Dissertation-SonjaBorchert_UB`

Synthese und Oxidation chiraler
Aminoverbindungen unter
Verwendung verschiedener
Katalysatorsysteme
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Sonja Borchert
aus Amberg
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftliche Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
01.10.2014
Vorsitzender des Promotionsorgans:
Prof. Dr. Johannes Barth
Gutachter:
Prof. Dr. Harald Gröger
apl. Prof. Dr. Norbert Jux
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Organische Chemie des Departments Chemie
und Pharmazie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg unter Leitung von
Prof. Dr. Harald Gröger in der Zeit von Januar 2009 bis August 2012 erstellt.
Teile dieser Arbeit sind bereits veröffentlicht oder wurden zur Veröffentlichung eingereicht:
W. Greschner, C. Lanzerath, T. Reß, K. Tenbrink, S. Borchert, A. Mix, W. Hummel,
H. Gröger, „Artificial Cofactor Regeneration with an Iron(III)porphyrin as NADH-Oxidase
Mimic in the Enzymatic Oxidation of L-Glutamate to alpha-Ketoglutarate", J. Mol. Cat. B:
Enzymatic 2013, im Druck.
S. Borchert, E. Burda, J. Schatz, W. Hummel, H. Gröger, „Combination of a Palladiumcatalyzed suzuki cross-coupling reaction with an asymmetric biotransformation towards a
one-pot reaction at room temperature”, J. Mol. Cat. B: Enzymatic 2012, 84, 89-93.
M. Weiß, S. Borchert, E. Rémond, S. Jugé, H. Gröger, „Asymmetric Addition of Nitrogen
Nucleophile to an Enoate in the Presence of a Chiral Phase-Transfer Catalyst: A Novel
Approach towards Enantiomerically Enriched Protected β-Amino Acids”, Heteroatom
Chemistry 2012, 23, 202-209.
Reviews:
H. Gröger, W. Hummel, S. Borchert, M. Kraußer, „Reduction of Ketones and Aldehydes to
Alcohols” in: Enzymes in Organic Synthesis (Hrsg. K. Drauz, H. Gröger, O. May), 3. Auflage,
Wiley-VCH, Weinheim, 2012.
H. Gröger, S. Borchert, M. Kraußer and W. Hummel, „Enzyme-Catalyzed Asymmetric
Reduction
of
Ketones”
in:
Encyclopedia
of
Industrial
Biotechnology:
Bioprocess,
Bioseparation and Cell Technology (editor: M.C. Flickinger), 7th edition, John Wiley & Sons,
Hoboken, New Jersey, 2010, volume 3, p. 2094-2110.
Poster:
Sonja Borchert, B. Blumenröder, E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Combination of a
Palladium-catalyzed suzuki cross-coupling reaction with an asymmetric biotransformation
towards a one-pot reaction in aqueous medium, 10th Biotrans Congress, Giardini Naxos,
2. Oktober – 6. September 2011
Sonja Borchert, E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Combination of a Palladium-catalyzed
suzuki cross-coupling reaction with an asymmetric biotransformation towards a one-pot
reaction in aqueous medium, 3rd EuCheMS Chemistry Congress, Nürnberg, 29. August –
2. September 2010
Danksagung:
Mein Dank gilt zuerst Herrn Prof. Dr. Harald Gröger, der mir die Möglichkeit zur Promotion
gegeben und der in uns Vertrauen gesetzt hat selbständig die spannenden Themen in
Erlangen erfolgreich weiterzuführen.
Außerdem möchte ich mich ganz herzlich bei unseren Kooperationspartnern für die
Bereitstellung der Enzyme bedanken. Im Rahmen des ChemBioTech-Projekts danke ich vor
allem Herrn Prof. Dr. Werner Hummel und seinen Mitarbeitern vom Institut für Molekulare
Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf: Carsten Lanzerath stellte die
Enzyme im Rahmen des ChemBioTech-Projekts her, Thorsten Rosenbaum unterstützte
meine Forschungsarbeit durch die Herstellung der ADHs und insbesondere der partiell
gereinigten Lk-ADH.
Mein Dank geht auch an meine „neuen“ Chefs Dr. Ulf Menyes und Dr. Rainer Wardenga für
ihre Unterstützung und Geduld.
Vielen Dank an alle derzeitigen und ehemaligen Labor- und Arbeitskollegen, im Arbeitskreis
Gröger und darüber hinaus, v.a. Svenja Staudt und Dr. Sabine Simon, sowie meinen
Kollegen bei der Enzymicals AG, allen voran Dr. Ute Liebelt und Philipp Süss für das
Korrekturlesen. Besonders möchte ich mich auch bei Katharina Tenbrink und Svenja Staudt
bedanken,
mit
denen
ich
gemeinsame
Projekte
bearbeitet
habe,
für
die
gute
Zusammenarbeit bedanken. Sehr wichtig für das Fortschreiten dieser Arbeit waren aus
meiner Sicht der wissenschaftliche Austausch und die konstruktiven Diskussionsrunden mit
Harald Maid, Philipp Böhm, Svenja Staudt, Nadja Wunderlich und Rainer Lippert.
Weiterhin möchte ich mich ganz herzlich bei den Angestellten des Instituts der Organischen
Chemie für die Unterstützung im Laboralltag und im Verwaltungsbereich bedanken. Ohne
diesen Beitrag wäre meine Dissertation nur schwer zu realisieren gewesen. Auch meinen
ehemaligen Praktikanten, allen voran Felix Held, sei an dieser Stelle für die Durchführung
einiger Synthesen gedankt.
Ein großes Dankeschön an meine Freunde für die schöne Zeit in Erlangen und überall sonst
auf der Welt.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie für die großartige Unterstützung. Egal
wieviele Kilometer uns trennen, dank Telefon sind sie doch immer da.
INHALTSVERZEICHNIS
I.
Inhaltsverzeichnis
I.
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... I
II.
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................. IX
III.
Tabellenverzeichnis ............................................................................................... XVII
IV.
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... XXI
1
Einleitung .................................................................................................................... 1
2
Motivation und Zielsetzung ....................................................................................... 3
3
Enantioselektive Synthese von β-Aminosäurederivaten durch organokatalysierte
Aza-Michael-Reaktion ................................................................................................ 7
4
3.1
Einleitung ................................................................................................... 7
3.2
Stand der Wissenschaft ............................................................................. 8
3.3
Ziel der Arbeit............................................................................................14
3.4
Ergebnisse und Diskussion .......................................................................15
3.4.1
Reproduktion der Literatur.........................................................................15
3.4.2
Einfluss der Katalysatorstruktur auf die Enantioselektivität ........................15
3.4.3
Einfluss der Reaktionstemperatur .............................................................16
3.5
Zusammenfassung des Teilkapitels ..........................................................19
Kombination von Palladiumkatalyse und Biokatalyse zur enantioselektiven
Synthese eines Alkohols und dessen Umsetzung zum chiralen Amin .................21
4.1
Einleitung ..................................................................................................21
4.2
Stand der Wissenschaft ............................................................................23
4.2.1
Vorstellung der Konzepte Mehrstufen-Eintopfreaktion und Tandemreaktion
..................................................................................................................23
4.2.2
Suzuki-Kupplung in wässrigem Reaktionsmedium ....................................24
I
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.3
Enzymatische Reduktion ...........................................................................27
4.2.4
Chemoenzymatische Eintopfreaktionen ....................................................30
4.2.5
Synthese chiraler Amine mittels Substitutionsreaktion ..............................31
4.3
Ziel der Arbeit............................................................................................33
4.4
Ergebnisse und Diskussion .......................................................................36
4.4.1
Etablierung der Suzuki-Reaktion in wässrigem Medium unter Verwendung
von PdCl2 und TPPTS ...............................................................................36
4.4.1.1
Verwendung von Triethylamin als Base ....................................................36
4.4.1.2
Verwendung von Natriumcarbonat als Base..............................................38
4.4.1.3
Verwendung von Natriumhydrogencarbonat als Base ...............................39
4.4.1.4
Verwendung von Puffersystemen..............................................................40
4.4.1.5
Eignung der Basen im Hinblick auf eine Tandemreaktion..........................41
4.4.1.6
Variation der Kupplungspartner .................................................................43
4.4.2
Photometertest zur Bestimmung der Enzymaktivität .................................48
4.4.2.1
Photometertest mit ADH aus Rhodococcus sp. (Rohextrakt) ....................48
4.4.2.2
Photometertest mit ADH aus Lactobacillus kefir (Rohextrakt) ...................50
4.4.3
Untersuchung potentiell inhibierender Faktoren aus der Palladiumkatalyse
im Hinblick auf eine Eintopf- oder Tandemreaktion ...................................51
4.4.3.1
Photometertests mit ADH aus Rhodococcus sp. zur Untersuchung
inhibierender Faktoren aus der Palladiumkatalyse ....................................52
4.4.3.2
Photometertests mit ADH aus Lactobacillus kefir zur Untersuchung der
Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert ............................................55
II
4.4.4
Enzymatische Reduktion ...........................................................................56
4.4.4.1
Enzymatische Reduktion mit ADH aus Rhodococcus sp. ..........................57
4.4.4.2
Enzymatische Reduktion mit ADH aus Lactobacillus kefir (Rohextrakt).....59
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.5
Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopfreaktion unter Verwendung von Natriumcarbonat als Base ............62
4.4.5.1
Eintopfreaktion mit ADH aus Rhodococcus sp. .........................................62
4.4.5.2
Eintopfreaktion mit ADH aus Lactobacillus kefir ........................................63
4.4.6
Maßstabsvergrößerung der Eintopfreaktion unter Verwendung von
Natriumcarbonat als Base .........................................................................65
4.4.6.1
Durchführung der Suzuki-Kupplung im vergrößerten Labormaßstab und
Reduktion der Katalysatorbeladung ..........................................................65
4.4.6.2
Durchführung der Eintopfreaktion im vergrößerten Labormaßstab ............67
4.4.7
Eintopfreaktion unter Verwendung von Natriumhydrogencarbonat als Base
..................................................................................................................68
4.4.8
Kombination von Palladiumkatalyse und Biotransformation in einer
Tandemreaktion ........................................................................................73
4.4.8.1
Untersuchung inhibierender Faktoren aus der enzymatischen Reduktion
auf die Suzuki-Kupplung ...........................................................................73
4.4.8.2
Eigenschaften der partiell gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir ...........77
4.4.8.3
Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5 mit gereinigter ADH
aus L. kefir ................................................................................................82
4.4.8.4
Durchführung der Tandemreaktion unter Verwendung partiell gereinigter
ADH aus L. kefir ........................................................................................84
4.4.9
Überführung des chiralen Alkohols 6 in das korrespondierende Amin 7 in
einer Substitutionsreaktion ........................................................................92
5
4.4.9.1
Mitsunobu-Reaktion ..................................................................................93
4.4.9.2
Hydrazinolyse ...........................................................................................98
4.5
Zusammenfassung des Teilkapitels ........................................................100
Enzymatische Oxidation natürlicher Aminosäuren zu α-Ketosäuren..................101
5.1
Einleitung ................................................................................................101
III
INHALTSVERZEICHNIS
5.2
Stand der Wissenschaft ..........................................................................103
5.3
Ziel der Arbeit..........................................................................................113
5.4
Ergebnisse und Diskussion .....................................................................114
5.4.1
Photometertests zur Aktivitätsbestimmung ..............................................114
5.4.1.1
Aktivität der Leucindehydrogenasen aus Bacillus cereus ........................116
5.4.1.2
Aktivität der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis..............................116
5.4.2
Eigenschaften der Enzyme .....................................................................117
5.4.2.1
Lagerstabilität..........................................................................................118
5.4.2.2
Test der Enzyme auf Inhibierung mittels Photometer ..............................120
5.4.3
Analytik – Umsatzbestimmung mittels 1H-NMR-Spektroskopie für
Umsetzungen von L-Valin zu α-Ketovalin ................................................124
5.4.4
Umsetzungen von L-Valin mit Leucindehydrogenase unter Verwendung von
NADH-Oxidase zur Cofaktorregenerierung .............................................126
5.4.4.1
Benchmarkreaktion und Reproduzierbarkeit ...........................................126
5.4.4.2
Einfluss der Rührgeschwindigkeit............................................................128
5.4.4.3
Nachdosieren verschiedener Komponenten während der Reaktion ........130
5.4.4.4
Einfluss von FAD auf den Reaktionsverlauf.............................................133
5.4.4.5
Präparative Untersuchungen zur Produktinhibierung ..............................135
5.4.4.6
Einfluss der Menge an NADH-Oxidase im präparativen Ansatz ..............137
5.4.4.7
Variation der Cofaktorkonzentration im Ansatz........................................138
5.4.5
Umsetzungen mit LeuDH unter Verwendung eines Eisen-Porphyrins als
alternatives Cofaktorregenerierungssystem ............................................140
IV
5.4.5.1
Benchmarkreaktion .................................................................................141
5.4.5.2
Kontrollexperimente ................................................................................142
5.4.5.3
Einfluss der Rührgeschwindigkeit............................................................143
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.5.4
Einfluss der Eisenporphyrin-Menge .........................................................144
5.4.5.5
Variation des pH-Werts ...........................................................................146
5.4.5.6
Stabilität der Ketosäure in Abhängigkeit des pH-Werts ...........................148
5.5
Zusammenfassung des Teilkapitels ........................................................150
6
Zusammenfassung..................................................................................................151
7
Summary..................................................................................................................159
8
Experimenteller Teil ................................................................................................167
8.1
Verwendete Chemikalien und Geräte ......................................................167
8.2
Synthesen und analytische Daten der Produkte ......................................171
8.2.1
(Enantioselektive) Synthese von β-Aminosäurederivaten durch
organokatalysierte Aza-Michael-Reaktion ...............................................171
8.2.1.1
Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (AAV 1): Phasentransfer-katalysierte AzaMichael-Reaktion ....................................................................................171
8.2.1.2
Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (AAV 2): Gefrierpunktbestimmung ...........175
8.2.2
Kombination von Palladiumkatalyse und Biokatalyse zur enantioselektiven
Synthese eines Alkohols und dessen Umsetzung zum chiralen Amin .....176
8.2.2.1
Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (AAV 3): Suzuki-Kupplung in wässrigem
Reaktionsmedium mit Triethylamin als Base ...........................................176
8.2.2.2
Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 (AAV 4): Etablierung der Suzuki-Kupplung in
wässrigem Reaktionsmedium mit Na2CO3 als Base ................................180
8.2.2.3
Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 (AAV 5): Suzuki-Kupplung in wässrigem
Reaktionsmedium mit NaHCO3 als Base.................................................182
8.2.2.4
Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 (AAV 6): „basenfreie“ Suzuki-Kupplung in
wässrigem Reaktionsmedium .................................................................185
8.2.2.5
Allgemeine Arbeitsvorschrift 7 (AAV 7): Eignung der Basen bzgl. ihres pHWerts ......................................................................................................187
V
INHALTSVERZEICHNIS
8.2.2.6
Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 (AAV 8): Synthese racemischer Alkohole
mittels Natriumborhydridreduktion [172] ..................................................187
8.2.2.7
Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 (AAV 9): Substitution der Phenylboronsäure
durch Phenylboronsäurepinakolester in der Suzuki-Kupplung .................190
8.2.2.8
Allgemeine Arbeitsvorschrift 10 (AAV 10): Photometertest zur Bestimmung
der Enzymaktivität (in Abhängigkeit vom Substrat)..................................192
8.2.2.9
Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 (AAV 11): Photometertest zur Bestimmung
des Einflusses verschiedener Additive aus der Suzuki-Kupplung auf die
ADHs ......................................................................................................195
8.2.2.10
Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 (AAV 12): Photometertest zur Bestimmung
der Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert ....................................199
8.2.2.11
Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 (AAV 13): Enzymatische Reduktion unter
Substrat-gekoppelter Cofaktorregenerierung...........................................201
8.2.2.12
Allgemeine Arbeitsvorschrift 14 (AAV 14): Eintopfreaktion mit Na2CO3 als
Base .......................................................................................................206
8.2.2.13
Allgemeine Arbeitsvorschrift 15 (AAV 15): Eintopfreaktion mit NaHCO3 als
Base – Weg A .........................................................................................211
8.2.2.14
Allgemeine Arbeitsvorschrift 16 (AAV 16): Eintopfreaktion mit NaHCO3 als
Base – Weg B .........................................................................................213
8.2.2.15
Allgemeine Arbeitsvorschrift 17 (AAV 17): Untersuchung auf limitierende
Faktoren in der Suzuki-Kupplung ............................................................214
8.2.2.16
Allgemeine Arbeitsvorschrift 18 (AAV 18): Tandemreaktion mit NaHCO3 als
Base und gereinigter Lk-ADH ..................................................................218
8.2.2.17
Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 (AAV 19): Einfluss der Verdünnung auf die
Suzuki-Kreuzkupplung ............................................................................220
VI
8.2.2.18
Allgemeine Arbeitsvorschrift 20 (AAV 20): Mitsunobu-Reaktion ..............222
8.2.2.19
Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 (AAV 21): Hydrazinolyse........................227
8.2.3
Enzymatische Oxidation natürlicher Aminosäuren zu α-Ketosäuren........231
INHALTSVERZEICHNIS
8.2.3.1
Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 (AAV 22): Aktivitätsbestimmung der
Leucindehydrogenase aus Bacillus species ............................................231
8.2.3.2
Aktivitätsbestimmung der Glutamat-Dehydrogenasen für L-Valin ............234
8.2.3.3
Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 (AAV 23): Aktivitätsbestimmung der
NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis .................................................235
8.2.3.4
Allgemeine Arbeitsvorschrift 24 (AAV 24): Umsatzbestimmung mittels
1
H-NMR-Spektroskopie ...........................................................................238
8.2.3.5
Umsatzbestimmung für die Umsetzungen von L-Valin in Gegenwart von
Fe-TSPP (10) ..........................................................................................240
8.2.3.6
Allgemeine Arbeitsvorschrift 25 (AAV 25): Oxidation von L-Valin (8a) unter
Verwendung von NADH-Oxidase zur Cofaktorregenerierung im Maßstab
von 1.5 ml ...............................................................................................242
8.2.3.7
Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV 26): Oxidation von L-Valin (8a) unter
Verwendung von NADH-Oxidase zur Cofaktorregenerierung im Maßstab
5 ml .........................................................................................................243
8.2.3.8
Variation der NOx-Menge........................................................................246
8.2.3.9
Einfluss der Cofaktorkonzentration..........................................................247
8.2.3.10
Allgemeine Arbeitsvorschrift 27 (AAV 27): Einfluss verschiedener
Komponenten (Nachdosieren) ................................................................248
8.2.3.11
Allgemeine Arbeitsvorschrift 28 (AAV 28): Untersuchung des
Reaktionssystems auf Produktinhibierung ...............................................251
8.2.3.12
Allgemeine Arbeitsvorschrift 29 (AAV 29): Oxidation von L-Valin (8a) unter
Verwendung von Fe-TSPP (10) zur Cofaktorregenerierung ....................253
9
8.2.3.13
Allgemeine Arbeitsvorschrift 30 (AAV 30): Kontrollexperimente ..............255
8.2.3.14
Stabilitätsuntersuchung der Ketosäure in Abhängigkeit vom pH-Wert .....257
Appendix ..................................................................................................................258
9.1
Produktisolierung von Ketovalin ..............................................................258
9.2
Experimenteller Teil ................................................................................258
VII
INHALTSVERZEICHNIS
10
VIII
9.2.1
Verwendete Geräte und Chemikalien ......................................................258
9.2.2
Bestimmung der Löslichkeitsgrenze von Ketovalin ..................................258
9.2.3
Produktisolierung mittels Fällung.............................................................259
9.2.4
Produktisolierung mittels Extraktion ........................................................260
Literaturverzeichnis ................................................................................................261
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
II.
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Paclitaxel ...................................................................................................... 1
Abbildung 1.2 Struktur von Odanacatib ............................................................................... 2
Abbildung 1.3 Gleichgewichtsreaktion zur Umwandlung einer α-Aminosäure in die analoge
α-Ketosäure........................................................................................................................... 2
Abbildung 2.1 Ziel dieser Arbeit ........................................................................................... 3
Abbildung 2.2 Phasentransfer-katalysierte Synthese chiraler β-Aminosäurederivate ........... 4
Abbildung 2.3 Synthese der chiralen Biarylamin-Substruktur ............................................... 5
Abbildung 2.4 Enzymatische Oxidation von α-Aminosäuren ................................................ 6
Abbildung 3.1 Retrosynthestische Analyse zur Synthese von β-Aminosäuren [18] .............. 8
Abbildung 3.2 Möglichkeiten der asymmetrischen Induktion in der Aza-Michael-Reaktion
[43] ........................................................................................................................................ 9
Abbildung 3.3 Bildung des chiralen Ionenpaars ..................................................................11
Abbildung 3.4 Intramolekulare Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion .............11
Abbildung 3.5 Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion als Teil einer
Ringschlussreaktion .............................................................................................................12
Abbildung 3.6 Intermolekulare Aza-Michaelreaktion ...........................................................12
Abbildung 3.7 Auswahl an chiralen Phasentransferkatalysatoren in der intermolekularen
Aza-Michael-Reaktion [11] ...................................................................................................13
Abbildung 3.8 Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion [65] ...............................14
Abbildung 3.9 Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion ......................................15
Abbildung 3.10 Einfluss der Katalysatorstruktur auf die Phasentransfer-katalysierte AzaMichael-Reaktion..................................................................................................................16
Abbildung 3.11 Aza-Michael-Reaktion zur Synthese von 3a unter optimierten Bedingungen
.............................................................................................................................................19
Abbildung 4.1 Biarylethylaminstruktur von Odanacatib .......................................................21
Abbildung 4.2 Aufbau der Biarylethylamin-Einheit in Odanacatib ........................................21
IX
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 4.3 Veranschaulichung des Reaktionskonzepts einer Tandemreaktion ..............23
Abbildung 4.4 Naturstoffe Dragmacidin F und Dynemicin A ................................................24
Abbildung 4.5 Mechanismus der Suzuki-Kreuzkupplung [76]..............................................25
Abbildung 4.6 Tris(3-Sulfonylphenyl)phosphin (TPPTS) 20 ................................................26
Abbildung 4.7 Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium bei Raumtemperatur ......................27
Abbildung 4.8 Enzymatische Route zur Herstellung von Montelukast 23 ............................28
Abbildung 4.9 Substrat-gekoppelte Cofaktorregenerierung .................................................29
Abbildung 4.10 Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopfreaktion .....................................................................................................................30
Abbildung 4.11 Umsetzung chiraler Hydroxyether zum Aminoether [72] .............................32
Abbildung 4.12 Mechanismus der Mitsunobu-Reaktion ......................................................33
Abbildung 4.13 Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopfreaktion .....................................................................................................................34
Abbildung 4.14 Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Tandemreaktion ...................................................................................................................34
Abbildung 4.15 Umsetzung des Alkohols 6 zum Amin 7 unter Inversion des Stereozentrums
.............................................................................................................................................35
Abbildung 4.16 Suzuki-Kupplung bei Raumtemperatur mit Triethylamin als Base ..............36
Abbildung 4.17 Suzuki-Kupplung mit Natriumcarbonat als Base .........................................38
Abbildung 4.18 Suzuki-Kupplung in Gegenwart von NaHCO3 als Base ..............................39
Abbildung 4.19 "Basenfreie" Suzuki-Kupplung....................................................................41
Abbildung 4.20 Verschiedene Sequenzen zum Zielprodukt 6 .............................................44
Abbildung 4.21 alternativer Syntheseweg von 5 mittels Suzuki-Kupplung...........................47
Abbildung 4.22 Photometertest zur Aktivitätsbestimmung der ADHs ..................................48
Abbildung 4.23 Formel zur Bestimmung der volumetrischen Enzymaktivität .......................48
Abbildung 4.24 Einfluss verschiedener Additive auf die Aktivität der ADH aus
Rhodococcus sp. ..................................................................................................................52
Abbildung 4.25 Einfluss von TPPTS auf die ADH aus Rhodococcus sp..............................53
Abbildung 4.26 Einfluss von Palladiumchlorid auf die ADH aus Rhodococcus sp. ..............53
Abbildung 4.27 Einfluss von Phenylboronsäure auf die ADH aus Rhodococcus sp. ...........54
X
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 4.28 Einfluss des Boronsäurepinakolesters auf die ADH aus Rhodococcus sp. .55
Abbildung 4.29 Enzymatische Reduktion unter Substrat-gekoppelter Cofaktorregenerierung
.............................................................................................................................................57
Abbildung 4.30 Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (4) mit ADH aus L. kefir .61
Abbildung 4.31 Schematische Darstellung zur Kombination von Suzuki-Kupplung und
enzymatischer Reduktion in einer Eintopfreaktion (Weg A) ..................................................62
Abbildung 4.32 Eintopfreaktion mit ADH aus Rhodococcus sp. unter Verwendung von
Na2CO3 als Base ..................................................................................................................63
Abbildung 4.33 Benchmark für die Eintopfreaktion im kleinen Maßstab (ADH aus L.kefir) ..67
Abbildung 4.34 Erweiterter Labormaßstab der Eintopfreaktion ...........................................67
Abbildung 4.35 Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Weg B..........................................72
Abbildung 4.36 Untersuchung auf die Kupplung inhibierende Faktoren ..............................74
Abbildung 4.37 Einfluss des Cofaktors auf die Suzuki-Kupplung ........................................74
Abbildung 4.38 Einfluss verschiedener Additive auf die ADH aus L. kefir (gereinigt) ..........79
Abbildung 4.39 Einfluss des Liganden TPPTS (Puffer pH 7)...............................................80
Abbildung 4.40 Einfluss von Palladiumchlorid (Puffer pH 7)................................................80
Abbildung 4.41 Einfluss von Phenylboronsäure (Puffer pH 7) .............................................81
Abbildung 4.42 Tandemreaktion mit gereinigter ADH aus L. kefir .......................................84
Abbildung 4.43 Proof of Concept der Tandemreaktion mit gereinigter ADH aus L. kefir......85
Abbildung 4.44 Kontrollexperimente bzgl. des Verdünnungseffekts ....................................86
Abbildung 4.45 Überführung des Alkohols 6 in das chirale Amin 7 .....................................93
Abbildung 4.46 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts 28 .....................................................95
Abbildung 4.47 1H-NMR-Spektrum des gereinigten Produkts 28 ........................................95
Abbildung 4.48 1H-NMR-Spektrum des Edukts 6 ................................................................96
Abbildung 4.49 Eliminierung und Addition von Wasser an Alkohol 6...................................96
Abbildung 4.50 Alkohol 39 ..................................................................................................97
Abbildung 4.51 Hydrazinolyse von 2-(1-(4-Biphenyl)ethyl)isoindolin-1,3-dion 28 ................98
Abbildung 4.52 Synthese von rac-7 mittels Hydrazinolyse ..................................................99
Abbildung 4.53 Synthese von (S)-7 mittels Hydrazinolyse ..................................................99
XI
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 5.1 Die acht essentiellen Aminosäuren ............................................................101
Abbildung 5.2 Auswahl an α-Ketosäuren, die in der Ernährungstherapie zur Anwendung
kommen .............................................................................................................................102
Abbildung 5.3 α-Ketoglutarat ............................................................................................103
Abbildung 5.4 Enzymatische Synthese von Ketovalin (9a) ...............................................103
Abbildung 5.5 Chemische Synthese von Ketovalin 9a über das Oxazolon 41 ...................104
Abbildung 5.6 Reaktionsschema der von Aminosäuredehydrogenasen katalysierten
Reaktionen .........................................................................................................................105
Abbildung 5.7 Synthese von D-tert-Leucin unter in situ Cofaktorregenerierung mit NOx [149]
...........................................................................................................................................106
Abbildung 5.8 Enzymatische Oxidation von Mononatriumglutamat (8i) zur Synthese von
α-Ketoglutarat (9i) [10] .......................................................................................................107
Abbildung 5.9 Bruttogleichung einer H2O2-bildenden (1) und einer H2O-bildenden NOx (2)
...........................................................................................................................................108
Abbildung 5.10 Selektive Oxidation von rac-Phenylethanol (rac-35) [125] ........................109
Abbildung 5.11 Oxidation von Cyclohexanol unter biomimetischer Cofaktorregenerierung
[158] ...................................................................................................................................110
Abbildung 5.12 Struktur von Fe-TSPP (10) [127] ..............................................................111
Abbildung 5.13 Oxidation von Cyclooctanol unter Fe-TSPP-vermittelter
Cofaktorregenerierung........................................................................................................111
Abbildung 5.14 Mechanismus der Fe-TSPP-vermittelten Cofaktorregenerierung [127] .....112
Abbildung 5.15 angestrebte Zielprodukte..........................................................................113
Abbildung 5.16 Reaktionsschema zur Oxidation von L-Aminosäuren unter in situ
Cofaktorregenerierung........................................................................................................114
Abbildung 5.17 Reaktionsgleichung des Photometertests zur Bestimmung der NOx-Aktivität
...........................................................................................................................................115
Abbildung 5.18 Reaktionsgleichung des Photometertests zur Bestimmung der
Aminosäuredehydrogenase-Aktivität bezogen auf L-Valin 8a .............................................115
Abbildung 5.19 Aktivität der gereinigten LeuDH ................................................................116
Abbildung 5.20 Untersuchung der LeuDH auf Inhibierung (mittels Photometertest) ..........120
Abbildung 5.21 Untersuchung der NADH-Oxidase auf Inhibierung (mittels Photometertest)
...........................................................................................................................................120
XII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 5.22 Untersuchung der LeuDH auf Produktinhibierung ....................................121
Abbildung 5.23 Produktinhibierung der LeuDH in Abhängigkeit der Ketovalin-Konzentration
...........................................................................................................................................121
Abbildung 5.24 Untersuchung der NOx auf Produktinhibierung ........................................122
Abbildung 5.25 Einfluss von Ketovalin 9a auf die NOx......................................................122
Abbildung 5.26 Untersuchung der NOx auf Substratinhibierung .......................................123
Abbildung 5.27 Einfluss von L-Valin (8a) auf die NOx .......................................................124
Abbildung 5.28 1H-NMR-Spektrum einer 1:1-Mischung von Ketovalin 9a und L-Valin 8a ..125
Abbildung 5.29 Benchmarkreaktion im Maßstab 5 ml .......................................................126
Abbildung 5.30 Reaktionsverlaufs der Benchmarkreaktion zur Oxidation von L-Valin (8a) 127
Abbildung 5.31 Reproduzierbarkeit der Benchmarkreaktion unter Verwendung
verschiedener Enzymchargen (analog Tabelle 8.37) .........................................................128
Abbildung 5.32 Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf die Oxidation von L-Valin ...............129
Abbildung 5.33 Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf den Reaktionsverlauf .....................129
Abbildung 5.34 Nachdosieren verschiedener Komponenten (LeuDH, NOx, NAD+) ...........130
Abbildung 5.35 Nachdosieren von NADH-Oxidase ...........................................................131
Abbildung 5.36 Nachdosieren von LeuDH ........................................................................132
Abbildung 5.37 Nachdosieren von NAD+ ..........................................................................133
Abbildung 5.38 FAD .........................................................................................................134
Abbildung 5.39 Variation der FAD-Konzentration im Ansatz .............................................134
Abbildung 5.40 Einfluss der FAD-Konzentration auf den Reaktionsverlauf .......................135
Abbildung 5.41 Untersuchung des Reaktionssystems auf Produktinhibierung ..................136
Abbildung 5.42 Präparative Untersuchung des Reaktionssystems auf Produktinhibierung
...........................................................................................................................................137
Abbildung 5.43 Variation der NOx-Menge im Ansatz ........................................................138
Abbildung 5.44 Reaktionsverlauf bei Variation der NOx-Menge im Ansatz .......................138
Abbildung 5.45 Einfluss des Cofaktors NAD+ ....................................................................139
Abbildung 5.46 Reaktionsverlauf unter Variation der NAD+-Konzentration ........................139
Abbildung 5.47 Oxidation von L-Valin (8a) unter Verwendung von Fe-TSPP (10) zur
Cofaktorregenerierung........................................................................................................140
XIII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 5.48 Oxidation von L-Valin unter Verwendung von Fe-TSPP (10) zur
Cofaktorregenerierung........................................................................................................141
Abbildung 5.49 Reaktionsverlauf der Benchmarkreaktion (Fe-TSPP zur
Cofaktorregenerierung) ......................................................................................................142
Abbildung 5.50 Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf das Reaktionssystem mit Fe-TSPP
...........................................................................................................................................143
Abbildung 5.51 Graphische Darstellung der Vergleichsexperimente analog Abbildung 5.50
...........................................................................................................................................144
Abbildung 5.52 Einfluss der Eisenporphyrinmenge ...........................................................145
Abbildung 5.53 Einfluss der Eisenporphyrin-Menge auf den Reaktionsverlauf ..................145
Abbildung 5.54 Variation des Reaktionsmediums und des pH-Werts................................146
Abbildung 5.55 Reaktionsverlauf bei variiertem Reaktionsmedium ...................................147
Abbildung 5.56 Schematische Darstellung des FeTSPP-Dimers (zur besseren Übersicht
wurden die Sulfonatophenylgruppen nicht berücksichtigt) ..................................................148
Abbildung 5.57 Vergleich der 1H-NMR-Spektren von 9a bei unterschiedlichen pH-Werten
...........................................................................................................................................148
Abbildung 5.58 Isobutyraldehyd (46) und dessen Hydrat (47)...........................................149
Abbildung 5.59 Optimierter Prozess zur enzymatischen Oxidation von L-Valin (8a)..........150
Abbildung 6.1 Aza-Michael-Reaktion zur Synthese von 3a unter optimierten Bedingungen
...........................................................................................................................................151
Abbildung 6.2 Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium bei Raumtemperatur ....................152
Abbildung 6.3 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit Na2CO3 als Base .................................153
Abbildung 6.4 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base................................153
Abbildung 6.5 Eintopfreaktion unter veränderter Sequenz ................................................154
Abbildung 6.6 Ergebnisse der enzymatischen Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5 ....155
Abbildung 6.7 Realisierung der Tandemreaktion ..............................................................155
Abbildung 6.8 Umsetzung des chiralen Alkohols 6 mittels SN2-Reaktion unter MitsunobuBedingungen ......................................................................................................................156
Abbildung 6.9 Optimierter Prozess zur enzymatischen Oxidation von L-Valin (8a)
(enzymatische Cofaktorregenerierung)...............................................................................157
XIV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 6.10 Optimierter Prozess zur enzymatischen Oxidation von L-Valin 8a
(biomimetische Cofaktorregenerierung mittels Fe-TSPP 10) ..............................................158
Scheme 7.1 Synthesis of β-amino acid derivative 3a via aza-Michael-reaction under
optimised conditions ...........................................................................................................159
Scheme 7.2 Suzuki cross-coupling reaction in aqueous medium at room temperature ......160
Scheme 7.3 Results of the one-pot reaction using Na2CO3 as base ..................................161
Scheme 7.4 Results of the one-pot reaction using NaHCO3 as base .................................161
Scheme 7.5 Variation of the reaction sequence in the one-pot reaction .............................162
Scheme 7.6 Results for the enzymatic reduction of biaryl ketone 5....................................163
Scheme 7.7 Combination of a Suzuki cross-coupling reaction and a biotransformation in a
tandem-reaction .................................................................................................................163
Scheme 7.8 SN2-substitution reaction using Mitsunobu reaction conditions .......................164
Scheme 7.9 Optimised process conditions for the enzymatic oxidation of L-valine 8a
(enzymatic cofactor regeneration) ......................................................................................165
Scheme 7.10 Optimised process conditions for the enzymatic oxidation of L-valine 8a
(biomimetic cofactor regeneration using Fe-TSPP) ............................................................166
Abbildung 8.1 Phasentransferkatalysierte Aza-Michael-Reaktion .....................................171
Abbildung 8.2 Suzuki-Kupplung mit Triethylamin als Base ...............................................176
Abbildung 8.3 Suzuki-Kupplung mit Natriumcarbonat als Base.........................................180
Abbildung 8.4 Suzuki-Kupplung unter Verwendung von NaHCO3 als Base ......................182
Abbildung 8.5 Basenfreie Suzuki-Kupplung ......................................................................185
Abbildung 8.6 Synthese racemischer Alkohole .................................................................187
Abbildung 8.7 Suzuki-Kupplung unter Verwendung von Phenylboronsäurepinakolester (30)
...........................................................................................................................................190
Abbildung 8.8 Photometertest zur Bestimmung der Enzymaktivität der ADHs ..................192
Abbildung 8.9 Photometertest bzgl. Einfluss verschiedener Additive ................................195
Abbildung 8.10 Photometertest zur Bestimmung der pH-Abhängigkeit .............................199
Abbildung 8.11 Enzymatische Reduktion unterschiedlich substituierter Acetophenone ....201
Abbildung 8.12 Eintopfreaktion unter Verwendung von Natriumcarbonat als Base ...........206
XV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 8.13 Eintopfreaktion unter Verwendung von NaHCO3 als Base........................211
Abbildung 8.14 Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Variation der Reaktionssequenz 213
Abbildung 8.15 Untersuchung auf limitierende Faktoren in der Suzuki-Kupplung .............214
Abbildung 8.16 Tandemreaktion mit gereinigter Lk-ADH ..................................................218
Abbildung 8.17 Einfluss der Verdünnung auf die Suzuki-Kreuzkupplung ..........................220
Abbildung 8.18 Umsetzung des Alkohols mit Phthalimid ...................................................222
Abbildung 8.19 Entschützen mit Hydrazin.........................................................................227
Abbildung 8.20 Photometertest zur Aktivitätsbestimmung der LeuDH ..............................231
Abbildung 8.21 Photometertest zur Bestimmung der Aktivität der GluDHs für L-Valin (8a)234
Abbildung 8.22 Aktivitätsbestimmung der NADH-Oxidase ................................................235
Abbildung 8.23 1H-NMR-Spektrum bei Verwendung von 0.5 mg/ml Fe-TSPP ..................241
Abbildung 8.24 1H-NMR-Spektrum bei Verwendung von 2.6 mg/ml Fe-TSPP ..................241
Abbildung 8.25 Enzymatische Oxidation von L-Valin (im Maßstab 1.5 ml) ........................242
Abbildung 8.26 Enzymatische Oxidation von L-Valin (8a) im Maßstab von 5 ml ...............243
Abbildung 8.27 Einfluss verschiedener Komponenten auf das Reaktionssystem
(Nachdosieren) ...................................................................................................................248
Abbildung 8.28 Untersuchung des Reaktionssystems auf Produktinhibierung ..................251
Abbildung 8.29 Oxidation von L-Valin unter biomimetischer Cofaktorregenerierung mittels
Fe-TSPP (10) .....................................................................................................................253
XVI
TABELLENVERZEICHNIS
III.
Tabellenverzeichnis
Tabelle 3.1 Einfluss der Reaktionstemperatur bei Verwendung von 12.5 M NaOH als Base17
Tabelle 3.2 Einfluss der Reaktionstemperatur bei Verwendung 50%-iger KOH (aq.) ...........18
Tabelle 4.1 Mehrfachdurchführung der Suzuki-Kreuzkupplung ............................................37
Tabelle 4.2 Reproduzierbarkeit der Suzuki-Kupplung mit NaHCO3 als Base .......................40
Tabelle 4.3 Ergebnisse der pH-Wert Messungen .................................................................42
Tabelle 4.4 Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) mit Phenylboronsäure (19) ..45
Tabelle 4.5 Verwendung von Phenylboronsäurepinakolester (30) als Kupplungspartner .....46
Tabelle 4.6 Aktivität der ADH aus Rhodococcus sp. für unterschiedlich substituierte
Acetophenone ......................................................................................................................49
Tabelle 4.7 Aktivität der ADH aus L. kefir für unterschiedlich substituierte Acetophenone ...50
Tabelle 4.8 Aktivität der ADH aus L. kefir (Rohextrakt) in Abhängigkeit vom pH-Wert .........56
Tabelle 4.9 Enzymatische Umsetzungen von 5 mit der ADH aus Rhodococcus sp..............58
Tabelle 4.10 Ergebnisse der Reduktion von Keton 5 mit ADH aus L. kefir (Rohextrakt) .......60
Tabelle 4.11 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit Na2CO3 als Base (ADH aus L. kefir) .........64
Tabelle 4.12 Reduktion der Katalysatorbeladung in der Suzuki-Kupplung (Scale-up) ..........66
Tabelle 4.13 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Weg A ......................69
Tabelle 4.14 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Weg B ......................72
Tabelle 4.15 Einfluss von Protein (HSA) auf die Suzuki-Kupplung .......................................75
Tabelle 4.16 Inhibierender Einfluss des Rohextrakts der ADH aus L. kefir ...........................76
Tabelle 4.17 Aktivität der gereinigten ADH aus L. kefir für unterschiedlich substituierte
Acetophenone ......................................................................................................................78
Tabelle 4.18 Aktivität der gereinigten ADH aus L. kefir in Abhängigkeit vom pH-Wert .........82
Tabelle 4.19 Biotransformationen mit verschiedenen Chargen gereinigter Lk-ADH .............83
Tabelle 4.20 Reproduzierbarkeit der Tandemreaktion .........................................................87
Tabelle 4.21 Einfluss der Enzym- bzw. Proteinmenge auf die Produktverteilung .................88
XVII
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 4.22 Einfluss des Palladiumkatalysators auf die Produktverteilung in der
Tandemreaktion ...................................................................................................................90
Tabelle 4.23 Einfluss der Reaktionszeit auf die Produktverteilung in der Tandemreaktion ...92
Tabelle 4.24 Umsetzung von rac-6 mit Phthalimid in einer SN2-Reaktion.............................94
Tabelle 4.25 Umsetzungen zum chiralen Produkt 28 ...........................................................98
Tabelle 5.1 Aktivität der verschiedenen Chargen Nox ........................................................117
Tabelle 5.2 Lagerstabilität einer gereinigten LeuDH (Charge 03/2011) ..............................118
Tabelle 5.3 Lagerstabilität zweier Chargen NOx ................................................................119
Tabelle 5.4 Evaluierung der Umsatzbestimmung mittels 1H-NMR-Spektroskopie ..............125
Tabelle 8.1 Ansätze analog AAV 1 unter Variation von Reaktionstemperatur und Base ....175
Tabelle 8.2 Gefrierpunkt der wässrigen Phase ..................................................................175
Tabelle 8.3 Ergebnisse analog AAV 3 bei 86 mM Substratkonzentration ...........................177
Tabelle 8.4 Ergebnisse analog AAV 3 bei 86 mM Substratkonzentration (50% IPA) ..........178
Tabelle 8.5 Ergebnisse analog AAV 3 bei 39 mM Substratkonzentration ...........................179
Tabelle 8.6 Zusammenfassung der Ergebnisse bzgl. Scale-up und Reduktion der
Katalysatorbeladung in der Suzuki-Kupplung .....................................................................182
Tabelle 8.7 Ansätze analog zur Synthese von 5 analog AAV 5 ..........................................184
Tabelle 8.8 Ansätze zur Synthese von rac-26 analog AAV 5 .............................................185
Tabelle 8.9 Ergebnisse der pH-Wert-Messungen...............................................................187
Tabelle 8.10 Ergebnisse zur Synthese von rac-6 analog AAV 9 ........................................191
Tabelle 8.11 Ergebnisse der Photometertests mit ADH aus Rhodococcus sp....................193
Tabelle 8.12 Ergebnisse der Photometertests mit ADH aus L. kefir (Rohextrakt) ...............194
Tabelle 8.13 Aktivität der partiell gereinigten ADH aus L. kefir ...........................................195
Tabelle 8.14 Inhibierung der ADH aus Rhodococcus sp. durch verschiedene Additive ......197
Tabelle 8.15 Inhibierung der gereinigten ADH aus L. kefir durch verschiedener Additive ...199
Tabelle 8.16 Ergebnisse der pH-Abhängigkeit der ADH aus L. kefir (Rohextrakt) ..............200
Tabelle 8.17 Ergebnisse der pH-Abhängigkeit der gereinigten ADH aus L. kefir ................201
XVIII
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 8.18 Zusammenfassung der Biotransformationen unter Verwendung der ADH aus
Rhodococcus sp. ................................................................................................................203
Tabelle 8.19 Reduktion von 4'-Phenylacetophenon (5) unter Verwendung von ADH aus
L. kefir (Rohextrakt) ............................................................................................................205
Tabelle 8.20 Zusammenfassung der Ergebnisse zur Reduktion von 4'-Phenylacetophenon
unter Verwendung von Lk-ADH (gereinigt) .........................................................................206
Tabelle 8.21 Zusammenfassung der Ergebnisse der Eintopfreaktion mit Na2CO3 (Lk-ADH)
...........................................................................................................................................209
Tabelle 8.22 Zusammenfassung der Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 ............212
Tabelle 8.23 Ergebnisse der Eintopfreaktion bei Variation der Reaktionssequenz .............214
Tabelle 8.24 Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Suzuki-Kupplung ...............................216
Tabelle 8.25 Zusammenfassung der Ergebnisse bzgl. des inhibierenden Einflusses von
Lk-ADH Rohextrakt ............................................................................................................217
Tabelle 8.26 Zusammenfassung der Ergebnisse der Tandemreaktion mit gereinigter Lk-ADH
...........................................................................................................................................219
Tabelle 8.27 Zusammenfassung der getesteten Reinigungsmethoden ..............................224
Tabelle 8.28 Zusammenfassung der getesteten Aufarbeitungsmethoden ..........................229
Tabelle 8.29 Aktivität der verschiedenen Chargen LeuDH .................................................232
Tabelle 8.30 Lagerstabilität der LeuDH aus Bacillus cereus (Charge 03/2011) ..................233
Tabelle 8.31 Ergebnisse bzgl. einer Produktinhibierung der LeuDH...................................234
Tabelle 8.32 GluDH-Aktivität für L-Valin (8a) ......................................................................235
Tabelle 8.33 volumetrische Aktivitäten der verwendeten Enzymchargen der NADH-Oxidase
...........................................................................................................................................237
Tabelle 8.34 Lagerstabilität der NADH-Oxidase .................................................................237
Tabelle 8.35 Zusammenstellung der Ergebnisse bzgl. Inhibierung der NOx ......................238
Tabelle 8.36 Kinetikdaten der Benchmarkreaktion .............................................................244
Tabelle 8.37 Kinetikdaten bzgl. Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit ...........................245
Tabelle 8.38 Kinetikdaten zum Einfluss der Rührgeschwindigkeit ......................................245
Tabelle 8.39 Kinetikdaten bzgl. FAD-Variation im Ansatz ..................................................246
Tabelle 8.40 Kinetikdaten bzgl. Variation der NOx-Menge im präparativen Ansatz ............247
Tabelle 8.41 Kinetikdaten bzgl. Einfluss der Cofaktorkonzentration im Ansatz...................248
XIX
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 8.42 Kinetikdaten bzgl. Einfluss von LeuDH (nachdosiert) ....................................249
Tabelle 8.43 Kinetikdaten bzgl. Einfluss der NOx-Menge (nachdosiert) .............................250
Tabelle 8.44 Kinetikdaten bzgl. Einfluss des Cofaktors NAD+ (nachdosiert).......................251
Tabelle 8.45 Kinetikdaten bzgl. Einfluss von Ketovalin im präparativen Ansatz .................252
Tabelle 8.46 Kinetikdaten der Benchmarkreaktion (Fe-TSPP zur Cofaktorregenerierung) .254
Tabelle 8.47 Einfluss der Eisenporphyrin-Menge auf den Reaktionsverlauf .......................254
Tabelle 8.48 Einfluss des pH-Werts auf den Reaktionsverlauf (Fe-TSPP) .........................255
Tabelle 9.1 Überführung von Ketovalin in die organische Phase .......................................260
XX
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
IV.
Abkürzungsverzeichnis
ADH
Alkoholdehydrogenase
AD-H-Säule
CHIRALPAK® Amolyse tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat)
AlaDH
Alanindehydrogenase
aq.
wässrig
Äq.
Äquivalent(e)
BM
Benchmark bzw. Benchmarkreaktion
CDCl3
deuteriertes Chloroform
cm
Zentimeter
COD
Cyclooctadien
d [cm]
Küvettendicke
d
Dublett
d
Tag(e)
δ [ppm]
chemische Verschiebung
DC
Dünnschichtchromatographie
DCM
Dichlormethan
dd
Dublett vom Dublett
DEA
Dieththylamin
DEAD
Diethylazadicarboxylat
DIAD
Diisopropylazadicarboxylat
DPPA
Diphenylazidophosphat
EA
Elementaranalyse
ee
Enantiomerenüberschuss (enantiomeric excess)
EI
Elektronenstoßionisation
EtOAc
Ethylacetat
f
Probenverdünnungsfaktor
FAB
fast atom bombardment
FAD
Flavin-Adenin-Dinukleotid
Fe-TSPP
Eisen-(III)-chloro-5,10,15,20-tetrakis-4,4‘,4‘‘,4‘‘‘-benzolsulfonsäureporphyrin
GluDH
Glutamatdehydrogenase aus Clostridium difficile oder Fusobacterium
nucleatum
h
Stunde
Hexan
Isomerengemisch von Hexan
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
XXI
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Hz
Hertz
IA-Säule
CHIRALPAK®-Säule IA, Amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat)
IB-Säule
CHIRALPAK®-Säule IB, Cellulose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamat)
IPA
iso-Propanol
i-PrOH
iso-Propanol
IR
Infrarot
J
skalare Kopplungskonstante [Hz]
kDa
Kilodalton
l
Liter
LB-ADH
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis
LeuDH
Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus oder
Bacillus stearothermophilus (Lyophilisat)
Lk-ADH
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir; so weit nicht anders
vermerkt wurde diese ADH als Rohextrakt eingesetzt
Kat.
Katalysator
Konz.
Konzentration
m
Multiplett
mg
Milligramm
m/z
Verhältnis Masse zu Ladung
MHz
Megahertz
min
Minute(n)
ml
Milliliter
mmol
Millimol
mol
Mol
MS
Massenspektrometrie
MTBE
Methyl-tert-butylether
MWCO
molecular weight cut off
NADH
Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (reduzierte Form)
+
NAD
Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (oxidierte Form)
NADPH
Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (reduzierte Form)
NADP+
Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (oxidierte Form)
n.b.
nicht bestimmt
nm
Nanometer
NMR
Kernmagnetische Resonanz
NOx
NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis
Ø
Durchmesser
XXII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
OJ-H-Säule
CHIRALCEL®-Säule OJ-H, Cellulose tris-(4-methylbenzoat)
PheDH
Phenylalanindehydrogenase
ppm
parts per million
q
Quartett
R
Substituent
RF
Retentionsfaktor
rac
racemisch
rpm
Umdrehung pro Minute (rounds per minute)
Rsp-ADH
Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus sp.
RT
Raumtemperatur
s
Singulett
SiO2
Kieselgel
t
Triplett
t
Zeit
TBAB
Tetrabutylammoniumbromid
tR
Retentionszeit
THF
Tetrahydrofuran
TPPTS
Tris(3-Sulfonylphenyl)phosphin Hydrat, Natrium-Salz
U
Units
UF
Ultrafiltration
U/mL
volumetrische Enzymaktivität
U/mmol
Units/Stoffmenge n(Substrat)
UV/Vis
Ultraviolett/Visible
V
Volumen
µl
Mikroliter
-1
ṽ [cm ]
Wellenzahl
Vg [ml]
Gesamtprobenvolumen
Vp [ml]
Probenvolumen
XXIII
EINLEITUNG
1
Einleitung
Chirale Verbindungen sind essentiell in lebenden Organismen. Insbesondere chirale
Alkohole, Amine und Aminosäuren haben eine große Bedeutung. Sie sind gleichzeitig
interessante Bausteine, z.B. für die Herstellung von Katalysatoren und pharmazeutischen
Wirkstoffen.
Betrachtet man die 200 meistverkauften pharmazeutischen Produkte in den USA 2011, so
befinden sich darunter besonders viele chirale Aminoverbindungen, z.B. Taxane.[1] Der in
Taxol (BMS) und Abraxan (Celgene) enthaltene Wirkstoff Paclitaxel (siehe Abbildung 1.1)
repräsentiert die Verbindungsklasse der β-Aminosäurederivate. Taxol wurde zunächst aus
der Rinde von Taxus brevifolia, der pazifischen Eibe, isoliert.[2] Mittlerweile sind auch
komplexe Totalsynthesen dieser Verbindung bekannt, die als Zytostatikum, insbesondere zur
Behandlung bösartiger Tumore im Rahmen einer Chemotherapie, zur Anwendung
kommt.[3,4]
Abbildung 1.1 Paclitaxel
Ein weiteres pharmazeutisch relevantes chirales Amin stellt Odanacatib (siehe Abbildung
1.2), ein chirales Amin mit einer Biaryleinheit, dar. Diese Substanz wird zur Behandlung von
Knochenkrebs und Osteoporose untersucht. Es handelt sich hierbei um einen Cathepsin K
Inhibitor. Cathepsin K, eine lysomale Zysteinprotease, spielt eine große Rolle beim
Knochenabbau,[5] da sie für die Auflösung der organischen Knochenmatrix in den
Osteoklasten zuständig ist.[6]
1
EINLEITUNG
Abbildung 1.2 Struktur von Odanacatib
Eine weitere bedeutende Verbindungsklasse chiraler Amine stellen die α-Aminosäuren dar.
Von den 20 natürlich vorkommenden sind vor allem die essentiellen Aminosäuren (Isoleucin,
Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) von Bedeutung.[7,8]
Nicht nur die essentiellen Aminosäuren spielen eine zentrale Rolle in lebenden Organismen.
Auf Grund bestimmter Erkrankungen oder einer notwendigen Niedrig-Protein-Diät, z.B. bei
chronischen Niereninsuffizienz kann es sinnvoll sein anstatt essentielle α-Aminosäuren direkt
aufzunehmen, α-Ketosäuren in Form von Nahrungsergänzungsmitteln zuzuführen.[9] Der
Körper ist in der Lage mittels Transaminierung die α-Ketosäuren in die analogen und für den
Körper essentiellen α-Aminosäuren umzuwandeln.[10]
Abbildung 1.3 Gleichgewichtsreaktion zur Umwandlung einer α-Aminosäure in die analoge
α-Ketosäure
Diese
Arbeit
beschäftigt
sich
mit
der
Synthese
und
Oxidation
von
chiralen
Aminoverbindungen unter Verwendung unterschiedlicher Katalysatorsysteme. Abhängig von
der Art der Verbindungsklasse wurden neben Organokatalysatoren auch Metall- und
Biokatalysatoren zur Synthese der verschiedenen Zielmoleküle verwendet.
2
MOTIVATION UND ZIELSETZUNG
2
Motivation und Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit ist die Synthese und die Oxidation chiraler Amino-Verbindungen unter
Verwendung verschiedener Katalysatorsysteme.
Im ersten Teilkapitel wird für die Synthese chiraler β-Aminosäurederivate über die
enantioselektive Aza-Michael-Reaktion auf ein chirales quartäres Ammoniumsalz als
Phasentransferkatalysator
zum
Aufbau
des
Stereozentrums
zurückgegriffen
(siehe
Abbildung 2.2). Die β-Aminosäurestruktur findet man in verschiedenen Wirkstoffen wieder,
z.B. in dem in Abbildung 1.1. dargestellten Zytostatikum Paclitaxel. Im zweiten Teilkapitel
wird die chirale Biarylethylamin-Substruktur des pharmazeutisch relevanten Odanacatib
(siehe Abbildung 1.2) unter Kombination verschiedenartiger Katalysatoren synthetisiert.
Neben der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkopplung findet hierbei auch die Biokatalyse
in Form einer enzymatischen Reduktion zum Aufbau des Stereozentrums Anwendung. Der
Fokus liegt dabei auf der Mehrstufen-Eintopfreaktion zur Synthese des chiralen
Biarylalkohols. Dieser chemoenzymatischen Synthese folgt eine klassisch chemische
Substitution des Alkohols zum Amin (siehe Abbildung 2.1).
Abbildung 2.1 Ziel dieser Arbeit
3
MOTIVATION UND ZIELSETZUNG
Im dritten Teilkapitel soll gezeigt werden, dass natürliche α-Aminosäuren, insbesondere
L-Valin,
interessante Substrate zur Herstellung von α-Ketosäuren darstellen. Mittels
Aminosäuredehydrogenasen sollen diese in die korrespondierenden α-Ketosäuren als
stickstofffreie Derivate überführt werden (siehe Abbildung 2.1).
Enantioselektive
Synthese
β-Aminosäurederivate
chiraler
durch
organokatalysierte Aza-Michael-Reaktion
Auf dem Weg der Aza-Michael-Reaktion zur enantioselektiven Synthese chiraler
β-Aminosäurederivate soll ausgehend von einem einfach zugänglichen prochiralen Molekül,
dem Crotonsäureethylester 2 und einem asymmetrischen Stickstoffnukleophil (1), ein
chirales
quartäres
Stereozentrums
Ammoniumsalz
genutzt
werden
als
Phasentransferkatalysator
(siehe
Abbildung
2.2).
zum
Der
Aufbau
des
Vorteil
von
Phasentransferkatalysatoren besteht in ihrer einfachen Verfügbarkeit und der Toleranz von
Wasser als vorteilhaftem technischen Lösungsmittel.[11-13] Das Produkt 3 soll mit möglichst
hoher Enantioselektivität gebildet werden.
Abbildung 2.2 Phasentransfer-katalysierte Synthese chiraler β-Aminosäurederivate
Kombination von Palladiumkatalyse mit einer Biotransformation zur Synthese
chiraler Alkohole in einer Eintopfreaktion und weitere Umsetzung zum chiralen
Amin
Als erster Schritt soll mittels Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer Reduktion der chirale
Biarylalkohol 6 hergestellt werden, der dann in weiteren Schritten mittels klassisch
chemischer Methoden in einer SN2-Reaktion unter Inversion des Stereozentrums in das
chirale Amin 7 überführt werden soll (siehe Abbildung 2.3). In der Biotransformation stehen
zwei
4
Alkoholdehydrogenasen
zur
Verfügung:
zum
Einen
die
(R)-selektive
MOTIVATION UND ZIELSETZUNG
Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Lactobacillus kefir und zum Anderen die (S)-selektive
ADH aus Rhodococcus species. Durch die Wahl des jeweiligen Biokatalysators sollen so
gezielt die beiden Enantiomere synthetisiert werden.
O
SuzukiKupplung
O
OH
∗
ADH
I
4
5
6
NH 2
SN 2-Reaktion
(Inversion)
∗
7
Abbildung 2.3 Synthese der chiralen Biarylamin-Substruktur
Der besondere Fokus in diesem Teilkapitel liegt auf der Kombination von Palladiumkatalysierter Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer Reduktion in einer Eintopfreaktion
zur Steigerung der Prozesseffizienz. Derartige Mehrstufen-Eintopfverfahren sind bereits
bekannt.[14-16] In der Literatur noch nicht beschrieben ist die Kombination von Palladiumkatalysierter
Suzuki-Kreuzkupplung
und
Biotransformation
(hier
im
Speziellen
der
enzymatischen Reduktion) in einer Tandemreaktion. Der Begriff Tandemreaktion bedeutet,
dass alle benötigten Komponenten von Anfang an zugegeben werden und beide Reaktionen
gleichzeitig
ablaufen.
Dafür
müssen
zunächst
die
Reaktionsbedingungen
der
Einzelreaktionen in Bezug auf die Reaktionstemperatur, das Reaktionsmedium und dessen
pH-Wert aufeinander abgestimmt werden. Als Katalysator in der Suzuki-Kupplung soll neben
Palladiumchlorid ein wasserlöslicher Phosphin-Ligand eingesetzt werden. Eine besondere
Herausforderung liegt hier in der Kompatibilität des pH-Werts des Reaktionsmediums.
Während die Suzuki-Kupplung üblicherweise in stark basischem organischen Medium
durchgeführt
wird,
bevorzugen
Alkoholdehydrogenasen
ein
neutrales
wässriges
Reaktionsmedium.
5
MOTIVATION UND ZIELSETZUNG
Enzymatische Oxidation natürlicher Aminosäuren zu α-Ketosäuren
In diesem Teilkapitel sollen natürliche L-Aminosäuren (8) mittels enzymatischer Oxidation in
ihre Stickstoff-freien Analoga, die α-Ketosäuren (9), überführt werden (siehe Abbildung 2.4).
Als Katalysatoren stehen hier verschiedene Aminosäuredehydrogenasen zur Verfügung, die
unter
milden
Reaktionsbedingungen
thermodynamischen
Gleichgewichtes
arbeiten.
dieser
Auf
Reaktion
Grund
wird
des
ein
ungünstigen
effizientes
Cofaktorregenerierungssystem (z.B. eine NADH-Oxidase) benötigt, um einen effizienten
Prozess zu gestalten. Zur in situ Cofaktorregenerierung stehen zum Einen eine NADHOxidase aus Lactobacillus brevis (enzymatische Cofaktorregenerierung) und zum Anderen
das Eisenporphyrin Fe-TSPP 10 (biomimetische Cofaktorregenerierung) zur Verfügung. In
beiden Fällen wird der für die Oxidation der Aminosäure benötigte Cofaktor NAD+ aus der
reduzierten Form NADH durch Oxidation mit molekularem Sauerstoff regeneriert. Als
Nebenprodukt entsteht lediglich Wasser.
Abbildung 2.4 Enzymatische Oxidation von α-Aminosäuren
6
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
3
Enantioselektive Synthese von β-Aminosäurederivaten durch
organokatalysierte Aza-Michael-Reaktion
3.1
Einleitung
Enantiomerenreine β-Aminosäuren stellen wertvolle Bausteine zur Herstellung von
pharmazeutisch relevanten Verbindungen, Peptidomimetika und Naturstoffen dar.[17,18] Im
Gegensatz zu den α-Aminosäuren sind β-Aminosäuren – mit Ausnahme von β-Alanin und
β-Aminoisobutansäure – in der Natur deutlich seltener anzutreffen.[17]
Einen bemerkenswerter Vertreter der β-Aminosäuren stellt neben dem Zytostatikum
Paclitaxel (siehe Abbildung 1.1), das von Bristol-Myers Squibb unter dem Namen TaxolTM
vertrieben wird, der Wirkstoff Sitagliptin als Antidiabetikum dar.[19,20]
Biokatalytisch können chirale β-Aminosäuren durch enzymatische Racematspaltung, z.B.
von β-Aminosäureestern, oder wie im Fall von Sitagliptin mittels Transaminierung von
β-Ketosäurederivaten hergestellt werden.[19] Darüber Hinaus sind β-Aminosäuren durch
eine Vielzahl chemischer Reaktionen zugänglich. Die wichtigsten Reaktionen sind in
Abbildung 3.1 retrosynthetisch dargestellt.[18]
Bei den hier dargestellten Methoden zur Synthese von β-Aminosäuren handelt es sich um
die Michael-Addition von Stickstoffnukleophilen (A),[21-23] die Homologisierung von
α-Aminosäuren (B),[24,25] die Hydrolyse von β-Aminonitrilen (C),[21,24,26-30] die Reduktion
von
α-Cyano-Carbonsäureestern
(D),[31,32]
die
reduktive
Aminierung
über
ein
Enamin (E),[33] Überführung einer Carbonsäurefunktion einer Dicarbonsäure in eine
Aminofunktion mittels Umlagerung (z.B. Curtius- oder Hofmann-Umlagerung) (F),[34] die
Ringöffnung von β-Lactamen (G),[35] die Oxidation von Aminoalkoholen (H), die
Amidomethylierung von Arylessigsäure- oder Malonsäureestern (I),[36-39] und die
Knoevenagel-Kondensation eines Aldehyds mit Malonsäureester in Gegenwart von
Ammoniumacetat (J).[40-42] Die Michael-Addition zeichnet sich durch die oftmals gute
Verfügbarkeit der α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen aus. Die Phasentransferkatalysierte Variante bietet zudem den Vorteil, dass die Katalysatoren einfach verfügbar sind
und Wasser als vorteilhaftes technisches Lösungsmittel tolerieren.[11-13]
7
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
Abbildung 3.1 Retrosynthestische Analyse zur Synthese von β-Aminosäuren [18]
3.2
Stand der Wissenschaft
Wie in Abbildung 3.1 deutlich zu erkennen ist gibt es eine Vielzahl an Möglichkeiten
β-Aminosäuren herzustellen. Die Addition eines Stickstoffnukleophils an α,β-ungesättigte
Carbonsäurederivate (Aza-Michael-Reaktion) stellt dabei einen sehr interessanten Ansatz
zur stereoselektiven Synthese von β-Aminosäurederivaten dar, da sind die als MichaelAkzeptoren benötigten α,β-ungesättigten Carbonsäureester oft schon verfügbar sind.[11]
Darüber hinaus bietet das Konzept der Aza-Michael-Reaktion das Potential der perfekten
Atomökönomie, wenn z.B. NH3 als Donor eingesetzt wird. Prinzipiell gibt es drei
Möglichkeiten mit dieser Methode ein chirales Produkt herzustellen (siehe Abbildung
3.2):[43]
1. Addition eines chiralen Amins an den Michael-Akzeptor
2. Addition eines Stickstoffnukleophils an einen chiralen Akzeptor
3. asymmetrische Katalyse
8
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
Abbildung 3.2 Möglichkeiten der asymmetrischen Induktion in der Aza-Michael-Reaktion
[43]
Im Folgenden wird vor allem auf die asymmetrische Katalyse eingegangen. Ausgehend von
einem prochiralen Substrat und einem achiralen Stickstoffnukleophil, wird mit Hilfe eines
chiralen Katalysators das Stereozentrum aufgebaut.
Zur Synthese enantiomerenreiner β-Aminosäure-Derivate mittels Aza-Michael-Reaktion sind
sowohl enzymatische als auch klassisch chemische Methoden bekannt. Unter den
Biotransformationen ist insbesondere die Hydrolase-katalysierte Michael-Addition von
Stickstoffnukleophilen zu nennen.[44-47] Weitere enzymatische Methoden zur Synthese
enantiomerenreiner β-Aminosäuren basieren auf der Racematspaltung racemischer
β-Aminosäuren und ihrer Derivate, der Homologisierung von α-Aminosäuren mittels
Aminomutase und der reduktiven Aminierung von Ketonen mittels β-Aminotransferase.[18]
In der Organokatalyse unterscheidet man zwischen kovalenter und nicht-kovalenter
Katalyse. Während der erste Fall die Bildung eines kovalenten Addukts aus Substrat und
Katalysator
beinhaltet,
Wechselwirkungen
wie
basieren
letztere
Katalyseprozesse
Wasserstoffbrückenbindungen
oder
auf
der
nicht-kovalenten
Bildung
von
Ionenpaaren.[48] Diese Konzepte kamen auch in der organokatalysierten Aza-MichaelReaktion bereits zur Anwendung.
Verschiedene elegante und effiziente Prozesse bezüglich der organokatalysierten AzaMichael-Reaktion konnten bereits erfolgreich etabliert werden, wenn Acyloxazolidinone [49],
9
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
α,β-ungesättigte N-Acylpyrrole [50] und α,β-ungesättigte Pyrazolyl-Butenone [51] oder Enale
[52-55] als Akzeptoren verwendet wurden. Dabei wurden verschiedene Katalysatorsysteme
und
Aktivierungsmechanismen
Carbonylverbindung
über
angewendet,
einen
z.B.
der
α,β-ungesättigten
(über
Lewis-Säure-Kat.)
Aktivierung
Übergangsmetallkatalysator
[49,50,56-58], auf Thioharnstoff-basierende Organokatalysatoren (über H-Brücken) [51] und
auf Pyrrolidin-basierenden Organokatalysatoren (über Iminium Bildung) [52-55,59-61]. In der
Aza-Michael-Reaktion werden meist aliphatische und aromatische Amine, Alkoxyamine,
Aldoxime, Stickstoffwasserstoffsäure und Azide als Stickstoffnukleophile eingesetzt. Weniger
reaktive Stickstoffnukleophile benötigen im Gegensatz zu den reaktiven Aminen einen
Katalysator (Brönsted- oder Lewis-Säure) oder katalytische Mengen starker Base. Werden
Carbamate
als
Nukleophile
eingesetzt,
so
werden
Brönsted-Säuren
oder
teure
Übergangsmetall-basierte Lewis-Säuren verwendet.[62]
Eine achirale Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion wurde 2008 von Park und
Jeong
beschrieben.[62]
Sie
verwendeten
Tetrabutylammoniumbromid
(TBAB)
als
Phasentransfer-Katalysator für die intermolekulare Addition von tert-Butylbenzyloxycarbamat
an cyclische und acyclische Enone in einem Zweiphasensystem bestehend aus Toluol und
wässriger KOH-Lösung.[62]
Chirale Phasentransferkatalysatoren wurden bereits in der asymmetrischen Aldolreaktion
und der Michael-Addition von Kohlenstoffnukleophilen und in Alkylierungsreaktionen
erfolgreich angewendet.[12,13] Der Vorteil von Phasentransferkatalysatoren besteht in ihrer
einfachen Verfügbarkeit und der Toleranz von Wasser als vorteilhaftem technischen
Lösungsmittel.[11-13]
In der (asymmetrischen) Phasentransfer-katalysierten Michael-Reaktion erfolgt zunächst die
Deprotonierung des Nukleophils (NuH) durch eine achirale Base. Das Anion Nu- wird vom
chiralen Phasentransferkatalysator in die organische Phase transportiert. Dabei bilden sie
zusammen ein chirales Ionenpaar, über das die asymmetrische Addition an das βKohlenstoffatom der α,β-ungesättigten Carbonylverbindung ablaufen kann.[48] Das Prinzip
ist in Abbildung 3.3 veranschaulicht dargestellt.
10
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
Abbildung 3.3 Bildung des chiralen Ionenpaars
Die asymmetrische Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion ist bisher noch wenig
bekannt. 2008 berichtete die Gruppe um Bandini und Umani-Ronchi über eine
enantioselektive intramolekulare Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion des
Indol-substituierten α,β-ungesättigten Carbonsäureesters 11. Als chirale Phasentransferkatalysatoren wurden Katalysatoren vom Cinchona-Typ (13) verwendet. Der Methylester 12
(Abbildung 3.4) konnte unter Verwendung von 10 mol% des Katalysators 13 mit einer
Ausbeute von 90% und einem ee-Wert von ebenfalls 90% erhalten werden.[63]
Abbildung 3.4 Intramolekulare Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion
Eine intermolekulare Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion wurde als erster
Schritt einer Ringschlussreaktion unter Bildung von 2-(Phenylsulfanyl)aziridinen (15)
beschrieben.[64] Die verwendeten Phasentransfer-Katalysatoren vom Cinchona-Typ wurden
in Mengen zwischen 20 und 50 mol% eingesetzt. Abhängig von der Ringgröße des
Substrats, der Reaktionszeit, dem Katalysator und der verwendeten Methode, konnten die
Produkte in Ausbeuten zwischen 17 und 96% und ee-Werten von 17-75% erhalten werden.
