Untersuchungen zur Rolle von Immunzell
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Aus der Neurologischen Klinik St. Josef-Hospital Bochum Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr.med. Ralf Gold Untersuchungen zur Rolle von Immunzell-BDNF während autoimmuner Entzündung im zentralen Nervensystem Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von De-Hyung Lee aus Frankfurt 2008 Dekan: Prof. Dr. med. Gert Muhr Referent: Prof. Dr. med. Ralf Gold Koreferent: PD Dr. med. Claus Gert Haase Tag der mündlichen Prüfung: 12.05.2009 Abstract Lee, De-Hyung Untersuchungen zur Rolle von Immunzell-BDNF während autoimmuner Entzündung im zentralen Nervensystem Problem: Die Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste chronisch entzündliche ZNS Erkrankung, die im jungen Erwachsenenalter auftritt und trotz verbesserten therapeutischen Maßnahmen häufig zu bleibenden Behinderungen führen kann. Die pathologischen Veränderungen sind unter anderem auch durch eine axonale Schädigung charakterisiert. Für das Neurotrophin „brain derived neurotrophic factor“ (BDNF) wurde schon bei degenerativen Erkrankungen Axon protektive Eigenschaften gezeigt. Bioaktives BDNF wird auch von Immunzellen produziert, z.B. in MS Läsionen. Diese beschreibenden Beobachtungen führten zur Hypothese der neuroprotektiven Autoimmunität, die eine protektive Funktion von Immunzellen in entzündlichen Läsionen postuliert. In dieser Arbeit soll die funktionelle Rolle des endogenen BDNF in Immunzellen für den Verlauf der autoimmunen Entmarkung untersucht werden. Methode: Die funktionelle Rolle von BDNF wurde in der Myelin-Oligodendrozyten Glykoprotein induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (MOG-EAE) untersucht, die viele Aspekte der MS widerspiegelt. Für diese Studien wurden konditionale BDNF knock-out Mäuse mit einer Defizienz von BDNF in T-Zellen und myeloiden Zellen verwendet. Ergebnis: In Mäusen mit einer kombiniert konditionalen Defizienz von BDNF in T-Zellen und myeloiden Zellen zeigte sich eine abgeschwächte Immunantwort mit verminderter Il-2 abhängiger T-Zellexpansion in der frühen Phase der MOGEAE, während in der späten Phase die Behinderung einschließlich des axonalen Schadens zunahm. Diskussion: Zusammengefasst zeigen die Studien im Rahmen dieser Arbeit eine duale Rolle für BDNF. Zum einen besitzt BDNF Axon protektive Eigenschaften, zum anderen beeinflusst BDNF die humorale und zelluläre Immunantwort. Meiner Familie Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung 6 1.1. Die Multiple Sklerose (MS) 6 1.2. Pathogenese der Multiplen Sklerose: Die Bedeutung axonaler Schädigung 7 1.3. Immunpathogenese der Erkrankung 9 1.4. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) 1.5. 9 Histologische Veränderungen der Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG)-EAE 1.6. 11 Neuroprotektive Forschungsansätze: Das Konzept der neuroprotektiven Autoimmunität 12 1.7. Brain derived neurotrophic factor (BDNF) 13 1.8. Ziele der Arbeit 15 2. Material und Methoden 16 2.1. Materialien und Herstellernachweis 16 2.2. Geräte und Software 17 2.3. Tierexperimentelle Methoden 18 2.3.1. Cre-lox P-System 18 2.3.2. Generierung konditionaler BDNF knock-out Mäuse in Immunzellen 19 2.3.3. Induktion und Analyse der MOG EAE 19 2.3.4. Perfusion und Gewebepräparation 20 2.4. Histologische Methoden 22 2.4.1. Immunhistochemische Färbung 22 2.4.2. Standardprotokoll der Immunhistochemie 22 2.4.3. Klüver PAS / Luxol Fast Blue (LFB) Färbung 24 -1- 2.4.4. Silber Färbung nach Bielschowsky 24 2.4.5. Hämalaun- Eosin Färbung 25 2.5. Immunologische Methoden 25 2.5.1. Standardprotokoll eines Sandwich ELISA 25 2.5.2. Proliferationsassay 26 2.6. Molekularbiologische Methoden 27 2.6.1. DNA Isolierung aus Mausschwänzen 27 2.6.2 Polymerasekettenreaktion (PCR, Standardprotokoll einer Genotypisierung) 27 2.6.3. Agarose Gelelektrophorese 29 2.6.4. RNA Isolierung 29 2.6.5. Real time PCR 29 2.7. Mikroskopie und Datenanalyse 30 3 Ergebnisse 32 3.1. Genotypisierung und Phänotypisierung konditionaler BDNF knock out Mäuse 32 3.2. Analyse der frühen Erkrankungsphase 33 3.2.1 Klinischer Verlauf der MOG-EAE 33 3.2.2 Histologische Analyse in der frühen Erkrankungsphase 36 3.2.2.1. Analyse der Entzündungsreaktion 36 3.2.2.2. Analyse von Demyelinisierung und axonalen Schaden 37 3.2.3 Immunologische Untersuchungen 39 3.2.3.1 Analyse der Zytokinexpression 39 3.2.3.2 Analyse der T-Zell Proliferation 41 3.3. Analyse der chronischen Phase der EAE in konditionalen BDNF knock-out Mäusen 43 3.3.1. Klinischer Verlauf der MOG EAE 43 3.3.2. Histologische Analyse in der chronischen 3.3.2.1. Erkrankungsphase (Tag 54 p.i.) 45 Analyse der Entzündungsreaktion 45 -2- 3.3.2.2. Analyse von Demyelinisierung und axonaler Schaden 3.3.3. 46 Histologische Analyse in der späten Erkrankungsphase (Tag 71 p.i.) 47 3.3.3.1. Analyse der Entzündungsreaktion 47 3.3.3.2. Analyse von axonalen Schaden und Demyelinisierung 48 4 Diskussion 50 4.1. Effekte von Immunzell BDNF auf axonales Überleben 4.2. 50 Effekte von Immunzell BDNF auf die Immunantwort 52 5. Zusammenfassung 54 6. Literaturverzeichnis 55 Danksagung Lebenslauf -3- Abkürzungsverzeichnis Abb Abbildung BDNF Brain derived neurotrophic factor BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise ° Grad Celsius ca. circa CD Cluster of differentiation CFA Freudsches Adjuvans CNTF Ciliary neurotrophic factor Con A Concanavalin A ctrl Kontrolle DNS Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat EAE Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme linked immunosorbend assay FCS Fetales Kälberserum fl/fl flox/flox GM graue Substanz H2O Wasser IFN Interferon IL Interleukin LckF lckCre BDNFfl/fl LFB Luxol Fast Blue LF lysMCre BDNFfl/fl LLF lysMCre lckCre BDNFfl/fl LPS Lipopolysaccharid Mac Maus Makrophagen Differenzierungsantigen Mg2+ Magnesium MS Multiple Sklerose MOG Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein NAWM normal erscheinende weisse Substanz -4- NK Natürliche Killerzellen NGF Neuronal growth factor PBS Phosphate buffered saline p.i. post injectionem PTX Pertussis Toxin RT-PCR Echtzeit-Polymerasekettenreaktion rpm Umdrehungen pro Minute s.c. subcutan Tab Tabelle TBS Tris Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan trk Tyrosin kinase Rezeptor U Einheit WT wild-typ w/v Gewicht pro Volumen x Mal ZNS Zentralnervensystem -5- 1. Einleitung Seit jeher ist die Medizin mit wissenschaftlicher Forschung vergesellschaftet, aber auch eine Disziplin, die insbesondere von der systematischen Beobachtung lebt. Ein ambitionierter schottischer Augenarzt namens William Mackenzie (1791-1886) beobachtete erstmalig Symptome, die am ehesten auf eine Multiple Sklerose (MS) zurückzuführen waren und mit schubartig verlaufenden Sehstörungen und zunehmenden Lähmungen einhergingen. Im Jahre 1868 beschrieb der französische Neurologe Jean-Marie Charcot die Variabilität der Erkrankung nicht nur umfassend klinisch (Charcot Trias), sondern auch detailliert pathologisch. So beobachtete er multiple plaqueartige Narben in der Nähe der Hirnventrikel und es gelang ihm der mikroskopische Nachweis von Verlust der Markscheiden an Autopsiematerial (Charcot, 1868). Über 140 Jahre später besteht die Möglichkeit, neue Methoden einschließlich histologischer, mikroskopischer und molekularbiologische Techniken zu nutzen, um weitere Einblicke in die Pathogenese der MS zu gewinnen. So ist man aus der Phase der Beobachtung zur Grundlagenforschung aufgerückt und beschäftigte sich zunächst überwiegend mit der Rolle des Immunsystems, das wohl einen wesentlichen Anteil zur Erkrankungsentstehung beiträgt. Zum besseren Verständnis von Pathogenese und Ätiologie der MS wurden in den letzten Jahrzehnten verschiedene experimentelle Modelle etabliert. Diese stellen eine tragende Säule in der folgenden Arbeit dar und ermöglichen neue Erkenntnisse auch zu neurobiologischen Faktoren, die die Erkrankungssuszeptibilität mit bestimmen. 1.1. Die Multiple Sklerose Die MS ist die häufigste entzündliche neurologische Erkrankung des jungen Erwachsenenalters. In Deutschland gehen Schätzungen von ca. 120.000 Erkrankten aus. Im Schnitt manifestiert sich die Erkrankung um das 30. Lebensjahr und betrifft das weibliche Geschlecht mit einem Verhältnis von 1,93,1:1. Die MS ist durch schubförmige und chronisch progrediente Krankheitsverläufe gekennzeichnet. Bei 80-90 % der Betroffenen beginnt die MS mit Schüben. Die primär progrediente Verlaufsform ist mit etwa 10 % deutlich seltener und betrifft beide Geschlechter gleich häufig. Ein Übergang in -6- die sekundär chronisch progrediente Verlaufsform erfolgt bei etwa 50% der unbehandelten schubförmigen Patienten innerhalb von 10 Jahren. Dieser Krankheitsverlauf zeichnet sich durch eine permanent voranschreitende Verschlechterung aus, wobei in der Übergangsphase zusätzlich aufgesetzte Schübe auftreten können. Zu Beginn der Erkrankung finden sich häufig Sehstörungen durch entzündliche Prozesse des Sehnerven, aber auch Gefühlsstörungen, eine Schwäche der Beine, eine Blasenstörung oder Gleichgewichtsstörungen können Erstsymptome einer MS sein. Daneben können anfänglich und im Verlauf auch sehr unspezifische Symptome wie frühzeitige körperliche und geistige Erschöpfbarkeit (Fatigue), Stimmungsschwankungen oder Gedächtnisstörungen eine Rolle spielen. In späteren Krankheitsstadien können schwere Lähmungserscheinungen mit schmerzhaften Spastiken bis zur Bettlägerigkeit führen. Im Gegensatz zu der landläufigen Meinung, dass die Erkrankung zwangsläufig „in den Rollstuhl“ führt, ist in der modernen Medizin nur noch ein relativ geringer Teil der behandelten Patienten schwerstbetroffen und pflegebedürftig. Allerdings lässt nach wie vor der genaue Krankheitsverlauf eines einzelnen MS Patienten nicht gut voraussagen. In einer Studie mit insgesamt 1844 MS Erkrankten wurde der Zeitpunkt der ersten klinischen Manifestation und der Krankheitsverlauf ausgewertet. Hierbei zeigte sich, dass primär chronisch progrediente Erkrankte zwar schon zu Beginn eher klinisch irreversible Schäden als initial schubförmig Erkrankte zurückbehielten, es aber keine Unterschiede zwischen der Krankheitsprogression primär chronisch bzw. initial schubförmig Erkrankter gab, wenn diese gewisse Vorschäden hatten (Confavreux et al., 2000). Diese unerwarteten Resultate werfen die Frage auf, weshalb trotz unterschiedlichem Krankheitsprogression Möglicherweise ab spielen einem hier Entzündungsmuster bestimmten und Niveau entzündungsunabhängig Aktivität gleich die verläuft. voranschreitende degenerative Veränderungen eine größere Rolle, als bisher vermutet. 1.2. Pathogenese der Multiplen Sklerose: Die Bedeutung axonaler Schädigung Die pathologischen Veränderungen der MS sind durch Störung der Blut-HirnSchranke, multifokal auftretende perivaskuläre Entzündung, Demyelinisierung, -7- Verlust von Oligodendrozyten, reaktive Gliose und axonale Schädigung gekennzeichnet. Jahrzehntelang wurde die MS überwiegend als vornehmlich durch CD4 positive T-Zellen vermittelte (Gold et al., 2006) demyelinisierende Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS) angesehen und der axonalen Schädigung wenig Beachtung geschenkt, obwohl es bereits zu Beginn des 20. Jahrhunderts klare Befunde für axonale Veränderungen in MS Läsionen gab. Schon um die Jahrhundertwende wurde ein axonaler Verlust in einem Teil der Entzündungsläsionen beobachtet (Kornek and Lassmann, 1999). Mit moderneren bildgebenden Verfahren einschließlich der Magnet Resonanz Tomographie (MRT), der funktionellen Magnet Resonanz Tomographie (fMRT) und der Magnetresonanzspektoskopie (MRS) konnten diese axonale Schädigung auch in vivo relativ gut nachgewiesen werden (De Stefano et al., 2003). Mit Hilfe der MRS Technik war es sogar möglich, einen Zusammenhang zwischen der bleibenden Behinderung und dem axonalen Schaden zu zeigen (Matthews et al., 1998). Mit modernen histopathologischen Methoden konnten die axonalen Veränderungen bei der MS auch feingeweblich genauer charakterisiert werden. Der axonale Schaden scheint dabei initial durch eine Dysfunktion des axonalen Transportes und schließlich durch die vollständige Durchtrennung und Degeneration des Axons charakterisiert zu sein. Die frühe Phase der MS ist durch die Akkumulation des Amyloid precusor Protein (APP) und durch Dephosphorylierung von Neurofilamenten als funktionelle Veränderungen im Axon gekennzeichnet (Ferguson et al., 1997; Peterson et al., 2001; Trapp et al., 1998). Insbesondere korreliert diese akute axonale Schädigung mit der Entzündungsreaktion, vor allem der Makrophageninfiltration (Kuhlmann et al., 2002). Weitere Studien sprechen für einen Zusammenhang zwischen der axonalen Schädigung und der Infiltrationsdichte von aktivierten Makrophagen, Mikroglia sowie zytotoxischen, CD8 positiven T-Zellen (Neumann, 2003), die klonal expandiert in Läsionen nachgewiesen werden konnten (Babbe et al., 2000). Andererseits scheint eine lokale Entzündungsreaktion nicht obligat für den axonalen Schaden zu sein, da selbst in Arealen, in denen keine Entzündung nachweisbar ist, wie z.B. in der normal erscheinenden weissen Substanz (NAWM) oder auch in der grauen Substanz axonale Degeneration -8- beobachtet werden kann. Dies mag ein indirekter Hinweis dafür sein, dass zusätzlich zur Entzündung unabhängige neurobiologische Effekte eine Rolle spielen (Stadelmann and Bruck, 2008; Trapp et al., 1998) 1.3. Immunopathogenese der Erkrankung Die Erkenntnis, dass T-Zellen eine zentrale Rolle in der Pathogenese der MS spielen, entstammt überwiegend Zellkulturarbeiten und experimentellen Modellen (siehe unten, (Ben-Nun et al., 1991)). Während der T-Zell Aktivierung entsteht durch bisher nicht einzeln bekannte Auslöser in Anwesenheit von Chemokinen und Zytokinen ein proinflammatorisches lokales Milieu. Hierbei entstehen aus naiven „Th0“ Zellen unter dem Einfluss des T- Zellwachstumsfaktors Interleukin (IL)-2 pro-inflammatorische „Th1“ Effektor Zellen, die z.B. das pro-inflammatorisches Zytokin Interferon (IFN)-γ, produzieren. Lange Zeit wurden diese „Th1“ Effektor Zellen alleinig für die Entstehung von Autoimmunität im ZNS verantwortlich gemacht. Im Gegensatz dazu bilden „Th2“ Zellen ein Gegengewicht zu den „Th1“ Zellen und sind durch Zytokine wie Interleukin (IL)-4, IL-5, IL-10 oder IL-13 charakterisiert. Eine in der pro-inflammatorischen Antwort und für die Auslösung einer EAE wichtigere Funktion als „Th1“ Zellen haben die kürzlich beschriebenen „Th17“ T-Zellen, die überwiegend IL-17 produzieren (Kebir et al., 2007; Tzartos et al., 2008). Zur Wiedererlangung der Balance im entzündlichen Milieu können zytotoxische T-Zellen, aber auch Natural Killer (NK) Zellen beitragen (Zhang et al., 1997). Erst in den letzten Jahren ist eine neue Subpopulation CD4 positiver T-Zellen, die durch den Transkriptionsfaktor FoxP3 charakterisiert sind, in den Fokus des Interesses geraten, da sie ebenso eine Entzündungsreaktion regulieren können (Koh et al., 1992; Korn et al., 2007). Zur Auslösung der Entzündungsreaktion im ZNS ist die Überwindung der Blut-Hirn Schranke von Immunzellen notwendig. Erst durch die komplexe Interaktion von Oberflächenmolekülen des Gefäßendothels und der Immunzellen ist die Einwanderung von Immunzellen in das Parenchym gewährleistet (Archelos and Hartung, 1997; Engelhardt et al., 1994). Insbesondere das „very late antigen“ (VLA-4) und das „leukocyte function associated antigen“ (LFA-1) sowie deren Partner „vascular cell adhesion molecule“ (VCAM) und „intercellular adhesion molecule“ (ICAM) sind wesentlich -9- für die Transmigration von Entzündungszellen über die Blut-Hirn Schranke verantwortlich (Archelos et al., 1993; Engelhardt et al., 2003). 