Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1

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Vom Molekül zur Zelle
Block 3 Seminar / Praktikum 1
Ao. Univ. Prof. Dr. Georg Weitzer
https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n202-2013/?state=0-53836-3031/organisatorische-informationen
Praktikum + Seminar
Art der Leistungsüberprüfung: LV mit “permanenten Prüfungscharakter”
Anwesenheitspflicht + Mitarbeit + Kurzreferat
Georg Weitzer, Ernst Müllner, Erwin Ivessa
Department für Medizinische Biochemie
Max F. Perutz Laboratories (MFPL)
Medizinische Universität Wien, Jan 2013
Literatur
Ergänzung der theoretischen Grundlagen und
biochemisches Praktikum im Block 3 vom Molekül zur Zelle (Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.)
Zellbiologie, Wiley - Verlag Chemie
Bruce Alberts
ergänzend z.B.
Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“),
Facultas - Universitäts Taschenbuch Verlag, Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
1
Der praktische Teil der
1. Übung findet statt am:
Institut für
Medizinische Chemie
Währingerstraße 10
Übungssaal III (Tiefparterre)
Eingang Wasagasse
Biochemisches Praktikum / Seminar
Das BIOCHEMIE PRAKTIKUM / SEMINAR besteht aus einem Seminaranteil
und dem eigentlichen Praktikum. Lerngrundlage ist das Praktikumsskriptum.
2 Praktika zu je 4 akad. Stunden, 3 Seminare zu je 2 akad. Stunden
Benötigte Materialien: Arbeitsheft für Protokolle, Anwesenheitsblatt eingelebt
Der Besuch der Veranstaltungen wird darin durch den jeweiligen Gruppenleiter
bestätigt.
Arbeitsmantel
2
Biochemisches Praktikum / Seminar
SEMINAR 1: Allgemeines Verhalten im Labor, notwendige Voraussetzungen,
Führung von Protokollen, Inhalt des ersten Praktikumstags. Fehlerquellen, zufällige
und systematische Fehler, Streuung; Vergabe der Referatthemen.
PRAKTIKUM 1: Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren;
Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen; Gelfiltration: Trennung von
Molekülen unterschiedlicher Größe.
Gr. 30 Do. 14.1. 15:30 pünktlich!
SEMINAR 2:
Besprechung der Ergebnisse und Fehlerquellen des 1. Praktikums;
Inhalt des zweiten Praktikumstags + Wiederholung theoretischer Grundlagen aus
der Vorlesung.
Gr. 30 Fr. 15.1. 14:30 pünktlich!
Biochemisches Praktikum / Seminar
PRAKTIKUM 2:
Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (KM-Wert) der
Lactatdehydrogenase (LDH) für Pyruvat, Ermittlung der Sättigungskonzentration
und der maximalen Umsatzgeschwindigkeit, Statistische Auswertung, Auswertung
mittels Kurvenanpassung am PC.
Gr. 30 Mi. 20.1. 15:30 pünktlich!
SEMINAR 3:
Auswertung des 2. Praktikums; Präsentation der Kurzreferate über
das Seminar/ Praktikum durch die Studierenden.
Gr. 30 Do. 21.1. 14:30 pünktlich!
3
Biochemisches Praktikum / Seminar
Ort der Lehrveranstaltungen:
PRAKTIKUM 1:
Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 3,
Eingang auf Seite Türkenstraße, Parterre.
PRAKTIKUM 2:
Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 1,
Haupteingang, 1. Stock.
Trennmethoden
• Dünnschichtchromatographie
• Ionenaustauschchromatographie
• Reversed Phase Chomatography
(apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase)
• Gaschromatographie
• Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie)
• Elektrophorese
• Affinitätschromatographie
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
4
Affinitätschromatographie:
z.B. Reinigung eines Enzyms aus
einer komplexen Mischung von
Proteinen
Praktikumsbeispiel 1
Trennung von Aminosäuren mittels
Dünnschichtchromatographie
(Trennung nach ihrer Polarität)
Georg Weitzer, Ernst Müllner,
01/2015
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Auftragen der Proben
Zellulose auf Alufolie,
polare, stationäre Phase
Glasröhrchen
Standard = Referenzwert
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Auftragen der Proben
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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DünschichtChromatographiefolie in Glastrog
mit Laufmittel
stellen
Wanderungsrichtung
der Proben
Laufmittel,
apolar,
mobile Phase
35% Azeton / 35%
n-Butanol in Acetatpuffer
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Dünnschichtchromatographie Trog
Chemie erleben
Wawra et al.
gelber Farbstoff
= Isatin
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Dünschichtchromatogramm
nach der Färbung / Trocknung
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
nach circa
2 Stunden:
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
8
Markieren der
Front
Start
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Front
Wanderungsstrecke der
mobilen
Phase
Wanderungsstrecke
der Aminosäure
W(as)
W(m)
Start
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Nernstscher Verteilungssatz
Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander
nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest
oder flüssig / flüssig).