Die besten Ergebnisse wurden für das Substrat 14 erzielt. Je nach Methode wurde es unter
Verwendung des Katalysators 16 mit einer Ausbeute von 96% und einem ee-Wert von 61%
bzw. mit einer Ausbeute von 93% und einem ee-Wert von 75% erhalten [64].
11
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
Abbildung 3.5 Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion als Teil einer
Ringschlussreaktion
Die Verwendung einfacher α,β-ungesättigter Alkylester als attraktive Substrate in der
intermolekularen asymmetrischen Aza-Michael-Reaktion war bis dato unbekannt. Im AK
Gröger beschäftigte sich Weiß im Rahmen seiner Doktorarbeit mit der intermolekularen AzaMichael-Reaktion.[65] Als Modellreaktion wählte er die Addition des Carbamats 1 an
E-4,4,4-Triflurbutansäureethylester (2) (siehe Abbildung 3.6). Das Carbamat 1 wurde
bereits erfolgreich als Nukleophil zur nicht-enantioselektiven Addition an elektronenarme
Alkene eingesetzt [62].
Abbildung 3.6 Intermolekulare Aza-Michaelreaktion
Auf der Suche nach einem geeigneten chiralen Phasentransfer-Katalysator für die
enantioselektive Aza-Michael-Reaktion konzentrierte sich Weiß auf die in Abbildung 3.7
dargestellten chiralen Ammonium- und Phosphonium-Katalysatoren.
Der kommerziell erhältliche Katalysator (-)-N-Dodecyl-N-methylephhedriniumbromid (17a)
zeigte nur niedrige Enantioselektivität (9% ee). Cinchona-Alkaloid basierte Katalysatoren
wurden bereits mit großem Erfolg in der asymmetrischen Katalyse eingesetzt.[12,13] Ähnlich
wie die Gruppe um Bandini und Umani-Ronchi konnte auch Weiß bei der Verwendung der
12
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
Cinchona-Katalysatoren keine nennenswerte Enantioselektivität beobachten. Das Produkt 3a
wurde als Racemat erhalten.[11,65]
Br
OH
Br
(CH2)11-CH3
N
Br
N
O
N
17a
O
N
N
F
F
17b
F
O
O
N
Br
O
P
N
oAn
F
F
CF3SO3
F
17c
17d
Abbildung 3.7 Auswahl an chiralen Phasentransferkatalysatoren in der intermolekularen
Aza-Michael-Reaktion [11]
Auch chirale Ammonium-Salze wie 17c, die von der Gruppe um Maruoka entwickelt wurden
erwiesen sich bereits als exzellente Katalysatoren in der asymmetrischen Katalyse.[12,13]
Dieser kommerziell erhältliche Stickstoff-haltige Phasentransferkatalysator 17c vom
Maruoka-Typ zeigte die beste Enantioselektivität für diese Reaktion. Das Produkt 3a konnte
mit einem ee-Wert von 22% und einer Ausbeute von 81% isoliert werden. Der chirale
Phosphonium-Katalysator 17d zeigte ähnlich wie der Alkaloid-basierte Katalysator 17b keine
Enantioselektivität
für
die
Aza-Michael-Reaktion
unter
den
gewählten
Reaktionsbedingungen.[11,66]
13
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
3.3
Ziel der Arbeit
Anhand der Addition von tert-Butylbenzyloxycarbamat (1a) an E-4,4,4-Triflurbutansäureethylester (2) als Modellreaktion (siehe Abbildung 3.8) soll der Einfluss verschiedener
Faktoren auf die Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion untersucht werden und
wenn möglich die bisherige Synthesemethode von Weiß optimiert werden.[65]
Abbildung 3.8 Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion [65]
In Vorarbeiten konnte unter Verwendung von 30 mol% des Katalysators 17c das gewünschte
Produkt in einer Ausbeute von 81% und mit einem ee-Wert von 22% erhalten werden. Die
Reaktion wurde bei -20°C durchgeführt, um die unerwünschte nicht-katalytische AzaMichael-Reaktion als Nebenreaktion zu unterdrücken (13% Ausbeute rac-3a nach 23
Stunden Rühren bei -20°C).[65]
Im Folgenden soll die Reaktion bezüglich ihrer Enantioselektivität optimiert werden. In
diesem Zusammenhang soll der Einfluss der Katalysatorstruktur eingehender untersucht
werden.
Hierzu
werden
zwei
sterisch
unterschiedlich
anspruchsvolle
Phasentransferkatalysatoren vom Maruoka-Typ (quartäres Ammoniumsalz) eingesetzt: zum
Einen das starre Spiroammoniumsalz 17c (siehe Abbildung 3.7) und zum Anderen ein
einfacheres
quartäres
Ammoniumsalz
18
(siehe
Abbildung
3.10)
mit
flexiblen
unverzweigten Alkylketten. Beide Katalysatoren erwiesen sich bereits als hoch effizient in der
enantioselektiven Synthese von α-Aminosäurederivaten via Alkylierung und lieferten
vergleichbare Ergebnisse bezüglich katalytischer Aktivität und Enantioseletivität.[12,67,68]
14
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
3.4
3.4.1
Ergebnisse und Diskussion
Reproduktion der Literatur
Zunächst sollte die von Markus Weiß entwickelte Modellreaktion (siehe Abbildung 3.8), die
Addition von tert-Butylbenzyloxycarbamat (1a) an E-4,4,4-Triflurbutansäureethylester (2),
reproduziert werden. Die Durchführung erfolgte analog AAV 1 im Zwei-Phasen-System
bestehend aus Toluol und Natriumhydroxid-Lösung (12.5 M) in Gegenwart von 30 mol% des
chiralen Phasentransfer-Katalysators 17c bei -20°C.
Abbildung 3.9 Phasentransfer-katalysierte Aza-Michael-Reaktion
Nach säulenchromatographischer Reinigung konnten 80% Produkt 3a mit einem ee-Wert
von 20% isoliert werden. Zum Vergleich: Weiß konnte in seiner Doktorarbeit unter
Verwendung von 30 mol% des Katalysators 3a das Produkt mit 81% Ausbeute und einem
ee-Wert von 22% erhalten.[65]
3.4.2
Einfluss der Katalysatorstruktur auf die Enantioselektivität
Im Folgenden sollte nun der Einfluss der Katalysatorstruktur auf die Enantioselektivität der
Reaktion näher untersucht werden. Dazu wurde neben dem chiralen Ammoniumsalz 17c mit
zwei
Binaphthyl-Resten
und
starrer
Struktur
der
flexiblere
chirale
N-haltige
Phasentransferkatalysator 18, der ebenfalls von der Gruppe um Maruoka entwickelt wurde,
eingesetzt. Der Katalysator 18 erwies sich bereits als höchst effizient in der asymmetrischen
Alkylierung.[12] Die Durchführung der Aza-Michael-Reaktion erfolgte analog AAV 1 bei -20°C
im Zwei-Phasensystem mit 12.5 M Natronlauge als wässrige Phase (siehe Abbildung 3.10).
15
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
O
O
O
N
H
1a
(2.0 Äq.)
+
Toluol
-20°C, 23 h
O
F3C
30 mol% Katalysator 18
1.2 Äq. Base (wässrig)
O
O
F3C
F
O
N
O
O
O
F
3a
82% Ausbeute
2% ee
F
2
(1.0 Äq.)
CH3
N
Br
CH3
F
F
F
18
Abbildung 3.10 Einfluss der Katalysatorstruktur auf die Phasentransfer-katalysierte AzaMichael-Reaktion
Wurde der starre Katalysator 17c verwendet, so konnte das Produkt 3a mit 80% Ausbeute
und einem ee-Wert von 20% isoliert werden (siehe Abbildung 3.9). Wurde der Katalysator
18 verwendet, so konnte das Produkt 3a ebenfalls in guter Ausbeute, hier mit 82%, isoliert
werden. Allerdings zeigt dieser Katalysator mit einem ee-Wert von 2% für das Produkt 3a
keine nennenswerte Enantioselektivität (siehe Abbildung 3.10). Die starre Struktur des
Organokatalysators 17c durch das zweite Binaphthylsystem trägt also entscheidend zur
Enantioselektivität der Reaktion bei und ist nötig um hinreichende asymmetrische Induktion
zu
bewirken.
Weitere
Experimente
werden
deshalb
unter
Verwendung
des
Phasentransferkatalysators 17c durchgeführt.
3.4.3
Einfluss der Reaktionstemperatur
Aus der Literatur ist bereits bekannt, dass eine unerwünschte Nebenreaktion auftritt, bei der
das Produkt 3a als Racemat gebildet wird.[65] Diese wird als nicht-katalytische Aza-MichaelReaktion bezeichnet und kann auch bei einer Reaktionstemperatur von -20°C nicht
vollständig unterdrückt werden. Es soll untersucht werden, ob diese Nebenreaktion
16
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
unterdrückt werden kann indem die Reaktion bei tieferen Temperaturen durchgeführt wird
und dadurch der ee-Wert des Produkts verbessert werden kann. Da sich bisher der
Katalysator 17c am geeignetsten zeigte, wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur auf die
Enantioselektivität der Aza-Michael-Reaktion unter Verwendung von Katalysator 17c
untersucht. Die Durchführung erfolgte analog AAV 1 im Zwei-Phasen-System bestehend aus
Toluol und 12.5 M Natronlauge (aq.). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.1 zusammengefasst.
Tabelle 3.1 Einfluss der Reaktionstemperatur bei Verwendung von 12.5 M NaOH als Base
a)
Eintrag
Temperatur
Ausbeute
ee-Wert [%]
1
-20°C
70%
20
2
-60°C
41%
15
3
-76°C a)
48%
24
Die Temperatur wurde über Nacht nicht gehalten
Auf den ersten Blick zeigt die Aza-Michael-Reaktion einen ungewöhnlichen Verlauf.
Vergleicht
man
die
Enantiomerenreinheit
des
Produkts
3a
in
Abhängigkeit
der
Reaktionstemperatur, so kann kein eindeutiger Einfluss der Temperatur auf die
Enantioselektivität der Reaktion festgestellt werden. Betrachtet man die Ausbeute des
Produkts 3a, so stellt man fest, dass bei einer Reaktionstemperatur unterhalb -20°C deutlich
weniger Produkt isoliert wurde (vgl. Eintrag 1 und Einträge 2 und 3 in Tabelle 3.1).
Erwähnenswert hierbei ist das Einfrieren der wässrigen Phase. Dies könnte ebenfalls die
Schwankungsbreite erklären. Analog AAV 2 wurde der Gefrierpunkt der 12.5 M Natronlauge
auf rund -20°C bestimmt. Um den tatsächlichen Einfluss der Reaktionstemperatur auf die
Enantioselektivität der Phasentransfer-katalysierten Aza-Michael-Reaktion untersuchen zu
können, wird eine wässrige Phase benötigt, die unter Reaktionsbedingungen flüssig bleibt.
Eine Vielzahl Phasentransfer-katalysierter Reaktionen werden im Zwei-Phasensystem mit
50%-iger Kalilauge als wässrige Phase verwendet.[69] Analog AAV 2 wurde der Gefrierpunkt
17
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
50%-iger Kalilauge auf unter -77°C bestimmt. Diese ist damit besser geeignet um den
Einfluss der Reaktionstemperatur auf die Enantioselektivität zu untersuchen.
Analog AAV 1 wurde mit Phasentransferkatalysator 17c die Modellreaktion im ZweiPhasensystem bestehend aus Toluol und 50%-iger Kalilauge bei -20°C durchgeführt (siehe
Tabelle 3.2, Eintrag 1) bevor die Reaktionstemperatur erneut variiert wurde. Die Ergebnisse
sind inTabelle 3.2 zusammengefasst.
Tabelle 3.2 Einfluss der Reaktionstemperatur bei Verwendung 50%-iger KOH (aq.)
Eintrag
Temperatur
Ausbeute
ee-Wert [%]
1
-20°C
80%
37
2
-60°C
50%
34
Bei einer Reaktionstemperatur von -20°C konnte nach Substitution der 12.5 M Natronlauge
durch 50%-ige Kalilauge als wässrige Phase, bei -20°C die Enantiomerenreinheit des
Produkts auf 37% ee gesteigert werden (siehe Tabelle 3.2, Eintrag 1). Im Vergleich dazu
konnte mit 12.5 M Natronlauge als wässrige Phase, unter ansonsten identischen
Reaktionsbedingungen lediglich ein ee-Wert von 20% erzielt werden (siehe Tabelle 3.1,
Eintrag 1). Dies entspricht nahezu einer Verdoppelung des ee-Werts allein durch Wechsel
der Base.
Eine Erklärung wäre, dass die Base an sich einen Einfluss auf die Enantioselektivität hat. Die
Gruppe um Bandini und Umani-Ronchi untersuchte bereits den Einfluss verschiedener
Basen wie LiOH, NaOH und CsOH auf die Enantioselektivität der intramolekularen AzaMichael-Reaktion (siehe Abbildung 3.4); dabei erhielten sie unabhängig von der
verwendeten anorganischen Base vergleichbare ee-Werte.[63] Somit ist davon auszugehen,
18
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
dass
die
verbesserte
Enantioselektivität
darauf
zurückzuführen
ist,
dass
das
Reaktionsgemisch auch beit tieferen Temperaturen flüssig bleibt.
Durch weitere Erniedrigung der Reaktionstemperatur konnte der ee-Wert des Produkts 3a
nicht weiter gesteigert werden (vgl. Tabelle 3.2, Eintrag 1 und 2). Der ee-Wert betrug 34%
gegenüber 37% ee. Die Abweichung von 3% liegt im Bereich der Messschwankungen.
Zudem konnte weniger Produkt isoliert werden (50% gegenüber 80%). Die Reaktion verläuft
bei -60°C langsamer als bei -20°C (vgl. Tabelle 3.2, Eintrag 1 und 2).
3.5
Zusammenfassung des Teilkapitels
Ausgehend von den Ergebnissen, die Weiß zur Synthese enantiomerenangereicherter βAminosäure-Derivate mittels Phasentransfer-katalysierter Aza-Michael-Reaktion erzielt hat,
konnte der ee-Wert des Produkts 3a von 20% auf 37% ee gesteigert werden ohne einen
Verlust in der Ausbeute hinnehmen zu müssen. Wurde an Stelle von 12.5 M Natronlauge
50%-ige Kalilauge als wässrige Phase eingesetzt, konnte das enantiomerenangereicherte
Produkt 3a mit 80% isoliert werden.
Abbildung 3.11 Aza-Michael-Reaktion zur Synthese von 3a unter optimierten Bedingungen
19
ENANTIOSELEKTIVE SYNTHESE VON β-AMINOSÄUREDERIVATEN DURCH
ORGANOKATALYSIERTE AZA-MICHAEL-REAKTION
Die Verbesserung der Enantioselektivität der Aza-Michael-Reaktion zur Synthese des
Produkts 3a durch den Wechsel der Base ist auf den unterschiedlichen Gefrierpunkt der
beiden Basenlösungen zurückzuführen. Während der Gefrierpunkt der 12.5 M Natronlauge 20°C beträgt, liegt der Gefrierpunkt von 50%-iger Kalilauge unterhalb von -77°C.
Zudem konnte gezeigt werden, dass das zweite Binaphthylsystem und die starre Struktur
des Katalysators 17c ausschlaggebend für die Enantioselektivität ist. Der einfachere
Katalysator 18 zeigte kaum asymmetrische Induktion in der Phasentransfer-katalysierten
Aza-Michael-Reaktion.
20
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4
Kombination von Palladiumkatalyse und Biokatalyse zur
enantioselektiven Synthese eines Alkohols und dessen
Umsetzung zum chiralen Amin
4.1
Einleitung
In Kapitel 1 wurde bereits die Bedeutung pharmazeutisch relevanter chiraler Amine erörtert.
In diesem Zusammenhang wurde auch der Cathepsin K Inhibitor Odanacatib vorgestellt.
Chemisch betrachtet handelt es sich bei diesem Wirkstoff um ein chirales Amin mit einer
Biarylstruktur (siehe Abbildung 4.1).
Abbildung 4.1 Biarylethylaminstruktur von Odanacatib
Betrachtet man diese Biarylethylamin-Einheit retrosynthetisch, so kann diese auch mittels
Palladium-katalysierter Suzuki-Kupplung aufgebaut werden. Das Stereozentrum gewinnt
man durch die Reduktion des Ketons zum chiralen Alkohol. Der chirale Alkohol kann dann in
einer klassisch chemischen SN2-Reaktion unter Inversion des Stereozentrums in das chirale
Amin überführt werden (siehe Abbildung 4.2).
Abbildung 4.2 Aufbau der Biarylethylamin-Einheit in Odanacatib
21
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Eine Methode zur nachhaltigen Synthese chiraler Alkohole aus Ketonen bietet die
Verwendung von Enzymen. Diese arbeiten unter besonders milden Bedingungen, z.B. in
wässrigem Medium bei Raumtemperatur, sehr selektiv (ee-Wert meist >99%). Durch die
Wahl eines geeigneten Enzyms kann selektiv das (R)- oder das (S)-Enantiomer gebildet
werden.
In der Synthesechemie werden Reaktionswege mit möglichst wenigen Teilschritten
bevorzugt. Eine Möglichkeit Teilschritte zu reduzieren bieten Mehrstufen-Eintopfreaktionen
oder Tandemreaktionen (siehe Abbildung 4.3 b) bzw. c)). Der Vorteil solcher MehrschrittEintopfreaktionen liegt in der Steigerung der Prozesseffizienz durch die Vermeidung von
zeitaufwändigen und kostenintensiven Aufarbeitungs- und Reinigungsschritten. Dabei
werden meist organische Lösungsmittel verwendet, die anschließend als Abfallprodukte
anfallen und entsprechend entsorgt werden müssen. Durch die Vermeidung von
Aufarbeitungsschritten und organischen Lösungsmitteln bieten diese Verfahren nicht nur
eine verbesserte Prozessökonomie sondern stellen auch nachhaltige Syntheserouten
dar.[70,71]
Der besondere Fokus in diesem Teilkapitel liegt auf der Kombination von Palladiumkatalysierter Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer Reduktion zur Synthese chiraler
Alkohole in einer Eintopfreaktion. Die Möglichkeit einer Tandemreaktion, in der alle
benötigten Komponenten von Beginn an zugegeben werden und bei der beide Reaktionen
gleichzeitig statt finden ist ein weiterer Aspekt dieses Teilkapitels. Anschließend wird der
chirale Alkohol in einer klassisch chemischen Reaktion, einer SN2-Substitution mit Phthalimid
als Nukleophil, unter Inversion des Stereozentrums, umgesetzt werden.[72] Nach Abspaltung
der Schutzgruppe mittels Hydrazinolyse soll das freie Amin mit möglichst hoher
Enantioselektivität erhalten werden.
22
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.2
Stand der Wissenschaft
4.2.1
Vorstellung der Konzepte Mehrstufen-Eintopfreaktion und
Tandemreaktion
Derartige Mehrstufen-Eintopfverfahren (siehe Abbildung 4.3 b)) zur Kombination von
Palladium-katalysierter
Suzuki-Kupplung
und enzymatischer
Reduktion
sind
bereits
bekannt.[14-16] Dabei werden beide Reaktionen nacheinander durchgeführt, ohne das
Zwischenprodukt
zu
isolieren,
bevor
die
im
zweiten
Reaktionsschritt
benötigten
Komponenten dazugegeben werden. In der Literatur noch nicht beschhrieben ist jedoch die
Kombination
von
Palladium-katalysierter
Suzuki-Kreuzkupplung
und
enzymatischer
Reduktion bei der alle benötigten Komponenten von Anfang an zugegeben werde und beide
Reaktionen parallel ablaufen (siehe Abbildung 4.3 c)). Hier und im Folgenden wird dieser
Reaktionstyp
der
Mehrstufen-Eintopfverfahren
als
Tandemreaktion
bezeichnet.
Im
Gegensatz zur Literatur wird in dieser Arbeit der Begriff der Tandemreaktion ausschließlich
für die in Abbildung 4.3 c) dargestellte Reaktionssequenz verwendet.[73]
Kat A
A
B
a) klassische Mehrstufensynthese
Kat A
A
Kat B
[B]
b) Mehstufen-Eintopfreaktion
C
Kat B
C
Kat A
&
Kat B
A
C
c) Tandemreaktion
Abbildung 4.3 Veranschaulichung des Reaktionskonzepts einer Tandemreaktion
Zur Kombination von Palladium-katalysierter Suzuki-Kreuzkupplung und Biotransformation in
einer Eintopfreaktion, muss die Palladium-katalysierte Reaktion in wässrigem Medium
durchgeführt werden. Möchte man diese beiden Reaktionsschritte sogar in einer
Tandemreaktion kombinieren, so müssen neben dem gemeinsamen Reaktionsmedium
23
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
weitere Kriterien, wie die Kompatibilität der beiden Einzelreaktionen hinsichtlich ihrer
Reaktionstemperatur und des pH-Werts, erfüllt sein. Da die Suzuki-Kupplung bevorzugt in
stark basischem Reaktionsmedium durchgeführt wird, während Alkoholdehydrogenasen im
Allgemeinen ein pH-neutrales wässriges Medium bevorzugen, liegt die besondere
Herausforderung zur Kombination dieser beiden unterschiedlichen Katalysatorsysteme in der
pH-Kompatibilität. Zudem wird die Suzuki-Kupplung in stark basischem, meist organischem
Medium durchgeführt, während Alkoholdehydrogenasen ein wässriges Medium bevorzugen.
Damit muss also in der Suzuki-Kupplung ein Palladium-Katalysator zur Anwendung
kommen, der in Wasser bei nur leicht basischem pH-Wert und möglichst bei
Raumtemperatur
zufriedenstellende
Ergebnisse
liefert.
Gleichzeitig
sollten
diese
Reaktionsbedingungen möglichst wenig negativen Einfluss auf den Biokatalysator ausüben.
4.2.2
Suzuki-Kupplung in wässrigem Reaktionsmedium
Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen kommen weltweit in Forschung und Entwicklung zur
Anwendung, z.B. in der Produktion pharmazeutischer Wirkstoffe, der Herstellung von
Feinchemikalien
und
der
Naturstoffsynthese.
So
stellt
die
Suzuki-Kupplung
z.B.
Schlüsselschritte in der Totalsynthese des antiviralen Bromindol-Alkaloids Dragmacidin F
und des Antitumormittels (+)-Dynemicin A dar.[74,75]
Abbildung 4.4 Naturstoffe Dragmacidin F und Dynemicin A
Bei der Suzuki-Reaktion wird eine Organobor-Verbindung, im Rahmen dieser Arbeit
Phenylboronsäure
(19),
mit
einem
4’-Iodacetophenon (4) umgesetzt.[76]
24
Aryl-,
Alkenyl-,
oder
Alkinylhalogenid,
hier
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Die Reaktion setzt sich aus 3 Teilschritten zusammen (siehe Abbildung 4.5):[76]
1. Oxidative Addition
2. Transmetallierung
3. Reduktive Eliminierung
Im ersten Schritt reagiert das Arylhalogenid mit dem Palladium(0)-Komplex, wobei dieser
zum Palladium(II)-Komplex oxidiert wird (oxidative Addition). Anschließend erfolgt die
Übertragung des organischen Rests R‘ von Bor auf Palladium (Transmetallierung).
Schließlich wird das Kupplungsprodukt R-R‘ abgespalten, wobei der Katalysator unter
Reduktion zum Palladium(0)-Komplex zurückgewonnen wird (reduktive Elimininerung).[76]
Pd(II)
R-R'
Pd(0)L2
R-X
R-Pd(II)L2-X
OH
R' B Base
OH
R-Pd(II)L2-R'
Base-B(OH)2 + X-
Abbildung 4.5 Mechanismus der Suzuki-Kreuzkupplung [76]
Der Katalysezyklus der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung beginnt mit der
oxidativen Addition der Palladium(0)-Spezies (siehe Abbildung 4.5). Tatsächlich muss diese
erst generiert werden. Eingesetzt werden ein Pd(II)-Präkatalysator und ein Ligand der
oxidiert wird während der Präkatalysator reduziert wird.[77] Als Liganden werden
üblicherweise einfache Phosphine wie Triphenylphosphin verwendet.
Im Hinblick auf die Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopf-oder Tandemreaktion, soll die Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium durchgeführt
werden. Wasser stellt nicht nur ein attraktives Lösungsmittel dar, da es günstig, leicht
verfügbar, nicht brennbar und nicht toxisch ist,[15,78,79] darüber hinaus sind alle Enzyme
mit Wasser, dem Lösungsmittel der Natur, kompatibel.[80] Um die Suzuki-Kupplung effizient
in wässrigem Medium durchführen zu können, benötigt man spezielle, wasserlösliche
25
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Katalysatoren. Um einen Katalysator in ein wässriges Medium zu überfüren benötigt man
Liganden mit hydrophilen Substituenten.[79] Sulfonierte Phosphine stellen die am weitesten
verbreiteten Liganden in wasserlöslichen Metallkomplexen dar.[81]
Der wasserlösliche sulfonierte Ligand Tris-(3-sulfonatophenyl)phosphan (TPPTS, 20) kommt
u.a. in der Hydroformylierung von Propen zu Butanal (in Wasser) zur Anwendung. Diese
industriell relevante Anwendung von TPPTS ist auch als Ruhrchemie/Rhône-PoulencProzess bekannt.[82] Unter Verwendung von Tris(3-Sulfonylphenyl)phosphin (TPPTS, 20)
(siehe Abbildung 4.6) und dem Rhodiumkatalysator [Rh(COD)(µ-Cl)]2 wird Propen selektiv
zu n-Butanal umgesetzt.[81,83]
SO3 Na
P
SO3 Na
Na O3S
TPPTS 20
Abbildung 4.6 Tris(3-Sulfonylphenyl)phosphin (TPPTS) 20
Eine weitere Anwendung sulfonierter Phosphine stellt die Palladium-katalysierte SuzukiKreuzkupplung dar. 1990 berichteten Casalnuovo und Calabrese die erfolgreiche Kupplung
von 4‘-Iodtoluol mit Phenylboronsäure (19) in einer Mischung aus Wasser und Acetonitril. Als
Katalysator
nutzten
sie
den
mono-sulfonierten
+
Phosphin-Palladiumkomplex
+
Pd(PPh2)(m-C6H4SO3M)*(H2O)4 (M = Na , K ).[84] Der dreifach sulfonierter Phosphin-Ligand
TPPTS, wurde nicht nur in der Palladium-katalysierten Tsuji-Trost-Reaktion und der
Hydroformylierung in Wasser eingesetzt,[81,83] sondern auch in der Suzuki-Kreuzkupplung.
Die Suzuki-Kupplung wurde zum Einen in einer Mischung aus Wasser und Acetonitril,[85-87]
zum Anderen in Glycerol als Lösungsmittel durchgeführt.[88] Üblicherweise kommen Basen
wie Natriumcarbonat oder eine Amin-Base zum Einsatz. Die dort beschriebenen
Reaktionsbedingungen, insbesondere Acetonitril als Teil des Reaktionsmediums sind nicht
für die Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopfreaktion geeignet. Im Hinblick auf die Eintopfreaktion soll die Suzuki Kreuzkupplung in
einem Reaktionsmedium durchgeführt werden von dem zu erwarten ist, dass es mit der
Biotransformation kompatibel sein würde. Da in der enzymatischen Reduktion Isopropanol
26
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
zur Cofaktorregenerierung eingesetzt wird, wird eine Mischung aus Wasser und Isopropanol
als Reaktionsmedium in der Suzuki-Kupplung bevorzugt.
Abbildung 4.7 Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium bei Raumtemperatur
Bereits während meiner Diplomarbeit habe ich mich mit der Suzuki-Kupplung unter
Verwendung der kommerziell erhältlichen Katalysatorkomponenten Palladiumchlorid und
TPPTS
(20)
beschäftigt.
Dabei
konnte
ich
erste
Erfolge
zur
Synthese
von
4‘-Phenylacetophenon 5 mittels Suzuki-Kreuzkupplung in wässrigem Reaktionsmedium
verbuchen. Besonders erfreulich war, dass die Reaktion bei Raumtemperatur abläuft.[89]
4.2.3
Enzymatische Reduktion
Die Reduktion von Ketonen zu Alkoholen ist eine der gebräuchlichsten und wichtigsten
chemischen Reaktionen. So erhielt Noyori 2001 den Nobelpreis u.a. für die Hydrierung von
Carbonylen mit chiralen Ruthenium-Katalysatoren zur Synthese chiraler Alkohole.
Eine Methode zur nachhaltigen Synthese chiraler Alkohole aus Ketonen bietet die
Verwendung
von
Enzymen.
Diese
Biokatalysatoren
können
in
Form
von
Ganzzellkatalysatoren oder als Rohextrakt eingesetzt werden. Sie sind sehr effiziente
Katalysatoren, die unter milden Reaktionsbedingungen gute Ergebnisse liefern. Ein weiterer
Vorteil von Enzymen liegt in der hohen Selektivität. Dabei reagieren sie nicht nur
chemoselektiv
sondern
auch
regio-
und
diastereoselektiv
und
vor
allem
hoch
enantioselektiv.[90] Sie können hohe Enantiomerenüberschüsse von über 99% liefern. Das
macht sie vor allem für die Pharmaindustrie interessant. So entwickelte Merck einen
alternativen enzymatischen Prozess zur Reduktion von Keton 21 zum entsprechenden
(S)-Alkohol 22, einem Schlüsselintermediat zur Herstellung von Montelukast 23 (Singulair;
siehe Abbildung 4.8).[91]
27
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Abbildung 4.8 Enzymatische Route zur Herstellung von Montelukast 23
Ein Nachteil der Enzyme liegt darin, dass sie häufig teure auf Nicotinamid-basierende
Cofaktoren benötigen. So verbrauchen Alkoholdehydrogenasen (ADHs), die zur Klasse der
Oxidoreduktasen gehören, bei der Reduktion von Ketonen zu Alkoholen NADH bzw.
NADPH, das zu NAD+ bzw. NADP+ umgesetzt wird. Der Einsatz dieser Verbindungen in
stöchiometrischen Mengen wäre viel zu teuer. Nun kann aber der Cofaktor während der
Reaktion regeneriert werden, was seinen Einsatz in katalytischer Menge erlaubt. In der
Literatur sind sowohl enzymatische als auch nicht-enzymatische Ansätze beschrieben.
Letztere
umfassen
chemische
oder
elektrochemische
Methoden
zur
Cofaktor-
Regenerierung.[92] Etablierte enzymatische Prozesse nutzen ein zweites Enzym (Enzymgekoppelte Cofaktorregenerierung) oder ein zweites Substrat (Substrat-gekoppelte CofaktorRegenerierung; siehe Abbildung 4.9). Hierbei wird dem Enzym Isopropanol als zweites
Substrat zur Verfügung gestellt. Während bei der Reduktion des Kupplungsprodukts zum
entsprechenden Alkohol NAD(P)H verbraucht wird und NAD(P)+ gebildet wird, wird
Isopropanol zu Aceton oxidiert, wobei NAD(P)H unter Verbrauch von NAD(P)+ regeneriert
wird.[90] Man benötigt nur ein Enzym, das aber beide Substrate akzeptieren muss. Es
handelt
sich hierbei um
eine Gleichgewichtsreaktion,
deren Gleichgewicht
durch
Verwendung von Isopropanol im Überschuss oder das Entfernen von Aceton aus dem
Reaktionsgemisch auf die Seite des gewünschten Alkohols verschoben werden kann, um
bessere Ausbeuten zu erzielen.[93,94] Darüber hinaus bietet Isopropanol den Vorteil, dass
es
die
Löslichkeit
hydrophober,
mit
4‘-Phenylacetophenon (5) verbessert.[93]
28
Wasser
nicht
mischbarer,
Ketone
wie
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Abbildung 4.9 Substrat-gekoppelte Cofaktorregenerierung
Eine zweite Möglichkeit ist die Enzym-gekoppelte Cofaktor-Regenerierung. Anstelle eines
zweiten Substrats für die Alkoholdehydrogenase (ADH) wird ein zweites Enzym, z.B. eine
Glucosedehydrogenase
(GDH)
oder
eine
Formiatdehydrogenase
(FDH)
zur
Cofaktorregenerierung verwendet.[90] Die GDH verbraucht bei der Oxidation von Glucose,
die im Überschuss eingesetzt wird, NAD(P)+, das dann als NAD(P)H wieder der
Alkoholdehydrogenase zur Reduktion des Ketons zum chiralen Alkohol zur Verfügung steht.
Bei der Hydrolyse vom Glukonolacton zur Glukonsäure handelt es sich um einen
irreversiblen Schritt. Dies führt zu einer Verschiebung des Gleichgewichts auf die Seite des
chiralen Alkohols. Dadurch wird die Rückreaktion unterdrückt und der gewünschte Alkohol
wird in besseren Ausbeuten erhalten.
Alkoholdehydrogenasen können (R)- oder (S)-spezifisch sein, abhängig davon ob das Hydrid
an die si- oder re-Seite des Ketons übertragen wird. Der stereochemische Verlauf ist dabei
vom sterischen Anspruch des Substrats vorgegeben und kann durch ein einfaches Modell,
der so genannten „Prelog´s Regel“, vorhergesagt werden.[90] Während die meisten
Dehydrogenasen wie z.B. die Alkoholdehydrogenasen aus Hefe oder Pferdeleber dieser
Regel folgen, d.h. der Angriff durch H- erfolgt von der re-Seite, wobei der (S)-Alkohol gebildet
wird, bildet die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir anti-Prelog konfigurierte
(R)-Alkohole.[90]
Die ADH aus Lactobacillus kefir gehört ebenso wie die ADH aus Lactobacillus brevis zu den
short-chain Alkoholdehydrogenasen.[95] Sie besitzen eine sehr ähnliche Primärstruktur und
sind
NADPH-abhängige,
(R)-selektive,
homotetramere
short-chain
Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs). Weiterhin weisen sie gemeinsame Motive auf, z.B.
GXXXGXG (G = Glycin) für die Cofaktor-Bindungsstelle.[96]
29
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.2.4
Chemoenzymatische Eintopfreaktionen
Mehrstufen-Eintopfreaktionen stellen ein interessantes Synthesekonzept zur Verbesserung
der Gesamtprozesseffizienz dar indem sie weniger Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte
benötigen. Dadurch werden Zeit, Geld und Ressourcen gespart. Diese Konzepte bieten ein
großes Potential in Bezug auf Nachhaltigkeit.
Obwohl
eine
Reihe
erfolgreicher
Kombinationen
von
chemo-katalytischen
und
biokatalytischen Reaktionen in chemoenzymatischen Eintopfreaktionen in organischem
Reaktionsmedium entwickelt wurden,[97-99] sind analoge Eintopfprozesse in wässrigem
Reaktionsmedium immer noch selten. Chemoenzymatische Eintopfreaktionen beinhalten
meist eine dynamisch-kinetische Racematspaltung, z.B. eines sekundären Alkohols unter
Verwendung einer Lipase und eines Übergangsmetallkomplexes, der zur Racemisierung des
unumgesetzten Alkohols eingesetzt wird.[100]
Da Palladium-katalysierte Kreuzkupplungen im Bereich der Metallkatalyse von ebenso
großem Interesse sind wie enzymatische Reduktionsreaktionen im Bereich der Biokatalyse,
ist die Kombination dieser beiden Reaktionen in einer Eintopfreaktion in Wasser und, mit
dem Langzeitziel einer Tandemreaktion, bei Raumtemperatur von Interesse. Im Jahr 2008
wurde erstmals die Kombination einer Palladium-katalysierten Suzuki Kreuzkupplung mit
einer asymmetrischen Biotransformation in einer Eintopfreaktion beschrieben (siehe
Abbildung 4.10).[14]
Abbildung 4.10 Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopfreaktion
30
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Diese stellt einen großen Erfolg dar; der chirale Biarylalkohol 6 wurde mit einem Umsatz von
91% und mit exzellenten ee-Wert von >99% mittels Eintopfreaktion erhalten. Der erste
Reaktionsschritt, die Suzuki-Kupplung wurde in Wasser durchgeführt. Für den zweiten
Reaktionsschritt, die enzymatische Reduktion, wurde dem Reaktionsmedium 25%
Isopropanol (v/v) hinzugefügt (siehe Abbildung 4.10).[14]
Weitere
Gruppen
arbeiteteten
mit
unterschiedlichen
Schwerpunkten
an
der
chemoenzymatischen Eintopfreaktion zur Synthese chiraler Biaryl-Alkohole.[15,16] Cacchi et
al. zeigten, dass mit DNA-Bindungsprotein stabilisierte Palladium-Nanopartikel als
Katalysator für die Phosphin-freie Palladium-katalysierte Suzuki-Kupplung in diesem
Eintopfprozess geeignet sind.[15] Kroutil und Schmitzer legten besonderen Wert auf das
Reaktionsmedium. Sie verwendeten ein vorteilhaftes Zwei-Phasen-System bestehend aus
einer wässrigen Phase und einer mit Wasser nicht mischbaren Ionischen Flüssigkeit als
Reaktionsmedium in der Eintopfreaktion.[16] Charakteristische Merkmale all dieser
Eintopfprozesse sind die Reaktionssequenz beginnend mit der („biokompatiblen“) SuzukiKreuzkupplung
und
anschließender
Biotransformation
sowie
die
hohen
Reaktionstemperaturen zwischen 70°C und 110°C im ersten Reaktionsschritt.
Wenn man daran interessiert ist beide Reaktionsschritte in einer Tandemreaktion, bei der
beide Reaktionen gleichzeitig ablaufen, zu realisieren muss für die Suzuki-Kreuzkupplung
allerdings eine Methode bei Raumtemperatur in einem Reaktionsmedium entwickelt werden,
das mit der Biotransformation kompatibel ist. Dabei ist neben dem Lösungsmittel an sich
insbesondere der pH-Wert zu betrachten. Während die Suzuki-Kupplung basenkatalysiert
verläuft, bevorzugen ADHs ein neutrales Reaktionsmedium.
4.2.5
Synthese chiraler Amine mittels Substitutionsreaktion
Klassisch chemisch können Alkohole in einer nukleophilen Substitution in chirale Amine
überführt werden. Da es sich bei OH- um eine sehr schlechte Abgangsgruppe handelt, muss
sie zunächst in eine bessere Abgangsgruppe überführt werden.[77] Eine alternative Methode
stellt die Mitsunobu-Reaktion dar, in der der Alkohol zum Elektrophil wird und das Nukleophil
frei gewählt werden kann.
Ortiz-Marciales et al. überführten chirale Hydroxyether in die analogen Aminoether indem sie
die Hydroxyether 24 in einer Mitsunobu-Reaktion mit Phthalimid (25) als Stickstoff-Nukleophil
31
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
umsetzten, wobei diese Reaktion unter Inversion des Stereozentrums verläuft. Anschließend
wurde die Schutzgruppe mit Hydrazin abgespalten und es wurde der freie Aminoether 27 in
62-88% Ausbeute mit ee-Werten von 95 bis >99% erhalten.[72] Phthalimid stellt im
Gegensatz zu Natriumazid nicht nur ein deutlich günstigeres, sondern vor allem ein nicht
toxisches Stickstoff-Nukleophil dar.
Abbildung 4.11 Umsetzung chiraler Hydroxyether zum Aminoether [72]
Streng genommen handelt es sich bei der Mitsunobu-Reaktion um die Veresterung von
Alkoholen mit Dialkyldiazodicarboxylaten und Triphenylphosphin.[76] Ihre Hauptanwendung
besteht in der Umwandlung chiraler sekundärer Alkohole über eine Inversion am
Stereozentrum zu den Estern und weiter zu dem zum Edukt enantiomeren Alkohol. Wählt
man an Stelle des Carboxylats ein anderes Nucleophil, so sind weitere Verbindungsklassen
wie Ether und, wie bereits erwähnt, Amine mittels Mitsunobu-Reaktion zugänglich.[76]
Der Mechanismus der Mitsunobu-Reaktion ist in Abbildung 4.12 dargestellt. Im ersten Schritt
addiert Triphenylphosphin an die schwache N=N-Bindung, wodurch ein Stickstoff-Anion
entsteht, dessen negative Ladung durch eine der Estergruppen stabilisiert wird. Dieses
Anion ist in der Lage den Alkohol zu deprotonieren. Auf Grund der starken Affinität von
Sauerstoff und Phosphor greift das gebildete Alkoxid sofort am positiv geladenen PhosphorAtom an, wobei wiederum ein Stickstoff-Anion entsteht. Dieses deprotoniert das Nukleophil,
das nun als Anion vorliegt. Zuletzt erfolgt der Angriff des Nukleophil-Anions am PhosphinDerivat
des
Alkohols
in
einer
regulären
SN2-Reaktion
am
Kohlenstoffatom
mit
Triphenylphosphinoxid als Abgangsgruppe.[77]
Die Abspaltung des Phthalimids um das freie Amin 7 zu erhalten erfolgt mittels
Hydrazinolyse.
32
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Abbildung 4.12 Mechanismus der Mitsunobu-Reaktion
4.3
Ziel der Arbeit
Ziel der Arbeit ist hier der Aufbau der Biaryl-Amin-Substruktur von Odanacatib (siehe
Abbildung
4.1)
mittels
Kombination
von
Palladiumkatalyse
und
Biokatalyse
zur
enantioselektiven Synthese des chiralen Alkohols 6 und dessen weitere Umsetzung zum
chiralen Amin 7. Dabei liegt der Schwerpunkt auf der Kombination von Palladiumkatalyse
und
Biokatalyse
in
einer
Mehrstufen-Eintopfreaktion
in
wässrigem
Medium
bei
Raumtemperatur mit dem Langzeitziel die beiden Reaktionen in einer Tandemreaktionen zu
kombinieren (siehe Abbildung 4.14).
Der
Vorteil
von
Mehrstufen-Eintopfreaktionen
liegt
in
der
Verbesserung
der
Gesamtprozesseffizienz durch die Vermeidung von Aufarbeitungs- und Reinigungsschritten.
Zur
Kombination
von
Suzuki-Kupplung
und
enzymatischer
Reduktion
in
einer
33
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tandemreaktion analog Abbildung 4.3 c) bzw. Abbildung 4.14 stellen eine besondere
Herausforderung dar.
Abbildung 4.13 Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Eintopfreaktion
Voraussetzung die beiden unterschiedlichen Reaktionstypen in einer Tandemreaktion
kombinieren zu können sind dabei, wie bereits in Abschnitt 4.2 erwähnt, die gleiche
Reaktionstemperatur, dasselbe Reaktionsmedium und derselbe pH-Wert.
Abbildung 4.14 Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer
Tandemreaktion
Mit dem kommerziell erhältlichen Katalysatorkomponenten Palladiumchlorid und TPPTS liegt
bereits ein Katalysatorsystem vor, das die Durchführbarkeit der Suzuki-Kreuzkupplung in
wässrigem Reaktionsmedium erlaubt.[89] Während meiner Diplomarbeit wurde in einem
ersten „proof-of-concept“ bereits die Suzuki-Kreuzkupplung mit Palladiumchlorid und TPPTS
in wässrigem Medium bei Raumtemeperatur gezeigt. Im Detail zu klären waren noch die
Rolle der Base und des pH-Werts. Diese beiden Faktoren spielen eine große Rolle bezüglich
der Kompatibilität von Suzuki-Reaktion und Biotransformation: während die Suzuki-Kopplung
in basischem Medium durchgeführt wird, erfolgt die enzymatische Reduktion von Ketonen in
neutralem bis leicht saurem Medium. Das pH-Optimum der ADHs aus Lactobacillus kefir und
Rhodococcus species für die Reduktion liegt bei pH 7.[101,102] Die Cofaktorregenerierung
34
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
in der enzymatischen Reduktion soll Substrat-gekoppelt mit Isopropanol als Cosubstrat
erfolgen.
Des Weiteren soll insbesondere der Einfluss der Katalysatorkomponenten der SuzukiKopplung – Palladiumchlorid und TPPTS – auf die ADH untersucht werden. So ist bereits
bekannt, dass Triphenylphosphin einen stark inhibierenden Einfluss auf die ADH aus
Rhodococcus sp. hat.[14] Bei 4 mM Konzentration sank die Restaktivität der ADH auf
56%.[14] TPPTS als dessen wasserlösliches Analogon könnte einen ähnlich starken Einfluss
haben.
Anschließend soll der chirale Biaryl-Alkohol 6 in einer Substitutionsreaktion unter Inversion
des Stereozentrums in das entsprechende chirale Biaryl-Amin 7 überführt werden. Dabei soll
die auf der Mitsunobu-Reaktion basierende Methode von Ortiz-Martiales et al. verwendet
werden (siehe Abbildung 4.15).[72]
Abbildung 4.15 Umsetzung des Alkohols 6 zum Amin 7 unter Inversion des Stereozentrums
Der Schwerpunkt dieses Teilkapitels liegt in der Kombination von Suzuki-Kupplung und
enzymatischer Reduktion in einer Eintopfreaktion in wässrigem Medium bei Raumtemperatur
unter Verwendung des wasserlöslichen Katalysatorsystems bestehend aus Palladiumchlorid
und TPPTS (10). Wenn möglich sollen Bedingungen gefunden werden, unter denen beide
Reaktionen gleichzeitig ablaufen, d.h. die Realisierung in einer Tandemreaktion.
35
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4
Ergebnisse und Diskussion
4.4.1
Etablierung der Suzuki-Reaktion in wässrigem Medium unter
Verwendung von PdCl2 und TPPTS
Wie bereits in Abschnitt 4.2.3 erwähnt, soll die Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium, unter
Verwendung von Palladiumchlorid und TPPTS (20) als wasserlösliches Katalysatorsystem
durchgeführt werden. Bereits während meiner Diplomarbeit habe ich mich mit der SuzukiKupplung
in
wässrigem
Medium
unter
Verwendung
dieses
Katalysatorsystems
beschäftigt.[89] Ein Problem stellte dabei die mangelnde Reproduzierbarkeit der Ergebnisse
dar. Deshalb soll zunächst die Suzuki-Kupplung unter Verwendung von Triethylamin als
Base genauer betrachtet werden und wenn nötig, eine Standardabweichung bestimmt
werden.
4.4.1.1
Verwendung von Triethylamin als Base
Im Hinblick auf eine potentielle Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer
Reduktion in einer Tandemreaktion ist darauf zu achten, dass der pH-Wert in der SuzukiKupplung möglichst niedrig ist. Deshalb wurde zunächst die organische Base Triethylamin in
Betracht gezogen. Um den pH-Wert möglichst niedrig zu halten, sollte die Base nicht wie
sonst üblich im Überschuss, sondern nur in äquimolarer Menge eingesetzt werden (siehe
Abbildung 4.16). Als Reaktionsmedium wird eine Mischung aus Isopropanol und Wasser
verwendet, wobei Isopropanol hier nicht nur eine Rolle als Lösungsmittel spielt, sondern, im
Hinblick auf die Tandemreaktion, gleichzeitig als Substrat in der Cofaktorregenerierung dient
(siehe Abbildung 4.9). Die Durchführung der Reaktion erfolgte analog AAV 3, wobei die
Reaktion zur Bestimmung der Schwankungsbreite mehrfach durchgeführt wurde.
Abbildung 4.16 Suzuki-Kupplung bei Raumtemperatur mit Triethylamin als Base
36
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Zunächst wurde die Suzuki-Kupplung bei 86 mM Substratkonzentration in Gegenwart von
25% Isopropanol (v/v) durchgeführt (siehe Tabelle 4.1, Eintrag 1). Dabei wurde im 1H-NMRSpektrum ein produktbezogener Umsatz von 91-94% zum Biarylketon 5 bestimmt. Die
Schwankung von 3% im Umsatz liegt im Bereich der Messungenauigkeit der 1H-NMRSpektroskopie. Der Gesamtumsatz könnte allerdings noch höher sein, wenn durch die
mangelnde Löslichkeit von 4‘-Iodacetophenon 4 und vor allem von 4‘-Phenylacetophenon (5)
in Wasser, nicht ein heterogenes Reaktionsgemisch entstehen würde.
Tabelle 4.1 Mehrfachdurchführung der Suzuki-Kreuzkupplung
Substratkonz.
Reaktionsvolumen
Isopropanolanteil
Umsatz [%]
[mM]
[ml]
(v/v)
niedrigster höchster
1
86
4.5
25
91
94
2
86
4.5
50
92
>95
3
39
10
50
94
>95
Eintrag
Da während der Reaktion die Bildung eines Feststoffs beobachtet wurde und das Produkt 5
nur schlecht wasserlöslich ist, wurde der Isopropanolanteil verdoppelt (siehe Tabelle 4.1,
Eintrag 2). In Gegenwart von 50% Isopropanol (v/v) konnte ein produktbezogener Umsatz
von bis zu >95% erzielt werden. Die verbesserte Substrat- und vor allem Produkt-Löslichkeit
in Gegenwart eines höheren Isopropanolanteils trägt also entscheidend zum Umsatz bei. Die
Schwankung im Umsatz beträgt hier noch 6%-Punkte. Dies liegt im Bereich der
Messungenauigkeit der 1H-NMR-Spektroskopie. Ein produktbezogener Umsatz von stets
>95% ist wünschenswert.
Da keine Erfahrungswerte darüber vorlagen, ob die uns zur Verfügung stehenden
Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir bzw. Rhodococcus species bei weiterer
Erhöhung des Isopropanol-Anteils im Reaktionsmedium auf >50% (v/v) aktiv und stabil
37
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
bleiben würden, wurde nun das Reaktionsvolumen von 4.5 ml auf 10 ml erhöht (siehe
Tabelle 4.1, Eintrag 3). Die Erhöhung des Reaktionsvolumens von 4.5 ml auf 10 ml bedeutet
gleichzeitig eine Erniedrigung der Substrat-Konzentration von 86 mM auf 39 mM. Unter
diesen
Bedingungen
wurden
stets
Umsätze
von
≥94%
erzielt.
Unter
diesen
Reaktionsbedingungen war die Schwankungsbreite in der Suzuki-Kupplung zur Synthese
von 4‘-Phenylacetophenon (5) am geringsten.
4.4.1.2
Verwendung von Natriumcarbonat als Base
Unter Verwendung von 1.0 Äquivalenten Triethylamin als Base zeigte die Suzuki-Kupplung
von 4‘-Iodacetophenon (4) und Phenylboronsäure (19) die geringste Schwankungsbreite,
wenn sie bei 39 mM Substratkonzentration und einem Isopropanol-Anteil von 50% (v/v)
durchgeführt wurde. Diese Reaktionsbedingungen wurden deshalb auch für die SuzukiKupplung unter Verwendung von 2.5 Äquivalenten Natriumcarbonat als Base gewählt (siehe
Abbildung 4.17). Die Durchführung der Reaktion erfolgte analog AAV 4 in einer Mischung
aus dest. Wasser und Isopropanol oder Phosphatpuffer pH 7 und Isopropanol als
Reaktionsmedium.
Abbildung 4.17 Suzuki-Kupplung mit Natriumcarbonat als Base
Unabhängig von der Lösungsmittel-Zusammensetzung wurde stets ein produktbezogener
Umsatz von >95% erzielt. Damit ist das Katalysatorsystem bestehend aus Palladiumchlorid
und TPPTS sehr effizient, wenn als Base Natriumcarbonat verwendet wird. Allerdings liegt
der pH-Wert der Natriumcarbonatlösung mit pH 10 – 11 (siehe Tabelle 4.3) deutlich zu hoch
um anschließend die enzymatische Reduktion ohne eine Adjustierung des pH-Werts
durchzuführen. Positiv hervorzuheben ist, dass gegenüber dem bereits in der Kombination
von Palladiumkatalysierter Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion eingesetzten
Katalysator [Pd(PPh3)2]Cl2,[14] der Vorteil des wasserlöslichen Katalysatorsystems darin
38
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
liegt, dass die Suzuki-Kupplung bei Raumtemperatur abläuft. Die Tatsache, dass nun beide
Reaktionen bei Raumtemperatur effizient ablaufen können, ist der erste Schritt im Hinblick
auf eine Tandemreaktion. Die nächste Voraussetzung dazu wäre ein im Bezug auf den pHWert mit der Biotransformation kompatibles Reaktionsmedium in der Suzuki-Kupplung.
4.4.1.3
Verwendung von Natriumhydrogencarbonat als Base
Die Basen Triethylamin und Natriumcarbonat sind im Hinblick auf eine mögliche
Tandemreaktion ungeeignet, da zum Einen die Kupplung mit Triethylamin nicht stabil genug
(siehe Abschnitt 4.4.1.1) und zum Anderen der pH-Wert von Natriumcarbonat mit pH 10-11
deutlich zu hoch für die ADHs ist. Deshalb sollte getestet werden, ob andere Basen deren
pH-Werte zwischen 8 und 9 liegen geeigneter sind oder ob es evtl. sogar möglich ist die
Reaktion in Puffer ohne Zusatz von Base durchzuführen. Gemäß AAV 5 wurde die Kupplung
von
4‘-Iodacetophenon
(4)
und
Phenylboronsäure
(19)
unter
Verwendung
des
Katalysatorsystems, bestehend aus Palladiumchlorid und TPPTS (20), in Gegenwart
verschiedener Mengen Natriumhydrogencarbonat untersucht (siehe Abbildung 4.18).
Abbildung 4.18 Suzuki-Kupplung in Gegenwart von NaHCO3 als Base
Dabei zeigte sich, dass unter Verwendung von 2.5 Äquivalenten Natriumhydrogencarbonat
ein sehr guter Umsatz von >95% erzielt werden konnte, unabhängig davon, ob als wässriges
Medium Phosphatpuffer oder destilliertes Wasser verwendet wurde. In Gegenwart einer
äquimolaren Menge Natriumhydrogencarbonat lag der Umsatz, nach einer Reaktionszeit von
ebenfalls 24 Stunden, noch bei 76%.
Auf Grund der Schwankungsbreite in der Suzuki-Kupplung unter Verwendung von
Triethylamin als Base (siehe Abschnitt 4.4.1.1), wurden auch hier mehrere Ansätze analog
AAV 5 in Gegenwart von 2.5 Äquivalenten Natriumhydrogencarbonat in dest. Wasser und
39
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Isopropanol im Verhältnis 1 : 1 (v/v)) durchgeführt. Dabei wurde mittels
1
H-NMR-
Spektroskopie stets ein produktbezogener Umsatz von >95% bestimmt (siehe Tabelle 4.2).
Damit erwies sich die Suzuki-Kupplung unter diesen Reaktionsbedingungen als sehr stabil.
Tabelle 4.2 Reproduzierbarkeit der Suzuki-Kupplung mit NaHCO3 als Base
Eintrag
NaHCO3
wässriges Medium
Umsatz [%]
1
2.5 Äquivalente
i-PrOH / dest. Wasser
>95
2
2.5 Äquivalente
i-PrOH / dest. Wasser
>95
3
2.5 Äquivalente
i-PrOH / dest. Wasser
>95
4
2.5 Äquivalente
i-PrOH / dest. Wasser
>95
Der nächste Schritt war die Kombination mit der Biotransformation und die Messung des
pH-Werts mittels pH-Elektrode, um zu untersuchen, ob Natriumhydrogencarbonat langfristig
auch als Base in einer potentiellen Tandemreaktion Anwendung finden könnte. Dafür muss
der pH-Wert in einem Bereich liegen in dem die ADH noch eine ausreichende Aktivität und
Stabilität aufweist.
4.4.1.4
Verwendung von Puffersystemen
Von den bisher getesteten Basen ist Natriumhydrogencarbonat als schwache anorganische
Base im Hinblick auf eine mögliche Tandemreaktion geeignet. Eine weitere Möglichkeit
könnte eine „basenfreie“ Tandemreaktion sein (Verzicht auf Zugabe von Base), wenn die
Suzuki-Kupplung auch in einer Mischung aus Isopropanol und leicht basischem Puffer
stattfindet. Eine ähnliche Methode wurde bereits von Cacchi et al. bei der Verwendung von
Protein-stabilisierten Nanopartikeln als Katalysator in der Suzuki-Kupplung zur Kombination
40
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in einer Eintopfreaktion beschrieben.[15]
Die Kupplung wurde dabei in Tris-Puffer pH 8.9 bei 100°C durchgeführt. Im Folgenden sollen
Kaliumphosphatpuffer
(Kpi)
pH 8
unterschiedlicher
Konzentrationen
als
Teil
des
Reaktionsmediums zur Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) und Phenylboronsäure (19)
getestet werden. Die Durchführung erfolgte analog AAV 6.
Abbildung 4.19 "Basenfreie" Suzuki-Kupplung
Bei Verwendung eines 100 mM Kpi-Puffer pH 8 wurde nach 24 Stunden ein Umsatz von
58% erzielt, während die Suzuki-Kupplung in 200 mM Kpi-Puffer pH 8 nach 24 Stunden
einen Umsatz von 79% lieferte. Die Pufferkonzentration hat also einen Einfluss auf den
Umsatz bzw. den Reaktionsverlauf. Ein Kontrollexperiment (siehe Tabelle 8.7, Eintrag 7), in
dem zusätzlich 2.5 Äquivalente Natriumhydrogencarbonat zugesetzt wurden, lieferte
vollständigen Umsatz. Damit konnte ausgeschlossen werden, dass die Puffersalze (v.a.
Phosphate) die Suzuki-Kupplung limitieren. Niedrigere Umsätze nach 24 Stunden sind eher
auf einen niedrigeren pH-Wert zurückzuführen.
4.4.1.5
Eignung der Basen im Hinblick auf eine Tandemreaktion
In Abschnitt 4.4.1.1 bis 4.4.1.4 wurde hauptsächlich die Eignung der Basen bzw. der daraus
resultierenden Reaktionsbedingungen für die Palladium-katalysierte Suzuki-Kupplung
betrachtet.
Um
die Suzuki-Kupplung
mit
der
enzymatischen
Reduktion
in
einer
Tandemreaktion zu kombinieren, muss ebenso die Kompatibilität der Reaktionsbedingungen
mit der ADH gegeben sein. Einen ersten Hinweis darauf gibt der pH-Wert des
Reaktionsmediums. Er muss in einem Bereich liegen, in dem die ADH noch eine
ausreichende Aktivität und Stabilität aufweist.
41
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Die pH-Wert Messungen erfolgten analog AAV 7. Auf die Zugabe von Isopropanol musste
komplett verzichtet werden, da die zur Verfügung stehende Elektrode (Unitrode von
Metrohm) dafür nicht geeignet war. Die Basen wurden jeweils in den Mengen eingesetzt, in
denen sie auch in der Suzuki-Kupplung und später in der Eintopfreaktion eingesetzt werden
sollen, d.h. es wurden lediglich 1.0 Äquivalente Triethylamin verwendet, während
2.5 Äquivalente Natriumcarbonat bzw. 2.5 Äquivalente Natriumhydrogencarbonat verwendet
wurden. Bezogen auf eine Ansatzgröße von 0.389 mmol in 10 ml wässrigem Medium
entspricht dies einer 39 mM Triethylamin-Konzentration und einer 97 mM Konzentration an
Natriumcarbonat bzw. Natriumhydrogencarbonat. Analog zu den Ansätzen wurden als
wässriges Medium destilliertes Wasser und Phosphatpuffer pH 7 verwendet, wobei
Triethylamin nur in Puffer pH 7 gemessen werden konnte, da in dest. Wasser als
Lösungsmittel
die
Leitfähigkeit
zu
niedrig
war.
Die
Ausgangskonzentration
des
Phosphatpuffers betrug 50 mM. Um eine Verdünnung des Puffers durch Isopropanol zu
simmulieren wurde, wenn möglich, auch der pH-Wert in einer 1 : 1-Mischung (v/v) aus dest.
Wasser und 50 mM Phosphatpuffer bestimmt (Endkonzentration: 25 mM). Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4.3 zusammengefasst.
Tabelle 4.3 Ergebnisse der pH-Wert Messungen
Eintrag
Base
Konzentration
Lösungsmittel
pH-Wert
1
Et3N
39 mM
Puffer pH 7 (50 mM)
10.2
2
Na2CO3
97 mM
Puffer pH 7 (25 mM)
10.4
3
Na2CO3
97 mM
dest. Wasser
11.3
4
NaHCO3
97 mM
dest. Wasser
8.3
5
NaHCO3
97 mM
Puffer pH 7 (25 mM)
7.4
6
NaHCO3
97 mM
Puffer pH 7 (50 mM)
7.2
Es zeigte sich, dass eine 39 mM Triethylamin-Konzentration selbst in 50 mM PhosphatPuffer pH 7 einen pH-Wert von 10.2 aufweist (siehe Tabelle 4.3, Eintrag 1). Damit liegt der
pH-Wert bereits in demselben Bereich wie eine 97 mM Natriumcarbonat-Lösung in 25 mM
Phosphat-Puffer pH 7 (pH 10.4; siehe Tabelle 4.3, Eintrag 2). Erstaunlich ist auch, dass der
25 mM Phosphatpuffer selbst in Gegenwart einer so starken Base wie Natriumcarbonat noch
einen Einfluss auf den pH-Wert hat (vgl. Tabelle 4.3, Einträge 2 und 3). Der pH-Wert einer
42
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
97 mM Natriumcarbonat-Lösung in dest. Wasser beträgt 11.3. Auf Grund der Ergebnisse der
pH-Wert
Messungen
ist
es
nicht
erfolgversprechend
mit
Triethylamin
als
Base
weiterzuarbeiten. Triethylamin und Natriumcarbonat-Lösung geben pH-Werte >10, wobei die
Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit Phenylboronsäure (19) in Gegenwart von
Natriumcarbonat im Überschuss deutlich stabiler verläuft als mit Triethylamin als Base (vgl.
Abschnitt 4.1.1.1 und 4.1.1.2). Für die 97 mM Natriumhydrogencarbonat-Lösung wurde, je
nachdem ob sie in 50 mM Phosphatpuffer pH 7 oder dest. Wasser angesetzt wurde, ein pHWert zwischen 7.2 und 8.3 gemessen (siehe Tabelle 4.3, Einträge 4-6). Während für die in
25 mM Puffer pH 7 angesetzte 97 mM Natriumhydrogencarbonat-Lösung der pH-Wert 7.4
betrug, wurde in 50 mM Puffer ein pH-Wert von 7.2 gemessen. Dies bedeutet, dass ein leicht
basisches Reaktionsmedium im Bereich von pH 7.4 – 8.3 ausreicht um die Suzuki-Kupplung
in wässrigem Medium durchzuführen und dabei quantitativen Umsatz zu erzielen (siehe auch
Tabelle 8.7, Eintrag 1 und Einträge 3-6). Zudem ist zu erwarten ist, dass die ADHs in diesem
Bereich aktiv und stabil sind. Das pH-Optimum der ADHs aus Lactobacillus kefir und
Rhodococcus species für die Reduktion liegt bei pH 7.[101,102] Das pH-Optimum beider
ADHs für die Oxidation liegt bei pH 8.0.[102,103] Damit ist bei pH 8 die Oxidation des
Alkohols stärker begünstigt. Durch den Einsatz von Isopropanol im Überschuss kann das
Gleichgewicht dennoch auf die Seite des Alkohols verschoben werden.[93]
Bevor aber an die Tandemreaktion gedacht werden kann, soll die Kombination von SuzukiKupplung mit nachgeschalteter Biotransformation in einer Eintopfreaktion erfolgen. Auf
Grund des niedrigen pH-Werts (~pH 8) ist vorstellbar, dass es gar nicht nötig ist nach der
Suzuki-Kupplung den pH-Wert auf pH 7 einzustellen. Dies wäre ein erster Schritt in Richtung
Tandemreaktion. Diesbezüglich soll untersucht werden, ob das Enzym in diesem Bereich
noch aktiv ist und wenn ja, wie stark das Enzym inhibiert wird (siehe Abschnitt 4.4.3.2).
Darüber
hinaus
muss
für
eine
Tandemreaktion
auch
die
Kupplung
von
1-(4-Iodphenyl)ethanol (29) mit Phenylboronsäure (19) untersucht werden.
4.4.1.6
Variation der Kupplungspartner
Im Hinblick auf eine Tandemreaktion gibt es zwei Möglichkeiten um ausgehend von
4‘-Iodacetophenon (4) zum chiralen Zielprodukt 6 zu gelangen (siehe Abbildung 4.20):
a) erst Suzuki-Kupplung und anschließend enzymatische Reduktion (Weg A)
b) erst enzymatische Reduktion und anschließend Suzuki-Kupplung (Weg B)
43
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Welcher Weg bevorzugt wird, hängt von den relativen Geschwindigkeiten im ersten Schritt
der Wege A und B ab.
A
B
A
B
Abbildung 4.20 Verschiedene Sequenzen zum Zielprodukt 6
Bisher wurde, sowohl in der Literatur als auch in dieser Arbeit lediglich der Weg A
untersucht.[14-16] Nun soll auch der Weg B untersucht werden. Zunächst wird hierfür die
Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) mit Phenylboronsäure (19) genauer
betrachtet (siehe Tabelle 4.4). Die enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (4) wurde
in unserem Arbeitskreis bereits beschrieben.[104,105] Dabei konnte das Zielprodukt 29 mit
einem Umsatz von >95% und exzellenter Enantioselektivität von >99% ee synthetisiert
werden.
Die Durchführung der Suzuki-Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) mit
Phenylboronsäure (19) erfolgte analog AAV 5 unter Variation der Zusammensetzung des
wässrigen Mediums und der Reaktionszeit. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.4
zusammengefasst. Das Substrat rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) wurde zuvor analog
AAV 8
ausgehend
von
4‘-Iodacetophenon
(4)
mittels
Natriumborhydrid-Reduktion
synthetisiert. Das Produkt wurde dabei mit einem Umsatz von >95% erhalten. Nach
44
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
säulenchromatographischer Reinigung wurde das saubere Produkt mit 89% Ausbeute als
Racemat erhalten (siehe Abschnitt 8.2.2.6.1).
Tabelle 4.4 Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) mit Phenylboronsäure (19)
Eintrag
Wässriges Medium
Zeit [h]
Umsatz [%]
1
i-PrOH / dest. Wasser
24
76
2
i-PrOH / Puffer pH 7
24
77
3
i-PrOH / dest. Wasser
64
83
4
i-PrOH / Puffer pH 7
64
81
Es zeigte sich, dass die Suzuki-Kupplung des Alkohols rac-29 mit Phenylboronsäure (19)
schlechter verläuft als die Kupplung des korrespondierenden Ketons 4 mit Phenylboronsäure
(19) (76 und 77% Umsatz gegenüber >95% nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden; siehe
Tabelle 4.4, Eintrag 1 und 2). Eine Verlängerung der Reaktionslaufzeit brachte lediglich eine
minimale Erhöhung des Umsatzes. Ein Umsatz von 83% stellt ein gutes Ergebnis dar (siehe
Tabelle 4.4, Eintrag 3).
Oft stellt die oxidative Addition den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der SuzukiKupplung dar. Die relative Reaktivität nimmt dabei in der Reihenfolge I > OTf > Br >> Cl ab.
Arylhalogenide, die durch elektronenziehende Substituenten aktiviert werden, sind reaktiver
in Bezug auf die oxidative Addition.[106] Im Hinblick auf die bisher in der Suzuki-Kupplung
mit Phenylboronsäure (19) eingesetzten Arylhalogenide 4‘-Iodacetophenon (4) und
1-(4-Iodphenyl)ethanol (29) bedeutet dies, dass es sich bei 4‘-Iodacetophenon (4) auf Grund
der elektronenziehenden Carbonylgruppe um ein aktiviertes Arylhalogenid handelt. Beim
Alkohol 29 handelt es sich dagegen um ein unaktiviertes Arylhalogenid. Dieser
Substituenten-Einfluss erklärt, weshalb die Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit
Phenylboronsäure (19) schneller verläuft als die Suzuki-Kupplung von 1-(4-Iodphenyl)-
45
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
ethanol (29) mit Phenylboronsäure (19). Unter ansonsten identischen Reaktionsbedingungen
wurde im ersten Fall nach 24 Stunden vollständiger Umsatz erzielt, während im zweiten Fall
nur 77% Umsatz erzielt wurden (siehe Tabelle 4.4, Eintrag 2).
Es ist literaturbekannt, dass Phenylboronsäure (19) einen inhibierenden Einfluss auf die
Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus species hat.[14] Es besteht die Möglichkeit in der
Suzuki-Kupplung die freie Boronsäure durch einen Boronsäureester zu ersetzen.[107] Der
Phenylboronsäurepinakolester (30) ist ebenso wie die Phenylboronsäure (19) kommerziell
erhältlich.
Die
Durchführung
der
Suzuki-Kupplung
in
Gegenwart
von
Natriumhydrogencarbonat unter Substitution von Boronsäure 19 durch den Pinakolester 30
erfolgte analog AAV 9. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.5 zusammengefasst.
Tabelle 4.5 Verwendung von Phenylboronsäurepinakolester (30) als Kupplungspartner
Eintrag
Wässriges Medium
Arylhalogenid
Umsatz [%]
1
i-PrOH / dest. Wasser
4
93
2
i-PrOH / Puffer pH 7
rac-29
54
3
i-PrOH / dest. Wasser
rac-29
73
Es wurde bereits gezeigt, dass die Kupplung des Alkohols rac-29 mit Phenylboronsäure (19)
weniger effizient verläuft als die Kupplung des Ketons 4 mit Phenylboronsäure (19) (rund
76% Umsatz gegenüber >95% Umsatz nach 24 Stunden). Ähnliches wurde auch für die
Kupplung mit dem Phenylboronsäurepinakolester (30) beobachtet (Tabelle 4.5). Vergleicht
man die für die Kupplung in dest. Wasser und Isopropanol erzielten Umsätze des Alkohols
rac-29 und des Ketons 4 mit dem Boronsäureester 30, so liegen diese Werte mit 73 und 93%
unter den in der Kupplung des Alkohols rac-29 und des Ketons 4 mit der Phenylboronsäure
(19) erzielten Umsätzen von rund 76 bzw. >95% (vgl. Tabelle 4.4, Einträge 1 und 2; Tabelle
46
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.5, Einträge 1 und 3). Wurde die Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol rac-29 mit dem
Phenylboronsäurepinakolester (30) in Isopropanol und Puffer pH 7 durchgeführt, so lag der
erzielte Umsatz von 54% Umsatz deutlich unter dem in Isopropanol und dest. Wasser
erzielten Umsatz von 73% und damit auch deutlich unter dem Umsatz der Kupplung von
rac-29 mit der Phenylboronsäure (19) in Isopropanol und Puffer pH 7 (77% Umsatz; siehe
Tabelle 4.4, Eintrag 2).