1.4 Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis Viele Erkenntnisse zur Immunpathogenese der MS wurden am Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) gewonnen, an dem sich in den letzten Jahren auch neurobiologische Veränderungen nachvollziehen ließen. Koritschoner und Schweinburg versuchten erstmalig eine Entzündung des Spinalmarkes in Kaninchen durch Immunisierung mit humanen Spinalmark auszulösen (Koritschoner, 1925). In den 30er Jahren des 20. Jahrhunderts fanden diese Experimente in dem Versuch ihre Fortsetzung, die neurologischen Komplikationen der Tollwut Impfung in Rhesusaffen durch Immunisierung mit Gewebe aus dem ZNS zu reproduzieren (Rivers et al., 1933). Seitdem wurde die EAE in verschiedenen verschiedenen Spezies, Nagetierstämmen, einschließlich erfolgreich in ausgelöst. Primaten und Verbesserte Immunisierungsprotokolle mit auf Mineralöl basierenden Adjuvans (Freudsches Adjuvans) erleichterten die Auslösung der Immunantwort. Einige Modelle benötigen zusätzlich die intraperitoneale Gabe von Pertussis Toxin, welches unter Umständen regulatorische T-Zellen depletiert (Cassan et al., 2006). Die Suszeptibilität und damit die Schwere und die Art der Erkrankung variieren sehr stark je nach Art des Antigens, der Immunisierungsprozedur und dem genetischen Hintergrund/Haplotyp des Tieres (Linington et al., 1993; Shaw et al., 1996). Anfänglich wurde die EAE durch aktive Immunisierung mit Spinalmarkhomogenisat, und dann mit aufgereinigtem basischem Myelinprotein (MBP) als erstem definiertem Autoantigen ausgelöst (Raine et al., 1978). Durch den Transfer von kultivierten, enzephalitogenen CD4 positiven TZell Klonen konnte in der Folge neben der aktiven Immunisierung eine EAE auch passiv ausgelöst werden (Ben-Nun and Lando, 1983) was auf die Bedeutung CD4 positiver T-Zellen in der Erkrankungsentstehung hinweist. Mittlerweile ist man bei der Auslösung der EAE nicht mehr auf komplette Myelinantigene beschränkt, sondern kann auf einzelne enzephalitogene Epitope und sogar auch auf gliale oder neuronale Antigene zurückgreifen - 10 - (Pellkofer et al., 2004). Dieses gilt auch für die passive Immunisierung mit TZellen, die für nicht Myelin Proteine spezifisch sind (Sospedra and Martin, 2005). Diese unterschiedlichen EAE Modelle ahmen viele klinische, histopathologische und immunologische Aspekte der Multiplen Sklerose nach (Gold et al., 2006; Wekerle et al., 1994), ohne dass ein einzelnes Paradigma das ganze Spektrum der MS imitieren kann. In den letzten zwei Dekaden wurden weitere Myelinautoantigene in Nagern charakterisiert, einschließlich des Myelin Oligodendrozyten Glykoproteins (MOG) (Linington et al., 1988). Das MOG ist aufgrund seiner Verankerung an der Oberfläche des Myelins insbesondere von großem Interesse, da diese exponierte Lage es als ein mögliches erstes Ziel der autoimmunen Attacke erscheinen lässt. Die meisten der neuere EAE Studien wurden in Inzuchtmausstämmen durchgeführt, in denen immundominante enzephalitogene T-Zell Epitope, wie z.B. MOG aa 35-55 in der C57BL/6 Maus, identifiziert werden konnten. Inzwischen ist das Paradigma der MOG-EAE in der Maus das am meisten genutzte EAE-Modell der letzten Jahre. In der C57BL/6 Maus, die durch den H-2b Haplotyp charakterisiert ist, löst die Immunisierung mit dem 35-55 MOG Peptid einen Erkrankungsschub gefolgt von einer chronischen Erkrankungsphase aus. 1.5. Histopathologische Veränderungen der MOG-EAE In den letzten Jahren wurden die histopathologischen Veränderungen und insbesondere degenerative Mechanismen an der MOG-EAE intensiv untersucht. Das entzündliche Infiltrat in der MOG-EAE der C57BL/6 Maus ist überwiegend durch CD4 positive T-Zellen und Makrophagen bzw. Mikroglia charakterisiert, die nach dem ersten Erkrankungsmaximum im Verlauf auf ca. 20% des Maximalwertes absinken. Obwohl sich nach Immunisierung durchaus auch eine B-Zellreaktion findet, sind humorale Faktoren für die Pathogenese der Erkrankung nicht zwingend notwendig (Calida et al., 2001), ganz im Gegensatz zur MOG-EAE in der Ratte oder auch im Weissbüschelaffen (Linington et al., 1988; Merkler et al., 2006). Hinsichtlich der Entmarkung zeigt die MOG-EAE in C57BL/6 Mäusen eine eher diffuse Demyelinisierung mit am Erkrankungsmaximum ausgeprägter Apoptose von Oligodendrozyten (Linker - 11 - et al., 2002). Obwohl die oligodendrogliale Repopulation mit nachfolgender Remyelinisierung eine wichtige Rolle in der Rekonstitution von Läsionen spielen kann (Levine et al., 2001) und oligodendrogliale Zellen nach ihrer Rekrutierung in der Lage sind, zu proliferieren und in reife Oligodendrozyten zu differenzieren (Reynolds et al., 2002), ist die Reparatur von entmarkten Läsionen in der MOG-EAE nur inkomplett, was zu einer Akkumulation demyelinisierter Läsionen über die Zeit führt (Herrero-Herranz et al., 2007). Neben zusätzlich bestehenden astroglialen Veränderungen lässt sich in der MOG-EAE auch ein ausgeprägter axonaler Verlust in Läsionen schon in frühen Erkrankungsstadien nachweisen. In den späteren Phasen findet sich zusätzlich ein diffuser axonaler Verlust, der die normal erscheinende weiße Substanz und sogar die graue Substanz betrifft (Herrero-Herranz et al., 2008). Im Modell der EAE wurden auch erste neuroprotektive Ansätze validiert. Während einige Therapieversuche, z.B. mit Glutamatrezeptorblockern oder Natrium Kanalblockern (Bechtold et al., 2004; Black et al., 2006) einen eindeutig schützenden Effekt zeigten, konnten bisher nur wenige endogene protektive Mechanismen identifiziert werden. Neben einer Triplikation im Ube4b/Nmnat Fusionsgen in der ola wlds Maus mit verzögerter Wallerscher Degeneration (Mack et al., 2001) konnte insbesondere eine myelinoprotektive und damit verbunden auch axonprotektive Bedeutung für das neurotrophe Zytokin „ciliary neurotrophic factor“ (CNTF) gezeigt werden (Linker et al., 2002), so dass auch weitere gliale oder auch neuronale Wachstumsfaktoren hinsichtlich ihrer protektiven Eigenschaften in der EAE von großem Interesse sein könnten. 1.6. Neuroprotektive Forschungsansätze: Das Konzept der neuroprotektiven Autoimmunität In den letzten Jahren gewann zunehmend das Konzept der sogenannten neuroprotektiven Immunität an Akzeptanz (Schwartz et al., 1999). Ausgangspunkt waren zunächst Beobachtungen, dass durch die autoimmune Entzündungsreaktion das Überleben von Axonen nach (traumatischer) Schädigung positiv beeinflusst werden konnte und potentiell zu einer Funktionsverbesserung, z.B. nach experimenteller Optikusläsion oder spinalem Trauma führte (Hohlfeld et al., 2000; Schwartz and Kipnis, 2001). Ebenso zeigte - 12 - auch die Applikation MBP spezifischer T-Zellen neuroprotektive Effekte, nachdem diese intraperitoneal verabreicht wurden und konsekutiv das Überleben retinaler Ganglienzellen nach einem artifiziell gesetztem Trauma gewährleisteten (Moalem et al., 1999). In Synopsis dieser Befunde mit der oben angesprochenen Rolle von glialen bzw. neuronalen Wachstumsfaktoren erscheint daher die Möglichkeit von besonderem Interesse, das Entzündungszellen nicht nur schädigende Faktoren in Läsionen zu produzieren, sondern auch neurobiologisch wirksame Substanzen sezernieren, die unter Umständen neuroprotektive Funktionen beinhalten. Diese Vermutung wird durch die Beobachtung gestützt, dass enzephalitogene T-Zellen aber auch andere T-Zellen in EAE Läsionen neurotrophe Faktoren einschließlich BDNF verstärkt exprimieren (Muhallab et al., 2002). Darüber hinaus produzieren auch NK- Zellen in der EAE Läsion Neurotrophine wie Neurotrophin-3 (NT-3) und BDNF (Hammarberg et al., 2000). 1.7. Brain derived neurotrophic factor In den letzten Jahren rückte die Rolle des Neurotrophin „Brain derived neurotrophic factor“ (BDNF) im Zusammenhang mit der Neuroprotektion zunehmend in das Zentrum des Interesses. BDNF wurde erstmalig 1989 als zweites Mitglied der Neurotrophin-Familie kloniert (Leibrock et al., 1989). Dieser Familie gehören auch der „Nerve growth factor“ (NGF), sowie die Neurotrophine (NT) -3, -4/5, - 6 und 7 an (Lewin and Barde, 1996). Im ZNS wird BDNF überwiegend von Neuronen und z. T. auch von aktivierten Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten exprimiert (Hofer and Barde, 1988; Lewin and Barde, 1996). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass aktivierte T-und B-Zellen sowie Makrophagen in vitro bioaktives BDNF sezernieren (Besser and Wank, 1999; Kerschensteiner et al., 1999). Auch in MS Läsionen und EAE Läsionen konnte man T-Zellen und Makrophagen nachweisen, die BDNF in Nachbarschaft zu TrkB positiven Neuronen und auch Astrozyten exprimieren (Stadelmann et al., 2002). Daneben zeigt BDNF auch immunologische Eigenschaften. So spielt BDNF bei der Aktivierung und für das Überleben von eosinophilen Granulozyten in Erkrankten mit allergischem Asthma eine Rolle - 13 - (Nassenstein et al., 2005). Auch scheint BDNF die B-Zell Entwicklung zu beeinflussen (Schuhmann et al., 2005). Neben der neuronalen Aktivität und neuronalen Plastizität kommt BDNF auch für das axonale Wachstum eine wichtige Rolle zu (Lewin and Barde, 1996). Ebenso scheint das BDNF funktionelle Aufgaben wie z.B. Gedächtnisbildung und Lernen zu beeinflussen (Chao, 2003). Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Differenzierung und das Überleben von Neuronen durch BDNF vermittelt wird (Lewin and Barde, 1996). Diese Tatsache wird insbesondere durch den Phänotyp der BDNF knock-out (k.o.) Maus unterstrichen, die homozygot innerhalb der ersten Wochen nach der Geburt verstirbt und selbst auf heterozygoten Hintergrund Verhaltensstörungen wie Hyperaktivität, Fettsucht, Aggressivität aber auch Einschränkungen der Mechanosensation zeigt (Carroll et al., 1998; Kernie et al., 2000; Lyons et al., 1999; Rios et al., 2001). Die Wirkungen von BDNF werden über verschiedene Rezeptoren vermittelt. Zum einen existiert der niederaffine p75 Rezeptor, an den auch andere Neurotrophine binden. Dieser wird in der Embryonalentwicklung ubiquitär ausgebildet und im adulten Gehirn insbesondere in Neuronen im Vorderhirn, aber auch punktuell außerhalb des Gehirns exprimiert. Zum anderen wird die neurobiologische Wirkung der Neurotrophine über Tyrosin Kinase Rezeptoren (Trk) vermittelt (Barbacid, 1995; Klein et al., 1991). BDNF selbst interagiert mit dem TrkB Rezeptor. Der TrkB Rezeptor wird überwiegend neuronal und astrozytär exprimiert (Lomen-Hoerth and Shooter, 1995; Stadelmann et al., 2002) und bildet zusammen mit p75 Heterotetramere, was die Affinität und Spezifität verstärkt (Chao, 1994). In neurodegenerativen Tiermodellen und Läsionsparadigmen wurden durch die Gabe von BDNF positive Effekte auf degenerierende oder geschädigte Neurone erzielt (Knüsel et al., 1992). Eine Übertragung auf humanen Erkrankungen scheiterte zunächst jedoch an der unzureichenden Verfügbarkeit von exogen zugeführtem BDNF in Läsionen des ZNS (Sagot et al., 1997). Angesichts der BDNF Produktion von infiltrierenden Immunzellen im ZNS auf der einen Seite und den beschriebenen schützenden Effekten einer autoimmunen Entzündungsreaktion sowie der protektiven Wirkung von BDNF - 14 - auf degenerierende Axone auf der anderen Seite scheint es möglich, dass endogenes, von Immunzellen produziertes BDNF die molekulare Grundlage des Konzeptes der neuroprotektiven Autoimmunität darstellt, wobei der funktionelle Beweis dieser attraktiven Hypothese noch aussteht. 