Die Rolle der Nukleoid-assoziierten Proteine HvrA und NrfA bei der

Die Rolle der Nukleoid-assoziierten Proteine HvrA und NrfA bei der
Regulation der Stickstoff-Fixierung in dem phototrophen
Purpurbakterium Rhodobacter capsulatus
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen
vorgelegt von
Karsten Raabe
aus
Iserlohn
Bochum 2003
Danksagungen
Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Klipp (†) für die Überlassung des Themas und
die zahlreichen wertvollen Anregungen und hilfreichen Ratschläge.
Bei Herrn Prof. Dr. W. Hengstenberg möchte ich mich für die Weiterbetreuung meiner
wissenschaftlichen Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. W. Oetmeier danke ich für die Übernahme des Korreferates.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. T. Drepper und Herrn Dr. B. Masepohl für ihre
engagierte Diskussionsbereitschaft und für die vielen wertvollen Ratschläge während der
letzten Jahre.
Abschließend danke ich allen MitarbeiterInnen der Arbeitsgruppe und des Lehrstuhls,
insbesondere Kai-Uwe Riedel, Alice Pawlowski, Christine Krall, Petra Dreiskemper und
Björn Kaiser für die freundschaftliche Zusammenarbeit.
Meinen Eltern, die mich während meiner Studienzeit unterstützt haben, danke ich ganz
besonders. Silke Geisler möchte ich für die Geduld, Hilfsbereitschaft und das Verständnis
in den letzten Wochen herzlich danken.
Kongressbeiträge
Drepper, T., Raabe, K., Masepohl, B. und Klipp, W. (2002)
Role of the Hfq-like protein NrfA in regulation of N2 fixation in Rhodobacter capsulatus
5th European Nitrogen Fixation Conference, 6. – 10. September 2002, Norwich, Großbritannien
Klipp, W., Drepper, T., Raabe. K. und Masepohl, B. (2002)
Regulation of nitrogen fixtion in the phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus
5th European Nitrogen Fixation Conference, 6. – 10. September 2002, Norwich, Großbritannien
Raabe, K., Drepper, T., Riedel, K.-U., Masepohl, B. und Klipp, W. (2002)
The H-NS like protein HvrA modulates expression of nitrogen fixation genes in Rhodobacter
capsulatus by binding to selected nif promoters
5th European Nitrogen Fixation Conference, 6. – 10. September 2002, Norwich, Großbritannien
Raabe, K., Drepper, T., Kruip, J., Riedel, K.-U., Masepohl, B. und Klipp, W. (2002)
Molecular analysis of the regulatory link between N2 fixation and photosynthesis in Rhodobacter
capsulatus
GBM Herbsttagung, 9. – 12. September, Bochum
Raabe, K., Riedel, K.-U. und Klipp, W. (1999)
Untersuchung zur NtrC-unabhängigen Regulation der Stickstoff-Fixierungsgenexpression durch den
Schwachlichtaktivator der Photosynthese HvrA in Rhodobacter capsulatus
Sympossium „Mechanismus der Genregulation bei Mikroorganismen“, 25. – 28. November 1999,
Osnabrück
Veröffentlichungen
Raabe, K., Drepper, T., Riedel, K.-U., Masepohl, B. und Klipp, W. (2002)
The H-NS-like protein HvrA modulates expression of nitrogen fixation genes in the phototrophic
purple bacterium Rhodobacter capsulatus by binding to selected nif promoters. FEMS Microbiol.
Lett. 216: 151-158.
Drepper, T., Raabe, K., Giaourakis, D., Gendrullis, M., Masepohl, B. und Klipp, W. (2002)
The Hfq-like protein NrfA of the phototrophic purple bacterium Rhodobacter capsulatus controls
nitrogen fixation via regulation of nifA and anfA expression. FEMS Microbiol. Lett. 215: 221-227.
Masepohl, B., Dreiskemper, P., Drepper, T., Groß, S., Isakovic, N., Pawlowski, A., Raabe, K., Riedel, K.-U.,
Sicking, C. und Klipp, W. (2002)
Protein-protein interactions of regulatory and other gene products involved in nitrogen fixation in
Rhodobacter capsulatus: identification of new anf genes. In: Finan et al. (eds.) Nitrogen fixation:
global perspectives; CABI Publishing, p. 424.
Masepohl, B., Drepper, T., Paschen, A., Groß, S., Pawlowski, A., Raabe, K., Riedel, K.-U. und Klipp, W.
(2002)
Regulation of nitrogen fixation in the phototrophic purple bacterium Rhodobacter capsulatus. J. Mol.
Microbiol. Biotechnol. 4: 243-248.
Klipp, W., Drepper, T., Groß, S., Masepohl, B., Raabe, K., Riedel, K-U., Yakunin, A.F. und
Hallenbeck, P. C. (2000)
Genetics of nitrogen fixation in Rhodobacter capsulatus: ammonium and molybdenum control of both
nitrogenase systems. In: Pedrosa et al. (eds.) Nitrogen fixation: from molecules to crop productivity;
Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, pp. 141-142.
Drepper, T., Masepohl, B., Paschen, A., Groß, S., Pawlowski, A., Raabe, K., Riedel, K-U. und Klipp, W.
(2003)
Regulation of synthesis and activity of molybdenum nitrogenase and the alternative nitrogenase in
Rhodobacter capsulatus
In: P. Dürre, B. Friederich (eds.) Regulatory Networks in Prokaryotes, Horizon Scientific Press ( in
Druck)
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
A
Einleitung ................................................................................................................................... 1
1
Die biologische Stickstoff-Fixierung .................................................................................... 1
1.1
Der Nitrogenase-Enzymkomplex .............................................................................. 2
2 Das phototrophe Purpurbakterium Rhodobacter capsulatus............................................. 4
2.1
Die bakterielle Photosynthese in R. capsulatus......................................................... 5
2.2
Die Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus ................................................................. 7
2.3
Die Aktivatorfamilie der „Enhancer-Bindeproteine“ .............................................. 12
3 Nukleoid-assoziierte Proteine ............................................................................................. 13
3.1
Nukleoid-assoziierte Proteine aus E. coli ................................................................ 13
3.2
Nukleoid-assozierte Proteine in R. capsulatus ........................................................ 18
4 Ziel der Arbeit...................................................................................................................... 20
B
Material und Methoden .......................................................................................................... 21
1
2
3
4
5
6
7
8
Bakterienstämme ................................................................................................................. 21
E.coli-Stämme ......................................................................................................... 21
1.1
R. capsulatus-Stämme ............................................................................................. 21
1.2
Plasmide................................................................................................................................ 21
2.1
Vektorplasmide ....................................................................................................... 21
2.2
Hybridplamide......................................................................................................... 22
Medien und Zusätze ............................................................................................................ 22
3.1
Medien..................................................................................................................... 22
E. coli-Medien......................................................................................................... 22
3.1.1
R. capsulatus-Medien.............................................................................................. 22
3.1.2
3.2
Zusätze zu Nährmedien ........................................................................................... 24
3.3
Enzyme .................................................................................................................... 25
3.4
Antiseren ................................................................................................................. 25
3.5
Oligonukleotide ....................................................................................................... 25
Chemikalien und Materialien............................................................................................. 26
Reaktions- und Nachweis-‘Kit‘ .......................................................................................... 26
Mikrobiologische Methoden ............................................................................................... 28
6.1
Herstellung von Nähr- und Testmedien .................................................................. 28
6.2
Bakterienanzucht ..................................................................................................... 28
6.3
Aufbewahrung von R. capsulatus-Stämmen ........................................................... 29
6.4
Messung der optischen Dichte................................................................................. 29
6.5
Transfer von moblisierbaren Plasmiden von E. coli nach R. capsulatus durch
Konjugation ............................................................................................................. 29
6.5.1
Identifizierung von R. capsulatus Interposonmutanten nach der Konjugation ....... 29
Nachweis von Enzymaktivitäten ........................................................................................ 30
7.1
Bestimmung der Nitrogenase-Aktivität im Acetylenreduktionstest........................ 30
7.2
Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität ............................................................ 30
DNA-Techniken ................................................................................................................... 31
8.1
Plasmid-Isolierung................................................................................................... 31
8.2
Mini- und Midipäparation von Plasmid-DNA......................................................... 31
8.3
Isolierung von chromosomaler DNA aus R. capsulatus.......................................... 32
8.4
Phenol-Chloroform-Extraktion................................................................................ 32
8.5
Präzipitation von DNA durch Alkohole .................................................................. 33
8.6
DNA-Konzentrationsbestimmung ........................................................................... 33
8.7
Restriktionsspaltung ................................................................................................ 33
8.8
Agarosegelelektrophorese ....................................................................................... 34
I
Inhaltsverzeichnis
8.9
Elution von DNA aus Agarosegelen ....................................................................... 34
8.10
Ligation von Vektor- und Fragment-DNA.............................................................. 34
8.11
Transformation ........................................................................................................ 35
8.11.1 Herstellung transformationskompetenter Zellen ..................................................... 35
8.11.2 Lagerung der kompetenten Zellen........................................................................... 35
8.11.3 Transformation von E. coli ..................................................................................... 35
8.12
Vervielfältigung von DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)..................... 35
8.13
Gel-Retardations-Experimente ................................................................................ 36
8.13.1 Gel-Retardations-Experimente im Agarose-Gelsystem ......................................... 36
8.13.2 Gel-Retardations-Experimente im Polyacryl-Amid-Gelsystem.............................. 37
9 Proteinbiochemische Methoden ......................................................................................... 37
9.1
Expression und Reinigung eines His6-Fusionsproteins ........................................... 37
9.1.1
Proteinexpression in E. coli und Zellaufschluss zur Herstellung eines
Rohextraktes............................................................................................................ 38
9.1.2
Affinitätschromatographie des aus E. coli gereinigten HvrA-His6Fusionsproteins ....................................................................................................... 38
9.1.3
Proteinexpression in R. capsulatus und Zellaufschluss zur Herstellung eines
Rohextraktes............................................................................................................ 38
9.1.4
Affinitätschromatographie des aus R. capsulatus gereinigten HvrA-His6Fusionsproteins ....................................................................................................... 38
9.2
Anionen-Austauschchromatographie ...................................................................... 39
9.3
Proteinbestimmung.................................................................................................. 39
9.4
Gesamtproteinisolierung aus Bakterien................................................................... 39
9.5
Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) ..................... 40
9.5.1 Coomassie-Blau Färbung ........................................................................................ 40
9.5.2
Elektrotransfer von Proteinen auf PVDF-Membranen (Western Blot)................... 41
9.5.3
Immunodetektion von Proteinen ............................................................................. 41
9.5.4
Anfärbung der PVDF-Membran ............................................................................. 41
9.6
Molekulargewichtsanalyse mittels MALDI-TOF ................................................... 41
C
Ergebnisse ................................................................................................................................ 43
1
Reinigung von HvrA............................................................................................................ 43
1.1
Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus dem heterologen Wirt E. coli........ 43
1.1.1
Konstruktion eines hvrA-his6-Expressionsplasmides.............................................. 44
1.1.2
Reinigung von HvrA-His6 aus E. coli BL21(DE3) ................................................. 46
1.1.3
Analyse des aus E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins mittels
MALDI-TOF........................................................................................................... 47
1.2
Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus dem homologen Wirt
R. capsulatus ........................................................................................................... 49
1.2.1
Konstruktion eines mobilisierbaren hvrA-his6-Expressionsplasmides.................... 49
1.2.2
Reinigung von HvrA-His6 aus R. capsulatus RA7.................................................. 51
1.2.3
Analyse des aus R. capsulatus gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins mittels
MALDI-TOF........................................................................................................... 51
2 Untersuchungen zur Funktion und Stabilität von HvrA-His6 ......................................... 53
2.1
Vorbemerkungen ..................................................................................................... 53
2.2
Komplementation einer R. capsulatus hvrA-Mutante mit hvrA-his6 ....................... 53
2.3
Akkumulation von HvrA und HvrA-His6 ................................................................ 55
3 Untersuchungen zur Bindung von HvrA an verschiedene nif- und anf-Promotoren.... 56
3.1
Vorbemerkungen ..................................................................................................... 56
3.2
Das aus R. capsulatus gereinigte HvrA-His6-Fusionsprotein bindet an den
bla-Promoter............................................................................................................ 57
3.3
Auswahlkriterien der zu untersuchenden Promotorfragmente ................................ 59
3.4
HvrA bindet an den nifH-Promotor ......................................................................... 61
II
Inhaltsverzeichnis
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an die Promotoren der Gene nifU2,
nifB1 und nifA1........................................................................................................ 63
3.6
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an verschiedene Subfragmente des
nifH-Promotors........................................................................................................ 66
3.7
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an den anfH-Promotor ............................ 69
4 Die Rolle von NrfA bei der Regulation der Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus......... 72
4.1
Vorbemerkungen ..................................................................................................... 72
4.2
Die Rolle von NrfA bei der Stickstoff-Fixierung.................................................... 72
4.2.1
Die Wirkung von NrfA auf die Synthese des Transkriptionsaktivators NifA......... 79
4.3
Die Rolle von NrfA bei der Regulation der alternativen Nitrogenase in
R. capsulatus ........................................................................................................... 80
4.3.1
Die Rolle von NrfA bei der Regulation der anfA-Expression................................. 82
5
Die Funktion von NrfA bei der Regulation der hvrA-Genexpression ............................ 84
5.1
Vorbemerkungen ..................................................................................................... 84
5.2
NrfA kontrolliert nicht die Regulation der hvrA-Genexpression ............................ 84
5.3
Untersuchung zum Einfluss der Lichtintensität auf die Akkumulation von HvrA.. 87
3.5
D
Diskussion ................................................................................................................................ 89
1
2
3
4
5
6
Nukleoid-assoziierte Proteine in Rhodobacter capsulatus ................................................ 89
Die Rolle von NrfA bei der Regulation der Nitrogenasegene .......................................... 89
2.1
Mechanismus der NrfA-vermittelten nifA- und anfA-Genexpression ..................... 92
2.2
Wie erfolgt die NrfA-abhängige Signaltransduktion in R. capsulatus? .................. 93
Die Rolle von HvrA bei der Stickstoff-Fixierung.............................................................. 94
3.1
Wie greift HvrA in die Regulation der Stickstoff-Fixierung ein? ........................... 95
3.1.1
HvrA beeinflusst die Genexpression durch eine spezifische Bindung an die
Promotoren.............................................................................................................. 95
3.2
Signaltransduktion von HvrA.................................................................................. 97
3.2.1
Wird HvrA posttranslational modifiziert?............................................................... 98
3.2.2
Beeinflusst die HvrA-Menge die Regulation der Stickstoff-Fixierungsgene?...... 101
3.3
Mechanismus der HvrA-vermittelten Modulation der nif-Genrepression............. 103
Besitzt NrfA einen Einfluss auf die HvrA-vermittelten regulatorische Prozesse?....... 106
HvrA hat eine antagonistische Wirkung zu IHF ............................................................ 107
Modell zur Funktion von IHF, NrfA und HvrA bei der Regulation der
Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus................................................................................ 109
E
Zusammenfassung................................................................................................................. 111
F
Literatur................................................................................................................................. 113
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. A-1: Schematische Darstellung der Nitrogenase-Enzymkomplexe ....................................... 4
Abb. A-2: Modell der Sauerstoff- und Licht-abhängigen Regulation der PhotosyntheseGene in R. capsulatus .................................................................................................... 6
Abb. A-3: Organisation der Genregionen für die Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus................ 8
Abb. A-4: Modell zur Regulation der Nitrogenase-Systeme in R. capsulatus.............................. 11
Abb. A-5: Modell zur NtrC-abhängigen Transkriptionsaktivierung............................................. 13
Abb. A-6: Aminosäure-Sequenz-Vergleich einiger H-NS-ähnlicher Proteine ............................. 16
Abb. A-7: Strukturelemente von H-NS......................................................................................... 17
Abb. A-8: Aminosäure-Sequenz-Vergleich von NrfA aus R. capsulatus und
A. caulinodans mit Hfq aus E. coli .............................................................................. 20
Abb. C-1: Schematische Darstellung zur Herstellung und Reinigung eines HvrA-His6Fusionsproteins.. .......................................................................................................... 44
Abb. C-2: Klonierungsstrategie zur Erzeugung eines hvrA-his6-Expressionsplasmides .............. 45
Abb. C-3: T7-Polymerase abhängige Expression des hvrA-his6-Gens ......................................... 46
Abb. C-4: Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus E. coli ................................................ 47
Abb. C-5: Molekulargewichtsanalysen des HvrA-His6-Fusions-Proteins mittels
MALDI-TOF................................................................................................................ 48
Abb. C-6: Erzeugung des R. capsulatus hvrA-his6-Expressionsstammes RA7 ............................ 50
Abb. C-7: Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus R. capsulatus ..................................... 51
Abb. C-8: Molekulargewichtsanalysen des HvrA-His6-Fusionsproteins mittels
MALDI-TOF................................................................................................................ 52
Abb. C-9: Bestimmung der NifH Menge aus verschiedenen Stämmen........................................ 54
Abb. C-10: Akkumulation von HvrA und HvrA-His6 ..................................................................... 55
Abb. C-11: Bindung von HvrA-His6 an den Promotor des β-Laktamase Gens (Pbla) ..................... 58
Abb. C-12: HvrA-Bindestudien mit dem nifH-Promotor (PnifH)...................................................... 61
Abb. C-13: HvrA-Bindestudien mit 32P-markierten Promotoren des β-Laktamase Gens
(Pbla) und des nifH-Gens (PnifH) ................................................................................... 62
Abb. C-14: HvrA-Bindestudien mit dem nifU2-rpoN-Promotor (PnifU2) ......................................... 64
Abb. C-15: HvrA-Bindestudien mit dem nifA1- (PnifA1) und nifB1-Promotor (PnifB) ....................... 65
Abb. C-16: Schematische Darstellung der Subfragmente des nifH-Promotors............................... 67
Abb. C-17: HvrA-Bindestudien mit dem nifH-Promotor (PnifH) und den Subfragmenten
PnifH-up und PnifH-down ................................................................................................ 68
Abb. C-18: Schematische Darstellung der Subfragmente des anfH-Promotors .............................. 70
Abb. C-19: HvrA-Bindestudien mit dem anfH-Promotor (PanfH) und den Subfragmenten
PanfH-up und PanfH-down................................................................................................ 71
Abb. C-20: Die ntr-Genregion aus R. capsulatus............................................................................ 73
Abb. C-21: Diazotrophes Wachstum des R. capsulatus Wildtyps und einer
nrfA-Mutante................................................................................................................ 74
Abb. C-22: Darstellung der ntr-Genregion aus R. capsulatus und des erzeugten
Plasmides pNAP1 ....................................................................................................... 77
Abb. C-23: Diazotrophes Wachstum des R. capsulatus Parentalstammes (∆nifHDK)
und einer nrfA-Mutante................................................................................................ 81
Abb. C-24: Akkumulation von HvrA .............................................................................................. 86
Abb. C-25: Regulation der hvrA-Genexpression und HvrA-Akkumulation in
Abhängigkeit des Umweltfaktors Licht ....................................................................... 88
IV
Abbildungsverzeichnis
Abb. D-1: Die ntr-Genregion verschiedener Organismen ............................................................ 90
Abb. D-2: Modell zur Rolle von NrfA bei der Regulation der beiden NitrogenaseSysteme in R. capsulatus ............................................................................................. 94
Abb. D-3: Modell zur HvrA-vermittelten regulatorischen Koppelung zwischen
Photosynthese und Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus............................................ 97
Abb. D-4: Aminosäuresequenzvergleich zwischen dem NifH- und HvrA-Protein .................... 100
Abb. D-5: Modell zur Funktion von HvrA bei der Licht-abhängigen Regulation der
nifH-Genexpression ................................................................................................... 105
Abb. D-6: Lokalisation der putativen initialen HvrA-Bindestelle in der nifH- und
anfH-Promotorregion ................................................................................................. 108
Abb. D-7: Modell zur Funktion von IHF, NrfA und HvrA bei der Regulation der
Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus......................................................................... 110
V
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. A-1: Nukleoid-assoziierte Proteine aus E. coli...........................................................14
Tab. C-1: Errechnetes und experimentell bestimmtes Molekulargewicht (MW)
des aus E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins.....................................48
Tab. C-2: Experimentell bestimmte Molekulargewichte (MW) der aus R. capsulatus
und E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteine ..........................................52
Tab. C-3: cis-Elemente der nif- und anf-Promotorregionen ...............................................60
Tab. C-4: Aktivität der Molybdän-Nitrogenase in einer nrfA-Mutante..............................75
Tab. C-5: Komplementation einer nrfA-Mutation durch pNAP1 (nrfA+)...........................78
Tab. C-6: Die Rolle von NrfA bei der Regulation der nif-Genexpression .........................79
Tab. C-7: Aktivität der alternativen Nitrogenase in einer nrfA-Mutante............................81
Tab. C-8: Die Rolle von NrfA bei der Regulation der anf-Genexpression ........................83
Tab. C-9: Die Rolle von NrfA bei der Regulation der Expression von hvrA .....................85
VI
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A. bidest.
A. dest.
Amp
APS
ADP
ATP
bp
BSA
C
Cm
Da
DMF
DNA
dNTP
EBP
EDTA
Fe
FeFeco
FeMoco
FeVco
g
h
kb
Km
l
M
min
MW
N
o.D.
Aqua bidestillata (zweifach destilliertes Wasser)
Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Ampicillin
Ammoniumpersulfat
Adenosin-5‘-Diphosphat
Adenosin-5‘-Triphosphat
Basenpaare
Rinderserumalbumin
Celsius
Chloramphenicol
Dalton
Dimethylformamid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonukleosid-5‘-Triphosphat
Enhancer-Bindeprotein
Ethylendiamintetraessigsäure
Eisen
Eisen-Eisen-Kofaktor
Eisen-Molybdän-Kofaktor
Eisen-Vanadium-Kofaktor
Gramm
Stunde
Kilobasen
Kanamycin
Liter
molar
Minute
Molekulargewicht
Stickstoff
optische Dichte
ONPG
ortho-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid
RNA
RNase
rpm
sec
SDS
Sm
Spc
Tc
TEMED
Tris
Ribonukleinsäure
Rinonuklease
Umdrehungen pro Minute
Sekunden
Natriumdodecylsulfat
Streptomycin
Spectinomycin
Tetracyclin
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
Trishydroxymethylaminomethan
VII
Abkürzungsverzeichnis
Tween
U
UAS
ü/N
UV
V
v/v
w/v
Polyoxyethylensorbitolmonolaurat
Unit
upstream activator sequence
über Nacht
Ultraviolett
Volt
Volumen pro Volumen
Gewicht pro Volumen
X-Gal
5-Bromo-4-Chloro-3-Indodyl-β-D-Galaktopyranosid
VIII
Einleitung
A
1
Einleitung
Die biologische Stickstoff-Fixierung
Neben Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff ist Stickstoff eines der häufigsten
Elemente in organischen Verbindungen. Dabei ist der Stickstoff Bestandteil vieler Klassen
von Makromolekülen wie Proteinen, Nukleinsäuren sowie Kofaktoren von Enzymen. Viele
Organismen decken ihren Stickstoffbedarf durch die Aufnahme von den in der Nahrung
enthaltenen organischen Stickstoffverbindungen. Pflanzen sind dagegen in der Lage, ihren
Bedarf an N-Quellen durch die Aufnahme von z.B. Ammonium oder Nitrationen aus dem
Boden zu decken. Neben den Pflanzen konkurrieren auch im Boden lebende
Mikroorganismen um die verschiedenen Stickstoffquellen. Somit stellt die verfügbare
Menge von Ammonium und Nitrat für das Wachstum der verschiedenen Organismen ein
limitierenden Faktor dar.
Durch die Aktivität von denitrifizierenden Bakterien gehen ca. 200 Mio. Tonnen Stickstoff
pro Jahr als N2-Gas in die Atmosphäre über. Nicht zuletzt deswegen besteht die
Erdatmosphäre zu 78 % aus gasförmigen Stickstoff. Durch zwei Prozesse wird die
Rückführung der für die belebte Natur wichtigen reduzierten Stickstoffverbindungen
gewährleistet: In der Erdatmosphäre führen Blitze durch ihre hohe Energie zur Bildung
von Stickoxiden (NOx), die durch Regen wieder in die Erdkruste zurückgeführt werden.
Darüber hinaus führt die Aktivität von prokaryontischen Mikroorganismen zur
Umwandlung von Luft-Stickstoff (N2) in Ammoniak (NH3), welcher dadurch „fixiert“
wird. Diese Fähigkeit ist nur auf wenige Bakterien, den sog. diazotrophen Prokaryonten,
beschränkt
und
stellt
eine
bedeutende
Rolle
bei
der
Aufrechterhaltung
des
Stickstoffkreislaufes auf der Erde dar. Die N2-Fixierer lassen sich in zwei Gruppen
unterteilen: die freilebend, diazotroph wachsenden Prokaryonten und die symbiotischen
N2-Fixierer. Die Fähigkeit N2 zu fixieren beruht auf dem Besitz eines hoch konservierten
Enzymsystems, dem Nitrogenase-Komplex, der allen diazotrophen Organismen zu eigen
ist. Das Nitrogenase-System katalysiert die Umwandlung von dem äußerst inerten N2-Gas
in Ammoniak. In Anbetracht der Tatsache, dass die Reduktion von N2 durch das 1910
entwickelte Haber-Bosch-Verfahren hoher Drücke und Temperaturen (300-1000 atm,
500°C) bedarf, ist es sehr bemerkenswert, dass Mikroorganismen dieses Enzymsystem
entwickelt haben, das bei gemäßigten Temperaturen und dem atmosphärischen Druck
(20-30°C und 1 atm) die gleiche Reaktion katalysiert.
1
Einleitung
1.1
Der Nitrogenase-Enzymkomplex
Das für die biologische Stickstoff-Fixierung verantwortliche Nitrogenase-System ist in
allen diazotrophen Organismen strukturell und funktionell gleich und besteht aus zwei
Komponenten. Die Dinitrogenase (Komponente I) katalysiert die Reduktion des
molekularen Stickstoffs zu NH3 , während die Dinitrogenase-Reduktase (Komponente II)
als Elektronendonor der Dinitrogenase fungiert. Die Reduktion von N2 zu NH3 erfolgt
unter Mg-ATP Verbrauch nach folgender Reaktionsgleichung:
N2 + 8 e– + 8 H+ + 16 Mg-ATP ⇒ 2 NH3 + H2 + 16 Mg-ADP + 16 Pi
Die Dinitrogenase-Reduktase besteht aus einem γ2-Homodimer, dessen Untereinheiten
durch das nifH-Gen kodiert werden und je ein Molekulargewicht (MW) von 32 kDa
aufweisen. Neben zwei ATP-Bindestellen, die jeweils auf die beiden Untereinheiten
verteilt sind, bindet die Komponente II auch einen [4Fe-4S]-Cluster, der durch CysteinReste der beiden Untereinheiten koordinativ gebunden ist (Georgiadis et al. 1992). Die
Funktion der Dinitrogenase-Reduktase besteht in einer Mg-ATP-abhängigen Übertragung
von Elektronen auf die Dinitrogenase in „Ein-Elektronen-Schritten“. Die Dinitrogenase
stellt im Gegensatz zur Dinitrogenase-Reduktase ein Heterotetramer dar, welches sich aus
zwei α- und aus zwei β-Untereinheiten zusammensetzt (Abb. A-1). Diese Untereinheiten,
die je ein MW von 54 kDa bzw. 58 kDa aufweisen, werden von den Strukturgenen nifD
und nifK kodiert (Kim und Rees 1992). Die Dinitrogenase enthält zwei unterschiedliche
Kofaktoren, je zwei als P-Cluster bezeichnete [8Fe-7S]-Komplexe und zwei EisenMolybdän-Kofaktoren (FeMoco; Chan et al. 1993, Peters et al. 1997, Dean et al. 1993).
Während die P-Cluster zwischen den α- und β-Untereinheiten lokalisiert sind, befinden
sich die FeMo-Kofaktoren nur innerhalb der α-Untereinheit (Kim und Rees 1994). Der
FeMoco ist ein Komplex, der neben 7 Eisen- und 9-Schwefelatomen noch das
Spurenelement Molybdän sowie Homocitrat enthält. Der FeMoco stellt das aktive Zentrum
der Nitrogenase dar, an dem die Reduktion von N2 erfolgt (Dean et al. 1993, Kim und Rees
1994).
Neben der konventionellen Mo-Nitrogenase können auch einige diazotrophe Organismen
unter Molybdän-Mangelbedingungen Stickstoff über eine Mo-freie Nitrogenase reduzieren. Dieser als „alternative Nitrogenase“ bezeichnete Enzymkomplex unterscheidet sich
vom Mo-Nitrogenase-Komplex durch die Struktur und die Metallzusammensetzung des
Kofaktors. Neben den α- und β-Untereinheiten besitzt der Dinitrogenase-Komplex des
2
Einleitung
alternativen Systems noch zwei δ-Untereinheiten, die essentiell für die Aktivität des
Enzymkomplexes sind (Eady et al. 1987, Chisnell et al. 1988, Waugh et al. 1995). Je nach
Metallatom, welches in den Kofaktor der alternativen Nitrogenase koordiniert ist, wird
diese als Vanadium-Nitrogenase oder Eisen-Nitrogenase bezeichnet. Die Apoproteine
dieser Nitrogenase-Systeme werden durch die Strukturgene vnfHDGK (vanadium
dependent nitrogen fixation) bzw. anfHDGK (alternativ nitrogen fixation) kodiert. Eine
Übersicht über den Aufbau verschiedenen Nitrogenasen gibt die Abbildung A-1.
Eine Heterometall-freie alternative Nitrogenase ist z.B. für R. capsulatus (Schneider et al.
1991 a, Schüddekopf et al. 1993) und Rhodospirillum rubrum (Lehmann und Roberts
1991, Davis et al. 1996) beschrieben worden, während eine Vanadium-abhängige
Nitrogenase u.a. in dem Cyanobakterium Anabena variabilis (Thiel 1993) und dem
Archaea Methanosarcina barkeri vorkommt (Chien et al. 2000). In Azotobacter vinelandii
konnten, als bisher einzigem Organismus, neben der konventionellen Mo-Nitrogenase auch
die beiden aufgeführten alternativen Nitrogenasen identifiziert werden (Robson et al. 1989,
Bishop und Premakumar 1992, Loveless und Bishop 1999).
Zu den enzymatischen Eigenschaften der Nitrogenasen gehört, dass die Enzyme neben der
Reduktion von elementarem Stickstoff zu Ammonium in einer Nebenreaktion auch Protonen zu molekularem H2 reduzieren. Darüber hinaus weisen die Nitrogenasen eine geringe
Substratspezifität auf. Neben N2 (N≡N) können auch andere Verbindungen mit einer
Dreifachbindung wie z.B. Cyanid (C≡N–) und Acetylen (HC≡CH) von den Nitrogenasen
reduziert werden. Während die Mo-Nitrogenasen die Fähigkeit zur Reduktion von
Acetylen zu Ethylen (H2C=CH2) aufweisen, besitzen die alternativen Nitrogenasen die
Eigenschaft, Acetylen in ein Gemisch aus Ethylen und Ethan (H3C-CH3) umzusetzen
(Dilworth et al. 1988). Da sowohl das Substrat Acetylen als auch die Produkte Ethylen und
Ethan leicht gaschromatographisch bestimmt werden können, ist dieses Testsystem zu
einem Standardverfahren geworden, um schnell und einfach die in vivo NitrogenaseAktivität von N2-fixierenden Organismen bestimmen zu können.
3
Einleitung
e−
α
γ
e−
4Fe-4S
γ
Ferrodoxin/
Flavodoxin
ATP
β
P
P
β
α
ADP+Pi
Dinitrogenase-Reduktase
Dinitrogenase
(NifH)
(NifDK)
δ
e−
α
γ
e−
4Fe-4S
γ
Ferrodoxin/
Flavodoxin
P
P-Kluster
ATP
β
P
P
β
ADP+Pi
C2H4
C2H2
2H+
N2
NH3
H2
C2H4
C2H6
α
δ
Dinitrogenase-Reduktase
Dinitrogenase
(VnfH, AnfH)
(VnfDGK, AnfDGK)
FeMoco
NH3
H2
C2H2
2H+
N2
FeVco
FeFeco
Abb. A-1: Schematische Darstellung der Nitrogenase-Enzymkomplexe
Die an der Nitrogenase-Reaktion beteiligten Proteine und der Elektronenfluss zur Dinitrogenase sind
schematisch dargestellt.
