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Die Übertragung von Methylgruppen ist ein essentieller Schritt, der in vielen Reaktionen jeder lebenden Zelle
stattfindet. Diese Transformation wird von Methyltransferasen (MTasen) katalysiert. Alle MTasen benötigen
Kofaktoren um ihre Funktion ausüben zu können, wobei S-Adenosyl-L-Methionin der am Häufigsten verwendete
Kofaktor in biologischen Systemen ist. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben dem natürlichen SAM auch
SAM-Analoga mit erweiterten Kohlenstoffketten, von DNA-C-MTasen sowie auch von C-MTasen die kleine
Moleküle methylieren, als Kofaktoren akzeptiert werden. Dieser Antrag beschreibt die Kombination von gerichteter
Evolution und rationalem Enzymdesign von C-MTasen mit dem Ziel einer verbesserten Übertragung von
erweiterten Kohlenstoffketten von SAM-Analoga. Dabei ist es sehr schwierig geeignete Selektionsverfahren für
MTasen zu entwickeln. Der erste Teil dieses Antrags beschreibt die gerichtete Evolution der DNA MTase M.SssI
auf SAM-Analoga. Dafür soll die Methode der in vitro Kompartimentierung (IVC) verwendet werden, bei welcher
eine Genbank in kleine Wasser in Öl Emulstionströpfchen verpackt wird in denen die in vitro Expression der
Genvarianten abläuft. Zur Selektion positiver Klone macht man sich die Tatsache zu Nutze, dass DNAMethylierung vor der Fragmentierung durch kognate Restriktionsenzyme schützt. Somit stellt diese Methodik eine
Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp her und ermöglicht eine effektive Selektion von evolvierten
Enzymvarianten. Die Ergebnisse der M.SssI Evolution sollen dann für ein rationales Enzymdesign von NovO
(methyliert kleine Moleküle) verwendet werden. Aufgrund der großen strukturellen Ähnlichkeiten beider Enzyme
in Bezug auf ihren Faltungstyp, welcher auch die Kofaktorbindestelle enthält, ist eine Kombination von
Zufallsmutagenese mit anschließender gerichteter Evolution von M.SssI und rationalem Design von NovO,
sinnvoll. Neben der Analyse von Enzymaktivitäten sollen auch biophysikalische Methoden zur Aufklärung von
Protein-Ligand-Wechselwirkungen angewendet werden. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten von MTasen
und Kofaktoren wird die Bedeutung einzelner Mutationen bezüglich der Kofaktor Spezifität hervorheben.
Zusammenfassend sollen die Ergebnisse dieses Projektes zu einer weiteren Aufklärung und möglichen Anwendung
von enzymatischen Alkylübertragungen führen.