1.8. Ziele der Arbeit In der folgenden Arbeit soll die funktionelle Bedeutung von BDNF in Immunzellen während autoimmuner Entmarkung im ZNS charakterisiert werden. Hierzu wird das Modell der MOG-EAE in genetisch veränderten Mäusen mit einer selektiven Defizienz von BDNF in T-Zellen und myeloiden Zellen untersucht. Durch diese Arbeit sollen neue Erkenntnisse über die molekularen Grundlagen des Paradigmas der neuroprotektiven Autoimmunität gewonnen werden. Mit besserem Verständnis der Pathogenese der autoimmunen Entmarkung können in Zukunft gezieltere und evtl. auch protektive Therapieansätze für die MS entwickelt werden. - 15 - 2. Material und Methoden 2.1. Materialien und Herstellernachweis Agarose, Roth, Karlsruhe Anti CD3 Antikörper, Serotec; Wiesbaden Anti-mouse Mac 3 Antikörper, Pharmingen, Heidelberg APP Antikörper (Klon MAB 348), Chemicon/Millipore, Schwalbach BSA, Roth, Karlsruhe Concanavalin A, Amersham, Piscataway, NJ, USA DAB (Diaminobenzidinhydrochlorid), Merck, Darmstadt ELISA IFN-γ, BD OptEIA, B&D Systems, Heidelberg ELISA IL-1β, BD OptEIA, B&D Systems, Heidelberg ELISA IL-2, BD OptEIA, B&D Systems, Heidelberg ELISA IL-6, BD OptEIA, B&D Systems, Heidelberg ELISA IL-12/23p40, BD OptEIA, B&D Systems, Heidelberg ELISA IL-17, BD OptEIA, B&D Systems, Heidelberg Entellan, Merck, Darmstadt Ethidiumbromid, Sigma, St. Louis, MA, USA Freudsches Adjuvans, Sigma, St. Louis, MA, USA Isopropanol, Sigma, St. Louis, MA, USA GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus; Fermentas, St. Leon-Rot, Germany Ketamin, Bayer, Leverkusen L-Glutamin, GibcoBRL, Eggestein Lipopolysaccharid, Sigma, St. Louis, MA, USA Loading Dye, Fermentas, St. Leon-Rot Methanol, J.T. Baker, AA Deventer, Niederlande Mass Ruler DNA Ladder, Low Range Fermentas, St. Leon-Rot, Germany Mycobacterium tuberculosis, Difco, Detroit, MI, USA Na-Pyruvat, GibcoBRL, Eggestein Oligonukleotide, Eppendorf, Hamburg Paraffin, Medite, Burgdorf Paraformaldehyd, Sigma, St. Louis, MA, USA Penicillin (100 U/ml) / Streptomycin (100 µg/ml), Biochrom, Berlin - 16 - Perjodsäure, Fluka, Neu-Ulm Pertussis Toxin, Sigma, St. Louis, MA, USA Proteinase K, Roth, Karlsruhe RNeasy- Kit, Quiagen, Hilden RPMI 1640, GibcoBRL, Eggestein Schiffsche Reagenz, Aldrich, München Strepdavidin HRP, DAKO, Hamburg Superscript II reverse Transkriptase, Invitrogen, San Diego, CA, USA Taq Polymerase, 5 prime, Gaithersburg, MD, USA Tetramethylbenzidin; B&D Systems, Heidelberg Tritium markiertem Thymidin, Amersham, Piscataway, NJ, USA Xylazin, Bayer, Leverkusen Xylol, Baver, Leverkusen Zellkulturmedien, GIBCO, Eggenstein 2.2. Geräte und Software Cell D Software, Olympus, Hamburg Einbetter EG 11GO, Leica, Wetzlar ELISA Reader, Dynatech, Sullyfield, VA, USA Eppendorf research Pipetten, Eppendorf Eppendorf Easypet, Eppendorf, Hamburg Flüssigkeits-Szintillator, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA Gewebeaufbereiter Leica TP1020, Leica, Wetzlar Heizblock, Grant, Cambridge, Großbritannien Kühlschrank, Liebherr, Ochsenhausen Multizentrifuge 3 S-R, Heraeus, Hanau Mikrotom, Leica, Wetzlar Mikrowelle, Siemens, München Olympus BX 51 Mikroskop, Olympus, Hamburg 7500 Real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA Thermocycler, Eppendorf, Hamburg Vortex Genie 2, Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA, USA Waage, Kern & Sohn, Balingen 96 Well Platten, Nunc, Roskilde, Dänemark - 17 - 96 Well Harvester, Pharmacia, Piscataway, NJ, USA Zeiss Axioskop 40, Zeiss, Göttingen 2.3. Tierexperimentelle Methoden C57/BL6 Mäuse wurden von der Firma Harlan-Winkelmann, Borchen (Deutschland) bezogen und artgerecht im Tierstall des Instituts für Multiple Sklerose Forschung Göttingen untergebracht. Alle Tierexperimente wurden im Einklang mit den Tierschutzrichtlinien des Landes Niedersachsen (Regierungspräsidium Braunschweig) und durchgeführt. Alle Mauslinien wurden mindestens zehn Mal auf den C57/BL6 Hintergrund zurückgekreuzt. 2.3.1. Cre-lox P System und Mausgenetik Die Analyse genetisch veränderter Nagetiere ermöglicht die Untersuchung der Funktion einzelner Gene im lebenden Organismus; bevorzugt werden hierzu Mäuse verwendet. Zwischenzeitlich existieren tausende genetisch veränderter Mauslinien, wobei einen Schwerpunkt so genannte „knock-out“ Mäuse bilden, bei denen zielgerichtet ein spezifisches Gen oder ein Genabschnitt deletiert wird (Brandon et al., 1995). Im Falle des knock-outs des BDNF Genes sind allerdings BDNF -/- Mäuse nicht lebensfähig und sterben entweder intrauterin oder kurz nach der Geburt (Korte et al., 1995). Zur genaueren Analyse bieten sich hier gewebsspezifische „knock-out“ Modelle an, zum Beispiel mit Hilfe des Cre-loxP-Systems. Die transgene Expression der Cre-Rekombinase des Bakteriophagen P1 kann gezielt eingesetzt werden, um einen zwischen zwei eingebrachten loxP Sequenzen liegenden Genabschnitt („gefloxtes Gen“) durch Rekombination zu deletieren (Sauer and Henderson, 1990). Durch gewebespezifische Expression der Cre Rekombinase z.B. mittels lck Promotor in Zellen der T-Zell-Linie oder mittels lysMCre Promotor in myeloiden Zellen lässt sich das „gefloxte“ Gen gezielt in T-Zellen oder Makrophagen deletieren. In der Praxis müssen hierzu Cre-exprimierende Mäuse mit einer Mauslinie verkreuzt werden, die zwei gefloxte BDNF Allele enthält. Am Beispiel der lysMCre BDNFfl/fl Maus soll das Cre-lox P System dargestellt werden (Abb.1). LysMCre Mäuse werden mit BDNFfl/fl Mäusen verkreuzt. In den daraus resultierenden lysMCre lysMcre BDNFfl/fl Mäusen wird das mit lox-P Sequenzen - 18 - flankierte BDNF selektiv in myeloiden Zellen deletiert. Durch die Verwendung der gewebespezifischen Promotoren in der Steuerung des Cre-Genes kann dann ein regulierter BDNF knock-out erreicht werden. Abb. 1: Verkreuzung von lysMCre Mäuse mit BDNFfl/fl Mäusen. In den generierte lysMCre lysMcre BDNFfl/fl Mäusen wird das mit lox-P Sequenzen (rote Dreiecke) flankierte BDNF selektiv in myeloiden Zellen deletiert. 2.3.2. Generierung konditionaler BDNF knock-out Mäuse in Immunzellen Die in den Versuchen verwendeten konditionalen knock-out Mäuse wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit generiert. Mäuse, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des lysMCre Promotors exprimieren (lysMCre Mäuse) wurden vom Institut für umweltmedizinische Forschung Düsseldorf von Frau Prof. Förster freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Mäuse, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des lck Promotors exprimieren (lck Cre Mäuse) wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, USA) käuflich erworben (Stock-Nummer: 006889, (Hennet et al., 1995)). Gefloxte BDNF Mäuse enthalten ein durch loxP Schnittstellen markiertes Exon 8 des BDNF Gens (i.e. das einzige kodierende Exon im BDNF Gen der Maus, BDNFfl/fl - 19 - Mäuse) und wurden freundlicherweise von Herrn Prof. Sendtner, Abteilung für Klinische Neurobiologie der Universitätsklinik Würzburg zur Verfügung gestellt (Matsumoto et al., 2008). Die lysMCre Mäuse wurden mit BDNFfl/fl Mäusen verkreuzt, bis man lysMCre/lysMCre BDNFfl/fl Genotypen erhielt. Durch Verpaarung von BDNFfl/fl Mäusen mit lckCre Mäusen wurden in gleicher Weise lckCre BDNFfl/fl Mäuse generiert. Zuletzt wurden lckCre BDNFfl/fl Mäuse mit lysMCre/lysMCre BDNFfl/fl Tiere verpaart, um die doppelt konditionale Maus (lysMCre/lysMCre lckCre BDNFfl/fl) zu generieren. Der Einfachheit halber und aus Platzgründen werden die lysMCre/lysMCre BDNFfl/fl Mäuse mit „LF“, lckCre BDNFfl/fl Mäuse mit „lckF“ und lysMCre/lysMCre lckCre BDNFfl/fl Mäuse mit „LLF“ bezeichnet. 2.3.3. Induktion und Analyse der MOG EAE Zur Induktion der MOG-EAE wurden 200 µg MOG 35-55 Peptid (Institut für Medizinische Immunologie, Charite Berlin) in gleichem Volumen mit kompletten Freudschem Adjuvans, welches zusätzlich Mycobacterium tuberculosis enthält (komplettes Freudsches Adjuvans-CFA), in einem Gesamtvolumen von 200 μl emulgiert. Die erhaltene Emulsion wurde mit Ketamin und Xylazin narkotisierten Mäusen in die Flanken und in die Schwanzbasis s.c. injiziert. Zusätzlich erhielten die Mäuse 400 ng Pertussistoxin (200 µl Volumen) i.p. an den Tagen 0 und 2 nach Immunisierung (p.i.). Die Versuchstiere wurden täglich gewogen und klinisch beurteilt, Mäuse mit einem Score ab „7“ wurden entsprechend den Tierschutzrichtlinien artgerecht getötet. Zur Analyse des klinischen Verlaufs wurden verstorbene Tiere ab dem Tag des Todes bis zum Versuchende mit „10“ gewertet. Definition der klinischen Scores bei der EAE Der EAE Score wurde anlehnend an den EAN Score (Linker et al., 2002) übernommen. Dieser birgt den Vorteil, dass statt den allgemein verwandten 5 Schweregraden eine sensitivere Beurteilung durch 10 Schweregrade existiert. - 20 - Tab. 1 : Modifizierter EAE Score EAE Score Klinische Symptome 0 Keine 1 läuft normal, proximaler Teil des Schwanzes waagrecht, Schwanzspitze schleift am Boden 2 läuft normal, gesamter Schwanz schleift am Boden 3 zusätzlich breitbeiniger Gang 4 breitbeiniger ataktischer Gang, Hinterbeine nicht mehr ganz durchgestreckt, Hinterteil niedriger als bei EAE Score 3 klappt zusätzlich beim Laufen teilweise oder permanent ein 5 Hinterbein nach hinten weg, kann aber noch für den nächsten Schritt vollständig nach vorne gebracht werden (leichte Paraparese der Hinterbeine) ein Bein konstant paretisch, kann für den Schritt nicht mehr 6 unter den Körper gezogen werden; oder beide Beine inkonstant hinten, könnten noch unter den Körper gezogen werden; oder seitliches Wegrutschen beider Beine, Gang im Spagat 7 beide Hinterbeine plegisch; Fortbewegung nur durch die Vorderbeine gewährleistet zusätzliche Schwäche der Vorderbeine, zieht sich nicht mehr 8 gerade und flott mit dem Vorderbeinen voran; Aufstützen des Oberkörpers nur auf die Unterarme (Tetraparese) 9 Tetraparese und Atemnot, moribund 10 Wegen Zustandes verstorben, Tod 2.3.4. Perfusion und Gewebepräparation Die Mäuse wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tage 14, 54, 71 p.i.) mittels CO2 Narkose tierschutzgerecht getötet. Nach Fixierung auf einer Präparierplatte und Desinfektion des Felles mit 70 % Ethanol erfolgte die Eröffnung und Freilegung des Brustkorbes. In einigen Experimenten wurden vorher Milz und inguinale Lymphknoten unfixiert für weitere Untersuchungen präpariert. Danach wurde das Herz der Maus vorsichtig aus dem Herzbeutel freigelegt. Mit Hilfe einer dünnen Kanüle (20 G), die in die linke Herzkammer - 21 - eingebracht wurde, wurden 50-100 ml PBS mit leichtem Druck in den Körperkreislauf injiziert. Über einen Schnitt in den rechten Vorhof des Herzens wurde die Maus entblutet. Danach wurde zur Gewebefixierung 4 % Paraformaldehyd (PFA) über die liegende Kanüle injiziert. Nach Perfusion der Maus mit insgesamt 100 ml 4 % PFA wurden sorgfältig das Rückenmark, wie auch das Gehirn und die Milz herauspräpariert und über Nacht in 4 % PFA belassen. Das perfundierte Gewebe wurde im Automaten entwässert und dann in Paraffin eingebettet. Zur weiteren histochemischen Verarbeitung wurden mit Hilfe des Mikrotoms 3 µm dicke Schnitte angefertigt und auf einen beschichteten Objektträger aufgebracht. 4 % PFA in PBS (w/v), pH 7.4 2.4. Histologische Methoden 2.4.1. Immunhistochemische Färbungen Die Immunhistochemie dient zur Erkennung spezifischer Antigene auf Gewebsschnitten. Diese werden entweder durch direkt markierte Antikörper (direkte Immunhistochemie) oder über einen markierten Sekundärantikörper (indirekte Immunhistochemie) Charakterisierung von Zellen, vermittelt. Diese beispielsweise Methode zur wird zur Bestimmung von Leukozytensubpopulationen im Gewebe verwendet. 2.4.2. Standardprotokoll der Immunhistochemie Zur Differenzierung entzündlicher Infiltrate wurden Färbungen mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Der CD3 Oberflächenmarker findet sich auf T-Zellen, während der Mac-3 Oberflächenmarker auf Makrophagen bzw. Mikroglia nachweisbar ist. Die Färbung auf Amyloid Precusor Protein (APP) dient zur Einschätzung des axonalen Schadens in der frühen Phase der EAE. APP wird in Neuronen synthetisiert und anterograd axonal transportiert. Es akkumuliert in geschädigten Axonen mit gestörtem Transport und wird so färberisch nachweisbar. - 22 - Die Färbungen wurden allesamt an 3 µm dicken Paraffinschnitten durchgeführt. Die Paraffin Schnitte wurden zum Entparaffinieren 30 Minuten in Xylol getaucht. Danach wurden die Objektträger in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert und in 10 mM Citratpuffer überführt. Zur Antigendemaskierung wurden die Objektträger bei 850 Watt 30 Minuten lang in einer Mikrowelle aufgekocht. Es folgte eine Abkühlungsphase von 15-20 Minuten sowie die Weiterverarbeitung in 1x TBS Puffer. Nach Markierung und Umrandung des Schnittes mit einem Fettstift erfolgte das Blocken mit 10% BSA für eine Dauer von 60 Minuten, um das unspezifische Binden von Antikörpern zu verhindern. Daraufhin wurde der entsprechende Erstantikörper in 1% BSA zugegeben. Die Erstantikörper wurden in folgender Konzentration verwendet: Mac-3 Antikörper (Ratte anti-Maus, BD 553799): 1:200 CD3 Antikörper (Ratte anti Human, Serotec MCA1477) 1:200 APP Antikörper (Maus anti-Human/Maus Antikörper, Chemicon, MAB348): 1:1000 Als Negativkontrolle wurden Schnitte ohne Primärantikörper mit 1% BSA inkubiert. Die Inkubation der Antikörper wurde bei 4° über Nacht in einer feuchten Kammer durchgeführt. Zur Blockierung der endogenen Peroxidase wurde 30 % H2O2 und 0.2 M Natrium-Azid hinzugegeben. Unter Verwendung des ABC Systems besteht die Möglichkeit den Primärantikörper zu detektieren. Hierfür wurde mit einem biotinylierten Sekundärantikörper (Kaninchen AntiRatte Antikörper bei Mac-3 und CD3 Färbung, Ziege anti-Maus Antikörper bei der APP Färbung) eine Stunde und anschließend mit dem Avidin-Biotin-EnzymKomplex 45 Minuten lang inkubiert. Zuletzt wurde als Substrat Diaminobenzidinhydrochlorid (DAB) für die Peroxidasereaktion hinzupipettiert. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte mit Hämalaun gefärbt. Alle Schnitte wurden dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe wieder dehydriert und nach Xylol mit Entellan eingedeckelt. Als Positivkontrolle für die Mac-3 und CD3 Färbung wurden Milzschnitte verwendet. - 23 - 2.4.3. Klüver PAS/ Luxol Fast Blue (LFB) Färbung Auf Grund der Affinität des LFB zum Neurokeratin des Myelins können myelinisierte Fasern dargestellt werden. Nach dem Entparaffinieren und Rehydrieren mittels absteigender Alkoholreihe bis 96 % Ethanol erfolgte die Inkubation in 0.1 % Luxol Fast Blue Lösung bei 56° über Nacht. Nach einem Wasch-Schritt mit 96 % Ethanol und Wasser wurde zur Differenzierung der Färbung 1 % LiCO3 hinzu gegeben bis sich der Hintergrund entfärbte und nur die Myelinscheiden türkis blau angefärbt waren. Nach einem erneuten WaschSchritt, mit 70 % Ethanol wurden die Schnitte in Aqua dest. gesammelt. Nach mikroskopischer Kontrolle des Schnittes konnte notfalls der Schnitt erneut in LiCO3 gegeben werden. Die Gegenfärbung erfolgte mittels Period-Schiffsäure Reagenz (PAS), indem die Schnitte für mindestens 10 Minuten in 0.8 % Perjodsäure inkubiert wurden. Es erfolgte der Transfer in Schiffsches Reagenz in dem die Schnitte 20 Minuten verblieben. Nach zweimaliger Sulfit Waschung und 10 minütigem Wässern wurden die Schnitte wieder dehydriert, fünf Minuten in Xylol geben und mit Hilfe von Entellan eingedeckelt. 2.4.4. Silber Färbung nach Bielschowsky Zur Silberimprägnierung von Axonen erfolgten zunächst die Entparaffinierung mit Xylol und dann die Rehydrierung in absteigender Alkoholreihe. Zu 37° vorgewärmter 20 % AgNO3 Lösung wurde dann tropfenweise 25 % NH3 hinzugegeben bis letztlich Silberhydroxid entstand. Die Schnitte wurden dann für ca. 10 Minuten und bei 37° in diese Lösung überführt, ohne dass die Schnitte Licht ausgesetzt wurden. Nach Waschen mit 0.1 % NH3 wurden die Schnitte erneut in Silberhydroxid gestellt und Entwickler Lösung hinzugegeben. Unter kontinuierlichem Schütteln wurden die Schnitte reduziert. Die Axone färbten sich schwarz, der Hintergrund wurde gelblich. Es erfolgte ein erneuter Waschschritt in 0.1 % NH3 und zuletzt in Aqua dest. Nach Dehydrierung mittels Alkoholreihe und Xylol erfolgte das Eindeckeln mit Entellan. Entwickler Lösung: 5.4 ml Formaldehyd in 114.6 ml A. dest. + 1 Tropfen konz. HNO3 (65 %) +0.5 g Zitronensäure - 24 - 2.4.5. Hämalaun-Eosin Färbung Nach dem Entparaffinieren und der Rehydratation wurden die Schnitte 10 Minuten in Hämalaun getaucht und danach gewässert. Daraufhin erfolgten diedas Inkubation in 0.1 % Eosin und ein erneuter Waschschritt. Nach der Dehydrierung mittels der Alkoholreihe wurden die Schnitte mit Entellan eingedeckelt. Hämalaun: 1 g Hämatoxylin in 1 l Aqua dest. + 0.2 g NaJO3 + 50 g Kaliumaluminiumsulfat + 50 g Chloralhydrat + 1 g Zitronensäure Eosin: 0.1 g Eosin in 100 ml Ethanol 70 % lösen + 3 Tropfen 100 % Essigsäure 2.5. Immunologische Methoden 2.5.1. Standardprotokoll eines Sandwich-ELISA Zur Quantifizierung der Zytokine IFN-γ, IL-6, IL-12/IL23 p40, IL-1β, IL-2 und IL17 wurden ELISA Analysen aus Überständen von Milz Zell Kulturen durchgeführt. Hierfür wurden ELISA Sets entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. Die 96 Well Flachbodenplatte mit verstärkter Proteinbindungskapazität wurden über Nacht mit dem „Capture“-Antikörper beschichtet (IFN-γ 1:250 in Carbonat/Bicarbonat Puffer; mIL-1 β 1:250; IL-6, IL12/IL23p40 und IL-2 1:250 in Carbonat/Bicarbonat; IL-17 1:200 in Carbonat/Bicarbonat) und über Nacht bei 4° aufbewahrt. Nach der Inkubation wurden die Platten gewaschen und die noch verbliebenen freien Bindungsstellen mit BSA bei Raumtemperatur für eine Stunde geblockt. Nach einem erneuten Wasch-Schritt wurden die Zellüberstande sowie die Standardreihe aufgetragen. Je nach Ansatz wurde dann verdünnt oder unverdünnt der Überstand als Dreifachansatz in die Vertiefungen pipettiert und bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden inkubiert. Danach wurde der biotinylierte Detektions-Antikörper auf die gewaschene Flachbodenplatte gegeben. Im nächsten Schritt wurde ein Detektionreagenz (Meerrettich-Peroxidase gebundenes Streptavidin, Streptavidin HRP) hinzugegeben. Das biotinylierte Ende des Detektionsantikörper Detektionsreagenz. Zur bindet Entwicklung an erfolgte das die Streptavidin des Zugabe von Tetramethylbenzidin (TMB) mit nachfolgender Farbreaktion, welche mit - 25 - Schwefelsäure abgestoppt wurde. Die optische Auswertung erfolgte bei 450 nm. Mittels einer angefertigten Standardkurve, können dann die ermittelten Extinktionswerte einer Konzentration zugeordnet werden. Die Auswertung erfolgte an einem ELISA Reader der Firma Dynatech. Zur Bestimmung des IL-1β wurden Peritonealmakrophagen aus der Maus präpariert. Die Maus wurde mit CO2 tierschutzgerecht getötet und auf der Präparierplatte fixiert. Nach Desinfektion mit 70 % Ethanol wurde das Fell vorsichtig abpräpariert, bis das Peritoneum sichtbar war. Dann wurde mit Hilfe einer Spritze und einer dünnen Nadel (26 G) 1 ml steriles PBS, in den Bauchraum gegeben, ohne Bestandteile des Gastrointestinaltraktes zu verletzen. Nach leichten massierenden Bewegungen wurde das PBS mit der Spritze aufgezogen und nach mehreren Wasch-Schritten in R10 Medium aufgenommen und in einer 96- Well Platte ausgesät. Pro Well wurden 500.000 Zellen in einem Gesamtvolumen von 250 µl Medium ausplattiert. Die Makrophagen wurden bei 37º und 5 % CO2 im Brutschrank kultiviert. Die Peritonealmakrophagen wurden mit Lipopolysaccharid (LPS) in einer Konzentration von 100 ng/ml stimuliert. Carbonat/ Bicarbonat Puffer: 0.1 M Carbonat pH 9.5 R10 Medium: 1640 RPMI, 1 % Penicillin, 1 % Streptomycin, 1 % L-Glutamin, 1 % Non essential Amino- acid, 1 % Na-Pyruvate, 10 % inaktiviertes FCS 2.5.2. Proliferationsassay Zur Analyse der T-Zell Proliferation wurde 10-12 Tage nach Immunisierung mit 200 µg MOG 35-55 die Milz und die inguinalen Lymphknoten präpariert. Nach Gewinnen einer Zellsuspension wurden insgesamt 250.000 Zellen pro Vertiefung in einer 96 Well Platte ausgesät. Es erfolgte eine spezifische Antigen Stimulation mit MOG 35-55 in einer Konzentration von 20 µg/ml sowie eine polyklonale Stimulation mit dem Lektin Concavalin A (1.25 µg/ml) Als Negativkontrolle wurden die Zellen unstimuliert in Medium belassen. TriplikatAnsätze wurden in einem Brutschrank mit 5 % CO2 für 56 Stunden inkubiert, dann mit 0.2 µCi/well Tritium markiertem Thymidin gepulst und nach 16 Stunden geerntet. Die Zellen wurden mit Hilfe eines 96 Well Harvester auf - 26 - einem Fiberglas Filterpapier überführt und die Radioaktivität wurde in einem 96 Well Betaplate Szintillator gemessen. 2.6. Molekularbiologische Methoden 2.6.1. DNA Isolierung aus Mausschwänzen Für die Genotypisierung der hier verwendeten genetisch veränderten C57/BL6 Mäuse wurde zunächst im Alter von ca. 4 Wochen 3-5 mm des Schwanzes biopsiert. Es erfolgte die Protein-Verdauung mit 20 µl Proteinase K bei 60º im Heizblock für ca. 7 Stunden. Zum Stoppen des Prozesses wurde die Probe für 5 Minuten bei 90º aufgekocht. Zum Abtrennen des Zelldetritus wurde die Probe bei 14.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert. Die Fällung der DNA erfolgte mit Isopropanol. Es erfolgte eine erneute Zentrifugation mit 14.000 rpm. Der Isopropanol Überstand wurde vorsichtig abgenommen und die Probe wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und Luft getrocknet. Je nach gewünschter Konzentration wurden zwischen 100-200 µl DNAase freies Wasser hinzugegeben und die Probe bei 40º inkubiert, so dass sich die DNA lösen könnte. Die Proben wurde bei 4º gelagert. Lysis Puffer: 100 mM TRIS pH 8.5 , 5 mM EDTA , 200 mM NaCl, 0.2 % SDS (w/v) 2.6.2. Polymerasekettenreaktion (PCR, Standardprotokoll einer Genotypisierung) Die grundlegenden Prinzipien der PCR wurden erstmalig von Kjell Kleppe 1971 beschrieben und 12 Jahre später von Carl Mullis umgesetzt (Mullis and Faloona, 1987). Mit der Entdeckung der aus dem thermostabilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnenen Taq-Polymerase wurde die Technik entscheidend verbessert (Saiki et al., 1988). Die PCR ist im Stande, in vitro eine mittels Primern genau definierte DNA Sequenz zu vervielfältigen. Ein PCR Protokoll besteht normalerweise aus insgesamt 30-35 Zyklen. Nach Denaturierung des DNA Stranges bei 95° erfolgt das Annealing der Primer, das sequenzspezifisch ist und zumeist bei einer Temperatur zwischen 55-65° erfolgt. Hieran schließt sich die Elongation bzw. die Amplifikation mittels der - 27 - Taq-Polymerase an. Zur Genotypisierung der Mäuse wurde die aus den Schwanzbiopsien gewonnene DNA verwendet. Der DNA wurden dNTP (2-10 mM,) die Primer (25 pmol) sowie 10 x Taq Puffer und vereinzelt Mg2+ hinzugegeben und die Probe mit H2O auf das gewünschte Volumen (25 µl) gebracht. Zuletzt wurde die Taq Polymerase hinzugefügt. Die PCR Reaktion fand in einem Thermocycler der Firma Eppendorf statt. Tab. 2: Sequenzen der zur Genotypisierung verwendeten Primer lysMCre Mlys 1 5´CTT GGG CTG CCA GAA TTT CTC 3´ Mlys 2 5´TTA CAG TCG GCC AGG CTG AC 3´ Cre8 5´CCC AGA AAT GCC AGA TTA CG 3´ BDNF flox BDNF 13 5´GTT GCG TAA GCT GTC TGT GCA CTG TGC 3´ BDNF 14 5´CAG ACT CAG AGG CGA CTT TGA TGG CTT G 3´ lckCre OIMR 1084 5´GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC 3´ OIMR 1085 5´GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT 3´ Tab. 3: Bandengröße der PCR Produkte lysMCre WT 350 bp lysMCre/lysMCre 1700 bp, 700 bp lysMCre/+ 1700 bp; 700 bp; 350 bp BDNF flox WT 600 bp flox/+ 600 bp, 700 bp flox/flox 750 bp - 28 - lckCre WT 100 bp Tg 400 bp 2.6.3. Agarose Gelelektrophorese Das gewonnene PCR Produkt wurde auf ein 2 % Agarosegel aufgetragen und eine Gelelektrophorese durchgeführt. Hierbei handelt es sich um eine molekularbiologische Methode, um DNA nach ihrer Größe zu trennen. 2 g Agarose wurden mit 100 ml Wasser in einer Mikrowelle aufgekocht und nach dem Aufkochen 3 µl Ethidiumbromid hinzugefügt. Daraufhin wurde das noch flüssige und heiße Gel in eine Gelkammer gegossen und ein Kamm zur Bildung der so genannten Taschen gesteckt. Nach dem Entfernen des Kammes wurde TBE Puffer in die Kammer gegossen. Nach Beladung der Geltaschen mit DNA Proben, zu dem im Volumenverhältnis von 1:6 Loading Dye hinzugefügt worden war, wurde an den Enden der Gelkammer eine Spannung von ca. 100 Volt angelegt und für ca 30 Minuten beibehalten. In dem so entstandenen elektrischen Feld wanderte die negativ geladene DNA in Richtung Anode. Mit Hilfe einer mit aufgetragenen DNA Leiter konnte dann die Größe der aufgetrennten DNA Fragmente bestimmt werden. TBE Puffer: 90 mM TRIS, 90 mM. Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8.0 2.6.4. RNA Isolierung Die RNA Isolierung aus Hirngewebe, Peritonealmakrophagen und T-Zellen erfolgte mit Hilfe des RNeasy System und wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Dabei macht man sich die selektiven Bindungseigenschaften von RNA an eine Silicagelmembran zu nutze. Nachdem den lysierten und in Guanidinthioisocyanat homogenisierten Proben Ethylalkohol hinzugefügt wurde, wurden die Proben auf die RNeasy SilicalgelSäulen aufgetragen. Guanidinthioisocyanat inaktiviert RNasen, währenddessen das hinzugefügte Ethanol die Bindungsbedingungen optimieren soll. Die Gesamt RNA bindet an der Silicagelmembran, während die übrigen Substanzen effizient durch mehrere Waschschritte ausgewaschen werden und somit - 29 - abgetrennt werden. Zuletzt wurde die gebundene RNA in RNase freies Wasser aufgenommen. 2.6.5. Real time PCR Die real time reverse transcription PCR wird zur Bestimmung der Genexpression verschiedener Gene verwendet. Des Weiteren macht diese Methode die Quantifizierung auf Genexpressionsbasis möglich. Unter Einsatz des SYBR Green-Farbstoffes kann die Amplifikation der Proben sichtbar und somit quantifizierbar gemacht werden. Dies ermöglicht, Informationen in Echtzeit („real time“) zu erhalten (Bustin, 2000). Für die reverse Transkription wurden 12 µl aufgereinigter RNA und 200 U Superscript II reverse Transkriptase verwendet. Die Quantifikation des Beta Aktins erfolgte mittels folgender Primer: Beta-actin S2 (5´-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3´), Beta-actin AS2 (5´-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3´), und Beta-actin Son2 (5´-FAM-CAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGCA-TAMRA3´). Die Analyse der BDNF mRNA Expression erfolgte mit folgenden Primern: mBDNF S (5´-GGGCCGGATGCTTCCTT-3`), mBDNF AS (5´-GCAACCGAAGTATGAAATAACCATAG-3´), und mBDNF Son (5´-TTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCAT-3´). Alle PCR Reaktionen wurden in 4 fach Ansätzen in einem 7500 Real Time PCR System durchgeführt. Mittels relativer Quantifizierung wurden die Daten in relative Genexpression angegeben, wobei die Expression der wild-typ Mäuse auf jeweils 100 % gesetzt wurde (Livak and Schmittgen, 2001). 