Einführung in die Trennmethoden (1. Seminar)
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Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum Ao. Univ. Prof. Dr. Georg Weitzer Georg Weitzer, Ernst Müllner, Erwin Ivessa Department für Medizinische Biochemie Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Medizinische Universität Wien, Jan 2017 Informationen zur Lehrveranstaltung: https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n202-2013/?state=0-53836-3031/organisatorische-informationen Praktikumsskriptum: Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle (Facultas Verlag, Hans Goldenberg (Hg.) Literatur dazu: Zellbiologie, Bruce Alberts, Wiley - Verlag Chemie ergänzend z.B. Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“), Facultas - UniversitätsTaschenbuch Verlag, Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 1 Biochemisches Praktikum / Seminar Das BIOCHEMIE PRAKTIKUM / SEMINAR besteht aus einem Seminaranteil und dem eigentlichen Praktikum. Lerngrundlage ist das Praktikumsskriptum. 2 Praktika zu je 4 akad. Stunden, 3 Seminare zu je 2 akad. Stunden Benötigte Materialien: 1. Arbeitsheft für Seminare und Praktikums-Protokolle, Anwesenheitsblatt eingelebt. Der Besuch der Veranstaltungen wird darin durch den jeweiligen Gruppenleiter bestätigt. 2. Arbeitsmantel Biochemisches Praktikum / Seminar SEMINAR 1: Notwendige Voraussetzungen, Allgemeines Verhalten im Labor. Verfassen des Protokolls. Besprechung des Inhalts des ersten Praktikumstags. Hinwies auf Fehlerquellen, zufällige und systematische Fehler und Streuung; Vergabe der Referat Themen. PRAKTIKUM 1: Dünnschichtchromatographie von Aminosäuren; Elektrophoretische Trennung von Serumproteinen; Gelfiltration: Trennung von Molekülen unterschiedlicher Größe. 2 Biochemisches Praktikum / Seminar SEMINAR 2: Besprechung der Ergebnisse und Fehlerquellen des 1. Praktikums; Inhalt des zweiten Praktikumstags + Wiederholung theoretischer Grundlagen aus der Vorlesung. Gr. 30 Fr. 20.1. 14:30 pünktlich! PRAKTIKUM 2: Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (KM-Wert) der Lactatdehydrogenase (LDH) für Pyruvat, Ermittlung der Sättigungskonzentration und der maximalen Umsatzgeschwindigkeit, Statistische Auswertung der Ergebnisse der Gruppe. SEMINAR 3: Auswertung des 2. Praktikums; Präsentation der Kurzreferate über das Seminar/ Praktikum durch die Studierenden. Gr. 30 Do. 26.1. 14:30 pünktlich! Biochemisches Praktikum / Seminar Ort der Lehrveranstaltungen: PRAKTIKUM 1: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 3, Eingang auf Seite Türkenstraße, Parterre. PRAKTIKUM 2: Institut für Medizinische Chemie, Währingerstr. 10, Saal 1, Haupteingang, 1. Stock. Art der Leistungsüberprüfung: LV mit “permanenten Prüfungscharakter” = = Anwesenheitspflicht + Mitarbeit + Kurzreferat Anwesenheitsblatt: https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n2022011/?state=0-10538-293_2/block-3-vom-molekuel-zur-zelle 3 PRAKTIKUM 1: Trennmethoden • Dünnschichtchromatographie • Ionenaustauschchromatographie • Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) • Gaschromatographie • Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) • Elektrophorese • Affinitätschromatographie Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Allen Methoden ist gemeinsam, dass die Moleküle durch den unterschiedlich langen Aufenthalt in zwei nicht mischbaren Phasen getrennt werden. Phasen sind Lösungsmittel, Oberflächen, Antikörper, … .) 4 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). Verteilungskoeffizient c = [Br2] Wasser [Br2] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Affinitätschromatographie: z.B. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen 5 Praktikumsbeispiel 1 Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie (Trennung nach ihrer Polarität) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Auftragen der Proben Zellulose auf Alufolie, polare, stationäre Phase Glasröhrchen Standard = Referenzwert Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 6 Auftragen der Proben Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 DünschichtChromatographiefolie in Glastrog mit Laufmittel stellen Wanderungsrichtung der Proben Laufmittel, apolar, mobile Phase 35% Azeton / 35% n-Butanol in Acetatpuffer Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 7 Dünnschichtchromatographie Trog Chemie erleben Wawra et al. gelber Farbstoff = Isatin Dünschichtchromatogramm nach der Färbung / Trocknung Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 8 nach circa 2 Stunden: Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Markieren der Front Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 9 Front Wanderungsstrecke der mobilen Phase W(mp) Wanderungsstrecke der Aminosäure W(as) Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). Verteilungskoeffizient c = [Br2] Wasser [Br2] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 10 Auswertung Wanderstrecke(as) = Rf(as) Wanderstrecke (m) Rf = Retentionsfaktor Chemie erleben, Wawra et al. Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizient c = [Aminosäure] stationäre Phase [Aminosäure] mobile Phase Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2013 Praktikumsbeispiel 2 Gelfiltration Trennung der Moleküle nach ihrer Größe Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 11 Gelfiltration Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch Stationäre Phase Poren und Kapillaren Glasfritte kleine Moleküle können hinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen) und kommen daher später aus der Säule heraus. Mobile Phase große kleine Moleküle Fraktionen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration • Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert. • 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen. • Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen. • Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt. • Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 12 Gelfiltrations - Chromatographie Säule Chemie erleben, Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Reagenzien für die Gelfiltration Elutionspuffer in Dispenserflasche Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 13 Gelfiltration Sammeln der Fraktionen Chemie erleben, Wawra et al. Fraktionen nach der Gelfiltration Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 14 Farbintensität Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Fraktionen Dextranblau: Methylrot: großes Molekül, eluiert zuerst kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2013 Praktikumsbeispiel 3 Elektrophorese Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 15 Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine Voraussetzungen: • Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. • richtige Wahl des Puffers ! • Trägermaterial (analog zur stationären Phase) • Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Arbeitsplatz Elektrophorese Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 16 Elektrophorese Apparatur Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 pipettieren kleiner Volumina mit automatische Pipetten Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 17 Elektrophorese - Probenvorbereitung Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Tröge mit Pufferlösung + Cellogel, Trägermaterial Anode Kathode Platin Elektroden Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 18 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 19 Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Chemie erleben, Wawra et al. Daher muss der pH des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa pH = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden ... ... ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW + Anode 01/2017 negativ geladene Proteine (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode Wanderungsrichtung Proben Kathode 250V 30 min Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW Standard Serum 01/2007 20 Zwischenfrage: • Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3- ? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Zwischenfrage: • Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3- ? • Weil die Anionenlücke durch die negative Ladung der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007 21 Gleichstromquelle: 250 V Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Nach der Elektrophorese • Färben der Proteine • Trägermaterial durchsichtig machen • Photometrische (densitometrische) Auswertung • Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 22 aufgetrennte Serumproteine Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Das Prinzip der Auswertung ... Detektor Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch der Proteinmenge Probe wird am Detektor vorbeigezogen Lichtquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 23 ... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz E= x cxd E = Extinktion c = Konzentration E = log (1/T) = log (I0/I) = spez. Molarer Extinktionskeoff. d = Schichtdicke I I0 Photozelle Lichtquelle Prisma Detektor Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW Küvette d = 1 cm 01/2007 verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 24 Ausdruck der Ergebnisse Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 Elektrophorese von Serumproteinen Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 25 aus: “Ergänzung der theoretischen Grundlagen”, H. Goldenberg, (Hg.) diagnostische Aussagemöglichkeiten (Beispiele) für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B. www.med4you.at/ laborbefunde/ lbef_ephorese_ eiweiss.htm Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Meßwerte Systematische Fehler Georg Weitzer,MUW Zufällige große Fehler 01/2017 Quelle: https://www.gesundheit.gv.at/labor/laborbefund/qualitaetssicherung 26 Meßwerte Systematische Fehler Zufällige große Fehler Varianz Mittelwert Georg Weitzer,MUW 01/2017 Standartabweichung Quelle: https://www.gesundheit.gv.at/labor/laborbefund/qualitaetssicherung Meßwerte Methode des kleinsten Fehlerquadrates Varianz Mittelwert Georg Weitzer,MUW 01/2017 