2
Das phototrophe Purpurbakterium Rhodobacter capsulatus
R. capsulatus ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium, das zu den
Rhodospirillaceae gehört und daher taxonomisch der α-Gruppe der Proteobakterien
zugeordnet wird. Die wissenschaftliche Bezeichnung von R. capsulatus ist auf zwei
augenscheinliche Merkmale, die auffällige rötliche Pigmentierung und die Ausbildung
einer Polysaccharidkapsel, zurückzuführen. Das erst genannte Merkmal steht im Zusammenhang mit einer wesentlichen Stoffwechselleistung, die der Organismus ausführen kann.
Unter anaeroben Bedingungen kann R. capsulatus durch anoxygene Photosynthese
Energieäquivalente (ATP) generieren, die dann u.a. genutzt werden, um Kohlendioxid
(CO2) als Kohlenstoffquelle zu assimilieren. Darüber hinaus kann R. capsulatus weitere
Kohlenstoffquellen wie z.B. Carbonsäuren heterotroph nutzen (Stahl und Sojka 1973).
4
Einleitung
Zudem ist R. capsulatus auch in der Lage, eine Vielzahl von Stickstoffquellen wie z.B.
Aminosäuren, Ammonium, Purine, Harnstoff und sogar molekularen Stickstoff (N2) zu
verwerten. Die Fähigkeit, N2 zu fixieren, ist in R. capsulatus auf die Anwesenheit von zwei
Enzymsystemen, der konventionellen Molybdän-haltigen Nitrogenase und der alternativen
Eisen-Nitrogenase zurückzuführen (Masepohl und Klipp 1996). Da die StickstoffFixierung nur unter hohem Energieaufwand möglich ist und deshalb eine sehr große
Menge an ATP benötigt wird, ist dieser Prozess in R. capsualtus energetisch und auch
regulatorisch an die anoxygene Photosynthese gekoppelt (Joshi und Tabita 1996, Kern et
al. 1998, Elsen et al. 2000). Somit sind R. capsulatus drei wichtige Stoffwechselleistungen
der belebten Natur zu eigen: die Photosynthese, die CO2-Assimilation und die StickstoffFixierung. Diese vielseitigen Stoffwechselleistungen und die damit verbundene
regulatorische Vernetzung weisen R. capsulatus als ein interessantes Objekt der
molekularbiologischen Forschung aus.
2.1
Die bakterielle Photosynthese in R. capsulatus
Neben allen höheren Pflanzen und Algen sind auch prokaryontische Organismen in der
Lage,
Photosynthese
zu
betreiben.
Diese
Fähigkeit
weisen
Chloroxybakterien,
Cyanobakterien, Rhodospirilalles (Purpur- und Grüne Bakterien) sowie Halobakterien auf.
In R. capsulatus besteht der Photosyntheseapparat aus einem Photosystem (PS), welches
dem PSII höherer Pflanzen ähnelt und sich aus den beiden membrangebundenen
Lichtsammelkomplexen (LH-Komplex I und II) und einem Reaktionszentrum (RC)
zusammensetzt. Im RC führt die Lichtenergie zur Abgabe eines Elektrons vom „speziellen
Paar“ der Bakteriochlorophyll-Moleküle, was letztendlich über einen zyklischen
Elektronenfluss zum Aufbau eines Protonengradienten führt, welcher genutzt wird, um
ATP über eine ATP-Synthetase (ATPase) zu synthetisieren. Da in diesem Prozess kein O2
freigesetzt wird, spricht man von der anoxygenen Photosynthese. In R. capsulatus sind die
für die Photosynthese relevanten Gene in einer 46 kb umfassenden Genregion im
Chromosom lokalisiert. (Youvan und Bauer 1985, Zsebo und Hearst 1984, Yang und
Bauer 1990, Armstrong et al. 1989, Young et al. 1989). Diese Gene kodieren für Proteine
der Bacteriochlorophyllbiosynthese (bch-Gene), der Carotinoidbiosynthese (crt-Gene), der
Lichtsammelkomplexe I und II (puf- und puc-Gene) und für das Reaktionszentrum (puhGene). Die Expression der Photosynthesegene puf, puh und puc erfolgt nur unter
anaeroben Bedingungen (Bauer und Bird 1996, Gregor und Klug 1999) und wird über ein
Zwei-Komponenten-Regulationssystem (RegB/RegA) kontrolliert. Bei dem RegB-Protein
5
Einleitung
handelt es sich um eine membrangebundene Sensorkinase, welche unter anaeroben
Bedingungen autophosphoryliert wird (Inoue et al. 1995). Die Phosphatgruppe wird dann
auf den Transkriptionsaktivator RegA (RegA-P) übertragen, der die Expression der
photosynthetischen Gene herbeiführt (Sganga und Bauer 1992, Mosley et al. 1994, Du et
al. 1998). Im Bereich der puf- und puc-Promotoren wird dieses durch eine direkte Bindung
von RegA-P an eine RegA-Bindestelle herbeigeführt (Abb. A-2; Bowman et al. 1999).
regB
ADP
RegB
ATP
RegB
senC
regA
hvrA
Pi
RegA
-P
RegA -P
HvrA
−O2
+
puc
+
puf
Schwachlicht
+
puh
Abb. A-2: Modell der Sauerstoff- und Licht-abhängigen Regulation der PhotosyntheseGene in R. capsulatus
Die Abbildung stellt schematisch die RegB/A- und HvrA-vermittelte Regulation der puc-, puf- und puhTranskription dar. Im oberen Teil der Abbildung ist die Organisation des regulatorischen PhotosyntheseGenklusters aus R. capsulatus gezeigt. Die Erläuterung des Regulationsmodells erfolgt im Text. Das senCGen kodiert für einen möglichen Regulator, der an der RegB/A-Signaltransduktion beteiligt ist (Buggy und
Bauer 1995).
Eine Repression der Transkription wird unter aeroben Bedingungen durch
das CrtJ-
Protein gewährleistet (Ponnampalam et al. 1995, Ponnampalam und Bauer 1997, Elsen et
al. 1998, Masuda et al. 2002). CrtJ bindet direkt an die CrtJ-Bindestelle, die stromaufwärts
der puc-Gene lokalisiert ist, und führt so zu einer Repression der genannten Gene
(Bowman et al. 1999). In einer jüngst erschienenen Studie konnte ein weiteres
Regulatorprotein identifiziert werden, welches bei Anwesenheit von Sauerstoff die pufund puc-Gene des Photosynthese-Apparates reprimiert (Dong et al. 2002). Dieser zweite
Sauerstoff-Repressor, AerR (aerobic repressor) kann mit CrtJ das gemeinsam regulierte
Gen (puc) kooperativ reprimieren. Neben der Sauerstoff-kontrollierten Synthese des
Photosystems besitzt auch die Lichtintensität einen modulierenden Einfluss auf die
Expressionsrate der Photosynthese-Gene. Dabei wird bei einer geringen Lichteinstrahlung
die RegA-abhängige Transkriptionsaktivierung der puf- und puh-Gene, jedoch nicht der
6
Einleitung
puc-Gene, durch den DNA-bindenden Schwachlichtaktivator HvrA zusätzlich verstärkt
(A-2; Buggy et al. 1994). Über den genauen Mechanismus der HvrA-vermittelten, Licht
abhängigen Signaltransduktion ist bisher noch wenig bekannt. In neueren Untersuchungen
wird angenommen, dass HvrA mit dem phosphorylierten RegA (RegA-P) interagiert
(Swem und Bauer 2002). Ob diese Interaktion die Grundlage der HvrA-vermittelten
Signaltransduktion ist, konnte bisher noch nicht geklärt werden.
Das HvrA-Protein weist hohe Ähnlichkeit zu den DNA-bindenden Proteinen H-NS
(histone-like nucleoid structuring protein) aus E. coli und SPB aus Rhodobacter
sphaeroides (Bertin et al. 1999), einem nahen Verwandten von R. capsulatus, auf. Jedoch
fungiert SPB im Gegensatz zu HvrA als Starklichtrepressor (Shimada et al. 1996). Das
hvrA-Gen in R. capsulatus ist in einem policistronischen Operon stromabwärts von senC
lokalisiert (Abb. A-2). Die Transkription des senC-regA-hvrA-Operons und die des regBGens erfolgt von überlappenden Promotoren aus. Die –35/–10 Konsensusregionen beider
Promotoren sind in räumlicher Nähe diametral zueinander angeordnet. In einem
autoregulatorischen Prozess reprimiert RegA-P die Expression der Gene senC-regA-hvrA
und des regB-Gens und induziert gleichzeitig die Expression der oben genannten
photosynthetischen Gene (Du et al. 1999). Darüber hinaus beeinflusst HvrA, in
Abhängigkeit von der Lichtintensität, negativ die Expression des eigenen Operons
(Drepper 2000).
2.2
Die Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus
R. capsulatus verfügt über eine Molybdän-haltige und eine heterometall-freie Nitrogenase,
welche die Fixierung von atmosphärischem Stickstoff unter phototrophen, anaeroben
Bedingungen und in Abwesenheit von gebundenem Stickstoff ermöglicht. Die Forschung
verschiedener Arbeitsgruppen hat in den letzten zwei Dekaden an die 50 nif-Gene (nif:
nitrogen fixation), die für die Synthese und die Regulation der Nitrogenase-Systeme
erforderlich sind, identifiziert (Willison et al. 1985, Klipp et al. 1988, Masepohl und Klipp
1996). Die nif-Gene sind in R. capsulatus in drei Genbereichen (A, B und C) organisiert,
die im Chromosom weit voneinander entfernt lokalisiert sind (Abb. A-3; Fonstein et al.
1992). Die an der Stickstoff-Fixierung beteiligten Gene lassen sich folgenden
Funktionsbereichen zuordnen:
(i)
Strukturgene der Nitrogenase,
(ii)
Gene der Kofaktorbiosynthese,
(iii)
Gene des Elektronen-übertragenden Systems,
7
Einleitung
(iv)
regulatorische Gene,
(v)
Gene des Molybdat-Aufnahmesystems.
A
rnfH rnfE nrfG
nifE
rnfD
nifN
rnfC
nifX
rnfB rnfA
fdxB nifQ
orf4
orf14
fdxN
fdxC
nifU1 nifS
orf6
rnfF
orf10
nifV
nifW
nifA1
nifB1
B
fdxD
modD
nifH
modC
nifD
modB
nifK
modA
nifU2
mopA
rpoN
(nifR4)
mopB
nifA2
orf24
orf25
nifB2
metRS
C
nifR3
ntrB
anfA
anfH
ntrC
ntrY
ntrX
nrfA
D
anfD
anfG anfK
anf1 anf2 anf3
Elektronentransport
Regulation
Mo-Transport
Kofaktorbiosynthese
Struktur
Unbekannte Funktion
Abb. A-3: Organisation der Genregionen für die Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus
In der Abbildung sind die nif-, anf- und nif-assoziierten Gene in den Regionen A, B, C und D dargestellt. Die
Pfeile symbolisieren Anordnung, Maßstab und Orientierung der Gene.
8
Einleitung
In einer vierten Genregion (Region D, Abb. A-3) befinden sich die anf-Gene, die für den
spezifischen Transkriptionsaktivator AnfA und die Apoproteine der alternativen Nitrogenase kodieren (Schüddekopf et al. 1993).
Im Gegensatz zu allen bisher bekannten N2-fixierenden Organismen liegen in
R. capsulatus die Gene nifA (nifA1, nifA2) dupliziert vor (Klipp et al. 1988, Masepohl et al.
1988, Preker et al. 1992). Dabei unterscheiden sich nifA1 und nifA2 lediglich in den ersten
57, bzw. 66 Basenpaaren (Paschen 1997).
Der hohe Energiebedarf der Stickstoff-Fixierung, die extreme Sauerstoffempfindlichkeit
der Nitrogenasen und die Vielzahl der an der N2-Fixierung beteiligten Gene setzen eine
strikte Regulation voraus. In R. capsulatus erfolgt die Regulation der nif- und anf-Gene auf
drei verschiedenen Ebenen (Abb. A-4; Masepohl et al. 2002). Auf einer ersten
übergeordneten Ebene erfolgt eine N-Kontrolle durch das globale Ntr-System (nitrogen
regulation), welches dem enterobakteriellen Ntr-System sehr ähnelt (Kranz und FosterHartnett 1990). In Enterobakterien besteht dieses System aus einer bifunktionalen
Uridylyltransferase / Uridylyl-entfernendem Enzym (GlnD), einem trimeren signaltransduzierenden Protein PII (GlnB), dem PII paralogen Protein GlnK und einem ZweiKomponenten-Regulationssystem, NtrB/C (Merrick und Edwards 1995, Arcondéguy et al.
2001). In Abhängigkeit vom Glutamin / α-Ketoglutarat-Verhältnis, wird PII reversibel über
die Uridylyltransferase-Aktivität von GlnD uridylyliert (Kamberov et al. 1994, 1995, Jiang
et al. 1998 a, b). Unter Stickstoffmangel (Glutamin / α-Ketoglutarat-Verhältniss niedrig)
liegt PII uridylyliert vor und ist nicht in der Lage, mit NtrB zu interagieren. Dadurch kann
NtrB in seiner Funktion als Kinase den Response-Regulator NtrC phosphorylieren,
welcher dann als Transkriptionsaktivator die Expression der Zielgene herbeiführt. Da R.
capsulatus all die Komponenten des enterobakteriellen Ntr-Systems aufweist, wird davon
ausgegangen, dass auch in R. capsulatus ein ähnlicher regulatorischer Mechanismus
besteht (Masepohl et al. 2002).
Unter Stickstoff-Mangel aktiviert NtrC-P (Cullen et al. 1996) u.a. die Expression der
duplizierten Gene nifA1 und nifA2 (Abb. A-4). In einer Studie konnte gezeigt werden, dass
die Transkription der beiden nifA-Gene in R. capsulatus durch die σ70-abhängige RNAPolymerase ausgeführt wird (Foster-Hartnett und Kranz 1994, Bowman und Kranz 1998).
Dies ist eine Besonderheit von R. capsulatus, da in allen anderen bislang untersuchten
Bakterien das phosphorylierte NtrC-Protein stets σ54-abhängige Promotoren aktiviert. Wie
die nifA-Expression unterliegt auch die anfA-Genexpression einer Ammonium-Kontrolle
durch das Ntr-System. Zusätzlich wird durch die Molybdat-Repressoren MopA und MopB
9
Einleitung
eine Molybdän-abhängige Kontrolle vermittelt (Wang et al. 1993, Kutsche et al. 1996). Die
zentralen Transkriptionsaktivatoren NifA und AnfA führen dann zusammen mit der σ54abhängigen RNA-Polymerase zur Transkription der nif- respektive anf-Gene (Abb. A-4).
Die Expression des für den σ54-Faktor kodierenden Gens rpoN, welches homolog zum
ntrA-Gen aus anderen Organismen ist, wird über NifA und AnfA durch einen
autoregulatorischen Mechanismus kontrolliert (Cullen et al. 1994). Auf der zweiten
Regulationsebene wird die Aktivität der NifA-Aktivatorproteine durch Sauerstoff und
gebundenen Stickstoff kontrolliert (Hübner et al. 1993). Die nifA-Genprodukte gehören zu
der Gruppe der Sauerstoff-sensitiven NifA-Proteine, da sie für diese Proteine
charakteristische Sequenzelemente enthalten (Fischer 1994). Dass auf dieser zweiten
regulatorischen Ebene auch NH4+ einen Einfluss auf die NifA-vermittelte nifGenexpression hat, konnte mit Hilfe eines konstitutiv exprimierten nifA1-Gens
nachgewiesen werden (Hübner et al. 1993, Kern et al. 1998). In neueren Untersuchungen
konnte gezeigt werden, dass die N-Kontrolle der NifA-Aktivität in einer glnB / glnKDoppelmutante völlig aufgehoben ist (Drepper 2000, Groß 2002).
10
Einleitung
Ebene 1
Pi
NtrC
NtrB -P
ADP
ATP
NtrB
NtrC -P
GlnB
−NH4+
σ70
- UMP
−NH4+
Ebene 2
+
+
+
nifA1
−
−
NifA1
nifA2
+
GlnK
σ54
−NH4
+
+
nif-Gene
rpoN
+
σ54
anf-Gene
NifH
ADP-R
NifH
NAD
DraT
Nikotinamid
−NH4+
- NH4+/
Dunkelheit
Licht
DraG
σ54
+ NH4+/
- NH4+/
ADP-R
+ Mo
AnfA
GlnB
+
mopAmod
MopA
NifA2
Ebene 3
+
anfA
Licht
AnfH
ADP-R
ADP-R
DraG
AnfH
Abb. A-4: Modell zur Regulation der Nitrogenase-Systeme in R. capsulatus
Die Abbildung fasst schematisch die auf drei Ebenen erfolgende Regulation der beiden Nitrogenase-Systeme
in R. capsulatus zusammen. Eine Beschreibung des Modells erfolgt im Text. Die jeweiligen physiologischen
Voraussetzungen für den regulatorischen Effekt sind durch die Boxen hervorgehoben. Der durchgekreuzte
Pfeil deutet an, dass der Signaltransduktor keinen Einfluss auf den entsprechende Kontrollmechanismus
ausübt. (+): positiver Einfluss, (–): negativer Einfluss
Desweiteren werden in R. capsulatus auf einer dritten regulatorischen Ebene die
Aktivitäten der beiden Nitrogenase-Enzym-Komplexe in Abhängigkeit von Ammonium
und Licht posttranslational reguliert (Masepohl et al. 1993). Diese Regulation basiert auf
einer reversiblen Modifizierung der Dinitrogenase-Reduktase. Eine der beiden
Untereinheiten wird an einem spezifischen Arginin-Rest (Arg102) kovalent mit einer ADPRibosegruppe modifiziert (Pierrard et al. 1993). Diese reversible Modifikation wird in
Gegenwart von Ammonium und bei Dunkelheit durch das DraT-Enzym (DinitrogenaseReduktase ADP-Ribosyltransferase) katalysiert und dient der schnellen Inaktivierung
beider Nitrogenase-Systeme. Das DraG-Protein (Dinitrogenase-Reduktase aktivierende
11
Einleitung
Glycohydrolase) kann unter geeigneten Bedingungen durch hydrolytische Abspaltung der
ADP-Ribose die Dinitrogenase-Reduktase wieder reaktivieren.
2.3
Die Aktivatorfamilie der „Enhancer-Bindeproteine“
Die an der Regulation der Stickstoff-Fixierung beteiligten Transkriptionsaktivatoren in
R. capsulatus und anderen diazotrophen Organismen gehören zur Familie der EnhancerBindeproteine (EBP), die auch als σ54-abhängige Aktivatoren bezeichnet werden (Morett
und Segovia 1993, Fischer 1994, Shingler 1996). Zu den am meisten erforschten
Vertretern dieser Gruppe gehören der Response-Regulator NtrC und das NifA-Protein.
Alle σ54-abhängigen Aktivatoren besitzen drei funktionell unterschiedliche Domänen
(Morrett und Segovia 1993, Shingler 1996). Der C-Terminus dieser Regulatorproteine
weist ein Helix-Turn-Helix Motiv auf, das für die DNA-Bindung essentiell ist. Die
konservierte
zentrale
Domäne
ist
der
transkriptionsaktivierende
Bereich
der
Regulatorproteine, während die N-terminale Domäne für die Signaltransduktion nötig ist.
Alle σ54-abhängigen Aktivatoren binden an einer für sie spezifischen DNA-Bindestelle, die
als UAS (upstream activator sequence) oder ELE (enhancer-like element) bezeichnet wird.
Sie ist in der Regel 100 bis 200 bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes am zu
regulierenden Gen lokalisiert (Abb. A-5; Kustu et al. 1991, Morett und Segovia 1993). Die
Promotoren der durch die EBP aktivierten Gene unterscheiden sich deutlich von den
üblichen bakteriellen σ70-RNA-Polymerase-abhängigen Promotoren. Im Gegensatz zu der
sonst vorkommenden –35/–10-Konsensus-Region, die für die Erkennung der auch als
„housekeeping“-Polymerase bezeichneten σ70-RNA-Polymerase benötigt wird, besitzen
diese Promotoren eine hoch konservierte –24/–12-Region (Morett und Buck 1989). Nach
der Bindung der σ54-RNA-Polymerase an den Promotor verharrt das RNA-PolymeraseHoloenzym in einem stabilen geschlossenen Promotorkomplex. Erst durch die Interaktion
des RNA-Polymerase-Holoenzyms mit einem EBP wie NtrC, bzw. NifA wird in einem
ATP-abhängigen
Prozess
der
geschlossene
Nukleo-Protein-Komplex
in
einen
transkriptionsaktiven offenen Promotorkomplex überführt (Popham et al. 1989, Kustu et
al. 1991). Die Voraussetzung für eine Interaktion der EBP mit der RNA-Polymerase, die
räumlich getrennt an verschiedene Bereiche des Promotors gebunden haben, ist eine
Biegung der DNA zwischen der UAS und der RNA-Polymerase-Bindestelle. Eine solche
Biegung in der DNA wird häufig durch ein DNA-Bindeprotein, dem IHF (integration host
12
Einleitung
factor) geschaffen (Abb. A-5; Goosen und van der Putte 1995, Bertoni et al. 1998, Wassem
et al. 2000).
NtrC
+N
UA S
IHF
σ54 RNA-Pol
geschlossener
Promotorkomplex
-24/-12
-N
UA S
ATP
IHF
ADP
+ Pi
NtrC-P
σ54 RNA-Pol
offener
Promotorkomplex
-24/-12
mRNA
Abb. A-5: Modell zur NtrC-abhängigen Transkriptionsaktivierung
Die Abbildung stellt die Situation am Promotor eines NtrC-abhängigen Gens unter reprimierenden (+N) und
dereprimierenden (–N) Bedingungen modellhaft dar. Die Beschreibung des Aktivierungsmodells erfolgt im
Text. Der Pfeil markiert den Transkriptionsstartpunkt.
IHF: intergation host factor; UAS: upstream activator sequence
3
Nukleoid-assoziierte Proteine
3.1
Nukleoid-assoziierte Proteine aus E. coli
Prokaryontische und eukaryontische Organismen müssen die chromosomale DNA, in
einem relativ kleinen Raum, der Zelle oder dem Zellkern, unterbringen. Dieses
Raumproblem wird deutlich, wenn man bedenkt, dass E. coli mit einer Länge von ca. 3 µm
und einem Durchmesser von ca. 1 µm das 4,7 Mb große Chromosom, welches als
zirkuläres Molekül einen durchschnittlichen Durchmesser von 430 µm aufweist, in der
Zelle unterbringt (Pettijohn 1996). Dieses Problem wird dadurch gelöst, dass durch die
Bindung von meist kleinen Proteinen, die als Nukleoid-assoziierte Proteine bezeichnet
werden, die chromosomale DNA eine hoch geordnete Struktur annimmt. In Prokaryonten
wird diese strukturierte chromosomale DNA als Nukleoid bezeichnet (Pettijohn 1996).
Neben ihrer Funktion, die Struktur der DNA aufrecht zu erhalten, sind viele dieser
13
Einleitung
Nukeoid-assoziierten Proteine auch in essentielle Vorgänge der DNA, wie der Replikation,
der Rekombination und der Transkription, involviert (Azam und Ishihama 1999). Die
Bindung eines Nukleoid-assoziierten Proteins in der Nähe eines Promotors verändert nicht
nur lokal die Struktur der DNA, sondern kann auch dazu führen, dass die Expression eines
Gens positiv oder negativ moduliert wird. Von mittlerweile zwölf identifizierten Nukleoidassoziierten Proteinen aus E. coli stellen HU (heat-unstable nucleoid protein), IHF und
H-NS die am häufigsten in E. coli verkommenden Proteine dieser Klasse dar (Azam et al.
1999). Eine Übersicht gibt Tab. A-1.
Tab. A-1: Nukleoid-assoziierte Proteine aus E. coli
Anzahl ASa DNA-Bindungseigenschaften
Protein
Abkürzung
CbpA
curved DNA-binding protein A
297
nicht-spezifischb
CbpB
curved DNA-binding protein B
289
spezifisch
DnaA
DNA-binding protein A
467
spezifisch
Dps
DNA-binding protein from starved
cell
167
nicht-spezifische
Fis
factor for inversion stimulation
98
spezifisch
Hfq (HF-I)
host factor for phage Q
102
nicht-spezifischb
H-NS
histone-like nucleoid structuring
protein
137
nicht-spezifischb
HU-1
HU-2
IciA
α
IHFα
β
IHFβ
heat-unstable nucleoid protein
inhibitor of chromosom initiation
A
integration host factor
90
90
297
99
94
nicht-spezifisch
nicht-spezifischb
spezifisch (z.B. an σ54-Promotoren)
Lrp
leucin-responsive regulatory
protein
167
spezifisch
StpA
supressor of td phenotype A
133
nicht-spezifisch
a
b
AS: Aminosäuren, Struktur spezifische Bindung
HU und IHF
Bei dem HU-Protein aus E. coli handelt es sich um ein heterodimeres, basisches Protein,
das unspezifisch an die DNA bindet und negative Supercoils in relaxierte DNA einführen
kann. Es kommt in einer hohen Anzahl (mit einer Kopienzahl von ca. 30.000 Dimeren) in
der Zelle vor. Ein weiteres heterodimeres Protein ist der IHF, welcher zu HU eine hohe
Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz aufweist (ca. 30 %ige Identität, Schmid
1990). Aber im Gegensatz zu HU bindet IHF sequenzspezifisch an DNA (Yang und Nash
14
Einleitung
1989), wobei er eine aus 13 Basenpaaren bestehende Konsensussequenz erkennt
(WATCAANNNNTTR; W = A oder T, R = A oder G, N = beliebiges Nukleotid). Das
IHF-Protein ist an vielen verschiedenen Prozessen innerhalb der Bakterienzelle beteiligt.
Es spielt unter anderem eine wichtige Rolle bei der ortspezifischen Rekombination, der
DNA-Replikation, der Transposition und der Transkription. Der IHF ist ein globales
Regulatorprotein, das zusätzlich auch eine Funktion bei der Kondensation des bakteriellen
Nukleoids ausübt und Biegungen von 140 bis 160° in die DNA einführen kann (Arfin et al.
2000, Rice et al. 1996). In E. coli besitzt das IHF-Protein einen positiven oder negativen
Einfluss auf die Expression einer großen Anzahl von Genen (Goosen und van de Putte
1995). Vor allem ist der IHF aber bei der Regulation von σ54-abhängigen Genen in
Bakterien involviert (Santero et al. 1992, Pérez-Martin und de Lorenzo 1997).
H-NS
Eines der am besten charakterisierten Nukleoid-assoziierten Proteine, welches mit einer
Kopienzahl von 20.000 in der Zelle vorkommt, ist das Histon-ähnliche Protein H-NS
(Williams und Rimsky 1997, Azam et al. 1999). Dieses Protein ist an einer Vielzahl von
zellulären Prozessen wie der Regulation der Genexpression und der DNA-Kondensierung
beteiligt (Altung und Ingmer 1997). Dabei fungiert H-NS als globaler Modulator der
Genexpression von mehr als 50 Genen (Williams und Rimsky 1997, Barth et al. 1995,
Schröder und Wagner 2002). Es konnte gezeigt werden, dass H-NS sowohl als ein
negativer, als auch als ein positiver Modulator der Genexpression fungiert. Jedoch hat
H-NS in den meisten Fällen einen negativen Einfluss auf die Genexpression der Zielgene
(Altung und Ingmer 1997, Schröder und Wagner 2002). Überdies ist zu beobachten, dass
viele der Gene, die durch das H-NS-Protein reguliert werden, in Abhängigkeit von
verschiedenen Umweltparametern, wie z.B. Osmolarität, Temperatur und pH-Wert,
reguliert werden (Altung und Ingmer 1997, Hommais et al. 2001). Somit stellt H-NS einen
globalen Regulator dar, welcher gewährleistet, dass bei veränderten Umweltbedingungen
eine Adaptation des Zellstoffwechsel an die gegenwärtige Situation erfolgen kann. Im
Gegensatz zu dem IHF-Protein, dessen dreidimensionale Struktur aufgeklärt ist und dessen
DNA-bindende Sequenz identifiziert wurde, sind für H-NS keine DNA-bindenden
Sequenzen bekannt (Rice et al. 1996). Man weiß jedoch, dass H-NS als Homodimer an
gebogene DNA oder an AT-Reiche Sequenzen bindet und dort Kurvaturen einführt
(Bracco et al. 1989, Yamada et al. 1991, Williams und Rimsky 1997). Mittlerweile
konnten auch in anderen Enterobakterien Histon-ähnliche Proteine, bzw. H-NS-ähnliche
15
Einleitung
Proteine (beide Begriffe werden in der Literatur synonym verwendet) wie z.B. SPB aus
R. sphaeroides, HvrA aus R. capsulatus, BpH3 aus Bordetella pertussis und ein weiteres
aus E. coli stammendes Protein, das StpA, identifiziert werden (Abb. A-6; Altung und
Ingmer 1997, Dorman et al. 1999, Bertin et al. 1999, 2001, Goyard und Bertin 1997,
Shimada et al. 1996).
Ec
Ec
Bp
Rs
Rc
H-NS
StpA
BpH3
SPB
HvrA
MSEALKILNNIRTLRAQARECTLETLEEMLEKLEVVVNERREE
MSVMLQSLNNIRTLRAMAREFSIDVLEEMLEKFRVVTKERREE
MPR-----ENYAVLQAKIEK-EITKLKHKAE----ALHTRRRK
MDI-----D----LDSMSLK-ELKSLQAQVAKAISTYEDRRKR
MDI-----D------ALSLN-ELKALRSKVDRAIVTYEERKKK
ESAAAAE
EEQQQRE
PVIA--S
DALA--E
EAFA--E
50
50
38
38
36
Ec
Ec
Bp
Rs
Rc
H-NS
StpA
BpH3
SPB
HvrA
VEERTRKLQQYREMLIADGIDPNELLNSLAAVKSGTKAKRAQR
LAERQEKISTWLELMKADGINPEELLGNSSAAAPRAGKKRQPR
IVKSMREYNITPEEIAAAFGSAKSVRAPSAPVRRKAGAPVAKR
LEEKARELGFSLSELTGTAATKR------------------RA
LDEIARKMGYPLAEILTMVETKP------------------RK
PAKYSYV
PAKYKFT
AVAPKYR
AAQPKYA
TVAAKYA
100
100
88
70
68
Ec
Ec
Bp
Rs
Rc
H-NS
StpA
BpH3
SPB
HvrA
DENGETKTWTGQGRTPAVIKKAMDEQGKSLDDFLIKQ
DVNGETKTWTGQGRTPKPIAQALAE-GKSLDDFLI
HPQT-GETWSGRGKAPRWLAAEEAA-GAKRDSFLIRD
NPENPSDTWSGRGRKPRWFEAAIKS-GKPAESMAI
NPANPSETWTGRGRKPKWVEAALAS-GKSLEDLTI
137
134
123
104
102
Abb. A-6: Aminosäure-Sequenz-Vergleich einiger H-NS-ähnlicher Proteine
Der Aminosäure-Sequenzen-Vergleich der Proteine wurden mit Hilfe des ClustalW-Algorithmus erstellt
(Thomson et al. 1994). Die homologen Sequenzen der H-NS-ähnlichen Proteine sind durch Rahmen
gekennzeichnet. Ec: E. coli; Bp: B. pertussis; Rs: R. sphaeroides; Rc: R. capsulatus
Diese H-NS-ähnlichen Proteine weisen nicht nur eine ähnliche Proteinstruktur auf, sondern
scheinen auch in den einzelnen Organismen nach gleichen regulatorischen Mechanismen
zu wirken. So konnte bereits für HvrA aus R. capsulatus gezeigt werden, dass es eine
E. coli hns-Mutante zum Teil komplemetieren kann (Bertin et al. 1999). Die höchste
Sequenzhomologie zu H-NS weist mit 56 % das StpA-Protein aus E. coli auf. Aber im
Gegensatz zu H-NS schein das StpA hauptsächlich die Funktion eines RNA-Chaperons
einzunehmen (Zhang et al. 1996, Cusick und Belfort 1998, Williams und Rimsky 1997).