Obwohl mit dem Phenylboronsäurepinakolester (30) etwas niedrigere Umsätze erzielt
wurden, könnte dies im Hinblick auf eine Tandemreaktion (in dest. Wasser und Isopropanol
als Lösungsmittel) von Nutzen sein, falls die ADH durch den Boronsäureesters 30 weniger
stark inibiert wird als durch die Phenylboronsäure (19). Hierzu sind weitere Informationen
notwendig. Es ist wichtig zu wissen, ob der Boronsäureester 30 unter Reaktionsbedingungen
hydrolysiert und ob seine inhibierende Wirkung auf das Enzym tatsächlich geringer ist, als
die der Phenylboronsäure (19). Letzteres soll in Photometertests untersucht werden (siehe
Abschnitt 4.4.3).
Eine weitere Möglichkeit das Keton 5 über eine Suzuki-Kupplung herzustellen stellt die
Suzuki-Kupplung von 4‘-Acetylphenylboronsäure (31) mit Halogenbenzol 32 dar (siehe
Abbildung 4.21).
Abbildung 4.21 alternativer Syntheseweg von 5 mittels Suzuki-Kupplung
Aus Zeitgründen wurde dieser Weg nicht eingehend untersucht. Im Hinblick auf eine
mögliche Tandemreaktion wäre es interessant zu wissen, ob die im Rahmen dieser Arbeit
zur Verfügung stehenden ADHs 4‘-Acetylphenylboronsäure (31) als Substrat akzeptieren.
Diese Untersuchung erfolgt mittels Photometertest (siehe Abschnitt 4.4.2).
47
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.2
Photometertest zur Bestimmung der Enzymaktivität
Bevor präparative Ansätze zur enzymatischen Reduktion der Ketone durchgeführt werden
können, muss die Aktivität der Enzyme bestimmt werden. Die volumetrische Aktivität [U/ml]
wird über den Verbrauch an Cofaktor NAD(P)H bestimmt. Dieser wird während der
Reduktion verbraucht und zu NAD(P)+ oxidiert (siehe Abbildung 4.22).
Abbildung 4.22 Photometertest zur Aktivitätsbestimmung der ADHs
Der Verbrauch an NAD(P)H wird im Photometer bei 340 nm, dem Absorptionsmaximum des
Cofaktors, beobachtet. Die Extinktionsabnahme wird über einen Zeitraum von 10 Minuten
beobachtet. Nach folgender Formel kann dann die volumetrische Enzymaktivität [U/ml]
berechnet werden:
=
∆
340 nm
∙
∙
∙
∙ ∙
Abbildung 4.23 Formel zur Bestimmung der volumetrischen Enzymaktivität
Diese Messungen werden mit jeder neuen Enzymcharge durchgeführt. Bei Lagerung einer
Enzymcharge über einen längeren Zeitraum wird vor dem Einsatz in präparativen
Biokatalysen überprüft, ob das Enzym an Aktivität verloren hat. In diesen Fällen wird die
Enzymmenge an die neue Aktivität angepasst.
4.4.2.1
Photometertest mit ADH aus Rhodococcus sp. (Rohextrakt)
Zunächst wird die Aktivität der Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus sp., die vom
Arbeitskreis von Prof. Hummel zur Verfügung gestellt wurde, getestet. Die Durchführung
erfolgt analog AAV 10. Als Referenzverbindung wird 4‘-Chloracetophenon (34) verwendet,
dessen relative Aktivität auf 100% festgesetzt wird. In Tabelle 4.6 sind exemplarisch die
48
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
relativen Aktivitäten einer Enzymcharge ADH aus Rhodococcus species für verschiedene
para-substituierte Acetophenone dargestellt.
Tabelle 4.6 Aktivität der ADH aus Rhodococcus sp. für unterschiedlich substituierte
Acetophenone
a)
Eintrag a)
Keton
Relative Aktivität [%]
1
4‘-Chloracetophenon (34)
100
2
4‘-Iodacetophenon (4)
106
3
4‘-Phenylacetophenon (5)
97
4
4‘-Acetylphenylboronsäure (31)
8
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), d = 1 cm, VP = 0.02 ml, f = 11
Die Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus species weist für die Referenzverbindung
4‘-Chloracetophenon (34) je nach Enzymcharge eine Aktivität zwischen 34 und 90 U/ml auf.
4‘-Iodacetophenon (4), das Edukt in der Eintopf- oder Tandemreaktion wird mit einer
relativen Aktivität von 106% ähnlich gut akzeptiert wie die Referenzverbindung.
4‘-Phenylacetophenon
(5),
das
Kupplungsprodukt
von
4‘-Iodacetophenon
(4)
und
Phenylboronsäure (19), wird mit einer relativen Aktivität von 97% meist etwas schlechter
akzeptiert. 4‘-Acetylphenylboronsäure (31), ein alternatives Substrat in der Suzuki-Kupplung
zur Synthese des Biarylketons 5 (siehe Abbildung 4.21), wird im Vergleich zu
4‘-Phenylacetophenon (5) so gut wie gar nicht akzeptiert (relative Aktivität <10%; siehe
Tabelle 4.6, Eintrag 4). Damit ist zu erwarten, dass eine Tandemreaktion ausgehend von
4‘-Acetylphenylboronsäure (31) und Halogenbenzol (32) vorwiegend über die SuzukiKupplung
mit
anschließender
Biotransformation
verläuft
(analog
Reaktionsweg
B,
Abbildung 4.20).
Die (S)-selektive ADH aus Rhodococcus species weist für die Ketone 4 und 5 ähnliche
Aktivität auf. D.h. dass der in der Tandemreaktion bevorzugte Reaktionsweg ausgehend von
49
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4‘-Iodacetophenon (4) und Phenylboronsäure davon abhängt, ob die Reduktion oder SuzukiKupplung von Keton 4 schneller abläuft. Würde vorwiegend 4‘-Iodacetophenon (4) zu
(S)-1-(4-Iodphenyl)ethanol ((S)-29) reduziert werden (Weg B in Abbildung 4.20), so ist der
maximal erzielbare Umsatz in der Eintopfreaktion durch die Kupplung des Alkohols (S)-29
mit Phenylboronsäure (19) auf 83% limitiert (vergleiche Tabelle 4.4, Eintrag 1).
Allgemein zeigen die verschiedenen Chargen der ADH aus Rhodococcus species für
4‘-Phenylacetophenon (5) eine Aktivität, die gut geeignet ist, um damit die Biotransformation
durchzuführen.
4.4.2.2
Photometertest mit ADH aus Lactobacillus kefir (Rohextrakt)
Des Weiteren wurde vom Arbeitskreis von Prof. Hummel aus Jülich eine (R)-selektive
Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (L. kefir) zur Verfügung gestelltt. Die
Aktivitätsbestimmung erfolgte analog AAV 10. Als Referenzverbindung wird Acetophenon
(33) verwendet, dessen relative Aktivität auf 100% festgesetzt wird. In Tabelle 4.7 sind
exemplarisch die relativen Aktivitäten einer Enzymcharge für verschiedene para-substituierte
Acetophenone dargestellt.
Tabelle 4.7 Aktivität der ADH aus L. kefir für unterschiedlich substituierte Acetophenone
a)
50
Eintrag a)
Substrat
Relative Aktivität [%]
1
Acetophenon (33)
100
2
4‘-Iodacetophenon (4)
79
3
4‘-Phenylacetophenon (5)
7
4
4‘-Acetylphenylboronsäure (31)
37
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), d = 1 cm, VP = 0.02 ml; f = 200
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Die volumetrische Aktivität der ADH aus L. kefir ist mit Werten zwischen 1032 und 1453 U/ml
(sieheTabelle 8.12) für die Referenzverbindung Acetophenon (33) sehr hoch. Zudem zeigte
sich, dass die (R)-selektive ADH aus Rhodococcus species und die (S)-selektive ADH aus
ADH aus L. kefir ein unterschiedliches Substratspektrum aufweisen. Während die ADH aus
Rhodococcus species 4‘-Iodacetophenon (4) und 4‘-Phenylacetophenon (5) ähnlich gut
akzeptiert, weist die ADH aus ADH aus L. kefir für 4‘-Phenylacetophenon (5) mit 7% relativer
Aktivität bezüglich der Referenzverbindung 33 eine deutlich niedrigere Aktivität als für
4‘-Iodacetophenon (4) auf (79% Aktivität relativ zur Referenz 33). Hingegen wird
4‘-Acetylphenylboronsäure (31) mit 37% relativer Aktivität bezogen auf Referenzverbindung
33 von der ADH aus L. kefir deutlich besser akzeptiert als 4‘-Phenylacetophenon (5) mit 7%
relativer Aktivität bezogen auf Acetophenon (33). Die Aktivität für 4‘-Acetylphenylboronsäure
(31) gegenüber der für 4‘-Iodacetophenon (4) ist dennoch deutlich schlechter.
Allgemein zeigt die ADH aus Lactobacillus kefir für 4‘-Phenylacetophenon (5) und
4‘-Iodacetophenon (4) eine Aktivität die gut geeignet ist um damit die Biotransformation
durchzuführen.
4.4.3
Untersuchung potentiell inhibierender Faktoren aus der
Palladiumkatalyse im Hinblick auf eine Eintopf- oder
Tandemreaktion
Aus der Literatur ist bekannt, dass verschiedene Komponenten aus der Suzuki-Kupplung
einen negativen Effekt auf die Aktivität der Alkoholdehydrogenase haben. Insbesondere
Phenylboronsäure (19) und Triphenylphosphin zeigten eine deutliche Inhibierung der ADH
aus Rhodococcus species.[14] Des Weiteren wird die Suzuki-Kupplung in basischem
Medium durchgeführt. In den bisher untersuchten Methoden zur Kombination von SuzukiKupplung und enzymatischer Reduktion in wässrigem Medium wurde deshalb vor
Enzymzugabe der pH-Wert adjustiert und die enzymatische Reduktion bei pH 7
durchgeführt.[14,15] Im Hinblick auf die geplante Kombination von Suzuki-Kupplung und
enzymatischer Reduktion in einer Tandemreaktion ist dies nicht möglich. Deshalb soll mittels
Photometertest auch die Aktivität der ADHs in Abhängigkeit vom pH-Wert untersucht
werden.
51
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.3.1
Photometertests mit ADH aus Rhodococcus sp. zur Untersuchung
inhibierender Faktoren aus der Palladiumkatalyse
Analog einer in der Literatur beschriebenen Methode wird der Einfluss verschiedener
Komponenten aus der Palladiumkatalyse auf die ADH aus Rhodococcus species
untersucht.[14] Die Messungen wurden nicht nur in 50 mM Phosphatpuffer pH 7
durchgeführt werden sondern auch in einer 1 : 1-Mischung (v/v) von Puffer und dest. Wasser
(25 mM Salzkonzentration) um den Verdünnungseffekt von 50% Isopropanol (v/v) als
Lösungsmittel und Cosubstrat in der enzymatischen Reduktion zu simulieren. Auf den Zusatz
von Isopropanol muss im Photometertest verzichtet werden, da die ADH in Gegenwart von
Isopropanol NAD+ zu NADH reduziert. Dies stört den Photometertest, in dem der Verbrauch
an NADH beobachtet wird. Man würde eine Inhibierung der ADH messen, obwohl lediglich
der Cofator NADH unter Oxidation von Isopropanol zu Aceton regeneriert wird (vergleiche
Abbildung 4.9).
Die Durchführung der Photometertests erfolgte analog AAV 11. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 4.25, Abbildung 4.26, Abbildung 4.27 und Abbildung 4.28 graphisch
dargestellt. Eine Untersuchung der aus Palladiumchlorid und TPPTS hergestellten
katalytisch aktiven Spezies war auf Grund ihrer starken Absorption bei 340 nm im
Photometer nicht möglich. Die beiden Komponenten wurden deshalb separat auf eine
Inhibierung der ADH getestet.
Abbildung 4.24 Einfluss verschiedener Additive auf die Aktivität der ADH aus
Rhodococcus sp.
Eine 2 mM Konzentration an TPPTS bzw. eine 1.5 mM Konzentration an Palladiumchlorid
entspricht dabei den Katalysatorkonzentrationen in einem Ansatz zur Kupplung von
4‘-Iodacetopenon (4) mit Phenylboronsäure (19) bei 39 mM Substratkonzentration. Es zeigte
sich, dass der Einfluss der Katalysatorkomponenten auf die Aktivität der ADH aus
Rhodococcus sp. bei den getesteten Konzentrationen vernachlässigbar ist (siehe Abbildung
4.25 und Abbildung 4.26).
52
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
Konzentration [mM]
pH 7 (50 mM)
pH 7 (25 mM)
Abbildung 4.25 Einfluss von TPPTS auf die ADH aus Rhodococcus sp.
Aus der Literatur ist bekannt, dass Triphenylphosphin einen stark inhibierenden Effekt auf die
Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus species ausübt.[14] Bereits in Gegenwart von
4 mM Triphenylphosphin verlor die ADH knapp 50% ihrer Aktivität. Umso bemerkenswerter
ist es, dass das wasserlösliche TPPTS (20) bei einer Konzentration bis 4 mM, keinen
signifikanten Einfluss auf die Enzymaktivität zeigt.
reletive Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Konzentration [mM]
pH 7 (50 mM)
pH 7 (25 mM)
Abbildung 4.26 Einfluss von Palladiumchlorid auf die ADH aus Rhodococcus sp.
53
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Konzentration [mM]
pH 7 (50 mM)
pH 7 (25 mM)
Abbildung 4.27 Einfluss von Phenylboronsäure auf die ADH aus Rhodococcus sp.
Phenylboronsäure zeigte, wie zu erwarten war, einen starken Einfluss auf die ADH aus
Rhodococcus species. Dabei ist der Einfluss leicht von der Pufferkonzentration abhängig,
wobei Abweichungen von rund 20% durchaus im Rahmen der Messungenauigkeit des
Photometertests liegen.
Eine Möglichkeit, den stark inhibierenden Einfluss der Phenylboronsäure (19) auf die
Aktivität der Alkoholdehydrogenase zu minimieren, ist die Substitution der Boronsäure 19
durch
einen
Phenylboronsäureester,
z.B.
den
kommerziell
erhältlichen
Phenylboronsäurepinakolester (30). Seine Anwendungsmöglichkeit in der Suzuki-Kupplung
wurde bereits in Abschnitt 4.4.1.6 beschrieben. Nun wurde mittels Photometertest auch sein
Einfluss auf die Enzymaktivität getestet. Das Ergebnis ist in Abbildung 4.28 graphisch
dargestellt. Es zeigte sich, dass die Ergebnisse für die Inhibierung der ADH aus
Rhodococcus sp. in Gegenwart des Phenylboronsäurepinakolesters (30) stark variieren, in
Abhängigkeit davon, ob als Lösungsmittel nur Puffer pH 7 (50 mM) oder eine 1 : 1 Mischung
(v/v) von dest. Wasser und Puffer pH 7 (entspricht 25 mM Puffer pH 7) verwendet wurde.
Diese Beobachtung ist unerwartet. Während der Pinakolester 30 in 25 mM Puffer pH 7 im
Vergleich zur Boronsäure 19 die ADH aus Rhodococcus sp. nur leicht inhibiert, zeigt die
ADH
in
50 mM
Phosphatpuffer
Phenylboronsäurepinakolesters
(30).
eine
In
deutliche
50 mM
Inhibierung
Phosphatpuffer
in
Gegenwart
pH 7
ähnelt
des
der
Kurvenverlauf sehr stark dem Verlauf in Gegenwart von Phenylboronsäure (19) als Additiv.
54
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
Konzentration [mM]
pH 7 (50 mM)
pH 7 (25 mM)
Abbildung 4.28 Einfluss des Boronsäurepinakolesters auf die ADH aus Rhodococcus sp.
Eine denkbare Ursache dafür ist, dass der Pinakolester 30 gespalten wird. Je nach pH-Wert
dürfte die Spaltung langsamer oder schneller verlaufen. Je schneller der Ester gespalten
wird, umso mehr liegt die freie Phenylboronsäure vor, deren negativer Einfluss auf die ADH
bereits
bekannt
ist.[14]
Jedoch
werden
Boronsäureester
üblicherweise
mit
Wasserstoffperoxid und Essigsäure gespalten.[107]
Ob der Pinakolester der Phenylboronsäure tatsächlich geeigneter ist als die freie Säure, ist
schwer vorauszusagen. Dies muss später präparativ getestet werden. In diesem
Zusammenhang empfiehlt es sich zu untersuchen, ob eine Spaltung des Boronsäureesters
30 unter Reaktionsbedingungen auch über einen längeren Zeitraum ausgeschlossen werden
kann. Alternativ stehen noch weitere kommerziell erhältliche Ester der Phenylboronsäure zur
Verfügung.
4.4.3.2
Photometertests mit ADH aus Lactobacillus kefir zur Untersuchung der
Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert
Im Hinblick auf eine Tandemreaktion oder eine Eintopfreaktion, bei der nach der Palladiumkatalysierten Suzuki-Kreuzkupplung nicht mehr der pH-Wert adjustiert werden soll, muss die
in der enzymatischen Reduktion einzusetzende Enzymmenge an die Reaktionsbedingungen,
v.a. im Bezug auf den pH-Wert, angepasst werden. Dazu wird die Enzymaktivität der ADH
aus L. kefir in verschiedenen Medien und bei unterschiedlichen pH-Werten bestimmt, um
55
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
anschließend die Enzymmenge in der enzymatischen Reduktion bzw. der Eintopfreaktion
anzupassen und den Aktivitätsverlust der ADH bei höheren pH-Werten auszugleichen. Die
Aktivitätsbestimmung erfolgt analog AAV 12 über die Verfolgung der Extinktionsabnahme
des Cofaktors (NADPH). Auf Grund der schlechten Löslichkeit von 4‘-Phenylacetophenon (5)
in Wasser, werden diese Messungen mit der Referenzsubstanz Acetophenon (33) als
Substrat durchgeführt, um den Fehler möglichst gering zu halten. Die Ergebnisse für die
pH-Abhängigkeit des Rohextrakts sind exemplarisch für eine Enzymcharge in Tabelle 4.8
zusammengefasst.
Tabelle 4.8 Aktivität der ADH aus L. kefir (Rohextrakt) in Abhängigkeit vom pH-Wert
a)
Eintrag a)
wässriges Medium
Relative Aktivität [%]
1
Puffer pH 7 (50 mM)
100
2
Puffer pH 8 (200 mM)
47
3
NaHCO3 pH 8.3 (97 mM)
32
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.02 ml, d = 1 cm, f = 200
Die ADH aus L. kefir (Rohextrakt) zeigt, verglichen mit der Restaktivität von 47% in
Phosphatpuffer pH 8, noch einmal eine um etwa ein Drittel niedrigere Aktivität in
Natriumhydrogencarbonatlösung pH 8.3 (siehe Tabelle 4.3, Eintrag 4). Dennoch kann man,
bei einer Restaktivität von 32% bei pH 8.3 gegenüber pH 7 (100% relative Aktivität) noch
präparative
Anwendungen
durchführen,
wobei
dann
in
der
Eintopfreaktion
das
Enzymvolumen an die Aktivität bei entsprechendem pH-Wert angepasst werden muss.
4.4.4
Enzymatische Reduktion
Nach der Bestimmung der Enzymaktivität folgt nun die Durchführung der Biotransformation.
Die Regenerierung des Cofaktors NAD(P)H erfolgt in situ unter Oxidation von Isopropanol zu
56
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Aceton (Substrat-gekoppelte Cofaktorregenerierung; siehe Abbildung 4.29), wobei der
Cofaktor in seiner oxidierten Form NAD(P)+ eingesetzt wird. Er wird durch das im
Überschuss eingesetzte Isopropanol zu NADP(H) reduziert, welches dann unter Oxidation
zur
Reduktion
des
eingesetzten
Ketons
genutzt
wird.
Die
Substrat-gekoppelte
Cofaktorregenerierung mit Isopropanol eignet sich besonders gut zur Cofaktorregenerierung
nur schwer wasserlöslicher Ketone wie dem 4‘-Phenylacetophenon (5), da Isopropanol die
Löslichkeit hydrophober Ketone verbessert.[93]
Abbildung 4.29 Enzymatische Reduktion unter Substrat-gekoppelter Cofaktorregenerierung
Die enzymatische Reduktion wurde in einem Gesamtvolumen von 10 ml mit einem
Isopropanol-Anteil von 25-50% (v/v) durchgeführt. Der erhöhte Isopropanol-Anteil von
50% (v/v) führte bei der Suzuki-Kupplung zu einer besseren Reproduzierbarkeit auf Grund
verbesserter Substrat-Löslichkeit (siehe Abschnitt 4.4.1.1). In der Literatur wurde bereits die
enzymatische Reduktion in Gegenwart eines Isopropanol-Anteils von bis zu 80% (v/v)
beschrieben.[108] Dementsprechend sind bei einem Isopropanol-Anteil von 50% (v/v) noch
keine Stabilitätsprobleme zu erwarten.
4.4.4.1
Enzymatische Reduktion mit ADH aus Rhodococcus sp.
Die enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (5) unter Verwendung der ADH aus
Rhodococcus sp. (Rohextrakt) soll in wässrigem Medium (Puffer pH 7) mit einem
Isopropanolanteil von 50% (v/v) durchgeführt werden. Um die Ergebnisse mit der bisherigen,
bei uns im Arbeitskreis entwickelten Methode vergleichen zu können, wurde ein zusätzliches
Experiment in Gegenwart von 25% Isopropanol (v/v) durchgeführt. Die Durchführung erfolgte
analog AAV 13. Die Ergebnisse für eine Enzymcharge sind in Tabelle 4.9 dargestellt.
57
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tabelle 4.9 Enzymatische Umsetzungen von 5 mit der ADH aus Rhodococcus sp.
a)
Eintrag a)
Wässriges Medium
i-PrOH-Anteil (v/v)
Umsatz [%]
ee-Wert [%]
1
i-PrOH / pH 7
25%
77
>99
2
i-PrOH / pH 7
50%
>95
>99
ADH aus Rhodococcus species, Charge 1
Die enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (5) unter Verwendung von
64 U/mmol ADH aus Rhodococcus sp. (Aktivität bezogen auf 5) verlief in Gegenwart von
50% Isopropanol (v/v) stets vollständig. Wenn die Reaktion mit derselben Enzymmenge aus
derselben Charge in Gegenwart von 25% Isopropanol (v/v) durchgeführt wurde, so wurde
lediglich ein Umsatz von 77% erzielt (siehe Tabelle 4.9, Eintrag 1). Im Vergleich zu der
bisher bei uns im Arbeitskreis etablierten Methode, bei der in Gegenwart von 25%
Isopropanol (v/v)) 184 U/mmol zur enzymatischen Reduktion von 5 mit ADH aus
Rhodococcus species eingesetzt wurden, stellt dies eine Reduktion der Katalysatormenge
um fast die Hälfte dar.[14]
Ein Nachteil der Substrat-gekoppelten Cofaktorregenerierung liegt darin, dass es keinen
irreversiblen Schritt gibt. Sowohl die Reduktion des Ketons 5, als auch die Oxidation von
Isopropanol sind reversibel, wodurch sich ein Gleichgewicht einstellt.[93] Dieses kann durch
Entfernen von Aceton aus dem Reaktionsgemisch oder durch einen Überschuss an
Isopropanol auf die Seite des Ziel-Produkts verschoben werden.[93,109,110] Ein
Überschuss von 25% Isopropanol (v/v) reicht nicht aus, um unter Verwendung von jeweils
64 U/mmol ADH aus Rhodococcus sp., einen vollständigen Umsatz zu erreichen. Bei
Verwendung
eines
Überschusses
von
50%
Isopropanol
(v/v),
wird
das
Reaktionsgleichgewicht vollständig in Richtung des Produkts (S)-6 verschoben (siehe
Tabelle 4.9, Eintrag 2). Dadurch wird weniger Katalysator benötigt, ohne Einbußen im
Umsatz hinnehmen zu müssen. Die Enantioselektivität dieser Reaktion war stets exzellent.
58
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Das Produkt (S)-6 wurde unabhängig vom Isopropanolanteil mit einem ee-Wert von >99%
erhalten. Nach säulenchromatographischer Reinigung konnte das Produkt (S)-6 in einer
Ausbeute von 64% isoliert werden.
Im Folgenden (siehe Abschnitt 4.4.5.1) wurde die Anwendung der ADH aus Rhodococcus
species in einer Eintopfreaktion in Gegenwart von 50% Isopropanol (v/v) als Lösungsmittel
unter Verwendung des wasserlöslichen Katalysatorsystems, bestehend aus Palladiumchlorid
und TPPTS (20) untersucht.
4.4.4.2
Enzymatische Reduktion mit ADH aus Lactobacillus kefir (Rohextrakt)
Die enzymatische Reduktion unter Verwendung der ADH aus L. kefir (Rohextrakt) wurde im
Hinblick auf die Kombination mit der Palladium-katalysierten Suzuki-Kreuzkupplung in einer
Eintopf- bzw. Tandemreaktion ebenfalls in wässrigem Medium mit einem Isopropanolanteil
von
50% (v/v)
durchgeführt.
Zunächst
wurde
die
enzymatische
Reduktion
von
4‘-Phenylacetophenon (5), dem Zwischenprodukt der Eintopfreaktion von Suzuki-Kupplung
mit nachgeschalteter Biotransformation, betrachtet (siehe Weg A, Abbildung 4.20). Des
Weiteren wurde auch die enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (4) in wässrigem
Medium mit einem Isopropanol-Anteil von 50% (v/v) isoliert untersucht. Dies ist für die
Eintopfreaktion bei veränderter Reaktionssequenz von Bedeutung (Biotransformation mit
nachgeschalteter Suzuki-Kupplung analog Weg B in Abbildung 4.20). Zur enzymatischen
Reduktion von 4‘-Iodacetophenon in wässrigem Medium mit einem Isopropanol-Anteil von
25% (v/v) lagen bereits Ergebnisse aus unserem Arbeitskreis vor.[105]
4.4.4.2.1
Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon
Die Durchführung der enzymatischen Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (5) unter
Verwendung der ADH aus L. kefir (Rohextrakt) erfolgte in Gegenwart von 50% Isopropanol
(v/v). Isopropanol dient hier sowohl als Lösungsmittel als auch als Substrat zur
Cofaktorregenerierung. Die Durchführung erfolgte analog AAV 13. Exemplarisch sind in
Tabelle 4.10 die Ergebnisse, die unter Verwendung einer Enzymcharge erzielt wurden
zusammengestellt.
59
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tabelle 4.10 Ergebnisse der Reduktion von Keton 5 mit ADH aus L. kefir (Rohextrakt)
O
Puffer / i-PrOH 1:1 (v/v)
RT, 24 h
V = 10 ml
5
39 mM
a)
OH
MgCl2,
118 U/mmol ADH aus L. kef ir
2.7 mM NADP+
(R)-6
Eintrag
Wässriges Medium
Enzymmenge [µl]
Umsatz [%]
ee-Wert [%]
1
i-PrOH / Puffer pH 7
495 a)
94
>99
2
i-PrOH / Puffer pH 8
1076 b)
>95
>99
118 U/mmol ADH aus L. kefir Charge 7;
b)
118 U/mmol ADH aus L. kefir Charge 7, Aktivität
angepasst an Puffer pH 8
Ausgehend
von
Vorarbeiten
in
unserem
Arbeitskreis
wurde
die
Reduktion
von
4‘-Phenylacetophenon (5) unter Verwendung von 184 U/mmol ADH aus L. kefir pro
0.25 mmol Substrat durchgeführt.[104] Es zeigte sich, dass unter Verwendung von 50%
Isopropanol (v/v) als Lösungsmittel und Cosubstrat zur Cofaktorregenerierung die
Enzymmenge weiter verringert werden konnte, ohne Einbußen im Umsatz hinnehmen zu
müssen.
Eine
Enzymmenge
von
118 U/mmol
ADH
aus
L.
kefir
(bezogen
auf
4‘-Phenylacetophenon (5)) erwies sich als ausreichend, um einen vollständigen Umsatz zu
erzielen (siehe Tabelle 4.10, Eintrag 1). Dies entspricht einer Reduktion der Enzymmenge
um rund ein Drittel (36%). Im Hinblick auf eine Tandemreaktion wurde die enzymatische
Reduktion auch in Isopropanol und Puffer pH 8 (200 mM) durchgeführt. Dabei wurde die
Enzymmenge an die Enzymaktivität bei pH 8 angepasst. Hierbei wurde ein Umsatz von
>95% erzielt (Tabelle 4.10, Eintrag 2). Das Produkt (R)-6 konnte unabhängig vom pH-Wert
des Reaktionsmediums stets mit exzellenter Enantioselektivität von >99% ee erhalten
werden.
Dies stimmt zuversichtlich, dass es möglich sein wird, die enzymatische Reduktion im
Anschluss an die Palladium-katalysierte Suzuki-Kupplung durchzuführen, ohne vorher den
pH-Wert adjustieren zu müssen.
60
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.4.2.2
Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon
Wie bereits in Abschnitt 4.4.1.6 beschrieben, betreffen bisherige Veröffentlichungen zur
Kombination von Palladium-katalysierter Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion in
einer Eintopfreaktion die Reaktionssequenz A (siehe Abbildung 4.20), in der erst die
Suzuki-Kupplung und anschließend die enzymatische Reduktion durchgeführt wird. In einer
Tandemreaktion aber kann die Produktbildung über beide in Abbildung 4.20 dargestellten
Reaktionssequenzen erfolgen. Welcher Weg bevorzugt wird, hängt von den relativen
Geschwindigkeiten der ersten Reaktion von Weg A und Weg B ab. In Abschnitt 4.4.1.6
wurde deshalb auch die Suzuki-Kupplung des Alkohols rac-29 mit Phenylboronsäure (19)
untersucht. Im Folgenden wird auch der Reaktionsweg B zur Kombination von Palladiumkatalysierter Kreuzkupplung und enzymatischer Reduktion in einer Eintopfreaktion
untersucht. Dafür wurde zunächst analog AAV 13 die isolierte enzymatische Reduktion von
4‘-Iodacetophenon (4) in 50% Isopropanol (v/v) und 50% Puffer pH 7 (v/v) durchgeführt.
Abbildung 4.30 Enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (4) mit ADH aus L. kefir
Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wurde das Produkt (R)-29 mit einem Umsatz von
>95% mit exzellenter Enantioselektivität von >99% ee erhalten (siehe Abbildung 4.30). Auf
eine Optimierung der Enzymmenge wurde verzichtet, da auf Grund der hohen Aktivität der
ADH aus L. kefir für 4‘-Iodacetophenon (4) nur sehr kleine Enzymvolumina eingesetzt
wurden.
61
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.5
Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion
in einer Eintopfreaktion unter Verwendung von Natriumcarbonat
als Base
Nachdem sich die Suzuki-Kupplung in einem Gesamtvolumen von 10 ml bei einem
Isopropanolanteil von 50% (v/v) am stabilsten erwies (siehe Abschnitt 4.4.1) und auch die
Biotransformation bei einem Isopropanolanteil von 50% (v/v) gute Ergebnisse erzielte, wird
die
Suzuki-Kupplung
in
der
Eintopfreaktion
unter
diesen
Reaktionsbedingungen
durchgeführt. Die Suzuki-Kupplung in Gegenwart von Natriumcarbonat als Base lieferte
stabile Ergebnisse. Zunächst soll die Eintopfreaktion unter Verwendung von 2.5
Äquivalenten Natriumcarbonat als Base durchgeführt werden. Unter diesen Bedingungen
wurde für die Kupplung von 4‘-Iodacetopenon (4) mit Phenylboronsäure (19) bei
Raumtemperatur nach 24 Stunden stets ein Umsatz von >95% erhalten. Nach der SuzukiKupplung muss der pH-Wert auf pH 7 adjustiert werden, bevor die Biokatalyse durch
Enzymzugabe gestartet werden kann.
Abbildung 4.31 Schematische Darstellung zur Kombination von Suzuki-Kupplung und
enzymatischer Reduktion in einer Eintopfreaktion (Weg A)
4.4.5.1
Eintopfreaktion mit ADH aus Rhodococcus sp.
Zunächst wurde analog AAV 14 die Eintopfreaktion mit der ADH aus Rhodococcus species
und Natriumcarbonat als Base durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden für
die Suzuki-Kreuzkupplung, wurde der pH-Wert auf pH 7 adjustiert. Anschließend wurden
Enzym und Cofaktor zugegeben und das Reaktionsgemisch weitere 24 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt (siehe Abbildung 4.32).
62
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
O
HO
+
wässr. Medium
(50% IPA (v/v))
RT, 24 h
I
4
O
OH 2.5 Äq. Na CO
2
3
B
PdCl2/TPPTS
pH adj.
25 U RR-ADH,
3.9 mM NAD+
OH
wässr. Medium
(50% IPA (v/v))
RT, 24 h
19
5
(S)-6
produktbez. Umsatz >95%
ee-Wert >99%
Abbildung 4.32 Eintopfreaktion mit ADH aus Rhodococcus sp. unter Verwendung von
Na2CO3 als Base
Unabhängig davon, ob die Eintopfreaktion in dest. Wasser und Isopropanol oder in
Isopropanol und Puffer pH 7 durchgeführt wurde, wurde das Produkt (S)-6 mit einem Umsatz
von >95% und einem ee-Wert von >99% erhalten werden. Als einziges Nebenprodukt, mit
einem Anteil von <5%, wurde das Zwischenprodukt 5 beobachtet. Die Tatsache, dass kein
weiteres Nebenprodukt gebildet wurde zeigt, dass der erste Teilschritt, die Suzuki-Kupplung,
unter Verwendung von Natriumcarbonat als Base vollständig ablief (>95% Kupplungsprodukt
5). Auch der zweite Reaktionsschritt, die enzymatische Reduktion mit ADH aus
Rhodococcus sp., verlief mit einem Umsatz von >95%. Somit wurde in beiden Teilreaktionen
der Eintopfreaktion der maximale Umsatz erzielt, der nach den Einzelreaktionen zu erwarten
war. Dieses Ergebnis bestätigt die Photometertests, in denen die PräkatalysatorKomponenten Palladiumchlorid und TPPTS keine signifikante Inhibierung der ADH aus
Rhodococcus species zeigten (siehe Abbildung 4.25 und Abbildung 4.26). Nach
säulenchromatographischer Reinigung konnte das Produkt (S)-6 in 72% Ausbeute mit
exzellenter Enantioselektivität von >99% ee erhalten werden.
4.4.5.2
Eintopfreaktion mit ADH aus Lactobacillus kefir
Auch die Eintopfreaktion mit ADH aus L. kefir und Natriumcarbonat als Base wurde analog
AAV 14
durchgeführt.
Ausgehend
von
4‘-Iodacetophenon (4)
wurde
in
situ das
Kupplungsprodukt 5 synthetisiert und nach Adjustierung des pH-Werts auf pH 7 in der
Biotransformation mit ADH aus L. kefir zum Produkt (R)-6 reduziert. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 4.11 zusammengefasst.
Anhand der Ergebnisse in Tabelle 4.11 kann man erkennen, dass die Palladium-katalysierte
Suzuki-Kupplung in Anwesenheit von 2.5 Äquivalenten Natriumcarbonat als Base vollständig
63
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
verläuft. Die enzymatische Reduktion im zweiten Schritt der Eintopfreaktion verläuft in
keinem der Fälle vollständig. Produktbezogene Umsätze von 86% und 92% (R)-6 über zwei
Reaktionsschritte stellen sehr gute Ergebnisse dar. Zum Vergleich: die enzymatische
Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5 in 50% Isopropanol (v/v) lieferte mit der gleichen
Charge ADH aus L. kefir einen Umsatz von >95% (siehe Tabelle 8.19, Eintrag 2).
Nach säulenchromatographischer Reinigung konnten 72% hoch reines Produkt mit einem
ee-Wert von >99% isoliert werden.
Tabelle 4.11 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit Na2CO3 als Base (ADH aus L. kefir)
a)
Eintrag
Enzym [µl]
Wässriges Medium
1
322 a)
2
322 a)
Umsatz [%]
ee-Wert von (R)-6
4
5
29
6
[%]
IPA / Puffer pH 7
-
14
-
86
>99
IPA / dest. Wasser
-
8
-
92
>99
ADH aus L. kefir Charge 5
Hiermit
konnte
gezeigt
werden,
dass
das
wasserlösliche
Katalysatorsystem
aus
Palladiumchlorid und TPPTS sehr gut für die Anwendung in einer Eintopfreaktion, in der die
Palladium-katalysierte Kreuzkupplung mit einer Biotransformation kombiniert wird, geeignet
ist. Man verfügt damit über ein Katalysatorsystem, mit dem beide Reaktionen bei
Raumtemperatur durchgeführt werden können. Dieses Ergebnis ist ein entscheidendes
Zwischenziel bei der Entwicklung einer Tandemreaktion analog Abbildung 4.3 c). Auf Grund
seiner hohen Basizität ist Natriumcarbonat als Base dafür ungeeignet (pH 10-11, siehe
Tabelle 4.3). Auf Grund des niedrigen pH-Werts von ~pH 8 (siehe Tabelle 4.3) und den
guten Ergebnissen in der Suzuki-Kupplung mit Natriumhydrogencarbonat (siehe Abschnit
4.4.7) wird diese als Base in der Eintopfreaktion getestet werden. Zunächst soll aber getestet
werden, ob die Eintopfreaktion mit Natriumcarbonat auch im Gramm-Maßstab vergleichbare
Ergebnisse liefert.
64
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.6
Maßstabsvergrößerung der Eintopfreaktion unter Verwendung
von Natriumcarbonat als Base
Bisher wurde die Eintopfreaktion stets im Milligramm-Maßstab durchgeführt. Es sollte nun
getestet werden, ob die Eintopfreaktion auch im Gramm-Maßstab zu realisieren ist. Dafür
wurde zunächst der Maßstab der Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium unter Verwendung
des wasserlöslichen Katalysatorsystems, bestehend aus Palladiumchlorid und TTPTS, auf
das 13-fache erhöht um ca. 1 g Produkt 5 zu erhalten. Darüber hinaus soll eine Optimierung
der Katalysatorbeladung in der Suzuki-Kupplung vorgenommen werden um anschließend
unter optimierten Bedingungen die Eintopfreaktion im Gramm-Maßstab durchzuführen.
Anschließend wird mit einer neuen Enzymcharge die Eintopfreaktion im kleinen Maßstab
wiederholt, um einen Vergleichswert für die Übertragbarkeit der Eintopfreaktion vom
Milligramm- in den Gramm-Maßstab zu erhalten.
4.4.6.1
Durchführung der Suzuki-Kupplung im vergrößerten Labormaßstab und
Reduktion der Katalysatorbeladung
Die Suzuki-Kupplung wurde analog AAV 14 in Isopropanol und dest. Wasser (1 : 1 (v/v)) in
Gegenwart von Natriumcarbonat als Base unter Verwendung von 4 mol% Palladiumchlorid
und 5 mol% TPPTS (20) in einem Reaktionsvolumen von 130 ml durchgeführt (siehe Tabelle
4.12).
Bereits der erste Ansatz, in dem die Ansatzgröße auf das 13-fache erhöht wurde, zeigte
vollständigen Umsatz (siehe Tabelle 4.12, Eintrag 1). Die Auswaage des Rohprodukts
betrug 96%. Nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel (Cyclohexan und
EtOAc 4 : 1 (v/v)) konnte das saubere Produkt mit einer Ausbeute von 88% isoliert werden.
Anschließend wurde untersucht, wie stark die Katalysatorbeladung reduziert werden kann.
Es zeigte sich, dass die Katalysatorbeladung in der Suzuki-Kupplung deutlich reduziert
werden konnte, ohne Einbußen im Umsatz hinnehmen zu müssen. Die Menge an
Palladiumchlorid wurde von 4 mol% (1.5 mM) auf 0.3 mol% (0.1 mM) und TPPTS von
5 mol% (1.9 mM) auf 0.4 mol% (0.2 mM) reduziert (siehe Tabelle 4.12, Eintrag 5). Die
Reaktion
verlief
weiterhin
mit
vollständigem
Umsatz.
Bei
dieser
niedrigen
Katalysatorbeladung reichte es aus, das Rohprodukt über eine mit Kieselgel gefüllte
65
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Pasteurpiptte (V = 2 ml) zu filtrieren, um den Katalysator aus dem Rohprodukt zu entfernen
(siehe Tabelle 4.12, Eintrag 5).
Tabelle 4.12 Reduktion der Katalysatorbeladung in der Suzuki-Kupplung (Scale-up)
Eintrag
1
2
3
4
5
a)
PdCl2
TPPTS
4 mol%
5 mol%
(1.5 mM)
(1.9 mM)
2.6 mol%
3.2 mol%
(1 mM)
(1.2 mM)
1.3 mol%
1.6 mol%
(0.5 mM)
(0.6 mM)
0.6 mol%
0.8 mol%
(0.2 mM)
(0.3 mM)
0.3 mol%
0.4 mol%
(0.1 mM)
(0.2 mM)
Umsatz
Roh-Ausbeute
Reinigung
Ausbeute
>95%
96%
Kieselgel a)
88%
>95%
97%
Celite b)
94%
>95%
99%
n.g. c)
n.g. c)
>95%
99%
n.g. c)
n.g. c)
>95%
103%
Filtration d)
93%
säulenchromatographische Reinigung an Kieselgel (Cyclohexan : EtOAc 4 : 1 (v/v));
Celite;
c)
nicht gereinigt;
d)
b)
Filtration über
Filtration durch mit Kieselgel gefüllte Pasteurpipette (V = 2 ml)
Für weitere Untersuchungen zur sukzessiven Reduktion der Katalysatormenge ist es sinnvoll
die Ansatzgröße zu erhöhen, da durch die geringen Katalysatormengen (insbesondere
Palladiumchlorid) eine exakte Einwaage nicht mehr möglich ist (Limitierung durch die
Genauigkeit der Waage und die Mindesteinwaagemenge).
Im Folgenden soll nun bei niedrigster Katalysatorbeladung (0.3 mol% Palladiumchlorid und
0.4 mol% TPPTS) die Suzuki-Kupplung mit der Biotransformation in einer Eintopfreaktion im
Gramm-Maßstab kombiniert werden.
66
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.6.2
Durchführung der Eintopfreaktion im vergrößerten Labormaßstab
Die Kombination von Suzuki-Kupplung und Biotransformation in einer Eintopfreaktion soll
auch im großen Maßstab (5.057 mmol) realisiert werden. Auf Grund der Ergebnisse mit der
neuen Charge ADH aus L. kefir im kleinen Maßstab (sieheAbbildung 4.33) soll die
Eintopfreaktion in Isopropanol und dest. Wasser an Stelle von Isopropanol und Puffer pH 7
als Reaktionsmedium durchgeführt werden. Während die Eintopfreaktion im Maßstab von
10 ml, durchgeführt in dest. Wasser und Isopropanol, über zwei Schritte einen Umsatz von
94% zum Zielprodukt (R)-6 liefert, wurde in Puffer pH 7 und Isopropanol ein etwas
niedrigerer Umsatz von 91% Produkt (R)-6 erzielt (siehe Abbildung 4.33). Gleichzeitig dient
das im Milliliter-Maßstab erzielte Ergebnis (siehe Abschnitt 4.4.6.2) als Vergleich für die
Übertragbarkeit der Eintopfreaktion in den Gramm-Maßstab.
Abbildung 4.33 Benchmark für die Eintopfreaktion im kleinen Maßstab (ADH aus L.kefir)
Die Durchführung der Eintopfreaktion im vergrößerten Labormaßstab (130 ml) erfolgte
analog AAV 4 unter Verwendung von 0.3 mol% Palladiumchlorid und 0.4 mol% TPPTS mit
Isopropanol und dest. Wasser als Lösungsmittel (siehe Abbildung 4.34).
Abbildung 4.34 Erweiterter Labormaßstab der Eintopfreaktion
67
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Im Scale-up der Eintopfreaktion mit Natriumcarbonat als Base wurde mittels 1H-NMRSpektroskopie ein Umsatz von >95% bestimmt. Der Anteil des Zielprodukts (R)-6 im
Rohprodukt betrug 88%. Als einziges Nebenprodukt wurde das 4‘-Phenylacetophenon (5)
mit 12% beobachtet. Dieses Ergebnis liegt im Bereich der isoliert durchgeführten
Biotransformation (siehe Tabelle 8.19, Eintrag 3) in der ein Umsatz von 87% erzielt wurde.
Nach säulenchromatographischer Reinigung wurde das saubere Produkt (R)-6 mit einer
Ausbeute von 66% isoliert. Ein Grund für die niedrigere Ausbeute ist die Emulsionsbildung
während der Extraktion mit Dichlormethan. Unter Berücksichtigung des Umsatzes wurde
nach der Extraktion nur 82% Rohprodukt der theoretisch möglichen Menge erhalten. Nach
säulenchromatographischer Reinigung wurden 660 mg sauberes Produkt erhalten. Dies
entspricht einer Ausbeute von 88% relativ zur Auswaage des Rohprodukts. Eine Möglichkeit
die Ausbeute zu verbessern ist die Verhinderung der Emulsionsbildung, z.B. durch Zugabe
von Protease oder durch Denaturierung des Enzyms mittels Erhitzen. Dazu sind gesonderte
Untersuchungen erforderlich.
Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer
Reduktion auch im Gramm-Maßstab mit entsprechendem Umsatz durchgeführt werden
kann. Unter nicht optimierten Bedingungen wurde das Produkt (R)-6 mit 88% Umsatz
erhalten. Es konnten 66% sauberes Produkt (R)-6 isoliert werden. Diese Werte liegen im
gleichen Bereich wie die Ergebnisse im kleinen Maßstab. Diese Untersuchungen beweisen,
dass die Eintopfreaktion mit der ADH aus Lactobacillus kefir unter Verwendung von
Natriumcarbonat als Base sehr gut in den Gramm-Maßstab übertragbar ist.
4.4.7
Eintopfreaktion unter Verwendung von
Natriumhydrogencarbonat als Base
Im Hinblick auf die Kombination von Palladium-katalysierter Suzuki-Kreuzkupplung und
enzymatischer Reduktion in einer Tandemreaktion ist insbesondere die pH-Kompatibilität mit
der ADH ein wichtiger Punkt. Auf Basis der Ergebnisse der pH-Messungen (siehe Tabelle
4.3) wurde Natriumhydrogencarbonat auf Grund seiner geringeren Basizität dafür als sehr
gut geeignet befunden. Darüber hinaus hat sich Natriumhydrogencarbonat auch als sehr gut
geeignet in der Suzuki-Kupplung gezeigt (siehe Abbildung 4.18).
68
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.7.1.1
Nachgeschaltete enzymatische Reduktion
In einem ersten Arbeitsschritt wurde die Eintopfreaktion unter Verwendung von
Natriumhydrogencarbonat als Base analog Reaktionsweg A (siehe Abbildung 4.20) mit
nachgeschalteter
Biotransformation
durchgeführt.
Die
Synthese
von
(R)-6
mittels
Eintopfreaktion erfolgte analog AAV 15 unter Verwendung von Natriumhydrogencarbonat
und der ADH aus Lactobacillus kefir. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.13 zusammengefasst.
Tabelle 4.13 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Weg A
Eintrag
a)
wässrige
Phase
a)
pH adj.
46 U
Enzym b)
bezogen auf
[µl]
5
29
6
[%]
Umsatz [%]
ee-Wert 6
1
dest. H2O
2.5 M HCl
pH 7
495
5
-
95
>99
2
Puffer pH 7
2.5 M HCl
pH 7
495
5
-
95
>99
3
Puffer pH 7
-
pH 7
495
77
2
21
n.b.
4
dest. H2O
-
pH 7
495
67
-
33
>99
5
dest. H2O
-
pH 8
1076
6
-
94
>99
6
Puffer pH 7
-
pH 8
1076
30
-
70
>99
7
dest. H2O
-
pH 8
1076
14
-
86
>99
8
Puffer pH 7
-
pH 8
1076
30
4
66
n.b.
9
dest. H2O
-
pH 8
1190 c)
7
-
93
>99
Abgesehen von 5.0 ml Isopropanol und 0.5 ml dest. Wasser für Katalysatorlösung;
L. kefir Charge 7;
c)
b)
ADH aus
Enzymmenge angepasst auf 46 U, nachdem das Enzym durch Lagerung an
Aktivität verloren hatte
69
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
In der Eintopfreaktion mit ADH aus L. kefir unter Verwendung von Natriumhydrogencarbonat
als Base wurde zunächst vor Enzymzugabe der pH-Wert auf pH 7 adjustiert (siehe Tabelle
4.13, Einträge 1 und 2). Dabei konnten vergleichbar gute Umsätze wie mit Natriumcarbonat
erzielt werden (vgl. Tabelle 4.11). Der Alkohol (R)-6 wurde, unabhängig vom verwendeten
Reaktionsmedium, mit einem Umsatz von 95% erhalten. Als einziges Nebenprodukt konnte
4‘-Phenylacetophenon (5) mit 5% nachgewiesen werden (siehe Tabelle 4.13, Einträge 1 und
2). Dieser Umsatz liegt im Bereich der isolierten enzymatischen Reduktion. Die isolierte
enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5 in Puffer pH 7 und Isopropanol als
Lösungsmittel lieferte unter Verwendung derselben Charge ADH aus L. kefir den chiralen
Alkohol (R)-6 mit 94% Umsatz (siehe Tabelle 8.19, Eintrag 4).
Die Notwendigkeit der pH-Wert Einstellung verdeutlicht ein Experiment, in dem unter
Verwendung des gleichen Enzymvolumens (46 U entspricht 118 U/mmol bezogen auf Keton
5 bei pH 7) auf die Adjustierung des pH-Werts vor Enzymzugabe verzichtet wurde (siehe
Tabelle 4.13, Einträge 3 und 4). In diesem Fall wurden deutlich niedrigere Umsätz erzielt.
Abhängig von der wässrigen Phase wurden 21% Zielprodukt (R)-6, 77% Kupplungsprodukt 5
und 2% reduziertes Edukt (R)-29 bzw. 33% Produkt (R)-6 und 67% Kupplungsprodukt 5
erhalten (Tabelle 4.13, Einträge 3 und 4). Der pH-Wert des Reaktionsmediums ist unter
diesen Umständen zu hoch um mit 46 U bezogen auf 4‘-Phenylacetophenon (bei pH 7) eine
vollständige
enzymatische
Reduktion
zu
erzielen.
Die
pH-Messungen
von
Natriumhydrogencarbonatlösung in dest. Wasser bzw. Puffer pH 7 ergaben einen pH-Wert
von ~8 (siehe Tabelle 4.3). Deshalb wurde in folgenden Experimenten die Enzymmenge auf
die Aktivität der Alkoholdehydrogenase bei pH 8 angepasst.
Nach Anpassung der Enzymmenge auf die Aktivität der ADH bei pH 8, konnte in Isopropanol
und dest. Wasser ohne Adjustierung des pH-Werts, ein produktbezogener Umsatz von 94%
erzielt werden (siehe Tabelle 4.13 Eintrag 5). Eine erste Reproduktion des Ergebnisses
gestaltete sich zunächst schwierig (siehe Tabelle 4.13 Eintrag 7). Nach Überprüfung der
Aktivität der Enzymcharge und einer entsprechenden Anpassung der Enzymmenge wurde
ein Umsatz von 93% zum Produkt (R)-6 über zwei Reaktionsschritte erhalten. Um
reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten ist es unbedingt erforderlich in kurzen Abständen die
Aktivität der ADH zu überprüfen.
Unter den hier gewählten Reaktionsbedingungen ist es möglich die Biotransformation direkt
im Anschluss an die Suzuki-Kupplung durchzuführen, ohne dass der pH-Wert adjustiert
werden muss. Es wurden sehr gute Ergebnisse erzielt werden, wenn die erste Reaktion in
70
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Wasser und Isopropanol als Reaktionsmedium durchgeführt wurde. Der Alkohol (R)-6 wurde
mit 94 bzw. 93% Umsatz erhalten. Unerwartet ist allerdings, dass in der Eintopfreaktion ohne
pH-Adjustierung bessere Ergebnisse erzielt wurden, wenn als Lösungsmittel Isopropanol und
dest. Wasser an Stelle von Isopropanol und Puffer pH 7 verwendet wurde. Nach den
Ergebnissen der pH-Wert-Messungen wäre zu erwarten, dass auf Grund des niedrigeren pHWerts die enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (5) in Isopropanol und Puffer
pH 7 gegenüber der Reduktion in Isopropanol und dest. Wasser begünstigt ist. Hierzu sind
zwei Ursachen denkbar: zum Einen der pH-Wert des Enzym-Rohextrakts (gelagert in Puffer
pH 7). Da dessen pH-Wert niedriger ist als der des Reaktionsmediums ist vorstellbar, dass
nach Zugabe einer großen Menge Rohextrakt in Isopropanol und dest. Wasser als
Lösungsmittel der pH-Wert niedriger ist als in Isopropanol und Puffer pH 7 als Lösungsmittel.
Eine weitere Erklärung wäre, dass die Salzkonzentration im Reaktionsmedium eine Rolle
spielt.
In Bezug auf das Langzeitziel, der Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und
enzymatischer Reduktion in einer Tandemreaktion, sind nun zwei wichtige Voraussetzungen
gegeben. Neben einer gemeinsamen Reaktionstemperatur, der Raumtemperatur, ist mit
Natriumhydrogencarbonat auch eine Base gefunden, die es nicht mehr nötig macht vor
Enzymzugabe den pH-Wert zu adjustieren. Dies stellt ein vielversprechendes Ergebnis dar.
Im Folgenden wird auch die Eintopfreaktion unter veränderter Reaktionssequenz
(nachgeschaltete Suzuki-Kupplung) untersucht.
4.4.7.1.2
Nachgeschaltete Suzuki-Kupplung
Aus den Photometertests (Tabelle 4.7) ist bekannt, dass die ADH aus Lactobacillus kefir
eine deutlich höhere Aktivität für 4‘-Iodacetophenon (4) als für 4‘-Phenylacetophenon (5)
aufweist. Für eine potentielle Tandemreaktion, in der alle Komponenten von Beginn an
vorliegen, bedeutet dies, dass Keton 4 schneller reduziert wird als Keton 5, welches in der
Tandemreaktion durch Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit Phenylboronsäure (19) erst
noch gebildet werden muss. Es ist also sehr wahrscheinlich, dass in der Tandemreaktion die
Bildung des Produktes (R)-6 eher über den Reaktionsweg B ablaufen wird (siehe Abbildung
4.20).
Im
Folgenden
soll
die
Eintopfreaktion
unter
Verwendung
von
Natriumhydrogencarbonat als Base mit nachgeschalteter Suzuki-Kupplung untersucht
werden.
71
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Abbildung 4.35 Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Weg B
Die beiden Einzelschritte wurden bereits untersucht und in Abschnitt 4.4.4.2.2 bzw. 4.4.1.6
beschrieben. Nun wurden beide Reaktionsschritte in einer Eintopfreaktion kombiniert, in der
zunächst die enzymatische Reduktion von 4‘-Iodacetophenon (4) durchgeführt wird, und
anschließend die für die Palladium-katalysierte Kreuzkupplung benötigten Komponenten
zugegeben wurden. Die Durchführung erfolgte analog AAV 16 in 50% Isopropanol und 50%
dest. Wasser mit ADH aus L. kefir. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.14 zusammengefasst.
Die Veränderung der Reihenfolge der einzelnen Reaktionsschritte in der Eintopfreaktion
bestätigt das Ergebnis aus der isolierten Kupplung des racemischen Alkohols. Mit 72 bzw.
76% Produkt (R)-6 liegen die Ergebnisse etwas hinter den besten Umsätzen der isolierten
Kupplung (83% rac-6; siehe Eintrag 3 in Tabelle 4.4). Eine Verlängerung der Reaktionszeit
im zweiten Schritt brachte keine deutliche Verbesserung im Umsatz (76 gegenüber 72%
Produkt (R)-6). Das Produkt (R)-6 wurde stets mit exzellenter Enantioselektivität von
>99% ee erhalten.
Tabelle 4.14 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Weg B
72
Eintrag
Reaktionszeit [h]
1
Umsatz [%]
ee-Wert von (R)-6 [%]
4
29
5
6
24 + 48
-
25
3
72
>99
2
24 + 121
-
21
3
76
>99
3
24 + 48
-
25
3
72
>99
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Es könnte noch einen Faktor geben, der die Palladium-katalysierte Kreuzkupplung limitiert.
Potentiell die Suzuki-Kupplung inhibierende Faktoren aus der enzymatischen Reduktion, wie
z.B. die Proteinkonzentration werden in Abschnitt 4.4.8.1 eingehend untersucht.
4.4.8
Kombination von Palladiumkatalyse und Biotransformation in
einer Tandemreaktion
Mit den bisherigen Untersuchungen wurden zwei entscheidende Voraussetzungen in Bezug
auf das Langzeitziel, der Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und enzymatischer
Reduktion
in
einer
Tandemreaktion
gegeben.
Neben
einer
gemeinsamen
Reaktionstemperatur, der Raumtemperatur, ist mit Natriumhydrogencarbonat auch ein mit
der ADH kompatibler pH-Wert des Reaktionsmediums gefunden. Dadurch ist es nicht mehr
nötig, vor der Enzymzugabe den pH-Wert zu adjustieren. Dies stellt ein vielversprechendes
Ergebnis
dar.
Des
Weiteren
wurden
bereits
beide
zum
Zielprodukt
führenden
Reaktionssequenzen in einer Eintopfreaktion getestet. Es ist zu erwarten, dass je nach
bevorzugter Reaktionssequenz in der Tandemreaktion zwischen 76 und 95% Umsatz zum
Produkt (R)-6 erzielt werden können.
4.4.8.1
Untersuchung inhibierender Faktoren aus der enzymatischen Reduktion auf
die Suzuki-Kupplung
In Abschnitt 4.4.3 wurde bereits der Einfluss verschiedener Komponenten aus der SuzukiKupplung auf die Aktivität der ADHs untersucht. Nun soll auch untersucht werden, ob in der
enzymatischen Reduktion benötigte Komponenten einen Einfluss auf die Palladiumkatalysierte Suzuki-Kupplung haben. Einen ersten Hinweis darauf lieferte die Eintopfreaktion
mit nachgeschalteter Suzuki-Kupplung (siehe Abschnitt 4.4.7.1.2). Um dies eingehender zu
untersuchen und festzustellen ob Cofaktor, HSA (Protein) oder Enzym-Rohextrakt die
Suzuki-Kupplung limitieren, wird analog AAV 17 die Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit
Phenylboronsäure (19) in Gegenwart dieser Komponenten als Additiv durchgeführt (siehe
Abbildung 4.36).
73
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Abbildung 4.36 Untersuchung auf die Kupplung inhibierende Faktoren
Die Untersuchung des Einflusses verschiedener, in der enzymatischen Reduktion benötigter
Komponenten auf die Suzuki-Kupplung erfolgte anhand der Reaktion von 4‘-Iodacetophenon
(4) mit Phenylboronsäure (19). Langfristig ist es auch interessant, den Einfluss dieser
Komponenten auf die Kupplung des Alkohols 29 mit Phenylboronsäure (19) zu untersuchen.
Aus Zeitgründen wurde darauf verzichtet.
4.4.8.1.1
Einfluss des Cofaktors auf die Suzuki-Kupplung
Zuerst wurde der Einfluss des Cofaktors auf die Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit
Phenylboronsäure (19) getestet. Der Cofaktor wurde wie in der Eintopfreaktion in seiner
oxidierten Form NADP+ eingesetzt. Die Konzentration von 2.2 mM NADP+ entspricht dabei
der in der Eintopfreaktion mit ADH aus L. kefir verwendeten Konzentration. Die Durchführung
erfolgte analog AAV 17. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.24 und Abbildung 4.37
zusammengefasst.
Abbildung 4.37 Einfluss des Cofaktors auf die Suzuki-Kupplung
74
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
In den meisten Ansätzen wurde nach 24 Stunden ein Umsatz von >95% erzielt. Es gab aber
auch Ansätze, in denen nur 75-92% Umsatz erzielt wurden (siehe Tabelle 8.24).
Möglicherweise ist dies auf eine Verlangsamung der Reaktion in Anwesenheit des Cofaktors
zurückzuführen. Es wurde gezeigt, dass die Gegenwart von 2.2 mM NADP+ die Palladiumkatalysierte Suzuki-Kupplung höchstens verlangsamt. Prinzipiell kann ein vollständiger
Umsatz erreicht werden.
4.4.8.1.2
Eine
Einfluss von Protein (HSA) auf die Suzuki-Kupplung
weitere
Möglichkeit
einer
limitierenden
Komponente
entsteht
durch
die
Proteinkonzentration im Rohextrakt. Es ist anzunehmen, dass sich die katalytisch aktive
Spezies an das Protein bindet. Diese stünde dann nicht mehr zur Katalyse zur Verfügung.
Als Protein wird HSA (human serum albumin) eingesetzt. Dies wird als Referenz zur
Bestimmung des Proteingehalts in Enzymformulierungen verwendet. Auf Grund der
Photometertests (siehe Tabelle 4.8) und der Ergebnisse in der Eintopfreaktion (siehe
Tabelle 4.13) wird angenommen, dass in einer Tandemreaktion ein Enzymvolumen von ca.
1.4 ml Rohextrakt bei einer Proteinkonzentration von 13 mg/ml eingebracht wird.
Entsprechend wurde analog AAV 17 die Suzuki-Kupplung in Gegenwart von 20 mg HSA
durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.15 zusammengefasst.
Tabelle 4.15 Einfluss von Protein (HSA) auf die Suzuki-Kupplung
HO
O
B
HSA
2.5 Äq. NaHCO3
PdCl2/TPPTS
OH
+
I
4
39 mM
a)
19
39 mM
O
wässriges Medium
(50% i-PrOH (v/v))
RT, 24-64 h
V = 10 ml
5
Eintrag
Wässriges Medium
HSA [mg]
Zeit [h]
Umsatz [%]
1
i-PrOH /dest. Wasser
20 a)
24
76
2
i-PrOH /dest. Wasser
20 a)
64
>95
Annahme: typ. Aufschluss liefert Rohextrakt mit einer Proteinkonzentration von 13 mg/mL, 1.4 ml
Rohextrakt enthalten dann 20 mg Protein
75
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Es zeigte sich, dass HSA die Kupplung zwar verlangsamt, sie aber nicht vollständig inhibiert.
Durch eine Verlängerung der Reaktionszeit von 24 auf 64 Stunden konnte ein vollständiger
Umsatz erzielt werden. Eine Optimierung der Reaktionszeit, bei der quantitativer Umsatz
erzielt werden kann, wurde nicht eingehender untersucht.
4.4.8.1.3
Einfluss des Enzym-Rohextrakts auf die Suzuki-Kupplung
Es konnte bereits ausgeschlossen werden, dass das Protein in Form von HSA die SuzukiKupplung inhibiert. Da im Rohextrakt aber nicht nur Protein enthalten ist, wurde auch der
Rohextrakt als Additiv in der Suzuki-Kupplung verwendet. Analog AAV 17 wurde die SuzukiKupplung in Gegenwart verschiedener Volumina des Rohextrakts durchgeführt. Darüber
hinaus wurde nach Zugabe des Rohextrakts der pH-Wert der Reaktionslösung mit pHStäbchen bestimmt. Wenn der pH-Wert deutlich kleiner als pH 8 war, wurde erneut
Natriumhydrogencarbonat zugegeben bis ungefähr pH 8 erreicht war. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 4.16 zusammengefasst.
Tabelle 4.16 Inhibierender Einfluss des Rohextrakts der ADH aus L. kefir
Eintrag
a)
ADH aus L. kefir
NaHCO3 [mM]
Zeit [h]
[ml] a)
[% (v/v)]
1
0.129
1.3
96
2
0.675
6.3
3
1.438
4
1.438
Umsatz [%]
4
5
29
6
64
~1
>95
-
-
182
63
~1
90
<5
<5
12.6
202 b)
24
c)
c)
>95
c)
12.6
408 d)
64
8
46
25
21
Charge 7 der ADH aus L. kefir;
b)
pH-Wert neutral;
c)
enthält Spuren davon;
d)
später stellte sich
heraus, dass 12.0 Äquivalente Natriumhydrogencarbonat zwar in dest. Wasser, aber nicht in
dest. Wasser/Isopropanol 1:1 (v/v) löslich sind.
76
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Betrachtet man die Ergebnisse aus Tabelle 4.16, so fällt zunächst auf, dass in 1.438 ml
Rohextrakt genügend Cofaktor enthalten ist, um katalytisch wirksam zu sein (siehe Einträge
3 und 4). Man sieht auch, dass mit steigendem Volumen an Enzym-Rohextrakt, die
Basenmenge erhöht werden musste, um noch das Kupplungsprodukt 5 zu erhalten. In
Gegenwart von 12.6% (v/v) Rohextrakt konnte selbst bei stark erhöhter Basenmenge
(204 mM gegenüber 97 mM; siehe Eintrag 3) kein 4‘-Phenylacetophenon (5), sondern
ausschließlich reduziertes Iodacetophenon 29, nachgewiesen werden. Trotz erhöhter
Basenmeng wurde nur ein neutraler pH-Wert erreicht. Bei weiterer Erhöhung der
Basenmenge
(~pH 8)
konnte
mittels
1
H-NMR-Spektroskopie
in
CDCl3
46%
Kupplungsprodukt 4‘-Phenylacetophenon 5 und 21% reduziertes Kupplungsprodukt 6
nachgewiesen werden (Tabelle 4.16, Eintrag 4).
Nach den hier erzielten Ergebnissen sieht es so aus, als ob in Gegenwart großer Mengen
Rohextrakt der pH-Wert der Reaktionslösung absinkt und dadurch die basenkatalysierte
Suzuki-Kupplung sehr stark verlangsamt oder sogar vollständig inhibiert wird. Da bereits
gezeigt werden konnte, dass reines Protein die Suzuki-Kupplung nur leicht verlangsamt,
benötigt man zur Realisierung der Tandemreaktion also ein möglichst reines Enzym, das
nach Möglichkeit nur das Protein der ADH enthält. Zu diesem Zweck wurde vom AK Hummel
eine partiell gereinigte ADH aus Lactobacillus kefir zur Verfügung gestellt. Im folgenden
Abschnitt wird dieses Enzym, im Hinblick auf die für dieses Projet relevanten Eigenschaften
wie z.B. Substratspezifizität und pH-abhängige Aktivität näher charakterisiert.
4.4.8.2
Eigenschaften der partiell gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir
Die Tests bezüglich inhibierender Faktoren aus der enzymatischen Reduktion auf die
Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit Phenylboronsäure (19) zeigten, dass ein
möglichst reines Enzym verwendet werden sollte (siehe Abschnitt 4.4.8.1). Deshalb wurde
für die Arbeiten an der Tandemreaktion vom FZ Jülich eine über Q-Sepharose gereinigte
ADH aus L. kefir zur Verfügung gestellt (nähere Informationen zur Reinigung können
Abschnitt 8.1 entnommen werden). Diese partiell gereinigte ADH wird in 10 mM Kpi-Puffer
pH 8 in Anwesenheit von Magnesiumchlorid (1 mM) gelagert. Bevor die gereinigte ADH als
Lactobacillus kefir präparativ eingesetzt wurde, wurden mittels Photometertests ihre
Eigenschaften in Bezug auf Substratspektrum, pH-abhängige Aktivität und Additive
untersucht.
77
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.8.2.1
Photometertest zur Aktivitätsbestimmung
Analog der bereits in Abschnitt 4.4.2 beschriebenen Methode wurde auch die volumetrische
Aktivität [U/ml] der (partiell) gereinigten ADH aus L. kefir mittels Photometertest über die
Extinktionsabnahme des Cofaktors NADPH bestimmt. Die Durchführung erfolgte analog
AAV 10. Als Referenzverbindung wurde Acetophenon (33) verwendet, dessen relative
Aktivität auf 100% festgesetzt wird. In Tabelle 4.17 sind exemplarisch die relativen
Aktivitäten einer Enzymcharge gereinigte ADH aus L. kefir für verschiedene parasubstituierte Acetophenone dargestellt werden.
Tabelle 4.17 Aktivität der gereinigten ADH aus L. kefir für unterschiedlich substituierte
Acetophenone
a)
Eintrag a)
Substanz
Relative Aktivität [%]
1
Acetophenon (33)
100
2
4‘-Iodacetophenon (4)
75
3
4‘-Phenylacetophenon (5)
12
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.02 ml, d = 1 cm, f = 200, Charge 11
Die volumetrische Aktivität der gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir ist mit Werten
zwischen 520 und 1363 U/ml für die Referenzverbindung Acetophenon (33) gut bis sehr
hoch (siehe Tabelle 8.13). Das Substratspektrum der partiell gereinigten ADH unterscheidet
sich kaum von dem des Rohextrakts (vgl. Tabelle 4.7). Die relativen Aktivitäten, gemessen
bei pH 7 (50 mM Phosphatpuffer) für 4‘-Iodacetophenon (4) und 4‘-Phenylacetophenon (5)
mit 75% bzw. 12% bezogen auf Acetophenon (33), entsprechen den für den Rohextrakt
bestimmten Werten von 79% für 4‘-Iodacetophenon (4) bzw. 7% für 4‘-Phenylacetophenon
(siehe Tabelle 4.7).
78
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.8.2.2
Photometertests mit gereinigter ADH aus L. kefir zur Untersuchung
inhibierender Faktoren aus der Palladiumkatalyse
Analog zur Untersuchung inhibierender Faktoren aus der Palladiumkatalyse auf die ADH aus
Rhodococcus
species
soll
der
Einfluss
von
TPPTS
(20),
Palladiumchlorid
und
Phenylboronsäure (19) auf die gereinigte ADH aus L. kefir in Photometertests untersucht
werden. Hierzu gibt es bisher keine Erfahrungswerte. Die Durchführung erfolgte analog
AAV 11 im Photometer über die Extinktionsabnahme des Cofaktors (NADPH). Die
Ergebnisse sind in Abbildung 4.39, Abbildung 4.40 und Abbildung 4.41 graphisch
dargestellt.
Abbildung 4.38 Einfluss verschiedener Additive auf die ADH aus L. kefir (gereinigt)
Die Messungen zeigen, dass die Katalysatorkomponenten aus der Suzuki-Kupplung, TPPTS
und Palladiumchlorid, keinen signifikanten Einfluss auf die Aktivität der gereinigten ADH aus
Lactobacillus kefir haben. Ähnliches gilt für die Aktivität der ADH aus Rhodococcus species.
