Development of Inhibitors for the Enzyme IspF - ETH E

Diss. ETH No. 19777
Development of Inhibitors for the Enzyme IspF
using High-Throughput Screening and Structure-Based
Design
A dissertation submitted to the
ETH ZURICH
For the degree of
DOCTOR OF SCIENCES
Presented by
Julie Géraldine Geist
M. Sci., University of Strasbourg (France)
Born March 4th, 1983
Citizen of France
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. François Diederich, examiner
Prof. Dr. Hans-Jürg Borschberg, co-examiner
Prof. Dr. Adelbert Bacher, co-examiner
Zurich 2011
Abstract
Abstract
Malaria is one of the most prevalent diseases, with approximately 300–500
million infections and 1–3 million deaths annually. A growing number of resistant
Plasmodium strains against common antimalarial agents are observed, making the
search for new drugs with novel mode of actions tremendously important.
The discovery of the non-mevalonate pathway for the biosynthesis of the isoprenoid
precursors isopentenyl diphosphate (IPP, 17) and dimethylallyl diphosphate
(DMAPP, 18) in the early 1990s afforded new therapeutic targets for the development
of new antimalarial drugs. Since this alternative pathway is present in pathogenic
bacteria such as Mycobacterium tuberculosis as well as in protozoan pathogens such
as Plasmodium falciparum, and is absent in humans, the enzymes of this pathway
have been recognized as attractive drug targets.
In this project, the fifth enzyme in the non-mevalonate pathway, IspF
(EC 4.6.1.12), was chosen as target for the development of new inhibitors, using
either high-throughput screening (HTS) or structure-based design.
Many X-ray
crystal structures of IspF are available in the Protein Data Bank (PDB), showing its
quaternary structure as a homotrimer with three active sites, each located between two
adjacent monomers. The active site of IspF is composed of two main pockets, pocket
III, which is rigid and highly conserved, and pocket II, which is flexible and less
conserved.
In the beginning of the project, HTS enabled first the discovery of
thiazolo[3,2-a]pyrimidines. Synthesis of a small library afforded ligands (±)-72–81,
IC50 values [µM]
IspF
R1
(±)-72
(±)-73
(±)-74
(±)-75
(±)-76
(±)-77
(±)-78
(±)-79
(±)-80
(±)-81
2-benzofuranyl
2-thiophenyl
2-thiophenyl
2-thiophenyl
2-thiophenyl
2-thiophenyl
2-benzofuranyl
4-methoxyphenyl
2-thiophenyl
Me
P. falc. strains
NF54
R2
R3
R5
Et
Et
Et
Et
Et
Bn
Et
Et
H
H
Br
Br
F
H
H
Br
Cl
Br
Br
Br
Br
32 ± 3
13 ± 2
3.9
9.6 ± 1.5
6.1 ± 0.8
1.5
Br
F
89 ± 12
322 ± 42
n.d.
Br
208 ± 22
125 ± 18
1.6
H > 300
> 300
3.2
Br
35 ± 5
2.1 ± 0.5
2.0
Cl
18 ± 2
7.4 ± 0.9
1.9
Br
11 ± 2
5.1 ± 0.4
1.5
Br
87 ± 7
141 ± 43
> 18
56 ± 5
65 ± 8
> 20
Br
P. falc.
M. tub.
O
R1
R2O
O
N
N
S
R5
thiazolo[3,2-a]pyrimidines
R3
OH
which inhibited the IspF enzymes of Arabidopsis thaliana, P. falciparum, and
M. tuberculosis in the low micromolar range.
IX
Best inhibitions were generally
Abstract
observed with R3 and R5 being bromine atoms, whereas the nature of substituent R1
was found to have little influence on the binding affinity of this class of compounds.
The bis-sulfonamides were the second class of IspF inhibitors discovered by
HTS. Ligands 88–109 were also found to inhibit the IspF enzymes of P. falciparum
and A. thaliana in the very low micromolar range.
Br
For instance, ligands 102 and 107 showed IC50
values in the nM range against IspF of A. thaliana.
R
Inhibition data obtained with a coupled-enzyme
R
assay in the HTS were confirmed by a
13
C NMR
assay, which proved that IspF was the actual target
O
O S
NH
NH
A. thaliana IspF
102 R = NO2 IC50 = 690 nM
107 R = Br IC50 = 530 nM
O S
O
Br
for both compound classes. It was shown by isothermal titration calorimetry (ITC)
that ligands bearing nitro groups or bromine atoms on their central core are able to
complex the Zn2+ ion at pH 8, which may affect the catalytic activity of IspF in the
biological assays.