Verteilungskoeffizient c =
[Br2] Wasser
[Br2]
Chloroform
Chemie erleben
Wawra et al.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Auswertung
Wanderstrecke(as)
= Rf(as)
Wanderstrecke (m)
Rf = Retentionsfaktor
Chemie erleben, Wawra et al.
Nernstscher Verteilungssatz
Verteilungskoeffizient c =
[Aminosäure] stationäre Phase
[Aminosäure] mobile Phase
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2013
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Praktikumsbeispiel 2
Gelfiltration
Trennung der Moleküle nach ihrer Größe
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Gelfiltration
Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch
Poren und Kapillaren
Glasfritte
kleine Moleküle können
hinein, haben dadurch
einen längeren Weg
zurückzulegen als die großen,
(die außen herum schwimmen)
und kommen daher später
aus der Säule heraus.
große
kleine Moleküle
Fraktionen
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2013
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Trennung eines Dextranblau / Methylrot
Gemisches mittels Gelfiltration
• Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer
äquilibriert.
• 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf
die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen.
• Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit
ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen.
• Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20
Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt.
• Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1
Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Gelfiltrations - Chromatographie Säule
Chemie erleben, Wawra et al.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Reagenzien für
die Gelfiltration
Elutionspuffer in
Dispenserflasche
Dextransblau / Methylrot
Farbstoffmischung
Salzsäure (HCl) zum
Ansäuern und Entwickeln
der Rotfärbung von
Methylrot
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Gelfiltration
Sammeln der Fraktionen
Chemie erleben, Wawra et al.
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Fraktionen nach der Gelfiltration
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Farbintensität
Schema der Trennung eines Dextranblau /
Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration
Fraktionen
Dextranblau:
Methylrot:
großes Molekül, eluiert zuerst
kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2013
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Praktikumsbeispiel 3
Elektrophorese
Trennung von geladenen
Molekülen im
elektrischen Feld
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Trennung und quantitative Analyse
der Serumproteine
Voraussetzungen:
• Serumproteine müssen positiv oder negativ
geladen sein.
• richtige Wahl des Puffers !
• Trägermaterial (analog zur stationären Phase)
• Gleichstromquelle
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Arbeitsplatz Elektrophorese
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Elektrophorese Apparatur
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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pipettieren kleiner Volumina
mit automatische Pipetten
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Elektrophorese - Probenvorbereitung
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Tröge mit Pufferlösung
+
Cellogel, Trägermaterial
Anode
Kathode
Platin
Elektroden
Gleichstromquelle
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben,
wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben,
wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Der isoelektrische Punkt pI der
Serumproteine ist ~ 5.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben,
wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen?
Der isoelektrische Punkt
pI der Serumproteine
ist ~ 5.
Daher muss der pH des
Puffer > 5 sein (in der
Praxis bei etwa pH =
9), damit ALLE
Proteine negativ
geladen werden ...
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
Chemie erleben, Wawra et al.
... ansonsten würden der Anteil an positiv
geladenen Proteinen zur Kathode wandern
01/2007
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+
Anode
negativ geladene Proteine
(Anionen) wandern zur positiv
geladenen Anode
Wanderungsrichtung
Proben
Kathode
250V
30 min
Gleichstromquelle
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
Standard
Serum
01/2007
Zwischenfrage:
• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie
Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-,
HCO3- ?
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Zwischenfrage:
• Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie
Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-,
HCO3- ?
• Weil die Anionenlücke durch die
negative Ladung der Proteine bei pH 7.4
ausgeglichen wird.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Gleichstromquelle: 250 V
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Nach der Elektrophorese
• Färben der Proteine
• Trägermaterial durchsichtig machen
• Photometrische (densitometrische)
Auswertung
• Messen der Farbstoffdichte entlang des
Trägermaterials
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
aufgetrennte Serumproteine
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Das Prinzip der
Auswertung ...
Detektor
Fläche ist proportional
der Farbmenge,
also auch der Proteinmenge
Probe wird am Detektor vorbeigezogen
Lichtquelle
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz
E=
x
cxd
E = Extinktion
c = Konzentration
E = log (1/T)
= log (I0/I)
 = spez. Molarer Extinktionskeoff.
d = Schichtdicke
I
I0
Photozelle
Lichtquelle Prisma
Detektor
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
Küvette
d = 1 cm
01/2007
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verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer)
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Ausdruck der Ergebnisse
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Elektrophorese von Serumproteinen
Chemie erleben
Wawra et al.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
aus: “Ergänzung
der theoretischen
Grundlagen”,
H. Goldenberg, (Hg.)
diagnostische
Aussagemöglichkeiten
(Beispiele)
für eine ausführlichere
Darstellung siehe z.B.
www.med4you.at/
laborbefunde/
lbef_ephorese_
eiweiss.htm
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
Themen für Vortrag im Rahmen des Biochemischen Seminars/Praktikum am 3. Seminartag:
Freier Vortrag, Dauer: 5 Minuten, Karteikarten erlaubt.
Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL
01/2007
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1.