Die Bemühungen, in den letzten Jahren eine vollständige Protein-Struktur von H-NS zu
ermitteln, sind bisher fehlgeschlagen. Jedoch konnten sowohl mittels Kern-ResonanzSpektroskopie
(NMR),
als
auch
mit
Circular-Dichroismus-Spektroskopie
(CD-
Spektroskopie) Strukturdaten der N-terminalen und der C-terminalen Domänen ermittelt
werden (Smyth et al. 2000, Shindo et al. 1995, Shindo et al. 1999). Ausgehend von diesen
Daten wurde ein Strukturmodell entwickelt, welches in Abbildung A-7 dargestellt ist
(Schröder und Wagner 2002).
16
Einleitung
Loop 1
N
α1
α2
α3
Loop 1´ Loop 2
β1
Protein-Protein-Interaktion
β2
Loop 3
α4
α5
C
DNA-Bindung
1
64
79
137
Verbindungsdomäne
Abb. A-7: Strukturelemente von H-NS
Der obere Teil der Abbildung zeigt schematisch die bisher identifizierten strukturellen Elemente von H-NS
aus E. coli. Im unteren Teil sind die Domänen von H-NS abgebildet. Eine Erläuterung erfolgt im Text. Die
α-helikalen Regionen sind durch Boxen und β-Faltblattstrukturen durch Pfeile dargestellt. Die in dem Protein
identifizierten Loop-Strukturen sind als Schlaufen hervorgehoben. Die Abbildung wurde von Schröder und
Wagner (2002) übernommen und verändert, indem die wesentlichen Aspekte dargestellt werden.
An die N-terminale Domäne (von Aminosäure 1 – 64), die drei α-Helikale Regionen
enthält, schließt die Verbindungsdomäne an, welche keine auffallenden Strukturelemente
enthält. In der C-terminalen Domäne (Aminosäure 79 – 137) sind vier Schlaufen (Loops)
ausgebildet, die von β-Faltblattstrukturen und α-helikalen Regionen umgeben werden
(Abb. A-7). Aminosäure-Sequenzvergleichen zwischen den H-NS-ähnlichen Proteinen
(Abb. A-6) ist zu entnehmen, dass der C-Terminus aller H-NS-ähnlichen Proteine der
konservierteste Bereich ist. In StpA beträgt die Homologie der Aminosäuren 91 – 134
70 %, während die C-terminale Domänen von HvrA (61 – 102) und BpH3 (28 – 123) eine
40 %ige Homologie zu H-NS aufweisen (Bertin et al. 1999). Den beiden Domänen des
H-NS-Proteins (die N- und C-terminale Domäne) können auch unterschiedliche Funktionen zugeordnet werden. Verschiedene genetische Analysen haben gezeigt, dass die
DNA-Binderegion von H-NS auf den C-Terminus beschränkt ist. Für die direkte Bindung
des Proteins an die DNA ist jedoch nur der Loop 2 entscheidend, der von den Aminosäuren
108 - 117 gebildet wird, während die angrenzenden Strukturen eine stabilisierende
Funktion haben. Die N-terminale Domäne ist hingegen für die Protein-Protein-Interaktion
zwischen den H-NS-Proteinen essentiell.
17
Einleitung
Hfq
Ein weiterer Vertreter der Klasse der Nukleoid-assoziierten Proteine aus E. coli ist das
Hfq-Protein (HF-I), welches als ein Faktor identifiziert wurde, der bei der Replikation der
RNA des Bakteriophagen Qβ beteiligt ist (Kajitani und Ishihama 1991). Das Hfq-Protein
kann sowohl unspezifisch an gebogene DNA, als auch spezifisch an RNA-Moleküle
binden (Kajitani und Ishihama 1991, Azam und Ishihama 1999). Das Protein ist auch an
einer Vielzahl von regulatorischen Prozessen in E. coli beteiligt. Es spielt vor allem eine
wichtige Rolle bei der Kontrolle der Translation von mRNA-Molekülen, u.a. der rpoS- und
ompA-Transkripte, die für den σ-Faktor S und ein Membranprotein (outer membran
protein) kodieren (Muffler et al. 1996, Vytvytska et al. 2000). Durch die Bindung von Hfq
an die mRNA wird die sekundäre Struktur der RNA verändert, was im Fall der rpoSmRNA zu einer Aktivierung der Translation führt. Im Gegensatz dazu inhibiert Hfq die
Translation der ompA-mRNA durch einen ähnlichen Mechanismus. Der Umstand, dass
Hfq einen positiven Einfluss auf die rpoS-Translation nimmt und somit, wenn auch
indirekt, die Genexpression der ca. 50 σS-abhängigen Gene kontrolliert, erklärt die
Beobachtung, dass eine Mutation im hfq-Gen von E. coli zu pleiotropen Effekten führt
(Leowen et al. 1998).
3.2
Nukleoid-assozierte Proteine in R. capsulatus
Auch in R. capsulatus sind, wie bereits erwähnt, Nukleoid-assoziierte Proteine identifiziert
worden. Dabei handelt es sich um die Proteine IHF, HU, HvrA und NrfA, die eine hohe
Homologie zu den aus E. coli bekannten Proteinen IHF, HU, H-NS und Hfq aufweisen
(Toussaint et al. 1993, Buggy et al. 1994, Drepper et al. 2002). Wie in E. coli kodieren in
R. capsulatus zwei Gene (huA und huB) für das HU-Protein. Über die genaue Funktion
dieses Proteins in R. capsulatus ist bisher noch nicht viel bekannt. Jedoch liegen genauere
Kenntnisse zur Funktion der Proteine IHF und HvrA in R. capsulatus vor. Das IHF-Protein
liegt in R. capsulatus als Heterodimer vor und wird durch die Gene himA und hip kodiert,
die weit voneinander entfernt auf dem Chromosom lokalisiert sind (Toussaint et al. 1993).
Bereits 1985 konnte Mechulam zeigen, dass IHF scheinbar einen positiven Einfluss auf die
Hydrogenase-Aktivität hat. In weiteren Analysen konnte demonstriert werden, dass IHF an
den Promotor der Hydrogenase-Strukturgene (hupSL) binden kann und so einen positiven
Einfluss auf die Genexpression hat. Auch bei der Regulation der Stickstoff-Fixierung ist
IHF beteiligt. In einer R. capsulatus himA-Mutante ist sowohl die Aktivität der MoNitrogenase als auch die der alternativen Nitrogenase aufgehoben (Kutsche 1995, Simon
18
Einleitung
2002). In genetischen Untersuchungen mit geeigneten lacZ-Reportergenfusionen wurde
gezeigt, dass IHF einen positiven Einfluss auf die Expression der Strukturgene (nifHDK
und anfHDGK) der beiden Nitrogenase-Systeme hat (Kutsche 1995, Simon 2002).
Bei dem HvrA-Protein aus R. capsulatus handelt es sich um ein basisches Protein, welches
aus 102 Aminosäuren besteht. Erstmalig wurde HvrA in R. capsulatus als Schwachlichtaktivator der photosynthetischen puf- und puh-Gene beschrieben (Buggy et al. 1994).
Unter Schwachlichtbedingungen steigert HvrA die RegA-P-abhängige Expression dieser
Gene. In weiteren Analysen konnte demonstriert werden, dass HvrA einen Einfluss auf die
Regulation der Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus hat (Kern et al. 1998). Dabei wurde
HvrA ursprünglich als ein Faktor identifiziert, welcher die postranslationale N-Regulation
des Transkriptionsaktivators NifA aufhebt. Diese wurde mittels einer allgemeinen Tn5Zufallsmutagenese mit einem R. capsulatus Stamm, der ein konstitutiv exprimiertes nifA1Gen und eine nifH-lacZ-Reporter-Genfusion trägt, nachgewiesen. Die Insertion des Tn5Transposons in dem hvrA-Gen führte bei diesem Stamm in Gegenwart von Ammonium zu
einer gesteigerten nifH-Expression (Kern et al. 1998). Darüber hinaus war auch unter
Ammonium-Mangel eine deutlich gesteigerte nifH-Expression zu beobachten. Weitere
Analysen demonstrierten, dass HvrA nicht alle NifA-abhängigen nif-Gene beeinflusst,
sondern selektiv die Expression von nifH und nifB1 kontrolliert (Drepper 2000). So konnte
gezeigt werden, dass HvrA unabhängig vom Ammonium-Status der Zelle die
Genexpression von nifH negativ beeinflusst. Wie auch für H-NS aus E. coli beschrieben,
deuten diese Analysen an, dass HvrA aus R. capsulatus als übergeordneter Regulator die
Expression verschiedener Gene sowohl negativ (nif-Gene) als auch positiv (puf- und puhGene) modulieren kann. Aktuelle Untersuchungen zeigen, das HvrA auch in die
Regulation der Expression der Ubichinol-Oxidase-Gene (cydAB-Gene) und die
Cytochrom-cbb3-Oxidase-Gene (ccoNOPQ-Gene) involviert ist (Swem und Bauer 2002).
Auch diese Gene werden durch HvrA in unterschiedlicher Weise reguliert. Während HvrA
die Expression des ccoNOPQ-Operons positiv moduliert, wird die Genexpression des
cydAB-Operons durch HvrA negativ reguliert.
In R. capsulatus konnte außerdem noch ein weiteres Nukleoid-assoziiertes Protein
identifiziert werden, dessen Gen (nrfA) stromabwärts der ntr-Genregion lokalisiert ist
(Abb. A-3; Giaourakis 2000). Dabei handelt es sich um das basische, aus 77 Aminosäuren
bestehende NrfA-Protein, welches zu dem aus A. caulinodans bekannten NrfA und dem
Hfq aus E. coli eine hohe Homologie aufweist (Abb. A-8).
19
Einleitung
Rc-NrfA M A A D K - Q N L Q D A F L N H V R K T K V P V T I F L I N G V K L Q
Ac-NrfA M A A E R T Q N L Q D T F L N H V R K S K T P L T I F L V N G V K L Q
M A - - K G Q S L Q D P F L N A L R R E R V P V S I Y L V N G I K L Q
Ec-Hfq
34
35
33
Rc-NrfA G V I T W F D N F C V L L R R D G Q S Q L V Y K H A I S T I M P G S P
Ac-NrfA G V V T W F D N F C V L L R R D G H S Q L V Y K H A I S T I M P G H P
G Q I E S F D Q F V I L L K - N T V S Q M V Y K H A I S T V V P S R P
Ec-Hfq
69
70
67
Rc-NrfA I S L Y E G E D
Ac-NrfA V Q L F D P T D E V A S E K A
Ec-Hfq
V S H H S N N A G G G T S S N Y H H G S S A Q N T S A Q Q D S E E T E
77
85
102
Abb. A-8: Aminosäure-Sequenz-Vergleich von NrfA aus R. capsulatus und
A. caulinodans mit Hfq aus E. coli
Der Aminosäure-Sequenz-Vergleich der Proteine wurden mit Hilfe der ClustalW-Algorithmus erstellt
(Thomson et al. 1994). Die homologen Sequenzen der einzelnen Proteine sind durch Rahmen gekennzeichnet
(Drepper et al. 2002). Rc: R. capsulatus; Ac: A. caulinodans Ec: E. coli
Untersuchungen in A. caulinodans haben gezeigt, dass NrfA in die Regulation der
Stickstoff-Fixierung involviert ist (Kaminski et al. 1994). Eine nrfA-Mutante führt in
A. caulinodans zu einem Nif–-Phänotyp. Dabei scheint NrfA die Expression des
Transkriptionsaktivatorgens nifA zu kontrollieren (Kaminski und Elmerich 1998). Zu
Beginn dieser Arbeit war noch unklar, welche Funktion NrfA in R. capsulatus einnimmt.
4
Ziel der Arbeit
In R. capsulatus wird die Synthese und Aktivität der beiden Nitrogenase-Systeme durch
eine komplexe Regulationskaskade in Abhängigkeit von den Umweltfaktoren NH4+,
Sauerstoff und Licht auf drei verschiedenen Ebenen kontrolliert. An dieser Regulation sind
nicht nur die spezifischen Transkriptionsaktivatoren NtrB, NtrC, NifA1, NifA2 und AnfA
beteiligt, sondern auch Nukleoid-assoziierte Proteine wie HvrA.
Das vorrangige Ziel dieser Arbeit bestand in der Bearbeitung der folgenden
Fragestellungen:
-
Über welchen Mechanismus erfolgt die HvrA-vermittelte Regulation der nif-Gene?
(i)
Kann HvrA spezifisch an die Promotoren der nif-Gene und binden?
(ii)
Wird die Funktion von HvrA durch einen Modifikationsprozess beeinflusst?
(iii)
Wird die Aktivität von HvrA durch Umweltsignale beeinflusst?
-
Ist NrfA in R. capsulatus in die Regulation der Stickstoff-Fixierung involviert?
(i)
Welche Rolle spielt NrfA bei der Regulation der Stickstoff-Fixierung?
(ii)
Auf welcher regulatorischen Ebene beeinflusst NrfA die Genexpression der
Stickstoff-Fixierung?
20
Material und Methoden
B
Material und Methoden
1
Bakterienstämme
1.1
E.coli-Stämme
Stamm
DH5α
JM110
S17-1
BL21 (DE3)
1.2
relevante Eigenschaften
F´ suppE44, ∆lacU169, (φ80lac∆M15), hsdR17
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, (res-, mod+), deoR
lacY galK galT ara fhuA dam dcm suppE∆(lac-proAB)
cC294::[RP4-2(Tc::Mu)(Km::Tn7)], pro, res, recA, Tcr, Smr
F´ ompT hsdSb (rB– mB–) gal dcm (DE3)
Referenz/Herkunft
Hanahan 1983
Yanisch-Perron 1985
Simon et al. 1983
Novagen
R. capsulatus-Stämme
Stamm
B10S
RA7
RA21
FS2
RA36
TD6
TD22
TD105
DG7
DG9
TD181
TD182
RA40
RA41
relevante Eigenschaften
Spontane Smr-Mutante des R. capsulatus B10 (Wildtyp)
hvrA-his6, Kmr
hvrA::Gm, nrfA::Spc
nifH-lacZ
nifH-lacZ, nrfA::Spc
∆nifHDK::Spc, anfA::Spc
∆nifHDK::Gm
hvrA::Gm
nrfA::Spc
∆nifHDK::Gm, nrfA::Spc
hvrA-lacZ
hvrA::Gm, hvrA-lacZ
nrfA::Spc, hvrA-lacZ
hvrA::Gm, nrfA::Spc, hvrA-lacZ
2
Plasmide
2.1
Vektorplasmide
Vektorplasmid relevante Eigenschaften
pK18
pUC / Kmr
pBR322
Ampr, Tcr
pET22B(+)
his6-Sequenz, Ampr
Referenz/Herkunft
Klipp et al. 1988
Raabe et al. 2002
diese Arbeit
Simon 2002
diese Arbeit
Drepper 2000
Drepper et al. 2002
Raabe et al. 2002
Drepper et al. 2002
Giaourakis 2000
Drepper 2000
Drepper 2000
diese Arbeit
diese Arbeit
Referenz/Herkunft
Pridmore 1987
Wallace et al. 1988
Novagen
21
Material und Methoden
2.2
Hybridplamide
Plasmid
Referenz/Herkunft
relevante Eigenschaften
pKRA20
pKRA21
pKRA23
pAPA1
pNAP1
pPHU284
pPHU282
pFS2
pTD7-2I
pTD14-3I
pDG8-3I
pKS131A
pK18-Derivat, hvrA
pET 22b(+) Derivat, hvrA-his6
pKRa21-Derivat, hvrA-his6, mob, Kmr
pPHU231-Derivat, nifA1c
pBBR1MCS-2-Derivat, nrfA
pPHU234-Derivat, nifA1-lacZ
pPHU234-Derivat, nifA2-lacZ
pSUP401-Derivat, nifH-lacZ
pSUP401-Derivat, anfH-lacZ
pSUP202-Derivat, hvrA-lacZ
pUC18-Derivat, nrfA::Spc, mob, Tcr
pPHU236-Derivat, anfA-lacZ
3
Medien und Zusätze
3.1
Medien
Raabe et al. 2002
Raabe et al. 2002
Raabe et al. 2002
Paschen 1997
Drepper et al. 2002
Drepper et al. 2002
Drepper et al. 2002
Drepper et al. 2002
Drepper et al. 2002
Drepper 2000
Giaourakis 2000
Drepper et al. 2002
3.1.1 E. coli-Medien
LB-Medium: (Sambrook et al. 1989)
Bacto Tryptone
Hefeextrakt
NaCl
A. dest.
10,0
7,5
5,0
ad. 1000
g
g
g
ml
LB-Agar:
Agar
LB-Medium
15,0 g
ad. 1000 ml
PY-Vollmedium:
Bacto Peptone
Hefeextrakt
1M MgCl2
1M CaCl2
0,5 % FeSO4
A. dest.
10,0
0,5
2,0
2,0
2,4
ad. 1000
PY-Agar:
Agar
PY-Medium
15,0 g
ad. 1000 ml
3.1.2 R. capsulatus-Medien
g
g
ml
ml
ml
ml
22
Material und Methoden
RCV-Minimalmedium:
10 % DL-Malat
40,0 ml
20 % MgSO4
1,0
7,5 % CaCl2
1,0
1 % EDTA
2,0
0,5 % FeSO4
2,4
0,1 % Thiamin
1,0
Spurenelement-Lösung
1,0
1 M Phosphat-Puffer (pH 6,8)
9,6
A. dest.
ad. 1000
RCV+N:
10 % (NH4)2SO4
RCV
10,0 ml
ad. 1000 ml
RCV-Serin:
1 M Serin
RCV
10,0 ml
ad. 1000 ml
Spurenelement-Lösung für RCV:
MnSO4 (x 1 H2O)
H3BO3
Cu(NO3)2 (x 3 H2O)
ZnSO2 (x 7 H2O)
NaMoO4 (x 2 H2O)
A. dest.
0,4
0,7
0,01
0,06
0,02
ad. 250
g
g
g
g
g
ml
AK-NL-Minimalmedium (Molybdän-frei; Schneider et al. 1991 b):
Minerallösung
10,0
Phosphat-Puffer
1,25
1 % Fe(III)-Citrat-Lösung 5,0
15 % Lactat-Lösung
1,4
1 % Thiamin-Lösung
0,5
A. dest.
ad. 1000
ml
ml
ml
ml
ml
ml
AK-NL +N:
10 % (NH4)2SO4
AK-NL
10,0 ml
ad. 1000 ml
AK-NL +Serin:
1M Serin
AK-NL
5,0 ml
ad. 1000 ml
Stammlösung für AK-NL:
Minerallösung:
MgSO4 (x 7H2O)
NaCl
CaCl2 (x 1H2O)
MnCl2
A. dest.
4,0
4,0
0,5
0,3
ad. 1000
Phosphatpuffer:
ml
ml
ml
ml
ml
ml
ml
ml
g
g
g
g
ml
10,0 g
KH2PO4
- pH auf 2-4 mit 32 % HCl einstellen
- über Aktivkohle reinigen
- pH auf 6,8 mit 40 % NaOH einstellen
- Zugabe von 1 ml 100 mM EDTA
23
Material und Methoden
1 % Fe(III)-Citrat-Lösung:
-
Autoklavieren
Reinigung über Aktivkohle
Lactatlösung:
-
30 % Lactat über Aktivkohle reinigen
pH mit 40 % NaOH auf 6,8 einstellen
mit A. bidest. auf doppeltes Volumen auffüllen
Zugabe von 1 ml 100 mM EDTA
-
Aktivkohle
10,0 g
A. bidest.
ad. 1000 ml
- 2-3 Tage rühren
- mind. 5 min kochen
- im Verhältnis 1:1 zur Reinigung der Stammlösung verwenden
Aktivkohle:
Reinigung der Stammlösung über Aktivkohle:
-
3.2
Die Aktivkohlelösung mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe durch den Filter
(Machery-Nagel) saugen; es entsteht eine Aktivkohleschicht auf dem Filter
die Aktivkohleschicht mit 100 ml A. bidest. waschen
die Stammlösung (pH 2-4) über die Aktivkohleschicht filtern
Zusätze zu Nährmedien
X-Gal-Medien:
pro 1000 ml
1 ml X-Gal (50 mg/ml in Dimethylformamid)
IPTG:
pro 1000 ml
5 ml 1 M IPTG-Stammlösung
Antibiotika-Konzentrationen für E. coli-Medien:
Substanz
Ampicillin
Chloramphenicol
Gentamicin
Kanamycin
Spectinomycin
Tetrazyklin
Abkürzung
Amp
Cm
Gm
Km
Spc
Tc
Konzentration
150 µg/ml
50 µg/ml
10 µg/ml
50 µg/ml
100 µg/ml
10 µg/ml
Bezugsquelle
Sigma
Serva
Sigma
Serva
Serva
Serva
Antibiotika-Konzentrationen für R. capsulats-Medien:
Substanz
Gentamicin
Kanamycin
Spectinomycin
Streptomycin
Tetrazyklin
(in Agarplatten)
Tetrazyklin
(in Flüssigmedium)
Abkürzung
Gm
Km
Spc
Sm
Tc
Konzentration
4 µg/ml
25 µg/ml
10 µg/ml
200 µg/ml
1,5 µg/ml
Bezugsquelle
Sigma
Serva
Serva
Serva
Serva
Tc
0,25 µg/ml
Serva
24
Material und Methoden
3.3
Enzyme
alle Restriktionsenzyme
T4-DNA-Ligase
T4-Polynukleotikinase
DNA-Polymerase (Klenow-Fragment)
RNase A
Pfu-Polymerase
3.4
Antiseren
HvrA-Antiserum
NifH-Anitserum
Ziege-Anti-Kaninchen-HRP-Konjugat
3.5
Gibco BRL, Fermentas, New England Biolabs
und Stratagene
Fermentas
Fermentas
Fermentas
Serva
Stratagene
(1:5000)
(1:30000)
(1:3000)
Raabe 1999
Labor Klipp
Amersham
Oligonukleotide
Primer Paar
Oligonkleotid Sequenz (5´-3´)
PCR-Produkte
CATATGGATATCGACGCGCTTTCACTGAAC
U:
PRK1-U/La
317 bp (hvrA)
L: AACTCGAGGATCGTCAGATCTTCCAGGGAC
U: TCGACCGATGCCCTTGAGAGC
PRK2-U/L
475 bp (kompetitive DNA)
L: TCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGC
U: AATATTATTGAAGCATTTATCAGG
PRK3-U/L
221 bp (Pbla)
L: TCGATGATAAGCTGTCAAACATG
U: CATTTCCTCCCGACAGAGGG
218 bp (PnifH)
PRK4-U/L
L: GTGTGGCTCCCTTGGGGGTT
U: CCTCATCGTCGGCTGCGACCC
226 bp (nifH-internes-Fragment)
PRK5-U/L
L: GAAGTTGATCGCGGTGATGACGCC
U: GCTTCGATCTGACCCGCTGAG
287 bp (PnifU2)
PRK6-U/L
L: GCGGTGTCCAGCGTCAGGC
U: GCTTCGTCGGCCTTGAAACG
PRK-7U/L
280 bp (PnifA1)
L: GCAGTCACCCCCTCACAGGA
U: TTTGTTTGCGCGCCTGTCGC
PRK-8U/L
260 bp (PnifB1)
L: GTCTTCGGGTTTTTCCTTGC
U: AGGTCAGCGACCTGCCGCCG
PRK-9U/L
238 bp (PnifH-up)
L: GTTTTGTTCGAAATGGAACAAGGC
U: CTTCAACACCATGATTTCGCG
234 bp (PnifH-down)
PRK-10U/L
L: ATCTTCTGACCCATCTCGACCAG
U: CGGTATCGCGCTTCGGCC
301 bp (PanfH)
PRK-11U/L
L: GCGATCTTGCGGGTCATGGG
U: GGTGATGGACACGCTGCGCA
310 bp (anfH-internes-Fragment)
PRK-12U/L
L: GGCATAGATCGCCATCATCT
U: GCGTCTGGTCGAAAGCGAAA
PRK-13U/L
300 bp (PanfH-up)
L: ATGGGAATCATCGCCCCGTC
U: TAATATCATATGGTTGA
PRK-14U/L
290 bp (PanfH-down)
L: GTCTGCTGCGGCAGACCGCC
a
Die mit einem Strich unterlegte Sequenzen sind Erkennungsstellen für NdeI und XhoI
25
Material und Methoden
4
Chemikalien und Materialien
Acrylamid / Bisacrylamid 35:1-Lsg.
Agar
Agarose
APS (Ammoniumpersulfat)
ATP
Bacto Peptone
Bacto Tryptone
BSA (Rinderserumalbumin)
DIG-Lumininiscent Detection Kit
DNA-Molekulargewichtsstandard (1kb-ladder)
dNTPs
EDTA
EtBr (Ethidiumbromid)
Gas-Pak Anaerobic-System
Hefeextrakt (Yeast-Extrakt)
IPTG
Lactat
DL-Malat
β-Merkaptoethanol
MetaPhor Agarose
ONPG
PD-10 Column
Protein-Molekulargewichtstandard (10 kDa Leiter)
PVDF-Membran
3MM Papier
QIAGEN-Säulen
SDS (Natriumdodecylsulfat)
TEMED
Tris
Tween 20
X-Gal
BioRad
Gibco BRL
Serva
BioRad
Boehringer
Difco
Difco
Sigma
Boehringer
Gibco BRL
Boehringer
Merck
Serva
BBL
Difco
Biomol
Serva
Sigma
Serva
FMC
Serva
Pharmacia
Gibco
Bio-Rad
Whatman
Qiagen
Serva
Bio-Rad
Sigma
Serwa
Roth
alle anderen Chemikalien
Merck, Riedel-de-Haen, Serva
und Sigma
5
Reaktions- und Nachweis-‘Kit‘
Bei der Benutzung käuflich erworbener Reaktions- und Nachweis-‘Kits‘ wurde nach dem
vom Hersteller mitgelieferten Protokoll vorgegangen und die beigefügten Reagenzien und
Puffer benutzt.
ECL Western Blotting Detection System
Plasmid Mini Kit
Plasmid Midi Kit
Microcon Centrifugal Filter Devices
NucleoSpin Extract (PCR-Purification-Kit)
Amersham
Qiagen
Qiagen
Amicon
Macherey-Nagel
26
Material und Methoden
Geräte
Blotapparatur
(min trans-Blo Eletrophoreti Transfer Cell
Computer
Hersteller
Dokumentationssystem
Sony UP-D860 E Thermoprinter
Elektrophoreseapparatur
Mini-Protean Gelkammer II und III
Filtron-Anlage
French press
Gaschromatograph
Imaging-Plate
Inkubationsschüttler
Gyrotory Shaker
Internet
BioRad
IBM-Kompatible Geräte verschiedener
MWG-Biotech Gel Printer 2000i
BioRad
PALL-Bio-Pharmaceuticals
SLM Aminco SLM Intruments Inc.
Hewlett-Packard Model 5890 Serie II
Fujix BAS-MS
New Brunswick Scintific G10
Capsulapedia
<http://capsulapedia.uchicago.edu/
capsulapedia.shtml>
NCBI Blast2
<http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>
WIT
<http://wit.mcs.anl.gov/WIT2/CGI/org.cgi>
ExPASy
<http://www.expasy.ch/cgi-bin/peptide-mass.p1>
PCR-Cycler
Robo-Cycler Gradient 40
pH-Meter
Phoshor-Imager
Rotoren
SS34, GSA
Spannungsgeräte
Spektralphotometer
Software
WINCLONE
Plasmid Map Enhancer 3.0
Vakuum-Zentrifuge
Zentrifugen
Stratagene
Knick Portatest 655
Fujix BAS 1000
Pharmacia ECPS 3000/150
BioRad Power supply 200/2.0
LKB Biochrom Ultrospec II
Pharmacia GeneQuant RNA/DNA
Calculator
Scientific und Education Software
Lasergene DNA*Star
UNIEQUP Univopor 100 H (speedvac)
Eppendorf Tischzentrifuge
Heraeus Sepatech Biofuge A
Heraeus Sepatech Biofuge pico
Sorvall Kühlzentrifuge RC-2B und
RC-5B
Alle hier aufgeführten Geräte entsprechen den üblichen Laborstandards.
27
Material und Methoden
Digitale Darstellung von Abbildungen
Zur Darstellung von Ergebnissen wurden die Fotografien, die von den Agarosegelen, den
SDS-PA-Gelen und den Immuno-blots erstellt wurden, sowie die nach Exposition mit 32Pmarkierten DNA entwickelten Röntgenfilme unter Zuhilfenahme elektronischer bildverarbeitender Medien bearbeitet (Colour Scanner). Die Abbildungen enthalten ausschließlich
Originaldaten. Eine inhaltsverändernde Bildbearbeitung ist nicht vorgenommen worden.
6
Mikrobiologische Methoden
6.1
Herstellung von Nähr- und Testmedien
Alle Nähr- und Testmedien werden 20 min bei 200 kPa autoklaviert. Hitzelabile Komponenten werden sterilfiltriert (Milipore-Membranfilter mit einem Porendurchmesser von
0,45 µm) und nachträglich dem Medium zugesetzt.
6.2
Bakterienanzucht
Escherichia coli
Für die Anzucht von E. coli-Kulturen werden 5 ml LB-Medium mit einer Einzelkolonie
angeimpft und bei 37°C über Nacht (ü/N) auf einem Brutroller inkubiert. Für größere
Ansätze wird das LB-Medium mit 1/50 des Volumens mit einer stationären Vorkultur
angeimpft. Die Inkubation erfolgt (ü/N) bei 37°C auf einem Rundschüttler. Die Inkubation
von Bakterienausstrichen erfolgt auf LB-Agarplatten bei 37°C.
Rhodobacter capsulatus
Aerobe Anzucht:
Die Inkubation von R. capsulatus Bakterienausstrichen erfolgt auf PY-Agarplatten in
Dunkelheit bei 30°C im Brutschrank (aerob).
Phototrophe Anzucht von R. capsulatus unter Starklichtbedingungen (Klipp et al. 1988)
R. capsulatus kann sowohl aerob im Dunkeln als auch anaerob im Licht bei 30°C wachsen
(photoheterotroph). Von den zu testenden Kulturen werden Einzelkolonieausstriche auf
PY-Agarplatten oder im Flüssigmedium in EPGs (bis 1,5 ml) in einem Anaerob-Inkubationstopf unter Verwendung des Gas-Pack-Anaerobic-System (BBL) angesetzt. Größere
Kulturvolumina werden in gasdichten, verschließbaren Röhrchen (Hungates) oder
Schottflaschen, die mit Hilfe eines im Deckel befindlichen Septums mit Argon bzw. mit N2
(diazotrophes Wachstum) begast werden können, kultiviert. Unter diesen Wuchsbedingungen wird R. capsulatus für drei Tage unter Starklichtbedingungen (sechs Glühbirnen
a 60 W, entspricht 2500 lux) inkubiert.
Phototrophe Anzucht von R. capsulatus unter Schwachlichtbedingungen
Unter Schwachlichtbedingungen erfolgt die Anzucht von EPG-Flüssigkulturen in einem
Anaerob-Inkubationstopf bei 30°C, wobei lediglich eine einzelne 25W-Glühbirne im
Abstand von 30 cm (entspricht 280 lux) die Ansätze unter Vermeidung gegenseitiger
Selbstbeschattung illuminiert.
28
Material und Methoden
6.3
Aufbewahrung von R. capsulatus-Stämmen
Stammplatten von R. capsulatus-Stämmen können nach der anaeroben Anzucht im
Anaeroben-Inkubationstopf für vier Wochen im Dunkeln bei Raumtemperatur (RT)
aufbewahrt werden.
6.4
Messung der optischen Dichte
Durch die Messung der optischen Dichte mit Hilfe eines Spektralphotometers bei einer
Wellenlänge von 580 nm (E. coli) und 660 nm (R. capsulatus) kann die Zelldichte in einer
Flüssigkultur ermittelt werden. Eine o.D.580 von 1 entspricht einem Titer von ca. 1 x 109 E.
coli-Zellen/ml. Bei R. capsulatus entspricht eine o.D.660 von 1 einem Titer von 3 x 108
Zellen/ml.