Letztere wurde lediglich als Rohextrakt eingesetzt. Zur Verdeutlichung sind die Ergebnisse
der Messungen unter Verwendung von Rohextrakt der ADH aus Rhodococcus species
(RR-ADH (RE)) und gereinigter ADH aus L. kefir (Lk-ADH ger.) in Phosphatpuffer pH 7 in
Abbildung 4.39, Abbildung 4.40 und Abbildung 4.41 vergleichend dargestellt.
Die Katalysator-Komponenten Palladiumchlorid und TPPTS zeigten unabhängig von der
verwendeten ADH keinen signifikanten Einfluss auf die Enzymaktivität. Da Palladiumchlorid
in dest. Wasser nur bedingt löslich ist, ist es nicht verwunderlich, dass es keinen
signifikanten Einfluss auf die Enzymaktivität zeigt. Auch TPPTS, das wasserlösliche
Analogon
zu
Triphenylphosphin,[83]
zeigte
keinen
signifikanten
Einfluss
auf
die
Enzymaktivität. Dies ist bemerkenswert, da aus der Literatur bekannt ist, dass
Triphenylphosphin einen deutlichen Einfluss auf die Enzymaktivität hat.[14]
79
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
Konzentration [mM]
Lk-ADH ger.
RR-ADH (RE)
Abbildung 4.39 Einfluss des Liganden TPPTS (Puffer pH 7)
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Konzentration [mM]
Lk-ADH ger.
RR-ADH (RE)
Abbildung 4.40 Einfluss von Palladiumchlorid (Puffer pH 7)
Der Einfluss der Phenylboronsäure (19) auf die Aktivität der ADH aus L. kefir ist etwas
stärker ausgeprägt als ihr Einfluss auf die Aktivität der ADH aus Rhodococcus species. Bei
39 mM Konzentration (entspricht der Konzentration zu Beginn der Tandemreaktion) zeigt die
partiell gereinigte ADH aus L. kefir eine Restaktivität von 39% während die ADH aus
Rhodococcus species noch eine Restaktivität von 65% besitzt (siehe Tabelle 8.14, Eintrag
27).
80
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Konzentration [mM]
Lk-ADH ger.
RR-ADH (RE)
Abbildung 4.41 Einfluss von Phenylboronsäure (Puffer pH 7)
4.4.8.2.3
Aktivitätsbestimmung der gereinigten ADH aus L. kefir in Abhängigkeit
vom pH-Wert
Im Hinblick auf die Tandemreaktion wurde auch die Enzymaktivität in Puffer pH 8.0 bzw. in
Natriumhydrogencarbonat-Lösung
pH 8.3
bestimmt,
um
die
Enzymmenge
in
der
enzymatischen Reduktion bzw. der darauffolgenden Eintopfreaktion auf den pH-Wert, der
nach der Suzuki-Kupplung erwartet wird, anzupassen. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte
wiederum über die Verfolgung der Extinktionsabnahme des Cofaktors NADPH. Die pHAbhängigkeit der Aktivität der gereinigten ADH aus L. kefir wurde analog AAV 12 mit
Acetophenon (33) als Substrat untersucht. Die Ergebnisse sind exemplarisch für eine
Enzymcharge in Tabelle 4.18 zusammengefasst. Weitere Messungen sind in Abschnitt
8.2.2.10.2 dargestellt.
Aus Tabelle 4.18 ist deutlich ersichtlich, dass die Aktivität der gereinigten ADH mit
steigender Basizität des Reaktionsmediums abnimmt. Mit 56 und 36% relativer Aktivität bei
pH 8 bzw. pH 8.3 zeigt die gereinigte ADH aus L. kefir im Photometer eine vergleichbare
pH-Abhängigkeit der Aktivität wie der Rohextrakt (siehe Tabelle 4.8).
81
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tabelle 4.18 Aktivität der gereinigten ADH aus L. kefir in Abhängigkeit vom pH-Wert
a)
4.4.8.3
Eintrag a)
Charge
Wässriges Medium
Relative Aktivität [%]
1
11
Puffer pH 7 (50 mM)
100
2
11
Puffer pH 8 (200 mM)
56
3
11
NaHCO3 pH 8.3(97 mM)
36
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.02 ml, d = 1 cm f = 200
Enzymatische Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5 mit gereinigter ADH
aus L. kefir
Die Aktivität der gereinigten ADH sowie ihre Eigenschaften bezüglich der pH-Abhängigkeit
und dem Einfluss verschiedener Additive auf die Aktivität wurde bereits in Abschnitt 4.4.8.2
näher untersucht. Vor Anwendung der gereinigten ADH in einer Tandemreaktion, wird
zunächst mit partiell gereinigter ADH aus L. kefir die enzymatische Reduktion von
4‘-Phenylacetophenon (5) analog AAV 13 durchgeführt. Die Regenerierung des während der
enzymatischen Reduktion verbrauchten Cofaktors NADPH erfolgt in situ mittels Isopropanol
(substratgekoppelte Cofaktorregenerierung; siehe Abbildung 4.9).
In der biokatalytischen Umsetzung von 4‘-Phenylacetophenon (5) zum Alkohol (R)-6 weist
die gereinigte ADH aus L. kefir stark unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zum
Rohextrakt auf (vgl. Tabelle 4.10). Mit keiner der verwendeten Enzymchargen konnte ein
vollständiger Umsatz erreicht werden. Mit gereinigter ADH blieben die Umsätze von 20-63%
bezüglich der Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (5) in NaHCO3-Lösung (pH 8.3) trotz
Anpassung der Aktivität und Enzymmengen weit hinter den Umsätzen von üblicherweise bis
zu ≥95%, die mit dem Rohextrakt der ADH aus L. kefir für die Reduktion von Keton 5 in
50 mM
Phosphatpuffer
pH 7
erzielt
wurden,
zurück.
Die
Umsetzung
von
4‘-Phenylacetophenon (5) mit gereinigter ADH aus L. kefir in 50 mM Phosphatpuffer pH 7
(siehe Tabelle 4.19, Eintrag 3) brachte eine Steigerung des Umsatz von 35% auf 54%.
82
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Dieser liegt aber deutlich niedriger als mit dem Rohextrakt der ADH aus L. kefir. Dies deutet
auf Stabilitätsprobleme des Enzyms unter Reaktionsbedingungen hin. Das Phänomen der
geringen Stabilität gereinigter Enzyme ist bereits in der Literatur beschrieben.[90] Die
Enantioselektivität der Reaktion war mit >99% ee stets exzellent.
Tabelle 4.19 Biotransformationen mit verschiedenen Chargen gereinigter Lk-ADH
Enzymmenge
Umsatz
ee-Wert
[% (v/v)]
[%]
[%]
i-PrOH / NaHCO3 (97 mM aq)
18.7 a)
63
>99
2
i-PrOH / NaHCO3 (97 mM aq)
8.7 b)
35
>99
3
i-PrOH / Puffer pH 7
3.3 c)
54
>99
4
i-PrOH / NaHCO3 (97 mM aq)
7.3 d)
20
>99
Eintrag
Wässriges Medium
1
a)
118 U/mmol ADH aus L. kefir Charge 9 bezogen auf NaHCO3 (aq);
Charge 10 bezogen auf NaHCO3 (aq);
pH 7;
d)
c)
b)
118 U/mmol ADH aus L. kefir
118 U/mmol ADH aus L. kefir Charge 10, bezogen auf Puffer
118 U/mmol ADH aus L. kefir Charge 11 bezogen auf NaHCO3 (aq)
Obwohl kein vollständiger Umsatz bei der Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon (5) erreicht
wurde, soll unter Verwendung von 118 U/mmol gereinigter ADH aus L. kefir (Aktivität
bezogen auf Keton 5 in Natriumydrogencarbonat-Lösung pH 8.3) die Tandemreaktion
durchgeführt werden. Auf Grund der Photometertests und der darin bestimmten relativen
Aktivitäten für 4‘-Iodacetopenon (4) und 4‘-Phenylacetophenon (5) ist davon auszugehen,
dass die Tandemreaktion überwiegend über den Weg B, enzymatische Reduktion von
4‘-Iodacetophenon (4) und anschließender Suzuki-Kupplung, ablaufen wird. Für die
enzymatische Reduktion von Keton 4 wird eine deutlich niedrigere Enzymmenge benötigt als
für die Reduktion des Kupplungsprodukts 5.
83
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Eine Untersuchung zur Verbesserung der Stabilität der gereinigten ADH aus Lactobacillus
kefir bietet sich für weitere separate Arbeiten an. Es gibt hauptsächlich zwei Methoden zur
Verbesserung der Enzymstabilität: zum Einen durch Immobilisierung, Cross-linking oder
chemische
Modifikation
der
Enzyme
und
zum
Anderen
durch
Zugabe
löslicher
Komponenten.[111] Im Fall von Lipasen sind verschiedene das Enzym stabilisierender
Reagenzien bekannt, die die Reaktionsgeschwindigkeit oder die Enantioselektivität
verbessern. So können Polyalkohole wie zum Beispiel Zucker oder Glycerol Proteine
stabilisieren.[90,112]
Kleine
polare
Moleküle
wie
DMF
erhöhen
die
Reaktionsgeschwindigkeit.[90,113] Auch die Zugabe von Salzen wie LiCl, NaCl oder
KCl,[90,114] oder schwacher organischer Basen (z.B. Triethylamin oder Pyridin) kann die
Reaktionsgeschwindigkeit verbessern [90,115,116]. Im Fall von Alkoholdehydrogenasen gibt
es keine spezifischen Angaben zur Verbesserung der Enzymstabilität. Es empfiehlt sich zu
prüfen, ob einige der Methoden zur Verbesserung der Stabilität von Lipasen auch auf
Alkoholdehydrogenasen übertragen werden können.
4.4.8.4
Durchführung der Tandemreaktion unter Verwendung partiell gereinigter
ADH aus L. kefir
Da reines Protein die Suzuki-Kupplung nur verlangsamt und nicht inhibiert (siehe
Abschnitt 4.4.8.1), wurde zur Realisierung der Tandemreaktion ein möglichst reines Enzym
verwendet, das nach Möglichkeit nur das Protein der ADH enthält. Im Folgenden wurde
deshalb eine partiell gereinigte ADH aus Lactobacillus kefir zur Verfügung gestellt. Die
Durchführung der Tandemreaktion unter Verwendung von gereinigter ADH aus L. kefir und
Natriumhydrogencarbonat als Base erfolgte analog AAV 18, wobei alle für die beiden
Reaktionen benötigten Komponenten zu Beginn vorliegen.
Abbildung 4.42 Tandemreaktion mit gereinigter ADH aus L. kefir
84
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.8.4.1
Die
Proof of Concept
Kombination
Tandemreaktion
von
Suzuki-Kupplung
wurde
analog
und
AAV 18
enzymatischer
unter
Reduktion
in
einer
Substrat-gekoppelter
in
situ
Cofaktorregenerierung mit Isopropanol durchgeführt. Die ADH aus L. kefir wurde als partiell
gereinigtes Enzym eingesetzt. Das zugesetzte Enzymvolumen von 2.3 ml entspricht einer
Aktivität von 118 U/mmol bezogen auf 4‘-Phenylacetophenon (5) im Reaktionsmedium
(Natriumhydrogencarbonatlösung pH 8.3).
Abbildung 4.43 Proof of Concept der Tandemreaktion mit gereinigter ADH aus L. kefir
Nach einer Reaktionszeit von 64 Stunden war das Substrat 4‘-Iodacetophenon (4) quantitativ
umgesetzt worden. Als Hauptprodukt entstand mit einem Anteil von 78% der Alkohol 29. Als
weiteres Produkt wurde im
1
H-NMR-Spektrum das Kupplungsprodukt 5 mit <5%
nachgewiesen. Der Anteil des Zielprodukts (R)-6 betrug 19%. Es wurde mit exzellenter
Enantioselektivität von >99% ee gebildet.
Mittels Substitution des Rohextraktes durch partiell gereinigte ADH aus L. kefir kann die
Tandemreaktion auch in Gegenwart großer Enzymmengen durchgeführt werden, ohne dass
die Basenmenge erhöht werden musste um Kupplungsprodukte und insbesondere das
Zielprodukt (R)-6 zu erhalten.
85
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.8.4.2
Kontrollexperiment (Verdünnung)
Unter Verwendung der partiell gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir war es möglich, die
Tandemreaktion zu realisieren. Mit bis zu 18.7% (v/v) gereinigtem Enzym wurde hier ein
deutlich höheres Volumen eingebracht als in den Experimenten zur Suzuki-Kupplung in
Gegenwart von Rohextrakt als Additiv.
Um auszuschließen, dass der niedrige Kupplungsanteil in der Tandemreaktion von 3%
4‘-Phenylacetopenon
(5)
und
19%
(R)-1-(4-Phenyl)ethanol
((R)-6)
auf
einen
Verdünnungseffekt durch den Puffer des Enzyms zurückzuführen ist, wurde analog AAV 19
die Suzuki-Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) mit Phenylboronsäure (19) in
einem Gesamtvolumen von 12.3 ml und einer Zusammensetzung des Reaktionsgemisches
die dem der Tandemreaktion in Abbildung 4.43 entspricht durchgeführt. Der dabei erzielte
Umsatz von 85% liegt im Bereich der bisher erzielten Umsätze unter Standardbedingungen.
Damit kann die Erhöung der Verdünnung als Ursache für einen erniedrigten Umsatz von
(R)-29 zu (R)-6 in der Tandemreaktion ausgeschlossen werden.
Abbildung 4.44 Kontrollexperimente bzgl. des Verdünnungseffekts
Analog AAV 19 wurde auch die Suzuki-Kupplung von 4‘-Iodacetophenon (4) mit
Phenylboronsäure (19) auf Verdünnungseffekte untersucht. Das Produkt 5 wurde mit einem
Umsatz von >95% erhalten. Damit konnte gezeigt werden, dass auch hier der niedrigere
Kupplungsanteil nicht auf
den Verdünnungseffekt
durch das eingebrachte große
Enzymvolumen zurückzuführen ist. Eine weitere Ursache für niedrige Kupplungsanteile in
der Tandemreaktion könnte eine hohe Proteinkonzentration sein.
86
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.4.8.4.3
Einfluss der Proteinmenge
Der Proof of Concept zur Kombination von Suzuki-Kupplung und enzymatischer Reduktion
mit gereinigtem Enzym in einer Tandemreaktion wurde bereits in Abschnitt 4.4.8.4.1
erbracht. Im Folgenden soll dieses Reaktionssystem eingehender charakterisiert werden und
ggf. auf seine Limitierungen untersucht werden.
Zunächst sollte evaluiert werden, ob die Variation der ADH-Chargen einen Einfluss auf die
Reproduzierbarkeit haben. Dies erfolgt analog AAV 18 unter Verwendung von 184 U/mmol
gereinigter ADH aus L. kefir. Die 184 U/mmol werden bezogen auf die Aktivität der ADH für
4‘-Phenylacetophenon (5) in Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 8.3). Abhängig von der
Aktivität der verwendeten Enzymcharge wurden damit bis zu 86 mg Protein in das
Reaktionsmedium eingebracht.
Tabelle 4.20 Reproduzierbarkeit der Tandemreaktion
Eintrag
a)
Proteinkonzentration
ADH aus L. kefir
Umsatz [%]
ee-Wert
[mg/ml] a)
[ml]
[% (v/v)]
4
5
29
6
von 6[%]
1
90
0.95 a)
8.7
-
3
62
35
>99
2
55
0.78 a)
7.3
-
13
42
45
>99
die Proteinkonzentration wurde am FZ Jülich mittels Bradfordtest bestimmt
Vergleicht man die Einträge 1 und 2 in Tabelle 4.20 so sieht man, dass die Umsätze in der
Tandemreaktion stark schwanken, je nachdem welche Enzymcharge verwendet wurde. In
Abschnitt 4.4.8.4.2 wurde mittels Kontrollexperiment bereits ausgeschlossen, dass dies auf
Verdünnung durch das Enzym zurückzuführen ist. Betrachtet man die mit dem Enzym
eingebrachte Proteinmenge, so ist eindeutig ein Trend zu erkennen: wird bei gleicher
Aktivität (118 U/mmol) mehr Protein in das Reaktionsmedium eingebracht, so nimmt der
Kupplungsanteil ab. In Gegenwart von 86 mg Protein wurden 35% Zielprodukt (R)-6 und 3%
87
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Kupplungsprodukt 5 gebildet (Tabelle 4.20, Eintrag 1). In Gegenwart von 43 mg Protein
erhöhte sich der Anteil zum Zielprodukt (R)-6 auf 45% und der des Kupplungsprodukts 5 auf
13% (Eintrag 2). Diese Ergebnisse korrelieren mit den Beobachtungen in Abschnitt 4.4.8.1.2.
Es ist bemerkenswert, dass der Anteil der enzymatischen Reduktion in der Tandemreaktion
höher
ist
als
der
Umsatz
in
der
isolierten
enzymatischen
Reduktion
von
4‘-Phenylacetophenon (5) unter Verwendung derselben Enzymmenge und Charge (vgl.
Ergebnisse in Tabelle 4.19). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zumindest bei
großen Enzymmengen die Reaktion überwiegend über die Reduktion von 4‘-Iodacetophenon
und die anschließende Kupplung des Alkohols 29 mit Phenylboronsäure (19) zum Produkt
(R)-6 verläuft (Weg B in Abbildung 4.20). Damit ist der in der Eintopfreaktion maximal
erzielbare Umsatz zum Produkt (R)-6 auf rund 86% limitiert (vgl. Eintopfreaktion Sequenz B
in Abschnitt 4.4.7.1.2).
Die Ansätze in Tabelle 4.20 wurden mit unterschiedlichen Enzymchargen durchgeführt.
Darüber hinaus wurden analog AAV 18 Ansätze mit einer Enzymcharge durchgeführt, wobei
durch Variation der Enmzymmenge gezielt unterschiedliche Mengen an Protein eingebracht
wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.21 zusammengefasst.
Tabelle 4.21 Einfluss der Enzym- bzw. Proteinmenge auf die Produktverteilung
a)
Umsatz [%]
Enzymmenge
Proteinmenge
[ml]
[mg]
4
5
29
6
1
0.95 a)
86
-
3
62
35
>99
2
0.475 b)
43
-
12
42
47
>99
3
0.34 c)
31
-
17
27
56
>99
Eintrag
ee-Wert von (R)-6 [%]
184 U/mmol gereinigte ADH aus L. kefir bezogen auf 5 in NaHCO3 (aq) pH 8.3;
gereinigte ADH aus L. kefir bezogen auf 5 in NaHCO3 (aq) pH 8.3;
L. kefir bezogen auf 5 in Puffer pH 7
88
c)
b)
59 U/mmol
184 U/mmol gereinigte ADH aus
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Unabhängig von der verwendeten Enzymmenge konnte kein Edukt 4 mehr im 1H-NMRSpektrum
nachgewiesen
werden.
D.h.
es
wurde
entweder
unter
Kupplung
mit
Phenylboronsäure (19) zu 4‘-Phenylacetophenon (5) oder unter enzymatischer Reduktion
zum Alkohol 29 umgesetzt. Unter Verwendung von 0.95 ml gereinigter ADH aus L. kefir
(184 U/mmol bezogen auf Keton 5 in Natriumhydrogencarbonatlösung pH 8.3) verlief die
enzymatische Reduktion vollständig. Im
reduziertes
Kupplungsprodukt
5
1
H-NMR-Spektrum konnten lediglich 3% nicht
beobachtet
werden.
Als
Hauptprodukt
wurde
1-(4-Iodphenyl)ethanol 29 mit einem Anteil von 62% erhalten. Für das Zielprodukt (R)-6
wurde ein Umsatz von 35% beobachtet (siehe Tabelle 4.21, Eintrag 1).
Je weniger gereinigtes Enzym und damit verbunden weniger Protein in der Tandemreaktion
eingesetzt wurde, desto größer wurde der Anteil am Zielprodukt (R)-6, wobei auch der Anteil
an Kupplungsprodukt 5 zunahm. Dieses Ergebnis bestätigt die bereits beschriebene
Beobachtung, dass die Suzuki-Kreuzkupplung in Gegenwart von mehr Protein langsamer
verläuft (siehe Tabelle 4.15) und, dass die enzymatische Reduktion in Gegenwart von
weniger Enzym langsamer verläuft. Ein nahezu vollständiger Umsatz in der enzymatischen
Reduktion konnte nur erzielt werden, wenn 118 U/mmol gereinigte ADH aus L. kefir bezogen
auf die Aktivität für 4‘-Phenylacetophenon (5) in Natriumhydrogencarbonatlösung pH 8.3
eingesetzt wurden (sieheTabelle 4.21, Eintrag 1).
Für die Tandemreaktion ist also eine ADH mit möglichst hoher spezifischer Aktivität [U/mg]
von entscheidendem Vorteil. Alternativ soll im Folgenden Abschnitt untersucht werden, ob
die Suzuki-Kupplung, insbesondere in Gegenwart großer Enzymmengen, durch eine
Erhöhung der Katalysatormenge (PdCl2 / TPPTS) begünstigt werden kann.
4.4.8.4.4
Einfluss des Palladiumkatalysators
Die Einträge 1-3 in Tabelle 4.20 zeigen, dass nach einer Reaktionszeit von 64 Stunden noch
ein großer Anteil an 1-(4-Iodphenyl)-ethanol (29) vorhanden ist, der nicht mittels SuzukiKupplung zum Produkt (R)-6 umgesetzt wurde. Könnte man den Alkohol 29 mit
Phenylboronsäure (19) vollständig kuppeln, so könnte man einen Umsatz von mehr als 90%
zum Produkt (R)-6 erzielen. Da bereits bekannt ist, dass die Suzuki-Kupplung des Alkohols
29 weniger effizient verläuft als die des Ketons 4 mit Phenylboronsäure (19) (vgl. Tabelle 4.2
und Tabelle 4.4), soll untersucht werden, ob der Gesamtumsatz zum Produkt (R)-6
89
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
verbessert werden kann, indem man zu Beginn der Reaktion bereits die Menge des
Palladiumkatalysators erhöht. Die Durchführung erfolgte analog AAV 18 unter Variation der
eingestzten Mengen an Palladiumchlorid und TPPTS. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.22
zusammengestellt.
Tabelle 4.22 Einfluss des Palladiumkatalysators auf die Produktverteilung in der
Tandemreaktion
Zeit
[mg]
[h]
4
5
29
6
(R)-6 [%]
5 mol%
86 a)
168
-
9
30
61
>99
8 mol%
10 mol%
86 a)
168
-
13
23
64
>99
3
4 mol%
5 mol%
31 b)
64
-
17
27
56
>99
4
8 mol%
10 mol%
31 b)
64
-
95
5
-
-
PdCl2
TPPTS
1
4 mol%
2
a)
Umsatz [%]
Proteinmenge
Eintrag
118 U/mmol bezogen auf 5 in 97 m NaHCO3 (aq),
b)
ee-Wert von
118 U/mmol bezogen auf 5 in Puffer pH 7
In Gegenwart von 118 U/mmol ADH aus L. kefir bezogen auf 5 in Natriumhydrogencarbonatlösung pH 8.3 und einer Reaktionszeit von 168 Stunden zeigte die Verdoppelung
der Katalysatormenge nur einen leichten Einfluss auf die Produktverteilung (vgl. Einträge 1
und 2 in Tabelle 4.22). Es wurden 61 bzw. 64% Alkohol (R)-6 gebildet. Ein Unterschied von
3%-Punkten im Umsatz liegt innerhalb der Messschwankungen zur Umsatzbestimmung
mittels 1H-NMR-Spektroskopie. Es änderte sich das Verhältnis des Kupplungsprodukts 5
zum Reduktionsprodukt 29 von rund 1 : 3 auf 1 : 2. Wie zu erwarten, war der Anteil an 5 bei
doppelter Katalysatormenge etwas höher. In Gegenwart von 118 U/mmol ADH aus L. kefir
bezogen auf 5 in 50 mM Phosphatpuffer pH 7 wirkt sich die Verdoppelung der
Katalysatormenge wesentlich stärker auf die Produktverteilung aus (siehe Eintrag 3 und 4 in
Tabelle
4.22).
Während
bei
Durchführung
der
Tandemreaktion
bei
einfacher
Katalysatormenge noch 56% Umsatz zum Zielprodukt (R)-6 beobachtet werden konnten,
90
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
wurde bei doppelter Katalysatormenge überhaupt kein Zielprodukt (R)-6 im
1
H-NMR-
Spektrum nachgewiesen. Es fand kaum enzymatische Reduktion statt. Hauptprodukt, mit
einem Anteil von 95%, war das Kupplungsprodukt 5. Als einziges Nebenprodukt wurde 5%
zum Alkohol 29 reduziertes 4‘-Iodacetophenon gebildet. Das Kupplungsprodukt 5 wurde gar
nicht reduziert und trotz doppelter Katalysatormenge fand keine Kupplung des gebildeten
1-(4-Iodphenyl)ethanol (29) mit Phenylboronsäure (19) statt. Dieser Vergleich wurde bei
kürzerer Reaktionszeit von 64 Stunden durchgeführt. Eine Verlängerung der Reaktionszeit
würde unter den Bedingungen in Eintrag 4 den Anteil des Zielprodukts (R)-6 nicht erhöhen,
da davon auszugehen ist, dass die ADH aus L. kefir nach 64 Stunden ihre Aktivität
vollständig
verloren
hat.
Im
Gegensatz
dazu
zeigt
das
Katalysatorsystem
aus
Palladiumchlorid und TPPTS auch nach mehr als 64 Stunden noch Aktivität.
4.4.8.4.5
Einfluss der Reaktionszeit
In Abschnitt 4.4.8.4.4 wurde bereits festgestellt, dass das aus Palladiumchlorid und TPPTS
bestehende Katalysatorsystem nach mehr als 64 Stunden noch aktiv ist. Deshalb wurde nun
der Einfluss der Reaktionszeit untersucht werden. Dies erfolgte analog AAV 18 unter
Verwendung einer neuen Enzymcharge und einer Enzymmenge, die einer Aktivität von
118 U/mmol
ADH
aus
L. kefir
bezogen
auf
4‘-Phenylacetopenon
(5)
in
Natriumhydrogencarbonatlösung pH 8.3 entspricht. Die Ergebnisse der Tandemreaktion
unter Variation der Reaktionszeit sind in Tabelle 4.23 zusammengefasst.
Nach
einer
Reaktionszeit
von
64
Stunden
wurde
im
1
H-NMR-Spektrum
eine
Produktverteilung von 13% 4‘-Phenylacetophenon (5), 42% 1-(4-Iodphenyl)ethanol (29) und
45% Zielprodukt (R)-6 bestimmt. Eine Verlängerung der Reaktionszeit von 64 auf 168
Stunden (1 Woche) brachte eine Verbesserung des Umsatzes in Bezug auf die SuzukiKreuzkupplung. Im 1H-NMR-Spektrum konnte das Zielprodukt (R)-6 mit einem Anteil von
66% am Gesamtumsatz nachgewiesen werden. Als Nebenprodukte wurden mit 6% das
Kupplungsprodukt 5 und das Reduktionsprodukt 29 mit 28% nachgewiesen. Das verwendete
Katalysatorsystem aus Palladiumchlorid und TPPTS ist selbst nach mehr als 3 Tagen noch
aktiv. Eine weitere Verlängerung der Reaktionszeit von 168 auf 329 Stunden brachte keine
signifikante Verbesserung. Das Produkt (R)-6 wurde mit 70% erhalten. Der Alkohol (R)-6
wurde stets mit exzellenter Enantioselektivität von >99% ee erhalten.
91
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tabelle 4.23 Einfluss der Reaktionszeit auf die Produktverteilung in der Tandemreaktion
a)
Umsatz [%]
Eintrag a)
Zeit [h]
1
ee-Wert von (R)-6 [%]
4
5
29
6
64
-
13
42
45
>99
2
168
-
6
28
66
>99
3
329
-
4
26
70
>99
118 U/mmol bezogen auf 5 in NaHCO3 (aq) pH 8.3
Mit Hilfe der gereinigten ADH aus L. kefir konnte gezeigt werden, dass die Durchführung
einer Tandemreaktion in der eine enzymatische Reduktion mit einer Palladium-katalysierten
Kreuzkupplung kombiniert wird, möglich ist. Dies ist vermutlich auf den pH-Wert des Enzyms
zurückzuführen. Durch die gereinigte ADH wird das wasserlösliche Katalysatorsystem aus
Palladiumchlorid und TPPTS nicht mehr so stark verlangsamt. Gleichzeitig erlaubt dieses
Katalysatorsystem die Durchführung der Suzuki-Kupplung in einer Tandemreaktion in
wässrigem Medium bei Raumtemperatur in schwach basischem Medium (pH 8.3). In der
Tandemreaktion konnte das Zielprodukt (R)-6 mit einem Umsatz von bis zu 70% erhalten
werden.
4.4.9
Überführung des chiralen Alkohols 6 in das korrespondierende
Amin 7 in einer Substitutionsreaktion
Der mittels Kombination von Suzuki-Kreuzkupplung und Biotransformation hergestellte
chirale Alkohol (S)- bzw. (R)-6, dessen Stereozentrum durch enzymatische Reduktion
aufgebaut wurde, sollte mittels einer klassisch chemischen Reaktion unter Inversion des
92
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Stereozentrums in das korrespondierende Amin 7 überführt werden. Zunächst erfolgte die
Umsetzung des chiralen Alkohols 6 in einer SN2-Reaktion unter Mitsunobu-Bedingungen mit
Phthalimid als Nukleophil. Anschließend sollte die Schutzgruppe mit Hydrazin abgespalten
werden. Diese Methode wurde bereits von Ortiz-Marciales et al. auf β-Hydroxyether
angewandt.[72]
Abbildung 4.45 Überführung des Alkohols 6 in das chirale Amin 7
4.4.9.1
Mitsunobu-Reaktion
Zunächst wurde analog AAV 20 der racemische Alkohol rac-6 in einer SN2-Reaktion unter
Mitsunobu-Bedingungen (DIAD, PPh3) mit Phthalimid als Nukleophil umgesetzt. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4.24 zusammengefasst.
Bei der Substitution am Alkohol rac-6 durch Phthalimid in absolutem THF wurden gute bis
sehr gute Umsätze erzielt (teilweise >95%). Nach säulenchromatographischer Reinigung
konnte das Produkt rac-28 mit bis zu 56% isoliert werden. Unabhängig von der stationären
Phase und dem Eluent wurde neben dem Produkt rac-28 auch das Edukt rac-6 isoliert, auch
wenn letzteres im 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts nicht mehr nachzuweisen war (siehe
Abbildung 4.46).
93
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tabelle 4.24 Umsetzung von rac-6 mit Phthalimid in einer SN2-Reaktion
OH
1.5 Äq Phthalimid
1.5 Äq PPh3
1.5 Äq DIAD
O
O
N
THF abs.
24 h
rac-6
rac-28
Ausbeute
Eintrag
Umsatz
Stationäre Phase
Lösungsmittel (v/v)
1
95%
Kieselgel
Pentan:DCM 1:3
2
92%
Kieselgel
3
>95%
Kieselgel ohne Sand
4
>95%
Basisches AlOx
a)
6
28
44%
39%
56%
42%
Pentan:DCM 1:3
24%
45%
Hexan:DCM 1:3
n.b. a)
45%
Pentan:DCM 1:3, 0.2%
DEA
nicht bestimmt
Die Umsatzbestimmung erfolgte über die Signale der CH3-Gruppen von Edukt 6 und Produkt
28, da dies die einzigen Signale von Edukt und Produkt waren, die eindeutig zuzuordnen
sind und nicht mit den Signalen der anderen Reagenzien zusammenfallen. In Abbildung
4.46 ist das
1
H-NMR-Spektrum des Rohprodukts rac-28 abgebildet. Der für die
Umsatzbestimmung relevante Bereich ist zudem vergrößert dargestellt. Im
1
H-NMR-
Spektrum des Rohprodukts ist deutlich das Dublett der CH3-Gruppe des Produkts 28 bei
1.95 ppm zu sehen, während das Dublett der CH3-Gruppe des Edukts rac-6 bei 1.53 ppm
kaum mehr nachweisbar ist. Die Integration der beiden Signale ergibt ein Verhältnis von 5:95
Edukt 6 zu Produkt 28. Zur Veranschaulichung ist in Abbildung 4.47 das 1H-NMR-Spektrum
des gereinigten Produkts 28 und in Abbildung 4.48 das 1H-NMR-Spektrum des sauberen
Edukts 6 abgebildet.
94
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Abbildung 4.46 1H-NMR-Spektrum des Rohprodukts 28
Abbildung 4.47 1H-NMR-Spektrum des gereinigten Produkts 28
Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass das Produkt 28 auf der Säule
hydrolisiert und man auf diesem Weg das Edukt erhält. Um diese Annahme zu überprüfen,
wurde das bereits saubere Produkt rac-28 erneut gesäult. Dabei konnte kein Alkohol 6
isoliert werden. Es wurde lediglich das Substitutionsprodukt 28 isoliert. Auch ein HPLC-
95
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Chromatogramm der Verbindung rac-28 konnte ohne Probleme aufgenommen werden.
Diese Untersuchungen deuten darauf hin, dass das Produkt 28 auf der Säule stabil ist. Die
Umsetzung des chiralen Alkohols (S)-6 mit Phthalimid unter Mitsunobu-Bedingungen lieferte
neue Hinweise. Nach säulenchromatographischer Reinigung wurde neben 48% Produkt
(R)-28 mit einem ee-Wert von 95% der eingesetzte chirale Alkohol 6 als Racemat isoliert
(siehe Tabelle 4.25, Eintrag 1).
Abbildung 4.48 1H-NMR-Spektrum des Edukts 6
Eine
Erklärung
für
den
Erhalt
des
Edukts
als
Racemat
rac-6
nach
säulenchromatographischer Reinigung eines Ansatzes, in dem der Alkohol (S)-6 in
enantiomerenreiner Form eingesetzt wurde, ist die teilweise Eliminierung von Wasser aus
dem chiralen Alkohol 6. Dabei entsteht 4‘-Phenylstyrol 38. Wird während der Aufarbeitung
ohne Schutzatmosphäre wieder Wasser addiert, entsteht der Alkohol 6 als Racemat (siehe
Abbildung 4.49).
Abbildung 4.49 Eliminierung und Addition von Wasser an Alkohol 6
96
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Eine ähnliche Beobachtung wurde bereits von Scott et al. beschrieben. Der sekundäre
Alkohol 39 reagierte unter Mitsunobu-Bedingungen mit Phthalimid als Nukleophil unter
Eliminierung zu einem olefinischen Nebenprodukt.[117]
Abbildung 4.50 Alkohol 39
Eine Möglichkeit die Probleme in der Mitsunobu-Reaktion von 6 zu umgehen, besteht in der
Verwendung anderer Nukleophile. Scott et al. setzten den Alkohol 39 mit DIAD,
Triphenylphosphin, DPPA (Diphenylazidophosphat) und Hünig-Base zum intermediären Azid
um. Mittels Staudinger Reduktion wurde dann das Amin als Hydrochlorid mit 91% ee
erhalten. Allerdings ist dieser Prozess mit Vorsicht zu betrachten, da dabei giftige und
explosive
Stickstoffwasserstoffsäure
(HN3)
sowie
stöchiometrische
Mengen
eines
organischen Azid-Intermediats entstehen.[117-119]
Für die Umsetzungen des chiralen Alkohols 6 zum chiralen Produkt 28 wurde deshalb
weiterhin die nukleophile Substitution unter Mitsunobu-Bedingungen mit Phthalimid als
Nukleophil durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.25 zusammengefasst.
Das chirale Produkt (S)-28 konnte mit 47% und mit einem ee-Wert von 95% isoliert werden.
Das enantiomere Produkt (R)-28 konnte mit bis zu 38% und einem ee-Wert von 98% isoliert
werden.
Im Folgenden soll die Schutzgruppe mittels Hydrazinolyse abgespalten werden, um das freie
Amin 7 zu erhalten.
97
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
Tabelle 4.25 Umsetzungen zum chiralen Produkt 28
Ausbeute [%]
4.4.9.2
Eintrag
Edukt
1
2
ee-Wert [%]
6
28
6
28
(S)-1-(4-Biphenyl)ethanol
28
47
2
95 (R)
(R)-1-(4-Biphenyl)ethanol
24
38
0
98 (S)
Hydrazinolyse
Wie in Abschnitt 4.3 beschrieben, soll das Mitsunobu-Produkt 28 in einem weiteren Schritt
mittels Hydrazinolyse in das freie Amin 7 überführt werden (siehe Abbildung 4.51). Die
Durchführung erfolgte analog AAV 21.
Abbildung 4.51 Hydrazinolyse von 2-(1-(4-Biphenyl)ethyl)isoindolin-1,3-dion 28
Durch Entschützen des racemischen Mitsunobu-Produkts rac-28 mit Hydrazin (1 M in Toluol)
konnte das freie Amin zunächst in einer Ausbeute von 59% erhalten werden. Durch das
Überführen des Produkts in die wässrige Phase und anschließendes Extrahieren mit MTBE
98
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
ging Produkt verloren. Dies ist auf die schlechte Löslichkeit des Produkts in MTBE
zurückzuführen. Durch das Aufnehmen des Produkts aus dem einrotierten trockenen
Rohprodukt in Chloroform und Abfiltrieren des unlöslichen Feststoffs (40) konnte das
saubere Produkt rac-7 mit 86% isoliert werden (siehe Abbildung 4.52).
Abbildung 4.52 Synthese von rac-7 mittels Hydrazinolyse
Alternativ wurde hierzu das Entschützen mit Hydrazinhydrat in Ethanol durchgeführt. Das
chirale Amin (S)-7 mit 13% Ausbeute und einem ee-Wert von 98% erhalten (siehe
Abbildung 4.53).
Abbildung 4.53 Synthese von (S)-7 mittels Hydrazinolyse
Durch eine weitere Optimierung der Aufarbeitung kann die Ausbeute des chiralen Amins mit
Sicherheit noch verbessert werden. Der ee-Wert des Produkts (S)-7 ist mit 98% bereits sehr
gut.
99
KOMBINATION VON PALLADIUMKATALYSE UND BIOKATALYSE
4.5
Zusammenfassung des Teilkapitels
Das wasserlösliche Katalysatorsystem, das aus den kommerziell erhältlichen Verbindungen
Palladiumchlorid und TPPTS hergestellt wurde, erwies sich nicht nur als höchst effizient für
die Kupplung von Phenylboronsäure (19) und 4‘-Iodacetophenon (4) in wässrigem Medium,
sondern auch als äußerst kompatibel in der Kombination mit einer Biotransformation in einer
Eintopfreaktion. Die gewünschten Biarylalkohole 6 wurden mit hohen Umsätzen von bis zu
>95%, in guten isolierten Ausbeuten (72%) und exzellenter Enantioselektivität von >99%
erhalten. Besonders bemerkenswert ist, dass sowohl die Palladium-katalysierte SuzukiKupplung als auch die enzymatische Reduktion bei Raumtemperatur ablaufen. Unter
Verwendung der schwachen Base Natriumhydrogencarbonat konnten die beiden Reaktionen
nicht nur in demselben Reaktionsmedium und bei derselben Reaktionstemperatur
(Raumtemperatur) durchgeführt werden, daüber hinaus war es nun nicht mehr notwendig vor
Enzymzugabe den pH-Wert zu adjustieren. Der chirale Biarylalkohol 6 wurde unter diesen
Bedingungen mit einem Umsatz von 93% und exzellenter Enantioselektivität von >99%
erhalten. Unter diesen Reaktionsbedingungen konnten die Suzuki-Kupplung und die
enzymatische Reduktion in einer Tandemreaktion, bei der alle für die beiden Reaktionen
benötigten Komponenten von Beginn an vorliegen und beide Reaktionen gleichzeitig
ablaufen können, kombiniert werden. Das Zielprodukt, der chirale Biarylalkohol 6 wurde
dabei mit gutem Umsatz von bis zu 70% und exzellenter Enantioselektivität von >99%
gebildet.
Anschließend wurde der Biarylalkohol 6 mittels einer Substitutionsreaktion unter Inversion
des Stereozentrums und anschließender Hydrazinolyse in das chirale Amin 7 überführt. Im
ersten Reaktionsschritt, der Substitution mit Phthalimid unter Inversion wurden sehr gute
Umsätze von 92 - >95% bestimmt. Das chirale Produkt 28 wurde in mäßigen Aubeuten von
38 - 47% in hoher Enantiomerenreinheit von bis zu 98% ee isoliert. Nach Hydrazinolyse
wurde das Biarylamin 7 mit bis zu 86% Ausbeute erhalten. Für das chirale Produkt (S)-7
wurde mittels chiraler HPLC ein ee-Wert von 98% bestimmt.
100
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5
Enzymatische Oxidation natürlicher Aminosäuren zu
α-Ketosäuren
5.1
Einleitung
Chirale Aminosäuren stellen nicht nur interessante Produkte dar, sondern auch wichtige
Synthesebausteine
zur
Herstellung
pharmazeutisch
relevanter
Verbindungen,
den
α-Ketosäuren. Mittels Oxidation können die α-Aminosäuren in ihre Stickstoff-freien Derivate,
die α-Ketosäuren überführt werden.[10]
Aminsäuren sind einfach zugänglich. In der Natur kommen mehr als 500 verschiedene
Aminosäuren vor. Davon reichen 20 Aminosäuren aus, um die Proteine aller Organismen
aufzubauen, die sogenannten proteinogenen Aminosäuren. Acht Aminosäuren davon kann
der Körper nicht selbst synthetisieren, die essentiellen Aminosäuren (siehe Abbildung 5.1).
Diese müssen mit der Nahrung aufgenommen werden. Dazu gehören Valin (8a),
Leucin (8b), Isoleucin (8c), Phenylalanin (8d), Threonin (8e), Lysin (8f), Tryptophan (8g) und
Methionin 8h.[7]
Abbildung 5.1 Die acht essentiellen Aminosäuren
Abhängig von der jeweiligen Aminosäure werden zwischen 3 und 16 mg/kg Körpergewicht
pro Tag benötigt. Bei einer ausgewogenen Ernährung scheidet ein gesunder Erwachsener
genau die Menge an stickstoffhaltigen Verbindungen hauptsächlich über die Nieren aus, die
dem
Stickstoffgehalt
der
zugeführten
Nahrung
entspricht.
Die
Stickstoffbilanz
ist
ausgeglichen.[8]
101
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Auf Grund verschiedener Erkrankungen kann es sinnvoll sein, dem Organismus an Stelle der
Aminosäure die analoge α-Ketosäure zuzuführen. Besonders die α-Ketosäuren natürlich
vorkommender Aminosäuren spielen eine wichtige Rolle im Metabolismus. So werden
α-Ketosäuren z.B. zur Behandlung von Urämie oder Krankheiten, die auf eine
Stickstoffakkumulation zurückzuführen sind, verwendet.[120] Im Körper werden die
Ketosäuren mittels Transaminierung in die entsprechenden Aminosäuren überführt.
Ein
Medikament,
das
zur
Ernährungstherapie
bei
Patienten
mit
eingeschränkter
®
Nierenfunktion eingesetzt wird ist Ketosteril von Fresenius Kabi.[121] Ketosteril® enthält
neben Ketovalin (9a) und Ketoleucin (9c) auch die α-Ketosäuren Ketoisoleucin (9b) und
Phenylbrenztraubensäure (9d) (siehe Abbildung 5.2), jeweils in Form ihrer CalciumSalze.[122] Die Ketosäuren-Analoga der essentiellen Aminosäuren werden eingesetzt, um
Mangelernährung
im
Rahmen
einer
Niedrig-Protein-Diät,
z.B.
bei
chronischer
Nierenerkrankung zu verhindern und fortschreitendes Nierenversagen zu verzögern.[9,122]
O
O
O-
O-
OH
O-
O
O
-Keto- -methylvalerat
9b
-Ketoisocaproat
9c
O
-Ketoisovalerat
9a
O
O
O
Phenylbrenztraubensäure
9d
Abbildung 5.2 Auswahl an α-Ketosäuren, die in der Ernährungstherapie zur Anwendung
kommen
Die
Verwendung
von
α-Ketosäuren
verzweigtkettiger
Aminosäuren
in
Nahrungsergänzungsmitteln wurde auch von der Evonik Degussa GmbH untersucht. Dabei
wird mindestens eine der folgenden α-Ketosäuren oder eine Kombination derer verwendet:
α-Ketoisocaproat (9c), α-Ketoisovalerat (9a) und α-Keto-β-methylvalerat (9b),[123] die
Ketosäuren der Aminosäuren Leucin (8b), Valin (8a) und Isoleucin (8c). Die genannten
α-Ketosäuren dienen dabei u.a. zur Unterstützung des Muskelaufbaus, zur Steigerung der
Muskelleistungsfähigkeit, einer Verbesserung des allgemeinen Wohlbefindens und tragen
gleichzeitig zur Entlastung des Stoffwechsels bei der Stickstoff-Detoxifizierung durch
reduzierte Stickstoffzufuhr und verbesserte Stickstoffretention im Körper bei. Oftmals werden
die oben genannten α-Ketosäuren in Kombination mit α-Ketoglutarat (9i) eingesetzt (siehe
Abbildung 5.3), das einen antioxidativen Effekt hat.[123]
102
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Abbildung 5.3 α-Ketoglutarat
In diesem Teilkapitel soll insbesondere die essentielle Aminosäure L-Valin (8a) in einer
Biotransformation in die analoge Ketosäure 9a überführt werden. Als Katalysator für die
oxidative Desaminierung kommt eine NADH-abhängige Leucindehydrogenase aus Bacillus
cereus zum Einsatz.[124] Zur Cofaktorregenerierung stehen eine NADH-Oxidase aus
Lactobacillus brevis und ein Eisenporpyrin zur Verfügung (siehe Abbildung 5.4).[125-127]
Abbildung 5.4 Enzymatische Synthese von Ketovalin (9a)
5.2
Stand der Wissenschaft
Bereits 1835 synthetisierte Berzelius mit Pyruvat die erste α-Ketosäure durch Destillation von
Weinsäure.[120,128] Heute sind sowohl chemische als auch enzymatische Methoden zur
Synthese von α-Ketosäuren bekannt.[120] Ein Nachteil der chemischen Methoden zur
Herstellung von Ketosäuren liegt darin, dass es keinen allgemein gültigen Zugangsweg gibt.
Je nachdem welche Ketosäure man synthetisieren möchte, muss man auf unterschiedliche
Reaktionswege zurückgreifen. Dies gilt auch für die Synthese von Ketoisovalerat (9a), der zu
L-Valin
(8a) analogen α-Ketosäure.
103
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Klassisch chemische Synthese von Ketosäuren
Chemisch kann Ketoisovalerat aus seiner analogen Aminosäure L-Valin (8a) hergestellt
werden. Zum Einen durch Oxidation mittels Fremy´s Salz,[129] zum Anderen durch
Umsetzung der Aminosäure mit Trifluressigsäureanhydrid.[130] Dabei wird zunächst das
Oxazolon 41 mit einer Ausbeute von 77% erhalten. Mittels Hydrolyse wird dann aus dem
entsprechenden Azlakton 42 Ketovalin (9a) mit einer Ausbeute von 58% erhalten (siehe
Abbildung 5.5).[130]
Abbildung 5.5 Chemische Synthese von Ketovalin 9a über das Oxazolon 41
Andere Methoden gehen von Derivaten der Aminosäure aus. Dazu gehört die
säurekatalysierte
Spaltung
von
N-Acetyl-α-methoxymethylestern
bzw.
α-Iminosäureestern.[131] Diese werden ausgehend vom N-Acetylaminosäuremethylester
bzw. dem Aminosäuremethylester durch N-Chlorierung und Dehydrochlorierung hergestellt.
Ketovalin konnte als Methylester mit 81 bzw. 73% isoliert werden, je nachdem ob vom
2-Acetylamino-2-methoxyaminosäuremethylester
oder
vom
Aminosäure-methylester
ausgegangen wurde.
Eine weitere Methode stellt die Synthese aus dem entsprechenden Cyanohydrin dar.[132]
Dieses wird zunächst zum α-Hydroxy-N-tert-butylamid umgesetzt, welches anschließend mit
Chromat (CrO3) zum α-Keto-N-tert-butylamid oxidiert wird. Nach Hydrolyse erhält man die
α-Ketosäure.
Darüber hinaus können α-Ketosäuren wie Ketovalin aus Ketonen synthetisiert werden.[133]
In situ erzeugtes 2,2-Difluro-1-tosyl-vinyl-Lithium wird mit dem entsprechenden Keton (im
Fall von Ketovalin: Aceton) zum Carbinol umgesetzt. Nach Hydrolyse mit Schwefelsäure
wurde zunächst die α,β-ungesättigte Carbonsäure erhalten. Nach weiterer Hydrolyse wurde
die Ketosäure erhalten. Im Fall von Ketovalin betrug die Gesamtausbeute 57%.
104
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Enzymatische Synthese von α-Ketosäuren
Enzymatisch kann Ketovalin ausgehend von Aldopantoat hergestellt werden unter Nutzung
des
Pantothensäure-Biosynthesewegs.[134]
D-Aldopantoatdehydrogenase
Aldopantoat
wird
zunächst
durch
eine
zu Dimethylmalat oxidiert. Eine Dimethylmalatdehydrogenase
zersetzt dieses zu Ketovalin und CO2.
Eine sehr elegante Möglichkeit stellt die enzymatische Oxidation der natürlichen
L-Aminosäuren
unter Verwendung einer Aminosäuredehydrogenase dar. Die erste
enzymatische Synthese einer α-Ketosäure aus der analogen α-Aminosäure wurde 1933 von
Krebs beschrieben.[135] Er verwendete Gewebeschnitte von Rattennieren zur Oxidation
racemischer Aminosäuren.
Heutzutage sind viele Aminosäuredehydrogenasen rekombinant verfügbar und auch
kommerziell erhältlich, z.B. von evocatal.[136] Aminosäuredehydrogenasen gehören zur
Klasse der Oxidoreduktasen.[137] Aminosäuredehydrogenasen katalysieren sowohl die
oxidative Desaminierung von Aminosäuren (8) als auch die reduktive Aminierung der
Ketosäuren (9) (siehe Abbildung 5.6).[138] Es handelt sich um eine reversible Reaktion,
deren Gleichgewicht weit auf der Seite der Aminosäure liegt.[139]
Abbildung 5.6 Reaktionsschema der von Aminosäuredehydrogenasen katalysierten
Reaktionen
In der Literatur sind verschiedene Aminosäuredehydrogenasen bekannt,[137] z.B. die
Glutamatdehydrogenasen
aus
Clostridium
symbiosum
oder
aus
Fusobacterium
nucleatum,[140-142] die Phenylalanindehydrogenase aus Rhodococcus species oder die
Leucindehydrogenasen aus Bacillus species.[124,143-146]
Bei der Leucindehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus cereus handelt es sich um ein NAD+abhängiges Enzym mit einem Molekulargewicht von 310 kDa. Es besteht aus acht
Untereinheiten à 39 kDa. Diese LeuDH katalysiert bevorzugt die oxidative Desaminierung
von L-Leucin (8b), L-Valin (8a) und L-Isoleucin (8c). Das pH-Optimum für die oxidative
105
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Desaminierung liegt bei pH 11.5. Darüber hinaus katalysiert dieses Enzym auch die
Rückreaktion, die reduktive Aminierung, von Ketoleucin (9b), Ketovalin (9a) und
Ketoisoleucin (9c).[124] Auf Grund des Reaktionsgleichgewichts ist die Synthese der
Aminosäure
durch
reduktive
Aminierung
bevorzugt.[147]
Allgemein
sind
+
Oxidationsreaktionen unter Verwendung von NAD -abhängigen Dehydrogenasen durch die
Lage des Gleichgewichts stark gehindert, da dieses auf der Seite der reduzierten Produkte
liegt.[148] Um das Gleichgewicht auf die Seite der oxidierten Reaktionsprodukte zu
verschieben, benötigt man ein effektives System zur Regenerierung von NAD+.[149]
Im Jahr 2003 veröffentlichten Hummel et al. einen enzymatischen Prozess zur Synthese von
unnatürlichem
D-tert-Leucin
(D-8j)
mittels
Racematspaltung
durch
eine
Aminosäuredehydrogenase. Die Leucindehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus cereus oxidiert
selektiv L-tert-Leucin (L-8j) zu Trimethylpyruvat (9j) unter gleichzeitiger Reduktion von NAD+
zu NADH. Ein gut geeignetes Enzym zur Regenerierung von NAD+ stellte hier die NADHOxidase (NOx) aus Lactobacillus brevis dar, die bei der Reduktion von molekularem
Sauerstoff lediglich Wasser als Nebenprodukt bildet (siehe Abbildung 5.7). Diese Reaktion
kann als irreversibel betrachtet werden. Damit stellt sie die Triebkraft unabhängig vom
Gleichgewicht der durch die LeuDH katalysierten Reaktion dar. D-tert-Leucin (D-8j) wurde als
enantiomerenreines Produkt mit einem exzellenten ee-Wert von >99% erhalten.[149]
Abbildung 5.7 Synthese von D-tert-Leucin unter in situ Cofaktorregenerierung mit NOx [149]
Im Jahr 2004 veröffentlichten Bommarius et al. einen enzymatischen Prozess zur Synthese
von α-Ketoglutarat (9i) aus Mononatriumglutamat (8i). Die Oxidation erfolgte enzymatisch
durch Katalyse mit einer L-Glutamatdehydrogenase (L-GluDH) aus Clostridium symbiosum
unter gleichzeitiger Reduktion des Cofaktors NAD+ zu NADH (siehe Abbildung 5.8). Zur
106
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Regenerierung des Cofaktors wurde ebenfalls eine H2O-bildende NADH-Oxidase, hier aus
Lactobacillus sanfranciscensis, verwendet. Bei einer Substratkonzentration von 5 mM wurde
nach 18 Stunden nahezu vollständiger Umsatz beobachtet. Auf Grund einer massiven
Produktinhibierung der GluDH und limitierender NOx-Stabilität führte die Erhöhung der
Substratkonzentration auf 25 mM zu einem niedrigen Umsatz von rund 25% nach 18
Stunden.[10]
Abbildung 5.8 Enzymatische Oxidation von Mononatriumglutamat (8i) zur Synthese von
α-Ketoglutarat (9i) [10]
Enzymatische Cofaktorregenerierung
Es wurde bereits erwähnt, dass bei Oxidationsreaktionen unter Verwendung von
Aminosäuredehydrogenasen ein effektives Cofaktorregenerierungssystem benötigt wird um
das Gleichgewicht auf die Seite der Ketosäuren zu verschieben.
In der Literatur sind sowohl enzymatische (Enzym-gekoppelt oder Substrat-gekoppelt) als
auch photochemische, elektrochemische oder biomimetische Cofaktorregenerierungsmethoden bekannt.[93,127,150] Während für reduktive Prozesse eine Vielzahl dieser
Cofaktorregenerierungssystemen zur Verfügung steht, sind nur wenige dieser Methoden zur
Regenerierung des oxidierten Cofaktors etabliert. Zur Enzym-gekoppelten Regenerierung
des oxidierten Cofaktors NAD(P)+ aus NAD(P)H stehen u.a. folgende Enzyme zur
Verfügung:
Glutamatdehydrogenase
(Substrat:
2-Ketoglutarat),
Lactatdehydrogenase
(Substrat: Pyruvat) und Alkoholdehydrogenase aus Pferdeleber (Substrat: Acetaldehyd).[90]
Alle drei Enzyme benötigen stöchiometrische Mengen der Ketoverbindungen, die instabil in
Lösung sind.[149,151] Gleichzeitig verhindert das Gleichgewicht dieser Reaktionssysteme
eine vollständige Oxidation der Aminosäure.[149] Eine gute Alternative stellen die NADH-
107
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Oxidasen (NOx) dar, die Sauerstoff als Oxidationsmittel nutzen. Man unterscheidet sie in
Peroxid-bildende (Abbildung 5.9 (1)) und Wasser-bildende NADH-Oxidasen (Abbildung 5.9
(2)).[126] H2O2-bildende NADH-Oxidasen katalysieren die Oxidation von NADH zu NAD+,
wobei bei der Reduktion von molekularem Sauerstoff Wasserstoffperoxid als Nebenprodukt
entsteht, während H2O-bildende NADH-Oxidasen Wasser als Nebenprodukt produzieren
(siehe Abbildung 5.9). Werden Peroxid-bildende NADH-Oxidasen, z.B. aus Thermus
thermophilus verwendet, so ist die Zugabe einer Katalase nötig, die gebildetes
Wasserstoffperoxid abbaut,[149] da Wasserstoffperoxid das Enzym deaktivieren kann.[152]
Ein gut geeignetes Enzym zur Regenerierung von NAD+ stellte hier die NADH-Oxidase aus
Lactobacillus brevis dar, die bei der Reduktion von molekularem Sauerstoff Wasser als
Nebenprodukt bildet.[126] NADH-Oxidasen stellen einen Mechanismus zum Schutz vor
oxidativem Stress dar. Man findet sie vor allem in Milchsäurebakterien oder fakultativ und
strikt anaeroben Bakterien.[153] Bei der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis handelt es
sich um ein homotetrameres Flavoenzym, das pro Untereinheit aus 450 Aminosäuren
besteht. Das Molekulargewicht der einzelnen Monomere beträgt 48.8 kDa. Das Enzym
katalysiert die Oxidation von zwei Äquivalenten NADH bei gleichzeitiger Reduktion von
einem Äquivalent Sauerstoff zu zwei Äquivalenten Wasser, ohne dass Wasserstoffperoxid
entsteht (siehe Abbildung 5.9 (2)).[154] Das pH-Optimum der NADH-Oxidase aus
Lactobacillus brevis liegt bei pH 6.[126]
Abbildung 5.9 Bruttogleichung einer H2O2-bildenden (1) und einer H2O-bildenden NOx (2)
Durch die Reduktion von Sauerstoff in einer irreversiblen 4-Elektronenübertragung wird das
ungünstige
thermodynamische
Gleichgewicht
der
LeuDH-katalysierten
oxidativen
Desaminierung von der α-Aminosäure zur Ketosäure verschoben.
Weitere Vertreten der Wasser-bildenden NADH-Oxidasen stellen die NOx aus Lactobacillus
sanfranciscensis und Lactobacillus lactis dar. Diese Enzyme haben einen Mechanismus
entwickelt, bei dem zwar bei Oxidation des ersten Äquivalents Cofaktor Wasserstoffperoxid
entsteht, welches aber von einem Cystein-Rest abgefangen wird, der zur Sulfensäure
oxidiert wird. Gleichzeitig entsteht ein Molekül Wasser. Ein zweites Molekül NAD(P)H wird
108
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
genutzt um die Sulfensäure wieder zu reduzieren, dabei wird ein zweites Wassermolekül
gebildet. Als Elektronenüberträger dient FAD.[153]
Die erste präparative Anwendung einer NOx aus Lactobacillus brevis wurde 2003 von
Hummel et al. zur in situ Cofaktorregenerierung in der Racematspaltung von racemischem
Phenylethanol rac-35 zur Gewinnung des enantiomerenreinen (S)-Alkohols beschrieben. Die
(R)-spezifische ADH aus Lactobacillus brevis oxidiert selktiv den (R)-Alkohol (R)-35 zum
Keton 33 während der (S)-Alkohol (S)-35 nicht umgesetzt wird. Während dieser Reaktion
wird NAD+ verbraucht und zu NADH reduziert. Dieses wird während der Reaktion in situ von
einer NADH-Oxidase unter Verbrauch von Sauerstoff und Bildung von Wasser regeneriert
(siehe Abbildung 5.10).[125]
Abbildung 5.10 Selektive Oxidation von rac-Phenylethanol (rac-35) [125]
Eine weitere Anwendung der NADH-Oxidase zur in situ Cofaktorregenerierung wurde
ebenfalls von Hummel et al. beschrieben und bereits oben diskutiert (siehe auch Abbildung
5.7).[149] Aus racemischem tert-Leucin (rac-8j) wurde mittels enantioselektiver oxidativer
Desaminierung von L-tert-Leucin (L-8j) zu Trimethylpyruvat (9j) unter Verwendung einer
Leucin-Dehydrogenase
(LeuDH)
aus
Bacillus
cereus
D-tert-Leucin
(D-8j)
als
enantiomerenreines Produkt mit einem exzellenten ee-Wert von >99% erhalten.[149]
Alternative Cofaktorregenerierungssysteme: Fe-TSPP
Eine weitere Möglichkeit NAD(P)+ in situ zu regenerieren besteht neben der Verwendung
natürlicher
NAD(P)H-Oxidasen,[125,126,149,152,155]
chemoenzymatischer
oder
109
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
elektrochemischer
systeme.[127]
Bei
Methoden,[156,157]
letzteren
handelt
in
es
der
sich
Nutzung
um
biomimetischer
niedermolekulare
Katalysatorsynthetische
Verbindungen, die die katalytische Funktion eines Enzyms nachahmen können.[127]
Steckhan et al. berichteten bereits 1997 die Verwendung von Übergangsmetallkomplexen
zur in situ Cofaktorregenerierung. Sie verwendeten einen Ruthenium-Komplex auf Basis von
1,10-Phenanthrolin-5,6-dion als Ligand zur Cofaktorregenerierung in der enzymatischen
Oxidation von Cyclohexanol zu Cyclohexanon.[158] Der bei der Oxidation von Cyclohexanol
verbrauchte Cofaktor NAD+ wird durch den Ruthenium-Komplex unter gleichzeitiger
Reduktion der Liganden regeneriert. Im weiteren Verlauf dieses Katalysezyklus entsteht das
unerwünschte Nebenprodukt Wasserstoffperoxid, das durch eine Katalase abgefangen wird
(siehe Abbildung 5.11).[158]
Abbildung 5.11 Oxidation von Cyclohexanol unter biomimetischer Cofaktorregenerierung
[158]
Eine biomimetische Wasser-bildende NAD(P)H-Oxidase wurde im AK Gröger etabliert. Es
handelt sich dabei um das wasserlösliche Fe-TSPP (10), ein Eisen(III)-Komplex, der mesoTetrakis(p-sulfonatophenyl)porphyrin als Ligand enthält (siehe Abbildung 5.12).[127]
Fe-TSPP akzeptiert sowohl NADH als auch NADPH als Substrat und oxidiert diese in
Anwesenheit von molekularem Sauerstoff zu NAD+ bzw. NADP+, wobei es eine höhere
Aktivität für die Oxidation von NADH als für die Oxidation von NADPH zeigt.[127]
Neben den Aktivitätsuntersuchungen wurden auch präparative Anwendungen des EisenPorphyrins in der Cofaktorregenerierung bei Biotransformationen beschrieben. Zum Einen
wurde die enzymatische Oxidation von D-Glucose zum D-Glukonolacton in Gegenwart einer
Glucose-Dehydrogenase aus Bacillus species durchgeführt. Dabei wird NAD(P)+ verbraucht
und zu NAD(P)H reduziert. Das D-Glukonolacton wird zur D-Glukonsäure hydrolysiert, wobei
der pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge konstant bei pH 7 gehalten wurde. Das in
katalytischen Mengen eingesetzte Eisen-Porphyrin (2 mol%) war in der Lage sowohl NAD+
110
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
als auch NADP+ zu regenerieren. Unabhängig davon ob NADH, NAD+ oder NADP+
verwendet wurde, wurde nach 24 Stunden >95% Umsatz erzielt.[127]
Abbildung 5.12 Struktur von Fe-TSPP (10) [127]
Eine weitere Anwendung der Fe-TSPP-katalysierten in situ Cofaktorregenerierung betrifft die
Oxidation von Cyclooctanol (44) zu Cyclooctanon (45) mit einer ADH. Bei Einsatz von
2 mol% Fe-TSPP und 2 mol% Cofaktor wurde nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden ein
Umsatz von >95% und eine Ausbeute von 93% erzielt.[127]
OH
2 mol% Fe-TSPP
ADH, NAD+
O
Puffer pH 7
RT, 24 h
44
45
Umsatz >95%
Abbildung 5.13 Oxidation von Cyclooctanol unter Fe-TSPP-vermittelter
Cofaktorregenerierung
Gröger et al. postulierten für die Fe-TSPP-vermittelte Cofaktorregenerierung den in
Abbildung 5.14 dargestellten Mechanismus.[127] Ausgehend von Fe-TSPP (10) und dem
reduzierten Cofaktor NAD(P)H bildet sich zunächst der Eisen(III)-Hydrid-Komplex 10a.
Dieser wird unter Koordination und Reduktion von molekularem Sauerstoff in den EisenHydroperoxo-Komplex 10c überführt. Dieser Schritt könnte über einer homolytische Fe-H-
111
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Bindungsspaltung unter Bildung von 10b, bestehend aus einer Fe(II)-Spezies und einem
Hydroperoxylradikal, verlaufen. Nach Protonierung und Abspaltung von Wasser (analog dem
Mechanismus der P450-Monooxygenasen) wird 10c in eine Eisen(IV)-Oxo-Spezies
überführt.[159,160] Zuletzt wird Fe-TSPP (10) unter gleichzeitiger Bildung von Wasser
regeneriert.[127]
Abbildung 5.14 Mechanismus der Fe-TSPP-vermittelten Cofaktorregenerierung [127]
Im Rahmen dieser Arbeit werden sowohl die Wasser-bildene NOx aus L. brevis, als auch
das Eisenporphyrin Fe-TSPP (10) zur in situ Cofaktorregenerierung in der LeuDHkatalysierten Oxidation von α-Aminosäuren zu ihren analogen α-Ketosäuren verwendet.
Abschließend werden beide Systeme miteinander verglichen.
112
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5.3
Ziel der Arbeit
Ziel dieses Teilkapitels war es eine allgemeine enzymatische Syntheseplattform zur
Herstellung
von
α-Ketosäuren
zu
etablieren.
Im
besonderen
Blickpunkt
des
Forschungsinteresses standen dabei α-Ketoglutarat (9i), α-Ketoleucin (9b), α-Ketovalin (9a)
und α-Ketophenylalanin (Phenylbrenztraubensäure (9d); siehe Abbildung 5.15). Dieses
Thema wurde im Rahmen des Projektverbundes von ChemBioTech zusammen mit Hummel
et al. und arbeitskreisintern mit Tenbrink bearbeitet.
O
O
NaO
O
OH
O
9i
O
OH
O
9b
O
OH
O
9a
OH
O
9d
Abbildung 5.15 angestrebte Zielprodukte
Für die Herstellung von α-Ketosäuren aus L-Aminosäuren durch oxidative Deaminierung
stehen eine Reihe von Aminosäuredehydrogenasen zur Verfügung, die in Verbindung mit
einer effizienten Regenerierung des Cofaktors (NAD(P)+) eingesetzt werden können (siehe
Abbildung 5.16).
Einige Aminosäuredehydrogenasen wie GluDH, LeuDH, AlaDH und PheDH sind kommerziell
verfügbar. Darüber hinaus stehen aus dem AK Hummel Aminosäuredehydrogenasen zur
Verfügung, mit denen ein breites Spektrum an α-Ketosäuren abgedeckt werden kann.
Aliphatische Aminosäuren wie Leucin und Valin können mit Hilfe einer rekombinant
verfügbaren LeuDH aus Bacillus cereus oxidativ deaminiert werden.[124] Für die oxidative
Aminierung von Aminosäuren mit einer aromatischen Seitenkette steht eine Phenylalanindehydrogenase aus Rhodococcus species rekombinant zur Verfügung.[143]
Zur in situ Cofaktorregenerierung kann auf zwei Regenerierungssysteme zurückgegriffen
werden, die molekularen Sauerstoff als Oxidationsmittel nutzen und lediglich Wasser als
Nebenprodukt produzieren. Zum Einen steht aus dem AK Hummel ein enzymatisches
System in Form der H2O-bildenden NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis zur
Verfügung,[125] und zum Anderen ein chemisches System in Form des synthetischen
Metalloporphyrins Fe-TSPP (siehe Abbildung 5.12) als biomimetische Oxidase.[127] In
113
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
beiden Fällen wird der bei der Oxidation der Aminosäure verbrauchte Cofaktor NAD+
(oxidierte Form) aus der reduzierten Form (NADH) durch Oxidation mit molekularem
Sauerstoff regeneriert.
O
R
O
Aminosäuredehydrogenase
OH
R
NH2
OH
O
H2O
NH3
NAD+
NADH
H2O
1/2 O2
Cofaktorregenerierungssystem
Abbildung 5.16 Reaktionsschema zur Oxidation von L-Aminosäuren unter in situ
Cofaktorregenerierung
5.4
Ergebnisse und Diskussion
Bevor
ein
enzymatischer
Leucindehydrogenase
Prozesses
(LeuDH)
aus
zur
Bacillus
Oxidation
cereus
von
unter
L-Valin
(8a)
gleichzeitiger
mittels
in
situ
Cofaktorregenerierung durch eine H2O-bildende NADH-Oxidase (NOx) aus Lactobacillus
brevis entwickelt werden kann, muss die Aktivität der zu verwendenden Enzyme (LeuDH,
NOx) bestimmt werden und eine geeignete Analytikmethode zur Umsatzbestimmung
etabliert werden. Darüber hinaus müssen die Enzyme charakterisiert werden. Dies erfolgt
spektrophotometrisch.
5.4.1
Photometertests zur Aktivitätsbestimmung
Auf Grund der stark unterschiedlichen pH-Abhängigkeiten der LeuDH aus Bacillus cereus
und
der
NOx
aus
Lactobacillus
brevis
muss
ein
„Kompromiss“
bezüglich
des
Reaktionsmediums gefunden werden.[124,126] Lanzerath bestimmte das pH-Optimum der
114
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Leucindehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus cereus auf pH 10.5 und das der NADH-Oxidase
(NOx) aus Lactobacillus brevis auf pH 6.[161] Als gemeinsames pH-Optimum der beiden
Enzyme bestimmte er pH 8.0.[161] Deshalb sollen präparative Ansätze später bei pH 8
durchgeführt werden. Folglich werden auch die Photometertests zur Aktivitätsbestimmung
der Enzyme in Kpi-Puffer pH 8, dem Reaktionspuffer, durchgeführt. Die volumetrische
Aktivität [U/ml] wird über den Verbrauch (siehe Abbildung 5.17) bzw. die Bildung (siehe
Abbildung 5.18) des Cofaktors NADH bestimmt.