Standartabweichung Quelle: https://www.gesundheit.gv.at/labor/laborbefund/qualitaetssicherung 27 Verteilung der Messdaten > 95% der Daten Hohe Spezifität aber geringe Sensitivität Hohe Sensitivität aber geringe Spezifität Georg Weitzer,MUW Quellen:http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/zaspel-uta-2003-09-26/HTML/chapter2.html https://de.wikipedia.org/wiki/Standardabweichung_%28Wahrscheinlichkeitstheorie%29 01/2017 Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2007 28 Vortrag im Rahmen des Biochemischen Seminars/Praktikum am 3. Seminartag: Freier Vortrag, Dauer: 5 Minuten, Karteikarten erlaubt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MUW 01/2017 Vortragsthemen 1. Beschreiben sie die prinzipielle chemische Struktur von Aminosäuren. Was sind proteinogene und nicht‐ proteinogene Aminosäuren? Was sind essentielle Aminosäuren? Geben sie an, wie man proteinogene Aminosäuren weiter unterteilen kann. Wie werden die unterschiedlichen Eigenschaften bewirkt? (Erklären Sie die Begriffe´hydrophob/hydrophil, negativ/positiv, sauer/basisch, polar/apolar) 2. Was ist das Trennprinzip der Dünnschichtchromatographie (DC)? Wie kann man mit dieser Methode proteinogene Aminosäuren trennen? Was versteht man dabei unter dem Rf‐Wert? Wandern polare oder apolare Aminosäuren schneller auf einer DC – warum? 3. Wie genau funktioniert die Gelchromatographie? Nach welchen Prinzipien erfolgt die Trennung von Stoffen? In welcher Reihenfolge erwarten wir das Erscheinen im Eluat, wenn wir eine Mischung dreier unterschiedlich großer Substanzen (MR=100, MR= 200, MR=1000) aufzutrennen versuchen? Was könnte man tun, wenn in einem Auffangröhrchen trotzdem zwei Substanzen (z.B. MR=100 und MR=200) zu finden sind? 29 4. Welches humane Ausgangsmaterial wird bei der Elektrophorese im Praktikum untersucht? In welche Fraktionen wird dieses Gemisch aufgetrennt? Nennen Sie Beispiele aus jeder Fraktion sowie deren Funktionen und überlegen Sie, in welchen Organen die meisten dieser Moleküle produziert werden. Welches Protein hat den größten Anteil im Serum und woher kommt es, und überlegen Sie, ob dieses im Krankheitsfall auch über andere Organe „verloren“ gehen kann. Beschreiben sie, wie ein Normalbefund aussieht. Welche Erkrankungen führen zu signifikanten Veränderungen des Normalbefundes, und wo liegen diese Veränderungen? 5. Nach welchem Prinzip kann man die Serumproteine mittels Gelelektrophorese trennen? Wieso können Proteine überhaupt geladen sein? Was ist der isoelektrische Punkt eines Proteins? Welchen Einfluss hat der pH‐Wert auf die Ladung des Proteins? Gibt es einen pHWert, bei dem Proteine generell negativ oder positiv geladen sind? Warum finden sich im Serum weniger Anionen als Kationen (Anionenlücke)? 6. Wie erfolgt die quantitative Auswertung eines Elektropherogramms und auf welchen Annahmen beruht sie? Wie kommt es zur Färbung der Serumproteine und wie zur quantitativen Analyse der aufgetrennten Gruppen? Vergleichen Sie Photometrie und Densitometrie und erklären Sie die Bedeutung des Lambert‐Beer’schen Gesetzes! 9. 7. Welche Art von Molekülen sind Enzyme und was ist ihre prinzipielle Funktion/Aufgabe? Was sind Isoenzyme und welche Bedeutung haben die Isoenzyme der LDH? Was sind Co‐ Enzyme? Was sind einfache und was sind regulatorische (allosterische) Enzyme? Welche Faktoren beeinflussen Struktur und/oder Funktion von Enzymen? 8. Beschreiben Sie, wie Sie vorgehen, um die Enzymaktivität (Enzymmenge) einer LDH Präparation zu bestimmen? Welche Reaktion katalysiert die Lactat‐Dehydrogenase (LDH) und welche Rolle spielt dabei NADH? 9. Was ist die Michaelis‐Konstante (KM) und was können wir daraus ableiten? Was sind die Gemeinsamkeiten und Unterschiede der nicht‐linearen und der linearisierten Darstellung? Welche Bedeutungen hat der KM‐Wert? Was ist vmax? Beschreiben Sie, wie Sie vorgehen, um den KM‐Wert der LDH zu bestimmen. 10. Welche unterschiedlichen Arten der Enzymhemmung gibt es? Wie würden die Darstellungen (nicht‐linear und linearisiert) aussehen, wenn ein kompetitiver Hemmstoff zugesetzt würde? Beschreiben Sie die Auswirkungen von Enzymhemmungen – auch im Hinblick aufMedikamente (z.B. was bewirken Statine?)! Welche Auswirkungen sind von derunregelmäßigen Einnahme von Medikamenten, die als Enzym‐Inhibitoren wirken, zu erwarten? 30 11. Was versteht man unter einem groben, einem zufälligen und einem systematischen Fehler? Welche statistischen Kenngrößen für zufällige Fehler werden häufig verwendet und wie sind diese definiert? Was versteht man bei der Labor‐Diagnostik unter Qualitätskontrolle – welche Formen werden in Österreich angewandt? 12. Welche Anforderungen werden an einen diagnostischen Test gestellt und was versteht man dabei unter Sensitivität und was unter Spezifität? Was bedeuten die Begriffe falsch positiv und falsch negativ? Erklären Sie, warum eine Erhöhung der Sensitivität immer zu Lasten der Spezifität geht und umgekehrt! Anwesenheitsblatt: https://studyguide.meduniwien.ac.at/curriculum/n2022011/?state=0-10538-293_2/block-3-vom-molekuel-zur-zelle 31