6.5
Transfer von moblisierbaren Plasmiden von E. coli nach R. capsulatus durch
Konjugation (verändert nach Simon et al. 1983)
Plasmide, die über eine Mobilisierungsfunktion verfügen (oriT), können von dem E. coli
Stamm S17-1, welcher die Transfer-Gen (tra-Gene) im Chromosom trägt, über Konjugation auf R. capsulatus übertragen werden. Durch die Konjugation werden diejenigen
Plasmide in R. capsulatus eingeführt, die dort stabil replizieren oder aufgrund eines
fehlenden Replikationsursprungs instabil sind. Mobilisierbare nicht replizierende Plasmide
(sogenannte „Suizid-Vektoren“) werden als Trägervektor rekombinanter DNA zur Erzeugung von R. capsulatus Insertions-/Interposon-Mutanten verwendet. Um die Ausbildung
einer Konjugationsbrücke zwischen E. coli S17-1 und R. capsulatus zu ermöglichen, wird
das im Folgende beschriebene Verfahren der Filterkreuzung angewandt.
Durchführung:
Der Rezipient wird von einer frischen anaeroben Stammplatte in 5 ml RCV+N aufgenommen und ü/N bei 30°C auf dem Brutroller resuspendiert. Der plasmidtragende E. coli
S17-1 Donor wird ü/N bei 37°C selektiv auf einer LB-Agarplatte angezogen. Von der
Donorplatte werden Einzelkolonien der logarithmischen Wachstumsphase geerntet und in
2 ml PY-Medium (ohne FeSO4) resuspendiert. Jeweils 500 µl der Rezipientenkultur
(stationäre Phase) werden mit 1 ml der Donorkultur vermischt und in einem
Eppendorfgefäß abzentrifugiert. Das Sediment wird im Rücklauf vorsichtig resuspendiert.
Die Zellsuspension wird anschließend auf Nitrozellulose-Filter (Schleicher & Schüll OE
66, Porendurchmesser 0,2 µm) übertragen und ü/N bei 30°C auf PY-Agarplatten inkubiert.
Die Filter werden in 1 ml RCV-Medium resuspendiert. Von der Bakteriensuspension wird
eine Verdünnungsreihe angelegt und verschiedene Volumina werden auf Selektivmedium
ausgestrichen.
6.5.1 Identifizierung von R. capsulatus Interposonmutanten nach der Konjugation
Die Erzeugung definierter Interposon-induzierter Mutanten erfolgt nach der Methode des
Markeraustausches. Zu diesem Zweck wird in das zu mutierende, auf einem Plasmid
lokalisierte Gen eine Antibiotikaresistenzgen-Kassette inseriert. Das resultierende
Konstrukt wird dann durch die S17-1 vermittelte Konjugation nach R. capsulatus transferiert. Zwischen den homologen Bereichen des Mutagenesekonstruktes und des
R. capsulatus Chromosoms kann durch ein doppeltes Rekombinationsereignis das
Interposon tragende Gen in das Chromosom integrieren und das Wildtyp-Gen ersetzen. Die
29
Material und Methoden
sogenannten Exkonjuganden zeichnet der Besitz der Interposon-vermittelten Antibiotikaresistenz und der Verlust der Vektor-kodierten Antibiotikaresistenz aus. Sie können
nach der Primärselektion durch paralleles Übertragen der jeweiligen Einzelkolonien
(isogene Zellen) auf entsprechende Selektivmedien identifiziert werden.
7
Nachweis von Enzymaktivitäten
7.1
Bestimmung der Nitrogenase-Aktivität im Acetylenreduktionstest
Aufgrund der geringen Sustratspezifität katalysieren die beiden NitrogenaseEnzymkomplexe ebenfalls die Umsetzung von Acetylen zu Ethylen. Beide Substanzen
lassen sich gaschromatographisch nachweisen und können als ein indirektes Maß zur
Bestimmung der Nitrogenase-Aktivität eingesetzt werden.
- Die Herstellung der Stammplatten und Vorkulturen erfolgt wie unter 6.2 beschrieben.
- Ausgehend von den Vorkulturen werden Testkulturen in 3 ml RCV oder
AK-NL + 9,5 mM Serin oder 20 mM NH4+ mit einer Ausgangszelldichte von 0,3 o.D.
(λ=660 nm) in Hungates angeimpft und mit Argon begast. Anschließend erfolgt die
Zugabe von 500µl Acetylen.
- Die Anzucht erfolgt unter phototrophen Bedingungen.
- Bei Erreichen der spätlogarithmischen Wuchsphase werden 5 µl der Gasphase entnommen und gaschromatographisch analysiert. Die Analyse erfolgt im HewlettPackard Gaschromatographen (Modell 5890 Serie II) unter Verwendung einer
Kapillarsäule zur Acetylen/Ethylen-Trennung. Der prozentuale Anteil der beiden Gase
wird durch den angeschlossenen Integrator bestimmt.
7.2
Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität (mod. nach Miller 1972)
Das lacZ-Gen aus E. coli kodiert für die β-Galaktosidase. Die leicht bestimmbare Enzymaktivität kann zur indirekten Quantifizierung der Expression einer lacZ-Reportergenfusion
genutzt werden. Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgt über die
Umsetzung der Verbindung β-ONPG (ortho-Nitrophenyl-β-D-Galktopyranosid). Als Spaltungsprodukte entstehen β-Galaktose und der Farbstoff o-Nitrophenol, dessen Absorption
bei der Wellenlänge von 420 nm photometrisch gemessen werden kann.
- Die Herstellung der Stammplatten und Vorkulturen erfolgt wie unter 6.2 beschrieben.
- Ausgehend von diesen Vorkulturen werden die Testkulturen in EPGs mit 1 ml RCV
oder AK-NL (mit Serin oder NH4+ in der gewünschten Konzentrationen ) mit einer
Ausgangszelldichte von 0,3 o.D. (λ=660 nm) angeimpft und bis zur späten exponentiellen Wuchsphase photoheterotroph angezogen.
- 400 µl einer Testkultur werden in 1 ml RCV-Medium verdünnt und die o.D.660
bestimmt.
- Für den β-Galaktosidase-Test werden zunächst 400 µl der verdünnten Zellen mit 25 µl
Chloroform und 25 µl 4-fach Z-Puffer und 0,15 SDS versetzt.
- Der Ansatz wird 10 sec gevortext und dann 5 min bei RT inkubiert.
- Durch Zugabe von 400 µl β-ONPG-Lösung (Substrat) wird der Enzymtest gestartet
und in Abhängigkeit von der β-Galaktosidase-Konzentration 5-120 min inkubiert.
- Die Ezymaktivität wird darauf durch Zugabe von 400 µl 1M Na2CO3 gestoppt.
- Danach wird der Reaktionsansatz für 10 min bei 13000 rpm zur Sedimentation der
Zellen abzentrifugiert.
30
Material und Methoden
-
Die Extinktion des Überstandes wird gegen einen Leerwert (ein Parallel-Ansatz, der
nach Zugabe der ONPG-Lösung sofort mit 400 µl 1M Na2CO3 versetzt wird) bei 420
nm bestimmt.
Die Berechnung der β-Galaktosidase-Aktivität in Miller-Units erfolgt nach folgender
Formel:
U = (E420 / o.D.660) x (VE/VP) x 3,5 x (1000 / t)
Lösungen:
VE : Volumen des Testansatzes
VP : Volumen der Probe
t : Inkubationszeit
4x Z-Puffer (pH 7)
60 mM Na2HPO4 (x 7 H2O)
40 mM NaH2PO4 (x 7 H2O)
10 mM KCl
1 mM MgSO4 (x 7 H2O)
50 mM β-Mercaptoethanol
Substratlösung
0,8 mg ONPG
ad 1 ml 1 x Z-Puffer
„Stopp“-Lösung
1M
Na2CO3
8
DNA-Techniken
8.1
Plasmid-Isolierung (modifiziert nach Birnboim und Doly 1979)
Die im folgenden beschriebene Methode der alkalischen Lyse dient der gezielten
Isolierung von Plasmid-DNA.
- 3 ml einer unter Selektionsdruck angezogenen E. coli ü/N Kultur werden in einem EPG
durch Zentrifugation bei 13000 rpm über 5 min geerntet.
- Das Zellsediment wird in 250 µl Puffer 1 resuspendiert.
- Es werden 250 ml Puffer 2 zugegeben und vorsichtig gemischt, bis die Lösung klar
wird. Die Zellen werden dann bei RT 5 min inkubiert.
- Nach Zugabe von 250 µl Puffer 3 werden die Ansätze vorsichtig vermischt und 5 min
in Eis inkubiert.
- Die denaturierte chromosomale DNA, Zelltrümmer und denaturierte Proteine werden
bei 13000 rpm über 10 min sedimentiert.
- Der Plasmit-DNA enthaltende Überstand wird in ein neues EPG gegeben. Nach
anschließender Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wird die Plasmid
DNA in 50 - 100 µl A. dest. oder TE-Puffer aufgenommen und bei -20°C gelagert.
Lösungen: Puffer 1
50 mM
Tris/HCl (pH 8)
10 mM
EDTA
100 mg/ml RNase
8.2
Puffer 2
200 mM NaOH
1% (w/v) SDS
Puffer 3
3 M Kaliumacetat
1,8 M Natriumformiat
Mini- und Midipäparation von Plasmid-DNA
Zur Gewinnung von größeren Mengen an Plasmid-DNA wird das Plasmid-Mini-kit bzw.
Midi-Kit der Firmen Qiagen oder Macherey & Nagel benutzt. Die Bakterienzellen werden
nach einem der alkalischen Lyse entsprechenden Verfahren aufgeschlossen. Das Lysat
wird auf eine Anionen-Austauscher-Säule gegeben und durch „Waschen“ mit
zunehmenden NaCl-Konzentrationen von Proteinen, RNA und Verunreinigungen
31
Material und Methoden
gereinigt. Nach der Elution der Plasmid-DNA von der Säule erfolgt eine IsopropanolFällung der DNA. Die Zusammensetzung der einzelnen Puffer sowie die genaue
Handhabung der Säule ist den Kits beiliegenden Beschreibungen zu entnehmen.
8.3
Isolierung von chromosomaler DNA aus R. capsulatus
Gesamt-DNA wird für die Amplifikation von Genbereichen mittels PCR (polymerase
chain reaction bzw. „Polymerase-Kettenreaktion“) eingesetzt. Die Bakterienzellmembran
wird durch das Detergens SDS lysiert. Die Reinigung der DNA von Proteinen erfolgt
durch wiederholte Phenol-Extraktion.
- Die R. capsulatus-Zellen einer PY-Agarplatte, die unter photoheterotrophen Bedingungen inkubiert wurden, werden geerntet und in 5 ml RCV+N überführt und bei 30°C
ü/N auf dem Brutroller inkubiert.
- 1,5 ml der Bakteriensuspension werden durch Zentrifugation (10 min bei 13000 rpm)
sedimentiert.
- Die sedimentierten Bakterienzellen werden in 1 ml TES-Puffer gewaschen.
- Dann werden die sedimentierten Bakterienzellen in 800µl TES-Puffer resuspendiert
und durch Zugabe von 40 µl 10 % SDS versetzt.
- Die Zell-Lyse erfolgt während einer Inkubation von 30 min bei RT.
- Der DNA-haltige Lösung wird 300 µl Phenol zugegeben. Danach wird die Lösung
geschüttelt und bei 13000 rpm zentrifugiert.
- Die wässrige Phase wird in ein neues Eppendorfgefäß überführt und erneut mit 300 µl
Phenol vermischt.
- Diese Phenolextraktion wird je nach Bedarf 4 - 5 mal wiederholt.
- Anschließend wird dis DNA mit Isopropanol aus der Lösung gefällt, getrocknet, in 100
µl TE Puffer aufgenommen und bei 4°C gelagert.
Lösungen:
8.4
TES-Puffer
50 mM Tris-HCl (pH 8)
50 mM NaCl
5 mM EDTA
TE-Puffer
10 mM Tris-HCl (pH 8)
1 mM EDTA
Phenol-Chloroform-Extraktion
Die Phenol-Chloroform Extraktion dient der Entfernung von Proteinen aus DNA-haltigen
Lösungen.
- Die DNA-Löung wird mit 1 Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol versetzt,
gevortext und zentrifugiert ( 3 min, 1300 rpm, RT).
- Anschließend wird die Oberphase abgenommen, mit 1 Volumen ChloroformIsoamylalkohol versetzt, gemischt und erneut zentrifugiert (3min, 13000 rpm, RT).
- Die Oberphase wird abgenommen und die darin enthaltene DNA mit Ethanol gefällt.
Lösungen:
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
50 % (v/v) Phenol (pH 8,4)
48 % (v/v) Chloroform
2 % (v/v) Isoamylalkohol
Chloroform/Isoamylalkohol
96 % (v/v) Chloroform
4 % (v/v) Isoamylalkohol
32
Material und Methoden
8.5
Präzipitation von DNA durch Alkohole
Bei der Ethanolfällung/Isopropanolfällung nutzt man die Eigenschaft des Alkohols, die
Hydrathülle der Nukleinsäure in einer wässrigen Lösung zu verdrängen. Die DNA fällt
dabei in Gegenwart von Kaliumacetat (Puffer 3) als Salz aus.
- Die DNA-Lösung wird in 1/10 Volumen Puffer 3 und 2,5 Volumen reinem Ethanol
(-20°C kalt) versetzt und 10 min bei -80°C inkubiert.
- Die präzipitierte DNA wird durch einen Zentrifugationsschritt (15 min, 13000 rpm,
RT) sedimentiert.
- Die DNA wird anschließend in einer Vakuumzentrifuge 30 sec getrocknet und
anschließend in A. dest. oder TE-Puffer aufgenommen
Lösungen:
8.6
Chloroform/Isoamylalkohol
96% (v/v) Chloroform
4% (v/v) Isoamylalkohol
DNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration von DNA in wässriger Lösung wird spektralphotometrisch (LKB
Ultrospec II, GeneQuant RNA/DNA Calculator) bestimmt. Bei einer Wellenlänge von
λ=260 entspricht eine o.D. von 1 einer Konzentration von 50 µg/ml dsDNA (Sambrock et
al. 1989). Über den Grad der Verunreinigung der DNA-Lösung mit Proteinen lässt sich mit
Hilfe des Quoitienten o.D.260/o.D.280 eine Aussage machen. Beträgt der Wert des
Quotienten < 1,8 kann die DNA-haltige Lösung als rein angesehen werden.
In Agarosegelen erfolgt die Konzentrationsbestimmung einer DNA-Lösung durch den
Vergleich mit der 1,6 kb Bande des Molekulargewichtsstandards (1 kb-ladder, Gibco
BRL). Nach Herstellerangaben enthält diese Bande eine DNA-Menge von 33 ng.
8.7
Restriktionsspaltung (Smith und Birnstiel 1976)
Die gezielte hydrolytische Spaltung der Phosphordiesterbindungen in einem DNA-Molekül
erfolgt durch die Resriktionsendonucleasen des Typ II. Für die Restriktionsspaltung
werden in der Regel 0,3-1 µg DNA eingesetzt. Um optimale Reaktionsbedingungen für die
jeweiligen Restriktionsenzyme zu erhalten, werden dem Reaktionsansatz entsprechend 10fach konzentrierter Restriktionspuffer zugegeben. Doppel- und Mehrfachrestriktionen
werden gleichzeitig durchgeführt, wenn die entsprechenden Restriktionsenzyme im selben
Restriktionspuffer arbeiten. Ansonsten muss nach jeder Spaltung die DNA mit Ethanol
gefällt werden und die sedimentierte DNA in dem entsprechendem Restriktionspuffer neu
aufgenommen werden. Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten, werden pro µg
DNA 1 - 5 Enzymeinheiten (Unit) in den Restriktionsansatz gegeben. Der zu spaltende
Ansatz wird in der Regel bei 37°C (Ausnahme: SmaI bei 30°C) über 1 - 2 h inkubiert. Für
die weitere Verwendung der entstandenen DNA-Fragmente in Klonierungsexperimenten
müssen die eingesetzten Restriktionsenzyme durch Hitze inaktiviert werden oder durch
eine Phenolisierung aus dem Ansatz entfernt werden. Nach der Restriktion steht die DNA
weiteren Klonierungen zur Verfügung oder kann durch Zugabe von 1/5 Volumen einer
Bromphenolblaulösung auf ein Agarosegel aufgetragen werden.
33
Material und Methoden
8.8
Agarosegelelektrophorese
Mit der Agarosegelelektrophorese kann eine Größenbestimmung restringierter DNAMoleküle sowie eine Mengenabschätzung isolierter DNA vorgenommen werden. Die
Wanderungsgeschwindigkeit eines DNA-Fragmentes im Gel ist dem Logarithmus des
Molekulargewichtes umgekehrt proportional. Durch den Vergleich mit der Länge
bekannter DNA-Fragmente kann die Länge von unbekannten DNA-Fragmenten bestimmt
werden. Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten in einem Agarosegel wird eine 0,8 1 %ige Agaroselösung in 120 ml TBE-Puffer aufgekocht. Zum Anfärben der DNA wird
0,5 µg Ethidiumbromid / ml der Gellösung zugegeben. Das Gel wird in eine Gelkammer
gegossen. Ein Taschenformer wird eingesetzt und nach Erstarren des Geles wieder
entfernt. Anschließend wird das Gel mit TBE-Puffer überschichtet. Vor dem Auftragen
wird die DNA-Probe mit 1/5 Bromhenolblaulösung versetzt. Die angelegte Spannung bzw.
Stromstärke und die Laufzeit sind von den gewünschten Trenneffekten abhängig. Die
Dokumentation erfolgt mit Hilfe des Videodokumentationssystem.
Lösungen: TBE-Puffer
Bromphenolblaulösung (BPB)
89,0 mM Tris/HCl (pH 8,3) 49,98 % (v/v)
TBE
89,0 mM Borat
49,98 % (v/v)
Glycerol
2,5 mM EDTA
0,04 % (w/v)
Bromphenolblau
Molekulargewichtsstandard `1 kb-Leiter´ (kb)
1 kb-Leiter: 12,2; 11,2; 10,2; 9,2; 8,1; 7,1; 6,1; 5,1; 4,1; 3,1; 2,0; 1,6; 1,0; 0,5;
0,4; 0,3; 0,2; 0,15; 0,134; 0,0075 kbp
8.9
Elution von DNA aus Agarosegelen (Vogelstein und Gillespie 1979)
Bei einer Umklonierung eines DNA-Fragmentes aus einem Plasmid in ein anderes Plasmid
ist die Methode der Elution von DNA aus Agarosegelen ein praktisches Verfahren, um
gewünschte DNA-Fragmente von anderen DNA-Fragmenten zu trennen. Dazu wird das
„Nucleo Spin Extraktion 2 in 1“-Kit der Firma Macherey & Nagel benutzt.
Nach der elektrophoretischen Trennung eines restringierten Plasmides wird das
gewünschte DNA-Fragment mit einem sauberen Skalpell aus dem Agarosegel geschnitten.
Die Elution der DNA erfolgt nach den Angaben des Herstellers unter Verwendung der
mitgelieferten Puffer und Lösungen.
8.10
Ligation von Vektor- und Fragment-DNA (Dugaiczyk et al. 1975)
Die durch die Restriktion entstandenen DNA-Fragmente können durch die LigaseReaktion mit der gewünschten Vektor-DNA verknüpft werden. Diese Reaktion wird durch
die T4-DNA-Ligase katalysiert. Das Enzym wird nach Herstellerangaben im mitgelieferten
Puffer eingesetzt und entweder 2 h bei RT oder über Nacht bei 6°C inkubiert. In einem
Reaktionsvolumen von 10-20 µl werden Vektor- und die zu inserierende DNA in einem
Verhältnis von 1:3 bis 1:5 eingesetzt.
34
Material und Methoden
8.11
Transformation (Mandel und Higa 1970)
8.11.1 Herstellung transformationskompetenter Zellen
Eine ü/N-Kultur des zu transformierenden E. coli Stammes wird bis zur stationären
Phase inkubiert.
- Ein Aliquot der Zellen wird mit LB-Medium (1:50) verdünnt und bei 37°C bis zur
einer o.D.580 von
0,4 - 0,5 angezogen.
Alle weiteren Schritte werden bei 4°C durchgeführt.
- Die Zellen werden für 5 min bei 6000 U/min (SS34-Rotor) zentrifugiert.
- Die sedimentierten Zellen werden mit der Hälfte des Ausgangsvolumens in kaltem
CaCl2 (50mM)
resuspendiert und für 30 min auf Eis gelagert.
- Nach einer Zentrifugation von 5 min bei 6000 U/min werden die Zellen mit 1/10 des
Ausgangsvolumens in CaCl2 aufgenommen.
- Die kompetenten Zellen werden bis zum weiteren Gebrauch entweder auf Eis gelagert
oder nach
Zugabe von Glycerol (Endkonzentration: 20% (v/v)) bei -80°C eingefroren.
-
Lösungen:
CaCl2-Stammlösung
50 mM CaCl2
8.11.2 Lagerung der kompetenten Zellen
Um kompetente Zellen über einen längeren Zeitraum lagern zu können, werden diese mit
Glycerin (15 % Endkonzentration) versetzt und bei -80°C eingefroren.
Auf 10 ml kompetente Zellen werden 2 ml Glycerin gegeben.
8.11.3 Transformation von E. coli
0,2 ml der kompetenten Zellen werden mit 0,1 ml TCM verdünnter DNA-Lösung
vermischt. Es folgt eine Lagerung der Proben über 30 min auf Eis. Nach einem
Hitzeschock für 90 s bei 42°C wird jeder Probe 0,7 ml LB-Medium hinzugegeben. Nach
vorsichtigem Vermischen folgt eine Inkubation von 1 h bei 37°C. Dann werden die Proben
auf Selektionsplatten ausplattiert und ü/N bei 37°C im Wärmeschrank inkubiert.
Lösungen: TCM Puffer (Transformationspuffer)
10 mM Tris/HCl pH 7,5
10 mM CaCl2
10 mM MgCl2
8.12
Vervielfältigung von DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
Bei der PCR (polymerase chain reaction bzw. „Polymerase-Kettenreaktion) handelt es sich
um ein Verfahren, bei dem bestimmte DNA-Abschnitte aus einem Probengemisch von
Gesamt-DNA amplifiziert und angereichert werden. Die bei der RCR eingesetzten
Oligonucleotidprimer binden links und rechts an dem zu amplifizierenden DNA-Abschnitt.
Die 3`-Enden der beiden Primer sind aufeinander ausgerichtet und ermöglichen der DNAPolymerase die Synthese neuer DNA-Stränge. Durch die Denaturierung (Erhitzen) werden
die neu synthetisierten DNA-Stränge getrennt. Nach dem Annealing (Abkühlen) der
35
Material und Methoden
Primer beginnt eine weitere DNA-Polymerasereaktion. Durch mehrfache Wiederholung
dieser Zyklen erreicht man die exponentielle Vermehrung der Ausgangs-DNA.
Standart PCR-Ansatz:
1 µl Template DNAa
5 µl DMSO
5 µl dNTP-Mix (2,5 mM pro Ansatz
je 15 µl Oligonukleotid 1 und 2 (je 1 pmol/µl)b
3 µl H2O
a
5 µl Puffer 10 x
1:100 verdünnt nach Gesamt-DNA-Isolierung
b
siehe 3.5 (Oligonukleotide)
1 µl Pfu-Polymerase (5 U/Ansatz)
Das PCR-Reaktiosgemisch wird mit 50 µl Paraffin überschichtet. Die PCR wird dann in
dem Thermocycler (Robo-Cycler, Stratagene) durchgeführt.
PCR-Programm:
1
95°C, 1 min (Denaturierung)
2
48°C bis 60°C, 90 sec (Annealing)
3
72°C, 1 min (Elongation)
4
zu Schritt 1, 35 Zyklen
Nach Beendigung der eigentlichen Amplifikationsreaktion wird der Reaktionsansatz noch
für weiter 10 min bei 72°C inkubiert. Nach Programmende können zur Überprüfung der
PCR 2 - 5 µl aus dem Ansatz entnommen werden und auf ein Agarosegel aufgetragen
werden.
8.13
Gel-Retardations-Experimente
Gel-Retardations-Experimente dienen zum in vitro Nachweis von Protein-DNAWechselwirkungen. Das Prinzip beruht darauf, dass Protein-DNA-Komplexe in einer
elektrophoretischen Auftrennung langsamer laufen als freie DNA. Bei dieser Methode
wird die DNA mit einer Proteinlösung inkubiert und die DNA-Retardation in einem
Gelsystem elektrophoretisch analysiert.
8.13.1 Gel-Retardations-Experimente im Agarose-Gelsystem (modifiziert nach
Goyard und Bertin 1997)
Die zu untersuchenden DNA-Fragmente werden mittels PCR-Methode aus der
chromosomalen R. capsulatus DNA ampliziert und über eine Anionen-Austauscher-Säule
(PCR-Purification-Kit der Firma Macherey & Nagel) gegeben und gewaschen. Das PCRProdukt wird dann im mitgelieferten 5 mM Tris-Puffer (pH 8,5) resuspendiert. Für die GelRetardation werden je 20 ng des zu untersuchenden DNA-Fragmentes mit 60 ng
Kompetitor-DNA (ein 475 bp-Fragment aus dem pBR322 Vektors) gemischt. Zu der DNA
wird die Proteinlösung gegeben und mit dem Reaktions-Mix I in einem Gesamtvolumen
von 10 µl gemischt und für 10 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 1/5 Volumen einer
Bromphenolblaulösung erfolgt eine elektrophoretische Trennung in einem 3 %igen
MetaPhorTM Agarosegel. Die Trennung erfolgt bei 125 V über 2,5 h. Das Gel wird
anschließend 10 min mit Ethidiumbromid gefärbt. Zur Dokumentation wird das im UVDurchlicht bestrahlte Gel fotografiert.
36
Material und Methoden
Lösungen:
Reaktions-Mix I
40 mM HEPES, pH8
100 mM Kalium Glutamat
10 mM Magnesium Aspartat
0,022 % IGEPAL CA-630
0,1 mg/ml BSA
8.13.2 Gel-Retardations-Experimente im Polyacryl-Amid-Gelsystem
Die Herstellung der zu untersuchenden DNA-Fragmente erfolgt wie unter 8.13.1
beschrieben. Je 3 ng DNA werden am 5´-Ende mit 32P mittels T4-Polynukleotidkinase
markiert (die Reaktion erfolgt nach Angaben des Herstellers). Nach der Markierung der
DNA erfolgt eine Hitzeinaktivierung des Enzyms (65°C für 10 min) und eine
Säulenreinigung der DNA. Für die Gel-Retardation werden dann 3 ng des zu
untersuchenden DNA-Fragmentes mit 120 ng poly(dIdC) als Kompetitor-DNA gemischt.
Zu der DNA wird die Proteinlösung gegeben und mit dem Reaktions-Mix II in einem
Gesamtvolumen von 10 µl gemischt und für 30 min bei 30°C inkubiert. Danach werden die
Ansätze auf ein 6 %iges Tris/Glycin-Gel aufgetragen. Die anschließende Polyacryl-AmidGelelektrophorese wird bei 120 V für 2 h durchgeführt. Das Gel wird dann getrocknet und
auf einen Detektorfilm aufgelegt. Die Expositionszeit beträgt 1 - 4 h. Danach werden die
Signale mittels eines Phosphor-Imager-Gerätes und entsprechender Software visualisiert.
Lösungen:
Reaktions-Mix II
25 mM HEPES, pH8
50 mM Kalium Glutamat
50 mM MgSO4
1 mM DTT
0,1 mM EDTA
0,05 % IGEPAL CA-630
20 µg/ml BSA
6 %iges Tris/Glycin-Gel
1,5 ml AA/BA-Mix (40%)
2 ml 10 x Tris/Glyin-Puffer
6,5 ml A. dest.
50 ml 10 % APS
20 ml TEMED
10 x Tris/Glycin-Puffer
50 mM Tris pH 9,3
100 mM Glycin
2 mM EDTA
9
Proteinbiochemische Methoden
9.1
Expression und Reinigung eines His6-Fusionsproteins
Viele Proteine können in E. coli exprimiert werden und, sofern es sich um lösliche Proteine
handelt, nach dem Zellaufschluss durch geeignete Reinigungsverfahren angereichert
werden. Für diese Expression von Proteinen stehen sogenannte Expressionssysteme zur
Verfügung. Diese bestehen aus einem E. coli Expressionsstamm und einem Vektor, in den
das für das zu exprimierende Protein kodierende Gen einkloniert wird. Der Vektor besitzt
einen induzierbaren Promotor (z.B. aus dem T7-Phagen), welcher die Expression der
stromabwärts vom Promoter liegenden Gene nur bei Anwesenheit einer speziellen
37
Material und Methoden
Polymerase (der T7-Polymerase) herbeiführt. Die Gene für diese Polymerase (T7Polymerase) liegen auf dem Chromosom des E. coli Expressionsstamm (z.B. BL21(DE3)),
dessen Expression mit einem Induktor (IPTG) induziert werden kann.
9.1.1 Proteinexpression in E. coli und Zellaufschluss zur Herstellung eines
Rohextraktes
Für die Expression eines HvrA-His6-Fusionsproteins wird das rekombinante Plasmid
pKRa21 in den E. coli Expressionstamm BL21(DE3) transformiert. Von den Transformanden wird eine ü/N-Kultur in LB-Medium unter Selektionsdruck (Amp) angezogen.
1 l Ampicilein-haltiges LB-Medium wird mit je 10 ml der ü/N-Kultur angeimpft und in je
einem 5l Erlenmeyrkolben bei 37°C auf einem Rundschüttler bis zu einer o.D.580 von 0,5
angezogen. Die Induktion der Proteinexpression wird durch die Zugabe von 1 mM IPTG
gestartet. Nach einer Inkubation von 3 Stunden werden die Zellen in einer SorvalZentrifuge (ROTOR) bei 6000 rpm über 10 min abzentrifugiert. Alle weiteren Schritte
werden bei 4°C durchgeführt. Die sedimentierten Zellen werden mit 50ml Puffer A
(20 mM Imidazol) resuspendiert und in einer French press (Amicon) bei 2200 psi aufgeschlossen. Die größeren unlöslichen Zellbestandteile werden bei 12000 rpm für 10 min
abzentrifugiert. Um das rekombinante hvrA-His6-Genprodukt zu reinigen, wird der
Proteinrohextrakt auf eine Ni-NTA-Säule aufgetragen.
9.1.2 Affinitätschromatographie des aus E. coli gereinigten HvrA-His6Fusionsproteins
Für die Reinigung eines HvrA-His6-Fusionsproteins wird von dem Ni-NTA-Säulenmaterial
(Ni-Nitrilotriacetic-acid) von QIAGEN verwendet. 3 ml Säulenmaterial (1,5 ml Bettvolumen) werden auf die Säule gegeben und mit 30 ml Puffer A (20 mM Imidazol)
äquilibriert. Nach beladen der Säule mit dem Proteinrohextrakt wird die Säule zunächst mit
5 Säulenvolumen Puffer A (100 mM Imidazol) gewaschen. Danach wird das HvrA-His6Fusionsprotein durch Anlegen eines Imidazol-Gradienten von 200 mM bis 500 mM
Imidazol (9 ml 200 mM Imidazol und 9 ml 500 mM Imidazol) eluiert. Es werden 3 ml
Fraktionen gesammelt.
9.1.3 Proteinexpression in R. capsulatus und Zellaufschluss zur Herstellung eines
Rohextraktes
Um das HvrA-His6-Fusionsprotein aus R. capsulatus reinigen zu können, wird der Stamm
RA7 in 18 l RCV (+ 20 mM NH4+) photoheterotroph bis zu einer o.D. von 1,2 angezogen.
Das Kulturvolumen wird mittels einer Filtron-Anlage auf 1,5 l eingeengt. Aller weiteren
Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Anschließend erfolgt eine Zentrifugation in einer
Sorval-Zentrifuge (Rotor) bei 6000 rpm über 1 h. Die sedimentierten Zellen werden mit 50
ml Puffer A (20 mM Imidazol) resuspendiert und in einer French press (Amicon) bei 2200
psi aufgeschlossen. Die größeren unlöslichen Zellbestandteile werden bei 12000 rpm für
10 min abzentrifugiert.