Abbildung 5.17 Reaktionsgleichung des Photometertests zur Bestimmung der NOx-Aktivität
Die NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis katalysiert die Oxidation von NADH zu NAD+
(unter Verbrauch von molekularem Sauerstoff und der Bildung von Wasser). Der Verbrauch
an NADH wird im Photometer bei einer Wellenlänge von 340 nm, dem Absorptionsmaximum
von NADH, beobachtet. Die Extinktionsabnahme wird über einen Zeitraum von zehn Minuten
verfolgt. Analog der Formel in Abbildung 4.23 zur Bestimmung der volumetrischen Aktivität
der ADHs wird aus der Anfangssteigung die volumetrische Aktivität der NADH-Oxidase aus
Lactobacillus
brevis
berechnet.
Ähnliches
gilt
für
die
Aktivitätsbestimmung
der
Aminosäuredehydrogenasen (LeuDH, GluDHs). Deren Aktivität für die Oxidation von L-Valin
(8a) wird über die Bildung von NADH bestimmt (siehe Abbildung 5.18). Während der
Oxidation von L-Valin zu Ketovalin (9a) wird NAD+ verbraucht und zu NADH reduziert.
Analog wird hierbei die Extinktionszunahme beobachtet und anhand der Gleichung in
Abbildung 4.23 die volumetrische Aktivität über die Anfangssteigung bestimmt.
Abbildung 5.18 Reaktionsgleichung des Photometertests zur Bestimmung der
Aminosäuredehydrogenase-Aktivität bezogen auf L-Valin 8a
115
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Diese Messungen wurden mit jeder neuen Enzymcharge durchgeführt. Für den Fall einer
längeren Lagerung eines Enzyms wird zwischendrin überprüft, ob das Enzym während der
Lagerung an Aktivität verloren hat. In diesem Fall wird, zur Vergleichbarkeit der Ergebnisse,
die Enzymmenge in präparativen Ansätzen an die aktuelle Aktivität angepasst.
5.4.1.1
Aktivität der Leucindehydrogenasen aus Bacillus cereus
Die Bestimmung der Aktivität der Leucindehydrogenasen (LeuDH) aus Bacillus cereus
erfolgte analog AAV 22 über die Extinktionszunahme bei einer Wellenlänge von 340 nm.
Diese LeuDH wurde zunächst als Rohextrakt und später in gereinigter Form zur Verfügung
gestellt (weitere Informationen siehe Abschnitt 8.2.3.1).
Abbildung 5.19 Aktivität der gereinigten LeuDH
Für die gereinigte LeuDH aus Bacillus cereus wurden über die volumetrische Aktivität und
den Proteingehalt die spezifische Aktivität berechnet. Sie variierte je nach Art der
Aufreinigung zwischen 2.0 und 2.4 U/mg.
Das natürliche Substrat der Leucindehydrogenase ist L-Leucin (8b). Die LeuDH aus Bacillus
cereus weist für L-Valin (8a) eine relative Aktivität von rund 50% verglichen mit der Aktivität
für L-Leucin (8b) auf.[162] Das Substratspektrum der LeuDH aus Bacillus stearothermophilus
ist bereits literaturbekannt.[144]
5.4.1.2
Aktivität der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis
Die Aktivitätsbestimmung der NADH-Oxidase aus L. brevis erfolgte mittels Photometertest
analog AAV 23. Der Proteingehalt wurde am Forschungszentrum Jülich mittels Bradford-Test
bestimmt. Der Proteingehalt lag zwischen 5 und 26.8 mg/ml. Dadurch kann die
volumetrische Aktivität in die spezifische Aktivität umgerechnet werden. Die Ergebnisse der
Aktivitätsbestimmungen sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst.
116
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Tabelle 5.1 Aktivität der verschiedenen Chargen Nox
Volumetrische Aktivität
Proteingehalt
Spezifische Aktivität
[U/ml]
[mg/ml] e)
[U/mg]
09/2010 b)
95
-
-
2
10/2010 b)
86
26.4
3.3
3
02/2011 c)
149 d)
13.0
11.5
4
03/2011 c)
225 d)
5.0
45.0
Eintrag a)
Charge
1
a)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.01 ml, d = 1 cm;
Enzymcharge;
c)
gereinigtes Enzym;
d)
b)
f = 10; keine Angaben über Reinigung der
gemessen von Tenbrink;[162]
e)
bestimmt am FZ Jülich
Die Aktivität der NADH-Oxidase variiert mit dem Grad und der Art der Aufreinigung. Für die
Rohextrakte (siehe Tabelle 5.1 Einträge 1 und 2) wurde bei Erhalt der Enzyme eine
volumetrische Aktivität von 95 bzw. 86 U/ml bestimmt. Über den Proteingehalt ergibt sich
eine spezifische Aktivität von 3.3 U/mg (siehe Tabelle 5.1 Eintrag 2). Die volumetrische
Aktivität der gereinigten NADH-Oxidase lag bei Erhalt der jeweiligen Chargen mit
volumetrischen Aktivitäten von 149 bzw. 225 U/ml (siehe Tabelle 5.1, Eintrag 3 und 4) höher
als die der Rohextrakte. Über den Proteingehalt von 13 bzw. 5 mg/ml wurde die spezifische
Aktivität auf 11.5 bzw. 45 U/mg berechnet (siehe Tabelle 5.1; Einträge 3 und 4). Dieser Wert
entspricht im Vergleich zu Eintrag 2 einer Aktivitätssteigerung um mehr als das Zehnfache.
Durch die Aufreinigung wurde also ein äußerst reines Enzym mit hoher spezifischer Aktivität
erhalten.
5.4.2
Eigenschaften der Enzyme
Im Folgenden Abschnitt sollen die Leucindehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus cereus und
die NADH-Oxidase (NOx) aus Lactobacillus brevis auf Eigenschaften wie Lagerstabilität und
Inhibierung getestet werden. Diese Untersuchungen erfolgen im Photometer über die
Verfolgung der Bildung (LeuDH-katalysierte Oxidation von L-Valin, siehe Abbildung 5.18)
oder des Verbrauchs (NOx-katalysierte Oxidation von NADH, siehe Abbildung 5.17) des
Cofaktors NADH.
117
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5.4.2.1
Lagerstabilität
Für jede verwendete Enzymcharge wurde die volumetrische Aktivität [U/ml] bestimmt (siehe
Tabelle 8.29 und Tabelle 5.1). Bei Lagerung einer Enzymcharge über mehr als 3 Wochen
bei -20°C ist es nötig in regelmäßigen Abständen die Aktivität des Enzyms zu überprüfen
und ggf. die in präparativen Ansätzen verwendeten Enzymmengen an die aktuelle Aktivität
des Enzyms anzupassen.
5.4.2.1.1
Lagerstabilität der Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus
Für die Untersuchung der LeuDH aus Bacillus cereus bezüglich ihrer Lagerstabilität bei
-20°C wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Lagerung die Aktivität der LeuDH für die
Oxidation von L-Valin (8a) bestimmt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte analog AAV 22. Die
Lagerstabilität wurde anhand einer gereinigten LeuDH untersucht. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 5.2 zusammengefasst:
Tabelle 5.2 Lagerstabilität einer gereinigten LeuDH (Charge 03/2011)
Eintrag
Zeitpunkt der Messung [d]
Vol. Aktivität [U/ml]
Relative Aktivität [%]
1
t=0
39
100
2
t = 42 d
33
85
Für die LeuDH wurde bei Erhalt des Enzyms eine Aktivität von 39 U/ml für die Oxidation von
L-Valin
(8a) bestimmt. Dieser Wert wird als Referenz für weitere Aktivitätsbestimmungen
dieser Charge bezüglich der Oxidation von L-Valin (8a) auf 100% gesetzt. Nach sechs
Wochen wurde die gleiche Enzymcharge erneut vermessen. Dabei wurde die Aktivität für die
Oxidation von L-Valin (8a) auf 33 U/ml bestimmt. Dies entspricht einer relativen Aktivität von
85%. Über einen Zeitraum von sechs Wochen verlor die gereinigte LeuDH somit 15% ihrer
ursprünglichen Aktivität. Eine Abweichung von 15% bei der Aktivitätsbestimmung mittels
Photometertest liegt durchaus im Rahmen der Messschwankungen. Die gereinigte LeuDH
aus Bacillus cereus ist bei -20°C sehr gut lagerbar.
118
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5.4.2.1.2
Lagerstabilität der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis
Für die Untersuchung der NOx aus Lactobacillus brevis hinsichtlich ihrer Lagerstabilität bei
-20°C wurde zu verschiedenen Zeitpunkten die Aktivität der NOx für die Oxidation von NADH
zu NAD+ bestimmt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte analog AAV 23. Die Lagerstabilität der
NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis wurde zum Einen für einen Rohextrakt und zum
Anderen für eine gereinigte NOx untersucht. Die bei Erhalt der Enzyme bestimmte Aktivität
wurde als Referenz auf 100% relative Aktivität festgesetzt. Die Ergebnisse dieser
Messungen sind in Tabelle 5.3 zusammengefasst.
Tabelle 5.3 Lagerstabilität zweier Chargen NOx
Eintrag a)
Charge
1
Zeitpunkt der
Volumetrische
Relative
Messung [d]
Aktivität [U/ml]
Aktivität [%]
t=0
95
100
t = 90
22
23
t=0
225 d)
100
t = 57
147
65
09/2010 b)
2
3
03/2011
4
a)
c)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.01 ml, d = 1 cm;
b)
Rohextrakt;
c)
gereinigtes;
d)
gemessen
von Tenbrink [162]
Bei der ersten Aktivitätsmessung wurde die Aktivität des Rohextrakts auf 95 U/ml bestimmt
(Tabelle 5.3; Eintrag 1). Nach knapp 13 Wochen Lagerung bei -20°C wurde für dieses
Enzym eine Aktivität von 22 U/ml für die Oxidation von NADH bestimmt (Tabelle 5.3; Eintrag
2). Dies entspricht einer relativen Aktivität von 23%. Die Aktivität der gereinigten NOx (siehe
Tabelle 5.3; Einträge 3 und 4) wurde bei ihrer ersten Messung auf 225 U/ml bestimmt. Nach
gut 8 Wochen wurde diese Messung wiederholt. Dabei wurde eine Aktivität dieser Charge
von 147 U/ml bestimmt. Dies entspricht einer relativen Aktivität von 65%.Bei einer
Lagertemperatur von -20°C verlor der Rohextrakt über 3 Monate (90 Tage) 77% seiner
Aktivität. Unter denselben Lagerbedingungen verlor die gereinigte NADH-Oxidase über einen
Zeitraum von ca. 8 Wochen (57 Tage) 35% ihrer ursprünglichen Aktivität. Berücksichtigt man
die Dauer im Verhältnis zum Aktivitätsverlust, so liegen die Werte für die beiden
Enzymchargen in einem ähnlichen Bereich.
119
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Da die NOx bei einer Lagerungstemperatur von -20°C deutlich an Aktivität verliert, ist darauf
zu achten ihre Aktivität in regelmäßigen und kurzen Abständen zu prüfen, bevor präparative
Ansätze durchgeführt werden.
5.4.2.2
Test der Enzyme auf Inhibierung mittels Photometer
Aus der Literatur ist bekannt, dass z.B. die Glutamatdehydrogenase aus Clostridium
symbiosum eine kompetitive Inhibierung sowohl durch das Produkt α-Ketoglutarat als auch
durch den Cofaktor NADH zeigt.[10] Im Folgenden soll nun untersucht werden, ob die
Leucindehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus cereus ebenfalls einer Produktinhibierung, hier
durch Ketovalin (9a), unterliegt. Des Weiteren soll auch die NADH-Oxidase aus L. brevis auf
Inhibierung durch L-Valin (8a) und Ketovalin (9a) getestet werden. Bisher gibt es noch keine
Untersuchungen der NADH-Oxidase auf eine mögliche Inhibierung durch die Aminosäure
L-Valin
(8a) und ihre analoge Ketosäure (9a).
Abbildung 5.20 Untersuchung der LeuDH auf Inhibierung (mittels Photometertest)
Analog den Photometertests zur Bestimmung der Enzymaktivität wird auch hier die Bildung
(siehe Abbildung 5.20) bzw. die Abnahme (siehe Abbildung 5.21) des Cofaktors NADH in
Gegenwart unterschiedlicher Mengen des zu testenden Additivs beobachtet. Die für die
LeuDH bzw. die NOx bestimmte Aktivität des Enzyms ohne Zusatz von Additiv wird als
Referenz auf 100% relative Aktivität festgesetzt. Alle weiteren bestimmten Aktivitäten werden
relativ dazu angegeben.
Abbildung 5.21 Untersuchung der NADH-Oxidase auf Inhibierung (mittels Photometertest)
120
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5.4.2.2.1
Inhibierung der Leucindehydrogenase durch Ketovalin 9a
Insbesondere die Produktinhibierung spielt bei der enzymatisch Oxidation von Aminosäuren
zu ihren analogen α-Ketosäuren eine große Rolle.[10] Die Untersuchung der LeuDH auf
Produktinhibierung erfolgte analog AAV 22 bei pH 8 in Gegenwart verschiedener
Konzentrationen Ketovalin (siehe Abbildung 5.22). Die Aktivität der LeuDH ohne Zusatz an
Additiv wird auf 100% festgesetzt. Alle weiteren bestimmten Aktivitäten werden relativ dazu
angegeben. Die Ergebnisse sind in in Abbildung 5.23 graphisch dargestellt.
Abbildung 5.22 Untersuchung der LeuDH auf Produktinhibierung
100
relative Aktivität [%]
80
60
40
20
0
0 mM
0,5 mM
2,5 mM
3,5 mM
Konzentration an Ketovalin (Na-Salz)
Abbildung 5.23 Produktinhibierung der LeuDH in Abhängigkeit der Ketovalin-Konzentration
Anhand der Abbildung 5.23 ist deutlich zu erkennen, dass die LeuDH-Aktivität mit
steigender Ketovalin-Konzentration abnimmt. Dies deutet auf eine Produktinhibierung hin.
Die hier beobachtete Produktinhibierung wird später im präparativen Ansatz überprüft (siehe
Abschnitt 5.4.4.5). Sollte es sich bei der im Photometer festgestellten Produktinhibierung um
eine kompetitive Hemmung handeln, so sollte im präparativen Ansatz in Gegenwart eines
effizienten Cofaktorregenerierungssystems (NOx irreversibel) das Gleichgewicht der
121
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Reaktion auf die Produktseite verschoben sein und damit verbunden der Einfluss der
Ketovalin-Konzentration deutlich niedriger sein.
5.4.2.2.2
Inhibierung der NADH-Oxidase durch Ketovalin
Bisher gibt es kaum Informationen über Faktoren, die die NADH-Oxidase aus Lactobacillus
brevis inhibieren. Deshalb wird im Folgenden die Inhibierung der NOx in Abhängigkeit
verschiedener Konzentrationen an Ketovalin (9a) untersucht. Die Durchführung erfolgt
analog AAV 23. Die Aktivität der NOx ohne Zusatz an Additiv wird auf 100% festgesetzt. Alle
weiteren bestimmten Aktivitäten werden relativ dazu angegeben. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 8.35 zusammengefasst und in Abbildung 5.25 graphisch dargestellt.
0-50 mM Ketovalin
NADH-Oxidase aus L. br ev is
NADH
100 mM Kaliumphosphatpuff er
pH 8
NAD +
Abbildung 5.24 Untersuchung der NOx auf Produktinhibierung
160
relative Aktivität [%]
140
120
100
80
60
40
20
0
0 mM
10 mM
25 mM
50 mM
Ketovalin-Konzentration
(Na-Salz)
Abbildung 5.25 Einfluss von Ketovalin 9a auf die NOx
Selbst
bei
einer
relativ
hohen
Konzentration
von
50 mM
Ketosäure
9a
(siehe
Abbildung 5.25) konnte keine signifikante Inhibierung der NOx beobachtet werden. Die
Restaktivität
122
betrug
noch
91%
im
Vergleich
zur
Aktivität
ohne
Additiv
(siehe
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Abbildung 5.25). Der Einfluss höherer Produktkonzentrationen auf die Aktivität der NOx
konnten im Photometer auf Grund der (starken) Eigenabsorption der Ketosäure bei einer
Wellenlänge von 340 nm nicht bestimmt werden.
Präparative Ansätze werden bei 25 mM Substrat-Konzentration durchgeführt. Anhand der
Ergebnisse des Photometertests ist selbst bei vollständigem Umsatz zum Produkt noch
keine Inhibierung der NOx durch das Produkt Ketovalin zu erwarten.
5.4.2.2.3
Untersuchung der NADH-Oxidase auf Inhibierung durch L-Valin
Wie bereits oben erwähnt, ist bisher wenig über die Inhibierung der NADH-Oxidase aus
L. brevis bekannt. Eine Inhibierung durch das Produkt Ketovalin (9a) konnte bereits
ausgeschlossen werden (siehe Abschnitt 5.4.2.2.2). Um zu wissen, ob eine Inhibierung
durch L-Valin (8a) in der Reaktionsführung berücksichtigt werden muss, erfolgt die
Untersuchung der NOx auf Substratinhibierung. Diese wurde analog AAV 23 bestimmt. Die
Aktivität der NOx ohne Zusatz an Additiv wird auf 100% festgesetzt. Alle weiteren
bestimmten Aktivitäten werden relativ dazu angegeben. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 5.27 graphisch dargestellt.
Abbildung 5.26 Untersuchung der NOx auf Substratinhibierung
Bis zu einer Konzentration von 50 mM L-Valin 8a konnte im Photometer keine inhibierende
Wirkung auf die NOx festgestellt werden. Selbst bei einer 100 mM Substratkonzentration
konnte noch eine Restaktivität von 72% bestimmt werden. Auf Grund dieser Ergebnisse ist
bei präparativen Ansätzen mit einer 25 mM Substratkonzentration keine Inhibierung der NOx
durch die Aminosäure L-Valin zu erwarten.
123
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
120
relative Aktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0 mM
10 mM
25 mM
50 mM
75 mM
100 mM
Valin-Konzentration
Abbildung 5.27 Einfluss von L-Valin (8a) auf die NOx
Analytik – Umsatzbestimmung mittels 1H-NMR-Spektroskopie für
5.4.3
Umsetzungen von L-Valin zu α-Ketovalin
Es wurde getestet, ob eine Umsatzbestimmung mittels 1H-NMR-Spektroskopie möglich ist,
oder ob die Signale überlappen. Dazu wurde analog AAV 24 eine Mischung von Aminosäure
8a und Ketosäure 9a in D2O gemessen. Eine Mischung der beiden Verbindungen im
Verhältnis 1:1 (v/v) wurde mit D2O versetzt und mittels 1H-NMR-Spektroskopie gemessen
(Spektrum siehe Abbildung 5.28). Das Signal des Lösungsmittels wurde auf 4.80 ppm
kalibriert.
Im 1H-NMR-Spektrum, aufgenommen in D2O, kann man die beiden Verbindungen sehr gut
voneinander unterscheiden. Die chemische Verschiebung der Signale von L-Valin (8a)
beträgt 0.99 (CH3), 2.25 (CH) und 3.59 ppm (CH), während die der Signale von Ketovalin
1.10 (CH3) und 3.00 ppm (CH) beträgt. Bei niedriger konzentrierten Proben (50 mM) ist der
Einfluss des Wassersignals deutlich stärker ausgeprägt. Hier liegt bereits das Signal der
Ketosäure bei 3.00 ppm im Drift des großen Wassersignals. Die Umsatzbestimmung erfolgt
deshalb über die Integrale der CH3-Gruppen von Edukt und Produkt (dd bei 0.99 ppm von
L-Valin
(8a) und d bei 1.10 ppm von Ketovalin (9a)), da diese Signale am besten exakt
integrierbar sind.
124
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Abbildung 5.28 1H-NMR-Spektrum einer 1:1-Mischung von Ketovalin 9a und L-Valin 8a
Zur Evaluierung der Umsatzbestimmung mittels 1H-NMR-Spektroskopie in D2O wurden eine
1:1 Mischung Ketosäure zu Aminosäure vermessen und der Umsatz analog oben
beschriebener Methode über die Integrale der CH3-Gruppen von Edukt und Produkt
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5.4 zusammengestellt.
Tabelle 5.4 Evaluierung der Umsatzbestimmung mittels 1H-NMR-Spektroskopie
Eintrag
1
Probenkonzentration
eingesetztes Verhältnis
bestimmtes Verhältnis
[mM]
Ketovalin : Valin
Ketovalin : Valin
25
1:1
1:1
Es zeigte sich zunächst eine 50 mM Probe als Untergrenze, wobei inzwischen auch bei
25 mM Proben der Umsatz bestimmt werden kann (Tabelle 5.4, Eintrag 1). Dabei wurden
die Stammlösungen in kleinen Maßkolben angesetzt und das in der Probe eingesetzte 1:1
Verhältnis von L-Valin zu Ketovalin spiegelte sich im 1H-NMR-Spektrum exakt wieder.
125
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5.4.4
Umsetzungen von L-Valin mit Leucindehydrogenase unter
Verwendung von NADH-Oxidase zur Cofaktorregenerierung
Die Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus und die NADH-Oxidase aus Lactobacillus
brevis weisen stark voneinander abweichende pH-Optima auf. Während das pH-Optimum
der NADH-Oxidase im leicht sauren Bereich liegt,[126] weißt die Leucindehydrogenase aus
B. cereus für die oxidative Desaminierung ein pH-Optimum im basischen Bereich auf.[124]
Auf Grund der stark unterschiedlichen pH-Abhängigkeit der beiden Enzyme musste ein
Kompromiss bezüglich des Reaktionsmediums gefunden werden. Lanzerath bestimmte als
gemeinsames pH-Optimum der beiden Enzyme pH 8.0.[161] Präparative Ansätze werden
deshalb wie die Photometertests in Kpi-Puffer pH 8 durchgeführt. Laut Literatur liegt das pHOptimum für die reduktive Aminierung von 2-Ketovalerat und 2-Ketoisovalerat bei
pH 8.5.[124] In Gegenwart eines effizienten Cofaktorregenerierungssystem, wie es die
NADH-Oxidase mit einem irreversiblen Schritt darstellt, ist dies jedoch vernachlässigbar.
5.4.4.1
Benchmarkreaktion und Reproduzierbarkeit
Die ersten präparativen Ansätze wurden analog AAV 25 in einem Gesamtvolumen von
1.5 ml im Thermoschüttler durchgeführt. Dabei konnte für die Oxidation von L-Valin (8a) nach
24 Stunden maximal ein Umsatz von 18% erzielt werden (siehe Abschnitt 8.2.3.6). Ein
limitierender Faktor könnte hier der Sauerstoff sein, der zur Cofaktorregenerierung benötigt
wird. Die NADH-Oxidase (NOx) regeneriert NAD+ aus NADH unter gleichzeitiger Reduktion
von Sauerstoff zu Wasser (siehe Abbildung 5.16). Weitere Ansätze wurden deshalb analog
AAV 26 in einem Gesamtvolumen von 5 ml im 10 ml Rundkolben durchgeführt (siehe
Abbildung 5.29). Der Reaktionsverlauf der Benchmarkreaktion ist in Abbildung 5.30
graphisch darstellt
Abbildung 5.29 Benchmarkreaktion im Maßstab 5 ml
126
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Durch die Erhöhung der Ansatzgröße auf ein Gesamtvolumen von 5 ml sowie der
Verwendung eines Rundkolbens anstelle eines Eppendorfgefäßes, konnte ein Umsatz von
69% erzielt werden (siehe Abbildung 5.30, blaue Kurve). Eine mögliche Ursache hierfür
könnte
eine
verbesserte
Durchmischung
der
Reaktionslöung
und
ein
besserer
Sauerstoffeintrag als im Schüttler sein.
100
Umsatz [%]
80
60
1
40
2
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
Abbildung 5.30 Reaktionsverlaufs der Benchmarkreaktion zur Oxidation von L-Valin (8a)
Um die Reproduzierbarkeit im Kolben zu überprüfen wurde ein Vergleichsexperiment (siehe
Tabelle 8.37, Eintrag 2) unter exakt gleichen Reaktionsbedingungen mit derselben
Enzymcharge durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Ergebnisse sehr gut reproduzierbar
sind; die beiden Kurven sind nahezu identisch (siehe Abbildung 5.30, rote Kurve). Die
Abweichungen liegen im Rahmen der für 1H-NMR-Messungen üblichen Schwankungen.
Die Benchmarkreaktion wurde analog AAV 26 mit jeder neuen Enzymcharge durchgeführt.
Eine Zusammenfassung dieser Reaktionen ist in Tabelle 8.37 und Abbildung 5.31
dargestellt. Daraus ist ersichtlich, dass die Reaktion innerhalb einer Enzymcharge sehr gut
reproduzierbar ist, die Übertragbarkeit bei Wechsel einer oder mehrerer Chargen ist nicht
gegeben. Der nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden erzielte Gesamtumsatz variiert
zwischen 69% und 93%. Ein Umsatz von 93% zum Produkt 9a bei 25 mM
Substratkonzentration stellt bereits ein sehr gutes Ergebnis dar.
Eine Ursache für schwierige Übertragbarkeit könnte sein, dass durch die unterschiedliche
Aktivität der Enzymchargen unterschiedliche Volumina an Enzym eingebracht werden,
127
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
wodurch auch die Puffermenge variiert. Bei Verwendung von Rohextrakten können auch
diese selbst den pH-Wert beeinflussen.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
Eintrag 1
Eintrag 3
Eintrag 4
Eintrag 5
Abbildung 5.31 Reproduzierbarkeit der Benchmarkreaktion unter Verwendung
verschiedener Enzymchargen (analog Tabelle 8.37)
Betrachtet
man
den
Kurvenverlauf
der
in
Abbildung
5.31
dargestellten
Benchmarkreaktionen unter Verwendung verschiedener Enzymchargen, so stellt man fest,
dass unabhängig vom Gesamtumsatz der Reaktionsverlauf für die enzymatische Oxidation
von L-Valin (8a) sehr ähnlich aussieht. In den ersten zwei bis drei Stunden der Reaktion
nimmt der Umsatz linear zu. Nach einer Reaktionszeit von ca. 4 Stunden verlangsamt sich
die Reaktion zunehmend bevor man in den Bereich der Sättigung kommt. Zwischen acht und
24 Stunden Reaktionszeit findet kaum weitere Produktbildung statt. Dies weist darauf hin,
dass eines der beiden Enzyme nach vier Stunden deutlich an Aktivität verliert.
5.4.4.2
Einfluss der Rührgeschwindigkeit
Wie bereits in Abschnitt 5.4.4.1 erwähnt könnte sich die Verfügbarkeit von Sauerstoff
limitierend auf den Umsatz von L-Valin (8a) zu Ketovalin (9a) auswirken. Deshalb soll
getestet werden, ob durch die Erhöhung der Rührgeschwindigkeit ein höherer Umsatz durch
bessere Sauerstoffdiffusion erzielt werden kann. Dafür werden analog AAV 26 zwei Ansätze
128
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
bei unterschiedlicher Rührgeschwindigkeit durchgeführt (siehe Abbildung 5.32). Die
Ergebnisse sind in Abbildung 5.33 graphisch dargestellt.
Abbildung 5.32 Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf die Oxidation von L-Valin
Im Gegensatz zur enzymatischen Oxidation von L-Leucin (8b) konnte bei der enzymatischen
Oxidation von L-Valin (8a) zu Ketovalin (9a) unter in situ Cofaktorregenerierung kein Einfluss
der Rührgeschwindigkeit auf die Produktbildung beobachtet werden (siehe Abbildung
5.33).[162] Da hier kein Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf die Oxidation von L-Valin (8a)
festgestellt werden konnte, sollen weitere Ansätze bei 400 rpm durchgeführt werden um
Scherkräfte, die das Enzym deaktivieren können, zu vermeiden.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
400 rpm
1000 rpm
Abbildung 5.33 Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf den Reaktionsverlauf
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Oxidation von L-Leucin (8b) und L-Valin (8a)
durch unterschiedliche Faktoren limitiert ist. Bei der Oxidation von L-Leucin (8b) stellen die
Sauerstofflöslichkeit und dessen Diffusion im Reaktionsgemisch den limitierenden Faktor
129
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
dar, während die Oxidation von L-Valin (8a) so langsam verläuft, dass weder
Sauerstofflöslichkeit noch Sauerstoffdiffusion den Prozess limitieren.
5.4.4.3
Nachdosieren verschiedener Komponenten während der Reaktion
Obwohl bei Verwendung unterschiedlicher Enzymchargen die Reaktion im Hinblick auf den
Gesamtumsatz nur schwer reproduzierbar ist, sieht der Kurvenverlauf doch recht ähnlich aus
(siehe Abbildung 5.31). In allen Fällen sieht man nach ca. vier Stunden eine deutlich
verlangsamte Produktbildung (Sättigung). Dies könnte auf ein Stabilitätsproblem eines der
beiden Enzym oder des Cofaktors unter Reaktionsbedingungen hindeuten.[151] Deshalb
werden im Folgenden nach einer Reaktionszeit von vier Stunden verschiedene
Komponenten (LeuDH, NOx, NAD+) nachdosiert, um zu untersuchen ob eine der drei
Komponenten die Produktbildung limitiert und diese Limitierung durch erneute Zugabe einer
Komponente überwunden werden kann. Die Durchführung erfolgte analog AAV 27. Als
Vergleich dient stets eine Benchmarkreaktion, die unter den gleichen Bedingungen ohne
erneute Zugabe einer der drei Komponenten durchgeführt wurde.
Abbildung 5.34 Nachdosieren verschiedener Komponenten (LeuDH, NOx, NAD+)
5.4.4.3.1
NADH-Oxidase
Aus der Literatur ist bekannt, dass die NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis nur in einem
sehr engen pH-Bereich (pH 5 - 7) stabil lagerbar ist.[125] Es ist also durchaus vorstellbar,
dass die NADH-Oxidase in Puffer pH 8 als Reaktionsmedium über 24 Stunden an Aktivität
verliert. Deshalb wird analog AAV 27 nachfolgend die NADH-Oxidase nach einer
130
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Reaktionszeit von vier Stunden erneut zugegeben (siehe Abbildung 5.34). Die Kinetikdaten
sind in Tabelle 8.43 zusammengefasst und in Abbildung 5.35 graphisch dargestellt.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
BM
Nox
Abbildung 5.35 Nachdosieren von NADH-Oxidase
Durch das Nachdosieren von NOx (Abbildung 5.35, rote Kurve) konnte im Vergleich zur
Benchmarkreaktion (Abbildung 5.35, blaue Kurve) kein Einfluss auf den Umsatz festgestellt
werden. Nach 24 Stunden lag der Umsatz im Fall der Benchmarkreaktion bei 69%, der des
Vergleichsexperiments bei 65%. Die Abweichung von 4% im Umsatz liegt im Rahmen der
Messschwankungen.
5.4.4.3.2
Leucindehydrogenase (LeuDH)
In den Photometertests (siehe Abschnitt 5.4.2.2) zeigte die LeuDH aus Bacillus cereus eine
Inhibierung durch Ketovalin (9a). Entsprechend wurde getestet, ob durch die erneute Zugabe
von LeuDH nach vier Stunden eine Verbesserung im Umsatz erzielt werden kann. Dafür
wurde analog AAV 26 eine Benchmarkreaktion durchgeführt. Zum Vergleich wurde analog
AAV 27 die Oxidation von L-Valin (8a) durchgeführt, wobei nach einer Reaktionszeit von vier
Stunden erneut 134 U/mmol LeuDH zugegeben wurden (siehe Abbildung 5.34). In
Abbildung 5.36 sind die beiden Reaktionsverläufe vergleichend dargestellt.
Vergleicht man den Kurvenverlauf der beiden Experimente, so kann kein Einfluss auf den
Umsatz durch die erneute Zugabe der Leucindehydrogenase festgestellt werden (siehe
131
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Abbildung 5.36). Nach 24 Stunden liegt der Umsatz mit 84% (Abbildung 5.36, rote Kurve)
nicht höher als der der Benchmarkreaktion (83% Umsatz; Abbildung 5.36, blaue Kurve).
Betrachtet man die graphische Darstellung der Ergebnisse so ist erkennbar, dass die beiden
Kurven nahezu deckungsgleich sind. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die
Leucindehydrogenase nicht den limitierenden Faktor bei der Oxidation von L-Valin (8a)
darstellt.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
BM
LeuDH
Abbildung 5.36 Nachdosieren von LeuDH
Da die Leucindehydrogenase bei pH 8 auch die reduktive Aminierung katalysiert und sich
somit eine Gleichgewicht zwischen Edukt und Produkt einstellt,[124] könnte es durchaus
sein, dass dieser Effekt bei der Untersuchung auf Produktinibierung im Photometer
beobachtet
wurde
(siehe
5.4.2.2.1).
Durch
die
Verwendung
eines
effizienten
Cofaktorregenerierungssystems im präparativen Ansatz, hier z.B. in Form der NADHOxidase wurde dieses Gleichgewicht auf die Produktseite verschoben.
5.4.4.3.3
Cofaktor
Das Nachdosieren der beiden Enzyme LeuDH und NOx brachte keine Verbesserung im
Umsatz verglichen mit der jeweils zugehörigen Benchmarkreaktion. Nun soll der Einfluss des
Cofaktors NAD+ untersucht werden.
132
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Die benötigten Cofaktoren sind nicht nur teuer sondern auch instabil in Lösung,[151] wobei
NAD(P)H in basischem Medium stabiler ist als in saurer Lösung, während NAD(P)+ in saurer
Lösung stabiler ist als in basischer Lösung.[163,164] Um auszuschließen, dass eine
mangelnde Stabilität des Cofaktors unter Reaktionsbedingungen (pH 8) den Prozess limitiert,
soll auch dieser nach vier Stunden nachdosiert werden (siehe Abbildung 5.34). Die
Durchführung erfolgt analog AAV 27. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.44 zusammengefasst
und in Abbildung 5.37 graphisch dargestellt.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
BM
NAD+
Abbildung 5.37 Nachdosieren von NAD+
Vor erneuter Zugabe des Cofaktors wurde nach vier Stunden eine Probe entnommen um
mittels 1H-NMR-Spektroskopie den Umsatz zu bestimmen. Mit 83% und 88% (Abbildung
5.37) lag der nach 24 Stunden erzielt Umsatz für beide Reaktionen in demselben Bereich.
Auch durch das Nachdosieren von Cofaktor (in Form von NAD+) kann nach einer
Reaktionszeit von vier Stunden kein signifikanter Einfluss auf den Umsatz festgestellt
werden.
5.4.4.4
Einfluss von FAD auf den Reaktionsverlauf
Bei der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis handelt es sich um ein homotetrameres
Flavoenzym mit einem Molekulargewicht von 48.8 kDa und einem kovalent gebundenen
FAD-Molekül pro Untereinheit.[154] Dieses Enzym gehört zu den FAD-abhängigen PyridinNukleotid-Reduktasen und weist ebenso wie die NADH-Oxidasen aus Lactobacillus
133
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
sanfranciscensis, Enterococcus faecalis, Streptococcus equi (Subspezies zooepidemicus)
und Brachyspira hyodysenteriae zwei FAD-Bindungsdomänen und ein NAD-Bindungsmotif
auf.[125]
Abbildung 5.38 FAD
Während die (H2O-bildende) NOx aus Leuconostoc mesenteroides durch FAD-Zugabe nicht
aktiviert wird,[165] kann die (H2O2-bildende) NOx aus Thermus thermophilus durch FADZugabe aktiviert werden.[166] Eine Aktivierung in Gegenwart von FAD wurde auch für die
NOx aus Lactobacillus brevis getestet.[139] In Photometertests, die in Gegenwart von
10 - 15 µM FAD durchgeführt wurden, zeigte die NOx eine Aktivitätssteigerung um das 5 bis
6.5-fache.[139] Es sollte nun untersucht werden, ob dies auch für den präparativen Ansatz
gilt und ob damit der Umsatz gesteigert werden kann. Analog der in Abschnitt 8.2.3.7.4
beschriebenen
Methode
wurden
Ansätze
bei
verschiedenen
FAD-Konzentrationen
durchgeführt (siehe Abbildung 5.39). Der Reaktionsverlauf wurde mittels
1
H-NMR-
Spektroskopie verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.39 zusammengefasst und in
Abbildung 5.40 graphisch dargestellt.
O
OH
NH2
8a
25 mM
+ H2O
0 - 75 µM FAD
1 mM NAD+
16.7 U LeuDH aus B. cereus
83.3 U Nox aus L. brevis
100 mM Kpi-Puffer pH 8
5 ml Gesamtvolumen
400 rpm
O
OH
O
9a
Abbildung 5.39 Variation der FAD-Konzentration im Ansatz
134
+ NH3
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Der in der Literatur beschriebene Einfluss von FAD konnte hier nicht bestätigt werden.[139]
Bei Zusatz von 10 µM FAD konnte kein Einfluss auf den Reaktionsverlauf beobachtet
werden (siehe Abbildung 5.40, rote Kurve). Die Ergebnisse stimmen mit denen der
Benchmarkreaktion (blaue Kurve) überein. In beiden Fällen lag der Gesamtumsatz nach 24
Stunden bei 83 bzw. 84%.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
BM, 0 µM FAD
10 µM FAD
75 µM FAD
Abbildung 5.40 Einfluss der FAD-Konzentration auf den Reaktionsverlauf
Um auszuschließen, dass die gewählte FAD-Konzentration von 10 µM zu niedrig war, wurde
auch ein Experiment in Gegenwart einer höheren FAD-Konzentration (75 µM; grüne Kurve)
durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde mit 79% sogar ein etwas niedriger Umsatz für die
Oxidation von L-Valin (8a) bestimmt. Die Abweichung von 5%-Punkten liegt noch im Bereich
der Fehlertoleranz so dass keine gesicherte Aussage darüber getroffen werden kann, ob
eine
erhöhte
FAD-Konzentration
nicht
sogar
einen
negativen
Einfluss
auf
den
Reaktionsverlauf ausübt. Da keine Umsatzsteigerung durch FAD-Zugabe beobachtet werden
konnte, wird in weiteren Ansätzen auf den Zusatz des teuren FAD verzichtet.
5.4.4.5
Präparative Untersuchungen zur Produktinhibierung
In den Abschnitten 5.4.2.2.1 und 5.4.2.2.2 wurde bereits die Produktinhibierung der LeuDH
sowie der NOx via Photometer untersucht. Dabei wurde ein sehr starker Einfluss von
Ketovalin (9a) auf die LeuDH aus Bacillus cereus festgestellt (siehe Abbildung 5.23). Eine
Inhibierung der NOx aus Lactobacillus brevis durch Ketovalin (9a) konnte nicht bestätigt
135
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
werden. Nun soll der Einfluss von Ketovalin (9a) auf das System unter Standardreaktionsbedingungen untersucht werden. Analog AAV 28 wurden Ansätze in Gegenwart
unterschiedlicher Mengen Ketovalin (9a) durchgeführt und der Reaktionsverlauf mittels
1
H-NMR-Spektroskopie verfolgt (siehe Abbildung 5.41). Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.45
zusammengefasst und in Abbildung 5.42 graphisch dargestellt.
O
OH
+ H2O
NH2
8a
25 mM
0 - 50 mM Ketovalin (9a)
1 mM NAD+
16.7 U LeuDH aus B. cereus
83.3 U Nox aus L. brevis
100 mM Kpi-Puffer pH 8
5 ml Gesamtvolumen
400 rpm
O
OH
+ NH3
O
9a
Abbildung 5.41 Untersuchung des Reaktionssystems auf Produktinhibierung
In der Benchmarkreaktion, bei 25 mM Substratkonzentration ohne Zusatz an Ketovalin (9a),
konnte nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden ein Umsatz von 93% erzielt werden
(Abbildung 5.42, blaue Kurve). Entgegen den Ergebnissen aus dem Photometertest zur
Inhibierung der LeuDH durch Ketovalin (9a) sieht man hier bei 2.5 mM KetovalinKonzentration noch keinen Einfluss auf den Reaktionsverlauf (Abbildung 5.42, rote Kurve).
Der Umsatz ist mit 92% nach 24 Stunden nahezu identisch mit dem Umsatz der
Benchmarkreaktion (93%, Eintrag 1).
Im Gegensatz zum Photometertest (siehe Abschnitt 5.4.2.2.1) wird in präparativen Ansätzen
ein System zur Cofaktorregenerierung eingesetzt. Die NADH-Oxidase dient aber nicht nur
Cofaktorregenerierung, sondern gleichzeitig auch zur Gleichgewichtsverschiebung. Der bei
der Oxidation der Aminosäure gebildete Cofaktor NADH regeneriert und steht damit nicht
mehr zur Rückreaktion, der reduktiven Aminierung der gebildeten Ketosäure, zur
Verfügung.[10] Dieser Effekt fehlt im beschriebenen Photometertest, in dem keine NADHOxidase vorhanden ist.
In Gegenwart höherer Mengen an Ketovalin (25 und 50 mM 9a) erkennt man einen deutlich
negativen Einfluss der Produktkonzentration auf den Reaktionsverlauf und den erzielten
Gesamtumsatz. Die Produktbildung in den ersten vier Stunden erfolgt deutlich langsamer (49
bzw. 42% gegenüber bis zu 75% Umsatz). Dennoch konnte bei 25 mM KetovalinKonzentration im Ansatz nach 24 Stunden noch ein Umsatz von 77% erzielt werden. Bei
136
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
50 mM Ketovalin-Konzentration im Ansatz wurde nach 24 Stunden noch ein Umsatz von
66% erzielt. Erstaunlich ist, dass in beiden Fällen zwischen acht und 24 Stunden noch eine
Umsatzsteigerung von 10% beobachtet wurde. Dies ist ein Hinweis auf eine hohe Stabilität
der Enzyme unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Durch eine Verlängerung der
Reaktionslaufzeit könnte möglicherweise noch ein besserer Umsatz in Gegenwart hoher
Ketovalin-Konzentrationen erreicht werden.
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
BM
2.5 mM KV
25 mM KV
50 mM KV
Abbildung 5.42 Präparative Untersuchung des Reaktionssystems auf Produktinhibierung
5.4.4.6
Einfluss der Menge an NADH-Oxidase im präparativen Ansatz
Die erneute Zugabe von NADH-Oxidase (siehe Abschnitt 5.4.4.3.1) brachte keine
Verbesserung im Umsatz. In der Literatur ist aber bekannt, dass die katalytische Aktivität der
NADH-Oxidase durch die Turnover Number (TON) limitiert ist.[10] Um auszuschließen, dass
dies hier der Fall ist, wurde eine sehr hohe Aktivität der NADH-Oxidase zugegeben (siehe
Abbildung 5.43). Die Durchführung erfolgte analog AAV 26. Die Ergebnisse sind in Tabelle
8.40 zusammengefasst und in Abbildung 5.44 graphisch dargestellt.
Der Einsatz von 83.3 U NADH-Oxidase zeigt den typischen Reaktionsverlauf: zunächst fast
linearer Anstieg der Produktbildung über zwei bis drei Stunden, nach ca. vier Stunden
langsamere Produktbildung und Eintritt in den Sättigungsbereich, nach acht Stunden kaum
mehr Produktbildung. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wurde ein Umsatz von 88%
erzielt (siehe Abbildung 5.44, blaue Kurve).
137
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Abbildung 5.43 Variation der NOx-Menge im Ansatz
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
83.3 U Nox
125 U Nox
Abbildung 5.44 Reaktionsverlauf bei Variation der NOx-Menge im Ansatz
Wurde zu Beginn der Reaktion eine erhöhte NOx-Menge von 125 U eingesetzt (rote Kurve),
so liegen die Umsätze nach vier bzw. acht Stunden um 8 bzw. 10%-Punkte höher als die der
Benchmarkreaktion. Unter Verwendung von 125 U NOx konnte bereits nach acht Stunden
ein Umsatz von 94% erzielt werden. Damit stellt dieses Experiment das beste bisher erzielte
Ergebnis dar.
5.4.4.7
Variation der Cofaktorkonzentration im Ansatz
In Photometertests wurde von Lanzerath am FZ Jülich für die LeuDH aus Bacillus cereus
eine optimale Cofaktorkonzentration von 5 mM (NAD+) bestimmt,[161] wohingegen für die
NOx aus Lactobacillus brevis eine niedrigere Cofaktorkonzentration bis 0.3 mM NADH von
Vorteil ist.[139] In den vorangegangenen präparativen Ansätzen wurde bisher eine
138
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Konzentration des Cofaktors von 1 mM gewählt. Auf Grund der Ergebnisse von Lanzerath
soll der Einfluss der NAD+-Konzentration (0.2 – 5 mM) im Ansatz untersucht werden (siehe
Abbildung 5.45). Die Durchführung erfolgte analog AAV 26.
Abbildung 5.45 Einfluss des Cofaktors NAD+
Wurde der Cofaktor NAD+ in Konzentrationen von 0.5 bis 5.0 mM eingesetzt, so wurde nach
24 Stunden ein Gesamtumsatz von 91 - 95% erzielt. Auch der Reaktionsverlauf ist in allen
Fällen ähnlich. Lediglich bei einer geringen Cofaktorkonzentration von 0.2 mM wurde nach
24 Stunden mit 80% Gesamtumsatz ein niedrigerer Umsatz erzielt (siehe Abbildung 5.46).
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
0.2 mM NAD+
0.5 mM NAD+
2.5 mM NAD+
5.0 mM NAD+
1.0 mM NAD+
Abbildung 5.46 Reaktionsverlauf unter Variation der NAD+-Konzentration
Obwohl
in
der
Literatur
bei
Verwendung
der
NADH-Oxidase
eine
0.2 mM
Cofaktorkonzentration bevorzugt wird,[149] wurde bei dieser Cofaktorkonzentration im
präparativen Ansatz der niedrigste Umsatz erzielt. Des Weiteren zeigte sich, dass eine
Cofaktorkonzentration von 5.0 mM nicht notwendig ist, da die Umsätze nicht signifikant
gesteigert werden konnten. Die bisher verwendete Cofaktorkonzentration von 1 mM ist völlig
139
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
ausreichend für einen optimalen Reaktionsverlauf und wird folglich für weitere Ansätze
beibehalten.
5.4.5
Umsetzungen mit LeuDH unter Verwendung eines EisenPorphyrins als alternatives Cofaktorregenerierungssystem
Neben der natürlichen NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis steht auch eine
biomimetische NAD(P)H-Oxidase in Form des synthetischen Eisen(III)-Porphyrins Fe-TSPP
zur in situ Regenerierung des reduzierten Cofaktors zur Verfügung.[125,158] Im Gegensatz
zur natürlichen NOx aus Lactobacillus brevis akzeptiert Fe-TSPP (10) nicht nur NADH als
Substrat sondern auch NADPH. Für die Oxidation von NADH weist es dabei eine Aktivität
von 6.3 U/mg auf.[127] Das Eisen(III)-Porphyrin 10 wurde bereits erfolgreich zur
Cofaktorregenerierung bei der Oxidation von Cyclooctanol und verschiedener Zucker
eingesetzt.[127] Im Folgenden soll nun in präparativen Ansätzen die natürliche NADHOxidase durch die biomimetische NOx ersetzt werden:
Abbildung 5.47 Oxidation von L-Valin (8a) unter Verwendung von Fe-TSPP (10) zur
Cofaktorregenerierung
140
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Wie bereits in Abschnitt 5.4.1 erwähnt weisen die NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis
und die LeuDH aus Bacillus cereus stark voneinander abweichende pH-Optima auf (NOx:
pH 6.0; LeuDH: pH 10.5).[161] Ein Vorteil der biomimetischen Oxidase Fe-TSPP (10) könnte
darin liegen, dass die Oxidation von L-Valin (8a) nun am pH-Optimum der LeuDH durchgefürt
werden könnte.
5.4.5.1
Benchmarkreaktion
Analog der bisherigen Benchmarkreaktion wird nun die NADH-Oxidase aus Lactobacillus
brevis durch das synthetische Fe(III)-Porphyrin 10 ersetzt. Entsprechend der Literatur
wurden 2 mol% (2.6 mg; 5 µmol) Fe-TSPP verwendet.[127] Die Durchführung erfolgte
analog AAV 29. Die Kinetikdaten sind in Tabelle 8.46 zusammengefasst und in Abbildung
5.49 graphisch dargestellt.
Abbildung 5.48 Oxidation von L-Valin unter Verwendung von Fe-TSPP (10) zur
Cofaktorregenerierung
Unter Verwendung des Eisenporphyrins 10 zur Cofaktorregenerierung in der enzymatischen
Oxidation von L-Valin zu Ketovalin (9a) wurde ein Umsatz von 72% erzielt. In Gegenwart der
biomimetischen NADH-Oxidase Fe-TSPP verläuft
die Reaktion allerdings
deutlich
langsamer. Während hier nach einem Tag der Umsatz bei 39% liegt, wurde bei Verwendung
der NOx aus L. brevis und derselben Enzymcharge LeuDH nach 24 Stunden bereits einen
Umsatz von 93% erzielt.
Bemerkenswert ist, dass unter Verwendung von Fe-TSPP (10) über einen Zeitraum von
mehreren Tagen eine Umsatzsteigerung beobachtet werden kann. Dies deutet auf eine
erstaunliche Stabilität der LeuDH unter Reaktionsbedingungen hin.
141
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
Zeit [d]
Abbildung 5.49 Reaktionsverlauf der Benchmarkreaktion (Fe-TSPP zur
Cofaktorregenerierung)
5.4.5.2
Kontrollexperimente
Bevor untersucht wird, wie der Gesamtumsatz gesteigert werden kann muss durch
Kontrollexperimente sicher gestellt sein, dass zum Einen das Eisen-Porphyrin nicht in der
Lage ist die Aminosäure direkt zu oxidieren und zum Anderen muss getestet werden, ob das
Produkt Ketovalin auch über eine Reaktionszeit von mehreren Tagen stabil bleibt.
5.4.5.2.1
Blindprobe (ohne LeuDH)
Da unter Verwendung von Fe-TSPP (10) selbst nach mehr als zwei Tagen noch eine
Umsatzsteigerung beobachtet werden kann soll ausgeschlossen werden, dass dies auf eine
direkte Oxidation der Aminosäure L-Valin (8a) durch das Fe(III)-Porphyrin zurückzuführen ist.
Analog AAV 30 wurde eine sogenannte Blindprobe durchgeführt (siehe Kapitel 8.2.3.13.1).
Unter Reaktionsbedingungen wurden alle Komponenten mit Ausnahme der LeuDH über
mehrere Tage gerührt. In regelmäßigen Abständen wurden Proben entnommen und mittels
1
H-NMR-Spektroskopie wurde deren Zusammensetzung analysiert. Selbst nach 4 Tagen
konnte im
1
H-NMR-Spektrum keine Ketosäure (9a) nachgewiesen werden. Es waren
ausschließlich die Signale der Aminosäure 8a im Spektrum zu sehen. Damit konnte gezeigt
142
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
werden, dass das Eisenporphyrin ausschließlich den Cofaktor oxidiert und nicht in der Lage
ist die Aminosäure zur entsprechenden Ketosäure umzusetzen.
5.4.5.2.2
Produktstabilität
In der Literatur ist beschrieben, dass einige Ketosäuren leicht decarboxylieren oder
polymerisieren.[120] Deshalb wurde getestet, ob das Produkt unter den gewählten
Reaktionsbedingungen (Raumtemperatur, Puffer pH 8, 400 rpm) stabil bleibt. Dafür wurde
α-Ketovalin (eingesetzt als Natrium-Salz) über mehrere Tage bei Raumtemperatur in
100 mM Kpi-Puffer pH 8 gerührt. Selbst nach 8 Tagen konnten im 1H-NMR-Spektrum keine
Veränderungen
festgestellt
werden.
Dies
zeigt,
dass
das
Produkt
unter
Reaktionsbedingungen stabil ist.
5.4.5.3
Bei
Einfluss der Rührgeschwindigkeit
der
enzymatischen
in
situ
Cofaktorregenerierung
konnte
kein
Einfluss
der
Rührgeschwindigkeit auf die Oxidation von L-Valin (8a) zu Ketovalin (9a) beobachtet werden
(siehe Abschnitt 5.4.4.2). Dies gilt allerdings nicht für die Oxidation von L-Leucin (8b).[162]
Abbildung 5.50 Einfluss der Rührgeschwindigkeit auf das Reaktionssystem mit Fe-TSPP
Nun soll untersucht werden, ob die bisher relativ niedrigen Umsätze bei der Oxidation von
L-Valin
(8a) zu Ketovalin (9a) unter Verwendung von Fe-TSPP (10) zur Cofaktor-
regenerierung auf mangelnde O2-Löslichkeit und O2-Diffusion zurückzuführen ist. Dafür wird
analog
AAV 29
ein
Vergleichsexperiment
bei
einer
höheren
Rührgeschwindigkeit
durchgeführt (siehe Abbildung 5.50). Die Reaktionsverläufe der beiden Experimente sind in
Abbildung 5.51 graphisch dargestellt.
143
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
Zeit [d]
400 rpm
1000 rpm
Abbildung 5.51 Graphische Darstellung der Vergleichsexperimente analog Abbildung 5.50
Unabhängig von der Rührgeschwindigkeit wurde nach acht bzw. neun Tagen ein maximaler
Umsatz von L-Valin (8a) zu Ketovalin (9a) von rund 70% erzielt. Ein deutlicher Einfluss der
Rührgeschwindigkeit auf den Reaktionsverlauf konnte dabei nicht festgestellt werden. Eine
Limitierung
des
Prozesses
bzw.
der
Cofaktorregenerierung
durch
unzureichende
Sauerstofflöslichkeit und Sauerstoffdiffusion kann damit ausgeschlossen werden. Weitere
Ansätze werden bei 400 rpm durchgeführt, um Scherkräfte zu minimieren.
5.4.5.4
Einfluss der Eisenporphyrin-Menge
Zur Oxidation von L-Valin 8a unter enzymatischer in situ Cofaktorregenerierung wurden
üblicherweise 83.3 U NOx eingesetzt. In der Literatur wird die für Fe-TSPP bestimmte
Aktivität bezüglich der Oxidation von NADH mit 6.3 U/mg angegeben.[127] Damit müssen
umgerechnet 13.2 mg Fe-TSPP eingesetzt werden um ebenfalls auf eine Aktivität von 83.3 U
für das (biomimetische) Cofaktorregenerierungssystem zu kommen. Analog AAV 29 wurde
der Reaktionsverlauf bei Verwendung unterschiedlicher Mengen Fe-TSPP (10) zur Cofaktorregenerierung verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.47 zusammengefasst und in
Abbildung 5.53 graphisch dargestellt.
Betrachtet man den in Abbildung 5.53 dargestellten Reaktionsverlauf, so sieht man, dass
die Reaktion in den ersten beiden Tagen unabhängig von der zugegebenen Menge
Eisenporphyrin ähnlich schnell verläuft. Es scheint, als ob hier nicht die Eisenporphyrin-
144
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Menge und damit verbunden die Cofaktorregenerierung den limitierenden Faktor darstellt
sondern die Leucindehydrogenase den geschwindigkeitsbestimmenden Faktor darstellt.
Abbildung 5.52 Einfluss der Eisenporphyrinmenge
Betrachtet man die Kurvenverläufe in Abbildung 5.53 genauer, so sieht es so aus, als ob
die Reaktion bei erhöhter Eisenporphyrinmenge von 13.2 mg gegenüber 2.6 mg schneller
verläuft. Allerdings muss bedacht werden, dass das Eisen(III)-Porphyrin 10 paramagnetisch
ist. Dies führt dazu, dass bei Einsatz großer Eisenporphyrin-Mengen die Signale im 1H-NMRSpektrum breiter werden und somit die Umsatzbestimmung ungenauer wird (vgl. Abbildung
8.23 und Abbildung 8.24).
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
Zeit [d]
2.6 mg Fe-TSPP
13.2 mg Fe-TSPP
Abbildung 5.53 Einfluss der Eisenporphyrin-Menge auf den Reaktionsverlauf
Auf Grund der paramagnetischen Eigenschaften des Eisen(III)-Porphyrins Fe-TSPP und der
daraus entstehenden Schwierigkeiten bei der Umsatzbestimmung mittels
1
H-NMR-
Spektroskopie ist es schwierig eine exakte Aussage über den Einfluss der EisenporphyrinMenge zu treffen. Sicher ist nur, dass keine signifikante Verbesserung im Umsatz erzielt
145
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
werden konnte. Unabhängig von Rührgeschwindigkeit und eingesetzter EisenporphyrinMenge wurde jeweils ein Umsatz im Bereich von 70% erreicht. In folgenden Ansätzen sollen
2.6 mg Fe-TSPP (10) zur Cofaktorregenerierung eingesetzt werden, da in Gegenwart
geringerer Mengen des Eisenporphyrins 10 die Umsatzbestimmung genauer ist. Zudem
entspricht die bisher verwendete Menge von 2.6 mg Fe-TSPP bezogen auf eine 25 mM
Substratkonzentration an L-Valin (8a) einer Katalysatorbeladung von 20 mol%. Bezogen auf
die 1 mM Cofaktorkonzentration sind 2.6 mg Fe-TSPP bereits ein, für Katalyse untypisch
hoher Überschuss von fünf Äquivalenten.
5.4.5.5
Variation des pH-Werts
Wie in Abschnitt 5.4.1 bereits beschrieben, weisen die NADH-Oxidase und die
Leucindehydrogenase stark voneinander abweichende pH-Optima auf. Das pH-Optimum der
NOx aus Lactobacillus brevis liegt bei pH 6.0 während das der LeuDH aus Bacillus cereus
bei pH 10.5 liegt.[161] Bisherige Ansätze wurden stets bei pH 8 durchgeführt, da hier beide
Enzyme noch eine für präparative Ansätze ausreichende Aktivität aufweisen.
Da an Stelle der NOx auch Fe-TSPP 10 zur Cofaktorregenerierung verwendet wird, soll nun
untersucht werden, ob eine Verbesserung erzielt werden kann, indem die Reaktion am
pH-Optimum der LeuDH durchgeführt wird (siehe Abbildung 5.54). Dazu wird analog
AAV 29 ein Experiment Puffer pH 10.5 durchgeführt und der Reaktionsverlauf mittels
1
H-NMR-Spektroskopie über einen Zeitraum von 24 Stunden beobachtet. Da hier eine
andere Charge Leucindehydrogenase verwendet wurde wie bisher wurde zum Vergleich wie
üblich eine Benchmarkreaktion in Puffer pH 8.0 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in in
Abbildung 5.55 graphisch dargestellt.
Abbildung 5.54 Variation des Reaktionsmediums und des pH-Werts
146
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
Entgegen der Erwartung brachte die Änderung des Reaktionsmediums von Puffer pH 8 auf
Puffer pH 10.5 keine Verbesserung. Wurde der Ansatz bei pH 10.5 durchgeführt, so konnte
nach 24 Stunden maximal 5% Produkt identifiziert werden. Da bei Durchführung der
Reaktion in Puffer pH 10.5 auch nach 24 Stunden keine signifikante Produktbildung zu
beobachten war wurde die Reaktion nach einem Tag abgebrochen. Im Vergleich dazu zeigt
die Reaktion in Puffer pH 8.0 nach 24 Stunden bereits einen Umsatz von 46%.
Erfahrungsgemäß nimmt dieser über mehrere Tage noch weiter zu (vgl. auch Abbildung
5.49).
100
Umsatz [%]
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
Zeit [h]
pH 8
pH 10.5
Abbildung 5.55 Reaktionsverlauf bei variiertem Reaktionsmedium
Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass bei Durchführung der Reaktion in Glycin-Puffer
pH 10.5 der pH-Wert der limitierende Faktor ist. Damit wäre nicht nur die NOx-vermittelte
Cofaktorregenerierung pH-abhängig sondern auch die durch das synthetische Eisen(III)Porphyrin 10 vermittelte Cofaktorregenerierung. Dies wird durch Untersuchungen von Böhm
gestützt. Mittels Photometertets zeigte er, dass das Eisen(III)-Porphyrin 10 für die Oxidation
von NADH ein Optimum bei pH 7.0 aufweist.[167] Auch in präparativen Anwendungen wie
der enzymatischen Oxidation von Glucose bzw. Cycloheptanol zeigte das Eisen(III)Porphyrin eine Deaktivierung in Abhängigkeit des pH-Werts. Die hier bei pH 10.5
beobachtete Deaktivierung kann durch die Dimerisierung des Eisen(III)-Porphyrins 10 im
Basischen zum µ-Oxo-verbrückten Dimer erklärt werden (siehe Abbildung 5.56).[168-170]
147
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
OH2
N
N
Fe
N
N
O
N
N
Fe
N
N
OH2
Abbildung 5.56 Schematische Darstellung des FeTSPP-Dimers (zur besseren Übersicht
wurden die Sulfonatophenylgruppen nicht berücksichtigt)
5.4.5.6
Stabilität der Ketosäure in Abhängigkeit des pH-Werts
Im Zusammmenhang mit der Produktstabilität wurde untersucht, ob die Ketosäure bei
niedrigerem pH-Wert stabil bleibt. Die Durchführung erfolgte analog der in Abschnitt 8.2.3.14
beschriebenen Methode. 25 mM Lösungen von Ketovalin werden mit 2.5 M Salzsäure auf
pH 7, pH 5 oder pH 3 angesäuert und mittels Kernmagnetresonanz untersucht (D2O wird auf
4.80 ppm kalibriert). In Abbildung 5.57 sind die aufgenommenen 1H-NMR-Spektren über
den Bereich von 0.4 - 3.4 ppm dargestellt.
Abbildung 5.57 Vergleich der 1H-NMR-Spektren von 9a bei unterschiedlichen pH-Werten
148
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
In Abbildung 5.57 erkennt man dass neben den Signalen der Ketosäure 9a (Duplett bei
1.1 ppm und Multipeltt bei 3.0 ppm) weitere Signale im 1H-NMR-Spektrum zu sehen sind. Es
handelt sich um ein Duplett bei 0.94 ppm und ein Multiplett bei 2.10 ppm. Die Intensität
dieser Signale nimmt zu je saurer die Lösung ist. Allgemein erkennt man, dass die Ketosäure
auch im sauren Bereich noch relativ stabil ist.
Mit Hilfe einer Referenzmessung konnte ausgeschlossen werden, dass es sich bei den
zusätzlich beobachteten Signalen um das Decarboxylierungsprodukt Isobutyraldehyd (46)
oder dessen Hydrat (47) handelt. Die Signale von Isobutyraldehyd kommen bei 2.56 ppm (m)
und 1.10. ppm (d). Die Signale des Hydrats kommen bei 1.74 ppm (m) und 0.92 ppm (d).
Abbildung 5.58 Isobutyraldehyd (46) und dessen Hydrat (47)
149
ENZYMATISCHE OXIDATION NATÜRLICHER AMINOSÄUREN ZU α-KETOSÄUREN
5.5
Zusammenfassung des Teilkapitels
Es konnte ein enzymatischer Oxidationsprozess entwickelt werden, in dem L-Valin (25 mM)
mittels Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus selektiv zur Ketosäure 9a oxidiert wurde.
Als Cofaktor wird NAD+ (1 mM) benötigt, das während der Oxidation der Aminosäure zu
NADH reduziert wird. Dieses wurde in situ regeneriert. Hierfür wurden zwei Methoden
getestet. Zum Einen eine NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis (enzymatische
Cofaktorregenerierung) und zum Anderen das Eisenporphyrin Fe-TSPP (biomimetische
Cofaktorregenerierung).
Abbildung 5.59 Optimierter Prozess zur enzymatischen Oxidation von L-Valin (8a)
Im Fall der Oxidation von L-Valin (8a) unter enzymatischer in situ Cofaktorregenerierung
mittels NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis wurde im
1
H-NMR-Spektrum nach 24
Stunden ein Umsatz von bis zu 94% 9a beobachtet. Bei der Oxidation von L-Valin (8a) unter
biomimetischer in situ Cofaktorregenerierung mittels Fe-TSPP (10) wurde nach einer
Reaktionszeit von mehreren Tagen ein Umsatz von rund 70% erzielt. Zusammenfassend
kann
gesagt
werden,
dass
bisher
die
Vorteile
des
enzymatischen
Cofaktor-
regenerierungssystems im Vergleich zum biomimetischen System (Fe-TSPP) überwiegen.
Die Reaktionszeit ist kürzer und es werden höhere Umsätze erzielt.
Dies stellt den ersten enzymatischen Prozess zur Oxidation von L-Valin (8a) dar. Bisherige
Synthesemethoden zur Herstellung von Ketovalin basieren meist auf mehreren Stufen oder
verwenden giftiges Chromat.[132] Bei 25 mM Valin-Konzentration konnten bis zu 95%
Umsatz zum Produkt erzielt werden.
150
ZUSAMMENFASSUNG
6
Zusammenfassung
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung pharmazeutisch relevanter Verbindungen
unter Verwendung verschiedener Katalysatorsysteme, wobei der Fokus auf der Synthese
und Oxidation chiraler Amino-Verbindungen liegt.
Enantioselektive Synthese chiraler β-Aminosäurederivate durch organokatalysierte
Aza-Michael-Reaktion
Ziel
dieses
Teilkapitels
war
es
mittels
organokatalysierter
Aza-Michael-Reaktion
β-Aminosäurederivate herzustellen. Ausgehend von den Ergebnissen von Weiß zur
Synthese
enantiomerenangereicherter
β-Aminosäure-Derivate
mittels
Phasentransfer-
katalysierter Aza-Michael-Reaktion, konnte der ee-Wert des Produkts 3a von 20% auf
37% ee gesteigert werden indem an Stelle von 12.5 M Natronlauge 50%-ige Kalilauge als
wässrige Phase eingesetzt wurde. Das enantiomerenangereicherte Produkt 3a konnte mit
80% isoliert werden.
Abbildung 6.1 Aza-Michael-Reaktion zur Synthese von 3a unter optimierten Bedingungen
Die Verbesserung der Enantioselektivität der Aza-Michael-Reaktion zur Synthese des
Produkts 3a durch den Wechsel der Base ist auf den unterschiedlichen Gefrierpunkt der
151
ZUSAMMENFASSUNG
beiden Lösungen zurückzuführen. Während der Gefrierpunkt der 12.5 M Natronlauge -20°C
beträgt, liegt der Gefrierpunkt von 50%-iger Kalilauge unterhalb von -77°C. Zudem konnte
gezeigt werden, dass das zweite Binaphthylsystem und die daraus resultierende starre
Struktur des Katalysators 17c ausschlaggebend für die Enantioselektivität ist. Der einfachere
Katalysator 18 zeigte kaum asymmetrische Induktion in der Phasentransfer-katalysierten
Aza-Michael-Reaktion.
Kombination von Palladiumkatalyse mit einer Biotransformation zur Synthese chiraler
Alkohole in einer Eintopfreaktion und weitere Umsetzung zum chiralen Amin
Ziel dieses Teilkapitels war es eine effiziente Herstellung von Biarylalkohol 6 und Amin 7 zu
entwickeln. Das wasserlösliche Katalysatorsystem, das aus den kommerziell erhältlichen
Verbindungen Palladiumchlorid und TPPTS hergestellt wurde, erwies sich als höchst effizient
für die Kupplung von Phenylboronsäure (19) und 4‘-Iodacetophenon (4) in wässrigem
Medium. Unabhängig davon, ob die Reaktion in Anwesenheit der starken Base
Natriumcarbonat oder der schwachen Base Natriumhydrogencarbonat durchgeführt wurde,
wurde nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur ein vollständiger
Umsatz (>95%) erzielt (siehe Abbildung 6.2).
Abbildung 6.2 Suzuki-Kupplung in wässrigem Medium bei Raumtemperatur
Im Vergleich zu bereits bekannten Systemen konnte, unabhängig von der verwendeten
Base, auf hohe Temperaturen für die Suzuki-Kupplung verzichtet werden. Dies stellt eine
wichtige Voraussetzung für die Kombination mit der enzymatischen Reduktion in einer
Tandemreaktion dar. Darüber hinaus konnte in Photometertests keine (signifikante)
152
ZUSAMMENFASSUNG
Inhibierung der ADHs durch Palladiumchlorid oder TPPTS beobachtet werden. Dies
bestätigte sich bei Durchführung der Mehrstufen-Eintopfreaktion.[80] Wurde Natriumcarbonat
als Base verwendet, so konnten die gewünschten Biaryl-Alkohole 5 mit hohem Umsatz von
bis zu ≥95%, in guten Ausbeuten (72%) und mit stets exzellenter Enantioselektivität von
>99% ee erhalten werden.[80] Aufgrund der starken Baszität von Natriumcarbonat musste
vor Enzymzugabe der pH-Wert auf pH 7 eingestellt werden.
Abbildung 6.3 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit Na2CO3 als Base
Um eine Tandemreaktion zu realisieren ist es nötig, dass beide Reaktionen neben dem
gleichen Reaktionsmedium und der gleichen Reaktionstemperatur auch bei demselben
pH-Wert durchgeführt werden können. Dabei hat sich Natriumhydrogencarbonat mit einem
pH-Wert von 8.3 in 97 mM Natriumhydrogencarbonat-Lösung als die am Besten geeignete
Base herausgestellt. Zunächst wurde auch hier in der Eintopfreaktion vor Enzymzugabe der
pH-Wert adjustiert. Dabei konnte der gewünschte Biaryl-Alkohol 6 mit hohem Umsatz von
95% und exzellenter Enantioselektivität von >99% ee erhalten werden. Es wurde gezeigt,
dass bei einer Anpassung der Enzymmenge an die Aktivität bei pH 8 in der Eintopfreaktion
auf die pH-Adjustierung vor Enzymzugabe verzichtet werden kann, ohne Einbußen im
Umsatz hinnehmen zu müsen. Es wurde ein Umsatz von bis zu 94% bei exzellenter
Enantioselektivität von >99% ee erzielt.
Abbildung 6.4 Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base
153
ZUSAMMENFASSUNG
Im Hinblick auf eine Tandemreaktion, in der die Produktbildung sowohl über eine SuzukiKupplung mit anschließender enzymatischer Reduktion als auch über die enzymatische
Reduktion mit anschließender Suzuki-Kupplung erfolgen kann, wurde auch die zweite
mögliche Reaktionssequenz untersucht (siehe Abbildung 6.5). Dabei konnte das Produkt
(R)-6 mit bis zu 76% Umsatz erhalten werden.