2. Mikroskopie und Datenanalyse Die Rückenmarksschnitte wurden unter einem Lichtmikroskop ausgewertet. Die Analyse erfolgte immer geblindet und schloss für alle Färbungen die Auswertung 6 unabhängiger Schnitte einer Maus ein. Nur zur Analyse der Demyelinisierung wurden 4 Schnitte pro Maus ausgewertet Zur Quantifizierung der Axondichten wurden demyelinisierte Flächen und homogenen Zellinfiltrate als Läsionen identifiziert. Das angrenzende Gewebe mit geringerer Infiltration und diffuser Entmarkung wurde als Periläsion definiert - 30 - und das nach zentral anschließende Gewebe als normal erscheinende weiße Substanz. Zusätzlich wurden anhand der gleichen Schnitte die axonale Dichte in der grauen Substanz in definierten Arealen im lateralen Vorderhorn und medialen Hinterhorn bestimmt (Herrero-Herranz et al., 2008). Zur Quantifizierung der Axone wurde ein speziell angefertigtes Zählgitter mit 100 µm Durchmesser (modifiziert nach (Bitsch et al., 1998) verwendet. Die Resultate sind als relative axonale Dichte angegeben. CD3 positive T-Zellen, Mac-3 positive Makrophagen/Mikroglia und APP positive Profile wurden mit Hilfe eines Zählgitters (Fläche 0,0625mm2) gezählt und die Infiltratdichte auf mm2 umgerechnet. Die semiquantitative Analyse der Demyelinisierung erfolgte mittels Cell D-Software und wurde als Anteil des entmarkten Areals an der gesamten weißen Substanz angegeben. Alle Daten wurden als Mittelwerte ± SEM angegeben. Die statistischen Berechnungen wurden nach Untersuchung auf Normalverteilung mit dem Mann-Whitney U Test durchgeführt (PRISM software, Graph Pad, San Diego, CA, USA). Die Mortalität wurde mit dem Chi-Square Test untersucht (http://www.physics.csbsju.edu/stats/). Die p Werte wurden als signifikant definiert wenn * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. Die Abbildungen wurden mit Xact Chart publishing, SciLab Inh., Hamburg erstellt. - 31 - 3. Ergebnisse 3.1. Generierung und Phänotypisierung konditionaler BDNF knock-out Mäuse Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden nach dem unten abgebildeten Verkreuzungsschema (Abb. 2) LF Mäuse, lckF Mäuse und LLF Mäuse generiert. Einen offensichtlichen Phänotyp zeigten diese Mäuse nicht. fl/fl lysMCre/lysMCre fl/fl lckCre/lckCre BDNF fl/fl lysMCre/lysMCre BDNF BDNF lckCre BDNF fl/fl fl/fl lysMCre/lysMCre lckCre BDNF Abb. 2: Verkreuzungsschema zur Generierung konditionaler BDNF knock-out Mäuse in Immunzellen (Bildquelle: Jackson Laboratories, Maine, USA). Im nächsten Schritt wurde mit Hilfe der real time-PCR die Effektivität der CreloxP vermittelten Deletion des BDNF Gens in Gehirngewebe, Peritonealmakrophagen und T-Zellen untersucht. Das Gehirngewebe diente hierbei als Kontrolle der Gewebespezifität des konditionalen knock-outs, bei dem die BDNF Expression selektiv in T-Zellen und Makrophagen/Mikroglia erniedrigt sein sollte. Die relative BDNF Genexpression in Immunzellen von lysMCre BDNFfl/fl (LF) Mäusen und lckCre BDNFfl/fl (lckF) Mäusen zeigte deutliche Unterschiede zu den wild-typ Kontrollen. Hierbei fand sich sowohl in T-Zellen als auch in den Peritonealmakrophagen eine spezifische Reduktion der BDNF Genexpression, wohingegen die Genexpression im Gehirn keine - 32 - Unterschiede ergab. In den lysMCre lckCre BDNFfl/fl (LLF) war die mBDNF Genexpression in Makrophagen und T-Zellen signifikant reduziert (Abb. 3). Die Genexpression ist als relative Genexpression im Verhältnis zum jeweiligen wild- realtive gene expression in % + SEM typ Gewebe dargestellt, welches auf 100% gesetzt wurde. 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 WT, n=3 LLF, n=2 WT, n=3 LLF, n=2 WT, n=3 LLF, n=2 Gehirn Makrophagen T-Zellen Abb. 3: Signifikant reduzierte mBDNF Genexpression in Makrophagen und TZellen in LLF Tieren (blau) im Vergleich zu den wild-typ Tieren (rot), (Makrophagen p < 0.0123; T-Zellen p < 0.0381). 3.2. Analyse der frühen Erkrankungsphase 3.2.1. Klinischer Verlauf der MOG-EAE Im Anschluss der Phänotypisierung wurden die konditionalen BDNF knock-out Mäuse mit MOG 35-55 immunisiert und der Krankheitsverlauf mit wild-typ Mäusen verglichen. In ersten Kontrollexperimente ergaben sich im Vergleich von lysMCre Mäusen, lckCre und lysMCre lckCre Mäusen, sowie BDNFfl/fl Mäusen mit wild-typ Mäusen keine signifikanten Unterschiede (Abb. 4). Daher wurden im Verlauf wild-typ Mäuse als Kontrolltiere verwendet. In Mäusen mit einer selektiven BDNF Defizienz in myeloiden Zellen (lysMCre BDNFfl/fl) zeigte sich insgesamt kein signifikanter Unterschied im Vergleich zu wild-typ Kontrollen. Einzig am Maximum der Erkrankung (Tag 14-20 p.i.) entstand der Eindruck, dass die LF Tiere etwas leichter erkrankt waren und sich in Relation - 33 - zu den wild-typ Mäusen weniger gut erholten, ohne dass dieser Unterschied signifikant war (p < 0.4566 an Tag 17; Abb. 5). Der Krankheitsverlauf der MOGEAE in Tieren mit einer selektiven Defizienz in T-Zellen zeigte über den ganzen Krankheitsverlauf keinen Unterschied zu den wild-typ Tieren (Abb. 6). mean clinical score + SEM 10 8 WT, n=31 6 lysMcre lckCre, n=7 lysMCre, n=7 BDNFfl/fl, n=12 4 lckCre, n=7 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 days p.i. Abb. 4: MOG-EAE in lysMCre lckCre Mäusen (blau), lysMCre Mäuse (grün), lckCre Mäusen (braun) und BDNFfl/fl Mäusen (hellblau) im Vergleich zu wild-typ Kontrolltieren (rot). Pool aus insgesamt 4 Experimenten. mean clinical score + SEM 8 7 6 5 4 3 2 WT, n=10 1 lysMCre BDNFfl/fl, n=10 0 0 10 20 30 40 50 days p.i. Abb. 5: MOG-EAE in lysMCre BDNFfl/fl, (blau) gegenüber wild-typ Kontrolltieren (rot). Die Daten sind aus zwei unabhängigen Experimenten mit je 10 Mäusen pro Gruppe gepoolt (Tag 17, p < 0.4566). - 34 - mean clinical score + SEM 8 7 6 5 4 3 2 WT, n=9 1 lckCre BDNFfl/fl, n=8 0 0 5 10 15 20 25 30 35 days p.i. Abb. 6: MOG-EAE in lckCre BDNFfl/fl (blau) gegenüber wild-typ Kontrolltieren (rot). Die Daten sind aus zwei unabhängigen Experimenten mit 9 wild-typ und 8 lckCre BDNFfl/fl Mäusen gepoolt. Demgegenüber entwickelten lysMCre lckCre BDNFfl/fl (im Folgenden auch als LLF Mäuse bezeichnet) mit einer kombinierten Defizienz von BDNF in T-Zellen und myeloiden Zellen in der frühen Erkrankungsphase im Vergleich zu wild-typ Kontrollen einen signifikant abgeschwächten Krankheitsverlauf mit einer nur leichten Paraparese, während die wild-typ Tiere im Mittel eine ausgeprägte Paraparese bis zur beginnenden Tetraparese entwickelten (Abb. 7). Hinsichtlich der Mortalität zeigten sich ebenfalls signifikante Unterschiede. Während bei den LLF Mäusen nur 1 von 34 Tieren verstarb, mussten in der wild-typ Gruppe 13 von 38 Mäusen entsprechend den Tierschutzrichtlinien aus dem Experiment genommen wurden (signifikant entsprechend dem chi-square Test; p = 0.004). Der Erkrankungsbeginn und die Inzidenz der Erkrankung zeigten keine Unterschiede zwischen beiden Gruppen. - 35 - 9 mean clinical score + SEM 8 7 6 5 4 3 2 WT, n=38 1 LysMCre lckCre BDNFfl/fl, n=34 0 0 5 10 15 20 25 days p.i. Abb. 7: MOG-EAE in LLF Tieren (blau) gegenüber wild-typ Kontrolltieren (rot). LLF Mäuse zeigen einen signifikant abgeschwächten Erkrankungsverlauf (p < 0.0001). Daten sind aus 5 unabhängigen Experimenten gepoolt. 3.2.2. Histologische Analyse in der frühen Erkrankungsphase Während der MOG-EAE wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Erkrankung Experimente histologisch aufgearbeitet. Eine erste Analyse erfolgte am Maximum der Erkrankung; hierfür wurde der Tag 14 p.i. gewählt. 3.2.2.1. Analyse der Entzündungsreaktion Zur Analyse der Entzündungsreaktion wurden an Rückenmarksquerschnitten immunhistochemische Färbungen für Makrophagen/Mikroglia (Mac-3 Färbung) T-Zellen (CD3 Färbung) und durchgeführt. Die Anzahl der infiltrierenden T-Zellen und Makrophagen/Mikroglia wurde in je 6 ausgeprägten, unabhängigen Läsionen pro Gruppen in einer verblindeten Analyse ausgewertet. Am Tag 14 p.i. zeigte sich in den LLF Mäusen eine signifikante Reduktion von CD3 positiven T-Zellen und Mac-3 positiver Makrophagen und Mikroglia (Abb. 8A,B). - 36 - 700 CD 3 pos. cells/mm2 + SEM Mac 3 pos. cells/mm2 + SEM 1.000 800 600 400 200 600 500 400 300 200 100 0 BD N Ff l /f l, 5 ly sM C re lc kC re n= W T, B ly sM C re lc k W T, A Cr e n= 5 BD N F fl/ n =5 ,fl n =5 0 Abb. 8: Signifikant weniger Mac-3 positive Zellen (A) sowie CD3 positive Zellen (B) (p < 0.0001) in den LLF Mäusen (blau, p < 0.0289) im Vergleich zu wild-typ Kontrollen (rot). 3.2.2.2. Analyse von Demyelinisierung und axonalem Schaden Im nächsten Schritt erfolgte an Serienschnitten die verblindete Auswertung der entmarkten Fläche nach LFB Färbung (Abb. 9A) sowie die Quantifizierung der axonalen Dichten in entmarkten Läsionen, der Periläsion sowie auch in der NAWM und der grauen Substanz (Abb. 9B). Neben der reduzierten Inflammation zeigten sich in LLF Mäusen auch ein Trend zur geringeren Demyelinisierung sowie ein geringer ausgeprägter axonaler Schaden in Läsionen und der Periläsion. Korrelierend dazu ließen sich tendenziell mehr APP positive Profile in der LLF Gruppe nachweisen, wobei der Unterschied nicht signifikant war (Abb. 9C). In der Analyse der Axondichten in NAWM und grauer Substanz ergaben sich keine Unterschiede zwischen LLF Mäusen und wild-typ Mäusen. - 37 - 5 20 axonal density + SEM 25 4 3 2 1 15 10 5 LLF GM WT GM LLF NAWM WT NAWM LLF perilesion ly sM C B WT perilesion lc kC re , re T, n= 5 W A LLF lesion WT lesion 0 0 n= 4 demyelination (% of white matter) + SEM 6 APP positive profiles/mm2 + SEM 500 400 300 200 100 BD N F fl/ ,f n =4 l lc kC re ly sM Cr e C W T, n= 5 0 Abb. 9 A-C: Luxol Fast Blue Färbung (A), Bielschowsky Silberimprägnation (B), APP Färbung (C) am Tag 14 p.i. Tendenziell geringere Demyelinisierung und axonaler Schaden in der Läsion in LLF Mäusen (blau). - 38 - 3.2.3. Immunologische Untersuchungen 3.2.3.1 Analyse der Zytokinexpression Um die Ursachen der verminderten inflammatorischen Infiltration in LLF Mäusen am Tag 14 p.i. zu untersuchen, wurde die Produktion von „Th1“ und „Th17“ Zytokinen im Überstand von primären Milzzellkulturen aus MOG immunisierten Mäusen analysiert. Nach Re-Stimulation mit MOG 35-55 in vitro wurden proinflammatorische Zytokine wie IFN-γ, IL-6, IL-12/IL-23 p40 und IL-17 in einer ELISA Analyse gemessen (Abb. 10). Die Produktion von IL-1β wurde im Überstand von Peritonealmakrophagen mit und ohne Stimulation mit LPS (100 ng/ml) untersucht. Die IFN-γ Produktion wie auch die IL-6 Sekretion war in LLF Mäusen im Gegensatz zu wild-typ Kontrollen deutlich erniedrigt (Abb. 10A,B). In den weiteren durchgeführten Messungen zeigte sich neben einer deutlich reduzierten IL-17 Produktion auch geringere Werte für das proinflammatorischen Zyotkin IL-12/IL23 p40 (Abb. 10C,D). Des Weiteren fand sich in den Kulturüberständen von LLF Mäusen nach Restimulation mit MOG35-55 eine reduzierte IL-2 Produktion (s.u.) und auch die LPS-vermittelte Induktion des proinflammatorische Zytokins IL-1β war in Überständen von Peritonealmakrophagen aus LLF Tieren im Vergleich zu wild-typ Kontrollen deutlich reduziert (Abb. 10E). - 39 - C N F fl/ ,fl n= 4 10.000 4.000 8.000 0 D - 40 - BD B lc k C re =4 BD N F fl/ T, n fl , 4 =4 n= BD NF fl/ ,fl n 0 ly sM Cr e W lc kC re 4 IL12/IL23 p40 (pg/ml) + SEM 20.000 lc kC re re n= 40.000 re 5.000 IL-17 (pg/ml) + SEM C lys M W T, interferon gamma (pg/ml) + SEM 60.000 M C =4 =4 1.000 T, n BD N F fl/ ,fl n 2.000 W lc kC re 3.000 lys re n= 4 A ly sM C W T, IL-6 (pg/ml) + SEM 80.000 300 250 200 150 100 50 0 6.000 4.000 2.000 0 IL-1ß fold induction + SEM 50 40 30 20 10 E lck Cr e ly sM C re W T, n =4 BD N F fl/ ,fln = 4 0 Abb. 10: Signifikante Reduktion aller Zytokine (A-D) in den LLF Tieren (blau, p < 0.05). Nicht signifikant verminderte IL-1β Produktion in LLF Mäusen (E). 3.2.3.2. Analyse der T-Zellproliferation Die verminderte Zytokinproduktion kann Ausdruck einer selektiven Störung der Th1/Th17 Differenzierung sein oder durch eine gestörte T-Zellexpansion zu erklären sein, wobei die defiziente IL-2 Produktion in LLF Mäusen nach MOG Stimulation bereits auf eine gestörte T-Zellproliferation hinweist (Abb. 11B). Zur weiteren Einordnung dieses Befundes erfolgte daher die Analyse der T Zellproliferation in einem radioaktiven Assay nach 3H Thymidineinbau. In LLF Tieren zeigte sich eine signifikant erniedrigte Proliferationsrate nach Antigenspezifischer MOG Stimulation mit MOG, aber auch nach polyklonaler Stimulation mit Concanavalin A (Con A) (Abb. 11A). Im Gegensatz dazu zeigten sich in den einfach-konditionalen BDNF knock-out Mäusen mit BDNF Defizienz nur in T-Zellen bzw. nur in Makrophagen/Mikroglia keine Unterschiede zu wildtyp Kontrollen (Abb. 12). - 41 - 2.000 IL-2 (pg/ml) + SEM 1.500 1.000 150 100 50 500 0 0 LLF WT WT MOG 35-55 LLF Con A lc kC C re ly sM B W A re T, n =4 medium LLF 4 WT BD NF fl/ ,fln = 3 H thymidine incorporation (cpm) + SEM 200 2.500 Abb. 11: Verminderte T-Zell Proliferation in LLF Tieren (p = 0.002) (A) und Con A Stimulation (p = 0.007). Verringerte IL-2 Produktion in LLF Mäusen (p = 0.04) 3 H thymidine incorporation (cpm) + SEM (B). Daten aus zwei Experimenten mit jeweils 8 Tieren. 5.000 4.000 3.000 2.000 1.000 0 WT LF LckF WT medium LF LckF WT MOG 35-55 LF LckF Con A Abb. 12: In LF (lysMCre BDNFfl/fl, blau) und LckF (lckCre BDNFfl/fl, hellblau) Tiere zeigen sich keine Unterschiede in der T-Zell Proliferation zu den wild-typ Kontrollen (rot) nach Aktivierung mit MOG oder Con A. - 42 - Zusammengefasst zeigt sich in der frühen Phase der MOG-EAE in Mäusen mit einer kombiniert-konditionalen Defizienz von BDNF in myeloiden Zellen und T-Zellen ein abgeschwächter klinischer Verlauf. Dieser geht mit einer verminderten entzündlichen Infiltration, einer reduzierten Produktion proinflammatorischer Zytokine sowie einer eingeschränkten T-Zellproliferation einher. 3.3. Analyse der chronischen Phase der EAE in konditionalen BDNF knock-out Mäusen 3.3.1. Klinischer Verlauf der MOG-EAE Zur Analyse eventueller neuroprotektiver Effekte von Immunzell-BDNF in der MOG-EAE wurde in den nächsten Experimenten die chronische Erkrankungsphase untersucht, in der die entzündliche Infiltration deutlich abnimmt, aber die degenerativen Veränderungen weiter zunehmen (HerreroHerranz et al., 2008). LLF Mäuse entwickelten im Verlauf der MOG-EAE bis zur chronischen Erkrankungsphase eine stärkere Behinderung mit Verschlechterung der Paraparese, während sich die wild-typ Kontrollen nach dem ersten Krankheitsmaximum leicht erholten und in der chronischen Erkrankungsphase eine sich weiter bessernde, leichte Paraparese zeigten (Abb. 13). In Relation zum Erkrankungsmaximum an Tag 20 p.i. kam es in LLF Mäusen also zu einer zunehmenden Behinderung, währenddessen sich die wild-typ Mäuse im Verlauf leicht besserten (Abb. 14). Am Tag 71 p.i. waren die LLF Mäusen in dieser Analyse im Mittel 2.5 Scorepunkte kränker als die wildtyp Kontrollen. - 43 - mean clinical score + SEM 8 7 6 5 4 3 2 WT, n=27 1 lysMCre lckCre BDNFfl/fl, n=25 0 0 10 20 30 40 50 60 70 days p.i. Abb. 13: Abgeschwächte akute Erkrankungsphase in LLF Tieren (blau), mit zunehmender Behinderung. Stärkere akute Erkrankungsphase in wild-typ Delta mean clinical score + SEM Mäusen (rot) mit Teilremission. Daten zeigen Pool aus vier Experimenten. 