9.1.4 Affinitätschromatographie des aus R. capsulatus gereinigten HvrA-His6Fusionsproteins
Der Proteinrohextrakt wird wie unter 9.2.2 beschrieben auf die Ni-NTA-Säule aufgetragen.
Nach Beladen der Säule mit Proteinrohextrakt wird die Säule zunächst mit 5
Säulenvolumen Puffer A (80 mM Imidazol) und mit 1 Säulenvolumen Puffer A (100 mM
Imidazol) gewaschen. Danach wird das HvrA-His6-Fusionsprotein durch Anlegen eines
38
Material und Methoden
Imidazol-Gradienten von 100 mM bis 400 mM Imidazol (9 ml 100 mM Imidazol und 9 ml
400 mM Imidazol) eluiert. Es werden 3 ml Fraktionen gesammelt.
9.2
Anionen-Austauschchromatographie
Zur Umpufferung des HvrA-His6-Fusionsproteins werden 2,5 ml der Eluate auf eine PD-10
Säule (Pharmacia; Bettvolumen 9,1 ml) geladen. Die Säule wird zuvor mit 25 ml Puffer B
äqulibriert. Mit 3,5 ml Puffer B wurde die Säule eluiert.
Lösungen:
9.3
Puffer A
50 mM NaH2PO4, pH 8
300 mM NaCl
20-500 mM Imidazol
Puffer B
40 mM
500 mM
NaH2PO4, pH 8
NaCl
Proteinbestimmung (nach Bradford 1976)
Für diese Proteinbestimmung werden 50 µl der Proteinlösung mit 950 µl BradfordReagenz vermischt und bei RT für 10 min inkubiert. Die Probe wird dann bei einer o.D.595
im Photometer gemessen. Eine Eichgerade wird mit Rinderserumalbumin (BSA)
angefertigt.
Lösungen: Bradford-Reagenz
100 mg Serva Blau G250
100 ml 85 % (v/v) ortho-Phosphorsäure
46,7 ml Ethanol
ad. 1000 ml A. dest.
9.4
Gesamtproteinisolierung aus Bakterien
1,5 ml logarithmische Kultur werden für 3 min abzentrifugiert. Der Überstand wird
quantitativ verworfen. Die sedimentierten Zellen werden durch Vortexen gelockert, dann
in 1 ml 1 x stacking buffer resuspendiert und für 3 min zentrifugiert (1300 rpm). Der
Überstand wird verworfen und die sedimentierten Zellenbestandteile werden in 75 µl
cracking buffer resuspendiert. Die Proben werden für 3 min bei 100°C gekocht, dann 1 min
gelockert (vortexen) und dann ein weiteres mal für 5 min bei 100°C gekocht. Nach dem
Lockern des Sedimentes (vortexen) wird die Probe 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird
in ein neues Eppendorfgefäß gefüllt. Die Probe kann bei -20°C über einen längeren
Zeitraum gelagert werden.
Das beschriebene Protokoll bezieht sich auf die Gesamtproteinisolierung von E. coli
Zellen. Bei R. capsulatus wird nach demselben Protokoll verfahren, mit dem Unterschied,
dass die Zellen über 10 min abzentrifugiert werden.
Puffer:
4 x stacking gel buffer
2,2 g Tris (auf 200 ml) pH 6,8
cracking buffer
0,125 ml 4 x stacking gel buffer
0,3 ml 10% SDS
0,2 ml 50% Glycerin
0,05 ml Mercaptoethanol
0,325 ml H2O
Zahnstocherspitze Bromphenolblau
39
Material und Methoden
9.5
Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE; nach
Laemmli 1970)
Die SDS-PAGE wird in einer BioRad-Mini-Protein-Gelkammer durchgeführt. Zuerst wird
das Trenngel in die zuvor zusammengebauten Gelkammern gegossen und mit Wasser
überschichtet. Nach der Polymerisation des Gels (ca. 1 Stunde) wird das Wasser entfernt
und das Sammelgel darüber gegossen. Die eingesetzten Taschenformer werden nach der
Polymerisation des Gels wieder entfernt. Anschießend wird das Gel in die mit Resevoirbuffer gefüllte Gelkammer gestellt. Die Protein-Proben werden vor dem Auftragen für 5
min bei 100°C gekocht (Gesamtprotein, 1:1 in cracing-buffer verdünnt, Gesamtvolumen
höchstens 20 µl). Die Elektrophorese erfolgt bei einer konstanten Spannung von 120 V für
ca. 2 h.
Trenngel 14 %ig (Angaben für 6 Gele)
0,66 ml Acrylamid-Konz.
0,66 ml 50% Glycerin
10 ml 4 x separating gel buffer
14 ml Acrylamid-Bisacrylamid
14,6 ml Wasser
0,4 ml 10% SDS
0,3 ml 10% (NH4)2S2O8 (APS)
2,4 µl TEMED
Sammelgel
6,27 ml Wasser
2,4 ml 4 x Stacking gel buffer
1,43 ml Acrylamid-Bisacrylamid
0,1 ml 10% SDS
0,1 ml 10% (NH4)2S2O8 (APS)
7,5 µl TEMED
Marker: 10 kDa Leiter (BioRad): 200; 120; 110; 100; 90; 80; 70; 60; 50; 40; 30;20; 10 kDa
Lösungen und Puffer:
10 x RB-Puffer (pro 1000 ml)
30,2 g Tris
144 g Glycin
Reservoir buffer
80 ml 10 x RB
8 ml 10% SDS
ad. 800 ml
4 x separateing gel buffer
36,4 g Tris pH 8,8 (auf 200 ml)
Acrylamid/Bisacryl.
40 % Acrcylamid
0,8 % Bisacrylamid
9.5.1 Coomassie-Blau Färbung
- Färben: 60 min in Färblösung
- Entfärben: 2 h schütteln schütteln in Entfärber.
Lösungen:
Färbelösung
50 % Methanol
10 % Essigsäure
1 % Coomassie
Entfärber
20 % Methanol
7 % Essigsäure
40
Material und Methoden
9.5.2 Elektrotransfer von Proteinen auf PVDF-Membranen (Western Blot)
Die Proteine werden mittels einer Transferapparatur der Firma BioRad (Mini Trans-Blot
Electrophoretic Transfer Cell) auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Übertragung
erfolgt für 15 min bei 150 mA und weitere 20 min bei 300 mA konstanter Stromstärke im
Dunn-Carbonat-Puffer.
Puffer:
Dunn-Carbonat-Puffer
10 mM NaHCO3, pH 9,3
3 mM NaCO3
20 % (v/v) Methanol
9.5.3 Immunodetektion von Proteinen
Nach dem Western Blot wird die Membran für eine Stunde bei 30°C in TBST mit 1%
Magermilchpulver (w/v) auf einem Taumelgenerator inkubiert. Anschließend erfolgt die
Inkubation der PVDF-Membran mit dem Antiserum in TBST für eine Stunde oder ü/N bei
37°C auf dem Taumelgenerator. Durch zweimaliges Waschen der Membran in TBST für
jeweils 30 min werden die überschüssigen Antikörper von der Membran entfernt. Dann
folgt die Inkubation der Membran mit dem sekundären Antikörper (Ziege-Anti-KaninchenAntikörper) mit einer Verdünnung von 1: 3000 in TBST. Der sekundäre Antikörper wird
durch viermaliges Waschen in TBST für 2 x 15 und 2 x 5 min entfernt. Anschließend
erfolgt die Entwicklung des Blots durch das ECL-System (Enhanced Chemiluminiscence
Western Blotting Detection System).
Lösungen und Puffer:
TBS-Puffer
TBST
50 mM Tris-HCl, pH 6,8 0,2 (v/v) Tween 20 in TBS-Puffer
150 mM NaCl
1 mM MgCl2
9.5.4 Anfärbung der PVDF-Membran (Matsudaira 1989)
Nach der Detektion wird die Membran für 15 min in TBST gewaschen und anschließend
30 min in Färbelösung inkubiert. Zur Entfärbung wird die Membran 10 min in
Entfärbelösung inkubiert.
Lösungen und Puffer:
9.6
Färbelösung
Entfärbelösung
50 % Methanol
50 % Methanol
0,1 % Coomassie Brilliant Blue R 10 % Essigsäure
Molekulargewichtsanalyse mittels MALDI-TOF
Bei der Bestimmung der Molekulargewichte von Proteinen mit Hilfe des MALDI-TOF
(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation) Massenspektrometers werden die Proteine
zuerst in Kristalle von UV-absorbierenden Molekülen (Matrix) eingebaut. Dabei übertragen die sauren UV-absobierenden Moleküle Protonen auf die Proteine und laden sie
positiv auf. Die in die UV-absobierenden Moleküle eingebauten Proteine werden dann in
das Hochvakuum des Massenspektrometers gebracht und mit einem UV-Laser Puls
bestrahlt. Dieser setzt explosionsartig die UV-absobierenden Moleküle und damit auch die
eingebauten Proteinionen frei. Die Proteine gehen dabei in die Gasphase über. Die positiv
41
Material und Methoden
geladenen Proteinionen werden in einem elektrischen Feld beschleunigt. Alle Ionen fliegen
durch eine feldfreie Vakuum-Flugröhre, den Flugzeitanalysator oder TOF (time of flight),
und treffen dann auf einen Detektor. Die Flugzeiten der Proteinionen werden gemessen.
Zur Detektion der Proteingrößen im MALDI-TOF werden die Proteinlösungen zunächst
umgepuffert (1 mM Tris pH 8). Dann werden 1 µl Proteinprobe mit 1 µl Sinapinsäure
(Matrix) vermischt und anschließend auf einen Probenträgerplatte aufgetragen und in das
MALDI-TOF Gerät eingeführt. Mittels Voyager-Software wird eine exakte Detektion der
Molekulargewichte ermöglicht.
Sinapinsäure-Matrix
500 µl 0,1 % TFA (Trifluorartic acid)
500 µl Acetonitril
10 mg Sinapinsäure
42
Ergebnisse
C
1
Ergebnisse
Reinigung von HvrA
In Rhodobacter capsulatus ist HvrA neben seiner Funktion als Schwachlichtaktivator der
Photosynthesegene an der Regulation der Stickstoff-Fixierung beteiligt. In genetischen
Studien
konnte
demonstriert
werden,
dass
die
durch
NifA
vermittelte
Transkriptionsaktivierung von nifH und die durch AnfA herbeigeführte Aktivierung von
anfH (Struktur-Gene der Mo-Dinitrogenase-Reduktase und Fe-Dinitrogenase-Reduktase)
und weiterer nif-Gene durch HvrA beeinflusst wird (Kern et al. 1998, Drepper 2000). Zu
Beginn der Arbeit war jedoch nicht bekannt, wie HvrA als Regulator in den Prozess der
NifA-abhängigen nif-Genexpression eingreift. Im Folgenden soll der Mechanismus der
HvrA-vermittelten Regulation der Stickstoff-Fixierungsgene untersucht werden. Da für
HvrA, wie für andere Vertreter der Familie Histon-ähnlicher Proteine, eine DNA-Bindung
an die Promotorregion des β-Lactamasegens gezeigt werden konnte (Bertin et al. 1999),
wurde zunächst geklärt, ob HvrA in der Lage ist, durch eine direkte Bindung an die
Promotoren der nif- und anf-Gene die Expression zu beeinflussen. Deshalb wurde durch in
vitro DNA-Bindestudien mit gereinigtem HvrA-Protein untersucht, ob HvrA spezifisch an
Promotoren ausgewählter Stickstoff-Fixierungsgene binden kann.
1.1
Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus dem heterologen Wirt
E. coli
Um die Bindungseigenschaften von HvrA an nif-Promotoren untersuchen zu können,
wurde HvrA als HvrA-His6-Fusionsprotein in einem E. coli Überexpressions-Stamm
synthetisiert und aus diesem anschließend über eine Ni-Nitrilotriessigsäure-Säule (NickelNTA-Säule) affinitätschromatographisch gereinigt. Grundlage dieser Experimente war die
Konstruktion eines Hybridplasmides, welches die Expression eines HvrA-His6-Proteins im
heterologen Wirt E. coli erlaubt. Eine Übersicht über die Klonierungs-, Expressions- und
Reinigungsschritte ist in Abb. C-1 schematisch dargestellt.
43
Ergebnisse
Amplifikation von hvrA mittels PCR
Klonierung des hvrA PCR-Fragmentes in pK18 [pKRa20]
Überprüfung der amplifizierten Region durch DNA-Sequenzanalyse
Umklonierung des hvrA-Fragmentes in pET-22b(+) [pKRa21 ]
Transformation des Plasmides pKRa21 in E. coli BL21(DE3)
Induktion der Expression des HvrA-His6-Fusionsproteins, Zellernte
und Herstellung des Proteinrohextraktes
Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins mit Hilfe der Nickel-NTAAffinitäschromatographie
Nachweis des rekombinanten HvrA-His6-Fusionsproteins:
1) SDS-PAGE; Western-blot
2) MALDI-TOF
HvrA-Bindestudien
Abb. C-1: Schematische Darstellung zur Herstellung und Reinigung eines HvrA-His6Fusionsproteins. Nähere Erläuterung siehe Text.
1.1.1 Konstruktion eines hvrA-his6-Expressionsplasmides
Mit Hilfe der PCR-Methode wurde das hvrA-Gen, mit Ausnahme des Stoppkodons, aus der
chromosomalen R. capsulatus Wildtyp DNA amplifiziert (Abb. C-2). Die Primer
(PRK1-U, PRK1-L) wurden so gewählt, dass an die hvrA-Sequenz im 5`-Bereich eine
NdeI- und im 3`-Bereich eine XhoI-Schnittstelle eingefügt wurde. Das 310 bp PCRProdukt wurde zunächst mit glatten Enden (blunt-end) in den SmaI restringierten pK18
Vektor ligiert. Aus dem so entstandenen Plasmid (pKRa20) wurde dann das hvrA Gen
44
Ergebnisse
durch Doppelrestriktion mit NdeI/XhoI herausgeschnitten und in den Expressionsvektor
pET-22b(+) kloniert. Durch die Klonierung in den Vektor pET-22b(+), welcher
stromabwärts der XhoI-Schnittstelle eine „His-Tag“-kodierende Sequenz trägt und
stromaufwärts der NdeI-Schnittstelle einen Promotor aus dem T7-Bakteriophagen (PT7)
besitzt, entstand das Hybridplasmid pKRa21, das die kodierende Sequenz eines HvrAHis6-Fusionsproteins aufweist.
NdeI
hvrA
Chromosomale DNA
Amplifikation des hvrA-Gens
XhoI
NdeI
hvrA
XhoI
NdeI
hvrA
XhoI
PCR-Produkt
Blunt-end Ligation des
PCR-Fragmentes in pK18
pKRa20
Umklonierung des
NdeI/XhoI-Fragmentes in pET22b(+)
hvrA
his6
pKRa21
Abb. C-2: Klonierungsstrategie zur Erzeugung eines hvrA-his6-Expressionsplasmides
Im oberen Teil der Abbildung ist die Amplifikation des hvrA-Gens skizzenhaft dargestellt. Die Primer sind
schematisch durch Balken angedeutet. Die nicht komplementären Sequenzen der Primer, die
Erkennungsstellen der Restriktionsenzyme NdeI und XhoI enthalten, sind als abgewinkelte Balken
dargestellt. Das Endkonstrukt pKRa21 kodiert für ein hvrA-his6-Gen. Der his-Tag ist als schwarze Spitze
abgebildet. Die Darstellung der DNA-Elemente ist nicht maßstäblich.
Die Expression des auf dem Plasmid pKRa21 gelegenen hvrA-his6-Gens steht unter
Kontrolle des PT7 und kann somit nur bei Anwesenheit der T7-Polymerase erfolgen
(Abb. C-3). Das Gen für die T7-Polymerase, dessen Expression mit IPTG induziert werden
kann, liegt auf dem Chromosom des E. coli Überexpressions-Stammes BL21(DE3).
45
Ergebnisse
IPTG
BL21(DE3)
+
P
pKRa21
T7 RNA-Polymerase Gen
hvrA
T7 RNA-Pol
his6
HvrA-His6
Abb. C-3: T7-Polymerase abhängige Expression des hvrA-his6-Gens
Die Expression des hvrA-his6 Hybridgens erfolgt von dem Promotor des Bakteriophagen-T7 nur bei Anwesenheit der T7-Polymerase, die in dem E. coli Expressionsstamm BL21(DE3) chromosomal kodiert
vorliegt.
Nach der Klonierung wurde, um die amplifizierte hvrA-Sequenz zu überprüfen, eine DNASequenzieranalyse durchgeführt. Den Ergebnissen der Sequenzierung war zu entnehmen,
dass das amplifizierte hvrA-Fragment keine Mutation enthält (Daten nicht gezeigt) und
somit für weitere Experimente verwendet werden konnte.
1.1.2 Reinigung von HvrA-His6 aus E. coli BL21(DE3)
Zur Reinigung des hvrA-his6-Genproduktes wurde der E. coli Stamm BL21(DE3), der das
rekombinante Plasmid pKRa21 (hvrA-his6) trug, in einem Liter Vollmedium, wie im
Material und Methoden Teil beschrieben, angezogen. Nach Aufschluss der Zellen in der
French-press und Abzentrifugation der unlöslichen Zellbestandteile, wurde der Rohextrakt
auf eine Ni-NTA-Säule geladen. Die gebundenen Proteine wurden nach Waschen der
Säule mit einem kontinuierlichen Imidazolgradienten von der Säule eluiert. Die Proteine
des Sedimentes, des Rohextraktes, des Durchflusses (Fraktion vor dem Waschschritt) und
der Waschfraktionen sowie die Proteine der Eluate wurden in einem denaturierenden SDSPolyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) der Größe nach elektrophoretisch voneinander getrennt
und
anschließend
das
HvrA-His6
mittels
Immunoblot-Verfahren
(Western-blot)
nachgewiesen. Für den immunologischen Nachweis wurde ein Antiserum verwendet,
welches bereits vor dieser Arbeit unter Verwendung eines verkürzten HvrA-His6-Proteins
46
Ergebnisse
erzeugt wurde (Raabe 1999). In Kontroll-Experimenten mit R. capsulatus Proteinrohextrakten konnte demonstriert werden, dass das Antiserum spezifische, gegen HvrA
gerichtete Antikörper enthält (siehe z.B. Abb. C-10). Die Ergebnisse der SDS-PAGE und
des immunologischen HvrA-Nachweis sind in Abb. C-4 A und B dargestellt.
In den Eluaten, die bei einer Imidazolkonzentration von 200 mM (Eluat-Fraktion I) bis 300
mM (Eluat-Fraktion II) erzeugt wurden (Abb. C-4, A, Spur 6 und 7), befanden sich
ausschließlich Proteine, deren apparentes Molekulargewicht (MW) von ca. 12 kDa dem zu
erwartenden MW des HvrA-His6-Fusionsproteins entsprach. Dass es sich bei diesen
Proteinen um das HvrA-His6-Fusionsprotein handelt, demonstrieren die Signale im
Western-blot (Abb. C-4, B). Mit der hier dargestellten Methode konnten letztendlich aus l l
E. coli Kultur 1200 µg des HvrA-His6-Fusionsproteins isoliert werden.
Eluate
A
kDa
1
2
3
4
5
I
II
III
IV
6
7
8
9
50
40
30
20
HvrA
10
B
HvrA
Abb. C-4: Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus E. coli
Die Proteinfraktionen der verschiedenen Reinigungsschritte sind in einem Coomassie-blau gefärbtem
SDS-PA-Gel (A) und im Western-blot mit HvrA-His6-Antiserum (B) analysiert worden.
Spur 1: 10 kDa-Marker
Spur 6: Eluat I (200-250 mM Imidazol)
Spur 2: Zellsediment
Spur 7: Eluat II (250-300 mM Imidazol)
Spur 3: Rohextrakt
Spur 8: Eluat III (300-350 mM Imidazol)
Spur 4: Durchfluss
Spur 9: Eluat IV (350-400 mM Imidazol)
Spur 5: Waschfraktion (100 mM Imidazol)
1.1.3 Analyse des aus E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins mittels
MALDI-TOF
Um die Reinheit und die exakte molekulare Masse des isolierten Proteins genauer
bestimmen zu können, wurde eine MALDI-TOF Analyse (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization − Time Of Flight) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein
Aliquot des HvrA-His6-Fusionsproteins unter Verwendung einer Amicon-Spin column
ankonzentriert und in einem geeignetem Puffer aufgenommen (Material und Methoden).
47
Ergebnisse
Die molekularen Massen des isolierten HvrA-His6-Fusionsproteins wurden in zwei parallel
durchgeführten Messungen bestimmt. In Abb. C-5 ist exemplarisch das Massenspektrum
der ersten MALDI-TOF-Analyse dargestellt. Die Ergebnisse beider Messungen sind in
Tab. C-1 zusammengefasst.
12787.51
100
90
80
Intensität [%]
70
6402.34
60
50
40
30
20
10
0
5000
6900
8800
Masse / Ladung
10700
12600
Abb. C-5: Molekulargewichtsanalysen des HvrA-His6-Fusions-Proteins mittels MALDITOF
Einstellungen des Massenspektrometers: Accelerating: 20000 V, Grid Voltage: 95%, Guide Wire: 0,1%,
Delay time: 4000 nsec, Shots/Spectrum: 150, Mass-Range (Da) 5000 – 14500, Matrix: Sinapinsäure, Laser
Intensity: 2594.
Tab. C-1: Errechnetes und experimentell bestimmtes Molekulargewicht (MW) des aus
E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins
Durchschnittliche Peptidmassea
12500,35 Da
Monoisotope Petidmassea
12492,57 Da
Messung 1
12787,51 Da
Messung 2
12785,62 Da
Mittelwert
12786,57 Da
a
Die errechneten durchschnittlichen bzw. monoisotopen MW des HvrA-His6-Fusionsproteins wurden durch
das Peptid Mass Program des EXPASY Servers des MPI Heidelberg nach Eingabe der HvrA-His6Aminosäure-Sequenz mit (f)-Methionin ermittelt.
Das Hauptsignal des in Abb. C-5 dargestellten Massenspektrums zeigt, dass das aus E. coli
gereinigte HvrA-His6-Protein ein Molekulargewicht von 12787,51 Da aufweist. Bei dem
zweiten Signal (6402,34 Da) handelt es sich um das doppelt-ionisierte Protein. Somit
konnte die Reinheit des isolierten Proteins demonstriert werden. Darüber hinaus kann eine
Co-Reinigung von anderen Proteinen, die in dem Massenspektrum zu erkennen gewesen
48
Ergebnisse
wäre, ausgeschlossen werden. Der Mittelwert des MW des aus E. coli gereinigten HvrAHis6-Fusionsproteins bei zwei parallel durchgeführten Massenbestimmungen beträgt
12787,57 Da und weicht überraschender Weise um 286 Da von dem für das HvrA-His6Protein (HvrA-His6-Aminosäure-Sequenz mit f-Methionin) ermittelten durchschnittlichen
MW ab. Da es sich dabei um eine Massenzunahme handelt, kann nicht ausgeschlossen
werden, dass das aus E. coli gereinigte HvrA-His6-Fusionsprotein vollständig kovalent
modifiziert vorliegt.
Ursprünglich sollten sich nach erfolgreicher Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins
DNA-Bindestudien anschließen. Da jedoch die Ergebnisse der massenspektroskopischen
Untersuchung von den erwarteten Ergebnissen abweichen, konnte nicht ausgeschlossen
werden, dass das HvrA-His6-Fusionsprotein modifiziert vorliegen könnte und somit seine
DNA-Bindeeigenschaften möglicherweise dadurch verändert werden. Für die weiteren
Untersuchungen sollte daher das HvrA-His6-Fusionsprotein aus dem homologen Wirt R.
capsulatus isoliert werden.
Das experimentell bestimmte MW des aus E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins
ist um 286 Da größer, als das theoretisch ermittelte MW. Dies könnte auf eine kovalente
Modifikation des Proteins hindeuten. Für die weiteren Experimente sollte daher das
Fusionsprotein aus R. capsulatus isoliert werden.
1.2
Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus dem homologen Wirt
R. capsulatus
1.2.1 Konstruktion eines mobilisierbaren hvrA-his6-Expressionsplasmides
Um das HvrA-His6-Fusionsprotein aus R. capsulatus zu synthetisieren und anschließend
reinigen zu können, sollte die HvrA-His6 kodierende Genregion durch homologe
Rekombination in das Chromosom von
R. capsulatus eingebracht werden. Dadurch
befand sich die Transkription des hvrA-his6-Gens unter der Kontrolle des nativen
Promotors (PsenC) (Abb. C-6).
49
Ergebnisse
Wildtyp
regB
P
senC
regA
hvrA
hvrA-his6
pKRa23
mob/Kmr
Selektion auf Kmr
RA7
regB
P
senC
regA hvrA-his6
mob/Kmr
(hvrA)
HvrA-His6
Abb. C-6: Erzeugung des R. capsulatus hvrA-his6-Expressionsstammes RA7
Die beiden gekreuzten Striche zwischen dem hvrA- und dem hvrA-his6-Gen weisen auf homologe Bereiche
hin, in denen die homologe Rekombination erfolgen kann. Hierdurch wird das gesamte Plasmid pKRa23 in
das Genom intregriert (RA7). Die Klammern um das hvrA-Gen des merodiploiden Stammes RA7 deuten an,
dass diese Kopie im Gegensatz zum hvrA-his6-Gen nicht mehr exprimiert wird.
Zu diesem Zweck wurde ein 4,2 kb Fragment, welches neben dem Kanamycin-Resistenz
vermittelnden aphII-Gen des Transposons Tn5 noch eine mob-Sequenz, die für die
Mobilisierung von Plasmiden durch E. coli S17-I erforderlich ist, in das Plasmid pKRa21
einkloniert. Das aus dieser Klonierung entstandene Plasmid (pKRa23) wurde dann durch
konjugativen Transfer in den R. capsulatus Wildtyp-Stamm B10S eingebracht. Da das
Plasmid pKRa23 in R. capsulatus nicht replizierbar ist, führte die Primärselektion auf
Kanamycin-haltigem Medium zu Exkonjuganden, in denen das Plasmid durch ein
einfaches Rekombinationsereignis in das Chromosom integriert war (Abb. C-6). Nach
photoheterotropher Anzucht des erzeugten R. capsulatus Stammes RA7 (hvrA-his6) war es
dann möglich, das HvrA-His6-Fusionsprotein aus dem homologen Wirt zu isolieren. Da die
Transkription des hvrA-his6-Gens aber vom nativen Promotor erfolgte, war eine im Vergleich zum E. coli Überexpressions-Stamm BL21(DE3) geringere Proteinausbeute aus l l
R. capsulatus RA7-Kultur zu erwarten. Um dennoch ausreichende Mengen des HvrA-His6Fusionsproteins für nachfolgende DNA-Bindestudien zu erhalten, wurde daher das
Fusionsprotein aus einem großen Kulturvolumen (18 l RCV +NH4+) isoliert.
50
Ergebnisse
1.2.2 Reinigung von HvrA-His6 aus R. capsulatus RA7
Nach der Anzucht der R. capsulatus RA7-Kulturen erfolgte eine Ankonzentrierung der
Zellen mittels Filtron-Anlage. Nach dem Zellaufschluss (Material und Methoden), wurde
der Proteinrohextrakt anschließend auf die Ni-NTA-Säule geladen. Die Reinigung und der
Nachweis des HvrA-His6-Fusionsproteins erfolgte wie bereits im Abschnitt 1.1.2 des
Ergebnisteils beschrieben. In den Fraktionen der Eluate III und IV (Abb. C-7, B) befanden
sich Proteine, die mit dem im Western-blot verwendeten spezifischen HvrA-Antiserum
reagierten. Die Größe der im SDS-PA-Gel und Western-blot dargestellten Proteine entspricht dem zu erwartenden MW des HvrA-His6-Fusionsproteins (Abb. C-7, A und B). Mit
diesem Reinigungsverfahren konnten aus 18 l R. capsualtus Kultur 294 µg reines HvrAHis6-Fusionsprotein isoliert werden.
Eluate
1
A
2
3
4
I
II
III
IV
V
5
6
7
8
9
kDa
50
40
30
20
HvrA
10
B
HvrA
Abb. C-7: Reinigung des HvrA-His6-Fusionsproteins aus R. capsulatus
Die Proteinfraktionen der verschiedenen Reinigungsschritte sind in einem Coomassie-blau gefärbten
SDS-PA-Gel (A) und im Western-blot mit HvrA-His6-Antiserum (B) analysiert worden.
Spur 1: 10 kDa-Marker
Spur 6: Eluat II (150-200 mM Imidazol)
Spur 2: Durchfluss
Spur 7: Eluat III (200-250 mM Imidazol)
Spur 3: Waschfraktion 1 (80 mM Imidazol)
Spur 8: Eluat IV (250-300 mM Imidazol)
Spur 4: Waschfraktion 2 (100 mM Imidazol)
Spur 9: Eluat V (300-350 mM Imidazol)
Spur 5: Eluat I (100-150 mM Imidazol)
1.2.3 Analyse des aus R. capsulatus gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins mittels
MALDI-TOF
In Analogie zur Massenbestimmung des aus E. coli gereinigtem HvrA-His6-Fusionsproteins wurde auch das aus R. capsulatus gereinigte Protein einer massenspektrometrischen Bestimmung mittels MALDI-TOF unterzogen. Das MW des HvrA-His6Fusionsproteins wurde in drei parallel durchgeführten Messungen bestimmt. Das Spektrum
51
Ergebnisse
der MALDI-TOF-Analyse der ersten Messung ist in Abbildung C-8 dargestellt. Die
Ergebnisse der drei Messungen sind in Tab.C-2 dargestellt.
12510,97
100
90
Intensität[%]
80
70
60
50
6258,85
40
30
20
10
0
4005
6212,8
8420,6
Masse / Ladung
10628,4
12836,2
Abb. C-8: Molekulargewichtsanalysen des HvrA-His6-Fusionsproteins mittels MALDITOF
Einstellungen des Massenspektrometers: Accelerating: 20000 V, Grid Voltage: 95%, Guide Wire: 0,1%,
Delay time: 4000 nsec, Shots/Spectrum: 150, Mass-Range (Da) 4000 – 15000, Matrix: Sinapinsäure, Laser
Intensity: 2594.
Tab. C-2: Experimentell bestimmte Molekulargewichte (MW) der aus R. capsulatus und
E. coli gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteine
Wirt
R. capsulatus
E. coli
Messung 1
12510,97 Da
12787,51 Da
Messung 2
12481,81 Da
12785,62 Da
Messung 3
12514,65 Da
−
Mittelwert
12502,48 Da
12786,57 Da
Durchschnittliche Peptidmassea
12500,35 Da
Monoisotope Petidmassea
12492,57 Da
a
Die errechneten durchschnittlichen bzw. monoisotopen MW des HvrA-His6-Fusionsproteins wurden durch
das Peptid Mass Program des EXPASY Servers des MPI Heidelberg nach Eingabe der HvrA-His6Aminosäure-Sequenz mit (f)-Methionin ermittelt.
Die molekulare Masse (Mittelwert aus drei parallelen Messungen) des gereinigten
HvrA-His6-Fusionsproteins entsprach mit einer Abweichung von 0,017 % der errechneten
durchschnittlichen Peptidmasse. Die Identität und Reinheit des HvrA-Proteins konnte
durch diese Messung weiter verifiziert werden. Ferner zeigen diese Daten, dass das HvrAProtein am N-terminalen Ende einen (f)-Methionin-Rest besitzt. Das Fehlen des
52
Ergebnisse
Methionins hätte eine Verringerung der Peptidmasse von 131,19 Da zur Folge gehabt und
wäre mit dieser Messmethode leicht zu detektieren gewesen. Des weiteren kann nach
dieser Messung ausgeschlossen werden, dass HvrA-His6 in einer modifizierten Form
vorliegt. Das aus dem homologen Wirt isolierte HvrA-His6-Fusionsprotein wurde für die in
dieser Arbeit beschriebenen DNA-Bindestudien verwendet.