Abbildung 6.5 Eintopfreaktion unter veränderter Sequenz
Da diese Ergebnisse im Hinblick auf eine Tandemreaktion vielversprechend waren, wurde
untersucht, ob eine oder mehrere Komponenten aus der enzymatischen Reduktion einen
negativen Einfluss auf die Suzuki-Kupplung haben. Dafür wurden die verschiedenen
Komponenten (Cofaktor NADP+, HSA, Rohextrakt) in den Mengen zur Suzuki-Kupplung von
4‘-Iodacetophenon (4) mit Phenylboronsäure (19) zugesetzt, in denen sie auch in der
Eintopfreaktion eingesetzt wurden. Dabei zeigte sich, dass der Cofaktor und HSA die nur zu
einer geringen Verlangsamung der Suzuki-Kupplung führen, während dieser Effekt bei große
Mengen an Rohextrakt deutlich bemerkbar ist. In weiteren Experimenten wurden Hinweise
gefunden,
dass
zurückzuführen
die
ist.
inhibierende Wirkung
Durch
vermehrte
des
Rohextrakts
Basenzugabe
konnte
auf
einen
die
pH-Effekt
Bildung
von
4‘-Phenylacetophenon (5) begünstigt werden.
Auf Grund dieser Ergebnisse wurde eine gereinigte ADH aus Lactobacillus kefir in der
Tandemreaktion verwendet. Diese wurde in 10 mM Kpi-Puffer pH 8 gelagert und zunächst im
Photometer untersucht bevor sie präparativ eingesetzt wurde. Dabei zeigte sich, dass der
Rohextrakt und das gereinigte Enzym vergleichbare Eigenschaften bzgl. Substratbreite und
Aktivitätsverlust in Abhängigkeit vom pH-Wert aufweisen. In Additiv-Versuchen konnte
gezeigt werden, dass die Katalysatorkomponenten Palladiumchlorid und TPPTS keine
signifikante Inhibierung der gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir zur Folge haben. In
präparativen Ansätzen zur Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5, weist die gereinigte ADH
Unterschiede zum Rohextrakt auf (siehe Abbildung 6.6).
154
ZUSAMMENFASSUNG
Abbildung 6.6 Ergebnisse der enzymatischen Reduktion von 4‘-Phenylacetophenon 5
Mit keiner Charge der gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir konnte ein vollständiger
Umsatz erreicht werden. Im besten Fall wurde ein Umsatz von 63% erzielt. Dies deutet auf
Stabilitätsprobleme der gereinigten ADH unter den Reaktionsbedingungen hin. Die
Enantioselektivität der enzymatischen Reduktion war, unabhängig von der eingesetzten ADH
und deren Formulierung stets exzellent. Das Produkt (S)-6 bzw. (R)-6 wurde stets mit einem
ee-Wert von >99% erhalten.
In Bezug auf die Tandemreaktion war die mangelnde Stabilität der gereinigten ADH aus
L. kefir von untergeordneter Priorität. Im 1H-NMR-Spektrum konnte das Produkt (R)-6 mit bis
zu 70% beobachtet werden (siehe Abbildung 6.7). Dies stützt die Theorie, dass in der
Tandemreaktion die Sequenz enzymatische Reduktion und anschließende SuzukiKreuzkupplung (Reaktionsweg B, Abbildung 4.20) höhere Relevanz hat als die Sequenz
Suzuki-Kupplung mit anschließender enzymatischer Reduktion (Reaktionsweg A, Abbildung
4.20). Der Umsatz von 70% zum Produkt (R)-6 in der Tandemreaktion liegt sehr nahe an
dem in der Eintopfreaktion mit veränderter Sequenz erhaltenem Umsatz von 76% und dem
maximal erzielten Umsatz von 83% für die Kupplung von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29)
mit Phenylboronsäure (19).
Abbildung 6.7 Realisierung der Tandemreaktion
155
ZUSAMMENFASSUNG
Bemerkenswert ist die hohe Stabilität des aus Palladiumchlorid und TPPTS gebildeten
Katalysators unter den gewählten Reaktionsbedingungen. Selbst nach einer Reaktionszeit
von mehr als einer Woche konnte noch eine Steigerung an Kupplungsanteilen beobachtet
werden.
Anschließend wurde der chirale Alkohol 6 mittels SN2-Reaktion unter MitsunobuBedingungen mit Phthalimid als Nukleophil umgesetzt. Nach anschließender Hydrazinolyse
wurde das freie Amin 7 erhalten (siehe Abbildung 6.8).
Der Umsatz im ersten Schritt, der nukleophilen Substitution, war mit bis zu >95% Umsatz
sehr gut. Nach säulenchromatographischer Reinigung konnten maximal 47% Produkt (R)-28
mit
einem
ee-Wert
von
95%
isoliert
werden.
Zusätzlich
wurde
nach
säulenchromatographischer Reinigung das Substrat, der Alkohol 6, als Racemat isoliert,
auch wenn dieser als chirales Edukt (S)-6 mit einem ee-Wert von >99% eingesetzt wurde.
Nach Umsetzung des (R)-Alkohols (R)-6 als Substrat in der nukleophilen Substitution und
anschließender säulenchromatographischer Reinigung konnte das Produkt (S)-28 mit 38%
und einem ee-Wert von 98% isoliert werden (siehe Abbildung 6.8).
Abbildung 6.8 Umsetzung des chiralen Alkohols 6 mittels SN2-Reaktion unter MitsunobuBedingungen
Im zweiten Schritt, der Hydrazinolyse des Intermediats 28, konnte das saubere Produkt rac-7
je nach Aufarbeitung mit bis zu 86% isoliert werden. Das chirale Produkt (S)-7 konnte unter
nicht optimierten Bedingungen mit 13% und einem ee-Wert von 98% erhalten werden (siehe
Abbildung 6.8). Durch weitere Optimierung der Hydrazinolyse oder alternativ der basischen
Entschützung von 28 kann das chirale Amin 7 möglicherweise mit besserer Ausbeute
erhalten werden. Die Enantiomerenreinheit des Amins ist mit 98% ee bereits sehr hoch.
156
ZUSAMMENFASSUNG
Enzymatische Oxidation natürlicher Aminosäuren zu α-Ketosäuren
Ziel dieses Teilkapitels war es am Beispiel von l-Valin zu zeigen, dass natürliche
α-Aminosäuren interessante Bausteine zur Herstellung von α-Ketosäuren darstellen. Es
konnte ein enzymatischer Oxidationsprozess entwickelt werden, in dem L-Valin mittels
Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus selektiv zur Ketosäure 9a oxidiert wurde. Als
Cofaktor wird NAD+ benötigt, das während der Oxidation der Aminosäure zu NADH reduziert
wird. Dieses wurde in situ regeneriert. Hierfür wurden zwei Methoden getestet. Zum Einen
eine NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis (enzymatische Cofaktorregenerierung) und
zum
Anderen
das
wasserlösliche
Eisenporphyrin
Fe-TSPP
(biomimetische
Cofaktorregenerierung).
Die Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus und die NADH-Oxidase aus Lactobacillus
brevis zeigten gute Aktivität bei pH 8. Für Umsetzungen von L-Valin (8a) zu Ketovalin (9a)
konnte Analytik mittels 1H-NMR-Spektroskopie etabliert werden. Lediglich in Gegenwart
höherer Mengen des Eisen(III)-Porphyrins Fe-TSPP (10) zur Cofaktorregenerierung wurde
die Umsatzbestimmung ungenau. In Gegenwart kleinerer Mengen an Fe-TSPP (10) oder bei
Verwendung der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis zur Cofaktorregenerierung stellt
1
H-NMR-Spektroskopie eine sehr gute und schnelle Methode dar. Im Fall der Oxidation von
L-Valin
(8a) unter NOx-vermittelter in situ Cofaktorregenerierung wurde im
1
H-NMR-
Spektrum nach 24 Stunden ein Umsatz von bis zu 94% beobachtet.
Abbildung 6.9 Optimierter Prozess zur enzymatischen Oxidation von L-Valin (8a)
(enzymatische Cofaktorregenerierung)
157
ZUSAMMENFASSUNG
Darüber hinaus war die Reproduzierbarkeit (Verwendung derselben Enzymcharge) gegeben.
Die Kurven waren nahezu deckungsgleich. Lediglich die Übertragbarkeit bei Verwendung
unterschiedlicher Enzymchargen ist schwierig (siehe Abbildung 5.31).
Die bei der Oxidation von L-Valin (8a) unter biomimetischer in situ Cofaktorregenerierung
(Fe-TSPP)
erzielten
Ergebnisse
blieben
hinter
den
unter
NOx-vermittelter
Cofaktorregenerierung erzielten Ergebnissen zurück. Selbst nach einer Reaktionszeit von
mehreren Tagen wurde lediglich ein Umsatz von rund 70% erzielt (siehe Abbildung 6.10).
Die Tatsache, dass über mehrere Tage eine weitere Produktbildung beobachtet werden
konnte,
deutet
auf
eine
bemerkenswerte
Langzeitstabilität
der
LeuDH
unter
Reaktionsbedingungen hin. Darüber hinaus wurde der Einfluss verschiedener Faktoren auf
das
System
aus
Rührgeschwindigkeit,
Leucindehydrogenase
Cofaktorkonzentration,
und
NADH-Oxidase
Enzymmengen,
untersucht,
z.B.
FAD-Konzentration,
Produktinhibierung, etc. Dabei konnte nicht eindeutig ein den Prozess limitierender Faktor
bestimmt werden. Die Hinweise aus Photometertests bezüglich einer Produktinhibierung der
LeuDH konnten in präparativen Ansätzen nicht bestätigt werden konnten.
Abbildung 6.10 Optimierter Prozess zur enzymatischen Oxidation von L-Valin 8a
(biomimetische Cofaktorregenerierung mittels Fe-TSPP 10)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Prozess zur Oxidation von L-Valin etabliert. Dabei konnte
bei 25 mM Substratkonzentration bis zu 94% Umsatz zum Produkt 9a erzielt werden.
Bisherige Synthesemethoden zur Herstellung von Ketovalin basieren meist auf mehreren
Stufen oder verwenden giftiges Chromat als Oxidationsmittel.[132]
158
SUMMARY
7
Summary
This thesis deals with the synthesis of pharmaceutically relevant compounds using varying
catalytic systems. The focus will be on the synthesis and oxidation of chiral aminoderivatives.
Enantioselective synthesis of chiral β-amino acid derivatives via organocatalytic azaMichael addition
The first topic attends to the synthesis of β-amino acid derivatives via organocatalysed azaMichael-reaction. Based on the results obtained by Weiß regarding the synthesis of
enantioenriched β-amino acid-derivatives via phasetransfer-catalysed aza-Michael addition,
the ee-value of the product 3a was enhanced from 20% to 37% without loss in the yield of
the isolated product (see Scheme 7.1). This was achieved simply by changing the base.
Instead of sodium hydroxide (12.5 M aqueous solution) potassium hydroxide (as a 50%
aqueous solution) was used. The enantioenriched product was isolated in 80% yield.
Scheme 7.1 Synthesis of β-amino acid derivative 3a via aza-Michael-reaction under
optimised conditions
159
SUMMARY
The increased enantioselectivity due to change of base arises from the differing freezing
points of the aqueous solutions.The 12.5 M sodium hydroxide solution freezes out at about 20°C, whereas the 50% potassium hydroxide solution remains liquid even at -77°C.
Furthermore it was demonstrated, that the second binaphthyl system of the chiral ammonium
catalyst and the thus resulting rigid structure of the catalyst 17c are crucial factors for the
enantioselectivity of the reaction. The more simple catalyst 18 barely showed asymmetric
induction in the phasetransfer-catalysed aza-Michael-reaction.
Combination of Palladium catalysis and a biotransformation towards the synthesis of
chiral alcohols in a one-pot reaction and further conversion to the chiral amine
The aim of this topic was the efficient synthesis of biaryl alcohol 6 and amine 7. The watersoluble catalyst-system consisting of commercially available palladium chloride and TPPTS
proved to be very efficient for the Suzuki cross-coupling reaction of phenylboronic acid (19)
and 4‘-iodoacetophenone (4) in aqueous medium. Independent whether the strong base
sodium sodium carbonate or the rather weak base sodium bicarbonate was applied in the
Suzuki cross-coupling reaction, after stirring for 24 hours at room temperature the biaryl
ketone 5 was obtained with >95% conversion (see Scheme 7.2).
Scheme 7.2 Suzuki cross-coupling reaction in aqueous medium at room temperature
Compared to systems known from the literature, the Suzuki cross-coupling reaction proceeds
smoothly without need for high temperature, independent of the base applied. Running the
palladium-catalysed reaction at ambient temperature (room temperature) is one important
requirement for its combination with the enzymatic reduction in a so-called tandem reaction,
160
SUMMARY
in which both reactions proceed simultaneously. Moreover, in a photometric assay, no
significant inhibition of the alcohol dehydrogenase was observed by either palladium chloride
or TPPTS. This result was confirmed by running the multistep one-pot reaction.[80] When
sodium carbonate was applied as a base, the desired biaryl alcohol 5 was obtained with up
to ≥95% conversion, in good yield (72%) and always with excellent enantioselectivity of
higher >99% ee.[80] Owing to the strong alkalinity of sodium carbonate, the pH had to be
adjusted to neutral prior to addition of the enzyme.
Scheme 7.3 Results of the one-pot reaction using Na2CO3 as base
In order to realise the tandem-reaction, both reactions have to proceed in the same reaction
medium, at the same the temperature and at the same pH-value. Sodium bicarbonate, of
which a 97 mM aqueous solution was determined pH 8.3, proved to be most compatible. At
first the one-pot reaction with sodium bicarbonate as a base was conducted including
pH-adjustment prior to the addition of the enzyme. The desired biaryl alcohol 6 was obtained
with high conversion of up to >95% and excellent enantioselectivity of >99% ee. It was
demonstrated, that by adjusting the amount of enzyme in the one-pot reaction according to
the remaining activity of the ADH at pH 8, it became unnecessary to adjust the pH to 7 prior
to enzyme addition. In doing so, no loss in conversion or enantioselectivity was observed.
The desired alcohol 6 was obtained with up to 94% conversion with excellent
enantioselectivity (see Scheme 7.4).
HO
O
B
OH
+
I
4
39 mM
19
39 mM
PdCl2/TPPTS
NaHCO3 (2.5 eq.)
with / without
pH adjustment,
Lk-ADH, NADP+
OH
aqueous medium
(50% i-PrOH (v/v)),
V = 10 ml
RT
>95% (R)-6, >99% ee (with pH adjustment)
94% (R)-6), >99% ee (without pH adjustment)
Scheme 7.4 Results of the one-pot reaction using NaHCO3 as base
161
SUMMARY
Regarding the tandem reaction mode, the product formation can take place either by Suzuki
cross-coupling reaction followed by enzymatic reduction or the Suzuki cross-coupling
following enzymatic reduction. The latter reaction sequence was examined in more detail as
well. The product (R)-6 was obtained in up to 76% conversion (see Scheme 7.5).
Scheme 7.5 Variation of the reaction sequence in the one-pot reaction
Regarding the tandem-reaction mode, these results were very promising. So it was further
investigated, whether one or more components needed in the enzymatic reduction reaction
have a negative influence on the Suzuki cross-coupling reaction. The various components,
e.g. cofactor NADP+, protein (HSA) or crude enzyme extract were added to the crosscoupling
reaction of
4‘-iodoacetophenone (4)
and phenylboronic
acid (19). The
corresponding additive´s concentration was adapted from the biotransformation. It has been
found that cofactor and protein only slightly slow down the cross-coupling reaction, whereas
large amounts of crude enzyme extract have a strong impact. No product was found at all.
Further experiments revealed that the inhibiting effect of the crude enzyme is due to a pHeffect. By increasing the amount of base, the formation of 4‘-phenylacetophenone (5) was
favoured.
Owing to these results a purified ADH from Lactobacillus kefir was applied in the tandemreaction.
Before
it
was
used
on
preparative
scale,
the
enzyme
was
studied
spectrophotometrically. Crude extract and purified enzyme showed similiar properties
regarding substrate scope and pH dependence. In the presence of the catalyst components
Palladium(II) chloride and TPPTS respectively, no significant decrease in enzyme activity
was observed for either of the enzyme formulations. For the enzymatic reduction of
4‘-phenylacetophenone 5 on preparative scale, the purified alcohol dehydrogenase from
L. kefir revealed differing properties compared to the crude extract (see Scheme 7.6).
162
SUMMARY
Scheme 7.6 Results for the enzymatic reduction of biaryl ketone 5
Quantitative conversion was not observed with any of the purified enzyme batches applied. A
maximum conversion of 63% was obtained. These results indicate, a lower stability of the
purified enzyme under reaction conditions. Enantioselectivity of the enzymatic reduction
reaction was always excellent, independent of the source of the enzyme or its formulation.
For the chiral products (S)-6 and (R)-6 respectively the enantiomeric excess was determined
>99% ee.
In terms of the tandem reaction, the purified ADH´s lack of stability turned out to be of minor
importance. The product (R)-6 was observed in the
1
H-nmr spectrum in up to 70%
conversion (see Scheme 7.7). This result supports the assumption that product formation in
the tandem-reaction mainly proceeds via reaction sequence B: enzymatic reduction followed
by Suzuki cross-coupling reaction (see Abbildung 4.20). Reaction sequence A (see
Abbildung 4.20), enzymatic reduction after the Suzuki cross-coupling reaction seems to be
of minor importance under the chosen reaction conditions. Conversion of 70% towards the
desired product (R)-6 in the tandem-reaction is close to the maximum conversion of 76%,
obtained in the one-pot reaction according to reaction sequence A.
Scheme 7.7 Combination of a Suzuki cross-coupling reaction and a biotransformation in a
tandem-reaction
163
SUMMARY
The high stability of the catalytically active palladium species created from palladium chloride
and TPPTS is remarkable. Even after a reaction time of more than one week an increase of
the cross-coupling product was observed.
Subsequently the chiral alcohol 6 was converted in a SN2-reaction under Mitsunobu-type
reaction conditions, using phthalimide as a nucleophile. After hydrozinolysis the free chiral
amine 7 was obtained. Conversion in the first reaction step was very high (up to >95%). After
purification by flash chromatography the product (R)-28 was isolated in 47% yield and an
enantioselectivity of 95% ee. Besides, the alcohol 6 was isolated as a racemate although it
was used as chiral substrate of >99% ee. After conversion of the alcohol (R)-6 into (S)-28
under the same reaction conditions and subsequent purification, the product (S)-28 was
isolated in 38% yield with an enantioselectivity of 98% ee (see Scheme 7.8) .
Scheme 7.8 SN2-substitution reaction using Mitsunobu reaction conditions
The second reaction, the hydrazinolysis of 28 gave the product rac-7 in up to 86% yield,
depending on the work-up procedure. Under non-optimised reaction conditions the chiral
amine (S)-7 was isolated in 13% yield and with 98% ee (see Scheme 7.8). Further
optimisation of the hydrazinolysis or deprotection of 28 under basic reaction conditions might
give the chiral amine 7 with higher isolated yield. The enantiomeric purity of 98% ee for the
amine (S)-7 is already very high.
164
SUMMARY
Enzymatic oxidation of natural amino acids into α-keto acids
In a third topic it was investigated, whether naturally occuring amino acids like L-valine are
interesting substrates for the synthesis of α-keto acids. An enzymatic oxidation process was
developed for the selective conversion of L-valine 8a (25 mM) to the corresponding keto acid
9a by a leucine dehydrogenase from Bacillus cereus. This enzyme requires NAD+ as a
cofactor, which is reduced to NADH while the amino acid is oxidised. NADH was regenerated
in situ. For this purpose two different approaches were studied: first a NADH-oxidase from
Lactobacillus brevis (enzymatic cofactor regeneration), second the water-soluble ironporphyrin Fe-TSPP (10) (biomimetic cofactor regeneration).
The leucine dehydrogenase from Bacillus cereus and the NADH-oxidase from Lactobacillus
brevis showed good activity at pH 8. It was established to examine the conversion of L-valine
8a into keto valine 9a by 1H-NMR spectroscopy. This analytical method for the determination
of conversion is only limited, when higher amounts of the iron porphyrin Fe-TSPP (10), which
is used for cofactor regeneration, are present. When only small quantities of Fe-TSPP or the
NADH-oxidase are applied for the cofactor regeneration, 1H-NMR spectroscopy is a very
convenient and quick method to determine conversion. In the case of the enzymatic
oxidation of L-valine (8a) using NOx-catalysed in situ cofactor regeneration, conversion of up
to 94% towards the desired product 9a was observed via 1H-nmr spectroscopy afer a
reaction time of 24 hours (see Scheme 7.9).
O
O
OH
16.7 U LeuDH from Bacillus sp.
OH
O
up to 94% conversion
NH2
H2O
H2O
NAD+
NADH
125 U NADH-oxidase from
Lactobacillus brevis
NH3
1/2 O2
Scheme 7.9 Optimised process conditions for the enzymatic oxidation of L-valine 8a
(enzymatic cofactor regeneration)
165
SUMMARY
Reproducibility was very good, when the same enzyme batch was used. The reaction course
was almost identical. Transferability was only difficult, when different enzyme batches were
used (see Abbildung 5.31).
The results obtained with biomimetic in situ cofactor regeneration (Fe-TSPP) were not as
good as those achieved with NADH-oxidase for cofactor regeneration. Even after a reaction
time of several days, a maximum conversion of 70% was reached (see Scheme 7.10). The
fact, that an increase in product formation was observed for several days, implies a high
long-term stability of the leucine dehydrogenase under reaction conditions.
Scheme 7.10 Optimised process conditions for the enzymatic oxidation of L-valine 8a
(biomimetic cofactor regeneration using Fe-TSPP)
Furthermore the influence of several parameters on the reaction system, comprising the
leucine dehydrogenase from Bacillus cereus and the NADH-oxidase from Lactobacillus
brevis, were investigated, e.g. stirring rate, cofactor concentration, amount of enzyme, FADconcentration, product inhibition, etc. It was not possible to determine one limiting parameter.
The hints concerning product inhibition from a photometric assay, were not confirmed on
preparative scale.
An enzymatic process for the oxidation of L-valine (8a) was established. Previous methods
for the preparation of keto valine mainly comprise multi-step syntheses or the use of toxic
chromate as oxidizing agent.[132] It was possible to obtain up to 95% conversion at a
substrate concentration of 25 mM L-valine.
166
EXPERIMENTELLER TEIL
8
Experimenteller Teil
8.1
Verwendete Chemikalien und Geräte
Chemikalien:
Die für diese Doktorarbeit verwendeten käuflichen Chemikalien wurden von Acros Organics®,
Sigma-Aldrich®, ABCR®, Fisher Scientific® oder Fluka® bezogen und ohne weitere Reinigung
eingesetzt. Das Lösungsmittel MTBE wurde als Hochschulspende von der Evonik Degussa
GmbH zur Verfügung gestellt. Alle verwendeten Lösungsmittel, außer MTBE, wurden vor
Gebrauch am Rotationsverdampfer destilliert.
Enzyme:
Die Cofaktoren NAD(P)H und NAD(P)+ wurden von Oriental Yeast Co. Ltd. oder Alfa Aesar®
bezogen.
Weitere Enzyme wurden im Rahmen von folgenden Zusammenarbeiten erhalten:
Alkoholdehydrogenasen aus Lactobacillus kefir (Lk-ADH) und Rhodococcus sp. (Rsp-ADH)
wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. W. Hummel (Universität Düsseldorf, Institut für
molekulare Enzymtechnologie, Forschungszentrum Jülich) entwickelt und für diese Arbeit zur
Verfügung gestellt.[101,171] Diese ADHs sind ebenfalls käuflich erwerblich bei evocatal
GmbH.
Die partiell gereinigte Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir wurde im Arbeitskreis
von Prof. Dr. W. Hummel (Universität Düsseldorf, Institut für molekulare Enzymtechnologie,
Forschungszentrum Jülich) durch Thorsten Rosenbaum hergestellt. Die Reinigung erfolgte
an einem ÄKTA mittels Anionen-Austausch-Chromatographie über Q-Sepharose. Dazu
wurde der Zellrohextrakt (10 g Zellen aus einer Hochzelldichte-Fermentation, resuspendiert
in 30 ml 100 mM Kpi pH 8.3, aufgeschlossen mittels Ultraschall und Abtrennung von Zellen
und Zellbruchstücken für 20 Minuten bei 38500 g) auf die Säule aufgetragen und mit 100 mM
Kaliumphosphatpuffer pH 8.3, versetzt mit 1 mM Magnesiumchlorid, gespült. Anschließend
wurde das Zielprotein mittels eines NaCl-Gradienten (0 – 1 M in 100 mM Kpi pH 8.3) über
zehn Säulenvolumina eluiert. Aktive Fraktionen wurden per Photometer-Assay identifiziert,
gepoolt und mittels Ultrafiltration umgepuffert (10 mM Kpi pH 8.3, versetzt mit 1 mM
Magnesiumchlorid) und aufkonzentriert (1 kU/ml).
167
EXPERIMENTELLER TEIL
Die NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis, die Leucindehydrogenase aus Bacillus cereus
sowie die Glutamatdehydrogenasen aus Fusobacterium nucleatum bzw. Clostridium difficile
wurden im Arbeitskreis von Prof. Dr. W. Hummel (Universität Düsseldorf, Institut für
molekulare Enzymtechnologie, Forschungszentrum Jülich) durch Carsten Lanzerath
hergestellt.
Dünnschichtchromatographie (DC):
Es wurden DC-Platten mit Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumträgerfolie von Merck®
verwendet. Zum Nachweis der Substanzzonen diente die Fluoreszenzlöschung bei einer
Wellenlänge von 254 nm.
Säulenchromatographie:
Die säulenchromatographische Reinigung wurde mit SiO2 als stationärer Phase durchgeführt,
dafür wurde Merck® Silikagel 60 (0.04-0.063 nm) der Firma ICN Biomedicals GmbH
verwendet.
NMR-Spektroskopie:
Die Spektren wurden auf einem JEOL JNM GX 400, JEOL JNM EX 400 oder Bruker Avance
300 oder 400 NMR-Spektrometer aufgenommen. Alle Spektren wurden bei Raumtemperatur
gemessen. Die chemischen Verschiebungen der 1H-NMR- und
13
C-NMR-Spektren sind in
ppm angegeben. Spinmultiplizitäten werden als s (Singulett), d (Dublett), dd (dupliziertes
Dublett), t (Triplett), q (Quartett) und m (Multiplett) angegeben. Die erhaltenen Daten wurden
mit der Software MestRe-C bearbeitet.
Massenspektrometrie (EI-MS):
Die Massenspektrometrie wurde am Finnigan MAT 95 XP-Spektrometer im EI-Modus der
Firma Thermo Electron Corporation® gemessen.
168
EXPERIMENTELLER TEIL
IR-Spektroskopie (IR):
Die Infrarotspektren wurden mit einem ASI React IR®-1000-Spektrometer bzw. mit einem
Nicolet IR 100 FT-IR Spektrometer der Firma Thermo Scientific® aufgenommen. Die
Absorption wird in Wellenzahl ṽ [cm-1] angegeben.
Elementaranalyse (EA):
Die Elementaranalyse wurde am Gerät EA 1119 CHNS, CE Instruments durchgeführt.
UV/Vis-Spektroskopie:
Die UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurden an einem SPEKOL® 1300 UV/VisSpektrophotometer der Firma Analytik Jena durchgeführt und mit dem Programm
WinASPECT 2.2.6.0 (unter Zuhilfenahme des Moduls „Kinetik Programms“) bearbeitet.
HPLC:
Die Spektren wurden mit einem LC-Net II/ADC Gerät und Pumpen (PU-1587 Intelligent Prep.
Pump und PU 987 Intelligent Prep. Pump) der Firma JASCO oder mit einem Gerät CBM-10A
und Pumpe (LC-10AT Liquid Chromatograph) der Firma Shimadzu aufgenommen. Die
Trennungen erfolgten an den Säulen Daicel Chiralpak® AD-H, Daicel Chiralcel® OJ-H, Daicel
Chiralpak® IA, Daicel Chiralpak® IB oder einer Nucleodur® Hilic-Säule.
pH-Messungen:
Die Messungen des pH-Werts wurden an einem Titrino (702 SM) der Metrohm GmbH & Co.
KG durchgeführt. Als Elektrode wurde eine Unitrode verwendet. Vor Durchführung der
Messungen erfolgte die Kalibrierung der Elektrode mit Puffern pH 5, pH 7 und pH 9. Die
Messungen wurden mit dem Programm Tiamo verfolgt.
Laborschüttler:
Die Suspensionen bestehend aus Palladiumchlorid und TPPTS wurden bei 500/min auf
einem TPIKA® MS3 basic geschüttelt.
169
EXPERIMENTELLER TEIL
Thermoschüttler:
Die Ansätze zur Oxidation von L-Valin in einem Gesamtvolumen von 1.5 ml wurden in einem
Eppendorf Thermomixer® comfort mit einem IsoRack 2 ml durchgeführt.
Zentrifuge:
Die
Abtrennung
des
Enzyms
vom
Reaktionsgemisch
mittels
Roti®-Spin
Zentrifugationseinheiten (erhältlich bei Carl Roth) mit einem MWCO von 10000 erfolgte in
einer himac CT15RE von Hitachi Koki Co., Ltd. bei 4°C und 14000 Umdrehungen.
170
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2
Synthesen und analytische Daten der Produkte
(Enantioselektive) Synthese von β-Aminosäurederivaten durch
8.2.1
organokatalysierte Aza-Michael-Reaktion
8.2.1.1
Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (AAV 1): Phasentransfer-katalysierte AzaMichael-Reaktion
O
O
O
N
H
1a
(2.0 Äq.)
+
O
F3C
21-30 mol% PTC
1.2 Äq. Base (wässrig)
O
Toluol
T, 23 h
O
O
O
F3C
O
O
3a
2
(1.0 Äq.)
F
N
F
F
F
F
F
CH3
N
N
CH3
F
F
Br
F
F
17c
F
N
Br
Br
TBAB
F
18
Abbildung 8.1 Phasentransferkatalysierte Aza-Michael-Reaktion
Zunächst wird eine Suspension des Phasentransfer-Katalysators in Toluol hergestellt. Dann
werden nacheinander 2.0 Äquivalente tert-Butylbenzyloxycarbamat (1) (Äquivalente bezogen
auf 2), 1.2 Äquivalente wässriger Base (12.5 M NaOH oder 50%-ige KOH) und
(E)-Triflurcrotonsäureethylester (2) zugegeben. Nach 23 Stunden Rühren bei möglichst
konstanter Temperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird
säulenchromatographisch an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 96:4 (v/v),
versetzt mit 0.2% Diethylamin) gereinigt. Die Bestimmung des ee-Werts erfolgt mittels
chiraler HPLC.
171
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.1.1.1
Synthese von rac-3-(Benzyloxy(tert-butoxycarbonyl)amino)-4,4,4triflurbutansäureethylester (rac-3a)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 1
(AAV 1). Es wurde eine Suspension von 34.1 mg (0.1 mmol;
20 mol%)
hergestellt.
Tetrabutylammoniumbromid
Nacheinander
wurden
tert-Butylbenzyloxycarbamat
(0.6 mmol)
und
crotonsäureethylester (2)
75 µl
(1),
in
5.0 ml
223.3 mg
45 µl
zugegeben.
(1.0 mmol)
50%-ige
(0.5 mmol)
Nach
Toluol
KOH
(E)-Triflur21 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur wurde gemäß Arbeitsvorschrift 1
aufgearbeitet das Produkt nach säulenchromatographischer
Reinigung als farblose Flüssigkeit von öliger Konsistenz erhalten. Die Bestimmung des eeWerts erfolgte mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IA, Hexan/Isopropanol 98:2 (v/v),
0.5 ml/min, 220 nm).
Ausbeute (sauberes Produkt): 56% (108.5 mg; 0.28 mmol)
Enantiomerenüberschuss: 0% ee
HPLC (Chiralpak® IA, Hexan/Isopropanol 99:1 (v/v), 0.5 ml/min, 220 nm):
tR1 = 13.2 min
tR2 = 14.6 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.20 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, H-C1), 1.52 (s, 9H, H-C9),
2.68 (dd, 2J = 16.6 Hz, 3J = 4.1 Hz, 1H, H-C4), 2.97 (dd, 2J = 16.6 Hz, 3J = 10.2 Hz, 1H,
H-C4), 4.13 (q, 3J = 7.1 Hz, 1H, H-C2), 4.87 (dd, J = 9.5 Hz, J = 24.3 Hz, 2H, H-C10), 5.10
(m, 1H, H-C5), 7.31-7.38 (m, 5H, H-C12, H-C13, H-C14, H-C15, H-C16).
Die spektroskopischen Daten des
angegebenen Daten überein.
172
1
H-NMR stimmen mit den in der Literatur [11,65]
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.1.1.2
Synthese von enantiomerenangereichertem 3-(Benzyloxy(tertbutoxycarbonyl)amino)-4,4,4-triflurbutansäureethylester (3a) mit
Katalysator 18
12
9
8
10
O
7
N
F3C
5
O
6
O
11
16
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 1
14
(AAV 1). Es wurde eine Suspension von 15 mg (20 µmol;
30 mol%) des chiralen Phasentransferkatalysators 18 in 666 µl
15
Toluol
O
3
4
13
O
hergestellt
und
29.5 mg
(0.132 mmol)
tert-
Butylbenzyloxycarbamat (1), 6.3 µl 12.5 M NaOH (0.08 mmol)
2
1
3a
C18H23F3NO5
M = 391.38 g/mol
und 10.0 µl (0.067 mmol) (E)-Triflur-crotonsäureethylester (2)
zugegeben. Nach 23 Stunden Rühren bei -20°C (im Kryostat)
wurde gemäß Arbeitsvorschrift 1 aufgearbeitet und das Produkt
säulenchromatographisch an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan
und Ethylacetat im Verhältnis 96 : 4 (v/v), versetzt mit 0.2% Diethylamin) gereinigt. Die
Bestimmung des ee-Werts erfolgte mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IA, Hexan/Isopropanol
98:2 (v/v), 0.5 ml/min, 220 nm). Das gereinigte Produkt wurde als farblose Flüssigkeit von
öliger Konsistenz erhalten.
Ausbeute: 82% (21.6 mg; 0.055 mmol)
Enantiomerenüberschuss: 2% ee
HPLC (Chiralpak® IA, Hexan/Isopropanol 98:2 (v/v), 0.5 ml/min, 220 nm):
tR1 = 10.3 min
tR2 = 11.2 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.20 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, H-C1), 1.52 (s, 9H, H-C9),
2.68 (dd, 2J = 16.6 Hz, 3J = 4.1 Hz, 1H, H-C4), 2.97 (dd, 2J = 16.7 Hz, 3J = 10.2 Hz, 1H,
H-C4), 4.13 (q, 3J = 7.1 Hz, 1H, H-C2), 4.87 (dd, J = 9.4 Hz, J = 24.3 Hz, 2H, H-C10), 5.10
(m, 1H, H-C5), 7.31-7.38 (m, 5H, H-C12, H-C13, H-C14, H-C15, H-C16).
Die spektroskopischen Daten des
1
H-NMR stimmen mit den in der Literatur [11,65]
angegebenen Daten überein.
173
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.1.1.3
Synthese von enantiomerenangereichertem 3-(Benzyloxy(tertbutoxycarbonyl)amino)-4,4,4-triflurbutansäureethylester (3a) mit
(S,S)-3,4,5-Triflurphenyl NAS-Bromid (17c)
12
9
8
10
O
7
N
F3C
5
O
6
O
11
16
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 1
14
(AAV 1).
Zunächst
wurde eine Suspension von 15 mg
(16 µmol; 25 mol%) des chiralen Phasentransferkatalysators
15
17c in 666 µl Toluol hergestellt. Nacheinander wurden 29.5 mg
O
3
4
13
O
(0.132 mmol) tert-Butylbenzyloxycarbamat (1), 6.3 µl 12.5 M
2
3a
C18H23F3NO5
M = 391.38 g/mol
1
NaOH (0.08 mmol; Eintrag 1-3) bzw. 6.0 µl 50%-ige KOH
(0.08 mmol; Einträge 4 und 5) und 10.0 µl (0.067 mmol)
(E)-Triflurcrotonsäureethylester (2)
Stunden
Rühren
bei
möglichst
zugegeben.
konstanter
Nach
23
Temperatur
(idealerweise im Kryostat) wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt
wurde säulenchromatographisch an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan und Ethylacetat im
Verhältnis 96 : 4 (v/v), versetzt mit 0.2% Diethylamin) gereinigt. Die Bestimmung des eeWerts erfolgte mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IA, Hexan/Isopropanol 98:2 (v/v),
0.5 ml/min, 220 nm). Das gereinigte Produkt wurde als farblose Flüssigkeit von öliger
Konsistenz erhalten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.1 zusammengefasst.
HPLC (Chiralpak® IA, Hexan/Isopropanol 98:2 (v/v), 0.5 ml/min, 220 nm):
tR1 = 10.3 min
tR2 = 11.2 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.20 (t, 3J = 7.1 Hz, 3H, H-C1), 1.52 (s, 9H, H-C9),
2.68 (dd, 2J = 16.6 Hz, 3J = 4.1 Hz, 1H, H-C4), 2.97 (dd, 2J = 16.7 Hz, 3J = 10.2 Hz, 1H,
H-C4), 4.13 (q, 3J = 7.1 Hz, 1H, H-C2), 4.87 (dd, J = 9.4 Hz, J = 24.3 Hz, 2H, H-C10), 5.10
(m, 1H, H-C5), 7.31-7.38 (m, 5H, H-C12, H-C13, H-C14, H-C15, H-C16).
Die spektroskopischen Daten des 1H-NMR stimmen mit den angegebenen Daten in der
Literatur [11,65] überein.
174
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.1 Ansätze analog AAV 1 unter Variation von Reaktionstemperatur und Base
a)
Eintrag
Base
Temperatur
Auswaage
Ausbeute
ee-Wert [%]
1
NaOH (12.5 M)
-20°C
18.3 mg
70%
20
2
NaOH (12.5 M)
-60°C
10.7 mg
41%
15
3
NaOH (12.5 M)
-76°C a)
12.6 mg
48%
24
4
KOH (50%)
-20°C
20.9 mg
80%
37
5
KOH (50%)
-60°C
13.0 mg
50%
34
die Temperatur konnte über Nacht nicht stabil gehalten werden
8.2.1.2
Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (AAV 2): Gefrierpunktbestimmung
Die Bestimmung des Gefrierpunkts wurde mit Hilfe eines Kryostaten vorgenommen. Dieser
ermöglichte es, die zu untersuchende Lösung langsam und exakt zu kühlen. Zur genauen
Kontrolle wurden zusätzlich zwei Thermometer verwendet. Eines wurde in der zu
untersuchenden Lösung angebracht und ein zweites in der nahen Umgebung (außerhalb des
Schlenkrohres). Die Lösung wurde zunächst auf -10°C abgekühlt und es wurde gewartet, bis
sich die Innentemperatur der Umgebungstemperatur angepasst hatte, bevor die Lösung
weiter abgekühlt wurde. Dann wurde in Schritten von je 2°C weiter abgekühlt. Auch hier wird
wiederum
vor
weiterem
Abkühlen
der
Lösung
gewartet,
bis
Innen-
und
Umgebungstemperatur übereinstimmen. Es wurde so lange in Schritten von je 2°C
abgekühlt, bis die Lösung (unter Wärmeentwicklung) ausfriert. Falls nötig wurde auf ein
Kältebad (Aceton und Trockeneis) zurückgegriffen, da der verwendete Kryostat nur bis
maximal -56°C kühlen kann.
Tabelle 8.2 Gefrierpunkt der wässrigen Phase
Eintrag
Wässrige Phase
Konzentration
Gefrierpunkt
1
NaOH
12.5 M
-19°C
2
KOH
50%-ig (13.45 M)
<-77°C
175
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2
Kombination von Palladiumkatalyse und Biokatalyse zur
enantioselektiven Synthese eines Alkohols und dessen
Umsetzung zum chiralen Amin
8.2.2.1
Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (AAV 3): Suzuki-Kupplung in wässrigem
Reaktionsmedium mit Triethylamin als Base
Abbildung 8.2 Suzuki-Kupplung mit Triethylamin als Base
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer,
parallel
dazu
angesetzten
4‘-Iodacetophenon
(4),
Suspension,
47.4 mg
bestehend
(0.389 mmol)
aus
95.7 mg
Phenylboronsäure
(19)
(0.389 mmol)
und
54.2 µl
(0.389 mmol) Triethylamin in 1.1-5.0 ml entgastem Isopropanol und 2.9-5 ml entgastem dest.
Wasser, gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei 400 Umdrehungen pro Minute und
Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert und
dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden
über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt
und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMRSpektroskopie in CDCl3 bestimmt.
Zur Bestimmung der Fehlergrenze werden jeweils zwei Ansätze gleichzeitig auf einem
Magnetrührer durchgeführt. Insgesamt werden je 6-8 Ansätze bei unterschiedlichen
Reaktionsvolumina
und
variierenden
Lösungsmittelverhältnissen
Ergebnisse sind tabellarisch zusammengefasst.
176
durchgeführt.
Die
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.1.1
Bestimmung der Fehlergrenze der Suzuki-Kupplung in 25% Isopropanol
(v/v) bei 86 mM Substrat-Konzentration
5'
9'
10
8'
9
7
6
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 3
O
3
2
4
(AAV 3). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
8
5
C14H12O
M = 196.24 g/mol
95.7 mg
(0.389 mmol)
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und 54.2 µl (0.389 mmol)
Triethylamin in einer Mischung aus 1.1 ml entgastem Isopropanol
und 2.9 ml entgastem dest. Wasser zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde der Ansatz gemäß Arbeitsvorschrift 3 aufgearbeitet und das
Rohprodukt als brauner Feststoff erhalten. Im
1
H-NMR-Spektrum konnte neben dem
Produkt 5 konnte noch unumgesetztes Substrat 4 nachgewiesen werden.
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 2.62 (s, 3H, H-C1), 7.39 (d, 3J = 7.32 Hz, 1H,
H-C10), 7.46 (t, 3J = 7.38 Hz, 2H, H-C9, H-C9´), 7.61 (d, 3J = 7.04 Hz, 2H, H-C8, H-C8´),
7.67 (d, 3J = 8.79 Hz, 2H, H-C5, H-C5'), 8.02 (d, 3J = 8.56 Hz, 2H, H-C4, H-C4`).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen der in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Verbindung und der Literatur [16] überein.
Tabelle 8.3 Ergebnisse analog AAV 3 bei 86 mM Substratkonzentration
Eintrag
Isopropanol-Anteil (v/v)
VGesamt
Umsatz
1
25%
4.5 ml
91%
2
25%
4.5 ml
91%
3
25%
4.5 ml
93%
4
25%
4.5 ml
91%
5
25%
4.5 ml
90%
6
25%
4.5 ml
91%
7
25%
4.5 ml
94%
8
25%
4.5 ml
93%
177
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.1.2
Bestimmung der Fehlergrenze der Suzuki-Kupplung in 50% Isopropanol
(v/v) bei 86 mM Substrat-Konzentration
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 3
O
4'
5'
8'
9'
10
7
6
3
2
(AAV 3). Zunächst wurde aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid
1
und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml entgastem dest. Wasser
4
5
eine Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension,
8
bestehend aus 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4),
9
5
C 14 H12 O
M = 196.24 g/mol
47.4 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure
(19)
und
54.2 µl
(0.389 mmol) Triethylamin in einer Mischung aus 2.2 ml entgastem
Isopropanol und 1.8 ml entgastem dest. Wasser, zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur, wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Nach Aufarbeitung
gemäß Arbeitsvorschrift 3 wurde das Rohprodukt als brauner Feststoff erhalten. Im 1H-NMRSpektrum
konnte
neben
dem
Produkt 5
konnte
noch
unumgesetztes
Substrat 4
nachgewiesen werden.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
Tabelle 8.4 Ergebnisse analog AAV 3 bei 86 mM Substratkonzentration (50% IPA)
178
Eintrag
Isopropanol-Anteil (v/v)
VGesamt
Umsatz
1
50%
4.5 ml
93%
2
50%
4.5 ml
96%
3
50%
4.5 ml
92%
4
50%
4.5 ml
92%
5
50%
4.5 ml
92%
6
50%
4.5 ml
>95%
7
50%
4.5 ml
>95%
8
50%
4.5 ml
93%
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.1.3
Bestimmung der Fehlergrenze der Suzuki-Kupplung in 50% Isopropanol
(v/v) bei 39 mM Substrat-Konzentration
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 3
O
4'
5'
8'
9'
10
7
6
3
2
(AAV 3). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
4
5
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
8
9
5
C 14 H12 O
M = 196.24 g/mol
95.7 mg
(0.389 mmol)
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und 54.2 µl (0.389 mmol)
Triethylamin in 5 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem
dest. Wasser, zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, wurde mit 2.5 M
Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Nach Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 3 wurde das
Rohprodukt als brauner Feststoff erhalten. Im
1
H-NMR-Spektrum konnte neben dem
Produkt 5 konnte noch unumgesetztes Substrat 4 nachgewiesen werden.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
Tabelle 8.5 Ergebnisse analog AAV 3 bei 39 mM Substratkonzentration
Eintrag
Isopropanol-Anteil (v/v)
VGesamt
Umsatz
1
50%
10 ml
94%
2
50%
10 ml
>95%
3
50%
10 ml
95%
4
50%
10 ml
>95%
5
50%
10 ml
>95%
6
50%
10 ml
>95%
7
50%
10 ml
>95%
8
50%
10 ml
>95%
179
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.2
Allgemeine Arbeitsvorschrift 4 (AAV 4): Etablierung der Suzuki-Kupplung in
wässrigem Reaktionsmedium mit Na2CO3 als Base
Abbildung 8.3 Suzuki-Kupplung mit Natriumcarbonat als Base
Zunächst wird aus 0.3 - 4 mol% Palladiumchlorid und 0.2 - 5 mol% TPPTS in 0.5 - 6.5 ml
entgastem dest. Wasser (0.5 ml je 2.7 mg Palladiumchlorid) eine Suspension angesetzt.
Nach 30 Minuten wird diese zu einer parallel dazu angesetzten Suspension, bestehend aus
einem Äquivalent 4‘-Iodacetophenon (4) (0.389 bzw. 5.057 mmol), einem Äquivalent
Phenylboronsäure (19) und 2.5 Äquivalenten Natriumcarbonat in entgastem Isopropanol und
entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer, gegeben (Gesamtvolumen 10 bzw. 130 ml,
bei einem Isopropanolanteil von 50% (v/v)). Nach 24 Stunden Rühren bei 400 Umdrehungen
pro Minute bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 2.5 bzw. 5 M Salzsäure auf
pH 1 angesäuert und es wird dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt. Gegebenenfalls erfolgt die
Reinigung des Produkts.
8.2.2.2.1
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (5) im Maßstab von 10 ml
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 4
O
4'
8'
9'
10
7
5'
3
6
4
2
5
8
9
5
C 14H 12O
M = 196.24 g/mol
180
(AAV 4). Zunächst wurde aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid
1
und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml entgastem dest. Wasser
eine Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension
bestehend aus 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4),
47.4 mg (0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und 103.1 mg
(0.973 mmol) Natriumcarbonat in 5.0 ml entgastem Isopropanol
EXPERIMENTELLER TEIL
und 4.5 ml entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer pH 7 gegeben. Nach 24 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1
angesäuert. Nach weiterer Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 4 wurde das Rohprodukt
als grauer Feststoff erhalten.
Umsatz: >95%
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
8.2.2.2.2
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (5) im Maßstab von 130 ml
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 4
O
4'
3
5'
8'
9'
7
10
8
6
2
Wasser wurde eine Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer
5
5
C 14H 12O
M = 196.24 g/mol
58.5 ml
11.4 - 143.7 mg (0.4 - 5 mol%) TPPTS in 6.5 ml entgastem dest.
4
9
und
(AAV 4). Aus 2.7 - 34.6 mg (0.3 - 4 mol%) Palladiumchlorid und
1
Suspension aus 1.244 g (5.057 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4),
0.617 g
(5.057 mmol)
Phenylboronsäure
(19)
und
1.340 g
(12.643 mmol) Natriumcarbonat in 65 ml entgastem Isopropanol
entgastem
dest.
Wasser,
gegeben.
Nach
24 Stunden
Rühren
bei
Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert.
Nach weiterer Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 4 wurde das Rohprodukt als brauner
Feststoff erhalten. Nach säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel (Laufmittel
Cyclohexan/Ethylacetat 4 : 1 (v/v)) oder Filtration wurde das saubere Produkt als weißer
Feststoff erhalten.
Die Ergebnisse bzgl. der Reduktion der Katalysatorbeladung sind in Tabelle 8.6
zusammengefasst.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
181
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.6 Zusammenfassung der Ergebnisse bzgl. Scale-up und Reduktion der
Katalysatorbeladung in der Suzuki-Kupplung
Eintrag
1
2
3
4
5
PdCl2
TPPTS
4 mol%
5 mol%
(1.5 mM)
(1.9 mM)
2.6 mol%
3.2 mol%
(1 mM)
(1.2 mM)
1.3 mol%
1.6 mol%
(0.5 mM)
(0.6 mM)
0.6 mol%
0.8 mol%
(0.2 mM)
(0.3 mM)
0.3 mol%
0.4 mol%
(0.1 mM)
(0.2 mM)
n.g.: nicht gereinigt;
(v/v));
b)
a)
Roh-Ausbeute
Reinigung
isoliert
>95%
96%
Kieselgel a)
88%
>95%
97%
Celite b)
94%
>95%
99%
n.g.
n.g.
>95%
99%
n.g.
n.g.
>95%
103%
Filtration c)
93%
säulenchromatographische Reinigung an Kieselgel (Cyclohexan : EtOAc 4:1
Filtration über Celite;
8.2.2.3
Umsatz
c)
Filtration durch mit Kieselgel gefüllte Pasteurpipette (V = 2 ml)
Allgemeine Arbeitsvorschrift 5 (AAV 5): Suzuki-Kupplung in wässrigem
Reaktionsmedium mit NaHCO3 als Base
Abbildung 8.4 Suzuki-Kupplung unter Verwendung von NaHCO3 als Base
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer
parallel
dazu
angesetzten
Suspension,
bestehend
aus
Natriumhydrogencarbonat
(1.0-2.5 Äquivalente), 0.389 mmol Arylhalogenid 4 bzw. rac-29 und 47.4 mg (0.389 mmol)
182
EXPERIMENTELLER TEIL
Phenylboronsäure (19) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser
oder Phosphatpuffer, gegeben. Nach 24-64 Stunden Rühren bei 400 Umdrehungen pro
Minute bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch angesäuert. Im Fall des Ketons 4
als Substrat erfolgt das Ansäuern mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1. Im Fall des racemischen
Alkohols rac-29 wird das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert.
Anschließend wird dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt.
8.2.2.3.1
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon 5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 5
O
4'
8'
9'
10
7
5'
3
6
4
(AAV 5). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
2
5
8
9
5
C 14H 12O
M = 196.24 g/mol
1
(5 mol%) TPPTS in 0.5 ml entgastem dest. Wasser wurde eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
32.7 - 81.7 mg
95.7 mg
(0.389 - 0.973 mmol)
(0.389 mmol)
(0.389 mmol)
Natriumhydrogencarbonat,
4‘-Iodacetophenon
Phenylboronsäure
(19)
in
(4)
und
5.0 ml
47.4 mg
entgastem
Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer, gegeben. Nach
24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert.
Nach weiterer Aufarbeitung analog Arbeitsvorschrift 5 wurde das Rohprodukt als brauner
Feststoff erhalten.
Die Ergebnisse unter Variation von Lösungsmittel und Basenmenge sind in Tabelle 8.7
zusammengefasst.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
183
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.7 Ansätze analog zur Synthese von 5 analog AAV 5
Eintrag
wässriges Medium
NaHCO3
Umsatz [%]
1
IPA / dest. Wasser
2.5 Äquivalente
>95
2
IPA / dest. Wasser
1.0 Äquivalente
76
3
IPA / dest. Wasser
2.5 Äquivalente
>95
4
IPA / dest. Wasser
2.5 Äquivalente
>95
5
IPA / dest. Wasser
2.5 Äquivalente
>95
6
IPA / pH 7
2.5 Äquivalente
>95
7
IPA / pH 8
2.5 Äquivalente
>95
8.2.2.3.2
Synthese von rac-1-(4-Biphenyl)ethanol (rac-6)
5'
9'
10
8'
9
7
6
4'
5
OH
3
2
4
8
rac-6
C14H14O
M = 198.26 g/mol
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 5
(AAV 5). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
81.7 mg
(0.973 mmol)
Natriumhydrogencarbonat,
96.5 mg
(0.389 mmol) rac-1-(4‘-Iodphenyl)ethanol (rac-29) und 47.4 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure
(19)
in
5.0 ml
entgastem
Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer pH 7 gegeben. Nach
24 - 64 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M
Essigsäure auf pH 5 angesäuert und analog Arbeitsvorschrift 5 aufgearbeitet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.8 zusammengefasst.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit denen des Racemats in Abschnitt
8.2.2.6.2 und der Literatur [16,89] überein.
184
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.8 Ansätze zur Synthese von rac-26 analog AAV 5
8.2.2.4
Eintrag
Wässriges Medium
Zeit [h]
Umsatz [%]
1
IPA / dest. Wasser
24
76
2
IPA / pH 7
24
77
3
IPA / dest. Wasser
64
83
4
IPA / pH 7
64
81
Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 (AAV 6): „basenfreie“ Suzuki-Kupplung in
wässrigem Reaktionsmedium
Abbildung 8.5 Basenfreie Suzuki-Kupplung
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer
parallel
dazu
angesetzten
Suspension,
bestehend
aus
95.7 mg
(0.389 mmol)
4‘-Iodacetophenon (4), 47.4 mg (0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) in 5.0 ml entgastem
Isopropanol und 4.5 ml entgastem Phosphatpuffer pH 8 (100-200 mM Kpi), gegeben. Nach
24 Stunden Rühren bei 400 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur wird das
Reaktionsgemisch mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert und es wird dreimal mit je 10 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3
bestimmt.
185
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.4.1
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (5) in 100 mM Kpi-Puffer pH 8
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 (AAV
O
4'
8'
9'
10
7
5'
3
6
4
2
6). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%)
1
5
TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine Suspension
angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus 95.7 mg
8
(0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) und 47.4 mg (0.389 mmol)
9
5
C 14H 12O
M = 196.24 g/mol
Phenylboronsäure (19) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem Puffer pH 8 (100 mM Kpi) gegeben. Nach 24 Stunden
Rühren Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf pH 1 angesäuert und nach
weiterer Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 6 wurde das Rohprodukt als brauner Feststoff
erhalten.
Umsatz: 58%
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
8.2.2.4.2
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (5) in 200 mM Kpi-Puffer pH 8
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 6 (AAV
O
4'
8'
9'
7
10
8
5'
3
6
4
9
2
5
5
C 14H 12O
M = 196.24 g/mol
6). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%)
1
TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine Suspension
angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus 95.7 mg
(0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) und 47.4 mg (0.389 mmol)
Phenylboronsäure (19) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem Puffer pH 8 (200 mM Kpi) gegeben. Nach 24 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur wurde auf pH 1 angesäuert. Nach weiterer Aufarbeitung gemäß
Arbeitsvorschrift 6 wurde das Rohprodukt als brauner Feststoff erhalten.
Umsatz: 79%
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
186
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.5
Allgemeine Arbeitsvorschrift 7 (AAV 7): Eignung der Basen bzgl. ihres pHWerts
Es wurden je 1.0-2.5 Äquivalente Base (bezogen auf eine Ansatzgröße von 0.389 mmol) in
5 bzw. 10 ml wässrigem Medium gelöst. Als wässriges Medium wurden destilliertes Wasser,
25 mM Phosphatpuffer pH 7 (dest. Wasser / 50 mM Phosphatpuffer 1:1 (v/v)) bzw. 45 mM
Phosphatpuffer pH 7 (dest. Wasser / 50 mM Phosphatpuffer 1:9 (v/v)) verwendet. Lediglich
die Base Triethylamin wurde in 50 mM Phosphatpuffer gemessen, da deren pH-Wert in dest.
Wasser nicht bestimmt werden kann. Die Ergebnisse sind Tabelle 8.9 zusammengefasst.
Tabelle 8.9 Ergebnisse der pH-Wert-Messungen
8.2.2.6
Eintrag
Base
Konzentration
Lösungsmittel
pH-Wert
1
Et3N
39 mM
Puffer pH 7 (50 mM)
10.2
2
Na2CO3
97 mM
dest. Wasser
11.3
3
Na2CO3
97 mM
Puffer pH 7 (25 mM)
10.4
4
NaHCO3
97 mM
dest. Wasser
8.3
5
NaHCO3
97 mM
Puffer pH 7 (25 mM)
7.4
6
NaHCO3
97 mM
Puffer pH 7 (50 mM)
7.3
Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 (AAV 8): Synthese racemischer Alkohole
mittels Natriumborhydridreduktion [172]
Abbildung 8.6 Synthese racemischer Alkohole
Zur Synthese der racemischen Alkohole werden 0.5 mmol des entsprechenden Ketons in
2.8 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 26.5 mg (0.7 mmol) Natriumborhydrid wird
187
EXPERIMENTELLER TEIL
24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird mit 2 M Salzsäure auf pH 7
eingestellt. Die Zugabe von 10 ml dest. Wasser führt zur Bildung eines weißen
Niederschlags. Es wird dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
Umsatz wird mittels
1
H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt. Die Reinigung erfolgt
säulenchromatographisch an Kieselgel. Die Bestimmung des ee-Werts erfolgt mittels chiraler
HPLC.
8.2.2.6.1
Synthese von rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 8 (AAV 8).
Es wurden 2.46 g (10 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) in 56 ml Methanol
gelöst
und
portionsweise
0.53 g
(14 mmol)
Natriumborhydrid
zugegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde
gemäß
Arbeitsvorschrift 8
chromatographischer
aufgearbeitet.
Reinigung
an
Nach
Kieselgel
säulen(Laufmittel:
Cyclohexan / Ethylacetat 5 : 1 (v/v)) wurde das gereinigte Produkt als weißer-leicht gelblicher
Feststoff erhalten. Die Bestimmung des ee-Werts erfolgte mittels chiraler HPLC (Chiralcel®
OJ-H, Hexan / Isopropanol 95 : 5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm).
Umsatz >95%
Ausbeute (gereinigtes Produkt): 89% (2.20 g; 8.9 mmol)
Enantiomerenüberschuss: 0%
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 1.45 (d, 3J = 6.48 Hz, 3H, H-C1), 1.82 (br s, 1H, OH),
4.83 (q,
3
J = 6.44 Hz, 1H, H-C2), 7.11 (d,
3
J = 8.24 Hz, 2H, H-C4, H-C4‘), 7.65 (d,
3
J = 8.36 Hz, 2H, H-C5, H-C5‘).
HPLC (Chiralcel® OJ-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR (S) = 20.6 min
tR (R) = 21.5 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen der Literatur [105] überein.
188
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.6.2
Synthese von rac-1-(4-Biphenyl)ethanol (rac-6)
OH
5'
8'
9'
10
7
6
4'
3
2
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 8
(AAV 8). Es wurden 0.49 g (2.5 mmol) 4‘-Phenylacetophenon (5) in
1
14 ml Methanol gelöst. Nach portionsweiser Zugabe von 132.4 mg
4
5
8
9
rac-6
C14H 14O
M = 198.26 g/mol
(3.5 mmol)
Natriumborhydrid
Raumtemperatur
gerührt.
wurde
Nach
24 Stunden
Aufarbeitung
bei
gemäß
Arbeitsvorschrift 8 wurde das Produkt als weißer Feststoff erhalten.
Die Bestimmung des ee-Werts erfolgte mittels chiraler HPLC
(Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm).
Umsatz: >95%
Auswaage: 99% (2.48 mmol)
Enantiomerenüberschuss: 0%
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 1.53 (d, 3J = 6.48 Hz, 3H, H-C1), 1.83 (br s, 1H, OH),
4.94 (q, 3J = 6.46 Hz, 1H, H-C2), 7.33 (t, 3J = 7.34 Hz, 1H, H-C10), 7.43 (m, 4H, H-C4,
H-C4´, H-C9, H-C9´), 7.57 (d, 3J = 8.22 Hz, 4H, H-C5, H-C5´, H-C8, H-C8´).
HPLC (Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR (S) = 13.9 min
tR (R) = 14.7 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen der in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Verbindung und der Literatur [16] überein.
189
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.7
Allgemeine Arbeitsvorschrift 9 (AAV 9): Substitution der Phenylboronsäure
durch Phenylboronsäurepinakolester in der Suzuki-Kupplung
R
O
+
B
wässriges Medium
(50% i-PrOH (v/v))
RT, 24h
V = 10 ml
I
4: R = COCH3
rac-29: R = rac-CHOHCH3
39 mM
R
2.5 Äq. NaHCO3
PdCl2/TPPTS
O
30
5: R = COCH3
rac-6: R = rac-CHOHCH3
39 mM
Abbildung 8.7 Suzuki-Kupplung unter Verwendung von Phenylboronsäurepinakolester (30)
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer
parallel
dazu
angesetzten
Natriumhydrogencarbonat,
Suspension,
0.389 mmol
bestehend
Arylhalogenid
aus
4
bzw.
81.7 mg
rac-29
(0.973 mmol)
und
80.2 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäurepinakolester (30) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer pH 7, gegeben. Nach 24-64 Stunden Rühren
bei 400 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch
angesäuert. Im Fall des Ketons 4 als Substrat erfolgt das Ansäuern mit 2.5 M Salzsäure auf
pH 1. Im Fall des Alkohols rac-29 wird das Reaktionsgemisch mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5
angesäuert. Anschließend wird dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt.
8.2.2.7.1
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (5)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 9
O
4'
8'
9'
10
7
5'
3
6
4
2
5
8
9
5
C 14H 12O
M = 196.24 g/mol
190
(AAV 9). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
81.7 mg
(0.973 mmol)
Natriumhydrogencarbonat,
95.7 mg
(0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) und 80.2 mg (0.389 mmol)
EXPERIMENTELLER TEIL
Phenylboronsäurepinakolester (30) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem
dest. Wasser gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde mit 2.5 M
Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Nach weiterer Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 9 wurde
das Rohprodukt als brauner Feststoff erhalten.
Umsatz: 93%
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
8.2.2.7.2
Synthese von rac-1-(4-Biphenyl)ethanol (rac-6)
OH
5'
8'
9'
10
7
6
4'
3
2
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 9
(AAV 9). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
4
5
Suspension angesetzt. Diese wurde zu Suspension aus 81.7 mg
8
9
rac-6
C14H 14O
M = 198.26 g/mol
(0.973 mmol) Natriumhydrogencarbonat, 96.5 mg (0.389 mmol)
rac-1-(4‘-Iodphenyl)ethanol (rac-29) und 80.2 mg (0.389 mmol)
Phenylboronsäurepinakolester
(30)
in
5.0 ml
entgastem
Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer pH 7 gegeben. Nach
24 Stunden Rühren bei bei Raumtemperatur wurde mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5
angesäuert. Nach weiterer Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 9 wurde das Rohprodukt
als brauner Feststoff erhalten.
Die Ergebnisse unter Variation der wässrigen Phase sind in Tabelle 8.10 zusammengefasst.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit denen des Racemats in Abschnitt
8.2.2.6.2 und der Literatur [16,89] überein.
Tabelle 8.10 Ergebnisse zur Synthese von rac-6 analog AAV 9
Eintrag
Wässriges Medium
Umsatz
1
i-PrOH / dest. Wasser
73%
2
i-PrOH / Puffer pH 7
54%
191
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.8
Allgemeine Arbeitsvorschrift 10 (AAV 10): Photometertest zur Bestimmung
der Enzymaktivität (in Abhängigkeit vom Substrat)
O
OH
ADH
Puffer pH 7
+ NAD(P)H
+ NAD(P)+
R
R
33, 34, 4, 5, 31
R = H, Cl, I, Ph, B(OH)2
35, 36, 29, 6, 37
R = H, Cl, I, Ph, B(OH)2
Abbildung 8.8 Photometertest zur Bestimmung der Enzymaktivität der ADHs
Es werden 10 mM Lösungen/Suspensionen der zu untersuchenden Ketone und der
Referenzsubstanz in Puffer pH 7 hergestellt. Der Cofaktor wird als 12.5 mM Lösung
eingesetzt. In eine Quarzküvette werden zunächst 960 µl bzw. 970 µl Keton-Lösung und
20 µl Cofaktor-Lösung pipettiert und die Absorption bei 340 nm gemessen. Dann werden
20 µl
bzw.
10 µl
Enzym
(in geeigneter
Verdünnung)
zugegeben,
so
dass
das
Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml beträgt und die Messung gestartet. Über einen Zeitraum
von 10 Minuten wird alle zwei Sekunden ein Messpunkt aufgenommen. Aus der
Anfangssteigung wird dann mittels folgender Formel die Aktivität der ADH (bezogen auf das
Substrat) in U/ml berechnet:
=
∆
340 nm
∙
∙
∙
∙ ∙
∆E340 nm/t: Anfangssteigung [1/min]
Vg: Gesamtvolumen (1 ml)
f: Verdünnungsfaktor
ε: Extinktionskoeffizient (6.3 ml/µmol·cm)
Vp: Probenvolumen [ml]
d: Schichtdicke der Küvette [1 cm]
8.2.2.8.1
Photometertest mit ADH aus Rhodococcus species (Rohextrakt)
Die Durchführung der Aktivitätsbestimmung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 10
(AAV 10). Als Referenzsubstanz wird 4‘-Chloracetophenon (34) verwendet. Die für dieses
Substrat bestimmte volumetrische Aktivität wird auf 100% gesetzt. Die angegebenen
relativen Aktivitäten beziehen sich auf die Aktivität der RR-ADH für die Referenz 34. Als
192
EXPERIMENTELLER TEIL
Cofaktor wird NADH eingesetzt. Messungen und Auswertungen zur Bestimmung der
Enzymaktivität erfolgten analog der Beschreibung in Arbeitsvorschrift 10.
Tabelle 8.11 Ergebnisse der Photometertests mit ADH aus Rhodococcus sp.
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Rel. Aktivität
[1/min]
[U/ml]
[%]
1 b)
0.7334
90
100
4'-Iodacetophenon
1 b)
0.8313
81
90
3
4'-Phenylacetophenon
1 b)
0.7072
67
74
4
4‘-Chloracetophenon
2 c)
1.0137
80
100
5
4‘-Iodacetophenon
2 c)
0.8802
70
88
6
4‘-Phenylacetophenon
2 c)
0.8409
67
84
7
4‘-Chloracetophenon
3 b)
0.8447
74
100
8
4‘-Iodacetophenon
3 b)
1.0425
91
123
9
4‘-Phenylacetophenon
3 b)
0.5817
51
69
10
4‘-Chloracetophenon
4 b)
0.3878
34
100
11
4‘-Iodacetophenon
4 b)
0.4094
36
106
12
4‘-Phenylacetophenon
4 b)
0.3825
33
97
13
4‘-Acetylphenylboronsäure
4 b)
0.0295
2
8
Eintrag a)
Keton
Charge
1
4‘-Chloracetophenon
2
a)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), d = 1 cm, VP = 0.02 ml;
8.2.2.8.2
b)
f = 11;
c)
f = 10
Photometertest mit ADH aus Lactobacillus kefir (Rohextrakt)
Die Durchführung der Photometertests erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 10
(AAV 10). Als Referenzsubstanz wurde Acetophenon (34) verwendet. Die angegebenen
relativen Aktivitäten beziehen sich auf die Aktivität für Acetophenon. Die Aktivität der Lk-ADH
wird für die Referenzsubstanz 34 auf 100% festgesetzt. Die Substrat-Lösungen und die
Referenz-Lösung werden mit wenig Magnesiumchlorid (1 mM) versetzt, da das Enzym
Magnesium-Ionen für die Stabilisierung der Struktur benötigt. Als Cofaktor wird NADPH
193
EXPERIMENTELLER TEIL
eingesetzt. Messungen und Auswertungen zur Bestimmung der Enzymaktivität erfolgten
analog Arbeitsvorschrift 10.
Tabelle 8.12 Ergebnisse der Photometertests mit ADH aus L. kefir (Rohextrakt)
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Rel. Aktivität
[1/min]
[U/ml]
[%]
5
0.6471
1032
100
4‘-Iodacetophenon
5
0.6888
1099
106
3
4‘-Phenylacetophenon
5
0.0897
143
14
4
Acetophenon
6
0.6932
1100
100
5
4‘-Iodacetophenon
6
0.5126
813
74
6
4‘-Phenylacetophenon
6
0.0720
114
10
7
Acetophenon
7
0.9155
1453
100
8
4‘-Iodacetophenon
7
0.7193
1141
79
9
4‘-Phenylacetophenon
7
0.0586
93
7
10
4‘-Acetylphenylboronsäure
7
0.3423
543
37
11
Acetophenon
8
0.7667
1217
100
12
4‘-Iodacetophenon
8
0.6914
1097
90
Eintrag a)
Substrat
Charge
1
Acetophenon
2
a)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), d = 1 cm, VP = 0.02 ml; f = 200
8.2.2.8.3
Photometertest mit ADH aus Lactobacillus kefir (gereinigt)
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 10
(AAV 10). Es wurden 10 mM Lösungen/Suspensionen der zu untersuchenden Ketone und
der Referenzsubstanz Acetophenon (34) in Puffer pH 7 hergestellt. Diese wurden mit einer
kleinen Menge Magnesiumchlorid versetzt (1 mM). Der Cofaktor wurde als 12.5 mM
NADPH-Lösung eingesetzt. In eine Quarzküvette werden zunächst 960 µl Keton-Lösung und
20 µl NADPH-Lösung pipettiert und die Absorption bei 340 nm gemessen. Dann wurden
20 µl Enzym hinzugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml betrug.
194
EXPERIMENTELLER TEIL
Messungen und Auswertungen zur Bestimmung der Enzymaktivität erfolgten analog
Arbeitsvorschrift 10.