2,0 WT, n=27 1,5 lysMCre lckCre BDNFfl/fl, n=25 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 -2,0 20 30 40 50 60 70 days p.i. Abb. 14: Differenz der Scorewerte im Vergleich zu Tag 20 p.i. mit Zunahme der Behinderung in LLF Mäusen (blau) (Tag 71; p = 0.0003). Pool aus vier unabhängigen Experimenten (Datensatz wie in Abb. 13). - 44 - 3.3.2. Histologische Analyse in der chronischen Erkrankungsphase (Tag 54 p.i.) Analog zu den histologischen Untersuchungen in der frühen Phase der MOGEAE wurden Färbungen für T-Zellen und Makrophagen/Mikroglia sowie eine Markscheidenfärbung und eine Analyse der Axondichten nach Silberimprägnation in der chronischen Erkrankungsphase (Tag 54 p.i.) und in der späten chronischen Erkrankungsphase (Tag 71 p.i.) durchgeführt. 3.3.2.1. Analyse der Entzündungsreaktion In der verblindeten Quantifizierung der Mac-3 positiver Makrophagen und Mikroglia (Abb. 15A) sowie CD3 positiver Zellen (Abb. 15B) am Tag 54 p.i. zeigte sich wie am 14 Tag p.i. erneut eine signifikant reduzierte Infiltration der Entzündungszellen in Rückenmarksquerschnitten von LLF Mäusen. 800 CD 3 pos. cells/mm2 + SEM Mac 3 pos. cells/mm2 + SEM 1.000 800 600 400 200 700 600 500 400 300 200 100 0 BD N F fl/ =7 lc kC re T, n lys M Cr e W re lck C B ly sM C re A W T, n =7 BD N F fl/ fl ,fl n ,n =7 =7 0 Abb. 15: Signifikant weniger Mac-3 (A) positive Zellen (p < 0.005) in LLF Mäusen sowie signifikant reduzierte Anzahl von CD3 (B) positiven Zellen (p < 0.0005). - 45 - 3.3.2.2. Analyse von axonalem Schaden und Demyelinisierung an Tag 54 p.i. Die Auswertung der entmarkten Flächen am Tag 54 p.i. zeigte eine signifikant geringere Entmarkung in den LLF Mäusen im Vergleich zu wild-typ Kontrollieren (Abb. 16A). Im Vergleich zum angedeutet geringeren axonalen Verlust in den LLF Tieren am Tag 14 p.i., ergab die Analyse der Axondichten in entmarkten Läsionen nun aber einen signifikant größeren axonalen Verlust in den LLF Tieren im Vergleich zu wild-typ Mäusen (Abb. 16B), was gut mit dem in dieser Erkrankungsphase schwereren klinischen Verlauf der MOG-EAE in den LLF Mäusen korreliert. Dagegen fanden sich keine Unterschiede in der axonalen Integrität in der Periläsion, NAWM und in der GM. Abb. 17 zeigt eine representative Bielschowsky Silber Färbung von Läsionen im Bereich der Seitenstränge des thorakalen Rückenmarkes an Tag 54 p.i. mit reduzierter 25 10 20 axonal density + SEM 12 8 6 4 2 15 10 5 Abb. 16: Luxol Fast Blue Färbung (A) und Silber Färbung (B) mit signifikant geringerer Demyelinisierung (p = 0.02) sowie signifikant erhöhtem axonalen Verlust (p = 0.02) in LLF Mäusen (blau); wild-typ Kontrollen (rot). - 46 - LLF GM WT GM LLF NAWM WT NAWM LLF perilesion WT perilesion fl/ ,fl NF BD B ly s M C re lc kC re W T, n= 6 A LLF lesion WT lesion 0 0 n= 7 Demyelination (% of white matter) + SEM Dichte der Axone in LLF Tieren. Abb. 17: Silber Färbung von spinalen Läsionen an Tag 54 p.i. mit deutlich reduzierter Dichte von Axonen in der Läsion aus einer LLF Maus (B) und einer wild-typ Maus (A). Balken = 20 µm im Detail, 100 μm in der Übersicht. 3.3.3. Histologische Analyse in der späten Erkrankungsphase (Tag 71 p.i.) 3.3.3.1. Analyse der Entzündungsreaktion In der späten chronischen Phase (Tag 71 p.i.) wurde die letzte histologische Aufarbeitung durchgeführt. Im Gegensatz zum Tag 54 p.i. zeigten sich nun keine signifikanten Unterschiede mehr zwischen LLF Mäusen und wild-typ Kontrolltieren bezüglich der Infiltration CD3 positiver T-Zellen und Mac-3 positiver Makrophagen/Mikroglia (Abb. 18A,B). - 47 - 400 700 CD 3 pos. cells / mm2 + SEM Mac 3 pos. cells/mm2 + SEM 800 600 500 400 300 200 100 300 200 100 0 BD =5 lc kC re T, n M Cr e B lys A ly s M C re W lc W kC r T, n e =5 BD N N F fl/ fl , n= F fl/ =fl 7 7 0 Abb. 18: Kein signifikanter Unterschied in der Mac-3 Färbung (A) und in der CD3 Färbung (B) am Tag 71 p.i. zwischen den LLF Tieren (blau) und wild-typ Kontrollen (rot). 3.3.3.2. Analyse von axonalen Schaden und Demyelinisierung Am Tag 71 p.i. ergab die Auswertung der entmarkten Flächen in der LFB Färbung keinen Unterschied zwischen LLF Mäusen und wild-typ Kontrolltieren (Abb. 19A). Wie schon am Tag 54 p.i. zeigte sich in demyelinisierten Läsionen von LLF Mäusen erneut ein signifikant erhöhter axonaler Verlust. Ebenso konnte eine zwar nur leicht, aber signifikant verminderte axonale Dichte in der grauen Substanz der LLF Mäuse festgestellt werden. Demgegenüber waren die Axondichten in der Periläsion, sowie der normal erscheinenden weißen Substanz in beiden Gruppen nicht unterschiedlich (Abb. 19B). - 48 - axonal density + SEM 15 10 5 15 10 5 LLF GM WT GM LLF NAWM WT NAWM LLF perilesion WT perilesion LLF lesion WT lesion fl F fl/ BD N C re n= 5 ly sM C re lc k W T, A 20 0 0 ,n =7 demyelination (% of white matter) + SEM 25 20 B Abb. 19: Kein Unterschied in Demyelinisierung, LLF Mäusen (blau) wild-typ Kontrollen (rot). Silber Färbung (B) mit höherem axonalen Verlust in Läsionen in LLF Mäusen (p < 0.0001), ebenso in der grauen Substanz (p = 0.002). Zusammengefasst findet sich in der späten, chronischen Phase der MOG-EAE ein schwerer Erkrankungsverlauf mit zunehmender Behinderung in LLF Mäusen, der mit einem vermehrten axonalen Verlust speziell in entmarkten Läsionen, nicht aber mit einer verstärkten Entzündungsreaktion einhergeht. - 49 - 4. Diskussion In der vorliegenden Arbeit wird die Bedeutung von endogenem BDNF in Immunzellen für den Verlauf autoimmuner Entmarkung im ZNS untersucht. Die Analysen in konditionalen knock-out Mäusen mit selektiver Defizienz von BDNF in Immunzellen zeigen eine duale Rolle von BDNF in der der MOG-EAE, nämlich: (1) eine Bedeutung von BDNF für das axonale Überleben (2) eine Rolle von BDNF für die zelluläre und humorale Immunantwort 4.2. Effekte von Immunzell-BDNF auf axonales Überleben In der späten Phase der MOG-EAE zeigten sich die Axondichten in Läsionen von LLF Mäusen deutlich reduziert. Diese Daten sprechen dafür, dass endogenem, von Immunzellen produziertem BDNF eine protektive Rolle in der MOG EAE zukommt. Dieser protektive Effekt spiegelt sich hauptsächlich im Erhalt der Axone und nicht im Erhalt von Markscheiden wieder. Demgegenüber konnten in Modellen traumatischer Rückenmarksschädigung direkt myelinoprotektive Effekte für BDNF beobachtet werden (Ikeda et al., 2002; McTigue et al., 1998). Die LLF Maus zeigte nur direkt in entmarkten Läsionen einen axonalen Verlust. Offensichtlich wirkt sich ein Fehlen von BDNF in Läsionen nur direkt an der Stelle aus, wo es von Immunzellen produziert wird und vermittelt keine Effekte über größere Distanzen. Dies weist auf einen unmittelbar parakrinen Mechanismus der BDNF vermittelten Axonprotektion hin. Die Axon protektiven Effekte von BDNF zeigten sich nur in Mäusen mit kombinierter Defizienz von BDNF in T-Zellen und Makrophagen, nicht aber in mono-konditionalen LF und lckF Mäusen. Dies kann dadurch erklärt sein, dass für eindrücklich nachweisbare Effekte in den Läsionen nur die Summe des von T-Zellen und Makrophagen produzierten BDNF ausreichend ist, während dies in den monokonditionalen BDNF knock-outs durch die Rest-BDNF Produktion in den Läsionen noch kompensiert wird. Ein Einwand gegen den definitiven Nachweis der funktionellen Bedeutung von Immunzell-BDNF für die Axon Protektion in der LLF Maus besteht darin, dass durch die abgeschwächte Entzündungsreaktion in der - 50 - frühen Erkrankungsphase auch mögliche andere protektive Mediatoren (wie zum Beispiel glial derived neurotrophic facor (GDNF), NT3 oder auch leukemia inhibitory factor (LIF), die alle von Immunzellen produziert werden (Besser and Wank, 1999; Vanderlocht et al., 2006) in geringerem Maße in Läsionen gelangen. Dies schwächt die Spezifität der erhobenen Befunde theoretisch ab. Hier könnten Ansätze mit therapeutischer Gabe von BDNF oder auch weitere konditionale knock-out Modelle weiterführende Befunde liefern, zum Beispiel die EAE Analyse in Mäusen, die nach konditionaler Deletion neuronal oder astrozytär kein BDNF exprimieren. Bisherige Ansätze zur systemischen therapeutischen Gabe von BDNF schlugen aufgrund der fehlenden BDNF Akkumulation in Läsionen fehlt (Dittrich et al., 1996). Eine experimentelle Möglichkeit exogenes BDNF in eine Läsion zu bringen, könnte durch MOG spezifische T-Zellen bewerkstelligt werden, die in die Läsionen einwandern können (sog. „Homing“) und dort BDNF (z.B. durch lentivirale Infektion) sezernieren. Dadurch ließe sich die Axon protektive Funktion von BDNF im experimentellen Modell weiter untersuchen. Die im Rahmen dieser Arbeit herausgearbeitete Axon protektive Bedeutung von BDNF eröffnen die Möglichkeit einer therapeutischen Nutzung von BDNF zur protektiven oder gar reparativen Therapie bei chronischentzündlichen ZNS Erkrankungen. Dies wäre allem bei chronisch-progredienten Erkrankungsverläufen von Interesse, bei denen die therapeutischen Optionen immer noch limitiert sind. Vorangegangene Studien berichten über die erfolgreiche Verabreichung von BDNF in einem motoneuronal degenerativen Mausmodell (Mitsumoto et al., 1994). Allerdings enttäuschte das therapeutische Konzept bei der Übertragung auf den Menschen 1999, was unter Umständen auf der limitierten Verfügbarkeit von systemisch oder auch intrathekal gegebenen BDNF im ZNS beruhen könnte (Dittrich et al., 1996). Dementsprechend zeigte die exogene Verabreichung von freiem BDNF im Modell der experimentellen autoimmunen Neuritis (EAN) ebenfalls keine Wirksamkeit (Felts et al., 2002). Zwischenzeitlich wurden Therapieansätze in der Multiplen Sklerose gefunden, für die auch neuroprotektive Effekte diskutiert werden. Die zur Behandlung der schubförmig verlaufenden Multiplen Sklerose zugelassene Substanz Glatirameracetat führt zur vermehrten Produktion von BDNF in - 51 - Glatirameracetat spezifischen T-Zellen (Aharoni et al., 2003), insbesondere in Th2-Zellen (Ziemssen and Schrempf, 2007). Bisher konnten in der Behandlung chronisch progredienter MS Verläufe mit Glatirameracetat aber leider keine durchschlagenden Erfolge erzielt werden. Zusammenfassend spricht der axonale Schutz durch Immunzell-BDNF in EAE Läsionen für das Konzept der neuroprotektiven Autoimmunität, das durch die beobachteten Effekte in den LLF Mäusen weiter gestützt wird. Insgesamt rückt durch diese Daten BDNF in den Fokus des Interesses und ist auch für therapeutische Möglichkeiten ein sehr reizvoller Ansatz. 4.2. In Effekte von Immunzell-BDNF auf die Immunantwort der frühen Phase der MOG-EAE zeigten sich in LLF Mäusen überraschenderweise deutliche immunologische Effekte mit einer verminderten entzündlichen Infiltration, einer gestörten Th1/Th17 Antwort und einer verminderten T-Zell Proliferation. Hier können sowohl parakrine als auch autokrine Wirkungen von BDNF zum Tragen kommen. Ein immunologischer Effekt von BDNF konnte schon auf eosinophile Granulozyten und in der Entwicklung von B-Zellen gezeigt werden (Nassenstein et al., 2003; Schuhmann et al., 2005). Im Modell der LLF Maus zeigt sich nun auch eine Bedeutung von BDNF für die T-Zellantwort, die zuvor nicht beschrieben wurde. Primär beeinflusst BDNF dabei die IL-2 Expression. IL-2 ist ein zentraler Wachstumsfaktor für T-Zellen, so dass auf diese Weise über BDNF vermittelte Mechanismen die Expansion von Antigen spezifischen T-Zellen reguliert wird. Sekundär ist dann in der LLF Maus aufgrund der eingeschränkten T Zellproliferation die Th1/Th17 Antwort und dann auch die T-Zell- und Makrophageninfiltrarion abgeschwächt, was sich letztlich in einem schwächeren Krankheitsverlauf in der frühen Krankheitsphase der MOG-EAE auswirkt. Im Immunsystem wird die Wirkung von BDNF über den hochaffinen TrkB Rezeptors vermittelt, der sich auf T-Zellen, und neben niederaffinen p75 Rezeptoren auch auf Antigen präsentierenden Zellen findet (Kruse et al., 2007; Laurenzi et al., 1994). Während der T-Zell Aktivierung könnte BDNF über Signalwege wirken, die den Transkriptionsfaktor „c-AMP responsive element binding protein“ (CREB) einschließen. Eine BDNF abhängige Aktivierung von CREB wurde bereits in Neuronen gezeigt, wo dieser Faktor eine Rolle bei der - 52 - Gedächtnisbildung im Rahmen der sog. Langzeitpotenzierung spielt (Dash et al., 1990). CREB kommt aber auch eine Rolle in der Regulation von Zytokin Genen wie zum Beispiel dem IL-2 Gen zu das Bindestellen für CREB in seinen regulatorischen Gen Elementen besitzt (Butscher et al., 1998). Die funktionelle Bedeutung von CREB im Immunsystem konnte bereits vor einiger Zeit in Mäusen gezeigt werden, die eine dominant negative CREB Mutation exprimieren. In diesem Modell findet sich eine deutlich reduzierte IL-2 Produktion und eine eingeschränkte Thymozytenproliferation (Barton et al., 1996). Die Untersuchung der Aktivierung von CREB und auch seinem Regulator CREM in der LLF Maus bedarf weiterer Untersuchungen. Die Rolle neurotropher Faktoren im Immunsystem wurde schon für den „leukemia inhibitory factor“ (LIF), einem neurotrophen Zytokin (Vanderlocht et al., 2006), und für das Neurotrophin „nerve growth factor“ (NGF) beschrieben. In LIF knock-out Mäsuen zeigt sich in der späteren Erkrankungsphase eine schwächere MOG-EAE, was vermutlich durch die Akkumulation von neutrophilen Granulozyten in Läsionen bewirkt wird, die die Entzündung modulieren (Linker et al., 2008). NGF führt in aktivierten T-Zellen zu einer sog. immediate early gene response“. Auf diese Weise wurde für NGF im Immunsystem eine Bedeutung für die B-Zell Proliferation und in der Regulation der Immunzell-Apoptose gezeigt (Otten et al., 1989). In EAE Modellen in der Ratte und dem Weissbüschelaffen führte die Gabe von NGF zu einer abgeschwächten EAE (Villoslada et al., 2000), was am ehesten durch einen Einfluss auf die Monozytenmigration vermittelt wird (Flugel et al., 2001). Zusammengefasst zeigt die Analyse der MOG-EAE in der LLF Maus einen Axon protektiven Effekt von BDNF, aber auch eine bisher nicht beschriebene Bedeutung von BDNF in der IL-2 abhängigen T-Zell Expansion. Somit besitzt BDNF eine duale Rolle in Nervensystem und Immunsystem und stellt ein (molekulares) Bindeglied in der Funktion dieser beiden komplexen Organsysteme dar. Eine solche Redundanz in der Funktion von Signalmolekülen in Nervensystem und Immunsystem wurde auch für viele andere Zytokine, Mediatoren und auch Hormone, wie z.B. für TNF-α, IL-6, Platelet acitvating factor (PAF), Neuropeptid Y, Substanz P, ADP, und Steroidhormone beschrieben (Druker et al., 2006). - 53 - In den letzten Jahren wurden auch weitere mögliche Funktionen von BDNF außerhalb des Nervensystems untersucht. So wurde kürzlich eine Expression von BDNF und seinem Rezeptor TrkB in der Prostata (Dalal and Djakiew, 1997) und für den BDNF Rezeptor TrkB eine Expression auch im Thymus beschrieben, was die Möglichkeit einer weiter reichenden Bedeutung dieses Faktors im Körper eröffnet (Berzi et al., 2008; Maroder et al., 1996). 