Beschreiben sie die prinzipielle chemische Struktur von Aminosäuren. Was sind proteinogene und nicht‐
proteinogene Aminosäuren? Was sind essentielle Aminosäuren? Geben sie an, wie man proteinogene
Aminosäuren weiter unterteilen kann. Wie werden die unterschiedlichen Eigenschaften bewirkt?
(Erklären Sie die Begriffe´hydrophob/hydrophil, negativ/positiv, sauer/basisch, polar/apolar)
2.
Was ist das Trennprinzip der Dünnschichtchromatographie (DC)? Wie kann man mit dieser Methode
proteinogene Aminosäuren trennen? Was versteht man dabei unter dem Rf‐Wert? Wandern polare oder
apolare Aminosäuren schneller auf einer DC – warum?
3.
Wie genau funktioniert die Gelchromatographie? Nach welchen Prinzipien erfolgt die Trennung von Stoffen?
In welcher Reihenfolge erwarten wir das Erscheinen im Eluat, wenn wir eine Mischung dreier
unterschiedlich großer Substanzen (MR=100, MR= 200, MR=1000) aufzutrennen versuchen? Was könnte
man tun, wenn in einem Auffangröhrchen trotzdem zwei Substanzen (z.B. MR=100 und MR=200) zu
finden sind?
4.
Welches humane Ausgangsmaterial wird bei der Elektrophorese im Praktikum untersucht? In welche
Fraktionen wird dieses Gemisch aufgetrennt? Nennen Sie Beispiele aus jeder Fraktion sowie deren
Funktionen und überlegen Sie, in welchen Organen die meisten dieser Moleküle produziert werden. Welches
Protein hat den größten Anteil im Serum und woher kommt es, und überlegen Sie, ob dieses im
Krankheitsfall auch über andere Organe „verloren“ gehen kann. Beschreiben sie, wie ein Normalbefund
aussieht. Welche Erkrankungen führen zu signifikanten Veränderungen des Normalbefundes, und wo liegen
diese Veränderungen?
5.
Nach welchem Prinzip kann man die Serumproteine mittels Gelelektrophorese trennen?
Wieso können Proteine überhaupt geladen sein? Was ist der isoelektrische Punkt eines
Proteins? Welchen Einfluss hat der pH‐Wert auf die Ladung des Proteins? Gibt es einen pHWert,
bei dem Proteine generell negativ oder positiv geladen sind? Warum finden sich im
Serum weniger Anionen als Kationen (Anionenlücke)?
6.
Wie erfolgt die quantitative Auswertung eines Elektropherogramms und auf welchen
Annahmen beruht sie? Wie kommt es zur Färbung der Serumproteine und wie zur
quantitativen Analyse der aufgetrennten Gruppen? Vergleichen Sie Photometrie und
Densitometrie und erklären Sie die Bedeutung des Lambert‐Beer’schen Gesetzes!
7.
Welche Art von Molekülen sind Enzyme und was ist ihre prinzipielle Funktion/Aufgabe?
Was sind Isoenzyme und welche Bedeutung haben die Isoenzyme der LDH? Was sind Co‐
Enzyme? Was sind einfache und was sind regulatorische (allosterische) Enzyme? Welche
Faktoren beeinflussen Struktur und/oder Funktion von Enzymen?
8.
Beschreiben Sie, wie Sie vorgehen, um die Enzymaktivität (Enzymmenge) einer LDH Präparation
zu bestimmen? Welche Reaktion katalysiert die Lactat‐Dehydrogenase (LDH)
und welche Rolle spielt dabei NADH?
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9.
Was ist die Michaelis‐Konstante (KM) und was können wir daraus ableiten? Was sind die
Gemeinsamkeiten und Unterschiede der nicht‐linearen und der linearisierten Darstellung?
Welche Bedeutungen hat der KM‐Wert? Was ist vmax? Beschreiben Sie, wie Sie vorgehen, um
den KM‐Wert der LDH zu bestimmen.
10.
Welche unterschiedlichen Arten der Enzymhemmung gibt es? Wie würden die Darstellungen
(nicht‐linear und linearisiert) aussehen, wenn ein kompetitiver Hemmstoff zugesetzt würde?
Beschreiben Sie die Auswirkungen von Enzymhemmungen – auch im Hinblick aufMedikamente
(z.B. was bewirken Statine?)! Welche Auswirkungen sind von derunregelmäßigen Einnahme von
Medikamenten, die als Enzym‐Inhibitoren wirken, zu erwarten?
Ersatzleistungen: Schriftliche Ersatzarbeit, Ausgabe und
Approbation durch den Fachverantwortlichen.
Ansprechperson für den Biochemie-Teil:
Ao. Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr. Herbert Stangl
Zentrum für Physiologie & Pathophysiologie
1090 Wien, Währinger Straße 10
Tel: (01) 4277 60823
e-mail: [email protected]
Bei negative Abschluss: Schiftliche Ersatzarbeit binnen 3 Tage an
Ao. Univ.-Prof. Dipl.-Ing. Dr. Herbert Stangl
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