Tabelle 8.13 Aktivität der partiell gereinigten ADH aus L. kefir
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Rel. Aktivität
[1/min]
[U/ml]
[%]
Acetophenon
0.6546
520
100
9 b)
4‘-Iodacetophenon
0.4737
376
72
3
9 b)
4‘-Phenylacetophenon
0.1012
80
15
4
10 c)
Acetophenon
0.5850
930
100
5
10 c)
4‘-Iodacetophenon
0.5140
816
88
6
10 c)
4‘-Phenylacetophenon
0.0853
135
15
7
11 d)
Acetophenon
0.8587
1363
100
8
11 d)
4‘-Iodacetophenon
0.6461
1025
75
9
11 d)
4‘-Phenylacetophenon
0.1029
163
12
Eintrag a)
Charge
Substanz
1
9 b)
2
a)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.02 ml, d = 1 cm;
b)
f = 100;
c)
f = 200; die Proteinkonzentration
wurde mittels Bradford-Test am FZ Jülich durch Thorsten Rosenbaum auf 90 mg/ml bestimmt;
d)
f = 200; die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Test am FZ Jülich durch Thorsten
Rosenbaum auf 55 mg/ml bestimmt
8.2.2.9
Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 (AAV 11): Photometertest zur Bestimmung
des Einflusses verschiedener Additive aus der Suzuki-Kupplung auf die
ADHs
O
+ NAD(P)H
5
OH
Additiv
Alkoholdehydrogenase
+ NAD(P)+
wässriges Medium
6
Abbildung 8.9 Photometertest bzgl. Einfluss verschiedener Additive
195
EXPERIMENTELLER TEIL
Es werden 10 mM Suspensionen von 4‘-Phenylacetophenon (5) in Puffer pH 7 (50 mM) oder
einer 1:1 Mischung, bestehend aus Puffer pH 7 und dest. Wasser, hergestellt und mit dem
zu
untersuchenden
Additiv
in
unterschiedlicher
Konzentration
versetzt
(86 mM
Phenylboronsäure und Triethylamin entsprechen dabei der Konzentration bei einem
Reaktionsvolumen von 4.5 ml). Der Cofaktor wird als 12.5 mM Lösung eingesetzt. In eine
Quarzküvette werden zunächst 960 µl Keton-Lösung und 20 µl Cofaktor-Lösung pipettiert
und die Absorption gemessen. Dann werden 20 µl Enzym in geeigneter Verdünnung
zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml beträgt und die Messung
gestartet. Über einen Zeitraum von 10 Minuten wird alle zwei Sekunden ein Messpunkt
aufgenommen. Aus der Anfangssteigung wird dann mittels folgender Formel die Aktivität der
Alkoholdehydrogenase in U/ml berechnet:
=
∆
340 nm
∙
∙
∙
∙ ∙
∆E340 nm/t: Anfangssteigung [1/min]
Vg: Gesamtvolumen (1 ml)
f: Verdünnungsfaktor
Vp: Probenvolumen [ml]
d: Schichtdicke der Küvette [cm]
Vor und nach jeder Messung von 4‘-Phenylacetophenon (5) mit einem Additiv wird eine
10 mM Suspension von 4‘-Phenylacetophenon (5) ohne Additiv gemessen. Die relative
Aktivität des Enzyms für diese Messung wird auf 100% festgesetzt.
8.2.2.9.1
Einfluss auf ADH aus Rhodococcus species
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 (AAV 11). Die Aktivität der
ADH aus Rhodococcus species für das Substrat 4‘-Phenylacetophenon (5) wird auf 100%
festgesetzt. Die angegebenen relativen Aktivitäten beziehen sich auf die Aktivität der ADH in
Gegenwart verschiedener Additive und der jeweiligen Konzentration. Als Cofaktor wurde
NADH eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.14 zusammengestellt und in Abbildung
4.25 bis Abbildung 4.28 graphisch dargestellt.
196
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.14 Inhibierung der ADH aus Rhodococcus sp. durch verschiedene Additive
Konz. Additiv
Additiv
1
TPPTS
0
50 mM
100
2
TPPTS
1
50 mM
85
3
TPPTS
2
50 mM
82
4
TPPTS
4
50 mM
88
5
TPPTS
0
25 mM
100
6
TPPTS
1
25 mM
100
7
TPPTS
2
25 mM
97
8
TPPTS
4
25 mM
92
9
PdCl2
0
50 mM
100
10
PdCl2
0.8
50 mM
100
11
PdCl2
1.5
50 mM
92
12
PdCl2
3
50 mM
95
13
PdCl2
0
25 mM
100
14
PdCl2
0.8
25 mM
103
15
PdCl2
1.5
25 mM
101
16
PdCl2
3
25 mM
93
17
Triethylamin
0
50 mM
100
18
Triethylamin
19
50 mM
100
19
Triethylamin
39
50 mM
9
20
Triethylamin
86
50 mM
3
[mM]
Puffer pH 7
Rel. Aktivität
Eintrag
[%]
197
EXPERIMENTELLER TEIL
21
Triethylamin
0
25 mM
100
22
Triethylamin
19
25 mM
40
23
Triethylamin
39
25 mM
14
24
Triethylamin
86
25 mM
1
25
Phenylboronsäure
0
50 mM
100
26
Phenylboronsäure
19
50 mM
79
27
Phenylboronsäure
39
50 mM
65
28
Phenylboronsäure
86
50 mM
45
29
Phenylboronsäure
0
25 mM
100
30
Phenylboronsäure
19
25 mM
59
31
Phenylboronsäure
39
25 mM
48
32
Phenylboronsäure
86
25 mM
36
33
Pinakolester 30
0
50 mM
100
34
Pinakolester 30
19
50 mM
74
35
Pinakolester 30
39
50 mM
39
36
Pinakolester 30
86
50 mM
34
37
Pinakolester 30
0
25 mM
100
38
Pinakolester 30
19
25 mM
80
39
Pinakolester 30
39
25 mM
65
40
Pinakolester 30
86
25 mM
80
8.2.2.9.2
Einfluss auf gereinigte ADH aus Lactobacillus kefir
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 11 (AAV 11). Die Aktivität der
partiell gereinigten ADH aus Lactobacillus kefir für das Substrat 4‘-Phenylacetophenon (5)
wird auf 100% festgesetzt. Die angegebenen relativen Aktivitäten beziehen sich auf die
Aktivität der ADH in Gegenwart verschiedener Additive und der jeweiligen Konzentration. Als
198
EXPERIMENTELLER TEIL
Cofaktor wurde NADPH eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.15 zusammengefasst
und Abbildung 4.39, Abbildung 4.40 und Abbildung 4.41 graphisch dargestellt.
Tabelle 8.15 Inhibierung der gereinigten ADH aus L. kefir durch verschiedener Additive
Eintrag
Additiv
Konz. Additiv [mM]
Puffer pH 7
Rel. Aktivität [%]
1
TPPTS
0
50 mM
100
2
TPPTS
2
50 mM
95
3
TPPTS
4
50 mM
93
4
PdCl2
0
50 mM
100
5
PdCl2
1.5
50 mM
93
6
PdCl2
3
50 mM
102
7
Phenylboronsäure
0
50 mM
100
8
Phenylboronsäure
19
50 mM
62
9
Phenylboronsäure
39
50 mM
39
8.2.2.10 Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 (AAV 12): Photometertest zur Bestimmung
der Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert
Abbildung 8.10 Photometertest zur Bestimmung der pH-Abhängigkeit
199
EXPERIMENTELLER TEIL
Es werden 10 mM Lösungen von Acetophenon (33) sowohl in Puffer pH 7 (50 mM,
Phosphatpuffer), in Puffer pH 8 (200 mM, Kaliumphosphatpuffer/KOH) und auch in einer
Natriumhydrogencarbonat-lösung (97 mM in dest. Wasser) hergestellt. Diese werden mit
einer kleinen Menge Magnesiumchlorid versetzt (1 mM). Der Cofaktor wird als 12.5 mM
NADPH-Lösung eingesetzt. In eine Quarzküvette werden zunächst 960 µl Keton-Lösung und
20 µl NADPH-Lösung pipettiert und die Absorption bei 340 nm gemessen. Dann werden
20 µl Enzym hinzugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml beträgt. Aus
der Anfangssteigung wird dann mittels folgender Formel die Aktivität der Lk-ADH in U/ml
berechnet:
=
∆
340 nm
∙
∙
∙
∙ ∙
∆E340 nm/t: Anfangssteigung [1/min]
Vg: Gesamtvolumen (1 ml)
f: Verdünnungsfaktor
Vp: Probenvolumen [ml]
d: Schichtdicke der Küvette [cm]
8.2.2.10.1
Photometertest mit ADH aus Lactobacillus kefir (Rohextrakt)
Die Durchführung der Aktivitätsbestimmung in Abhängigkeit vom pH-Wert erfolgte analog
Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 (AAV 12). Als Substrat wurde die Referenzverbindung
Acetophenon (33) verwendet. Die für dieses Substrat in Puffer pH 7 bestimmte
volumetrische Aktivität [U/ml] wird auf 100% gesetzt. Die angegebenen relativen Aktivitäten
der ADH aus L. kefir beziehen sich auf die Aktivität für Acetophenon (33) in Puffer pH 7.
Tabelle 8.16 Ergebnisse der pH-Abhängigkeit der ADH aus L. kefir (Rohextrakt)
a)
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Rel. Aktivität
[1/min]
[U/ml]
[%]
pH 7 (50 mM)
0.7667
1217
100
8
pH 8 (200 mM)
0.3624
575
47
8
NaHCO3 (97 mM)
0.2452
389
32
Eintrag a)
Charge
wässriges Medium
1
8
2
3
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.02 ml, d = 1 cm, f = 200
200
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.10.2
Photometertest mit ADH aus Lactobacillus kefir (gereinigt)
Die Durchführung der Aktivitätsbestimmung in Abhängigkeit vom pH-Wert erfolgte analog
Allgemeine Arbeitsvorschrift 12 (AAV 12). Als Substrat wurde die Referenzverbindung
Acetophenon (33) verwendet. Die für dieses Substrat in Puffer pH 7 bestimmte
volumetrische Aktivität [U/ml] wird auf 100% gesetzt. Die angegebenen relativen Aktivitäten
der ADH aus L. kefir beziehen sich auf die Aktivität für Acetophenon (33) in Puffer pH 7.
Tabelle 8.17 Ergebnisse der pH-Abhängigkeit der gereinigten ADH aus L. kefir
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Rel. Aktivität
[1/min]
[U/ml]
[%]
pH 7 (50 mM)
0.7069
561
100
9 b)
pH 8 (200 mM)
0.2636
209
37
3
9 b)
NaHCO3 (97 mM)
0.2124
169
30
4
10 c)
pH 7 (50 mM)
0.6410
1017
100
5
10 c)
pH 8 (200 mM)
0.3639
578
57
6
10 c)
NaHCO3 (97 mM)
0.2315
367
36
7
11 d)
pH 7 (50 mM)
0.9741
1546
100
8
11 d)
pH 8 (200 mM)
0.5458
866
56
9
11 d)
NaHCO3 (97 mM)
0.3533
561
36
Eintrag a)
Charge
Wässriges Medium
1
9 b)
2
a)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.02 ml, d = 1 cm;
b)
f = 100,
c)
f = 200,
d)
f = 200
8.2.2.11 Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 (AAV 13): Enzymatische Reduktion unter
Substrat-gekoppelter Cofaktorregenerierung
Abbildung 8.11 Enzymatische Reduktion unterschiedlich substituierter Acetophenone
201
EXPERIMENTELLER TEIL
Zunächst wird das Keton (0.25-0.389 mmol) in einer Mischung aus Isopropanol und Puffer
oder Isopropanol und 97 mM Natriumhydrogencarbonat-Lösung in einem Gesamtvolumen
von 10 ml gelöst. Anschließend werden Enzym und Cofaktor zugegeben. Nach 24 Stunden
Rühren bei Raumtemperatur wird dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert und die
vereinigten
organischen
Lösungsmittel
wird
Phasen
am
werden
über
Rotationsverdampfer
Magnesiumsulfat
entfernt
und
getrocknet.
das
Das
Rohprodukt
im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3
bestimmt. Der ee-Wert wird mittels chiraler HPLC bestimmt. Eine Reinigung des Produkts
erfolgt gegebenenfalls säulenchromatographisch an Kieselgel.
8.2.2.11.1
Synthese von (S)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((S)-6)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 13
(AAV 13).
Zu
einer
Suspension
von
49.1 -76.3 mg
(0.25 -
0.389 mmol) 4’-Phenylacetophenon (5) in 5.0 ml Puffer pH 7 und
5.0 ml Isopropanol wurden 18 mg (0.027 mmol) NAD+ und
64 U/mmol RR-ADH (bezogen auf das Substrat 5) gegeben. Nach
24
Stunden
Rühren
bei
Raumtemperatur
wurde
gemäß
Arbeitsvorschrift 13 aufgearbeitet. Der ee-Wert wurde mittels
chiraler
(Chiralpak® IB,
HPLC
Hexan/Isopropanol
95:5
(v/v),
0.8 ml/min,
238 nm)
bestimmt.Die Ergebnisse unter Verwendung verschiedener Enzymchargen sind in Tabelle
8.18 zusammengefasst.
Für ein Beispiel (Tabelle 8.18, Eintrag 1) wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch
an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 4 : 1 (v/v)) gereinigt. Das saubere Produkt
(S)-6
wurde
als
weißer
Feststoff
in
einer
Ausbeute
von
64%
und
einem
Enantiomerenüberschuss von >99% ee erhalten.
HPLC (Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 13.1 min
tR(R) = (14.0 min)
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
202
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.18 Zusammenfassung der Biotransformationen unter Verwendung der ADH aus
Rhodococcus sp.
Wässriges
IPA-Anteil
Ansatzgröße
Enzymmenge
Umsatz
ee-Wert
Medium
(v/v)
[mmol]
[µl]
[%]
[%]
1
IPA / pH 7
25%
0.25
232 a)
77
>99
2
IPA / pH 7
50%
0.25
232 a)
>95
>99
3
IPA / pH 7
50%
0.25
240 b)
>95
>99
4
IPA / pH 7
50%
0.25
315 c)
>95
>99
Eintrag
a)
64 U/mmol RR-ADH Charge 1;
8.2.2.11.2
5'
I
6
4'
5
b)
64 U/mmo RR-ADH-Charge 2;
c)
64 U/mmo RR-ADH Charge 3
Synthese von (R)-1-(4-Iodphenyl)ethanol ((R)-29)
OH
3
2
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 13 (AAV 13).
Zu einer Lösung von 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) in
1
4
(R)-29
C8H7IO
M = 248.06 g/mol
5.0 ml
Isopropanol
und
5.0 ml
Puffer
pH 7
wurden
wenig
Magnesiumchlorid (~1 mM), 107 µl ADH aus L. kefir (300 U/mmol
bezogen
auf
4;
Charge 7)
und
17 mg
(0.022 mmol)
NADP+
hinzugefügt. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde
gemäß Arbeitsvorschrift 13 aufgearbeitet und das Rohprodukt als orangefarbener Feststoff
erhalten. Die Bestimmung des ee-Werts erfolgte mittels chiraler HPLC (Chiralcel® OJ-H,
Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm).
Umsatz: >95%
Auswaage: 95% (92.0 mg; 0.371 mmol)
Enantiomerenüberschuss: >99%
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ [ppm] = 1.45 (3H, d, 3J = 6.52 Hz, H-C1), 4.84 (1H, q,
3
J = 6.44 Hz, H-C2), 7.11 (2H, d, 3J = 8.32 Hz, H-C4, H-C4‘), 7.66 (2H, d, 3J = 8.32 Hz, H-C5,
H-C5‘).
HPLC (Chiralcel® OJ-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
203
EXPERIMENTELLER TEIL
tR(S) = 20.5 min
tR(R) = 21.5 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen aus der Doktorarbeit von Marina Kraußer
[105] überein.
8.2.2.11.3
5'
8'
9'
10
9
7
6
Synthese von (R)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((R)-6) mit Lk-ADH Rohextrakt
4'
5
OH
3
2
4
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 13
(AAV 13). Zu einer Suspension von 76.3 mg (0.389 mmol)
1
4’-Phenylacetophenon (5) in 5.0 ml Puffer und 5.0 ml Isopropanol
wurden wenig Magnesiumchlorid (~1 mM), 18 mg (0.024 mmol)
8
(R)-6
C14H14O
M = 198.26 g/mol
NADP+ und 118 U/mmol ADH aus L.kefir (Aktivität bezogen auf das
Substrat 5 bei entsprechendem pH-Wert) gegeben. Nach 24
Stunden
Rühren
bei
Raumtemperatur
wurde
gemäß
Arbeitsvorschrift 13 aufgearbeitet. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB
bzw. AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Die Ergebnisse
unter Verwendung verschiedener Enzymchargen sind in Tabelle 8.19 zusammengestellt.
Für ein Beispiel (Tabelle 8.19, Eintrag 2) wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch
an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 4 : 1 (v/v)) gereinigt. Das saubere Produkt
(R)-6
wurde
als
weißer
Feststoff
in
einer
Ausbeute
von
68%
und
einem
Enantiomerenüberschuss von >99% ee erhalten.
HPLC (Rohprodukt; Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 13.1 min
tR(R) = 13.9 min
HPLC (gereinigtes Produkt; Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol = 95:5 (v/v), 0.8 ml/min,
238 nm):
tR(S) = 15.8 min
tR(R) = 16.7 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
204
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.19 Reduktion von 4'-Phenylacetophenon (5) unter Verwendung von ADH aus
L. kefir (Rohextrakt)
Wässriges
IPA-Anteil
Ansatzgröße
Medium
(v/v)
[mmol]
[µl]
[%]
[%]
1
IPA / pH 7
50%
0.25
322 a)
>95
>99
2
IPA / pH 7
50%
0.389
322 a)
>95
>99
3
IPA / pH 7
50%
0.389
404 b)
87
>99
4
IPA / pH 7
50%
0.389
495 c)
94
>99
5
IPA / pH 8
50%
0.389
1076 d)
>95
>99
Eintrag
a)
118 U/mmol Lk-ADH Charge 5;
d)
118 U/mmol Lk-ADH Charge 7, Aktivität angepasst an Puffer pH 8
8.2.2.11.4
5'
8'
7
10
8
118 U/mmol Lk-ADH Charge 6;
c)
ee-Wert
118 U/mmol Lk-ADH Charge 7;
Synthese von (R)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((R)-6) mit gereinigter Lk-ADH
OH
9'
b)
Enzymmenge Umsatz
6
4'
3
2
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 13
(AAV 13).
1
Zu
einer
Lösung
von
81.7 mg
(0.389 mmol)
Natriumhydrogencarbonat in 5 ml dest. Wasser oder Puffer pH7
4
5
9
(R)-6
C 14 H 14 O
M = 198.26 g/mol
und
5 ml
Isopropanol
wurden
76.3 mg
(0.389
mmol)
4‘-Phenylacetophenon (5), wenig Magnesiumchlorid (~1 mM),
118 U/mmol ADH aus L. kefir (Aktivität bezogen auf das Substrat 5
bei eintsprechendem pH-Wert) und 18 mg (0.024 mmol) NADP+
gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde gemäß Arbeitsvorschrift 13
aufgearbeitet und das Rohprodukt als weißer Feststoff erhalten. Der ee-Wert wurde mittels
chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)
bestimmt. Die Ergebnisse, die unter Verwendung verschiedener Enzymchargen erzielt
wurden, sind in Tabelle 8.20 zusammengefasst.
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 17.8 min
tR(R) = 19.2 min
205
EXPERIMENTELLER TEIL
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
Tabelle 8.20 Zusammenfassung der Ergebnisse zur Reduktion von 4'-Phenylacetophenon
unter Verwendung von Lk-ADH (gereinigt)
Wässriges
IPA-Anteil
Enzymmenge
Umsatz
ee-Wert
Medium
(v/v)
[ml]
[%]
[%]
1
IPA / NaHCO3 (aq)
50%
2.30 a)
63
>99
2
IPA / NaHCO3 (aq)
50%
0.95 b)
35
>99
3
IPA / pH 7
50%
0.34 c)
54
>99
4
IPA / NaHCO3 (aq)
50%
0.78 d)
20
>99
Eintrag
a)
118 U/mmol Lk-ADH Charge 9 bezogen auf 97 mM NaHCO3 (aq);
bezogen auf 97 mM NaHCO3 (aq);
d)
c)
b)
118 U/mmol Lk-ADH Charge 10
118 U/mmol Lk-ADH Charge 10, bezogen auf Puffer pH 7;
118 U/mmol Lk-ADH Charge 11 bezogen auf 97 mM NaHCO3 (aq)
8.2.2.12 Allgemeine Arbeitsvorschrift 14 (AAV 14): Eintopfreaktion mit Na2CO3 als
Base
Abbildung 8.12 Eintopfreaktion unter Verwendung von Natriumcarbonat als Base
Zunächst wird aus 2.7 mg Palladiumchlorid und 11.4 mg TPPTS in 0.5 bzw. 2 ml entgastem
dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer parallel dazu
angesetzten Suspension, bestehend aus einem Äquivalent 4‘-Iodacetophenon (4) (0.389
bzw. 5.057 mmol), einem Äquivalent Phenylboronsäure (19) und 2.5 Äquivalenten
Natriumcarbonat in 5 bzw. 65 ml entgastem Isopropanol und 4.5 bzw. 63 ml entgastem dest.
206
EXPERIMENTELLER TEIL
Wasser oder Phosphatpuffer pH 7 gegeben, so dass die Endkonzentration von
4‘-Iodacetophenon 39 mM beträgt. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird der
pH-Wert mit 2.5 M bzw. konzentrierter Salzsäure auf pH 7 adjustiert, bevor Enzym und
Cofaktor (NAD(P)+) zugegeben werden. Nach weiteren 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wird dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen
Phasen
werden
über
Magnesiumsulfat
getrocknet.
Das
Lösungsmittel
wird
am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt. Der ee-Wert wird mittels
chiraler HPLC (Chiralpak® IB oder AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)
bestimmt. Die Reinigung des Produkts erfolgt gegebenenfalls säulenchromatographisch an
Kieselgel.
8.2.2.12.1
Synthese von (S)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((S)-6)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 14
(AAV 14). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
95.7 mg
(0.389 mmol)
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und 103.1 mg (0.973 mmol)
Natriumcarbonat in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem Puffer pH 7 oder dest. Wasser gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde der pH-Wert mit 2.5 M Salzsäure auf pH 7 eingestellt, bevor 373 µl
ADH aus Rhodococcus sp. (64 U/mmol bezogen auf 5; Charge 2) und 26 mg (0.039 mmol)
NAD+ zugegeben wurden. Nach weiteren 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde
gemäß Arbeitsvorschrift 14 aufgearbeitet. Das Rohprodukt wurde als hellgelber Feststoff
erhalten. Der ee-Wert des Rohprodukts wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB,
Hexan/Isopropanol
95:5
(v/v),
0.8 ml/min,
238 nm)
bestimmt.
Nach
säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat
4:1 (v/v)) wurde das saubere Produkt als weißer Feststoff isoliert.
Umsatz: >95% (96% (S)-6, 4% 5)
Auswaage (Rohprodukt): 74.2 mg
Ausbeute (gereinigtes Produkt): 72% (55.5 mg; 0.280 mmol)
Enantiomerenüberschuss: >99%
207
EXPERIMENTELLER TEIL
HPLC (Rohprodukt; Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 13.1 min
tR(R) = 14.0 min
HPLC (gereinigtes Produkt; Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min,
238 nm):
tR(S) = 14.8 min
tR(R) = 15.7 min
Analog der hier beschriebenen Synthese wurde ein Experiment in Isopropanol und dest.
Wasser, statt Isopropanol und Puffer pH 7, durchgeführt. Dabei wurde das Produkt (S)-6 mit
einem Umsatz von 97% und einem ee-Wert von >99% erhalten. Als einziges Nebenprodukt
entstand das Kupplungsprodukt 5 mit einem Anteil von 3%.
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
8.2.2.12.2
5'
9'
10
8'
9
7
6
Synthese von (R)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((R)-6)
4'
5
OH
3
2
4
8
(R)-6
C14H14O
M = 198.26 g/mol
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 14
(AAV 14). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
95.7 mg
(0.389 mmol)
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und 103.1 mg (0.973 mmol)
Natriumcarbonat in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser oder Puffer pH 7 gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde der pH-Wert mit 2.5 M Salzsäure auf pH 7 eingestellt, bevor wenig
Magnesiumchlorid (1 mM), 118 U/mmol ADH aus L. kefir (Aktivität bezogen auf 5) und 18 mg
(0.024 mmol) NADP+ zugegeben wurden. Nach weiteren 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur erfolgte die Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 14. Der ee-Wert wurde
mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB bzw. AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min,
238 nm) bestimmt. Die Ergebnisse, die unter Verwendung verschiedener Enzymchargen
erzielt wurden, sind in Tabelle 8.21 zusammengefasst.
208
EXPERIMENTELLER TEIL
Für ein Beispiel (Tabelle 8.21, Eintrag 2) wurde das Rohprodukt säulenchromatographisch
an Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 4 : 1 (v/v)) gereinigt. Das saubere Produkt
(R)-6
wurde
als
weißer
Feststoff
in
einer
Ausbeute
von
72%
und
einem
Enantiomerenüberschuss von >99% ee erhalten.
HPLC (Rohprodukt; Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 15.3 min
tR(R) = 16.6 min
HPLC (sauberes Produkt; Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 14.3 min
tR(R) = 15.2 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
Tabelle 8.21 Zusammenfassung der Ergebnisse der Eintopfreaktion mit Na2CO3 (Lk-ADH)
Umsatz [%]
Eintrag
a)
Enzym [µl]
ee-Wert von 6 [%]
Wässriges Medium
4
5
29
6
1
322 a)
IPA / pH 7
-
14
-
86
>99
2
322 a)
IPA / dest. Wasser
-
8
-
92
>99
3
404 b)
IPA / pH 7
-
9
-
91
>99
4
404 b)
IPA / dest. Wasser
-
6
-
94
>99
Lk-ADH Charge 5;
8.2.2.12.3
b)
Lk-ADH Charge 6
Synthese von (R)-6 im Maßstab von 130 ml
OH
5'
8'
9'
10
7
6
4'
3
2
(AAV 14). Aus 2.7 mg (0.3 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(0.4 mol%) TPPTS wurde in 2 ml entgastem dest. Wasser eine
4
5
8
9
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 14
(R)-6
C 14 H 14 O
M = 198.26 g/mol
Suspension angesetzt. Diese wurde zu Suspension aus 1.244 g
(5.057 mmol)
4‘-Iodacetophenon
(4),
0.617 g
(5.057 mmol)
209
EXPERIMENTELLER TEIL
Phenylboronsäure (19) und 1.340 g (12.643 mmol) Natriumcarbonat in 65.0 ml entgastem
Isopropanol und 63.0 ml entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde der pH-Wert auf pH 7 adjustiert, bevor 12.4 mg (0.130 mmol)
Magnesiumchlorid, 5.25 ml ADH aus L. kefir (118 U/mmol bezogen auf 5; Charge 6) und
234 mg (0.306 mmol) NADP+ zugegeben wurden. Nach weiteren 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde dreimal mit je 130 ml Dichlormethan extrahiert. Dabei bildete sich
eine Emulsion. Die weitere Aufarbeitung erfolgte analog der allgemeine Arbeitsvorschrift 14.
Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® IB bzw. AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5
(v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Nach säulenchromatographischer Reinigung an
Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 4:1 (v/v); Ø 5.5 cm, Höhe 15 cm) wurde das
Produkt als weißer Feststoff erhalten.
Umsatz: >95% (88% (R)-6, 12% 5)
Auswaage (Rohprodukt): 817 mg
Ausbeute (gereinigtes Produkt): 66% (660 mg; 3.330 mmol)
Enantiomerenüberschuss: >99%
HPLC (Rohprodukt; Chiralpak® IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 13.7 min
tR(R) = 14.5 min
HPLC (gereinigtes Produkt; Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min,
238 nm):
tR(S) = 15.9 min
tR(R) = 17.1 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
210
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.13 Allgemeine Arbeitsvorschrift 15 (AAV 15): Eintopfreaktion mit NaHCO3 als
Base – Weg A
Abbildung 8.13 Eintopfreaktion unter Verwendung von NaHCO3 als Base
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer
parallel
dazu
angesetzten
Suspension,
bestehend
aus
81.7 mg
(0.973 mmol)
Natriumhydrogencarbonat, 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) und 47.4 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem
dest. Wasser oder 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml Phosphatpuffer pH 7, gegeben.
Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 Umdrehungen pro Minute wird ggf.
mit 2.5 M Salzsäure der pH-Wert auf pH 7 adjustiert, bevor wenig Magnesiumchlorid (1 mM),
118 U/mmol ADH aus L. kefir (Aktivität bezogen auf 5 bei pH 7 oder pH 8) und 18 mg
(0.024 mmol) NADP+ zugegeben werden. Nach weiteren 24 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wird dreimal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Der
Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt. Der ee-Wert wird mittels
chiraler HPLC (Chiralpak® IB oder AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)
bestimmt.
Synthese von (R)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((R)-6)
OH
5'
8'
9'
10
7
6
4'
3
2
4
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 15
(AAV 15Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
8
9
(R)-6
C 14 H 14 O
M = 198.26 g/mol
211
EXPERIMENTELLER TEIL
81.7 mg (0.973 mmol) Natriumhydrogencarbonat, 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon
und 47.4 mg (0.389 mmol) Phenylboronsäure in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem
dest.
Wasser
oder
Puffer
gegeben.
Nach
24
Stunden
Rühren
bei
Raumtemperatur wurden wenig Magnesiumchlorid (1 mM), 118 U/mmol Lk-ADH (bezogen
auf 5 bei entsprechenden pH-Wert) und 18 mg (0.024 mmol) NADP+ zugegeben. Nach
weiteren 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde gemäß Arbeitsvorschrift 15
aufgearbeitet und das Rohprodukt als hellgelber Feststoff erhalten. Der ee-Wert des
Rohprodukts wurde mittels chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v),
0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Die Ergebnisse, die unter Verwendung verschiedener
Enzymchargen erzielt wurden, sind in Tabelle 8.22 zusammengefasst.
Tabelle 8.22 Zusammenfassung der Ergebnisse der Eintopfreaktion mit NaHCO3
wässrige
Eintrag
a)
Phase a)
pH adj.
46 U
Enzym b)
bezogen auf
[µl]
5
29
6
von 6 [%]
Umsatz [%]
ee-Wert
1
dest. H2O
2.5 M HCl
pH 7
495
5
-
95
>99
2
pH 7
2.5 M HCl
pH 7
495
5
-
95
>99
3
pH 7
-
pH 7
495
77
2
21
n.b.
4
dest. H2O
-
pH 7
495
67
-
33
>99
5
dest. H2O
-
pH 8
1076
6
-
94
>99
6
pH 7
-
pH 8
1076
30
-
70
>99
7
dest. H2O
-
pH 8
1076
14
-
86
>99
8
pH 7
-
pH 8
1076
30
4
66
n.b.
9
dest. H2O
-
pH 8
1190 c)
7
-
93
>99
Abgesehen von 5.0 ml Isopropanol und 0.5 ml dest. Wasser für Katalysatorlösung;
Charge 7;
c)
b)
Lk-ADH
Enzymmenge angepasst auf 46 U, nach dem das Enzym durch Lagerung an Aktivität
verloren hatte
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
212
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.14 Allgemeine Arbeitsvorschrift 16 (AAV 16): Eintopfreaktion mit NaHCO3 als
Base – Weg B
Abbildung 8.14 Eintopfreaktion mit NaHCO3 als Base – Variation der Reaktionssequenz
Zu einer Lösung von 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon (4) in 5.0 ml entgastem
Isopropanol und 5.0 ml entgastem Puffer pH 7 werden wenig Magnesiumchlorid (1 mM),
107 µl Lk-ADH (300 U/mmol bezogen auf das Substrat 4, Charge 8) und 17 mg (0.022 mmol)
NADP+ hinzugefügt. Nach 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 Umdrehungen
pro Minute werden 81.7 mg (0.973 mmol) Natriumhydrogencarbonat, 47.4 mg (0.389 mmol)
Phenylboronsäure (19) und eine 30 Minuten zuvor angesetzte Suspension, bestehend aus
2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml entgastem dest.
Wasser, hinzugefügt. Nach weiteren 48-121 Stunden Rühren bei Raumtemperatur und
400 Umdrehungen pro Minute wird mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5-6 angesäuert und dreimal
mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über
Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und
das Rohprodukt im Ölpumpenvakuum getrocknet. Die Umsatzbestimmung erfolgt mittels
1
H-NMR-Spektroskopie in CDCl3. Die Bestimmung des ee-Werts erfolgt mittels chiraler
HPLC (Chiralpak® AD-H oder IB, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm).
Synthese von (R)-1-(4-Biphenyl)ethanol (R)-6)
5'
9'
10
8'
9
7
6
4'
5
OH
3
2
4
8
(R)-6
C14H14O
M = 198.26 g/mol
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 16
(AAV 16).
1
Zu
einer
Lösung
von
95.7 mg
(0.389 mmol)
4‘-Iodacetophenon (4) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 5.0 ml
entgastem Puffer pH7 wurden wenig Magnesiumchlorid (~1 mM),
107 µl Lk-ADH (300 U/mmol bezogen auf das Substrat 4) und
17 mg (0.022 mmol) NADP+ hinzugefügt. Nach 24 Stunden Rühren
bei
Raumtemperatur
wurden
81.7 mg
(0.973 mmol)
213
EXPERIMENTELLER TEIL
Natriumhydrogencarbonat,
47.4 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure
(19)
und
eine
Suspension aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser hinzugefügt. Nach weiteren 48-121 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde gemäß Arbeitsvorschrift 16 aufgearbeitet und das Rohprodukt als
gelb-brauner Feststoff erhalten. Die Bestimmung des ee-Werts erfolgte mittels chiraler HPLC
(Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm). Die Ergebnisse, die
unter Verwendung verschiedener Enzymchargen erzielt wurden, sind in Tabelle 8.23
zusammengefasst.
HPLC (Rohprodukt; Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 17.0 min
tR(R) = 18.4 min
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
Tabelle 8.23 Ergebnisse der Eintopfreaktion bei Variation der Reaktionssequenz
Eintrag
Reaktionszeit [h]
1
Umsatz [%]
ee-Wert von (R)-6 [%]
4
29
5
6
24 + 48
-
25
3
72
>99
2
24 + 121
-
21
3
76
>99
3
24 + 48
-
25
3
72
>99
8.2.2.15 Allgemeine Arbeitsvorschrift 17 (AAV 17): Untersuchung auf limitierende
Faktoren in der Suzuki-Kupplung
Abbildung 8.15 Untersuchung auf limitierende Faktoren in der Suzuki-Kupplung
214
EXPERIMENTELLER TEIL
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer
parallel
dazu
angesetzten
Natriumhydrogencarbonat,
Suspension,
95.7 mg
bestehend
(0.389 mmol)
aus
81.7 mg
4‘-Iodacetophenon
(0.973 mmol)
(4),
47.4 mg
(0.389 mmol) Phenylboronsäure (19), und dem zu untersuchenden Additiv in entsprechender
Menge – wobei angenommen wird, dass die Proteinkonzentration nach einem typischen
Aufschluss im Rohextrakt 13 mg/ml beträgt – in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser oder Puffer pH 7, gegeben. Vor Zugabe des Katalysators wurde
unter Umständen erneut Base in Form von Natriumhydrogencarbonat zugegeben, da der
pH-Wert nach Zugabe des Additivs (z.B. Rohextrakt) teilweise stark abfiel. Nach 24 bis 64
Stunden Rühren bei Raumtemperatur und 400 Umdrehungen pro Minute wird das
Reaktionsgemisch mit 2.5 M Salzsäure angesäuert und es wird dreimal mit je 10 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3
bestimmt.
8.2.2.15.1
5'
9'
10
8'
9
7
6
Einfluss von HSA
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 17
O
3
2
(AAV 17). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
4
8
5
C14H12O
M = 196.24 g/mol
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
81.7 mg
(0.973 mmol)
(0.389 mmol)
Natriumhydrogencarbonat,
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
95.7 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure (19) und 20 mg HSA in 5.0 ml entgastem
Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben. Nach 24-64 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Nach Aufarbeitung gemäß
Arbeitsvorschrift 17 wurde das Rohprodukt als gelber Feststoff erhalten.
Umsatz nach 24 h: 76%
Umsatz nach 64 h: >95%
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
215
EXPERIMENTELLER TEIL
Einfluss von NADP+
8.2.2.15.2
5'
9'
10
8'
7
9
6
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 17
O
3
(AAV 17). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
2
1
4
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
8
5
C14H12O
M = 196.24 g/mol
81.7 mg
(0.973 mmol)
(0.389 mmol)
Natriumhydrogencarbonat,
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
95.7 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure (19) und 17 mg (0.022 mmol) NADP+ in 5.0 ml
entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser oder Puffer gegeben. Nach
24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert.
Nach Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 17 wurde das Rohprodukt als gelb-brauner
Feststoff
erhalten.
Die
Ergebnisse,
die
unter
Verwendung
verschiedener
Reaktionsbedingungen erzielt wurden, sind in Tabelle 8.24 zusammengefasst.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
Tabelle 8.24 Einfluss des Cofaktors NADP+ auf die Suzuki-Kupplung
Eintrag
NADP+ [mg]
Wässriges Medium
NaHCO3
Zeit [h]
Umsatz [%]
1
17
IPA /dest. Wasser
2.5 Äq
24
75
2
17
IPA /dest. Wasser
2.5 Äq
24
>95
3
17
IPA /dest. Wasser
2.5 Äq
24
>95
4
17
IPA /pH 7
2.5 Äq
24
>95
5
17
IPA /pH 7
2.5 Äq
24
83
216
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.15.3
5'
9'
10
8'
7
6
Einfluss von Rohextrakt der ADH aus L. kefir
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 17
O
3
(AAV 17). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
2
1
4
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus
8
9
81.7 mg
5
C14H12O
M = 196.24 g/mol
(0.973 mmol)
(0.389 mmol)
Natriumhydrogencarbonat,
4‘-Iodacetophenon
(4),
47.4 mg
95.7 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure (19) und 0.129 -1.438 ml Rohextrakt in 5.0 ml
entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben. Mit Hilfe von pHStäbchhen wurde der pH-Wert überprüft, da die Messung mittels pH-Elektrode nicht möglich
war. Bei pH<8 wurde solangeNatriumhydrogencarbonat zugegeben bis ~pH 8 erreicht war.
Nach 24-64 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit 2.5 M
Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Nach Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 17 wurde das
Rohprodukt als gelb-brauner Feststoff erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.25
zusammengefasst.
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
Tabelle 8.25 Zusammenfassung der Ergebnisse bzgl. des inhibierenden Einflusses von
Lk-ADH Rohextrakt
a)
Eintrag
Lk-ADH [ml] a)
NaHCO3 gesamt
Zeit [h]
1
0.129
81.7 mg
2
0.675
3
4
Umsatz [%]
4
5
29
6
64
~1
>95
-
-
163.4 mg
63
~1
90
<5
<5
1.438
196.1 mg
24
b)
b)
>95
b)
1.438
392.2 mg c)
64
8
46
25
21
Lk-ADH Charge 7
b)
enthält Spuren davon;
c)
später stellte sich heraus, dass 392.2 mg
Natriumhydrogencarbonat zwar in dest. Wasser, aber nicht in dest. Wasser/Isopropanol 1:1 (v/v)
löslich sind.
217
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.16 Allgemeine Arbeitsvorschrift 18 (AAV 18): Tandemreaktion mit NaHCO3 als
Base und gereinigter Lk-ADH
Abbildung 8.16 Tandemreaktion mit gereinigter Lk-ADH
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt (500 Umdrehungen pro Minute im
Schüttler). Nach 30 Minuten wird diese gemeinsam mit partiell gereinigter ADH aus L. kefir
(118 U/mmol bezogen auf das Substrat 5 bei pH 7 oder 97 mM NaHCO3-Lösung pH 8.3) und
18 mg (0.024 mmol) NADP+ zu einer parallel dazu angesetzten Suspension, bestehend aus
81.7 mg (0.973 mmol) Natriumhydrogencarbonat, 95.7 mg (0.389 mmol) 4‘-Iodacetophenon
(4) und 47.4 mg (0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und wenig Magnesiumchlorid (1 mM)
in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest. Wasser oder Phosphatpuffer
pH 7, gegeben. Nach 64-329 Stunden Rühren bei Raumtemperatur bei 400 rpm wird mit
2.5 M Essigsäure auf etwa pH 5 angesäuert. Anschließend wird dreimal mit je 10 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3
bestimmt.
Der
ee-Wert
wird
mittels
chiraler
HPLC
(Chiralpak®
IB
oder
AD-H,
Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt.
Synthese von (R)-1-(4-Biphenyl)ethanol ((R)-6) mittels Eintopf-Tandemreaktion
5'
9'
10
8'
9
7
6
4'
5
OH
3
2
4
8
(R)-6
C14H14O
M = 198.26 g/mol
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 18
(AAV 18). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg
1
(5 mol%) TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine
Suspension angesetzt. Diese wurde ebenso wie 59 - 118 U/mmol
gereinigte Lk-ADH (bezogen auf 4‘-Phenylacetophenon (5)) und
18 mg (0.024 mmol) NADP+ zu einer Suspension aus 81.7 mg
(0.973 mmol) Natriumhydrogencarbonat, 95.7 mg (0.389 mmol)
218
EXPERIMENTELLER TEIL
4‘-Iodacetophenon (4) und 47.4 mg (0.389 mmol) Phenylboronsäure (19) und wenig
Magnesiumchlorid (1 mM) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest.
Wasser oder Phosphatpuffer pH 7 gegeben. Nach 64-329 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur bei 400 Umdrehungen pro Minute wird mit 2.5 M Essigsäure auf etwa pH 5
angesäuert. Nach weiterer Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 18 wird das Rohprodukt als
hellgelber Feststoff erhalten. Die Ergebnisse, die unter Verwendung verschiedener
Enzymchargen erzielt wurden, sind in Tabelle 8.26zusammengefasst.
HPLC (Rohprodukt; Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(S) = 17.6 min
tR(R) = 19.1 min
Tabelle 8.26 Zusammenfassung der Ergebnisse der Tandemreaktion mit gereinigter Lk-ADH
Eintrag
Charge
Enzymmenge [ml]
Zeit [h]
1
9
2.3 a)
2
9
3
Umsatz [%]
6
ee-Wert (R)-6 [%]
4
5
29
64
1
3
78 19
>99
0.75 b)
64
-
23
34 43
>99
10
0.95 a)
69
-
3
62 35
>99
4
10
0.475 c)
64
-
12
42 47
>99
5
10
0.34 b)
64
-
17
27 56
>99
6 d)
10
0.34 b)
64
-
95
5
7 d) e)
10
0.34 b)
64
-
71
10 19
>99
8
10
0.95 a)
168
-
9
30 61
>99
9 d)
10
0.95 a)
168
-
13
23 64
>99
10
11
0.78 a)
64
-
13
42 45
>99
11
11
0.78 a)
168
-
6
28 66
>99
12 e)
11
0.78 a)
168
-
7
31 62
>99
13
11
0.78 a)
168
-
6
28 66
>99
14
11
0.78 a)
329
-
4
26 70
>99
-
-
219
EXPERIMENTELLER TEIL
a)
118 U/mmol bezogen auf 5 in NaHCO3 (aq);
c)
59 U/mmol bezogen auf 5 in NaHCO3 (aq);
e)
wässrige Phase Puffer pH 7 statt dest. Wasser
d)
b)
118 U/mmol bezogen auf 5 in Puffer pH 7;
5.4 mg Palladiumchlorid und 22.8 mg TPPTS;
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
8.2.2.17 Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 (AAV 19): Einfluss der Verdünnung auf die
Suzuki-Kreuzkupplung
Abbildung 8.17 Einfluss der Verdünnung auf die Suzuki-Kreuzkupplung
Zunächst wird aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%) TPPTS in 0.5 ml
entgastem dest. Wasser eine Suspension angesetzt. Nach 30 Minuten wird diese zu einer
parallel dazu angesetzten Suspension, bestehend aus 0.389 mmol Aryliodid 4 bzw. rac-29
47.4 mg
(0.389 mmol)
Phenylboronsäure
(19)
und
81.7 mg
(0.973 mmol)
Natriumhydrogencarbonat in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml entgastem dest.
Wasser gegeben, der zuvor noch 2.070 ml entgastes dest. Wasser und 230 µl 100 mM KpiPuffer pH 8 zugegeben wurden, um den Effekt der Verdünnung durch die große Menge an
gereinigter Lk-ADH zu untersuchen – das Enzym wird in 10 mM Kpi-Puffer pH 8 gelagert.
Nach 64 Stunden Rühren bei Raumtemperatur bei 400 Umdrehungen pro Minute wird das
Reaktionsgemisch angesäuert. Im Fall des Ketons 4 als Substrat erfolgt das Ansäuern mit
2.5 M Salzsäure auf pH 1. Bei Verwendung des Alkohols rac-29 wird das Reaktionsgemisch
mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Anschließend wird dreimal mit je 10 ml
Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im
Ölpumpenvakuum getrocknet. Der Umsatz wird mittels 1H-NMR-Spektroskopie in CDCl3
bestimmt.
220
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.17.1
5'
9'
10
8'
9
7
6
Synthese von 4‘-Phenylacetophenon (5)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 (AAV
O
4'
3
2
19). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%)
1
4
5
TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine Suspension
angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus 95.7 mg
8
(0.389 mmol)
5
C14H12O
M = 196.24 g/mol
4‘-Iodacetophenon
Phenylboronsäure
(19)
(4),
und
47.4 mg
81.7 mg
(0.389 mmol)
(0.973 mmol)
Natriumhydrogencarbonat in 5.0 ml entgastem Isopropanol und
4.5 ml entgastem dest. Wasser gegeben, der zuvor noch 2.070 ml entgastes dest. Wasser
und 230 µl 100 mM Kpi-Puffer pH 8 zugegeben wurden. Nach 64 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 1 angesäuert. Nach weiterer
Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 19 wurde das Rohprodukt als hellgelber Feststoff
erhalten.
Umsatz: >95%
Auswaage: 90% (68.9 mg; 0.351 mmol)
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit den in Abschnitt 8.2.2.1.1
angegebenen Daten und der Literatur [16,89] überein.
8.2.2.17.2
5'
9'
10
8'
9
7
6
Synthese von rac-1-(4-Biphenyl)ethanol (rac-6)
4'
5
OH
3
2
4
8
(R)-6
C14H14O
M = 198.26 g/mol
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 19 (AAV
19). Aus 2.7 mg (4 mol%) Palladiumchlorid und 11.4 mg (5 mol%)
1
TPPTS wurde in 0.5 ml entgastem dest. Wasser eine Suspension
angesetzt. Diese wurde zu einer Suspension aus 81.7 mg
(0.973 mmol) Natriumhydrogencarbonat, 96.5 mg (0.389 mmol)
rac-1-(4-Iodphenyl)ethanol (rac-29) und 47.4 mg (0.389 mmol)
Phenylboronsäure (19) in 5.0 ml entgastem Isopropanol und 4.5 ml
entgastem dest. Wasser gegeben, der zuvor noch 2.070 ml entgastes dest. Wasser und
230 µl 100 mM Kpi-Puffer pH 8 zugegeben wurden. Nach 64 Stunden Rühren bei
Raumtemperatur wurde mit 2.5 M Essigsäure auf pH 5 angesäuert. Nach weiterer
Aufarbeitung gemäß Arbeitsvorschrift 19 wurde das Rohprodukt als grauer Feststoff
erhalten.
221
EXPERIMENTELLER TEIL
Umsatz: 85%
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des in der Diplomarbeit [89] bereits
vollständig charakterisierten Racemats und der Literatur [16] überein.
8.2.2.18 Allgemeine Arbeitsvorschrift 20 (AAV 20): Mitsunobu-Reaktion
Abbildung 8.18 Umsetzung des Alkohols mit Phthalimid
In einem kleinen Schlenkrohr werden 39.2 mg (0.2 mmol) Alkohol 6, 44.1 mg (0.3 mmol)
Phthalimid und 78.8 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin in 2 ml absolutem THF gelöst. Dazu
wird eine Lösung aus 59.5 µl (0.3 mmol) Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) in 1 ml
absolutem THF zugetropft. Der Reaktionsverlauf wird mittels Dünnschichtchromatographie
(DC) beobachtet. Wenn kein Edukt mehr im DC nachzuweisen ist, wird das Lösungsmittel
entfernt. Der Umsatz wird mittels
1
H-NMR-Spektroskopie in CDCl3 bestimmt. Das
Rohprodukt wird säulenchromatographisch an unterschiedlichen stationären Phasen
gereinigt. Als Laufmittel wird Pentan/Dichlormethan 1:3 (v/v) bzw. Cyclohexan/Dichlormethan
1:3 (v/v) verwendet. Der ee-Wert wird mittels chiraler HPLC (Chiralpak® AD-H,
Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt.
222
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.18.1
Synthese von rac-2-(1-(4-Biphenyl)ethyl)isoindolin-1,3-dion (rac-28)
14'
13'
13
12'
O
5'
9'
10
8'
9
7
8
6
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 20
14
11'
3
12
N
2
11
(AAV 20). In 2 ml absolutem THF wurden 39.2 mg (0.2 mmol)
rac-1-(4-Biphenyl)ethanol
O
(rac-6),
44.1 mg
(0.3 mmol)
Phthalimid und 78.8 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin gelöst.
Dazu
wurde
eine
Lösung
aus
59.5 µl
(0.3 mmol)
1
Diisopropylazodicarboxylat in 1 ml absolutem THF zugetropft.
4
Der
rac-28
C22H17NO2
M = 327.38 g/mol
Reaktionsverlauf
wurde
mittels
Dünnschicht-
chromatographie beobachtet. Nach 24 Stunden wurde das
Lösungsmittel
am
Rotationsverdampfer
entfernt.
Nach
säulenchromatographischer Reinigung an Kieselgel wurde das gereinigte Produkt als weißer
Feststoff erhalten.
Der
ee-Wert
wurde mittels
chiraler
HPLC (Chiralpak®
AD-H,
Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm) bestimmt. Die Ergebnisse, die unter
Verwendung Variation der stationären Phase und des Eluenten erzielt wurden, sind in
Tabelle 8.27 zusammengefasst.
Enantiomerenüberschuss: 0%
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm)
tR = 32.3 min
tR = 34.3 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.95 (d, 3J = 7.36 Hz, 3H, H-C1), 5.60 (q,
3
J = 7.32 Hz, 1H, H-C2), 7.31 (t, 3J = 7.32 Hz, 1H, H-C10), 7.40 (t, 3J = 7.54 Hz, 2H, H-C9,
H-C9‘), 7.55 (m, 6H, H-C4, H-C4‘, H-C5, H-C5‘, H-C8, H-C8‘), 7.68 (d, 3J = 8.48 Hz, 2H,
H-C13, H-C13‘), 7.80 (d, 3J = 8.52 Hz, 2H, H-C14, H-C14‘).
13
C-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 17.5 (1C, C1), 49.3 (1C, C2), 123.2 (2C, C13,
C13‘), 127.1 (2C, C4, C4‘), 127.2 (2C, C5, C5‘), 127.3 (1C, C10), 127.9 (2C, C8, C8‘), 128.7
(2C, C9, C9‘), 132.0 (2C, C12, C12‘), 133.9 (2C, C14, C14‘), 139.3 (1C, C6), 140.6 (1C, C3),
140.7 (1C, C7), 168 (2C, C11, C11‘).
223
EXPERIMENTELLER TEIL
EA:
C
H
N
O
berechnet
80.71%
5.23%
4.28%
9.77%
bestimmt
79.94%
5.20%
4.21%
n.b.
Masse (EI): m/z = 327 [M+], 312 [M-CH3]+.
IR: ν̃ [cm-1] = 3059, 3029 (Aryl-H Valenzschwingungen); 2931 (CH3-Valenzschwingungen);
1774, 1697 (C=O Valenzschwingungen Imid-5-Ring); 1606 (C=C Valenzschwingungen der
Aromaten);
1484;
1463 (C-H Deformationsschwingung
der
CH3-Gruppe und des
Biarylsystems), 1380, 1331 (symmetrische C-H Deformationsschwingung der CH3-Gruppe
und des Phthalimids), 839 (C-H Deformationsschwingung 1,4-disubstituierter Aromat); 764,
734
(C-H
Deformationsschwingung
1,2-disubstituierter
Aromat);
710
(C-H
Deformationsschwingungen monosubstituierter Aromat).
Tabelle 8.27 Zusammenfassung der getesteten Reinigungsmethoden
Eintrag
Umsatz
Stationäre Phase
Lösungsmittel (v/v)
Isol. 6
Isol. 28
1
95%
Kieselgel
Pentan:DCM 1:3
44%
39%
2
92%
Kieselgel
56%
42%
3
>95%
Kieselgel ohne Sand
Pentan:DCM 1:3
24%
45%
4
>95%
Basisches AlOx
Hexan:DCM 1:3
n.b.
45%
5
n.b. a)
Cellulose
Hexan:DCM 1:3
a) n.b. nicht bestimmt
224
Pentan:DCM 1:3,
0.2% DEA
Keine Trennung
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.18.2
Synthese von (R)-2-(1-(4-Biphenyl)ethyl)isoindolin-1,3-dion ((R)-28)
14'
13'
13
12'
O
5'
9'
10
8'
9
7
8
6
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 20
14
11'
3
12
N
2
11
(AAV 20). In 2 ml THF abs. wurden 39.2 mg (0.2 mmol)
(S)-1-(4-Biphenyl)ethanol
O
((S)-6),
44.1 mg
(0.3 mmol)
Phthalimid und 78.8 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin gelöst.
Dazu wurde eine Lösung aus 59.5 µl (0.3 mmol) DIAD in 1 ml
1
4
(R)-28
C22H17NO2
M = 327.38 g/mol
THF
abs.
getropft.
Raumtemperatur
Nach
wurde
24
gemäß
Stunden
Rühren
bei
Arbeitsvorschrift
20
aufgearbeitet. Nach säulenchromatographischer Reinigung an
Kieselgel (Laufmittel: Pentan/Dichlormethan 1:3 (v/v)) wurde
das saubere Produkt als weißer Feststoff isoliert. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC
bestimmt (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm).
Umsatz: 93%
Ausbeute (gereinigtes Produkt):
48% (R)-28
28% rac-6
Enantiomerenüberschuss: 95%
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(R) = 24.0 min
tR(S) = 25.2 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.95 (d, 3J = 7.36 Hz, 3H, H-C1), 5.60 (q,
3
J = 7.32 Hz, 1H, H-C2), 7.31 (t,
3
J = 7.34 Hz, 1H, H-C10), 7.40 (dd,
3
J = 7.28 Hz,
3
J = 7.76 Hz, 2H, H-C9, H-C9‘), 7.55 (m, 6H, H-C4, H-C4‘, H-C5, H-C5‘, H-C8, H-C8‘), 7.68
(d, 3J = 8.48 Hz, 2H, H-C13, H-C13‘), 7.80 (d, 3J = 8.48 Hz, 2H, H-C14, H-C14‘).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des Racemats in Abschnitt 8.2.2.18.1
überein.
225
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.18.3
Synthese von (S)-2-(1-(4-Biphenyl)ethyl)isoindolin-1,3-dion ((S)-28)
14'
13'
13
12'
O
5'
9'
10
8'
9
7
8
6
4'
5
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 20
14
11'
3
12
N
2
11
(AAV 20). In 2 ml THF abs. wurden 39.2 mg (0.2 mmol)
(R)-1-(4-Biphenyl)ethanol
O
((R)-6),
44.1 mg
(0.3 mmol)
Phthalimid und 78.8 mg (0.3 mmol) Triphenylphosphin gelöst.
Dazu wurde eine Lösung aus 59.5 µl (0.3 mmol) DIAD in 1 ml
1
4
(S)-28
C22H17NO2
M = 327.38 g/mol
THF
abs.
getropft.
Raumtemperatur
Nach
wurde
24
gemäß
Stunden
Rühren
bei
Arbeitsvorschrift
20
aufgearbeitet. Nach säulenchromatographischer Reinigung an
Kieselgel (Laufmittel: Hexan/Dichlormethan 1:3 (v/v)) wurde das
saubere Produkt als weißer Feststoff isoliert. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC
bestimmt (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm).
Ausbeute (gereinigtes Produkt):
38% (S)-28
24% rac-6
Enantiomerenüberschuss (S)-28: 98%
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 97:3 (v/v), 0.8 ml/min, 238 nm):
tR(R) = 20.4 min
tR(S) = 23.8 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.95 (d, 3J = 7.36 Hz, 3H, H-C1), 5.60 (q,
3
J = 7.32 Hz, 1H, H-C2), 7.31 (t,
3
J = 7.32 Hz, 1H, H-C10), 7.40 (dd,
3
J = 7.80 Hz,
3
J = 7.28 Hz, 2H, H-C9, H-C9‘), 7.55 (m, 6H, H-C4, H-C4‘, H-C5, H-C5‘, H-C8, H-C8‘), 7.68
(d, 3J = 8.48 Hz, 2H, H-C13, H-C13‘), 7.80 (d, 3J = 8.52 Hz, 2H, H-C14, H-C14‘).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des Racemats in Abschnitt 8.2.2.18.1
überein.
226
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.2.19 Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 (AAV 21): Hydrazinolyse
Abbildung 8.19 Entschützen mit Hydrazin
Zunächst werden 19.2 mg (0.059 mmol) 28 in Ethanol gelöst. Nach Zugabe von 470 µl einer
1 M Lösung von Hydrazin in Toluol (0.47 mmol; 8 Äquivalente) oder Hydrazin-Hydrat wird die
Lösung unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Lösungsmittel am
Rotationsverdampfer entfernt.
Die Aufarbeitung kann auf verschiedene Wege erfolgen:
A) Wird zum Entschützen des Racemats eine 1 M Lösung von Hydrazin in Toluol verwendet,
so fällt beim Abkühlen bzw. beim Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer ein
weißer Feststoff aus (40). Dieser wird abfiltriert und die restliche Lösung wird bis zur
Trockene eingeengt. Anschließend wird das Produkt in Ether (MTBE) aufgenommen und mit
2.5 M Salzsäure extrahiert. Nach Einstellen des pH-Werts der wässrigen Phase mit 2 N
NaOH auf pH>12 wird diese dreimal mit Ether (MTBE) extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und das Produkt im Ölpumpenvakuum getrocknet.
B) Nach Beendigung der Reaktion (Entschützen des Racemats in 1 M Lösung von Hydrazin
in Toluol) wird das Lösungsmittel vollständig am Rotationsverdampfer entfernt. Das
Rohprodukt wird in Chloroform gelöst. Das Nebenprodukt 40 ist unlöslich in Chloroform und
wird abfiltriert. Das Lösungsmittel des Filtrats wird am Rotationsverdampfer entfernt und das
Produkt im Ölpumpenvakuum getrocknet.
C) Nach Beendigung der Reaktion (Entschützen mit Hydrazin-Hydrat) und Abkühlen auf
Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch fünfmal mit je 10 ml Dichlormethan extrahiert.
Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das
227
EXPERIMENTELLER TEIL
Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt. Die Reinheit der Verbindung wird mittels 1H-NMRSpektroskopie überprüft.
Der ee-Wert des gereinigten Produkts wird unabhängig von der Aufarbeitung mittels chiraler
HPLC bestimmt (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v) versetzt mit 0.1% DEA,
0.8 ml/min, 238 nm).
8.2.2.19.1
5'
9'
10
8'
9
7
6
Synthese von rac-1-(4-Biphenyl)ethylamin (rac-7)
4'
5
NH2
3
2
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 (AAV
21). In 5 ml Ethanol wurden 19.2 mg (0.059 mmol) rac-28 gelöst.
1
4
8
rac-7
C14H15N
M = 197.12 g/mol
Nach Zugabe von 470 µl einer 1 M Lösung von Hydrazin in Toluol
(0.47 mmol) wurde die Lösung unter Rückfluss erhitzt. Nach drei
Stunden erfolgte die Aufarbeitung analog der in Arbeitsvorschrift 21
beschriebenen Methode A oder B. Der ee-Wert wurde mittels
chiraler HPLC bestimmt (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5
(v/v) versetzt mit 0.1% DEA, 0.8 ml/min, 238 nm). Das Produkt wurde als weißer Feststoff
erhalten. Die Ergebnisse, die unter Variation der Aufarbeitung erzielt wurden, sind in Tabelle
8.28 zusammengefasst.
Enantiomerenüberschuss: 0%
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v) versetzt mit 0.1% DEA, 0.8 ml/min,
238 nm):
tR = 11.9 min
tR = 14.1 min
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.42 (d, 3J = 6.60 Hz, 3H, H-C1), 4.16 (q,
3
J = 6.59 Hz, 1H, H-C2), 7.32 (t, 3J = 7.34 Hz, 1H, H-C10), 7.42 (m, 4H, Har), 7.56 (m, 4H,
Har);
13
C-NMR (100 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 25.65 (1C, C1), 51.05 (1C, C2), 126.14 (2C, C4,
C4‘), 127.05 (2C, C5, C5‘), 127.13 (1C, C10), 127.24 (2C, C8, C8‘), 128.73 (2C, C9, C9‘),
139.81 (1C, C6), 140.96 (1C, C7), 146.80 (1C, C3).
228
EXPERIMENTELLER TEIL
Die spektroskopischen Daten (1H-NMR) stimmen mit denen der kommerziell erhältlichen
Referenzverbindung überein.
Tabelle 8.28 Zusammenfassung der getesteten Aufarbeitungsmethoden
a)
Eintrag
Ansatzgröße
Hydrazin
Aufarbeitung
Isoliert 28
Isoliert 40
1
0.059 mmol
1 M in Toluol
Methode A
59%
n.b. a)
2
0.059 mmol
1 M in Toluol
Methode B
86%
86%
nicht bestimmt
8.2.2.19.2
5'
9'
10
8'
9
7
6
Synthese von enantiomerenreinem (S)-1-(4-Biphenyl)ethylamin
4'
5
NH2
3
2
4
8
(S)-7
C14H15N
M = 197.12 g/mol
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 21 (AAV
21). In 2 ml Ethanol und 5 ml Hydrazin-Hydrat wurden 13.1 mg
1
(0.040 mmol) (S)-28 gelöst und für 16 Stunden bei 50°C gerührt.
Nach Abkühlen auf Raumtemperatur erfolgte die Aufarbeitung
analog der in Arbeitsvorschrift 21 beschriebenen Methode C. Die
Reinheit der Verbindung wurde mittels 1H-NMR-Spektroskopie in
CDCl3 überprüft. Beim Aufnehmen des weißen Feststoffs in CDCl3
blieb ein Teil des Feststoffs ungelöst. Dieser wurde abfiltriert. Im 1H-NMR wurde das Produkt
identifiziert. Dennoch konnte mittels HPLC kein ee-Wert bestimmt werden, da das Produkt zu
stark verunreinigt war. Nach Lösen in MTBE und Filtration konnte das saubere Produkt als
weißer Feststoff erhalten werden. Der ee-Wert wurde mittels chiraler HPLC bestimmt
(Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v) versetzt mit 0.1% DEA), 0.8 ml/min,
238 nm).
Ausbeute: 13% (1.0 mg; 0.005 mmol);
Enantiomerenüberschuss: 98%
HPLC (Chiralpak® AD-H, Hexan/Isopropanol 95:5 (v/v) versetzt mit 0.1% DEA):
tR = 13.8 min
tR = 16.3 min
229
EXPERIMENTELLER TEIL
1
H-NMR (400 MHz, CDCl3, RT): δ [ppm] = 1.42 (d, 3J = 6.64 Hz, 3H, H-C1), 4.16 (q,
3
J = 6.63 Hz, 1H, H-C2), 7.32 (t, 3J = 7.34 Hz, 1H, H-C10), 7.42 (m, 4H, Har), 7.56 (m, 4H,
Har).
Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen des Racemats und der kommerziell
erhältlichen Verbindung überein.
230
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3
Enzymatische Oxidation natürlicher Aminosäuren zu
α-Ketosäuren
8.2.3.1
Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 (AAV 22): Aktivitätsbestimmung der
Leucindehydrogenase aus Bacillus species
Abbildung 8.20 Photometertest zur Aktivitätsbestimmung der LeuDH
Zur Bestimmung der Aktivität der Leucindehydrogenase (LeuDH) aus Bacillus cereus bzw.
Bacillus stearothermophilus (Lyophilisat) wird zunächst eine 100 mM Lösung der
Aminosäure 8a und eine 20 mM NAD+-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8
hergestellt. Zur Untersuchung der LeuDH auf Produktinhibierung werden darüber hinaus
100 mM Lösungen an L-Valin (8a) hergestellt, die zusätzlich das Additiv 9a (Ketovalin
eingesetzt als Natriumsalz) in entsprechender Konzentration enthalten (10, 50 und 70 mM).
In eine Quarzküvette werden nacheinander 890 µl 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8, 50 µl
Aminosäure-Lösung und 50 µl NAD+-Lösung pipettiert und die Absorption bei einer
Wellenlänge von 340 nm gemessen. Dann werden 10 µl Enzym (in geeigneter Verdünnung)
zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml beträgt, und die Messung
gestartet. Bei Verwendung von lyophilisiertem Enzym wird eine bestimmte Menge Enzym
eingewogen und in Puffer gelöst zugegeben. Über einen Zeitraum von 10 Minuten wird alle
zwei Sekunden ein Messpunkt aufgenommen. Aus der Anfangssteigung wird dann mittels
folgender Formel die Aktivität der Leucindehydrogenase berechnet:
=
∆
340 nm
∙
∙
∙
∙ ∙
∆E340 nm/t: Anfangssteigung [1/min]
Vg: Gesamtvolumen [ml]
f: Verdünnungsfaktor
ε: Extinktionskoeffizient (6.3 ml/µmol·cm)
231
EXPERIMENTELLER TEIL
Vp: Probenvolumen [ml]
d: Schichtdicke der Küvette [cm]
Die volumetrische Aktivität [U/ml] kann, bei Kenntnis des Proteingehalts [mg/ml] der
Enzymcharge, in die spezifische Aktivität [U/mg] umgerechnet werden.
8.2.3.1.1
Die
Aktivitätsbestimmung der LeuDH aus Bacillus species
Aktivitätsbestimmung
der
Leucindehydrogenasen
erfolgte
analog
Allgemeine
Arbeitsvorschrift 22 (AAV 22). In eine Quarzküvette wurden nacheinander 890 µl 100 mM
Kaliumphosphatpuffer pH 8, 50 µl Aminosäure-Lösung und 50 µl NAD+-Lösung pipettiert und
die Absorption bei 340 nm gemessen. Dann wurden 10 µl Enzym zugegeben, so dass das
Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml betrug, und die Messung wurde gestartet. Messung und
Auswertung zur Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgten gemäß der Beschreibung in
Arbeitsvorschrift 22. Bei Kenntnis des Proteingehalts wurde die volumetrische Aktivität [U/ml]
in die spezifische Aktivität [U/mg] umgerechnet.
Tabelle 8.29 Aktivität der verschiedenen Chargen LeuDH
Eintrag
a)
a)
Charge
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Proteingehalt b)
Spezif. Aktivität
[1/min]
[U/ml]
[mg/ml]
[U/mg]
1
09/2010
0.1163 f)
18.5
-
-
2
Degussa c)
0.2458 f)
-
-
1.7 c)
3
01/2011 d)
0.2855 g)
50
23
2.2
4
02/2011 d)
0.2140 g
34
17
2.0
5
03/2011 e)
0.2437 f)
39
16
2.4
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.01 ml, d = 1 cm;
bestimmt;
c)
LeuDH aus B. stearothermophilus (Lyopilisat);
FZ Jülich mittels Hitzedenaturierung und Q-Sepharose;
e)
b)
der Proteingehalt wurde am FZ Jülich
d)
die Reinigung des Enzyms erfolgte am
die Reinigung des Enzyms erfolgte am FZ
f)
Jülich mittels Hitzedefällung, Q-Sepharose und Ultrafiltration; f = 10;
232
g)
f =11
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3.1.2
Lagerstabilität der LeuDH aus Bacillus cereus
Die Aktivitätsbestimmung der LeuDH aus Bacillus cereus, bei Erhalt der Enzymcharge und
nach einer bestimmten Lagerzeit, erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 22 (AAV 22).
In eine Quarzküvette wurden nacheinander 890 µl 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8, 50 µl
Aminosäure-Lösung und 50 µl NAD+-Lösung pipettiert und die Absorption bei einer
Wellenlänge von 340 nm gemessen. Dann wurden 10 µl Enzym (Charge 03/2011 in
geeigneter Verdünnung) zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml
betrug, und die Messung wurde gestartet. Über einen Zeitraum von 10 Minuten wurde alle
zwei Minuten ein Messpunkt aufgenommen. Aus der Anfangssteigung wurde dann die
volumetrische Aktivität der Leucindehydrogenase [U/ml] berechnet. Die Aktivität bei Erhalt
der Enzymcharge wurde auf 100% festgesetzt.
Tabelle 8.30 Lagerstabilität der LeuDH aus Bacillus cereus (Charge 03/2011)
Eintrag
Zeitpunkt der Messung [d]
Vol. Aktivität [U/ml]
Rel. Aktivität [%]
1
t=0
39
100
2
t = 42
33
85
8.2.3.1.3
Test der Leucindehydrogenase auf Produktinhibierung – mittels
Photometertest
Die
Aktivitätsbestimmung
der
Leucindehydrogenase
erfolgte
analog
Allgemeine
Arbeitsvorschrift 22 (AAV 22). Zur Bestimmung der Aktivität von Leucindehydrogenase
(LeuDH) aus Bacillus cereus in Anwesenheit unterschiedlicher Mengen der Katosäure 9a
(eingesetzt als Natrium-Salz), wurde zunächst eine 100 mM Lösung der Aminosäure und
eine 20 mM NAD+-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8 hergestellt. Des Weiteren
wurden jeweils 100 mM L-Valin-Lösungen hergestellt, die zusätzlich die Ketosäure 9a in
Konzentration von 10, 50 und 70 mM enthielten. In eine Quarzküvette wurden nacheinander
890 µl 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8, 50 µl der entsprechenden Aminosäure-Lösung
und 50 µl NAD+-Lösung pipettiert und die Absorption gemessen. Dann wurden 10 µl Enzym
(in geeigneter Verdünnung) zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml
betrug, und die Messung wurde gestartet. Über einen Zeitraum von 10 Minuten wurde alle
233
EXPERIMENTELLER TEIL
zwei Minuten ein Messpunkt aufgenommen. Aus der Anfangssteigung wurde dann die
Aktivität der Leucindehydrogenase [U/ml] berechnet. Die Aktivität wird dann angegeben als
relative Aktivität bezogen auf die Aktivität ohne Zusatz an Ketosäure 9a (relative Aktivität
100%).