5. Zusammenfassung Das Neurotrophin “brain derived neurotrophic factor” (BDNF) spielt eine entscheidende Rolle für das neuronale Überleben, neuronale Differenzierung und Plastizität. In neurobiologischen Modellen konnten auch Axon protektive Effekte gezeigt werden. Während im ZNS bioaktives BDNF überwiegend von Neuronen produziert wird konnte eine Expression von BDNF auch in Immunzellen in vitro und Läsionen der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) sowie bei Multipler Sklerose (MS) nachgewiesen werden. Angesichts dieser Beobachtungen vermutete man, dass Immunzellen nicht zwangsläufig nur Gewebe schädigende, sondern auch neuroprotektive Effekte via BDNF vermitteln können. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von BDNF in der Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) induzierten EAE untersucht, welche viele Ähnlichkeiten mit der MS besitzt. Mäuse mit selektiver BDNF Defizienz in T-Zellen und Makrophagen/Mikroglia zeigen eine abgeschwächte Immunantwort in der frühen Erkrankungsphase, die maßgeblich durch eine eingeschränkte IL-2 abhängige T-Zellproliferation bedingt ist. Allerdings zeigten die Mutanten im weiteren Erkrankungsverlauf eine zunehmende Behinderung und einen im Vergleich zur Kontrollgruppe ausgeprägteren axonalen Verlust in der späten chronischen Phase der EAE. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass BDNF bei autoimmuner Entmarkung im ZNS eine bifunktionale Rolle spielt und zum einen die T-Zell Antwort beeinflusst zum anderen aber auch Axon protektive Eigenschaften besitzt. Diese Ergebnisse bestätigen die funktionelle Relevanz des Konzepts der neuroprotektiven Autoimmunität und rücken BDNF in Zentrum als mögliches neues Therapieziel bei chronisch-entzündlichen ZNS Erkrankungen. - 54 - 6. Literaturverzeichnis Aharoni, R., Kayhan, B., Eilam, R., Sela, M. and Arnon, R. (2003). Glatiramer acetate-specific T cells in the brain express T helper 2/3 cytokines and brainderived neurotrophic factor in situ. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A 100, 1415714162 Archelos, J. J. and Hartung, H. P. (1997). The role of adhesion molecules in multiple sclerosis: biology, pathogenesis and therapeutic implications. Mol. Med Today 3, 310-321 Archelos, J. J., Jung, S., Maurer, M., Schmied, M., Lassmann, H., Tamatani, T., Miyasaka, M., Toyka, K. V. and Hartung, H. P. (1993). Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by an antibody to the intercellular adhesion molecule ICAM-1. Ann. Neurol 34, 145-154 Babbe, H., Roers, A., Waisman, A., Lassmann, H., Goebels, N., Hohlfeld, R., Friese, M., Schroder, R., Deckert, M., Schmidt, S., Ravid, R. and Rajewsky, K. (2000). Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med 192, 393-404 Barbacid, M. (1995). Neurotrophic factors and their receptors. Curr. Opin. Cell Biol. 7, 148-155 Barton, K., Muthusamy, N., Chanyangam, M., Fischer, C., Clendenin, C. and Leiden, J. M. (1996). Defective thymocyte proliferation and IL-2 production in transgenic mice expressing a dominant-negative form of CREB. Nature 379, 8185 Bechtold, D. A., Kapoor, R. and Smith, K. J. (2004). Axonal protection using flecainide in experimental autoimmune encephalomyelitis. Ann. Neurol 55, 607616 Ben-Nun, A. and Lando, Z. (1983). Detection of autoimmune cells proliferating to myelin basic protein and selection of T cell lines that mediate experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. J Immunol. 130, 1205-1209 Ben-Nun, A., Liblau, R. S., Cohen, L., Lehmann, D., Tournier-Lasserve, E., Rosenzweig, A., Zhang, J. W., Raus, J. C. and Bach, M. A. (1991). Restricted T-cell receptor V beta gene usage by myelin basic protein-specific T-cell clones in multiple sclerosis: predominant genes vary in individuals. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A 88, 2466-2470 Berzi, A., Ayata, C. K., Cavalcante, P., Falcone, C., Candiago, E., Motta, T., Bernasconi, P., Hohlfeld, R., Mantegazza, R., Meinl, E. and Farina, C. (2008). - 55 - BDNF and its receptors in human myasthenic thymus: Implications for cell fate in thymic pathology. J Neuroimmunol. 197, 128-139 Besser, M. and Wank, R. (1999). Cutting edge: clonally restricted production of the neurotrophins brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNA by human immune cells and Th1/Th2-polarized expression of their receptors. J Immunol. 162, 6303-6306 Bitsch, A., Da, C. C., Bunkowski, S., Weber, F., Rieckmann, P. and Bruck, W. (1998). Identification of macrophage populations expressing tumor necrosis factor-alpha mRNA in acute multiple sclerosis. Acta Neuropathol. 95, 373-377 Black, J. A., Liu, S., Hains, B. C., Saab, C. Y. and Waxman, S. G. (2006). Longterm protection of central axons with phenytoin in monophasic and chronicrelapsing EAE. Brain 129, 3196-3208 Brandon, E. P., Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995). Targeting the mouse genome: a compendium of knockouts (Part II). Curr. Biol. 5, 758-765 Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol. Endocrinol. 25, 169-193 Butscher, W. G., Powers, C., Olive, M., Vinson, C. and Gardner, K. (1998). Coordinate transactivation of the interleukin-2 CD28 response element by c-Rel and ATF-1/CREB2. J Biol. Chem. 273, 552-560 Calida, D. M., Constantinescu, C., Purev, E., Zhang, G. X., Ventura, E. S., Lavi, E. and Rostami, A. (2001). Cutting edge: C3, a key component of complement activation, is not required for the development of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. J Immunol. 166, 723-726 Carroll, P., Lewin, G. R., Koltzenburg, M., Toyka, K. V. and Thoenen, H. (1998). A role for BDNF in mechanosensation. Nat Neurosci. 1, 42-46 Cassan, C., Piaggio, E., Zappulla, J. P., Mars, L. T., Couturier, N., Bucciarelli, F., Desbois, S., Bauer, J., Gonzalez-Dunia, D. and Liblau, R. S. (2006). Pertussis toxin reduces the number of splenic Foxp3+ regulatory T cells. J Immunol. 177, 1552-1560 Chao, M. V. (1994). The p75 neurotrophin receptor. J Neurobiol. 25, 1373-1385 Chao, M. V. (2003). Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signalling pathways. Nat. Rev. Neurosci. 4, 299-309 Charcot, M. (1868). Histologie de la sclerose en plaques. Gaz Hospital 144, 554-558 - 56 - Confavreux, C., Vukusic, S., Moreau, T. and Adeleine, P. (2000). Relapses and progression of disability in multiple sclerosis. N. Engl. J Med 343, 1430-1438 Dalal, R. and Djakiew, D. (1997). Molecular characterization of neurotrophin expression and the corresponding tropomyosin receptor kinases (trks) in epithelial and stromal cells of the human prostate. Mol. Cell Endocrinol. 134, 1522 Dash, P. K., Hochner, B. and Kandel, E. R. (1990). Injection of the cAMPresponsive element into the nucleus of Aplysia sensory neurons blocks longterm facilitation. Nature 345, 718-721 De Stefano, N., Guidi, L., Stromillo, M. L., Bartolozzi, M. L. and Federico, A. (2003). Imaging neuronal and axonal degeneration in multiple sclerosis. Neurol Sci. 24, S283-S286 Dittrich, F., Ochs, G., Grosse-Wilde, A., Berweiler, U., Yan, Q., Miller, J. A., Toyka, K. V. and Sendtner, M. (1996). Pharmacokinetics of intrathecally applied BDNF and effects on spinal motoneurons. Exp. Neurol. 141, 225-239 Druker, J., Liberman, A. C., Acuna, M., Giacomini, D., Refojo, D., Silberstein, S., Pereda, M. P., Stalla, G. K., Holsboer, F. and Arzt, E. (2006). Molecular understanding of cytokine-steroid hormone dialogue: implications for human diseases. Ann. N. Y. Acad Sci. 1088, 297-306 Engelhardt, B., Conley, F. K. and Butcher, E. C. (1994). Cell adhesion molecules on vessels during inflammation in the mouse central nervous system. J Neuroimmunol 51, 199-208 Engelhardt, B., Vajkoczy, P. and Laschinger, M. (2003). Detection of endothelial/lymphocyte interaction in spinal cord microvasculature by intravital videomicroscopy. Methods Mol. Med 89, 83-93 Felts, P. A., Smith, K. J., Gregson, N. A. and Hughes, R. A. (2002). Brainderived neurotrophic factor in experimental autoimmune neuritis. J. Neuroimmunol. 124, 62-69 Ferguson, B., Matyszak, M. K., Esiri, M. M. and Perry, V. H. (1997). Axonal damage in acute multiple sclerosis lesions. Brain 120, 393-399 Flugel, A., Matsumuro, K., Neumann, H., Klinkert, W. E., Birnbacher, R., Lassmann, H., Otten, U. and Wekerle, H. (2001). Anti-inflammatory activity of nerve growth factor in experimental autoimmune encephalomyelitis: inhibition of monocyte transendothelial migration. Eur. J Immunol. 31, 11-22 Gold, R., Linington, C. and Lassmann, H. (2006). Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and - 57 - culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain 129, 1953-1971 Hammarberg, H., Lidman, O., Lundberg, C., Eltayeb, S. Y., Gielen, A. W., Muhallab, S., Svenningsson, A., Linda, H., van Der Meide, P. H., Cullheim, S., Olsson, T. and Piehl, F. (2000). Neuroprotection by encephalomyelitis: rescue of mechanically injured neurons and neurotrophin production by CNS-infiltrating T and natural killer cells. J. Neurosci. 20, 5283-5291 Hennet, T., Hagen, F. K., Tabak, L. A. and Marth, J. D. (1995). T-cell-specific deletion of a polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferase gene by sitedirected recombination. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A 92, 12070-12074 Herrero-Herranz, E., Pardo, L. A., Bunt, G., Gold, R., Stuhmer, W. and Linker, R. A. (2007). Re-expression of a developmentally restricted potassium channel in autoimmune demyelination: Kv1.4 is implicated in oligodendroglial proliferation. Am J Pathol. 171, 589-598 Herrero-Herranz, E., Pardo, L. A., Gold, R. and Linker, R. A. (2008). Pattern of axonal injury in murine myelin oligodendrocyte glycoprotein induced experimental autoimmune encephalomyelitis: implications for multiple sclerosis. Neurobiol. Dis. 30, 162-173 Hofer, M. M. and Barde, Y. A. (1988). Brain-derived neurotrophic factor prevents neuronal death in vivo. Nature 331, 261-262 Hohlfeld, R., Kerschensteiner, M., Stadelmann, C., Lassmann, H. and Wekerle, H. (2000). The neuroprotective effect of inflammation: implications for the therapy of multiple sclerosis. J Neuroimmunol 107, 161-166 Ikeda, O., Murakami, M., Ino, H., Yamazaki, M., Koda, M., Nakayama, C. and Moriya, H. (2002). Effects of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) on compression-induced spinal cord injury: BDNF attenuates down-regulation of superoxide dismutase expression and promotes up-regulation of myelin basic protein expression. J Neuropathol Exp Neurol.142-153 Kebir, H., Kreymborg, K., Ifergan, I., Dodelet-Devillers, A., Cayrol, R., Bernard, M., Giuliani, F., Arbour, N., Becher, B. and Prat, A. (2007). Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med 13, 1173-1175 Kernie, S. G., Liebl, D. J. and Parada, L. F. (2000). BDNF regulates eating behavior and locomotor activity in mice. EMBO J 19, 1290-1300 Kerschensteiner, M., Gallmeier, E., Behrens, L., Leal, V. V., Misgeld, T., Klinkert, W. E., Kolbeck, R., Hoppe, E., Oropeza-Wekerle, R. L., Bartke, I., Stadelmann, C., Lassmann, H., Wekerle, H. and Hohlfeld, R. (1999). Activated - 58 - human T cells, B cells, and monocytes produce brain-derived neurotrophic factor in vitro and in inflammatory brain lesions: a neuroprotective role of inflammation? J Exp. Med 189, 865-870 Klein, R., Nanduri, V., Jing, S. A., Lamballe, F., Tapley, P., Bryant, S., CordonCardo, C., Jones, K. R., Reichardt, L. F. and Barbacid, M. (1991). The trkB tyrosine protein kinase is a receptor for brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3. Cell 66, 395-403 Knüsel, B., Beck, KD., Winslow, JW., Rosenthal, A., Burton, L. E., Widmer, H. R., Nikolics, K. and Hefti, F. (1992). Brain-derived neurotrophic factor administration protects basal forebrain cholinergic but not nigral dopaminergic neurons from degenerative changes after axotomy in the adult rat brain. J Neurosci. 12, 4391-4402 Koh, D. R., Fung-Leung, W. P., Ho, A., Gray, D., cha-Orbea, H. and Mak, T. W. (1992). Less mortality but more relapses in experimental allergic encephalomyelitis in CD8-/- mice. Science 256, 1210-1213 Koritschoner, S. (1925). Induktion von Paralyse und Rückenmarksentzündung durch Immunisierung von Kaninchen mit menschlichem Rückenmarksgewebe. Z. Immunitätsf Exp Therapie 42, 217-283 Korn, T., Anderson, A. C., Bettelli, E. and Oukka, M. (2007). The dynamics of effector T cells and Foxp3+ regulatory T cells in the promotion and regulation of autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol 191, 51-60 Kornek, B. and Lassmann, H. (1999). Axonal pathology in multiple sclerosis. A historical note. Brain Pathol. 