (I0/I)
 = spez. Molarer Extinktionskeoff.
d = Schichtdicke
T = Transmission
I
I0
Lichtquelle
Photometer
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
Prisma
Detektor
Küvette
d = 1 cm
01/2007
9
1/23/2017
Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität
Zusatz von LDH
niedrige Pyruvatkonzentration
hohe Pyruvatkonzentration
modifiziert nach „Ergänzung“, H. Goldenberg
k = v für gegebene [S]
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Messung der Extinktionsänderung bei
jeder Substratkonzentration
E=xcxd
c = E / ( x d)
c / t = E / ( x d x t) = v
Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der Dauer
der Reaktion messen (wie in der Grafik zuvor dargestellt).
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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1/23/2017
Auswertung der Messdaten durch Umwandlung
in ein Lineweaver-Burk Diagramm ...
Zusatz von LDH
Jedes “k” (Steigung links) entspricht
einem Punkt im Diagramm rechts
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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1/23/2017
... Pipettierfehler oder Messfehler ?
nicht alles
muss immer
stimmen ...
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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1/23/2017
… zu wenig NADH+H+
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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1/23/2017
Beispiel 2
Bestimmung der Lactatdehydrogenaseaktivität im Serum
bei verschiedenen Enzymmengen
Bestimmung der
Enzymmenge
vmax x [S]
v
v=
[S] + Km
Bei [S] >> Km:
v = Vmax
Und damit:
v = f {[E]}
modiziert nach
„Ergänzung“, H.
Goldenberg
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
[S]
01/2013
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1/23/2017
Experimentelle Vorbereitungen
„Ergänzung“, H.
Goldenberg
1. Lösungen 2 bis 4 mischen
2. LDH Lösung zugeben
3. Abnahme der NADH Konzentration messen
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Gemessen wird wieder die Abnahme
der Extinktion pro
Zeiteinheit, aber diesmal in Abhängigkeit von der Enzymmenge
k = E / min
Zusatz von LDH
wenig Enzym
viel Enzym
modiziert nach
„Ergänzung“, H.
Goldenberg
Aktivität (U/l) = E / min x Konstante
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2014
15
1/23/2017
16
1/23/2017
Durchführung und Diskussion im 3. Semiar
Georg Weitzer, MUW
2017
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