Unfortunately, no co-crystal of a protein-ligand complex could be obtained
with both the thiazolo[3,2-a]pyrimidines and the bis-sulfonamides, making the
identification of their binding mode in the enzyme difficult. In the P. falciparum cellbased assay, the thiazolo[3,2-a]pyrimidines showed activities in the low micromolar
range against P. falciparum NF54 strains, whereas the bis-sulfonamides were
inactive.
Structure-based design was used to improve ligand affinity and solubility of
cytosine analogues reported by C. Baumgartner, which afforded ligand 112 featuring
a pyrrolidine ring to address pocket II. While solubility of this ligand in water was
achieved, no activity against the target enzyme was observed. Next, cytidine-based
132–135 and substrate-based ligands 162 and 175, featuring an adamantyl or
analogous subunit for the filling of pocket II, were synthesized but were also found to
be inactive.
Another challenge was to prevent binding of the substrate to the Zn2+ ion by
developing small inhibitors bearing zinc-binding groups (ZBG). A fragment-based
approach was used to design such small ligands, which enabled the discovery of the
sulfonamide-based ligand 200 that showed activity in the millimolar range against
IspF of E. coli.
X
Abstract
CF3
N
S
H 2N
28% inhibition at 2 mM
against E. coli IspF
O
O
200
In summary, it was shown in this project that inhibitors for the enzyme IspF
could be either discovered by HTS with the challenge of identifying their binding
mode, or by fragment-based design. It was observed that highly polar ligands do not
inhibit the IspF enzyme, since high desolvation costs can reduce the overall gain in
binding free energy. It is therefore necessary to find a compromise between ligand
polarity and ligand affinity. Finally, the discovery of an adequate ligand that can
address pocket II still needs to be identified.
XI
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Malaria ist mit 300–500 Millionen Infektionen und ca. 1–3 Millionen
Todesfällen pro Jahr eine der verheerendsten Tropenkrankheiten. Durch die stark
wachsende
Zahl
von
resistenten
Plasmodium-Stämmen
gegen
bestehende
Antimalaria-Wirkstoffe ist es für die Zukunft wichtig, neue Wirkstoffe mit einem
neuartigen Wirkmechanismus zu finden. Die Entdeckung des mevalonatunabhängigen
Biosynthesewegs der Isoprenoid-Vorläufer Isopentenylpyrophosphat (IPP, 17) und
Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP, 18) in den frühen 1990er Jahren erbrachte
aussichtsreiche therapeutische Ziele für die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen
Malaria. Da dieser alternative Weg bei Menschen nicht in Erscheinung tritt, sondern
nur von Bakterien, wie den Tuberkulose-Erregern Mycobacterium tuberculosis, oder
von Parasiten, wie den Malaria-Erregern Plasmodium falciparum, benutzt wird,
wurden die Enzyme des mevalonatunabhängigen Weges als aussichtsreiche Ziele für
die Entwicklung neue Wirkstoffe erkannt.
In dieser Arbeit wurde das fünfte Enzym des mevalonatunabhängigen Weges,
IspF (EC. 4.6.1.12), als Ziel für die Herstellung von Inhibitoren gewählt. Zwei
verschiedene Methoden wurden dafür benutzt: High-throughput Screening (HTS) und
Strukturbasiertes Design. Mehrere Röntgenkristallstrukturen von IspF sind in der
Protein Data Bank (PDB) bekannt, die die quaternäre Struktur von IspF als
Homotrimer mit drei aktiven Taschen zeigen. Eine aktive Tasche wird zwischen zwei
Monomeren gebildet und besteht aus zwei Haupttaschen: “Pocket III”, die sehr
konserviert und wenig flexibel ist, und “Pocket II”, die weniger konserviert und
flexibler ist.
Am Anfang dieses Projektes wurden mit Hilfe von HTS zuerst die
Thiazolo[3,2-a]pyrimidine als potentielle Inhibitoren entdeckt. Die Herstellung von
Derivaten führte zu den Verbindungen (±)-72–81, die das IspF–Enzym von
Arabidopsis thaliana, P. falciparum und M. tuberculosis im niedrigen mikromolaren
Bereich hemmen. Die besten Hemmwerte wurden mit Brom in den Positionen R3 und
R5 gefunden. Der Substituent R1 scheint keinen Einfluss auf die Bindungstärke dieser
Liganden zu haben.