9, 651-656 Korte, M., Carroll, P., Wolf, E., Brem, G., Thoenen, H. and Bonhoeffer, T. (1995). Hippocampal long-term potentiation is impaired in mice lacking brainderived neurotrophic factor. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A 92, 8856-8860 Kruse, N., Cetin, S., Chan, A., Gold, R. and Luhder, F. (2007). Differential expression of BDNF mRNA splice variants in mouse brain and immune cells. J Neuroimmunol 182, 13-21 Kuhlmann, T., Lingfeld, G., Bitsch, A., Schuchardt, J. and Bruck, W. (2002). Acute axonal damage in multiple sclerosis is most extensive in early disease stages and decreases over time. Brain 125, 2202-2212 Laurenzi, M. A., Barbany, G., Timmusk, T., Lindgren, J. A. and Persson, H. (1994). Expression of mRNA encoding neurotrophins and neurotrophin receptors in rat thymus, spleen tissue and immunocompetent cells. Regulation of neurotrophin-4 mRNA expression by mitogens and leukotriene B4. Eur. J Biochem. 223, 733-741 - 59 - Leibrock, J., Lottspeich, F., Hohn, A., Hofer, M., Hengerer, B., Masiakowski, P., Thoenen, H. and Barde, Y. A. (1989). Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor. Nature 341, 149-152 Levine, J. M., Reynolds, R. and Fawcett, J. W. (2001). The oligodendrocyte precursor cell in health and disease. Trends Neurosci. 24, 39-47 Lewin, G. R. and Barde, Y. A. (1996). Physiology of the neurotrophins. Annu. Rev. Neurosci. 19, 289-317 Linington, C., Berger, T., Perry, L., Weerth, S., Hinze-Selch, D., Zhang, Y., Lu, H. C., Lassmann, H. and Wekerle, H. (1993). T cells specific for the myelin oligodendrocyte glycoprotein mediate an unusual autoimmune inflammatory response in the central nervous system. Eur. J Immunol. 23, 1364-1372 Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C. and Vass, K. (1988). Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. Am J Pathol. 130, 443-454 Linker, R. A., Kruse, N., Israel, S., Wei, T., Seubert, S., Hombach, A., Holtmann, B., Luhder, F., Ransohoff, R. M., Sendtner, M. and Gold, R. (2008). Leukemia inhibitory factor deficiency modulates the immune response and limits autoimmune demyelination: a new role for neurotrophic cytokines in neuroinflammation. J Immunol. 180, 2204-2213 Linker, R. A., Maurer, M., Gaupp, S., Martini, R., Holtmann, B., Giess, R., Rieckmann, P., Lassmann, H., Toyka, K. V., Sendtner, M. and Gold, R. (2002). CNTF is a major protective factor in demyelinating CNS disease: a neurotrophic cytokine as modulator in neuroinflammation. Nat Med 8, 620-624 Livak, K. J. and Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408 Lomen-Hoerth, C. and Shooter, E. M. (1995). Widespread neurotrophin receptor expression in the immune system and other nonneuronal rat tissues. J Neurochem. 64, 1780-1789 Lyons, W. E., Mamounas, L. A., Ricaurte, G. A., Coppola, V., Reid, S. W., Bora, S. H., Wihler, C., Koliatsos, V. E. and Tessarollo, L. (1999). Brain-derived neurotrophic factor-deficient mice develop aggressiveness and hyperphagia in conjunction with brain serotonergic abnormalities. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A 96, 15239-15244 Mack, T. G., Reiner, M., Beirowski, B., Mi, W., Emanuelli, M., Wagner, D., Thomson, D., Gillingwater, T., Court, F., Conforti, L., Fernando, F. S., Tarlton, - 60 - A., Andressen, C., Addicks, K., Magni, G., Ribchester, R. R., Perry, V. H. and Coleman, M. P. (2001). Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene. Nat Neurosci. 4, 1199-1206 Maroder, M., Bellavia, D., Meco, D., Napolitano, M., Stigliano, A., Alesse, E., Vacca, A., Giannini, G., Frati, L., Gulino, A. and Screpanti, I. (1996). Expression of trKB neurotrophin receptor during T cell development. Role of brain derived neurotrophic factor in immature thymocyte survival. J Immunol. 157, 2864-2872 Matsumoto, T., Rauskolb, S., Polack, M., Klose, J., Kolbeck, R., Korte, M. and Barde, Y. A. (2008). Biosynthesis and processing of endogenous BDNF: CNS neurons store and secrete BDNF, not pro-BDNF. Nat Neurosci. 11, 131-133 Matthews, P. M., De Stefano, N., Narayanan, S., Francis, G. S., Wolinsky, J. S., Antel, J. P. and Arnold, D. L. (1998). Putting magnetic resonance spectroscopy studies in context: axonal damage and disability in multiple sclerosis. Semin. Neurol 18, 327-336 McTigue, D. M., Horner, P. J., Stokes, B. T. and Gage, F. H. (1998). Neurotrophin-3 and brain-derived neurotrophic factor induce oligodendrocyte proliferation and myelination of regenerating axons in the contused adult rat spinal cord. J Neurosci. 18, 5354-5365 Merkler, D., Schmelting, B., Czeh, B., Fuchs, E., Stadelmann, C. and Bruck, W. (2006). Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Mult Scler 12, 369-374 Mitsumoto, H., Ikeda, K., Klinkosz, B., Cedarbaum, J. M., Wong, V. and Lindsay, R. M. (1994). Arrest of motor neuron disease in wobbler mice cotreated with CNTF and BDNF. Science 265, 1107-1110 Moalem, G., Leibowitz-Amit, R., Yoles, E., Mor, F., Cohen, I. R. and Schwartz, M. (1999). Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy. Nat Med 5, 49-55 Muhallab, S., Lundberg, C., Gielen, A. W., Lidman, O., Svenningsson, A., Piehl, F. and Olsson, T. (2002). Differential expression of neurotrophic factors and inflammatory cytokines by myelin basic protein-specific and other recruited T cells infiltrating the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis. Scand. J Immunol. 55, 264-273 Mullis, K. B. and Faloona, F. A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 Nassenstein, C., Braun, A., Erpenbeck, V. J., Lommatzsch, M., Schmidt, S., Krug, N., Luttmann, W., Renz, H. and Virchow, J. C., Jr. (2003). The - 61 - neurotrophins nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3, and neurotrophin-4 are survival and activation factors for eosinophils in patients with allergic bronchial asthma. J Exp Med 198, 455-467 Nassenstein, C., Braun, A., Nockher, W. A. and Renz, H. (2005). Neurotrophin effects on eosinophils in allergic inflammation. Curr. Allergy Asthma Rep. 5, 204-211 Neumann, H. (2003). Molecular mechanisms of axonal damage in inflammatory central nervous system diseases. Curr. Opin. Neurol 16, 267-273 Otten, U., Ehrhard, P. and Peck, R. (1989). Nerve growth factor induces growth and differentiation of human B lymphocytes. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A 86, 10059-10063 Pellkofer, H., Schubart, A. S., Hoftberger, R., Schutze, N., Pagany, M., Schuller, M., Lassmann, H., Hohlfeld, R., Voltz, R. and Linington, C. (2004). Modelling paraneoplastic CNS disease: T-cells specific for the onconeuronal antigen PNMA1 mediate autoimmune encephalomyelitis in the rat. Brain 127, 18221830 Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A. and Trapp, B. D. (2001). Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann. Neurol 50, 389-400 Raine, C. S., Traugott, U., Iqbal, K., Snyder, D. S., Cohen, S. R., Farooq, M. and Norton, W. T. (1978). Encephalitogenic properties of purified preparations of bovine oligodendrocytes tested in guinea pigs. Brain Res. 142, 85-96 Reynolds, R., Dawson, M., Papadopoulos, D., Polito, A., Di, B., I, Pham-Dinh, D. and Levine, J. (2002). The response of NG2-expressing oligodendrocyte progenitors to demyelination in MOG-EAE and MS. J Neurocytol. 31, 523-536 Rios, M., Fan, G., Fekete, C., Kelly, J., Bates, B., Kuehn, R., Lechan, R. M. and Jaenisch, R. (2001). Conditional deletion of brain-derived neurotrophic factor in the postnatal brain leads to obesity and hyperactivity. Mol. Endocrinol. 15, 1748-1757 Rivers, T. M., Sprunt, D. H. and Berry, G. P. (1933). Observations on attempts to produce acute disseminated encephalomyelitis in monkeys. J Exp Med 58, 39-53 Sagot, Y., Vejsada, R. and Kato, A. C. (1997). Clinical and molecular aspects of motoneurone diseases: animal models, neurotrophic factors and Bcl-2 oncoprotein. Trends Pharmacol. Sci. 18, 330-337 - 62 - Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. and Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491 Sauer, B. and Henderson, N. (1990). Targeted insertion of exogenous DNA into the eukaryotic genome by the Cre recombinase. New Biol.441-449 Schuhmann, B., Dietrich, A., Sel, S., Hahn, C., Klingenspor, M., Lommatzsch, M., Gudermann, T., Braun, A., Renz, H. and Nockher, W. A. (2005). A role for brain-derived neurotrophic factor in B cell development. J. Neuroimmunol. 163, 15-23 Schwartz, M. and Kipnis, J. (2001). Protective autoimmunity: regulation and prospects for vaccination after brain and spinal cord injuries. Trends Mol. Med. 7, 252-258 Schwartz, M., Moalem, G., Leibowitz-Amit, R. and Cohen, I. R. (1999). Innate and adaptive immune responses can be beneficial for CNS repair. Trends Neurosci. 22, 295-299 Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F. and Tse, H. Y. (1996). Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: mapping of T cell epitopes and T cell receptor V beta gene segment usage. J Neurosci. Res. 45, 690-699 Sospedra, M. and Martin, R. (2005). Immunology of multiple sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 Stadelmann, C. and Bruck, W. (2008). Interplay between mechanisms of damage and repair in multiple sclerosis. J Neurol 255, 12-18 Stadelmann, C., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Bruck, W., Hohlfeld, R. and Lassmann, H. (2002). BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells? Brain 125, 75-85 Trapp, B. D., Peterson, J., Ransohoff, R. M., Rudick, R., Mork, S. and Bo, L. (1998). Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N. Engl. J. Med. 338, 278-285 Tzartos, J. S., Friese, M. A., Craner, M. J., Palace, J., Newcombe, J., Esiri, M. M. and Fugger, L. (2008). Interleukin-17 production in central nervous systeminfiltrating T cells and glial cells is associated with active disease in multiple sclerosis. Am J Pathol. 172, 146-155 Vanderlocht, J., Hellings, N., Hendriks, J. J., Vandenabeele, F., Moreels, M., Buntinx, M., Hoekstra, D., Antel, J. P. and Stinnissen, P. (2006). Leukemia - 63 - inhibitory factor is produced by myelin-reactive T cells from multiple sclerosis patients and protects against tumor necrosis factor-alpha-induced oligodendrocyte apoptosis. J Neurosci Res 83, 763-774 Villoslada, P., Hauser, S. L., Bartke, I., Unger, J., Heald, N., Rosenberg, D., Cheung, S. W., Mobley, W. C., Fisher, S. and Genain, C. P. (2000). Human nerve growth factor protects common marmosets against autoimmune encephalomyelitis by switching the balance of T helper cell type 1 and 2 cytokines within the central nervous system. J. Exp. Med. 191, 1799-1806 Wekerle, H., Kojima K, Lannes-Vieira J, Lassmann H and Linington C (1994). Animal models. Ann Neurol. 36, 47-53 Zhang, B., Yamamura, T., Kondo, T., Fujiwara, M. and Tabira, T. (1997). Regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by natural killer (NK) cells. J Exp Med. 186, 1677-1687 Ziemssen, T. and Schrempf, W. (2007). Glatiramer acetate: mechanisms of action in multiple sclerosis. Int. Rev. Neurobiol. 79, 537-570 - 64 - Danksagung Zu guter Letzt möchte ich mich für all die Hilfe bedanken, die mir im Laufe der Arbeit zu teil geworden ist. Den größten Anteil an dieser Arbeit trägt Dr. med. Ralf Linker, der mich seit dem Beginn des Projektes beraten hatte und mir zu jeder Zeit tatkräftig zur Seite gestanden hat. Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Ralf Gold als Leiter der Neurologischen Abteilung des St. Josefs Hospitals für die Überlassung des Themas und für die hervorragenden Arbeitsbedingungen, die die Arbeit sehr erleichtert haben. Auch bei Herrn PD Dr. rer. nat. Fred Lühder möchte ich mich für die vielen und lehrreichen Diskussionen bedanken. Ohne die Hilfe von Dr. rer. nat. Niels Kruse wäre so mancher Teil der Arbeit deutlich schwerer zu Stande gekommen. Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Silvia Seubert, die eine hervorragende technische Assisstentin ist. Eine bessere technische Assisstentin kann man sich nicht wünschen. Ebenso gilt mein Dank Frau Alexandra Bohl, die mit ihrer Unterstützung auch das Projekt vorangetrieben hat. Lebenslauf Persönliche Daten: Name Geburtsdatum Geburtsort Konfession De-Hyung Lee 28. Februar 1974 Frankfurt am Main katholisch Schulausbildung 08/1980 - 07/1984 08/1984 - 06/1993 06/1993 Gruneliusschule Grund- und Hauptschule Frankfurt Carl- Schurz- Gymnasium Frankfurt Abitur Zivildienst 12/1993 - 02/1995 Therapeutische Nachsorge Wohngemeinschaften im Stadtgebiet Frankfurt (Drogenberatung) Hochschulausbildung 11/1995 - 07/1997 11/1997 - 03/2001 04/2001 - 02/2003 Vorklinisches Studium an der Universität Würzburg Klinisches Studium an der Universität Würzburg Praktisches Jahr 20.08.1997 27.08.1998 20.03.2001 04.06.2002 Ärztliche Vorprüfung Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Ärztliche Prüfung 14.02.2004 Approbation Arbeitgeber/ Dienststelle 01.08.2002-31.01.2004 01.02.2004- 30.11.2006 Arzt im Praktikum, Neurologische Universitätsklinik Würzburg Wissenschaftlicher Assistent im Institut für Multiple Sklerose Forschung Göttingen und 01.10.2004-15.05.2006 16.05.2006-31.12.2006 1.12.2006- gemeinnützige Hertie Stiftung (Leitung Prof. Gold) und Mitbetreuung der MS- Ambulanz der Neurologischen Universitätsklinik Göttingen (UKG) (Leitung Prof. Bähr) Notaufnahme und Stroke Unit UKG Neurologische Intensivstation UKG Wissenschaftlicher Assistent und Assistenzarzt der Neurologischen Klinik der Ruhr Universität St. Josef Hospital Bochum