Mit dem beschriebenen Reinigungsverfahren ist es möglich, das HvrA-His6-Fusionsprotein
aus R. capsulatus in ausreichender Menge mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie zu
isolieren. Das HvrA-Protein aus R. capsulatus besitzt am N-terminalen Ende ein
(f)-Methionin. Das aus dem homologen Wirt gereinigte HvrA-His6-Fusionsprotein liegt
unmodifiziert vor.
2
Untersuchungen zur Funktion und Stabilität von HvrA-His6
2.1
Vorbemerkungen
Um auszuschließen, dass der His-Tag die Funktion des HvrA-His6-Fusionsproteins beeinflusst, wurde in einem Komplementationsexperiment untersucht, ob das HvrA-His6Fusionsprotein dieselbe Funktion wie das native HvrA-Protein hat. Darüber hinaus kann
sich auch die Stabilität eines Fusionsproteins von der eines nativen Proteins unterscheiden.
In den nachfolgenden Experimenten wurde der Frage nachgegangen, ob das Fusionsprotein
die Funktion des Wildty-HvrA-Proteins in R. capsulatus ersetzen kann. Ferner wurde auch
die Akkumulation von HvrA und dem HvrA-His6-Fusionsprotein in R. capsulatus
untersucht.
2.2
Komplementation einer R. capsulatus hvrA-Mutante mit hvrA-his6
Eine R. capsulatus hvrA-Mutation (nifA1c, nifH-lacZ, hvrA) führt im Vergleich zum
Parentalstamm (nifA1c, nifH-lacZ) sowohl in Gegenwart, als auch in Abwesenheit von
Ammonium zu einer Steigerung der nifH-Genexpression (Kern et al. 1998). Auch in
Westren-blot Experimenten, die mit einem gegen die Dinitrogenase-Reduktase (NifHProtein) gerichteten Antiserum durchgeführt wurden, konnte gezeigt werden, dass in
Gegenwart von Ammonium nur in der hvrA-Mutante (nifA1c, hvrA) das NifH-Protein
akkumuliert. Wohingegen in Gesamtzellextrakten des Parentalstamms (nifA1c) kein NifHProtein zu detektieren war (Drepper 2000).
53
Ergebnisse
In den folgenden Experimenten wurde nun untersucht, ob das HvrA-His6-Fusionsprotein
die Funktion des HvrA-Wildtyp-Proteins ersetzen kann. Zu diesem Zweck wurde in die
R. capsulatus Stämme B10S (Wildtyp), TD105 (hvrA) und RA7 (hvrA-his6) das replikative
Plasmid pAPA1 (nifA1c) durch konjugativen Transfer eingebracht. Dieses Plasmid
gewährleistet eine konstitutive, von der N-Quelle unabhängige Expression des nifA1-Gens.
Die zu untersuchenden Stämme wurden in RCV-Medium mit NH4+ (Nitrogenase
reprimierende Bedingungen) als einziger N-Quelle bis zur spät logarithmischen Phase
photoheterotroph angezogen. Anschließend wurden Proteinextrakte von den Kulturen
erzeugt. Der Nachweis des NifH-Proteins in den Zellextrakten wurde dann mittels
Western-blot mit dem NifH-Antiserum bestimmt (Abb. C-9).
B10S (hvrA+)
+ pAPA1
TD105 (hvrA–)
+ pAPA1
RA7 (hvrA-his6)
+ pAPA1
A
B
A
B
A
B
1
2
3
4
5
6
NifHADP-R
NifH
Abb. C-9: Bestimmung der NifH Menge aus verschiedenen Stämmen
Zur Bestimmung der Dinirtrogenase-Reduktase Menge (NifH-Protein) wurden die Stämme B10S (Wildtyp),
TD105 (hvrA) und RA7 (hvrA-his6), die alle das replikative Plasmid pAPA1 (nifA1c) enthielten photoheterotroph in RCV-Medium mit Ammonium (Nitrogenase reprimierende Bedingungen) angezogen. Nach
Isolierung der Proteinextrakte zweier paralleler Kulturen (A und B) wurde die NifH-Menge mit Hilfe das R.
capsulatus NifH-Antiserums immunologisch nachgewiesen. Die Pfeile am linken Bildrand markieren die
Positionen der modifizierten Form (NifH-ADP-Ribosyliert) und der unmodifizierten Form (NifH) der
Dinitrogenase-Reduktase.
Im Parentalstamm (B10S mit pAPA1) ist in Gegenwart von NH4+ kein NifH-Protein
nachweisbar. Dies ist auf die Ammonium abhängige Regulation der NifA1-Aktivität
zurückzuführen. In der hvrA-Mutante TD105 (pAPA1) ist eine signifikante Akkumulation
von NifH auch in Gegenwart von NH4+ nachweisbar. Diese Beobachtung entspricht den
Erwartungen, da eine hvrA-Mutation, wie bereits beschrieben, zu einer Synthese des NifHProteins in Anwesenheit von Ammonium führt. In den Zellextrakten des hvrA-his6Stammes RA7 (pAPA1) ist ebenfalls das NifH-Protein zu detektieren. Da aber die Menge
an akkumulierten NifH-Proteinen in dem Stamm RA7 deutlich geringer ist als in der hvrAMutante, kann gefolgert werden, dass das HvrA-His6-Fusionsprotein funktionell ist und
weitgehend eine HvrA-Mutante komplementieren kann.
54
Ergebnisse
Das HvrA-His6-Fusionsprotein ist in R. capsulatus funktionell. Es kann das WildtypHvrA-Protein beinahe vollständig ersetzen.
2.3
Akkumulation von HvrA und HvrA-His6
Nachdem demonstriert werden konnte, dass das HvrA-His6-Fusionsprotein in R.
capsulatus funktionell ist, wurde in einem weiteren Experiment die Proteinstabilität von
HvrA untersucht. Dies war notwendig, um auszuschließen, dass der His-Tag die Stabilität
des Fusionsproteins beeinflusst.
Zur Bestimmung der HvrA- und HvrA-His6-Stabilität wurden der R. capsulatus WildtypStamm (B10S), der hvrA-his6-Stamm (RA7) sowie die hvrA-Mutante (TD105) in RCVMedium mit Serin und Ammonium als einziger Stickstoff-Quelle photoheterotroph
angezogen. Nach Zellernte und Zellaufschluss wurde der Proteinextrakt im SDS-PA-Gel
elektrophoretisch getrennt. Anschließend wurden Proteinmengen mittels Western-blot mit
dem HvrA-Antiserum nachgewiesen (Abb. C-10).
B10S
(hvrA+)
[NH4+]
RA7
(hvrA-his6)
TD105
(hvrA–)
+
–
+
–
+
–
1
2
3
4
5
6
HvrA-His6
HvrA
Abb. C-10: Akkumulation von HvrA und HvrA-His6
Zur Analyse der Akkumulation von HvrA und HvrA-His6-Proteinen wurden der R. capsualtusWildtypstamm (B10S), der hvrA-Mutantenstamm (TD105) und der hvrA-his6-Stamm (RA7) unter
Nitrogenase-reprimierenden Bedingungen (RCV + NH4+ [+]) und unter Nitrogenase-dereprimierenden
Bedingungen (RCV + Serin [–]) angezogen. Der Proteingesamtzellextrakt der untersuchten Stämme wurde
im Western-blot mit HvrA-Antiserum untersucht. Die Pfeile am linken Bildrand markieren die Positionen des
HvrA-Proteins und des HvrA-His6-Fusionsproteins.
In dem in Abb. C-10 dargestellten Western-blot konnte gezeigt werden, dass die
Proteinrohextrakte der Stämme B10S und RA7 vergleichbare Mengen von HvrA bzw.
HvrA-His6 enthalten, was deutlich zeigt, dass der His-Tag keinen signifikanten Einfluss
auf die Proteinstabilität hat. Da das hvrA- und hvrA-his6-Gen der beiden Stämme den
gleichen Promotor haben, und somit die Expression gleich ist, ist deshalb auch der
55
Ergebnisse
Rückschluss auf die Proteinstabilität möglich. Des weiteren ist zu beobachten, dass die
Akkumulation von HvrA unabhängig von den Anzuchtbedingungen erfolgt. Die HvrAMengen der Kulturen, die unter Nitrogenanse reprimierenden Bedingungen (+N) kultiviert
wurden, sind mit den Mengen der Kulturen, die unter Nitrogenanse dereprimierenden
Bedingungen (-N) kultiviert wurden, vergleichbar. In genetischen Analysen, die mittels
hvrA-lacZ-Fusionen durchgeführt wurden, konnte bereits demonstriert werden, dass die
Expression von hvrA unabhängig von der Verfügbarkeit von Ammonium erfolgt (Drepper
2000). Die Ergebnisse der Western-blot Analysen decken sich mit den genetischen Daten
und zeigen darüber hinaus, dass keine posttranskriptionalen Regulationsmechanismen die
hvrA-Expression beeinflussen.
In der hvrA-Mutante (TD105) war kein HvrA-Protein zu detektieren. So konnte mit diesem
Experiment auch demonstriert werden, dass das in dieser Arbeit verwendete Antiserum
spezifisch gegen HvrA gerichtete Antikörper enthält.
Das HvrA-His6-Fusionsprotein weist die gleiche Proteinstabilität wie das native Protein
auf. In R. capsulatus akkumuliert das HvrA-Protein unabhängig von der N-Quelle in der
Zelle.
3
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an verschiedene nif- und anfPromotoren
3.1
Vorbemerkungen
Nachdem in dieser Arbeit demonstriert werden konnte, dass das hvrA-his6-Genprodukt
in vivo eine hvrA Mutation komplementieren kann und somit gezeigt wurde, dass es die
Funktionalität des nativen Proteins hat, wurden im Folgenden in vitro Experimente mit
dem gereinigten HvrA-His6-Fusionsprotein durchgeführt. In diesen Experimenten sollte
HvrA hinsichtlich seiner Wechselwirkung mit den Promotoren der verschiedenen nif- bzw.
anf-Gene in Gel-Retardations-Experimenten charakterisiert werden. Zur Identifizierung
von nif- und anf-Genen, die durch HvrA beeinflusst werden, wurde zuvor lacZFusionsanalysen in unterschiedlichen genetischen Hintergründen durchgeführt (Drepper
2000, Raabe et al. 2002). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben gezeigt, dass HvrA
keinen Einfluss auf die Transkription der nifA- und nifU2-rpoN-Gene hat, während sich
eine hvrA-Mutation auf die Expression der NifA- bzw. AnfA-abhängigen nifH-, nifB- und
56
Ergebnisse
anfH-Gene auswirkt. Eine zentrale Frage dieser Arbeit war, ob HvrA spezifisch nur an
diesen letzt genannten Promotoren binden kann oder generell an alle nif-Promotoren
bindet. Zu diesem Zweck wurde die Bindung von HvrA an die nifH-, nifB-, nifU2-rpoN-,
nifA- und anfH-Promotoren in Gel-Retardations-Experimenten untersucht. Da es sich bei
dem aus E. coli isolierte HvrA-His6-Fusionsprotein möglicherweise um ein modifiziertes
Protein handelt, wurde für die Experimente das aus R. capsulatus gereinigte Fusionsprotein
verwendet.
3.2
Das aus R. capsulatus gereinigte HvrA-His6-Fusionsprotein bindet an den blaPromoter
In einem bereits von Bertin beschriebenen Gel-Retardationsexperiment wurden die
spezifischen Bindungen von H-NS und H-NS-ähnlichen Proteinen, zu denen auch HvrA
zählt, an den bla-Promoter (Pbla) des Plasmides pBR322 untersucht (Bertin et al. 1999,
Goyard und Bertin 1997). Bei den Proteinen handelte es sich um H-NS-His6- und HvrAHis6-Fusionsproteine, die aus E. coli isoliert worden waren. In diesen Experimenten wurde
das Vektorplasmid pBR322 mit den Restriktionsenzymen SspI und TaqI restringiert. An
dem 217 bp Pbla-Fragment konnte dann die spezifische Bindung von H-NS (H-NS-His6)
bzw. HvrA (HvrA-His6) demonstriert werden. Die darüber hinaus entstandenen DNAFragmente des restringierten Vektors dienten als kompetitive DNA. Als Gelsystem wurde
ein 3%iges Meta-Phor Agarosegel verwendet. Um in dieser Arbeit die DNABindeeigenschaft von HvrA an die ausgewählten Promotorfragmente zu untersuchen,
wurde das beschriebene Gelsystem übernommen und dahingehend modifiziert, dass das
Pbla-Fragment mittels PCR aus der Vektor DNA amplifiziert wurde. In Abb. C-11 A ist
schematisch das bla-Promotorfragment und die Lage der für die Transkription des Gens
essentiellen cis-Elemente skizziert. Als kompetitive DNA wurde ein 475 bp Fragment
verwendet, das auch aus dem Vektor amplifiziert wurde. Um die Bindung von HvrA-His6
an den Promotor zu überprüfen, wurden dann in den Ansätzen je 20 ng des Pbla-Fragmentes
und 60 ng der kompetitiven DNA gemischt, im Anschluss steigende Proteinmengen des
aus R. capsulatus gereinigten HvrA-His6-Fusionsproteins hinzugegeben und anschließend
in einem 3 %igen MetaPhor Agarosegel aufgetrennt (Material und Methoden). Die
Bindung von HvrA an ein DNA-Fragment führte zu einer Veränderung der
elektrophoretischen Mobilität während der Gelelektrophorese. Um die mit Ethidiumbromid
angefärbten DNA-Banden im Agarosegel deutlicher präsentieren zu können, wurden die
Gelbilder in den folgenden Abbildungen als Negativbild dargestellt.
57
Ergebnisse
A
-35/-10
500 bp
RBS
bla
-35/-10
RBS
Pbla
σ70
B
µM HvrA-His6
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9 5,5 6,1
Kompetitor
Pbla
Pbla
-35/-10
RBS
Abb. C-11: Bindung von HvrA-His6 an den Promotor des β-Laktamase Gens (Pbla)
Im oberen Teil der Abbildung (A) ist schematisch die Gen- und Promotorregion des β-Laktamase Gens (Pbla)
des Vektors pBR322 dargestellt. Die relative Lage der cis-Elemente in der Promotorregion sind durch Boxen
gekennzeichnet. Zur Bestimmung der DNA-Bindeeigenschaften (B) von HvrA-His6 an den Promotor des
β-Laktamase Gens (Pbla) wurden in dem Gel-Retardationsexperiment 20 ng von Pbla und 60 ng der
kompetitiven DNA eingesetzt. Zu der DNA wurden Proteinkonzentrationen von 0 bis 6,1 µM hinzu gegeben.
Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −35/−10 (σ70-Bindestelle)
In Abbildung C-11 B ist die spezifische Bindung von HvrA an das Pbla-Fragment ab einer
HvrA-Konzentration von 3,1 µM zu beobachten. Dies deckt sich mit den in der Literatur
veröffentlichen Daten (Bertin et al. 1999) und zeigt, dass das aus R. capsulatus gereinigte
HvrA-His6-Fusionsprotein diese Bindeeigenschaft aufweist. Eine Bindung von HvrA an
die kompetitive DNA tritt nicht auf. Da in diesem modifizierten Test-System die
spezifische Bindung von HvrA an den Pbla demonstriert werden konnte, wurde es für die
folgenden
DNA-Bindestudien
an
weiteren
Promotorfragmenten
verwendet.
Die
Amplifikation der Promotorfragmente mittels PCR-Methode wurde in diesem Test-System
gewählt, da es schwierig war, die im Folgenden zu untersuchenden nif- und anfPromotoren in ein Promotor freies Plasmid zu klonieren.
58
Ergebnisse
Das verwendete kompetitive Gel-Retardationssystem eignet sich, um die spezifische
Bindung von HvrA an den Promotor des β-Lactamase-Gen zu demonstrieren.
3.3
Auswahlkriterien der zu untersuchenden Promotorfragmente
Im Folgenden wurden die Bindeeigenschaften von HvrA an die Promotoren der Gene nifH,
nifB1, rpoN, nifA1 und anfH untersucht. Die Auswahl der DNA-Abschnitte des jeweiligen
Pomotors der nif- und anf-Gene wurde unter den folgenden Gesichtspunkten vorgenommen:
(i)
Wie auch schon für H-NS aus E. coli in Gel-Retardations- und DNA-footprintExperimenten gezeigt werden konnte, befinden sich die Bereiche, an denen H-NS
binden kann, in der Regel stromaufwärts des Translationsstarts der Zielgene
(Altung und Ingmer 1997). In Analogie zu dieser Beobachtung wurden die
Promotorbereiche der zu untersuchenden nif- und anf-Gene stromaufwärts vom
entsprechenden Translationsstart amplifiziert.
(ii)
Für die Transkriptionsaktivierung der ausgewählten Gene müssen mehrere Proteine
an die entsprechenden Promotoren binden:
-
ein Transkriptionsaktivator der Enhancer-Bindeprotein-Familie (NtrC, NifA
oder AnfA)
-
eine RNA-Polymerase (σ70 bzw. σ54)
-
der IHF (integration host factor)
In Tabelle C-3 sind diese Proteine zusammengefasst dargestellt. Für die jeweiligen
Proteine existieren in den entsprechenden Promotorregionen konservierte DNABindestellen (Aktivatorbindestelle: UAS, IHF-Bindestelle und RNA-PolymeraseBindestellen). Da bereits für H-NS beschrieben wurde, dass sich der Bindebereich
des H-NS-Proteins teilweise mit Binderegionen von Transkriptionsaktivatoren
deckt und durch die Bindung von H-NS die Aktivatoren von dem Promotor
verdrängt werden können, ist nicht auszuschließen, dass auch HvrA bevorzugt an
die cis-Elementen der nif- und anf-Genregion bindet (van Ulsen et al. 1996,
Afflerbach et al. 1999).
(iii)
Darüber hinaus sollten die eingesetzten Fragmente nicht größer als 320 bp sein, um
eine Bindung detektieren zu können.
59
Ergebnisse
Tab. C-3: cis-Elemente der nif- und anf-Promotorregionen
Gen
UAS
IHF
NtrC-P
nifH
NifA
+
σ54
nifB1
NifA
+
σ54
nifU2-rpoN
NifA
?
σ54
nifA1
NtrC
?
σ70
anfH
AnfA
+
σ54
Um für die Gel-Retardations-Experimente DNA-Fragmente einsetzen zu können, die alle
angeführten Anforderungen erfüllen, wurden die ausgewählten Promotorfragmente gezielt
mittels PCR aus der chromosomalen DNA von R. capsulatus amplifiziert.
60
Ergebnisse
3.4
HvrA bindet an den nifH-Promotor
In diesem Experiment wurde untersucht, ob HvrA an den nifH-Promotor spezifisch binden
kann. Zu diesem Zweck wurde neben dem PnifH-Fragment als negative Kontrolle ein
internes nifH-Gen-Fragment (`nifH´) derselben Größe verwendet (Abb. C-12 A).
A
UAS
fdxD
IHF-BS
500 bp
-24/-12 RBS
nifH
IHF-BS
PnifH
UAS
-24/-12
RBS
`nifH´
NifA
IHF
σ54
µM HvrA-His6
B
0
1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9 5,5 6,1
Kompetitor
IHF-BS
PnifH
UAS
-24/-12
RBS
PnifH
µM HvrA-His6
0
1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9 5,5 6,1
Kompetitor
`nifH´
`nifH´
Abb. C-12: HvrA-Bindestudien mit dem nifH-Promotor (PnifH)
Im oberen Teil der Abbildung (A) ist schematisch die Gen- und Promotorregion des nifH-Gens mit den
verschiedenen cis-Elementen dargestellt. Zur Bestimmung der DNA-Bindeeigenschaften von HvrA-His6 an
den Promotor des nifH-Gens (PnifH) wurden in dem Gel-Retardations-Experiment 20 ng von PnifH und 60 ng
kompetitive DNA eingesetzt (B). Zu der DNA wurden HvrA-Proteinkonzentrationen von 0 bis 6,1 µM
hinzugegeben. Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 (σ54-Bindestelle), UAS (upstream
activator sequence), IHF-BS (integration host factor-Bindestelle).
61
Ergebnisse
Aus der Abb. C-12 B wird ersichtlich, dass HvrA ab einer Proteinkonzentration von 2,5
µM spezifisch an das PnifH-Fragment bindet. Eine Bindung an das interne `nifH´-Fragment
ist jedoch bei keiner HvrA-Konzentration zu beobachten. Dieses Experiment zeigt
deutlich, dass HvrA nicht nur spezifisch an das Pbla-Fragment, sondern auch an die
Promotorregion des nifH-Gens binden kann.
In der Literatur wurden nicht nur DNA-Bindestudien mit H-NS aus E. coli mittels der
beschriebenen Agarosegelsystems durchgeführt, sondern auch in einem anderen
Gelsystem. So können z.B. zu untersuchende DNA-Fragmente mit
32
P markiert und nach
Inkubation mit H-NS in einem nicht denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoretisch
aufgetrennt und mittels Phosphoimagager visualisiert werden. Als kompetitive DNA diente
hierbei poly(dIdC) (Tipper et al. 1994).
Nachdem gezeigt werden konnte, dass das Agarosegelsystem nicht nur geeignet ist, um die
Bindung von HvrA an den Promotor des Pbla nachzuweisen, sondern auch an den Promotor
des nifH-Gens (PnifH), wurde als nächstes untersucht, ob diese Bindungen auch auf ein
Polyacrylamidgelsystem übertragbar sind. Zu diesem Zweck wurden je 3 ng radioaktiv
markierte Pbla- und PnifH-Fragmente nach Inkubation mit 0,6 nM HvrA im
Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt (Abb. C-13).
PnifHI
Pbla
poly[dIdC]
–
–
+
–
–
+
HvrA-His6
–
+
+
–
+
+
Abb. C-13: HvrA-Bindestudien mit 32P-markierten Promotoren des β-Laktamase Gens
(Pbla) und des nifH-Gens (PnifH)
Für die Bindestudien wurden jeweils 3 ng 32P-makierter Pbla- bzw. PnifH-DNA bzw. 0,6 µM HvrA-His6
eingesetzt. Als kompetitive DNA dienten 120 ng poly(dIdC). Die Zugabe von Protein und/oder poly(dIdC)
werden durch ein „+“-Zeichen und das Fehlen durch ein „−“ Zeichen verdeutlicht.
Deutlich ist die DNA-Bindung von HvrA an die Promotorfragmente Pbla und PnifH in
Abbildung C-13 zu erkennen. Durch Zugabe von 120 ng kompetitiver DNA (poly[dIdC])
zu
den
Proben
konnte
die
DNA-Bindung
inhibiert
werden.
Auch
in
dem
Polyacrylamidgelsystem konnte die Bindeeigenschaft von HvrA reproduziert werden.
62
Ergebnisse
HvrA bindet spezifisch an den Promotor des nifH-Gens.
3.5
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an die Promotoren der Gene nifU2,
nifB1 und nifA1
Desweiteren wurde die Bindung von HvrA an die Promotorregionen von nifU2-rpoN,
nifB1 und nifA1 untersucht. Wie bereits Tabelle C-3 zu entnehmen ist, unterscheiden sich
die Promotorregionen von nifB1 und nifU2-rpoN von der des nifA1-Promotors in zwei
wesentlichen Eigenschaften (siehe Abb. C-14 A und C-15 A). Die Transkription der Gene
nifB1 und nifU2-rpoN wird durch das Regulatorprotein NifA Protein aktiviert und durch
die σ54-RNA-Polymerase katalysiert. Dem gegenüber wird die Expression des
Transkriptionsaktivatorgens nifA durch den phosphorylierten Regulator NtrC (NtrC-P) und
der σ70-RNA-Polymerase aktiviert. Die DNA-Bindestudien dieser drei Promotorfragmente
wurden unter den gleichen Bedingungen, die auch für Bindung an das nifHPromotorfragment gewählt wurden, durchgeführt und sind in den Abbildungen C-14 B und
C-15 B dargestellt.
63
Ergebnisse
A
500 bp
UAS -24/-12 RBS
nifK
nifU2
PnifU2
rpoN
UAS
NifA
B
-24/-12 RBS
σ54
µM HvrA-His6
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9 5,5 6,1
Kompetitor
PnifU2
Abb. C-14: HvrA-Bindestudien mit dem nifU2-rpoN-Promotor (PnifU2)
In oberen Teil der Abbildung (A) ist schematisch die Gen- und Promotorregion des nifU2-rpoN-Operons mit
verschiedenen cis-Elementen dargestellt. Zur Bestimmung der DNA-Bindeeigenschaften von HvrA-His6 an
den nifU2 Promotor wurden in dem Gel-Retardations-Experiment 20 ng von PnifU2 und 60 ng kompetitive
DNA eingesetzt (B). Zu der DNA wurden Proteinkonzentrationen von 0 bis 6,1 µM hinzu gegeben.
Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 (σ54-Bindestelle), UAS (upstream activator sequence),
In Abbildung C-14 B ist eine Bindung von HvrA an das PnifU2-Fragment ab einer
Proteinkonzentration von 3,7 µM zu beobachten. Demgegenüber konnte in Abbildung C15 B keine Bindung von HvrA an die Promotorfragmente der nifA1- und nifB1-Gene
(PnifA1, PnifB1) selbst mit hohen HvrA Konzentration beobachtet werden.
64
Ergebnisse
1000 bp
A
IHF-BS
UAS
-24/-12 RBS
UAS -35/-10 RBS
nifA1
nifB1
PnifA1
UAS
PnifB1
-35/-10
RBS
σ70
NtrC-P
B
UAS
IHF-BS -24/-12
IHF
NifA
RBS
σ54
µM HvrA-His6
0
1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9 5,5 6,1
PnifA1
Kompetitor
UAS
-35/-10
RBS
PnifA1
µM HvrA-His6
0
Kompetitor
1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9 5,5 6,1
PnifB1
UAS
IHF-BS -24/-12
RBS
PnifB1
Abb. C-15: HvrA-Bindestudien mit dem nifA1- (PnifA1) und nifB1-Promotor (PnifB)
In oberen Teil der Abbildung (A) ist schematisch die Gen- und Promotorregion des nifA1- und nifB1-Gens
mit verschiedenen cis-Elementen dargestellt. Zur Bestimmung der DNA-Bindeeigenschaften von HvrA-His6
an den Promotor des nifA1- und nifB1-Gens wurden in dem Gel-Retardations-Experiment 20 ng von PnifA1
und PnifB1 und 60 ng kompetitive DNA eingesetzt (B). Zu der DNA wurden Proteinkonzentrationen von 0 bis
6,1 µM hinzu gegeben. Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 und −35/−10 (σ54- und σ70Bindestelle), UAS (upstream activator sequence), IHF-BS (integration host factor-Bindestelle).
65
Ergebnisse
Somit scheint HvrA nicht, wie erwartet, an alle nif-Promotoren zu binden, die durch den
Transkriptionsaktivator NifA1 aktiviert werden.
HvrA bindet nicht an alle NifA-regulierten nif-Promotoren. Jedoch konnte eine Bindung
von HvrA an den nifU2-rpoN-Promotor demonstriert werden.
3.6
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an verschiedene Subfragmente des
nifH-Promotors
Nachdem die spezifische Bindung von HvrA an den Promotor des nifH-Gens demonstriert
werden konnte, wurde in weiteren Experimenten untersucht, in welchen Bereichen der
nifH-Promotorregion HvrA bindet und welche cis-Elemente möglicherweise für eine
Bindung wichtig sind. Zu diesem Zweck wurden zwei Subfragmente aus dem
nifH-Promotorbereich mittels PRC amplifiziert (Abb. C-16), die nach folgenden Kriterien
ausgewählt wurden: (i) Um untersuchen zu können, ob einzelne cis-Elemente der nifHPromotorregion ausreichen, um die HvrA-Bindung herbeizuführen, sollten diese
Fragmente entweder nur ein, bzw. zwei cis-Elemente enthalten. (ii) Außerdem sollte die
Größe der Subfragmente der Größe des Fragmentes PnifH entsprechen. Diese Subfragmente
werden im Folgenden als PnifH-up (enthält die UAS) und PnifH-down (enthält die IHF-BS
und die σ54-BS) bezeichnet (Abb. C-16).
66
Ergebnisse
500 bp
IHF-BS
fdxD
UAS
-24/-12 RBS
nifH
PnifH
PnifH -up
PnifH -down
`nifH´
Abb. C-16: Schematische Darstellung der Subfragmente des nifH-Promotors
In der Abbildung sind schematisch die für die Gel-Retardations-Experimente eingesetzten Subfragmente des
nifH-Promoters dargestellt. Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 (σ54-Bindestelle), UAS
(upstream activator sequence), IHF-BS (integration host factor-Bindestelle)
Da in vorangegangenen Experimenten eine Gel-Retardation des PnifH-Fragmentes ab einer
HvrA-Konzentration von 3 µM zu erkennen war, wurden im folgenden Experiment
Proteinkonzentrationen von 0 µM bis 4,9 µM eingesetzt (Abb. C-17). Als negative
Kontrolle diente wieder das interne `nifH´-Fragment. Wie auch schon in Abb. C-12
gezeigt, bindet HvrA spezifisch an das PnifH-Fragment, wohingegen keine Bindung von
HvrA an das als Kontrolle dienende Fragment (`nifH´) zu erkennen ist.
67
Ergebnisse
UAS
PnifH
IHF-BS
-24/-12
RBS
µM HvrA-His6
0
UAS
`fdxD
PnifH -up
µM HvrA-His6
1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9
Kompetitor
Kompetitor
PnifH -5´-up
PnifH
IHF-BS -24/-12 RBS
nifH´
`nifH´
`nifH´
PnifH -down
µM HvrA-His6
µM HvrA-His6
0 4,9
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9
Kompetitor
Kompetitor
PnifH -3´-down
`nifH´
Abb. C-17: HvrA-Bindestudien mit dem nifH-Promotor (PnifH) und den Subfragmenten
PnifH-up und PnifH-down
Zur Bestimmung der DNA-Bindeeigenschaften von HvrA-His6 an die Subfragmente des nifH-Promotors
wurden in dem Gel-Retardationsexperiment 20 ng des zu untersuchenden Promotorfragmentes und 60 ng
kompetitive DNA eingesetzt. Zu der DNA wurden Proteinkonzentrationen von 0 bis 4,9 µM hinzu gegeben.
Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 (σ54-Bindestelle), UAS (upstream activator sequens),
IHF-BS (integration host factor-Bindestelle)
Zudem ist auch keine spezifische Bindung an das Subfragment PnifH-up, welches nur die
UAS enthält, zu beobachten. Dagegen ist mit dem Fragment PnifH-down, welches die IHFBS und die σ54-BS trägt, bei einer HvrA-Konzentration von 4,9 µM eine schwache
Bindung zu beobachten. Somit liegt nahe, dass auf diesem Subfragment DNA-Bereiche
enthalten sind, an die HvrA, wenn auch schwach, binden kann. Daraus kann gefolgert
werden, dass sich ein Teil der Binderegion von HvrA möglicherweise mit der IHF-BS oder
der σ54-BS überlappt.
68
Ergebnisse
Es werden alle cis-Elemente des nifH-Promotors benötigt, damit HvrA vollständig an das
PnifH-Fragment binden kann. Eine schwache, unvollständige Bindung von HvrA ist erst ab
einer Proteinkonzentration von 4,9 µM HvrA an den Subfragment PnifH-down zu erkennen,
welches die IHF-BS und die σ54-BS trägt.