Tabelle 8.31 Ergebnisse bzgl. einer Produktinhibierung der LeuDH
Eintrag
Konzentration an Ketovalin in der Küvette [mM]
Relative Aktivität [%]
1
0
100
2
0.5
89
3
2.5
65
4
3.5
48
8.2.3.2
Aktivitätsbestimmung der Glutamat-Dehydrogenasen für L-Valin
O
OH +
NAD+
NH2
O
GluDH
100 mM Kaliumphosphatpuffer
pH 8
8a
OH
+
NADH
O
9a
Abbildung 8.21 Photometertest zur Bestimmung der Aktivität der GluDHs für L-Valin (8a)
Zur Bestimmung der Aktivität von Glutamat-Dehydrogenase (GluDH) aus Clostridium difficile
bzw. aus Fusobacterium nucleatum wird zunächst eine 250 mM Lösung der Aminosäure (8a)
und eine 20 mM NAD+-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8 hergestellt. In eine
Quarzküvette (d = 1 cm) werden nacheinander 465 µl 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8,
400 µl Aminosäure-Lösung und 125 µl NAD+-Lösung pipettiert und die Absorption bei einer
Wellenlänge von 340 nm gemessen. Dann werden 10 µl Enzym zugegeben, so dass das
Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml beträgt, und die Messung wird gestartet. Aus der
Anfangssteigung wird dann mittels folgender Formel die Aktivität der GlutamatDehydrogenase berechnet:
=
234
∆
340 nm
∙
∙
∙ ∙
∙
EXPERIMENTELLER TEIL
∆E340 nm/t: Anfangssteigung [1/min]
Vg: Gesamtvolumen (1 ml)
f: Verdünnungsfaktor
ε: Extinktionskoeffizient (6.3 ml/µmol·cm)
Vp: Probenvolumen [ml]
d: Schichtdicke der Küvette [cm]
Tabelle 8.32 GluDH-Aktivität für L-Valin (8a)
Eintrag a)
GluDH
∆E340 nm/t [1/min]
Volumetrische Aktivität [U/ml]
1
C. difficile
0
0
2
F. nucleatum
0.0170
0.27
a)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.01 ml, d = 1 cm, f = 1
Ergebnis:
Die Glutamat-Dehydrogenase aus Clostridium difficile (Charge 02/2011) zeigte unter diesen
Bedingungen keine Aktivität für L-Valin. Die Glutamat-Dehydrogenase aus Fusobacterium
nucleatum (Charge 01/2011) hingegen zeigte eine volumetrische Aktivität von 0.27 U/ml.
Dieser Wert ist zwar sehr niedrig, aber es ist erstaunlich, dass die Glutamat-Dehydrogenase
aus Fusobacterium nucleatum überhaupt L-Valin (8a) als Substrat akzeptiert.
8.2.3.3
Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 (AAV 23): Aktivitätsbestimmung der
NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis
Abbildung 8.22 Aktivitätsbestimmung der NADH-Oxidase
Die Bestimmung der volumetrischen Aktivität [U/ml] der NADH-Oxidase (NOx) aus
Lactobacillus brevis erfolgt durch Beobachtung der Abnahme der NADH-Konzentration bei
einer Wellenlänge von 340 nm. Zunächst wird eine 20 mM NADH-Lösung in 100 mM
235
EXPERIMENTELLER TEIL
Kaliumphosphatpuffer pH 8 hergestellt. In einer Quarzküvette (d = 1 cm) werden 980 µl
Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 8) bzw. 980 µl einer Lösung des zu messenden Additivs
(L-Valin bzw. Ketovalin, eingesetzt als Natriumsalz) und 10 µl NADH-Lösung pipettiert und
die Absorption bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Dann werden 10 µl Enzym (in
geeigneter Verdünnung) zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml
beträgt, und die Messung wird gestartet. Über einen Zeitraum von 10 Minuten wird alle zwei
Sekunden ein Messpunkt aufgenommen. Aus der Anfangssteigung wird dann mittels
folgender Formel die volumetrische Aktivität der NADH-Oxidase, angegeben in U/ml,
berechnet:
=
∆
340 nm
∙
∙
∙
∙ ∙
∆E340nm/t: Anfangssteigung [1/min]
Vg: Gesamtvolumen (1 ml)
f: Verdünnungsfaktor
ε: Extinktionskoeffizient (6.3 ml/µmol·cm)
Vp: Probenvolumen [ml]
d: Schichtdicke der Küvette [cm]
Die volumetrische Aktivität [U/ml] kann, bei Kenntnis des Proteingehalts [mg/ml] der
Enzymcharge, in die spezifische Aktivität [U/mg] umgerechnet werden.
8.2.3.3.1
Aktivitätsbestimmung der NADH-Oxidase aus Lactobacillus brevis
Die Aktivitätsbestimmung bei Erhalt der Enzymchargen erfolgte analog Allgemeine
Arbeitsvorschrift
23
(AAV 23).
In
einer
Quarzküvette
(d = 1 cm)
wurden
980 µl
Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 8) und 10 µl NADH-Lösung (20 mM) pipettiert und die
Absorption bei 340 nm gemessen. Dann wurden 10 µl Enzym (in geeigneter Verdünnung)
zugegeben, so dass das Gesamtvolumen in der Küvette 1 ml betrug, und die Messung
wurde gestartet. Messung und Auswertung erfolgten gemäß der in AAV 23 beschriebenen
Methhode. Bei Kenntnis des Proteingehalts wurde die volumetrische Aktivität [U/ml] in die
spezifische
Aktivität
zusammengefasst.
236
[U/mg]
umgerechnet.
Die
Ergebnisse
sind
in
Tabelle
8.33
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.33 volumetrische Aktivitäten der verwendeten Enzymchargen der NADH-Oxidase
Eintrag a)
Charge
1
a)
∆E340 nm/t
Vol. Aktivität
Proteingehalt
Spezif. Aktivität
[U/mg]
[1/min]
[U/ml]
09/2010 b)
0.5963
95
-
-
2
10/2010 b)
0.5409
86
26.4
3.3
3
02/2011 c)
- d)
149 d)
13.0
11.5
4
03/2011 c)
- d)
225 d)
5.0
45.0
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm);
Ultrafiltration;
8.2.3.3.2
d)
b)
c)
f = 10;
gemessen von Tenbrink [162];
e)
[mg/ml]
e)
Reinigung der NOx mittels Q-Sepharose und
bestimmt am FZ Jülich
Lagerstabilität der NADH-Oxidase
Die Aktivitätsbestimmung bei Erhalt der Enzymchargen und nach einer bestimmten Lagerzeit
erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 23 (AAV 23). In einer Quarzküvette (d = 1 cm)
wurden dann 980 µl Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH 8) und 10 µl NADH-Lösung (20 mM)
pipettiert und die Absorption gemessen. Schließlich wurden 10 µl Enzym (in geeigneter
Verdünnung) zugegeben und die Messung wurde gestartet. Messung und Auswertung
erfolgten gemäß der in AAV 23 beschriebenen Methhode. Die bestimmte Aktivität wird dann
angegeben als relative Aktivität, bezogen auf die Aktivität, die bei Erhalt der Enzymcharge
(t = 0) gemessen wurde (relative Aktivität 100%).
Tabelle 8.34 Lagerstabilität der NADH-Oxidase
Eintrag
Charge
1
Zeitpunkt der
Volumetrische
Relative
Messung
Aktivität [U/ml]
Aktivität [%]
t=0
95
100
t = 90 d
22
23
t=0
225 c)
100
t = 57 d
147
65
09/2010 a)
2
3
03/2011
4
b)
Vg = 1 ml, ε = 6.3 ml/(µmol·cm), Vp = 0.01 ml, d = 1 cm;
Q-Sepharose und Ultrafiltration am FZ Jülich;
c)
a)
Rohextrakt;
b)
NOx gereinigt mittels
gemessen von Tenbrink [162]
237
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3.3.3
Untersuchungen zur Inhibierung
Die Untersuchung der NADH-Oxidase auf Inhibierung durch L-Valin (8a) bzw. Ketovalin
(eingesetzt als Natriumsalz) mittels Photometer erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift
23 (AAV 23). Die Aktivität der NOx ohne Zusatz eines Additivs wird auf 100% festgesetzt.
Die angegebenen relativen Aktivitäten beziehen sich auf die Aktivität der NOx in Gegenwart
der verschiedenen Additive. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.35 zusammengefasst.
Tabelle 8.35 Zusammenstellung der Ergebnisse bzgl. Inhibierung der NOx
Eintrag
Additiv
Konzentration [mM]
Relative Aktivität [%]
1
L-Valin
(8a)
0
100
2
L-Valin
(8a)
10
103
3
L-Valin
(8a)
25
117
4
L-Valin
(8a)
50
100
5
L-Valin
(8a)
75
78
6
L-Valin
(8a)
100
72
7
Ketovalin (9a)
0
100
8
Ketovalin (9a)
10
145
9
Ketovalin (9a)
25
119
10
Ketovalin (9a)
50
91
8.2.3.4
Allgemeine Arbeitsvorschrift 24 (AAV 24): Umsatzbestimmung mittels
1
H-NMR-Spektroskopie
Es werden zunächst jeweils 25 - 250 mM Lösungen (Umsatzbestimmung von L-Valin (8a))
bzw. 50 mM Lösungen (Umsatzbestimmung von L-Phenylalanin (8d)) der Aminosäure und
der entsprechenden Ketosäure 9a bzw. 9d) in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8
hergestellt. Für die Messungen werden Mischungen der beiden Verbindungen im Verhältnis
1:1, 2:1 und 1:2 hergestellt, so dass das Probenvolumen 300 µl beträgt. Anschließend wird
238
EXPERIMENTELLER TEIL
mit 350 µl D2O aufgefüllt und die Probe mittels 1H-NMR-Spektroskopie analysiert. Zur
Umsatzbestimmung werden die Integrale der CH3-Gruppen herangezogen (siehe auch
Abschnitt 5.4.3).
8.2.3.4.1
Umsatzbestimmung für Umsetzungen von L-Phenylalanin
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 24 (AAV 24). Auf Grund der
schlechten Löslichkeit, vor allem der Ketosäure, wurden hier 50 mM Lösungen von
L-Phenylalanin
(8d) und der α-Ketosäure 9d in 100 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8
hergestellt. Für die Messungen wurden Mischungen der beiden Verbindungen im Verhältnis
1:1, 2:1 und 1:2 hergestellt (insgesamt 300 µl Probenvolumen) und mit 350 µl D2O aufgefüllt.
Anschließend erfolgte die Analyse der Zusammensetzung mittels 1H-NMR-Spektroskopie:
Eintrag
eingesetztes Verhältnis
bestimmtes Verhältnis
Phenylbrenztraubensäure : Phenylalanin Phenylbrenztraubensäure : Phenylalanin
1
1:1
1:3
2
1:2
1:5
3
2:1
2:3
Ergebnis:
Die bestimmten Verhältnisse stimmten nicht mit den angesetzten Verhältnissen überein. Das
Singulett der Phenylbrenztraubensäure (4.10 ppm) liegt bereits zu stark im Drift des breiten
Wasser-Signals. Mittels 1H-NMR-Spektroskopie kann somit nur eine qualitative aber keine
quantitative Aussage darüber gemacht werden, ob Produkt gebildet wurde (Singulett der
Ketosäure 9d bei 4.10 ppm).
8.2.3.4.2
Umsatzbestimmung für die Umsetzungen von L-Valin
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 24 (AAV 24). Es wurden
zunächst jeweils 25 - 250 mM Lösungen von L-Valin (8a) und der Ketosäure (9a) in 100 mM
Kaliumphosphatpuffer pH 8 hergestellt. Für die Messungen wurden Mischungen der beiden
239
EXPERIMENTELLER TEIL
Verbindungen im Verhältnis 1:1, 2:1 und 1:2 hergestellt, so dass das Probenvolumen 300 µl
beträgt. Anschließend wurde mit 350 µl D2O aufgefüllt und die Probe mittels 1H-NMRSpektroskopie analysiert. Die Umsatzbestimmung erfolgte über die Integrale der CH3Gruppen (dd bei 1.0 ppm von L-Valin (8a) und d bei 1.1 ppm von Ketovalin (9a)):
Konzentration
eingesetztes Verhältnis
bestimmtes Verhältnis
Stammlösung [mM]
Ketovalin : Valin
Ketovalin : Valin
1
250
1:1
1:1.2
2
250
1:2
1:2.4
3
250
2:1
2:1.2
4
25
1:1
1:1
Eintrag
Ergebnis und Fehleranalyse:
Die Ergebnisse stimmten anfangs nicht exakt. Dies ist vermutlich auf Fehler beim Ansetzen
der Proben zurückführen (Einwaage kleinster Substratmengen, kein Maßkolben). Dennoch
ist ein positiver Trend erkennbar: die Verhältnisse der 1:2-und der 2:1-Mischung spiegeln
das Verhältnis der 1:1 Mischung wieder. Dies spricht dafür, dass der Fehler bei den Proben
liegt und nicht bei der Methode. Darüber hinaus liegt eine Fehlerquelle bei der
Umsatzbestimmung mittels 1H-NMRSpektroskopie bei ca. 5%.
8.2.3.5
Umsatzbestimmung für die Umsetzungen von L-Valin in Gegenwart von
Fe-TSPP (10)
Das in Abbildung 8.23 dargestellte 1H-NMR-Spektrum entspricht einem Ansatz unter
Verwendung von 0.5 mg/ml Fe-TSPP (10). Die Basislinie im ausgewählten und für die
Umsatzbestimmung relevanten Bereich ist gerade. Sowohl die Signale der CH3-Gruppe der
Ketosäure als auch die Signale der CH3-Gruppen der Aminosäure sind scharf und somit gut
integrierbar. Damit ist eine genaue Umsatzbestimmung möglich.
Das in Abbildung 8.24 dargestellte 1H-NMR-Spektrum entspricht einem Ansatz unter
Verwendung von 2.6 mg/ml Fe-TSPP (10). Die Baseline weist starke Schwankungen auf. Die
Signale der CH3-Gruppe der Ketosäure als auch die Signale der CH3-Gruppen der
240
EXPERIMENTELLER TEIL
Aminosäure sind deutlich breiter als bei vergleichbaren Ansätzen mit nur 2.6 mg Fe-TSPP
10. Dadurch, dass die Signale breiter sind und sie sich überlappen wird die
Umsatzbestimmung entsprechend schwieriger und somit ungenauer.
Abbildung 8.23 1H-NMR-Spektrum bei Verwendung von 0.5 mg/ml Fe-TSPP
Abbildung 8.24 1H-NMR-Spektrum bei Verwendung von 2.6 mg/ml Fe-TSPP
241
EXPERIMENTELLER TEIL
Aufgrund der paramegnetischen Eigenschaften des Eisen(III)-Porphyrins 10 werden im
1
H-NMR-Spektrum die Signale von Edukt 8a und Produkt 9a in Gegenwart von 2.6 mg/ml
breiter und somit die Umsatzbestimmung ungenauer.
8.2.3.6
Allgemeine Arbeitsvorschrift 25 (AAV 25): Oxidation von L-Valin (8a) unter
Verwendung von NADH-Oxidase zur Cofaktorregenerierung im Maßstab
von 1.5 ml
Abbildung 8.25 Enzymatische Oxidation von L-Valin (im Maßstab 1.5 ml)
Die Durchführung der Ansätze erfolgt in einem Gesamtvolumen von 1.5 ml im
Eppendorfgefäß. Zunächst wird L-Valin (8a) so eingewogen, dass die Konzentration im
Reaktionsgefäß 25-100 mM beträgt und in der berechneten Menge 100 mM Kpi-Puffer pH 8
im Ultraschallbad gelöst. Dann werden die Aminosäuredehydrogenase und die NADHOxidase hinzugefügt. Zuletzt wird die NAD+-Stammlösung zupipettiert. Nach 24 Stunden im
Thermoschüttler bei 25° und 550 rpm werden die Ansätze bei 4°C in der Zentrifuge mit
14000 rpm über eine Ultrafiltrationsmembran (MWCO 10 kDa) filtriert. Anschließend wird
mittels 1H-NMR-Spektroskopie der Umsatz bestimmt. Dafür werden 300 µl Probe mit 350 µl
D2O versetzt.
Synthese von 3-Methyl-2-oxobutansäure (9a)
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 25 (AAV 25).
Es
wurden 4.4 mg
Kaliumphosphatpuffer
(0.038 mmol)
gelöst.
L-Valin
Dann
in 1.151 ml 100 mM
wurden
100 µl
Leucin-
dehydrogenase (5 U; Charge 01/2011), 234 µl NADH-Oxidase (25 U;
Charge 10/2010) und 15 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung
242
EXPERIMENTELLER TEIL
zupipettiert. Nach 24 Stunden im Thermoschüttler wurde die Reaktion analog AAV 25
abgebrochen und der Umsatz bestimmt.
Umsatz: 18%
1
H-NMR (400 MHz, D2O, RT): δ [ppm] = 1.09 (d, J = 7.04 Hz, 6H, H-C4, H-C4‘), 3.00 (m, 1H,
H-C3). Die spektroskopischen Daten stimmen mit denen der kommerziell erhältlichen
Verbindung überein.
8.2.3.7
Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV 26): Oxidation von L-Valin (8a) unter
Verwendung von NADH-Oxidase zur Cofaktorregenerierung im Maßstab
5 ml
Abbildung 8.26 Enzymatische Oxidation von L-Valin (8a) im Maßstab von 5 ml
Die Durchführung der Ansätze erfolgt in einem 10 ml Rundkolben bei definierter
Rührgeschwindigkeit (400 bzw. 1000 rpm). Zunächst werden 14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin
eingewogen und in der berechneten Menge 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst (Ultraschallbad!).
Die Endkonzentration im Reaktionsgefäß beträgt 25 mM. Gegebenenfalls wird nun FAD als
Lösung in 100 mM Kpi-Puffer pH 8 zugegeben. Dann werden Leucindehydrogenase und
NADH-Oxidase hinzugefügt. Zuletzt wird der Cofaktor als 100 mM NAD+-Stammlösung
(angesetzt in 100 mM Kpi-Puffer) zupipettiert. Das Gesamtvolumen beträgt 5 ml. Während
der Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur und definierter Rührgeschwindigkeit
wird in regelmäßigen Abständen (nach 0.5, 1, 2, 3, 4, 8 und 24 Stunden) mittels 1H-NMRSpektroskopie der Umsatz bestimmt. Dafür werden je 300 µl Probe mit 350 µl D2O versetzt
und die Probe wird sofort gemessen.
243
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3.7.1
4'
4
3
Benchmark-Reaktion im Maßstab 5 ml
Die Synthese erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV 26)
O
2
1
bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
(0.125 mmol) L-Valin (8a) in 3.836 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst.
O
9a
C5H8O3
M = 116.12 g/mol
Dann wurden 334 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge 01/2011),
780 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 10/2010) und 50 µl einer
100 mM NAD+-Stammlösung zupipettiert. Während der Reaktionszeit
von 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde gemäß Arbeitsvorschrift 26 in regelmäßigen
Abständen Proben genommen und der Umsatz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
8.36 zusammengefasst:
Tabelle 8.36 Kinetikdaten der Benchmarkreaktion
Umsatz [%] nach
Eintrag
1
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
18
27
43
54
59
66
69
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.7.2
4'
4
3
Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit der Benchmarkreaktion
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV
O
2
1
26) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
(0.125 mmol) L-Valin in 3.836 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst. Dann
wurden 334 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge 01/2011), 780 µl
NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 10/ 2010) und 50 µl einer 100 mM
NAD+-Stammlösung zupipettiert. Während einer Reaktionszeit von 24 Stunden bei
Raumtemperatur wurde wurde gemäß Arbeitsvorschrift 26 in regelmäßigen Abständen
Proben genommen und der Umsatz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.37
zusammengestellt:
244
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.37 Kinetikdaten bzgl. Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit
Umsatz [%] nach
Eintrag
a)
LeuDH
NOx
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
01/2011
10/2010
18
27
43
54
59
66
69
2
01/2011
10/2010
15
24
42
51
57
66
69
3
02/2011
02/2011
23
32
60
69
75
86
93
4
03/2011
03/2011
21
33
56
65
70
78
83
5
03/2011 a)
03/2011 a)
20
31
56
70
75
84
88
Enzym-Mengen wurde auf die aktuelle Aktivität angepasst
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.7.3
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV
4'
4
3
Einfluss der Rührgeschwindigkeit
O
2
1
26) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 bzw. 1000 rpm. Es wurden
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) in 3.950 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
gelöst. Dann wurden 491 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge
02/1011), 559 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 02/2011) und 50 µl
einer 100 mM NAD+-Stammlösung zupipettiert. Während der Reaktionszeit von 24 Stunden
bei Raumtemperatur wurde wurde gemäß Arbeitsvorschrift 26 in regelmäßigen Abständen
Proben genommen und der Umsatz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.38
zusammengefasst:
Tabelle 8.38 Kinetikdaten zum Einfluss der Rührgeschwindigkeit
Umsatz [%] nach
Eintrag
Rührgeschwindigkeit
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
400 rpm
23
32
60
69
75
86
93
2
1000 rpm
25
44
62
69
74
84
93
245
EXPERIMENTELLER TEIL
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.7.4
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV
4'
4
Einfluss der FAD-Konzentration
O
2
3
1
26) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
(0.125 mmol) L-Valin in 3.998 - 4.128 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst.
Nun wurden gegebenenfalls 20 - 150 µl einer 2.5 mM FAD-Lösung
zupipettiert. Dann wurden 432 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge
03/2011), 370 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 03/2011) und 50 µl einer 100 mM NAD+Stammlösung zupipettiert. Während der Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur
wurde wurde gemäß Arbeitsvorschrift 26 in regelmäßigen Abständen Proben genommen und
der Umsatz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.39 zusammengefasst:
Tabelle 8.39 Kinetikdaten bzgl. FAD-Variation im Ansatz
Umsatz [%] nach
Eintrag
FAD [µM]
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
0
21
33
56
65
70
78
83
2
10
18
29
55
64
70
78
84
3
75
18
30
50
60
65
74
79
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.8
Variation der NOx-Menge
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV
4'
4
3
O
2
1
26) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
246
(0.125 mmol) L-Valin (8a) in 3.595 - 3.878 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
EXPERIMENTELLER TEIL
gelöst. Dann wurden 505 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge 03/2011 - angepasste
Enzymmenge, nachdem das Enzym durch Lagerung an Aktivität verloren hatte), 567 –
850 µl NADH-Oxidase (250/3 – 250/2 U; Charge 03/2011 - angepasste Enzymmenge,
nachdem das Enzym durch Lagerung an Aktivität verloren hatte) und 50 µl einer 100 mM
NAD+-Stammlösung zupipettiert. Während der Reaktionszeit von 24 Stunden bei
Raumtemperatur wurden gemäß Arbeitsvorschrift 26 in regelmäßigen Abständen Proben
genommen und der Umsatz bestimmt. Die Ergebnisse sind Tabelle 8.40 zusammengefasst:
Tabelle 8.40 Kinetikdaten bzgl. Variation der NOx-Menge im präparativen Ansatz
LeuDH
NOx
Umsatz [%] nach
Eintrag
[U]
[µl]
[U]
[µl]
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
16.7
505
83.3
567
20
31
56
70
75
84
88
2
16.7
505
125
850
24
38
64
74
83
94
94
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.9
Einfluss der Cofaktorkonzentration
4'
4
3
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 26 (AAV
O
2
1
26) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
(0.125 mmol) L-Valin (8a) in 3.395 - 3.635 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
gelöst. Dann wurden 505 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge vom
03/2011 - angepasste Enzymmenge, nachdem das Enzym durch
Lagerung an Aktivität verloren hatte), 850 µl NADH-Oxidase (125 U; Charge 03/2011 angepasste Enzymmenge, nachdem das Enzym durch Lagerung an Aktivität verloren hatte)
und 10 - 250 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung zupipettiert. Während der Reaktionszeit
von 24 Stunden bei Raumtemperatur wurden gemäß Arbeitsvorschrift 26 in regelmäßigen
Abständen Proben genommen und der Umsatz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle
8.41 zusammengestellt:
247
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.41 Kinetikdaten bzgl. Einfluss der Cofaktorkonzentration im Ansatz
Umsatz [%] nach
Eintrag
NAD+-Konzentration
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
0.2 mM
20
31
53
62
67
78
80
2
0.5 mM
22
33
63
-
77
87
91
3
1 mM
24
38
64
74
83
94
94
4
2.5 mM
18
31
55
67
76
89
94
5
5 mM
21
34
60
72
79
90
95
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.10 Allgemeine Arbeitsvorschrift 27 (AAV 27): Einfluss verschiedener
Komponenten (Nachdosieren)
Abbildung 8.27 Einfluss verschiedener Komponenten auf das Reaktionssystem
(Nachdosieren)
Die
Durchführung
der
Ansätze
erfolgt
in
einem
10 ml
Rundkolben
bei
einer
Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Zunächst werden 14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a)
eingewogen und in der berechneten Menge 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst (Ultraschallbad).
Die End-Konzentration im Reaktionsgefäß beträgt 25 mM. Dann werden 50/3 U (16.7 U)
Leucindehydrogenase und 250/3 U (83.3 U) NADH-Oxidase hinzugefügt. Zuletzt werden
248
EXPERIMENTELLER TEIL
50 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung (angesetzt in 100 mM Kpi-Puffer) zupipettiert. Das
Gesamtvolumen beträgt 5 ml. Nach vier Stunden wird erneut die zu untersuchende
Komponente zugegeben (50/3 U Leucindehydrogenase, 250/3 U NADH-Oxidase oder 50 µl
einer 100 mM NAD+-Stammlösung). Während einer Reaktionszeit von 24 Stunden bei
Raumtemperatur wird in regelmäßigen Abständen (nach 0.5, 1, 2, 3, 4, 8 und 24 Stunden)
mittels
1
H-NMR-Spektroskopie der Umsatz bestimmt. Dafür werden je 300 µl Probe
entnommen, mit 350 µl D2O versetzt und sofort gemessen.
8.2.3.10.1
4'
4
3
Einfluss von Leucindehydrogenase
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 27
O
2
1
(AAV 27) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden
OH
O
9a
C5H8O3
M = 116.12 g/mol
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) in 4.148 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
gelöst. Dann wurden 432 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge
03/2011), 370 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 03/2011) und 50 µl
einer 100 mM NAD+-Stammlösung zupipettiert. Gegebenenfalls wurde
nach vier Stunden erneut 432 µl Leucindehydrogenase zugegeben. Reaktionsverfolgung und
Umsatzbestimmung erfolgten gemäß Arbeitsvorschrift 27. Die Ergebnisse sind in Tabelle
8.42 zusammengefasst:
Tabelle 8.42 Kinetikdaten bzgl. Einfluss von LeuDH (nachdosiert)
Umsatz [%] nach
Eintrag
LeuDH [µl]
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
432
21
33
56
65
70
78
83
2
432 + 432
21
31
55
64
69
79
84
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
249
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3.10.2
4'
4
3
Einfluss von NADH-Oxidase
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 27
O
2
1
(AAV 27) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) in 3.836 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
gelöst. Dann wurden 334 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge
01/2011), 780 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 10/2010) und 50 µl
+
einer 100 mM NAD -Stammlösung zupipettiert. Gegebenenfalls wurde nach vier Stunden
erneut 780 µl NADH-Oxidase zugegeben. Reaktionsverfolgung und Umsatzbestimmung
erfolgten
gemäß
Arbeitsvorschrift
27.
Die
Ergebnisse
sind
in
Tabelle
8.43
zusammengefasst:
Tabelle 8.43 Kinetikdaten bzgl. Einfluss der NOx-Menge (nachdosiert)
Umsatz [%] nach
Eintrag
NOx [µl]
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
780
18
27
43
54
59
66
69
2
780 + 780
15
26
47
55
59
69
65
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.10.3
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 27
4'
4
Einfluss von Cofaktor
O
2
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
3
1
(AAV 27) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) in 4.148 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
gelöst. Dann wurden 432 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge
03/2011), 370 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 03/2011) und 50 µl
+
einer 100 mM NAD -Stammlösung zupipettiert. Gegebenenfalls wurde nach vier Stunden
erneut 50 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung zupipettiert. Reaktionsverfolgung und
Umsatzbestimmung erfolgten gemäß Arbeitsvorschrift 27. Die Ergebnisse sind in Tabelle
8.44 zusammengestellt:
250
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.44 Kinetikdaten bzgl. Einfluss des Cofaktors NAD+ (nachdosiert)
Umsatz [%] nach
Eintrag
a)
100 mM NAD+-Lösung [µl]
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
50
21
33
56
65
70
78
83
2
50 + 50
- a)
- a)
- a)
- a)
68
81
88
nicht bestimmt
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.11 Allgemeine Arbeitsvorschrift 28 (AAV 28): Untersuchung des
Reaktionssystems auf Produktinhibierung
Abbildung 8.28 Untersuchung des Reaktionssystems auf Produktinhibierung
Die
Durchführung
der
Ansätze
erfolgt
in
einem
10 ml
Rundkolben
bei
einer
Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Zunächst werden 14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin und die
entsprechende Menge an Natrium-3-Methyl-2-oxobutansäure (0 - 0.25 mmol) eingewogen
und in der berechneten Menge 100 mM Kpi-Puffer pH 8 im Ultraschallbad gelöst, so dass die
Endkonzentration der Aminosäure, bei einem Gesamtvolumen von 5 ml, 25 mM beträgt.
Dann werden 50/3 U (16.7 U) Leucindehydrogenase und 250/3 U (83.3 U) NADH-Oxidase
hinzugefügt. Zuletzt werden 50 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung, angesetzt in 100 mM
Kpi-Puffer, zupipettiert. Während der Reaktionszeit von 24 Stunden bei Raumtemperatur
wird in regelmäßigen Abständen (nach 0.5, 1, 2, 3, 4, 8 und 24 Stunden) mittels 1H-NMR-
251
EXPERIMENTELLER TEIL
Spektroskopie der Umsatz bestimmt. Dafür werden je 300 µl Probe entnommen, mit 350 µl
D2O versetzt und sofort gemessen.
Synthese von 3-Methyl-2-oxobutansäure (9a)
4'
4
3
Die Durchführung erfolgte analog allgemeiner Arbeitsvorschrift 28
O
2
1
(AAV 28) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) und 0 – 34.5 mg (0 - 0.250 mmol)
Natrium-3-Methyl-2-oxobutansäure in 3.950 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8
gelöst. Dann wurden 491 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge
02/2011), 559 µl NADH-Oxidase (250/3 U; Charge 02/2011) und 50 µl einer 100 mM NAD+Stammlösung zupipettiert. Reaktionsverfolgung und Umsatzbestimmung erfolgten gemäß
Arbeitsvorschrift 28. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.45 zusammengefasst:
Tabelle 8.45 Kinetikdaten bzgl. Einfluss von Ketovalin im präparativen Ansatz
Umsatz [%] nach
Eintrag
Ketovalin [mM]
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
0
23
32
60
69
75
86
93
2
2.5
21
31
53
64
71
83
92
3
25
13
22
30
44
49
61
77
4
50
13
23
32
36
42
53
66
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
252
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3.12 Allgemeine Arbeitsvorschrift 29 (AAV 29): Oxidation von L-Valin (8a) unter
Verwendung von Fe-TSPP (10) zur Cofaktorregenerierung
Abbildung 8.29 Oxidation von L-Valin unter biomimetischer Cofaktorregenerierung mittels
Fe-TSPP (10)
Die Durchführung der Ansätze erfolgt in einem Gesamtvolumen von 5 ml in einem 10 ml
Rundkolben bei definierter Rührgeschwindigkeit (400 bzw. 1000 rpm). Zunächst werden
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) eingewogen und in 100 mM Kpi-Puffer pH 8 oder
Glycin/NaOH-Puffer pH 10.5 im Ultraschallbad gelöst. Die Konzentration an L-Valin im
Reaktionsgefäß beträgt für jeden Ansatz 25 mM. Dann werden 50/3 U (16.7 U)
Leucindehydrogenase und Fe-TSPP (10) zur Cofaktorregenerierung hinzugefügt. Zuletzt
werden 50 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung (angesetzt in 100 mM Kpi-Puffer)
zupipettiert. Das Gesamtvolumen beträgt 5 ml. Während der Reaktionslaufzeit von mehreren
Tagen bei Raumtemperatur werden in regelmäßigen Abständen Proben entnommen und
mittels
1
H-NMR-Spektroskopie der Umsatz bestimmt. Dafür werden je 300 µl Probe
entnommen, mit 350 µl D2O versetzt und sofort vermessen.
8.2.3.12.1
4'
4
3
Benchmarkreaktion zur Synthese von 3-Methyl-2-oxobutansäure (9a)
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 29 (AAV
O
2
1
29) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
(0.125 mmol) L-Valin (8a) eingewogen und in 4.459 ml 100 mM KpiPuffer
pH 8
im
Ultraschallbad
Leucindehydrogenase
Fe-TSPP(0.025 mmol)
und
50 µl
einer
(50/3 U;
100 mM
gelöst.
Charge
Dann
wurden
02/2011),
NAD+-Stammlösung
491 µl
2.6 mg
zupipettiert.
Reaktionsverfolgung und Umsatzbestimmung erfolgten gemäß Arbeitsvorschrift 29. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 8.46 zusammengestellt:
253
EXPERIMENTELLER TEIL
Tabelle 8.46 Kinetikdaten der Benchmarkreaktion (Fe-TSPP zur Cofaktorregenerierung)
Umsatz [%] nach
Eintrag
1
1d
2d
6d
8d
39
48
68
72
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.12.2
Einfluss von Rührgeschwindigkeit und Eisenporphyrinmenge auf den
Reaktionsverlauf
4'
4
3
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 29 (AAV
O
2
1
29) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg
OH
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
(0.125 mmol) L-Valin (8a) in 4.459 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst.
Dann wurden 491 µl Leucindehydrogenase (50/3 U; Charge 02/2011),
2.6 - 13.2 mg
Fe-TSPP
(10)
und
50 µl
einer
100 mM
NAD+-
Stammlösung hinzugefügt. Reaktionsverfolgung und Umsatzbestimmung erfolgten gemäß
Arbeitsvorschrift 29. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8.47 zusammengefasst:
Tabelle 8.47 Einfluss der Eisenporphyrin-Menge auf den Reaktionsverlauf
Fe-TSPP
Rührgeschwindigkeit
Umsatz [%] nach
[mg]
[rpm]
1d
2d
4d
6d
8d
9d
1
2.6
400
39
48
- a)
68
72
- a)
2
13.2
400
38
52
69
70
- a)
- a)
3
2.6
1000
32
42
53
- a)
- a)
69
4
13.2
1000
41
55
62
- a)
69
- a)
Eintrag
a)
nicht bestimmt
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
254
EXPERIMENTELLER TEIL
8.2.3.12.3
4'
4
3
Einfluss des pH-Werts auf den Reaktionsverlauf
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 29 (AAV
O
2
1
29) bei einer Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Zunächst wurden
OH
14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) in 4.445 ml 100 mM Puffer (Kpi pH 8
O
9a
C 5H 8O 3
M = 116.12 g/mol
bzw.
NaOH/Glycin
pH 10.5)
gelöst.
(50/3 U;
Charge
Leucindehydrogenase
Dann
wurden
03/2011
-
505 µl
angepasste
Enzymmenge, nachdem das Enzym durch Lagerung an Aktivität verloren hatte), 2.6 mg
(0.025 mmol) Fe-TSPP (10) und 50 µl einer 100 mM NAD+-Stammlösung hinzugefügt.
Reaktionsverfolgung und Umsatzbestimmung erfolgten gemäß Arbeitsvorschrift 29. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 8.48 zusammengefasst:
Tabelle 8.48 Einfluss des pH-Werts auf den Reaktionsverlauf (Fe-TSPP)
Umsatz [%]nach
Eintrag
Puffer
pH
0.5 h
1h
2h
3h
4h
8h
24 h
1
Kpi
8
9
12
18
22
24
35
46
2
Glycin/NaOH
10.5
3
4
4
4
4
4
5
Die spektroskopischen Daten stimmen mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der
kommerziell erhältlichen Verbindung überein.
8.2.3.13 Allgemeine Arbeitsvorschrift 30 (AAV 30): Kontrollexperimente
Die
Durchführung
erfolgt
in
einem
10 ml
Rundkolben
bei
einer
definierten
Rührgeschwindigkeit (400 oder 1000 rpm). Zunächst wurden 14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin
(8a) eingewogen und im entsprechenden Volumen von 100 mM Kpi-Puffer pH 8 im
Ultraschallbad gelöst, so dass die Endkonzentration im Reaktionsgefäß 25 mM beträgt.
Gegebenenfalls werden 2.6 mg (0.025 mmol) Fe-TSPP (10) und 50 µl einer 100 mM
NAD+-Stammlösung, angesetzt in 100 mM Kpi-Puffer, hinzugefügt. Das Gesamtvolumen
beträgt 5 ml. Während einer Reaktionslaufzeit von mehreren Tagen bei Raumtemperatur
werden in regelmäßigen Abständen Proben entnommen und mittels 1H-NMR-Spektroskopie
255
EXPERIMENTELLER TEIL
der Umsatz bestimmt. Dafür werden je 300 µl Probe entnommen, mit 350 µl D2O versetzt
und sofort gemessen.
8.2.3.13.1
Blindprobe zur Untersuchung auf direkte Oxidation von L-Valin (8a)
durch Fe-TSPP (10)
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 30 (AAV 30) bei einer
Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 14.6 mg (0.125 mmol) L-Valin (8a) in 4.950 ml
100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst. Dann wurden 2.6 mg (0.025 mmol) Fe-TSPP (10) und 50 µl
einer 100 mM NAD+-Stammlösung hinzugefügt. Während der Reaktionslaufzeit von vier
Tagen bei Raumtemperatur wurden in regelmäßigen Abständen nach 1 – 2 Tagen Proben
entnommen und mittels 1H-NMR-Spektroskopie der Umsatz bestimmt. Dafür wurden 300 µl
Probe mit 350 µl D2O versetzt und sofort gemessen. Die spektroskopischen Daten stimmen
mit den Daten in Abschnitt 8.2.3.4.2 und denen der kommerziell erhältlichen Verbindung
überein.
Ergebnis:
Selbst nach einer Reaktionszeit von vier Tagen konnte mittels 1H-NMR-Spektroskopie kein
Produkt nachgewiesen werden. Damit konnte gezeigt werden, dass das Eisenporphyrin 10
ausschließlich den Cofaktor oxidiert und nicht in der Lage ist, die Aminosäure direkt zu
oxidieren.
8.2.3.13.2
Untersuchung der Stabilität von Ketovalin (9a) unter
Reaktionsbedingung
Die Durchführung erfolgte analog Allgemeine Arbeitsvorschrift 30 (AAV 30) bei einer
Rührgeschwindigkeit von 400 rpm. Es wurden 17.3 mg (0.125 mmol) Natrium-3-methyl-2oxobutansäure in 5 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst. Diese Lösung wurde über acht Tage
bei Raumtemperatur gerührt. In regelmäßigen Abständen von 1 – 3 Tagen wurden Proben
entnommen und mittels 1H-NMR-Spektroskopie die Stabilität der Ketosäure 9a überprüft.
Dafür wurden 300 µl Probe mit 350 µl D2O versetzt und wurde sofort gemessen. Die
spektroskopischen Daten stimmen mit denen der gekauften Verbindung überein.
256
EXPERIMENTELLER TEIL
Ergebnis:
Nach acht Tagen wurden im 1H-NMR-Spektrum ausschließlich die Signale der Ketosäure
identifiziert. Dies beweist die Stabilität unter Reaktionsbedingungen.
8.2.3.14 Stabilitätsuntersuchung der Ketosäure in Abhängigkeit vom pH-Wert
Es wurden je 17.3 mg (0.125 mmol) Natrium-3-methyl-oxobutansäure in 5 ml 100 mM KpiPuffer pH 8 gelöst. Dann wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 7, pH 5 oder pH 3 angesäuert.
Anschließend wurden aus der wässrigen Lösung je 300 µl Probe entnommen und mit 350 µl
D2O versetzt. Mittels
1
H-NMR-Spektroskopie wurde überprüft, ob Veränderungen im
Spektrum zu sehen sind, was auf eine mangelnde Säurestabilität hinweisen würde.
Ergebnis:
Es sind weitere Signal im 1H-NMR zusehen: ein Duplett bei 0.94 ppm und ein Multiplett bei
2.1 ppm. Die Intensität dieser Signale nimmt zu, je saurer die Lösung ist. Mit Hilfe einer
Referenzmessung
konnte
ausgeschlossen
werden,
dass
es
sich
um
das
Decarboxylierungsprodukt Isobutyraldehyd (46) oder dessen Hydrat (47) handelt.
257
APPENDIX
9
Appendix
9.1
Produktisolierung von Ketovalin
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sehr gute Umsätze von bis zu 95% für die Oxidation von
L-Valin
zu Ketovalin erzielt. Zur Gestaltung eines effizienten Prozesses spielt auch die
Isolierung des möglichst reine Produkts eine große Rolle. Da sowohl die verwendeten
Katalysatoren, LeuDH und NOx, als auch Edukt und Produkt sowie der Cofaktor
(NADH/NAD+) wasserlöslich sind, gestaltet sich die Aarbeitung nicht so einfach. Eine
Möglichkeit wäre das Produkt selektiv als Salz aus dem Reaktionsgemisch abzutrennen.
Ketovalin wird in Form seines Calcium-Salzes von der Evonik-Degussa GmbH vertrieben.
Eine weitere Möglichkeit bietet die Überführung des Produkts in die organische Phase,
indem zunächst das Reaktionsgemisch angesäuert wird und die α-Ketosäure in mit einem
geeigneten Lösungsmittel aus der wässrigen Phase extrahiert wird.
9.2
Experimenteller Teil
9.2.1
Verwendete Geräte und Chemikalien
Die Geräte und Chemikalien aus Kapitel 8.1 wurden ebenfalls für die hier beschriebenen
Experimente verwendet.
9.2.2
Bestimmung der Löslichkeitsgrenze von Ketovalin
Zur Bestimmung der Löslichkeitsgrenze von Ketovalin in dest. Wasser bei Raumtemperatur,
soll in 20 ml dest. Wasser so lange Natrium-3-Methyl-2-oxobutansäure gegeben werden, bis
eine gesättigte Lösung erreicht ist.
Ergebnis:
Bei Raumtemperatur konnten mehr als 2.2 g (15.6 mmol) Natrium-3-Methyl-2-oxobutansäure
in 20 ml dest. Wasser gelöst werden. Die Löslichkeit von Natrium-3-Methyl-2-oxobutansäure
in Wasser liegt mit >780 mM höher als die Löslichkeit von L-Valin (Wikipedia: 85 g/l
entspricht 726 mM ).
258
APPENDIX
9.2.3
Produktisolierung mittels Fällung
Zu 5 ml einer 100 mM Lösung von Ketovalin (eingesetzt als Natrium-Salz) in dest. Wasser
bzw. in 100 mM Kpi-Puffer pH 8 wird eine 1 M Calciumchlorid- bzw. MagnesiumchloridLösung pipettiert. Wird eine Niederschlagsbildung beobachtet, so wird mittels einer
Blindprobe getestet, ob tatsächlich die Ketosäure oder die Puffersalze ausfallen. Dafür wird
zu 5 ml Kpi-Puffer pH 8 eine 1 M Calciumchlorid- bzw. Magnesiumchlorid-Lösung pipettiert.
Fällung als Calciumsalz
Zu 5 ml einer 100 mM Lösung der von Ketovalin (eingesetzt als Natrium-Salz) in dest.
Wasser bzw. in 100 mM Kpi-Puffer pH 8 wurde eine 1 M Calciumchlorid-Lösung pipettiert.
Wurde die Ketosäure-Lösung in dest. Wasser angesetzt, konnte bei Zugabe der
Calciumchlorid-Lösung
keine
Niederschlagsbildung
beobachtet
werden.
Wurde
die
Ketosäure in Phosphatpuffer angesetzt, so wurde bereits bei Zugabe der ersten Tropfen der
1 M Calciumchlorid-Lösung die Bildung von Niederschlag beobachtet (nach 200 µl
vollständig). Zusätzlich wurde ein Blindprobe durchgeführt: dafür wurde zu 5 ml 100 mM KpiPuffer pH8 1 M Calciumchlorid-Lösung pipettiert. Auch hier wurde Niederschlag beobachtet.
Fällung als Magnesiumsalz
Zu 5 ml einer 100 mM Lösung von Ketovalin (eingesetzt als Natrium-Salz) in dest. Wasser
bzw. in 100 mM Kpi-Puffer pH8 wurde eine 1 M Magnesiumchlorid-Lösung pipettiert. Wurde
die Ketosäure in Phosphatpuffer angesetzt, so wurde nach Zugabe von 200 µl
Magnesiumchlorid-Lösung eine Trübung beobachtet, die sich bei weiterer Zugabe von
Magnesiumchlorid-Lösung verstärkte. Schließlich konnte Niederschlag beobachtet werden
(ab 400 µl Bildung von Niederschlag). Zusätzlich wurde ein Blindprobe durchgeführt: dafür
wurde zu 5 ml 100 mM Kpi-Puffer pH 8 1 M Magnesiumchlorid-Lösung pipettiert. Auch hier
wurde Niederschlag beobachtet.
Ergebnis:
Erste Versuche das Produkt als Calcium- oder Magnesiumsalz zu isolieren erwiesen sich
nicht als zielführend.
259
APPENDIX
9.2.4
Produktisolierung mittels Extraktion
Es werden zunächst 17.3 mg (0.125 mmol) Ketovalin (eingesetzt als Natriumsalz) in 5 ml
100 mM Kpi-Puffer pH 8 gelöst. Anschließend wird mit 2.5 M Salzsäure angesäuert. Die
wässrige Phase wird dreimal mit organischem Solvens extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird am
Rotationsverdampfer entfernt und eine Probe der wässrigen Phase mittels
1
H-NMR-
Spektroskopie untersucht. Mit Hilfe von L-Valin als Standard wird die Menge an Ketosäure
quantifiziert.
Extraktion mit Dichlormethan:
Es wurden je 17.3 mg (0.125 mmol) Ketovalin (eingesetzt als Natriumsalz) in 5 ml 100 mM
Kpi-Puffer pH 8 gelöst. Anschließend wurde mit 2.5 M Salzsäure auf pH 5 bzw. pH 2-3
angesäuert und es wurde dreimal mit je 5 ml Dichlormethan extrahiert. Das Lösungsmittel
wurde am Rotationsverdampfer entfernt. Mittels 1H-NMR-Spektroskopie in D2O wurde die
Ketosäure analysiert. Des Weiteren wurden aus der wässrigen Lösung je 300 µl Probe
entnommen und mit 350 µl D2O versetzt. Mittels 1H-NMR-Spektroskopie wurde überprüft, ob
noch Ketosäure in der wässrigen Phase zu finden ist. Die Restkonzentration an Ketosäure in
der wässrigen Lösung wurde mit Hilfe von 150 µl einer 25 mM Lösung von L-Valin als
Standard bestimmt.
Tabelle 9.1 Überführung von Ketovalin in die organische Phase
260
Eintrag
angesäuert auf
Restkonzentration an Ketovalin in der Pufferlösung
1
pH 5
25 mM
2
pH 2-3
~14 mM
LITERATURVERZEICHNIS
10 Literaturverzeichnis
1
Available from: http://www.cbc.arizona.edu/njardarson/group/top-pharmaceuticalsposter.
2
M.C. Wani, H.L. Taylor, M.E. Wall, P. Coggon, A.T. McPhail, J. Am. Chem. Soc.
1971, 93, 2325-2327.
3
R.A. Holton, C. Somoza, H.B. Kim, F. Liang, R.J. Biediger, P.D. Boatman, M. Shindo,
C.C. Smith, S. Kim, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 1597-1598.
4
K.C. Nicolaou, Z. Yang, J.J. Liu, H. Ueno, P.G. Nantermet, R.K. Guy, C.F. Claiborne,
J. Renaud, E.A. Couladouros, K. Paulvannan, E.J. Sorensen, Nature 1994, 367, 630634.
5
J.Y. Gauthier, N. Chauret, W. Cromlish, S. Desmarais, L.T. Duong, J.-P. Falgueyret,
D.B. Kimmel, S. Lamontagne, S. Léger, T. LeRiche, C.S. Li, F. Massé, D.J. McKay,
D.A. Nicoll-Griffith, R.M. Oballa, J.T. Palmer, M.D. Percival, D. Riendeau, J.
Robichaud, G.A. Rodan, S.B. Rodan, C. Seto, M. Thérien, V.-L. Truong, M.C. Venuti,
G. Wesolowski, R.N. Young, R. Zamboni, W.C. Black, Bioorganic & Medicinal
Chemistry Letters 2008, 18, 923-928.
6
G. Blaeser-Kiel, Deutsches Ärzteblatt 2013, 110, 1331-1332.
7
K.P.C. Vollhardt, N.E. Schore, Organische Chemie, 3. Auflage, Wiley-VCH Verlag
GmbH, Weinheim, 2000.
8
G. Löffler, Basiswissen Biochemie mit Pathobiochemie, 4. Ausgabe, SpringerLehrbuch, Berlin Heidelberg, 2001.
9
S.F. Feiten, S.A. Draibe, R. Watanabe, M.R. Duenhas, A.C. Baxmann, F.B. Nerbass,
L. Cuppari, Eur J Clin Nutr 2004, 59, 129-136.
10
P. Ödman, W.B. Wellborn, A.S. Bommarius, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15,
2933-2937.
11
M. Weiß, S. Borchert, E. Rémond, S. Jugé, H. Gröger, Heteroat. Chem. 2012, 23,
202-209.
12
T. Ooi, K. Maruoka, Angew. Chem. 2007, 119, 4300-4345.
13
K. Maruoka, T. Ooi, Chem. Rev. 2003, 103, 3013-3028.
14
E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew. Chem. 2008, 120, 9693-9696.
15
A. Prastaro, P. Ceci, E. Chiancone, A. Boffi, R. Cirilli, M. Colone, G. Fabrizi, A.
Stringaro, S. Cacchi, Green Chem. 2009, 11, 1929-1932.
16
V. Gauchot, W. Kroutil, A.R. Schmitzer, Chem. – Eur. J. 2010, 16, 6748-6751.
17
J. Rudat, B.R. Brucher, C. Syldatk, AMB Express 2012, 2.
261
LITERATURVERZEICHNIS
18
A. Liljeblad, L.T. Kanerva, Tetrahedron 2006, 62, 5831-5854.
19
C.K. Savile, J.M. Janey, E.C. Mundorff, J.C. Moore, S. Tam, W.R. Jarvis, J.C.
Colbeck, A. Krebber, F.J. Fleitz, J. Brands, P.N. Devine, G.W. Huisman, G.J.
Hughes, Science 2010, 329, 305-309.
20
M. Bischoff, Deutsches Ärzteblatt 2012, 109, 1718.
21
R. Sekura, M. Hochreiter, A. Meister, J. Biol. Chem. 1976, 251, 2263-2270.
22
A. Zukha, J. Rivlin, The Journal of Organic Chemistry 1958, 23, 94-96.
23
J.E. Baldwin, L.M. Harwood, M.J. Lombard, Tetrahedron 1984, 40, 4363-4370.
24
R. Caputo, E. Cassano, L. Longobardo, G. Palumbo, Tetrahedron 1995, 51, 1233712350.
25
K. Balenovic, D. Cerar, Z. Fuks, Journal of the Chemical Society (Resumed)
1952,3316-3317.
26
J.P. Kutney, G.K. Eigendorf, H. Matsue, A. Murai, K. Tanaka, W.L. Sung, K. Wada,
B.R. Worth, J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 938-943.
27
S. Matsubara, T. Kodama, K. Utimoto, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 6379-6380.
28
J. Wu, X.-L. Hou, L.-X. Dai, The Journal of Organic Chemistry 2000, 65, 1344-1348.
29
P.W. Sutton, A. Bradley, J. Farràs, P. Romea, F. Urpí, J. Vilarrasa, Tetrahedron
2000, 56, 7947-7958.
30
J. Farràs, X. Ginesta, P.W. Sutton, J. Taltavull, F. Egeler, P. Romea, F. Urpı,́ J.
Vilarrasa, Tetrahedron 2001, 57, 7665-7674.
31
J.C. Hessler, J. Am. Chem. Soc. 1913, 35, 990-994.
32
J. Lee, D. Gauthier, R.A. Rivero, The Journal of Organic Chemistry 1999, 64, 30603065.
33
G. Bartoli, C. Cimarelli, E. Marcantoni, G. Palmieri, M. Petrini, The Journal of Organic
Chemistry 1994, 59, 5328-5335.
34
S. Kobayashi, K. Kamiyama, T. Iimori, M. Ohno, Tetrahedron Lett. 1984, 25, 25572560.
35
J.K. Rasmussen, A. Hassner, Chem. Rev. 1976, 76, 389-408.
36
H. Böhme, R. Broese, F. Eiden, Chemische Berichte 1959, 92, 1258-1262.
37
H. Hellmann, G. Haas, Chemische Berichte 1957, 90, 1357-1363.
38
M. Calmès, F. Escale, C. Glot, M. Rolland, J. Martinez, Eur. J. Org. Chem. 2000,
2000, 2459-2466.
39
C.Y.K. Tan, D. Wainman, D.F. Weaver, Bioorg. Med. Chem. 2003, 11, 113-121.
40
W.M. Rodionow, A.M. Fedorowa, Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A
and B Series) 1926, 59, 2949-2952.
41
262
T.B. Johnson, J.E. Livak, J. Am. Chem. Soc. 1936, 58, 299-303.
LITERATURVERZEICHNIS
42
L. Lázár, T. Martinek, G. Bernáth, F. Fülöp, Synth. Commun. 1998, 28, 219-224.
43
M. Liu, M.P. Sibi, Tetrahedron 2002, 58, 7991-8035.
44
T. Kitazume, T. Ikeya, K. Murata, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1986,1331-1333.
45
T. Kitazume, K. Murata, J. Fluorine Chem. 1987, 36, 339-349.
46
T. Kitazume, K. Murata, Y. Kokusho, S. Iwasaki, J. Fluorine Chem. 1988, 39, 75-86.
47
K.R. Rao, Y.V.D. Nageswar, H.M.S. Kumar, Tetrahedron Lett. 1991, 32, 6611-6612.
48
A. Berkessel, H. Gröger, Asymmetric Organocatalysis, 1. Ausgabe, Wiley VCH,
Weinheim, 2005.
49
L. Falborg, K.A. Jorgensen, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1
1996,2823-2826.
50
N. Yamagiwa, H. Qin, S. Matsunaga, M. Shibasaki, J. Am. Chem. Soc. 2005, 127,
13419-13427.
51
M.P. Sibi, K. Itoh, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 8064-8065.
52
Y.K. Chen, M. Yoshida, D.W.C. MacMillan, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 9328-9329.
53
J. Vesely, I. Ibrahem, R. Rios, G.-L. Zhao, Y. Xu, A. Córdova, Tetrahedron Lett. 2007,
48, 2193-2198.
54
I. Ibrahem, R. Rios, J. Vesely, G.-L. Zhao, A. Cordova, Chem. Commun. 2007,849851.
55
I. Ibrahem, R. Rios, J. Vesely, G.-L. Zhao, A. Córdova, Synthesis 2008, 2008, 11531157.
56
K. Li, P.H. Phua, K.K. Hii, Tetrahedron 2005, 61, 6237-6242.
57
P.H. Phua, J.G. de Vries, K.K. Hii, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1775-1780.
58
I. Reboule, R. Gil, J. Collin, Tetrahedron: Asymmetry 2005, 16, 3881-3886.
59
H. Jiang, J.B. Nielsen, M. Nielsen, K.A. Jørgensen, Chem. – Eur. J. 2007, 13, 90689075.
60
G.-L. Zhao, A. Córdova, Tetrahedron Lett. 2007, 48, 5976-5980.
61
H. Arai, N. Sugaya, N. Sasaki, K. Makino, S. Lectard, Y. Hamada, Tetrahedron Lett.
2009, 50, 3329-3332.
62
J. Lee, M.-h. Kim, S.-s. Jew, H.-g. Park, B.-S. Jeong, Chem. Commun. 2008,19321934.
63
M. Bandini, A. Eichholzer, M. Tragni, A. Umani-Ronchi, Angew. Chem. 2008, 120,
3282-3285.
64
S. Fioravanti, M.G. Mascia, L. Pellacani, P.A. Tardella, Tetrahedron 2004, 60, 80738077.
65
M. Weiß, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2011.
263
LITERATURVERZEICHNIS
66
E. Rémond, A. Tessier, F.R. Leroux, J. Bayardon, S. Jugé, Org. Lett. 2010, 12, 15681571.
67
T. Ooi, Y. Arimura, Y. Hiraiwa, L.M. Yuan, T. Kano, T. Inoue, J. Matsumoto, K.
Maruoka, Tetrahedron: Asymmetry 2006, 17, 603-606.
68
T. Hashimoto, K. Maruoka, Chem. Rev. 2007, 107, 5656-5682.
69
S. Shirakawa, K. Maruoka, Angew. Chem. 2013, 125, 4408-4445.
70
P. Anastas, J.C. Warner, Green Chemistry: Theory and Practice, Oxford University
Press, Oxford, 1998.
71
P.T. Anastas, L.G. Heine, T.C. Williamson, Green Chemical Syntheses and
Processes American Chemical Society, Washington D.C., 2000.
72
K. Huang, M. Ortiz-Marciales, W. Correa, E. Pomales, X.Y. López, The Journal of
Organic Chemistry 2009, 74, 4195-4202.
73
H. Pellissier, Tetrahedron 2013, 69, 7171-7210.
74
N.K. Garg, D.D. Caspi, B.M. Stoltz, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 9552-9553.
75
A.G. Myers, N.J. Tom, M.E. Fraley, S.B. Cohen, D.J. Madar, J. Am. Chem. Soc.
1997, 119, 6072-6094.
76
T. Laue, A. Plagens, Namen- und Schlagwortreaktionen der Organischen Chemie, 3.
Auflage, Teubner Verlag, Stuttgart, 1998.
77
J. Clayden, N. Greeves, S. Warren, P. Wothers, Organic Chemistry, Oxford
University Press, New York, 2007.
78
K. Alfonsi, J. Colberg, P.J. Dunn, T. Fevig, S. Jennings, T.A. Johnson, H.P. Kleine, C.
Knight, M.A. Nagy, D.A. Perry, M. Stefaniak, Green Chem. 2008, 10, 31-36.
79
K.H. Shaughnessy, Chem. Rev. 2009, 109, 643-710.
80
S. Borchert, E. Burda, J. Schatz, W. Hummel, H. Gröger, J. Mol. Catal. B: Enzym.
2012, 84, 89-93.
81
W.A. Herrmann, C.W. Kohlpaintner, Angewandte Chemie International Edition in
English 1993, 32, 1524-1544.
82
E.G. Kuntz, Chemtech 1987, 17, 570-575.
83
M. Ferreira, H. Bricout, F. Hapiot, A. Sayede, S. Tilloy, E. Monflier, ChemSusChem
2008, 1, 631-636.
84
A.L. Casalnuovo, J.C. Calabrese, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 4324-4330.
85
C. Dupuis, K. Adiey, L. Charruault, V. Michelet, M. Savignac, J.-P. Genêt,
Tetrahedron Lett. 2001, 42, 6523-6526.
86
E.C. Western, J.R. Daft, E.M. Johnson, P.M. Gannett, K.H. Shaughnessy, The
Journal of Organic Chemistry 2003, 68, 6767-6774.
264
LITERATURVERZEICHNIS
87
A. Omumi, D.G. Beach, M. Baker, W. Gabryelski, R.A. Manderville, J. Am. Chem.
Soc. 2010, 133, 42-50.
88
A. Wolfson, C. Dlugy, Chem. Pap. 2007, 61, 228-232.
89
S. Borchert, Diplomarbeit, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 2008.
90
K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, 5th edition, Springer-Verlag,
Berlin, 2004.
91
J. Liang, J. Lalonde, B. Borup, V. Mitchell, E. Mundorff, N. Trinh, D.A. Kochrekar, R.
Nair Cherat, G.G. Pai, Org. Process Res. Dev. 2009, 14, 193-198.
92
F. Hollmann, I.W.C.E. Arends, K. Buehler, ChemCatChem 2010, 2, 762-782.
93
H. Gröger, S. Borchert, M. Kraußer, W. Hummel, Enzyme-catalyzed asymmetric
reduction of ketones in: Encyclopedia of Industrial Biotechnology, Bioprocess,
Bioseparation, and Cell Technology, (editor: M.C. Flickinger), John Wiley & Sons,
Hoboken, New Jersey, 2010, volume 3, p. 2094-2109.
94
T. Stillger, M. Bönitz, M. Villela Filho, A. Liese, Chem. Ing. Tech. 2002, 74, 10351039.
95
H. Gröger, W. Hummel, R. Metzner, 7.10 Reduction: Asymmetric Biocatalytic
Reduction of Ketones in: Comprehensive Chirality, (editor: M.C. Editors-in-Chief:
Erick and Y. Hisashi), Elsevier, Amsterdam, 2012. http://dx.doi.org/10.1016/B978-008-095167-6.00712-6181-215.
96
N.H. Schlieben, K. Niefind, J. Müller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J. Mol.
Biol. 2005, 349, 801-813.
97
H. Pellissier, Tetrahedron 2008, 64, 1563-1601.
98
A. Bruggink, R. Schoevaart, T. Kieboom, Org. Process Res. Dev. 2003, 7, 622-640.
99
O. Pàmies, J.-E. Bäckvall, Chem. Rev. 2003, 103, 3247-3262.
100
K. Engstrom, M. Vallin, P.-O. Syren, K. Hult, J.-E. Backvall, Org. Biomol. Chem.
2011, 9, 81-82.
101
A. Weckbecker, W. Hummel, Biocatal. Biotransform. 2006, 24, 380-389.
102
F. Krier, J. Kreit, J.-B. Millière, Letters in Applied Microbiology 1998, 26, 283-287.
103
W. Hummel, Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990, 34, 15-19.
104
E. Burda, Dissertation, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 2010.
105
M. Kraußer, Dissertation, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 2011.
106
N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 1995, 95, 2457-2483.
107
R. Brückner, Reaktionsmechanismen, 3. Auflage, Elsevier Verlag, München, 2004.
108
B. Kosjek, W. Stampfer, M. Pogorevc, W. Goessler, K. Faber, W. Kroutil, Biotechnol.
Bioeng. 2004, 86, 55-62.
109
K. Goldberg, K. Edegger, W. Kroutil, A. Liese, Biotechnol. Bioeng. 2006, 95, 192-198.
265
LITERATURVERZEICHNIS
110
S. Lütz, C. Wandrey, N. Rao, Chem. Ing. Tech. 2005, 77, 1669-1682.
111
A. Freeman, Trends Biotechnol. 1984, 2, 147-148.
112
T. Yamane, T. Ichiryu, M. Nagata, A. Ueno, S. Shimizu, Biotechnol. Bioeng. 1990, 36,
1063-1069.
113
M. Reslow, P. Adlercreutz, B. Mattiasson, Biocatal. Biotransform. 1992, 6, 307-318.
114
T. Okamoto, S. Ueji, Chem. Commun. 1999,939-940.
115
T. Ke, A.M. Klibanov, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3334-3340.
116
M.-C. Parker, S. A. Brown, L. Robertson, N. J. Turner, Chem. Commun. 1998,22472248.
117
J.P. Scott, M. Alam, N. Bremeyer, A. Goodyear, T. Lam, R.D. Wilson, G. Zhou, Org.
Process Res. Dev. 2011, 15, 1116-1123.
118
J. Wiss, C. Fleury, U. Onken, Org. Process Res. Dev. 2006, 10, 349-353.
119
J. Wiss, C. Fleury, C. Heuberger, U. Onken, M. Glor, Org. Process Res. Dev. 2007,
11, 1096-1103.
120
A.J.L. Cooper, J.Z. Ginos, A. Meister, Chem. Rev. 1983, 83, 321-358.
121
Weitere
Infos
zu
Ketosteril.
Available
from:
http://www.diagnosia.com/de/medikament/ketosteril-tabletten#patient.
122
J.H. Chang, D.K. Kim, J.T. Park, E.W. Kang, T.H. Yoo, B.S. Kim, K.H. Choi, H.Y. Lee,
D.-S. Han, S.K. Shin, Nephrology 2009, 14, 750-757.
123
A. Karau, M. Kottenhan, K. Drauz, N. Windhab, A. Grünert (Evonik Degussa GmbH),
DE102007016715A1, 2008.
124
H. Schütte, W. Hummel, H. Tsai, M.-R. Kula, Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985, 22,
306-317.
125
B. Geueke, B. Riebel, W. Hummel, Enzyme Microb. Technol. 2003, 32, 205-211.
126
W. Hummel, B. Riebel, Biotechnol. Lett. 2003, 25, 51-54.
127
H. Maid, P. Böhm, S.M. Huber, W. Bauer, W. Hummel, N. Jux, H. Gröger, Angew.
Chem. 2011, 123, 2445-2448.
128
J.J. Berzelius, Annalen der Physik 1835, 112, 1-29.
129
A. García-Raso, P.M. Deyá, J.M. Saá, J. Org. Chem. 1986, 51, 4285-4287.
130
F. Weygand, W. Steglich, H. Tanner, Justus Liebigs Annalen der Chemie 1962, 658,
128-150.
131
H. Poisel, Chemische Berichte 1978, 111, 3136-3139.
132
J. Anatol, A. Medète, Synthesis 1971, 1971, 538-539.
133
K. Tanaka, T. Nakai, N. Ishikawa, Tetrahedron Lett. 1978, 19, 4809-4810.
134
P.T. Magee, E.E. Snell, Biochemistry 1966, 5, 409-416.
266
LITERATURVERZEICHNIS
135
H.A. Krebs, Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie 1933, 217, 191227.
136
Aminosäuredehydrogenasen sind kommerziell erhältlich bei evocatal GmbH,
Merowinger
Platz
1a,
40225
Düsseldorf,
Deutschland.
Available
from:
http://www.evocatal.com/de/download/infomaterial.html.
137
N.M.W. Brunhuber, J.S. Blanchard, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular
Biology 1994, 29, 415-467.
138
A.S. Bommarius, K. Drauz, W. Hummel, M.R. Kula, C. Wandrey, Biocatal.
Biotransform. 1994, 10, 37-47.
139
M. Kuzu, Doktorarbeit, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, 2005.
140
S.E.H. Syed, P.C. Engel, D.M. Parker, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) General Subjects 1991, 1115, 123-130.
141
L.A. Basso, P.C. Engel, A.R. Walmsley, European Journal of Biochemistry 1993, 213,
935-945.
142
S.E. GHARBIA, H.N. SHAH, Journal of General Microbiology 1988, 134, 327-332.
143
W. Hummel, H. Schütte, E. Schmidt, C. Wandrey, M.-R. Kula, Appl. Microbiol.
Biotechnol. 1987, 26, 409-416.
144
T. Ohshima, S. Nagata, K. Soda, Arch. Microbiol. 1985, 141, 407-411.
145
A. Honorat, F. Monot, D. Ballerini, Enzyme Microb. Technol. 1990, 12, 515-520.
146
W. Hummel, H. Schütte, M.-R. Kula, Appl. Microbiol. Biotechnol. 1981, 12, 22-27.
147
B.D. Sanwal, M.W. Zink, Arch. Biochem. Biophys. 1961, 94, 430-435.
148
A. Weckbecker, H. Gröger, W. Hummel, Regeneration of Nicotinamide Coenzymes:
Principles and Applications for the Synthesis of Chiral Compounds in: Biosystems
Engineering I, (editor: C. Wittmann and R. Krull), Springer Berlin Heidelberg, 2010,
120, p. 195-242.
149
W. Hummel, M. Kuzu, B. Geueke, Org. Lett. 2003, 5, 3649-3650.
150
P. Kornberger, F. Giffhorn, G.-W. Kohring, M.C. Flickinger, Dehydrogenases,
Electrochemical Cofactor Regeneration in: Encyclopedia of Industrial Biotechnology,
(editor: John Wiley & Sons, Inc., 2009. 10.1002/9780470054581.eib254.
151
C.-H. Wong, G.M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 4890-4899.
152
B.R. Riebel, P.R. Gibbs, W.B. Wellborn, A.S. Bommarius, Adv. Synth. Catal. 2003,
345, 707-712.
153
G.T. Lountos, R. Jiang, W.B. Wellborn, T.L. Thaler, A.S. Bommarius, A.M. Orville,
Biochemistry 2006, 45, 9648-9659.
154
M. Kuzu, K. Niefind, W. Hummel, D. Schomburg, Acta Crystallogr., Sect. F: Struct.
Biol. Cryst. Commun. 2005, 61, 528-530.
267
LITERATURVERZEICHNIS
155
B.R. Riebel, P.R. Gibbs, W.B. Wellborn, A.S. Bommarius, Adv. Synth. Catal. 2002,
344, 1156-1168.
156
S.L. Pival, M. Klimacek, B. Nidetzky, Adv. Synth. Catal. 2008, 350, 2305-2312.
157
I. Schröder, E. Steckhan, A. Liese, Journal of Electroanalytical Chemistry 2003, 541,
109-115.
158
G. Hilt, B. Lewall, G. Montero, J.H.P. Utley, E. Steckhan, Liebigs Annalen 1997,
1997, 2289-2296.
159
I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A.M. Stock, S.A. Maves, D.E. Benson, R.M.
Sweet, D. Ringe, G.A. Petsko, S.G. Sligar, Science 2000, 287, 1615-1622.
160
L. Que, W.B. Tolman, Nature 2008, 455, 333-340.
161
C. Lanzerath, geplante Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf.
162
K. Tenbrink, geplante Dissertation, Universität Bielefeld.
163
S.L. Johnson, P.T. Tuazon, Biochemistry 1977, 16, 1175-1183.
164
N.J. Oppenheimer, N.O. Kaplan, Biochemistry 1974, 13, 4675-4685.
165
K. Koike, T. Kobayashi, S. Ito, M. Saitoh, J. Biochem. 1985, 97, 1279-1288.
166
H.-J. Park, C.O.A. Reiser, S. Kondruweit, H. Erdmann, R.D. Schmid, M. Sprinzl,
European Journal of Biochemistry 1992, 205, 881-885.
167
P. Böhm, Doktorarbeit, Universität Bielefeld, 2013.
168
E.B. Fleischer, J.M. Palmer, T.S. Srivastava, A. Chatterjee, J. Am. Chem. Soc. 1971,
93, 3162-3167.
169
A.A. El-Awady, P.C. Wilkins, R.G. Wilkins, Inorganic Chemistry 1985, 24, 2053-2057.
170
M.A. Ivanca, A.G. Lappin, W.R. Scheidt, Inorganic Chemistry 1991, 30, 711-718.
171
W. Hummel, M.R. Kula (FZ Jülich GmbH), EP 0456107, 1991.
172
K. Ahmad, S. Koul, S.C. Taneja, A.P. Singh, M. Kapoor, H. Riyaz ul, V. Verma, G.N.
Qazi, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, 1685-1692.
268