XII
Zusammenfassung
IC50–Werte [µM]
IspF
R1
(±)-72
(±)-73
(±)-74
(±)-75
(±)-76
(±)-77
(±)-78
(±)-79
(±)-80
(±)-81
2-Benzofuranyl
2-Thiophenyl
2-Thiophenyl
2-Thiophenyl
2-Thiophenyl
2-Thiophenyl
2-Benzofuranyl
4-Methoxyphenyl
2-Thiophenyl
Me
P. falc. Stämme
NF54
R2
R3
R5
Et
Et
Et
Et
Et
Bn
Et
Et
H
H
Br
Br
F
H
H
Br
Cl
Br
Br
Br
Br
32 ± 3
13 ± 2
3.9
9.6 ± 1.5
6.1 ± 0.8
1.5
Br
F
89 ± 12
322 ± 42
n.d.
Br
208 ± 22
125 ± 18
1.6
H > 300
> 300
3.2
Br
35 ± 5
2.1 ± 0.5
2.0
Cl
18 ± 2
7.4 ± 0.9
1.9
Br
11 ± 2
5.1 ± 0.4
1.5
Br
87 ± 7
141 ± 43
> 18
56 ± 5
65 ± 8
> 20
Br
M. tub.
P. falc.
O
R1
R2O
O
N
N
S
R5
Thiazolo[3,2-a]pyrimidine
R3
OH
Als nächstes wurden – ebenfalls durch HTS – die Bis-sulfonamide entdeckt.
Die Verbindungen 88–109 hemmen das IspF Enzym von P. falciparum und
A. thaliana im sehr niedrigen mikromolaren Bereich. Liganden 102 und 107 haben
beispielweise
IC50–Werte
im
nanomolaren
Bereich gegen IspF von A. thaliana.
Br
Die
gekoppelten
R
Enzymassay, der im HTS benutzt wurde, wurden
R
Hemmungsdaten
nochmals mit einem
aus
13
dem
C NMR Assay überprüft,
O
O S
NH
NH
A. thaliana IspF
102 R = NO2 IC50 = 690 nM
107 R = Br IC50 = 530 nM
O S
um zu bestätigen, dass IspF das richtige Target
O
Br
für beide Verbindungsklassen ist. Es wurde mit isothermer Titrationskalorimetrie
festgestellt, dass Liganden mit Nitro- oder Brom-Substituenten am mittleren Arylring
das Zinkkation bei pH 8 binden und dadurch die katalytische Aktivität von IspF im
Assay reduzieren könnten.
Leider wurde mit beiden Verbindungsklassen kein Co-Kristall des EnzymLigand Komplexes erhalten, um den Bindungsmodus der verschiedenen Inhibitoren
mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse zu identifizieren. In einem Cell-based Assay
zeigten die Thiazolo[3,2-a]pyrimidine Aktivität im niedrigen mikromolaren Bereich
gegen P. falciparum–NF54–Stämme, wohingegen die Bis-sulfonamide inaktiv waren.
Strukturbasiertes Design wurde als zweite Methode benutzt, um die
Wasserlöslichkeit und Affinität von früheren Cytosinanaloga, die von C. Baumgartner
hergestellt worden sind, zu verbessern. Ligand 112 mit einem Pyrrolidinring, der die
Pocket II ausfüllen soll, wurde als neues Analogon vorgeschlagen.
Obwohl die
Wasserlöslichkeit verbessert werden konnte, hat Ligand 112 keine Aktivität gegen
IspF gezeigt. Ausserdem wurden die Cytidinderivate 132–135 und Substratderivate
162 und 175, die die Pocket II mit einen Adamantylrest oder ähnlichem ausfüllen,
hergestellt, sie waren jedoch inaktiv gegen das Zielenzym.
XIII
Zusammenfassung
Als nächstes wurde versucht, die Koordination des Substrates am Zn2+–Ion zu
verhindern, durch die Herstellung von Liganden mit Resten, die typischerweise
Zinkionen stark binden können.
Durch Design von kleinen Fragmenten wurde
Ligand 200 entdeckt, der Aktivität im millimolaren Bereich gegen IspF von E. coli
zeigt.
CF3
N
S
H 2N
28% Hemmung bei 2 mM
gegen E. coli IspF
O
O
200
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Inhibitoren für das Enzym IspF entweder
durch HTS oder Design von kleinen Fragmenten entdeckt werden können. Es wurde
festgestellt, dass sehr polare Verbindungen zu keiner Aktivität führen, weil zu viel
Desolvatisierungsenergie gebraucht wird. Deswegen ist es wichtig, einen Kompromis
zwischen Polarität und Affinität des Ligandes zu finden. Schliesslich muss immer
noch ein passender Ligand gefunden werden, der mit Pocket II in Wechselwirkung
tritt.
XIV