3.7
Untersuchungen zur Bindung von HvrA an den anfH-Promotor
In den vorangegangenen Experimenten wurden die DNA-Bindeeigenschaften von HvrA an
die Promotorregionen verschiedener nif-Gene untersucht. In den folgenden Bindestudien
sollte nun geklärt werden, ob HvrA auch an den anfH-Promotor binden kann. In Analogie
zu den Bindestudien mit der nifH-Promotorregion wurde in diesen Studien neben dem
anfH-Promotorfragment (PanfH), welches alle für die Transkriptionsaktivierung des anfHGens essentiellen cis-Elemente trägt, auch die Bindung von HvrA an zwei Subfragmente
der anfH-Promotorregion untersucht. In diesen Experimenten wurde durch die
Verwendung von Subfragmenten ebenfalls der Frage nachgegangen, ob einzelne cisElemente, die in der Promotorregion lokalisiert sind, schon ausreichen, um eine Bindung
von HvrA herbeizuführen. Bei der Auswahl der zu untersuchenden Fragmente musste
jedoch berücksichtigt werden, dass im Gegensatz zum nifH-Promotor die Lage der AnfABindestelle (UAS) in der anfH-Promotorregion von R. capsulatus bislang noch unbekannt
ist. Genetische Untersuchungen haben aber gezeigt, dass AnfA für die Transkription des
anfHDGK-Operons essentiell ist (Schüddekopf 1994). Da sich die UAS für AnfA in
Azotobacter vinelandii 200 bis 300 bp stromaufwärts des Transkriptionsstarts befindet
(Drummond et al. 1995), wurde ein Bereich des anfH-Promotors amplifiziert, welcher
ausgehend vom Transkriptionsstart des anfH-Gens stromaufwärts 300 bp umfasst (PanfH).
Somit sollte gewährleistet werden, dass alle bekannten cis-Elemente des Promotors
inklusive der noch nicht charakterisierten UAS auf diesem Fragment enthalten sind
(Abb. C-18). Ein internes Fragment des anfH-Gens diente auch in diesem Experiment als
negative Kontrolle. Für die Erzeugung der Subfragmente der anfH-Promotorregion wurden
die Primer so gewählt, dass (i) diese Fragmente dieselbe Größe des PanfH aufweisen und (ii)
entweder ein oder zwei der in der anfH-Promotorregion enthaltenen cis-Elemente tragen
(Abb. C-18). Diese Subfragmente wurden als PanfH-up und PanfH-down bezeichnet. Für die
DNA-Bindestudien wurden dann, wie in den vorangegangenen Studien, gleiche DNAMengen mit steigenden HvrA-Konzentrationen von 0 bis 4,9 µM gemischt und
elektrophoretisch in einem Agarosegel getrennt.
69
Ergebnisse
500 bp
-24/-12
UAS ? IHF-BS
RBS
anfA
anfH
PanfH
PanfH -up
PanfH -down
`anfH´
Abb. C-18: Schematische Darstellung der Subfragmente des anfH-Promotors
In der Abbildung sind schematisch die für die Gel-Retardations-Experimente eingesetzten Fragmente des
anfH-Promotors dargestellt. Abkürungen: RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 (σ54-Bindestelle), IHF-BS
(integration host factor-Bindestelle)
In Abbildung C-19 sind die Ergebnisse der Gel-Retardations-Experimente dargestellt. Eine
spezifische Bindung von HvrA an das PanfH-Fragment ist, wie auch schon für das PnifHFragment gezeigt werden konnte, ab einer HvrA-Konzentration von 2,5 µM zu erkennen.
Auch die HvrA-Bindung an das PanfH-Fragment ist spezifisch, da keine Gel-Retardation mit
dem internen `anfH´-Fragment zu erkennen ist. Ebenfalls ist auch keine Bindung von
HvrA an das Subfragment PanfH-down zu beobachten, welches die RNA-PolymeraseBindestelle trägt. Jedoch ist ab höheren HvrA-Konzentrationen von 4,3 und 4,9 µM eine
leichte Bindung von HvrA an das Subfragment PanfH-up festzustellen (Abb. C-19). Diese
Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: HvrA bindet spezifisch an die
Promotorregion des anfH-Gens. Für die spezifische und vollständige Bindung von HvrA
werden, wie auch schon für den nifH-Promotor demonstriert werden konnte, alle in dem
DNA-Abschnitt enthaltenen cis-Elemente benötigt. In hoher Konzentration kann HvrA
jedoch auch an das Subfragment des anfH-Promotors, welches neben der putativen UAS
auch die IHF-BS aufweist, schwach binden.
70
Ergebnisse
PanfH
IHF-BS
UAS ?
-24/-12 RBS
UAS ? IHF
PanfH -up
µM HvrA-His6
µM HvrA-His6
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9
Kompetitor
Kompetitor
PanfH
PanfH -up
-24/-12 RBS
PanfH -down
`anfH´
µM HvrA-His6
µM HvrA-His6
0
0 1,9 2,5 3,1 3,7 4,3 4,9
Kompetitor
PanfH -down
4,9
Kompetitor
`anfH´
Abb. C-19: HvrA-Bindestudien mit dem anfH-Promotor (PanfH) und den Subfragmenten
PanfH-up und PanfH-down
Zur Bestimmung der DNA-Bindeeigenschaften von HvrA-His6 an Fragmente des anfH-Promotors wurden in
dem Gel-Retardationsexperiment 20 ng des zu untersuchenden Promotorfragmentes und 60 ng kompetitive
DNA eingesetzt. Zu der DNA wurden Proteinkonzentrationen von 0 bis 4,9 µM hinzugegeben. Abkürungen:
RBS (Ribosomale Bindestelle), −24/−12 (σ54-Bindestelle), UAS (upstream activator sequence), IHF-BS
(integration host factor-Bindestelle)
HvrA bindet schon bei geringen Proteinkonzentrationen spezifisch an den Promotor des
anfH-Gens. Für diese spezifische Bindung werden alle cis-Elemente benötigt. Eine
schwache Bindung von HvrA erfolgt erst bei hohen Proteinkonzentrationen an das PanfHup-Fragment, welches die IHF-BS und die UAS trägt.
71
Ergebnisse
4
Die Rolle von NrfA bei der Regulation der Stickstoff-Fixierung in
R. capsulatus
4.1
Vorbemerkungen
In R. capsulatus existiert neben HvrA und IHF noch ein weiteres DNA-assoziiertes
Protein, NrfA (Nitrogen regulation factor A), welches möglicherweise eine Rolle bei der
Regulation der Stickstoff-Fixierungsgene spielt (Giaourakis 2000, Drepper et al. 2002).
Das NrfA-Protein, dessen Gen in R. capsulatus in der ntr-Genregion lokalisiert ist (Abb.
C-20 A), weist mit 70 % eine hohe Homologie zu dem aus Azorhizobium caulinodans
bekannten NrfA-Protein auf. Aufgrund von Untersuchungen in A. caulinodans ist bekannt,
dass NrfA für die Expression von nifA benötigt wird (Kaminski et al. 1994). So führt eine
–
nrfA-Mutation in A. caulinodans in Folge der fehlenden NifA Synthese zu einem Nif Phänotyp. In den folgenden Untersuchungen wurde daher der Frage nach gegangen, ob
NrfA in R. capsulatus einen Einfluss auf die Regulation und die Synthese der beiden
Nitrogenasesysteme hat.
4.2
Die Rolle von NrfA bei der Stickstoff-Fixierung
Um zu klären, ob NrfA einen Einfluss auf die Aktivität der Molybdän-Nitrogenase (MoNitrogenase) hat, wurden zu Beginn dieser Analysen das diazotrophe Wachstum des
R. capsulatus Wildtypstammes (B10S) und einer nrfA-Mutante (DG7; AbbC-20 B;
Giaourakis 2000) untersucht. Da R. capsulatus sowohl mit der Molybdän-Nitrogenase als
auch mit der alternativen Nitrogenase in der Lage ist, atmosphärischen Stickstoff als
einzige Stickstoffquelle zu nutzen, kann das diazotrophe Wachstum deshalb indirekt
Aufschluss
über
die
Aktivität
der
jeweiligen
Nitrogenasesysteme
geben.
Als
Negativkontrolle diente in diesem Experiment der R. capsulatus Stamm TD6. Dieser
Stamm weist neben einer Mutation in den Strukturgenen der Mo-Nitrogenase (∆nifHDK)
noch eine Mutation im Regulatorgen der alternativen Nitrogenase, anfA auf. Dies hat zur
Folge, dass in diesem Stamm keines der beiden Nitrogenasesysteme synthetisiert wird und
dieser Stamm sowohl einen Nif–- als auch einen Anf–-Phänotyp aufweist.
72
Ergebnisse
A
nifR3
ntrB
ntrC
ntrY
ntrX
nrfA
hflX
orf2422
nrfA
B
DG7
Ω-Spc
Abb. C-20: Die ntr-Genregion aus R. capsulatus
Der obere Teil der Abbildung (A) zeigt die Anordnung der R. capsualtus ntr-Genregion. Im unteren Teil (B)
ist schematisch die Lokalisation des Spectinomycin-Interposons des in dieser Arbeit verwendeten nrfAMutantenstammes DG7 dargestellt. Die Größe des Interposons ist nicht maßstabsgetreu.
Die R. capsulatus Stämme wurden in RCV-Medium ohne Stickstoffquelle mit einem
Ausgangswert der optischen Zelldichte von 0,1 (Wellenlänge: λ = 660 nm; o.D.660) in
gasdichten Reagenzgläsern angeimpft und mit N2-Gas begast. Das diazotrophe Wachstum
(Verwendung von N2 als N-Quelle) der Testkulturen wurde über einen Zeitraum von 60
Stunden (h) verfolgt. Die Wuchskurven sind in Abb. C-21 dargestellt. Darüber hinaus
wurden die Stämme parallel unter Nitrogenase reprimirenden Bedingungen in RCVMedium mit Ammonium (+N) als Stickstoffquelle (Positivkontrolle) kultiviert.
73
Ergebnisse
Optische Dichte bei 660 nm
A
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Wildtyp
nrfA
∆nifHDK, anfA
[+ N]
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [h]
Optische Dichte bei 660 nm
B
1,4
− N]
[−
1,2
Wildtyp
nrfA
1,0
0,8
0,6
0,4
∆nifHDK, anfA
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [h]
Abb. C-21: Diazotrophes Wachstum des R. capsulatus Wildtyps und einer nrfA-Mutante
Zur Bestimmung der Auswirkung eine nrfA-Mutation auf das diazotrophe Wachstum wurden die Stämme
B10S (Wildtyp), DG7 (nrfA) und TD6 (∆nifHDK, anfA) in RCV ohne Stickstoffquelle (–N) und in RCV mit
Ammonium (+N) über einen Zeitraum von 60 h kultiviert.
Wie in Abbildung C-21 A dargestellt, weisen alle untersuchten Stämme, die in
Ammonium-haltigem Medium kultiviert wurden, gleiche Wuchseigenschaften auf. Nach
60 h erreichen alle Stämme annähernd die gleich o.D.660 von 1,8. Somit kann gezeigt
werden, dass eine nrfA-Mutantion keinen Einfluss auf das Wachstum unter Ammonium
suffizienten Bedingungen hat. Anhand der Wuchskurven der Zellen, die in Stickstofffreien Medium (N2-Gas als einzige N-Quelle) kultiviert wurden, ist zu erkennen, dass der
Wildtyp nach einem Zeitraum von ca. 20 h die logarithmische Wuchsphase erreicht hat
und danach stetig bis zu einer maximalen o.D.660 von ca. 1,3 wächst. Die
Wuchseigenschaften des Wildtypstammes unter diazotrophen Bedingungen sind in etwa
mit denen im Ammonium-haltigen Medium vergleichbar und zeigen, dass N2 eine
ausreichende Stickstoffquelle darstellt. Aufgrund der Mutationen in den Genen, die für die
Apoproteine der Mo-Nitrogenase und den Transkriptionsaktivator der alternativen
Nitrogenase kodieren, war der Kontrollstammens TD6 wie erwartet nicht in der Lage,
74
Ergebnisse
diazotroph zu wachsen. Der Stamm DG7 (nrfA) zeigte in der früh logarithmischen
Wuchsphase (nach ca. 20 h) unter diazotrophen Wuchsbedingungen, im Vergleich zu
Wildtyp, ein um ca. 40% verringertes Wachstum. Je länger aber die Zellen kultiviert
wurden, desto mehr relativierte sich dieser anfängliche Wuchsdefekt und die Zellen
erreichten nach 60 h eine o.D.660 von ca. 1. Diese Ergebnisse zeigen, dass NrfA in R.
capsulatus für das diazotrophe Wachstum nicht essentiell ist, aber für das maximale
Wachstum benötigt wird. Diese verringerte Wuchsrate der nrfA-Mutante kann nur auf eine
Beeinträchtigung der Molybdän-Nitrogenase-Aktivität oder eine verringerte Synthese
zurück geführt werden.
Aus diesem Grund wurde in einem anschließenden Experiment die in vivo NitrogenaseAktivität derselben Stämme (Wildtyp, nrfA– und ∆nifHDK/anfA–)
im Acetylen-
reduktionstest quantifiziert. Dazu wurden die Stämme unter N-Mangelbedingungen (+
Serin) und unter Nitrogenase-reprimierenden (+ N) Bedingungen in RCV-Medium
photoheterotroph bis zur spätlogarithmischen Wuchsphase angezogen. Die Ergebnisse des
anschließend durchgeführten Acetylen-Reduktionstests sind in Tabelle C-4 zusammengefasst.
Tab. C-4: Aktivität der Molybdän-Nitrogenase in einer nrfA-Mutante
Stamm
Nitrogenase-Aktivitäta
relevanter Genotyp
−N
+N
B10S
Wildtyp
3,1
±
1,4
637,4
±
24,0
DG7
nrfA
0,4
±
0,1
86,3
±
16,1
TD6
∆nifHDK,
0,9
±
0,2
anfA
n.g
a
Die Aktivität der Molybdän-Nitrogenase wurde nach Anzucht der R. capsulatus Stämme unter AmmoniumMangelbedingungen (RCV mit 9,5 mM Serin; −N) und in Gegenwart von 20 mM NH4+ (+N) anhand eines
Acetylenreduktionstests bestimmt. Die Enzymaktivität ist in nmol Ethylen / h x mg Protein) angegeben. Die
Daten repräsentieren Mittelwerte aus drei voneinander unabhängigen Messungen. n.g.: nicht gemessen
Im Wildtypstamm (B10S) führt der Ammoniummangel (−N) zur Synthese der MoNitrogenase, die über einen Zeitraum von 16 h, bezogen auf mg Protein,
Acetylen umsetzt. In dem entsprechenden,
637 nmol
mit Ammonium kultivierten (+N)
Wildtypstamm, ist aufgrund der NH4+-Regulation keine Nitrogenase exprimiert worden
und folglich auch keine Enzymaktivität nachweisbar. Der Stamm TD6 (∆nifHDK, anfA)
weist unter den getesteten Anzuchtbedingungen keine Nitrogenaseaktivität auf. In der
nrfA-Mutante ist nur unter N-Mangelbedingungen ein Umsatz von 86 nmol Acetylen zu
75
Ergebnisse
messen, der im Vergleich zum Wildtypstamm einer Restaktivität von etwa 13 % entspricht.
Wie bereits vermutet führt eine Mutation im nrfA-Gen in R. capsulatus zu einer
erheblichen Beeinträchtigung der Nitrogenase-Aktivität.
In einer weiteren Analyse sollte nun ausgeschlossen werden, dass der gerade beschriebene
nrfA-Phänotyp auf einen polaren Effekt der Ω Spc-Kassette, die sich im nrfA-Gen des
Stammes DG7 befindet, zurückzuführen ist (Abb.C-22 A). Nach der Insertion der Ω SpcKassette in das nrfA-Gen könnte die Expression des stromabwärts liegenden hflX-Gens
ausbleiben. Außerdem war noch nicht geklärt, von welchem Promotor aus die
Transkription des nrfA-Gens erfolgt. Da in R. capsulatus nrfA stromabwärts der ntr-Gene
lokalisiert ist, könnte das nrfA-Gen mit den ntr-Genen co-transkribiert werden. Darüber
hinaus könnte aber auch die Transktiption von nrfA von einem Promotor aus erfolgen, der
in der 196 bp ntrX-nrfA intergenischen Region lokalisiert ist (Abb. C-22). Die folgenden
Analysen sollten außerdem einen Aufschluss über die Lage des nrfA-Promotors liefern.
Zu diesem Zweck wurde im Folgenden ein Komplementationsexperiment durchgeführt.
Zunächst wurde aus dem Plasmid pDG8-1I ein 952 bp Fragment, auf dem das gesamte
nrfA-Gen sowie ein Teil des stromaufwärts gelegenen `3-Bereichs des ntrX-Gens, und
damit auch die putative Promotorregion von nrfA und des stromabwärts gelegenen 5´Bereichs des hflX-Gens, mit dem Restriktionsenzymen BamHI und SalI herausgeschnitten
(Abb. C-22).
76
Ergebnisse
A
nifR3
ntrB
ntrC
ntrY
ntrX
nrfA
hflX
orf2422
?
?
nrfA
DG7
Ω-Spc
BamHI
B
pNAP1
`ntrX
SalI
?
nrfA
hflX´
Abb. C-22: Darstellung der ntr-Genregion aus R. capsulatus und des erzeugten Plasmides
pNAP1
Der obere Teil der Abbildung (A) zeigt die Anordnung der R. capsualtus ntr-Genregion und schematisch die
Lokalisation des Spectinomycin-Interposons des in dieser Arbeit verwendeten nrfA-Mutantenstammes DG7.
Im unteren Teil (B) ist das Plasmid pNAP1 schematisch und nicht maßstabstreu abgebildet. In der Abbildung
sind die für die Erzeugung des Komplementations-Plasmides pNAP1 benötigten Restriktionsschnittstellen
(BamHI, SalI) dargestellt. Der putative Promotor des nrfA-Gens in der intergenischen ntrX-nrfA Region ist
durch einen Pfeil symbolisiert.
Das Fragment wurde in den zuvor mit BamHI und SalI restringierten Vektor
pBBR1MCS-2 ligiert. Das erhaltene, selbst replizierende, rekombinante Plasmid (pNAP1)
wurde dann durch konjugativen Transfer in die Stämme B10S und DG7 eingebracht (siehe
Abb. C-22 B). Um die Komplementation der nrfA-Mutante zu untersuchen, wurden
anschließend im in vivo Nitrogenase-Aktivitätstest die Acetylenreduktion der beiden
Stämme B10S (pNAP1) und DG7 (pNAP1) unter NH4+-Mangel und in Gegenwart NH4+
bestimmt (Tab. C-5).
77
Ergebnisse
Tab. C-5: Komplementation einer nrfA-Mutation durch pNAP1 (nrfA+)
Stamm
Nitrogenase-Aktivitäta
relvanter Genotyp
−N
+N
B10S
Wildtyp
3,1
±
1,4
637,4
±
24,0
DG7
nrfA
0,4
±
0,1
86,3
±
16,1
B10S (pNAP1) Wildtyp, nrfA+
1,7
±
0,1
861,5
±
88,0
DG7 (pNAP1) nrfA−, nrfA+
4,2
±
1,4
614,2
±
20,2
a
Die Aktivität der Molybdän-Nitrogenase wurde nach Anzucht der R. capsulatus Stämme unter AmmoniumMangelbedingungen (RCV mit 9,5 mM Serin; −N) und in Gegenwart von 20 mM NH4+ (+N) anhand eines
Acetylenreduktionstests bestimmt. Die Enzymaktivität ist in nmol Ethylen / h x mg Protein) angegeben. Die
Daten repräsentieren Mittelwerte aus drei voneinander unabhängigen Messungen.
Die Messergebnisse im oberen Teil der Tab. C-5 zeigen, dass in der nrfA-Mutante die
Nitrogenase-Aktivität unter dereprimierenden Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp
(B10S) signifikant verringert ist. Die Enzymaktivitäten des Wildtyp Stammes B10S
(pNAP1) unter dereprimierenden Bedingungen (−N) zeigen im Vergleich zum Plasmidfreien Wildtypstamms B10S, mit einem ein Umsatz von 861 nmol Acetylen, eine leicht
erhöhte Nitrogenase-Aktivität. Auch in dem Stamm DG7 (pNAP1) ist mit einem Umsatz
von 614 nmol Acetylen unter dereprimierenden Bedingungen eine deutlich gesteigerte
Nitrogenase-Aktivität gegenüber dem Stamm DG7 zu messen. Wie bereits im vorherigen
Experiment demonstriert, können aufgrund der NH4+-Regulation des Nitrogensae-Systems
keine Enzymaktivitäten der unter +N-kultivierten Stämme gemessen werden.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Plamid pNAP1 den nrfA-Phänotyp
komplementieren kann. Dieser Befund zeigt weiterhin, dass die reduzierte NitrogenaseAktivität im Stamm DG7 (nrfA) auf die Mutation im nrfA-Gen und nicht auf eine
ausbleibende Expression des hflX-Gens zurückzuführen ist. Darüber hinaus kann
geschlossen werden, das die Expression des nrfA-Gens von einem Promotor aus erfolgen
muss, der sich in der ntrX-nrfA intergenischen Region befindet.
In R. capsulatus ist NrfA nicht essentiell für das diazotrophe Wachstum. Das Protein ist
aber wichtig für das maximale Wachstum durch die Molybdän-Nitrogenase. Die
Nitrogenase-Aktivität ist in einer nrfA-Mutante stark reduziert. Dass es sich bei diesem
Phänotyp ausschließlich um einen nrfA-Phänotyp handelt, demonstriert das Komplementationsexperiment. Die Expression des nrfA-Gens erfolgt von einem eigenen Promotor aus,
der sich in der intergenischen Region zwischen ntrX und nrfA befindet.
78
Ergebnisse
4.2.1 Die Wirkung von NrfA auf die Synthese des Transkriptionsaktivators NifA
Die Reduktion der Nitrogenase-Aktivität in einer nrfA-Mutante könnte entweder auf eine
Beeinträchtigung des Nitrogenase-Systems oder auf eine verringerte Expression der nifGene zurückgeführt werden. Mittels geeigneter nif-Reportergenfusionen sollte nun in
Expressionsstudien untersucht werden, auf welcher regulatorischen Ebene NrfA das
Nitrogenase-System beeinflusst. Zu diesem Zweck wurden die replikativen Plasmide
pPHU284 (nifA1-lacZ) und pPHU282 (nifA2-lacZ), bei denen es sich um translationale
nifA-lacZ-Fusionen handelt, und pFS2 (nifH-lacZ), welches ein transkriptionales nifHlacZ-Fusionskonstrukt ist, in den Wildtypstamm und in die nrfA-Mutante eingebracht. Um
die Expression der replikativen lacZ-Fusionen zu bestimmen, wurden die Testkulturen
unter den entsprechenden N2-Fixierungsbedingungen oder in Gegenwart von NH4+
angezogen. Die β-Galaktosidase-Aktivitäten der Stämme wurden nach Miller (1972)
bestimmt und sind in Tab. C-6 dargestellt.
Tab. C-6: Die Rolle von NrfA bei der Regulation der nif-Genexpression
β-Galaktosidase-Aktivitäta
Stamm
relevanter Genotyp
FS2
nifH-lacZ
RA36
+N
−N
7,5 ± 2,6
2879,4 ± 290,9
nifH-lacZ, nrfA
0
1251,0 ± 113,8
B10S (pPHU284)
nifA1-lacZ
0
11895,3 ± 531,5
DG7 (pPHU284)
nifA1-lacZ, nrfA
0
4616,3 ± 107,0
B10S (pPHU282)
nifA2-lacZ
0
3083,1 ± 38,0
DG7 (pPHU282)
nifA2-lacZ, nrfA
0
1227,2 ± 284,8
a
Die Bestimmung der β-Galaktosidase Aktivität erfolgt in R. capsulatus Kulturen, die zuvor unter
Ammonium-Mangelbedingungen (9,5 mM Serin, -N) und in Gegenwart von Ammonium (20 mM NH4+, +N)
im RCV-Medium unter photoheterotrophen Bedingungen angezogen wurden. Die Enzymaktivitäten sind in
Miller-Units angegeben. Die Daten repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.
Wie aus Tab. C-6 hervorgeht, unterliegt die Expression der nif-Gene (nifH, nifA1 und
nifA2) im Wildtyp erwartungsgemäß der Ammonium-Regulation. Die nifH-Expression im
nrfA-Mutantenstamm unter dereprimierenden Bedingungen ist im Vergleich zum Parentalstamm signifikant verringert. Dieser Befund zeigt, dass die Abnahme der in vivo
Nitrogenase-Aktivität in der nrfA-Mutante auf eine verringerte Expression der
Strukturgene nifHDK zurückzuführen ist und nicht auf eine Inaktivierung der Nitrogenase.
Die Expression beider nifA-Kopien (nifA1 und nifA2) weist unter dereprimierenden
Bedingungen in den nrfA-Mutantenstämmen, im Vergleich zu dem Parentalstamm, eine
79
Ergebnisse
um 60 % verringerte Expressionsrate auf. Diese Daten zeigen, dass der Defekt im
nrfA-Gen einen identischen Einfluss auf die Expression der beiden nifA-Kopien hat.
Folglich ist die verringerte Expression von nifH in einer R. capsulatus nrfA-Mutante auf
die
verminderte
Expression
der
Transkriptionsaktivatoren
NifA1
und
NifA2
zurückzuführen. Darüber hinaus ist auch die Expression von nifH, nifA1 und nifA2 in der
nrfA-Mutante, wie im Wildtyp, Ammonium reguliert.
In R. capsulatus kontrolliert NrfA die Synthese der Molybdän-Nitrogenase auf Ebene der
nifA1- und nifA2-Genexpression.
4.3
Die Rolle von NrfA bei der Regulation der alternativen Nitrogenase in
R. capsulatus
In Analogie zu den Untersuchungen, die den Einfluss einer nrfA-Mutation auf die
Regulation der Molybdän-Nitrogenase geklärt haben, wurde in den folgenden Experimenten der Frage nachgegangen, ob NrfA auch an der Regulation des alternativen
Nitrogenase-Systems beteiligt ist. Zu diesem Zweck wurde zuerst das diazotrophe
Wachstum und die in vivo Nitrogenase-Aktivität bestimmt. Um die Aktivität der
alternativen Nitrogenase messen zu können, wurde als Parentalstamm ein ∆nifHDK-Stamm
(TD22; Drepper et al. 2002) verwendet, welcher aufgrund des Gendefektes keine
Molybdän-Nitrogenase synthetisieren kann. So konnte gewährleistet werden, dass die
Messergebnisse nicht durch die Aktivität der Mo-Nitrogenase beeinträchtigt werden. Als
negative Kontrolle wurde der Stamm TD6 (∆nifHDK, anfA) verwendet, der keine der
beiden Nitrogenasen exprimieren kann. Sowohl die beiden Stämme TD22 und TD6 als
auch der nrfA-Mutantestamm DG9 (∆nifHDK, nrfA; Drepper et al. 2002) wurden dann, um
das diazotrophe Wachstum zu bestimmen, im AK-NL-Medium (ohne Molybdän) ohne
Stickstoffquelle in gasdichten Reagenzgläsern angeimpft und mit N2 begast. Unter
entsprechenden reprimierenden Kultivierungsbedingungen wurde dem Medium 20 mM
NH4+ beigefügt. Um die Aktivität der alternative Nitrogenase zu quantifizieren, wurden die
oben genannten Stämme in AK-NL-Medium unter N2-fixierenden (– N) und Nitrogenasereprimierenden (+ N) Bedingungen photoheterotroph bis zur spätlogarithmischen Wuchsphase angezogen. Die Ergebnisse des diazotrophen Wachstums sind in Abb. C-23, die des
Acetylenreduktionstests in Tab. C-7 dargestellt.
80
Ergebnisse
Optische Dichte bei 660 nm
A
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
∆nifHDK
∆nifHDK, nrfA
[+ N]
∆nifHDK, anfA
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [h]
Optische Dichte bei 660 nm
B
1,4
∆nifHDK
− N]
[−
1,2
1,0
∆nifHDK, nrfA
0,8
0,6
0,4
∆nifHDK, anfA
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Zeit [h]
Abb. C-23: Diazotrophes Wachstum des R. capsulatus Parentalstammes (∆nifHDK) und
einer nrfA-Mutante
Zur Bestimmung der Auswirkung einer nrfA-Mutation auf das diazotrophe Wachstum durch die alternative
Nitrogenase wurden die Stämme TD22 (∆nifHDK), DG9 (∆nifHDK, nrfA) und TD6 (∆nifHDK, anfA) in
AK-NL ohne Stickstoffquelle (–N) und in AK-NL mit Ammonium (+N) über einen Zeitraum von 60 h
kultiviert.
Tab. C-7: Aktivität der alternativen Nitrogenase in einer nrfA-Mutante
Stamm
Nitrogenase-Aktivitäta
relvanter Genotyp
−N
+N
TD22
∆nifHDK
DG9
∆nifHDK,
TD6
∆nifHDK,
0,6
±
0,1
112,9
±
28,1
nrfA
0,6
±
0,2
45,4
±
10,7
anfA
0,5
±
0,1
0,8
±
0,2
a
Die Aktivität der alternativen Nitrogenase wurde nach Anzucht der R. capsulatus Stämme unter
Ammonium-Mangelbedingungen (AK-NL mit 9,5 mM Serin; −N) und in Gegenwart von NH4+ (AK-NL mit
20 mM NH4+; +N) anhand eines Acetylenreduktionstests bestimmt. Die Enzymaktivität ist in nmol Ethylen /
(h x mg Protein) angegeben. Die Daten repräsentieren Mittelwerte aus drei voneinander unabhängigen
Messungen.
81
Ergebnisse
Die in Abb. C-23 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass alle untersuchten Stämme, die in
NH4+ haltigen Medium kultiviert wurden, gleiche Wuchseigenschaften aufweisen und nach
60 h die stationäre Wuchsphase erreichen. Unter dereprimierenden Anzuchtbedingungen (–
N) ist der Parentalstamm TD22 (∆nifHDK) in der Lage, diazotroph zu wachsen und
erreicht nach 60 h eine o.D.660 von 1,3. Wie erwartet, kann der Stamm TD6 (∆nifHDK,
anfA) unter diazotrophen Bedingungen nicht wachsen. Der Stamm DG9 (∆nifHDK, nrfA)
weist in der früh logarithmischen Wuchsphase (nach ca. 20 h) unter diazotrophen
Wuchsbedingungen eine ähnliche Wuchsrate wie der Wildtyp auf. Jedoch verlangsamt sich
diese Wuchsrate im weiteren Verlauf der Messung und die Zellen erreichen dann nach 60 h
eine o.D.660 von ca. 0,9. Diese Ergebnisse zeigen, das NrfA für das diazotrophe Wachstum
durch die alternative Nitrogenase nicht essentiell ist, aber für das optimale Wachstum
benötigt wird.
Die Ergebnisse des in vivo Nitrogenase-Aktivitästests (Tab. C-7) demonstrieren, dass in
den mit Ammonium kultivierten (+N) Stämmen (TD22, DG9 und TD6) sowie in dem
–
unter –N angezogenen Stamm TD6 (Anf Referenz) keine Enzymaktivitäten nachweisbar
sind. Der unter N-Mangelbedingungen kultivierte nrfA-Mutantenstamm (DG9) zeigt im
Vergleich zum Parentalstamm TD22 eine um 60% verringerte Nitrogenase-Aktivität.
Wie auch schon für die Mo-Nitrogenase gezeigt werden konnte, führt eine nrfA-Mutation
in R. capsulatus zu einer Verminderung der Aktivität der alternativen Nitrogenase.
In R. capsulatus ist NrfA für das maximale Wachstum unter diazotrophen Bedingungen
durch die alternative Nitrogenase notwendig. Die Aktivität der alternativen Nitrogenase ist
in einer nrfA-Mutante auf 40 % reduziert.
4.3.1 Die Rolle von NrfA bei der Regulation der anfA-Expression
Da eine nrfA-Mutation in R. capsulatus ebenfalls einen Einfluss auf die Aktivität der
alternativen Nitrogenase hat, wurde mit Reportergenfusionen untersucht, auf welcher
regulatorischen Ebene NrfA wirksam wird. Zu diesem Zweck wurden in den
Wildtypstamm B10S und den nrfA-Mutantenstamm DG7 die replikativen Plasmide
pTD7-2I (anfH-lacZ) und pKS131A (anfA-lacZ) via konjugativen Transfer eingebracht
(Drepper 2000, Drepper et al 2002). Die zu untersuchenden Stämme wurden dann unter
Nitrogenase-dereprimierenden (–N, –Mo) und -reprimierenden Bedingungen (+N, –Mo)
photoheterotroph angezogen. Anschließend wurden die Expressionen der anfH- und anfA82
Ergebnisse
lacZ-Fusionen durch die β-Galaktosidase-Aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle C-8 dargestellt.
Tab. C-8: Die Rolle von NrfA bei der Regulation der anf-Genexpression
β-Galaktosidase-Aktivitäta
Stamm
relevanter Genotyp
B10S (pTD7-2I)
anfH-lacZ
DG7 (pTD7-2I)
anfH-lacZ, nrfA
B10S (pKS131A)
anfA-lacZ
DG7 (pKS131A)
anfA-lacZ, nrfA
−N
+N
16,0 ± 16,0
1437,7
± 60,2
4,7 ± 4,2
549,4
± 97,7
130,5 ± 97,6
2033,8
± 141,3
24,6 ± 4,2
438,0 ± 21,4
a
Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität erfolgt in R. capsulatus-Kulturen, die zuvor unter Ammonium-Mangelbedingungen (9,5 mM Serin, -N) und in Gegenwart von Ammonium (20 mM NH4+, +N) in AKNL-Medium unter photoheterotrophen Bedingungen angezogen wurden. Die Enzymaktivitäten sind in
Miller-Units angegeben. Die Daten repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.
Die Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität in diesen Kulturen zeigt, dass eine
vollständige Induktion der anfH- und anfA-Genexpression nur in Abwesenheit von
Ammonium zu verzeichnen ist (Tab. C-8). Weiterhin kann man anhand der deutlich
verringerten β-Galaktosidase Aktivität des Stammes DG7 (pTD7-2I) unter –NBedingungen im Bezug zum Parentalstamm B10S (pTD7-2I) ersehen, dass eine nrfAMutante einen Einfluss auf die Transkriptionsaktivierung von anfH ausübt. Ebenfalls ist
auch eine verringerte anfA-lacZ-Expression (unter –N) in dem Stamm DG7 (pKS131A) zu
verzeichnen. Somit kann die reduzierte anfH-Expression in der nrfA-Mutante auf die
herabgesetzte anfA-Expression zurückgeführt werden. Anhand dieser Daten kann gefolgert
werden, dass der Einfluss von NrfA auf der Ebene der anfA-Expression das alternative
Nitrogenase-System beeinflusst. Sowohl die reduzierte Nitrogenase-Aktivität des
alternativen Nitrogenase-Systems, als auch die verringerte anfH- und anfA-Expression in
einer nrfA-Mutante gleichen weitgehend den Ergebnissen der Aktivitätstests des MoNitrogenase-Systems und der nifH-, nifA1- und nifA2-Expressionsanlysen. Die Regulation
des alternativen Nitrogenase-Systems erfolgt somit wahrscheinlich nach dem selben
Mechanismus wie die Regulation des Mo-Nitrogenase-Systems.
83
Ergebnisse
Wie bereits für die Molybdän-Nitrogenase gezeigt werden konnte, führt in R. capsulatus
eine nrfA-Mutation zu einer verringerten Aktivität der alternativen Nitrogenase. Die
reduzierte Nitrogenase-Aktivität und anfH-Genexpression ist auf eine verringerte
Expression des Transkriptionsaktivatorgens anfA zurückzuführen.
5
Die Funktion von NrfA bei der Regulation der hvrA-Genexpression
5.1
Vorbemerkungen
Die NrfA-Proteine aus A. caulinodans und R. capsulatus weisen neben ihrer Homologie
untereinander auch hohe Homologien zu dem Nukleoid-assozierten Hfq-Protein (Host
factor for phage Q), aus E. coli auf (Azam und Ishihama 1999, Kajitani und Ishihama
1991). Das Hfq-Protein aus E. coli ist schon seit längerem als DNA- und RNA-bindendes
Protein bekannt, das an der Regulation einer Vielzahl von Genen beteiligt ist. Eine
Mutation im hfq-Gen hat in E. coli pleiotrope Effekte und führt u.a. auch zu einer
Deregulation der hns-Genexpression (Sledjeski et al. 2001). Um zu untersuchen, ob in
R. capsulatus die Genexpression des hns homolgen Gens, hvrA, durch NrfA beeinflusst
wird, wurden hvrA-lacZ-Reportergenfusionen und HvrA-Immunodetektionsanalysen mit
verschiedenen R. capsulatus-Stämmen durchgeführt. Darüber hinaus sollte auch ermittelt
werden, welche Rolle das Umweltsignal Licht bei der Akkumulation von HvrA spielt.
5.2
NrfA kontrolliert nicht die Regulation der hvrA-Genexpression
Um den Einfluss von NrfA auf die Expression von HvrA untersuchen zu können, wurde
das in R. capsulatus nicht replizierende Plasmid pTD14-3I (Drepper 2000), welches eine
hvrA-lacZ Fusion trägt, in die Stämme B10S (Wildtyp), DG7 (nrfA) und TD105 (hvrA)
durch konjugativen Transfer eingebracht und durch ein einfaches Rekombinationsereignis
im Chromosom etabliert. Dadurch konnte die Expression der hvrA-lacZ-ReportergenFusion unter die Kontrolle des chromosomalen senC-regA-hvrA-Promotors gebracht
werden. Die so erzeugten Stämme wiesen dennoch keine hvrA-Mutation auf, da ein in
Transkriptionsrichtung vor das regA-hvrA-Fragment geschalteter KanamycinresistenzgenPromotor für eine konstitutive Expression der zweiten hvrA-Kopie sorgte. Des weiteren
wurde auch die Expression des hvrA-Gens in einer hvrA-nrfA-Doppelmutante untersucht.
84
Ergebnisse
Ausgehend vom Stamm TD105 (hvrA, Drepper 2000) wurde das nicht replizierende
Plasmid pDG8-3I (nrfA; Giaourakis 2000) nach R. capsulatus transferiert. Über ein
Doppel-Rekombinationsereignis erfolgte eine stabile Integration der Mutation in das
Chromosom. In den resultierenden Mutantenstamm RA21 (hvrA, nrfA) wurde dann das
Plasmid pTD14-3I eingebracht. Nach Anzucht der Teststämme in RCV-Medium mit (–N)
und (+N) Bedingungen wurde dann die β-Galaktosidase-Aktivität ermittelt. Das Ergebnis
ist in Tab. C-9 dargestellt.
Tab. C-9: Die Rolle von NrfA bei der Regulation der Expression von hvrA
β-Galaktosidase-Aktivitäta
Stamm
relevanter Genotyp
TD181
hvrA-lacZ
570,6 ± 1,5
517,9 ± 28,5
RA40
hvrA-lacZ, nrfA
540,1 ± 7,1
421,3 ± 3,8
TD182
hvrA-lacZ, hvrA
1613,4 ± 5,0
1330,5 ± 23,8
RA41
hvrA-lacZ, hvrA, nrfA
1403,3 ± 18,9
1182,1 ± 22,1
+N
−N
a
Die Bestimmung der β-Galaktosidase Aktivität erfolgt in R. capsulatus-Kulturen, die zuvor unter Ammonium-Mangelbedingungen (9,5 mM Serin, -N) und in Gegenwart von Ammonium (20 mM NH4+, +N) im
RCV-Medium unter photoheterotrophen Bedingungen angezogen wurden. Die Enzymaktivitäten sind in
Miller-Units angegeben. Die Daten repräsentieren Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen.
Wie auch schon Drepper (2000) zeigen konnte, führt eine hvrA-Mutation zu einer um den
Faktor drei erhöhten Expression der hvrA-lacZ-Fusion. In einer nrfA-Mutante (RA40) war
die Expression von hvrA nicht beeinflusst (Tab. C-9). Weiterhin kann anhand der nahezu
identischen β-Galaktosidase-Aktivitäten der Stämme TD182 (hvrA-lacZ, hvrA) und RA41
(hvrA-lacZ, hvrA, nrfA) in Abwesenheit und Anwesenheit von Ammonium gefolgert
werden, dass die erhöhte hvrA-Genexpression im Stamm RA41, nicht auf eine nrfAMutation zurückführen ist. Ebenfalls konnte durch diese Studien wiederholt gezeigt
werden (Drepper 2000), dass die Expression von hvrA unabhängig von der Verfügbarkeit
von gebundenem Stickstoff erfolgt. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass HvrA
wahrscheinlich in einer autoregulatorischen Weise die Expression des eigenen Gens
beeinflusst und das NrfA-Protein keinen Einfluss auf die Transkription des hvrA-Gens hat.
Da das NrfA-Protein aus A. caulinodans und das Hfq-Protein aus E. coli für die
Stabilisierung von mRNA-Transkripten benötigt werden (Kaminski und Elmerich, 1998;
Nogueira und Springer, 2000), sollte in dem folgenden Experiment untersucht werden, ob
eine nrfA-Mutante in R. capsulatus auf translationaler oder posttranslationaler Ebene die
Synthese von HvrA beeinflusst. Zu diesem Zweck sollte die Akkumulation des HvrA85
Ergebnisse
Proteins in einer nrfA-Mutante mittels Western-blot-Analysen mit dem HvrA-Antiserum
untersucht werden. Der Vergleich der HvrA-Menge in einer nrfA-Mutante mit der im
Wildtyp akkumulierten HvrA-Menge gibt indirekt Aufschluss darüber, ob die Synthese
von HvrA durch NrfA über einen translationalen bzw. postranslationalen Prozess
beeinflusst wird. Zu diesem Zweck wurden die Stämme B10S (Wildtyp) und DG7 (nrfA)
in RCV-Medium mit und ohne Ammonium photoheterotroph bis zur spätlogarithmischen
Wuchsphase angezogen und geerntet. Von den Zellen wurde ein zellfreier Proteinextrakt
hergestellt. Anschließend wurde die HvrA-Menge mit Hilfe des Western-blot-Verfahrens
untersucht (Abb. C-24).
B10S
[NH4+]
DG7
–
+
–
+
1
2
3
4
HvrA
Abb. C-24: Akkumulation von HvrA
Zur Analyse der Akkumulation von HvrA wurden der R. capsualtus-Wildtypstamm (B10S), der nrfAMutantenstamm (DG7) unter Nitrogenase-reprimierenden Bedingungen (RCV + NH4+ [+]) und unter
Nitrogenase-dereprimierenden Bedingungen (RCV + Serin [–]) angezogen. Der Proteingesamtzellextrakt der
untersuchten Stämme wurde im Western-blot mit HvrA-Antiserum untersucht. Die Pfeile am linken Bildrand
markieren die Positionen des HvrA-Proteins.
Dabei zeigte sich, dass die Menge an akkumulierten HvrA in den untersuchten Stämmen
unabhängig von den Kultivierungsbedingungen annähernd gleich war. Somit kann
ausgeschlossen werden, dass auf translationaler bzw. posttranslationaler Ebene die
Synthese von HvrA durch NrfA beeinflusst wird.
NrfA beeinflusst weder die Transkription noch die Translation des hvrA-Gens.
86
Ergebnisse
5.3
Untersuchung zum Einfluss der Lichtintensität auf die Akkumulation von
HvrA
Vorangegangene Studien und die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zeigen,
dass Ammonium nicht zu einer veränderten HvrA-Expression und Akkumulation führt
(Abb. C-24). Jedoch steigt die hvrA-lacZ Expression in Kulturen, die unter SchwachlichtBedingungen (280 lux) kultiviert wurden, signifikant um Faktor drei an (Drepper 2000;
Abb. C-25 A). Somit wurde demonstriert, dass die hvrA-Gen Expression von der
Lichtintensität abhängt. Um beurteilen zu können, ob Licht als Umweltsignal neben der
geschilderten Expressionserhöhung des hvrA-Gens auch eine erhöhte Akkumulation von
HvrA zur Folge hat, wurde ein weiteres Experiment durchgeführt. Die Ergebnisse der
Genexpressionsstudien geben keinen Aufschluss über die tatsächliche, in der Zell
akkumulierte Proteinmenge. Neben der Translationseffizienz eines Transkriptes können
auch posttranslationale Prozesse, wie z.B. ein proteolytischer Abbau, die Menge des
Proteins beeinflussen.
Um dieser Frage nachzugehen, wurde der Wildtyp-Stamm B10S in RCV-Medium mit
Serin unter photoheterothrophen Wuchsbedingungen unter Standard-Lichtbedingungen
(2500 lux) und unter Schwachlicht-Bedingungen (280 lux) kultiviert. Anschließend wurde
ein Proteinextrakt von den Kulturen hergestellt. Die Menge an HvrA in den Zellextrakten
wurde nach Auftrennung der Proteine im SDS-PA-Gel und anschließendem Western-blot
mit HvrA-Antiserum bestimmt (Abb. C-25 B).
87
Ergebnisse
A
B
B10S
[lux]
Lichtintensität β-Gal.
[lux]
Aktivität
−N
hvrA-lacZ
2500
341
hvrA-lacZ
280
1026
2500
280
1
2
HvrA
Abb. C-25: Regulation der hvrA-Genexpression und HvrA-Akkumulation in Abhängigkeit
des Umweltfaktors Licht
Um den Einfluss unterschiedlicher Lichtintensitäten auf die Akkumulation von HvrA zu untersuchen, wurde
der R. capsulatus-Wildtypstamm B10S im RCV-Medium mit 9,5 mM Serin unter Standardlichtbedingungen
(2500 lux) und unter Schwachlichtbedingungen (280 lux) photoheterotroph angezogen. Der Proteingesamtzellextrakt der Kulturen wurde im Western-blot mit HvrA-Antiserum untersucht. Die Angaben zur
Expression der hvrA-lacZ Reportergenfusion unter verschiedenen Lichtintensitäten wurde von Drepper
(2000) übernommen.
Wie in Abbildung C-25 B dargestellt, kann eine erhöhte Proteinmenge in den Kulturen, die
unter Schwachlichtbedingungen kultiviert wurden, verzeichnet werden. Der Vergleich mit
den von Drepper (Abb. C-25 A) durchgeführten hvrA-Expressionsanalysen und den Daten
des Western-blots zeigt, dass auch auf Proteinebene in Zellen, die unter Schwachlichtbedingungen kultiviert werden, um mindestens Faktor drei mehr HvrA akkumuliert wird.
Somit konnte gezeigt werden, dass der Schwachlichtaktivator der photosynthetischen Gene
in Abhängigkeit von der Lichtintensität exprimiert und akkumuliert wird. Ferner liefern die
Ergebnisse keinen Hinweis darauf, dass die Synthese von HvrA durch translationale bzw.
posttranslationale Prozesse beeinflusst wird.
Das HvrA-Protein wird unabhängig von der NH4+-Verfügbarkeit, aber in Abhängigkeit
von der Lichtmenge in der Zelle akkumuliert.
88
Diskussion
D
1
Diskussion
Nukleoid-assoziierte Proteine in Rhodobacter capsulatus
Im Gegensatz zu klassischen Regulatoren, die über eine spezifische Bindung an einen
Promotor die Transkription eines Gens aktivieren oder reprimieren, nehmen Nukleoidassoziierte Proteine in der Regel keinen direkten Einfluss auf die Genexpression, sondern
modulieren durch ihre Bindung an verschiedenen Stellen der DNA meist gleichzeitig die
Aktivität verschiedener spezifischer Transkriptionsaktivatoren. Mittlerweile sind auch in
R. capsulatus drei solcher Nukleoid-assoziierten Proteine identifiziert worden, die u.a.
auch an verschiedenen Stellen in die Regulation der Stickstoff-Fixierung involviert sind
(Kutsche 1995, Kern et al. 1998, Drepper et al. 2002, Raabe et al. 2002). Eines dieser
Proteine ist der IHF (integration host factor), der in verschiedenen diazotrophen
Organismen eine Rolle bei der Regulation der N2-Fixierung spielt (Hoover 1990). Der IHF
bindet als Heterodimer sequenzspezifisch an DNA (Azam und Ishihama 1999). Durch die
Lage der IHF-Bindestelle in den Promotorregionen der nif- und anf-Gene, die immer
zwischen der UAS und dem Transkriptionsstartpunkt lokalisiert ist (Santero et al. 1992),
induziert IHF die topologische Veränderung, die dann die an die UAS gebundenen NifAbzw. AnfA-Proteine in räumliche Nähe zur σ54-abhängigen RNA-Polymerase bringt, wo
sie mit dieser interagieren können und somit die Transkription herbeiführen (Goosen und
van de Putte 1995, Pérez-Martin und de Lorenzo 1997). Für die Expression der nif-Gene in
Klebsiella pneumoniae ist gezeigt worden, dass der IHF für die NifA-abhängige
Transkriptionsaktivierung der nif-Gene essentiell ist (Hoover et al. 1990). Auch in
R. capsulatus ist IHF an der Regulation der Gene für die Molybdän- und die alternative
Nitrogenase beteiligt (Kutsche 1995, Simon 2002). Es konnte gezeigt werden, dass in einer
R. capsulatus himA-Mutante (himA kodiert für eine Untereinheit des IHF) die
enzymatische Aktivität beider Nitrogenasesysteme stark reduziert ist (Simon 2002,
Kutsche 1995), da IHF für die NtrC-abhängige Expression von nifA1 und nifA2 essentiell
ist. Die beiden anderen Nukleoid-assoziierten Proteine aus R. capsulatus, die in die
Regulation der Stickstoff-Fixierung involviert sind (NrfA und HvrA), werden in dem
folgenden Diskussionsabschnitt hinsichtlich ihrer Funktionen näher betrachtet.
2
Die Rolle von NrfA bei der Regulation der Nitrogenasegene
Bisher wurde nrfA in Azorhizobium caulinodans und R. capsulatus identifiziert (Kaminski
et al. 1994, Drepper et al. 2002). Auch in E. coli wurde ein nrfA-homologes Gen (hfq)
89
Diskussion
gefunden (Kajitani und Ishihama 1991). Die Anordnung von nrfA respektive hfq auf den
Chromosomen unterscheidet sich in den verschiedenen Organismen (siehe Abb. D-1).
Während in R. capsulatus nrfA direkt stromabwärts von ntrX angeordnet ist, ist es in
A. caulinodans durch mehrere Gene von ntrX getrennt. Allen Organismen gemein ist
jedoch das stromabwärts von nrfA bzw. hfq gelegene hflX-Gen, dessen Funktion in
R. capsulatus und A. caulinodans noch unbekannt ist. Darüber hinaus befindet sich das
nrfA-Gen in R. capsulatus in der sogenannten Ntr-Genregion, deren Gene ntrB und ntrC
für das gut charakterisierte Zwei-Komponenten-Regulationssystem kodieren, welches in
Abhängigkeit von Ammonium die Transkription der Transkriptionsaktivatoren nifA1,
nifA2 und anfA
kontrolliert (Drepper 2002). Weiterhin lassen Sequenzanalysen in
R. capsulatus vermuten, dass es sich bei den ntrY- und ntrX-Genprodukten um ein
funktionelles Zwei-Komponenten-System handelt, welches aus der Sensorkinase NtrY und
dem Responseregulator NtrX besteht (Giaourakis 2000). In Mutationsanalysen konnte
weiterhin demonstriert werden, dass NtrX in die Regulation der beiden NitrogenaseSysteme involviert ist (Giaourakis 2000). Die Lokalisation des nrfA-Gens in R. capsulatus
deutet daher schon an, dass NrfA, wie auch schon für A. caulinodans beschrieben wurde,
bei der Regulation der N-Fixierung beteiligt sein könnte.
R. capsulatus
nifR3
ntrB
ntrC
ntrY
ntrX
nrfA hflX
A. caulinodans
ntrB
ntrC
orf-1
ntrY
ntrX
orf-2
nrfA
hflX
E. coli
ntrB
ntrC
glnA
hfq
hflX
Abb. D-1: Die ntr-Genregion verschiedener Organismen
Homologe Gene sind in den Grautönen dargestellt. Die senkrechten Striche deuten an, dass die Gene auf dem
Chromosom an verschiedenen Stellen lokalisiert sind. Alle Gene sind nicht maßstabsgetreu, sondern nur
schematisch dargestellt.
90
Diskussion
In A. caulinodans führt eine Mutation im nrfA-Gen zu einem vollständigen Verlust der
Nitrogenase-Aktivität (Kaminski et al. 1994). Dieser Nif–-Phänotyp ist auf die fehlende
Expression des nifA-Gens zurückzuführen (Kaminski et al. 1994). Auch in nicht diazotrophen Organismen wie E. coli und Salmonella typhimurium konnte ein NrfA-homologes
Protein, Hfq, identifiziert werden (Brown und Elliott 1996). In E. coli ist das Hfq-Protein
im Gegensatz zu A. caulinodans bei der Regulation einer Vielzahl von Genen beteiligt
(Loewen et al. 1998). So führt eine hfq-Mutation in E. coli zu pleiotrophen Phänotypen
(Muffler et al. 1996, Muffler et al. 1997, Tsui et al. 1996). Dies ist vor allem darauf
zurückzuführen, dass die Expression von rpoS durch Hfq positiv beeinflusst wird
(Nogueira und Springer 2000). Trotz dieser Unterschiede zwischen NrfA aus
A. caulinodans und Hfq aus E. coli weisen beide Proteine bei der Regulation der Genexpression gleiche Mechanismen auf. Dies konnte auch in einem KomplementationsExperiment gezeigt werden, in dem das NrfA-Protein aus A. caulinodans eine E. coli hfqMutante komplementieren sowie das Hfq aus E. coli den Nif–-Phänotyp in A. caulinodans
wieder herstellen konnte (Kaminski und Elmerich 1998).
Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zeigen, das NrfA auch in R. capsulatus,
wie in A. caulinodans, in die Regulation der Stickstoff-Fixierung involviert ist. Anhand der
Wuchsexperimente mit einer nrfA-Mutante zeichnet sich ab, dass NrfA nicht wie eine
E. coli hfq-Mutante zu einem pleiotropen Phänotyp führt. Da darüber hinaus in der fast
vollständig sequenzierten R. capsulatus Genomsequenz (Overbeek et al. 2000) kein rpoSähnliches Gen in R. capsulatus identifiziert werden konnte, scheint in R. capsulatus die
Regulation der bei Eintreten in die stationäre Phase benötigten Gene möglicherweise in
einer σS-unabhängigen Weise zu erfolgen. In den Studien dieser Arbeit konnte weiterhin
demonstriert werden, dass die beeinträchtigte Nitrogenase-Aktivität der MolybdänNitrogenase in einer R. capsulatus-nrfA-Mutante auf eine verminderte Expression der
Transkriptionsaktivatorgene nifA1 und nifA2 zurückzuführen ist. Aber im Gegensatz zu
A. caulinodans, wo NrfA für die Synthese von NifA absolut essentiell ist (Kaminski und
Elmerich 1998), führt ein Defekt in nrfA in R. capsulatus nur zu einer um 60 %
verringerten Expression beider nifA-Kopien. Allerdings konnte in der gesamten
R. capsulatus-Gensequenz keine zweite nrfA-Kopie in R. capsulatus identifiziert werden,
welches den Gendefekt in dem nrfA-Mutantenstamm hätte komplementieren können.
Weiterhin kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass NrfA die Transkription von ntrC
beeinflusst, dessen Genprodukt (NtrC) die Transkription von nifA bzw. anfA aktiviert.
91
Diskussion
Da jedoch in A. caulinodans gezeigt werden konnte, dass NrfA die nifA-Expression
beeinflusst (Kaminski und Elmerich 1998), ist es auch für R. capsulatus anzunehmen, dass
NrfA für die nifA-Expression benötigt wird. Darüber hinaus konnte in den Analysen dieser
Arbeit gezeigt werden, dass NrfA auch für die maximale Synthese der alternativen
Nitrogenase in R. capsulatus benötigt wird. Wie auch bei der Regulation der Gene der
Molybdän-Nitrogenase kontrolliert NrfA die Gene des alternativen Nitrogenase-Systems in
R. capsulatus auf Ebene der Expression des Transkriptionsaktivators anfA.
2.1
Mechanismus der NrfA-vermittelten nifA- und anfA-Genexpression
Die Translatierbarkeit einer mRNA kann durch die Bindung des Hfq-Proteins entweder
gefördert oder gehemmt werden. Genaue Kenntnisse zu diesem Mechanismus sind bereits
für E. coli und S. typhimurium beschrieben worden (Brown und Elliott 1997, Loewen et al.
1998). Das Hfq-Protein führt in E. coli als positiver Regulator auf translationaler Ebene zu
einer Synthese des rpoS-Genproduktes (Muffler et al. 1996). Darüber hinaus sind auch
Beispiele bekannt, in denen Hfq auf translationaler Ebene einen negativen Einfluss auf die
Translation hat. So wird z.B. das Gen ompA (ompA kodiert für ein Membranprotein) sowie
das eigene hfq-Gen durch Hfq negativ kontrolliert (Nogueira und Springer 2000). In beiden
Fällen führt die Bindung von Hfq an die mRNA wahrscheinlich zu einer Änderung der
Sekundärstruktur der jeweiligen mRNA, wodurch im Fall des rpoS-Transkriptes diese
Strukturänderung erst die Bindung der ribosomalen 30S-Untereinheit ermöglicht.
Weiterhin wird vermutet, dass durch die Hfq-Bindung die rpoS-mRNA stabilisiert wird
und einer verringerten Degradation ausgesetzt ist (Muffler et al. 1996). Demgegenüber
verhindert die veränderte Struktur der ompA-mRNA die Bindung von Ribosomen
(Vytvytska et al. 2000). Auch für A. caulinodans konnte gezeigt werden, dass NrfA nicht
für die Initiation der Transkription von nifA, sondern für die Translation und (oder)
mRNA-Stabilität benötigt wird (Kaminski und Elmerich 1998). Da die Mutationsanalysen
in dieser Arbeit gezeigt haben, dass beim Fehlen von NrfA die nifA- und anfA-Expression
herabgesetzt ist, ist anzunehmen, dass das NrfA-Protein in R. capsulatus die mRNA
stabilisiert und (oder) für die Translationsinitiation benötigt wird. Offensichtlich ist aber
auch ohne NrfA eine Translation möglich, da die Analysen zeigten, dass im Gegensatz zu
A. caulinodans noch eine geringe Expression vorhanden war.
92
Diskussion
2.2
Wie erfolgt die NrfA-abhängige Signaltransduktion in R. capsulatus?
Die durchgeführten Analysen machen deutlich, dass in R. capsulatus die nifA1-, nifA2- und
anfA-Genexpression einer NrfA-vermittelten Regulation unterliegt. Aufgrund der hohen
Sequenzübereinstimmungen kann vermutet werden, dass neben NrfA aus A. caulinodans
und Hfq aus E. coli auch das NrfA-Protein aus R. capsulatus für die Translation der nifAund anfA-Transkripte benötigt wird. Dabei stellt sich die Frage, ob NrfA generell an die
mRNA der genannten Transkripte binden kann oder ob die Bindung durch ein äußeres
Signal bzw. einen Umweltreiz induziert wird.
Es gibt einige Beispiele, in denen physiologische Änderungen die mRNA-Stabilität beeinflussen. So unterliegen in R. capsulatus die pufBLAMX- und pucAB-Transkripte, deren
Gene für die light-harvesting Komplexe I und II kodieren, unter steigenden O2-Konzentrationen einem erhöhten Abbau (Klug 1991, Hebermehl und Klug 1998). Die Anwesenheit
von Sauerstoff führt innerhalb von drei Minuten zu einem Abbau der 2,7-kb pufQBALMX
mRNA durch einen Degradationskomplex, dessen integraler Faktor RNaseE ist (Jäger et
al. 2001). In einem anderen Organismus, Chlorella vulgaris, hat NH4+ einen Einfluss auf
die mRNA-Stabilität des Nitrat-Reduktase-Transkriptes. Die Zugabe von NH4+ zu den
Zellen, die unter Ammonium-Mangel angezogen werden, führt zu einem Abbau der
mRNA innerhalb von fünfzehn Minuten (Cannos und Pendelton 1994). Jedoch konnte
bisher noch nicht gezeigt werden, dass Änderungen des Sauerstoffpartialdrucks bzw. der
Ammonium-Verfügbarkeit einen Einfluss auf die Aktivität von NrfA bzw. Hfq haben.
Allerdings ist bekannt, dass das Hfq-Protein aus E. coli in Abhängigkeit der Wuchsphase
die ompA-mRNA stabilisiert und die Translatierbarkeit beeinflusst (Vytvytska et al. 2000,
Vytvytska et al. 1998, Moll et al. 1999).
Im Verlauf des bakteriellen Wachstums kann generell zwischen zwei unterschiedlichen
Wuchsphasen, der logarithmischen und der stationären Wuchsphase, unterschieden
werden. Charakteristisch für die stationäre Wuchsphase ist, dass aufgrund des
Nährstoffmangels die Zellteilungsrate stark verringert ist und schließlich ganz zum
Erliegen kommt, während in der logarithmischen Wuchsphase noch ausreichende Mengen
an Nährstoffen vorhanden sind und die Zellen eine maximale Teilungsrate aufweisen.
Unabhängig von der Wuchsphase führen in R. capsulatus gerade Mangelbedingungen wie
der Ammonium-Mangel dazu, dass eines der beiden Nitrogenase-Systeme synthetisiert
wird (Masepohl et al. 2002).
So ist es auch für R. capsulatus vorstellbar, dass durch NrfA eine Adaptation der nifA- und
anfA-mRNA Stabilität in Abhängigkeit der Wuchsphase erfolgen könnte. Bei Erreichen
93
Diskussion
der stationären Phase könnte es dann nach diesem Modell (siehe Abb. D-2) infolge einer
verringerten NrfA-Bindung an die mRNA von nifA bzw. anfA zu einer Degradation der
Transkripte kommen. Dadurch würde die Synthese der Nitrogenase ausbleiben.
NtrC -P
−NH4+
σ70
log-Wuchsphase
nifA
+
+
+
NrfA
anfA
+
mRNA
mRNA
NifA
AnfA
−NH4+
nif-Gene
−NH4+
+
+
anf-Gene
Abb. D-2: Modell zur Rolle von NrfA bei der Regulation der beiden Nitrogenase-Systeme
in R. capsulatus
Die Abbildung fasst schematisch die Funktion von NrfA bei der Regulation der beiden Nitrogenase-Systeme
zusammen. Eine Beschreibung des Modells erfolgt im Text. Die physiologischen Voraussetzungen für den
regulatorischen Effekt sind durch gestrichelte Boxen hervorgehoben. +: positiver Einfluss; –: negativer
Einfluss
3
Die Rolle von HvrA bei der Stickstoff-Fixierung
Das H-NS-ähnliche HvrA-Protein in R. capsulatus gehört wie auch das NrfA-Protein zu
der Gruppe der Nukleoid-assoziierten Proteine und fungiert als Schwachlichtaktivator der
photosynthetischen puf- und puh-Gene (Bertin et al. 1999, Azam und Ishihama 1999,
Buggy et al 1994). Außerdem ist HvrA auch in die Regulation der Stickstoff-Fixierung in
R. capsulatus involviert (Kern et al. 1998, Drepper 2000, Masepohl et al. 2002). Eine
hvrA-Mutante, in der nifA1 konstitutiv exprimiert wird (hvrA, nifA1c, nifH-lacZ), führt im
Vergleich zum R. capsulatus Parentalstamm sowohl in Gegenwart von Ammonium als
auch unter Ammonium-Mangel zu einer Steigerung der nifH-Expression (Kern et al.
1998). Weiterhin ist bekannt, dass HvrA neben dem Einfluss auf die nifH-Expression auch
die Expression von nifB1 und anfH kontrolliert (Drepper 2000). Somit stellt HvrA einen
94
Diskussion
übergeordneten Regulator in R. capsulatus dar, der die Photosynthese und die StickstoffFixierung regulatorisch verbindet.
Im nächsten Abschnitt wird nun die Signalverarbeitung und der regulatorische
Mechanismus von HvrA näher betrachtet.
3.1
Wie greift HvrA in die Regulation der Stickstoff-Fixierung ein?
Während in vergangenen Studien gezeigt werden konnte, dass HvrA die Expression
verschiedener nif-Gene negativ modulieren kann (Drepper 2000, Raabe et al. 2002), wird
nun der zugrunde liegende Mechanismus näher betrachtet. Dabei können drei Möglichkeiten in Betracht gezogen werden, wie HvrA seinen negativen Einfluss auf die nifGenexpression ausübt:
(i)
HvrA könnte die Genexpression eines weiteren Regulators beeinflussen, welcher
entweder direkt die Genexpression der nif-Gene kontrolliert oder indirekt die
Funktion von NifA moduliert.
(ii)
HvrA könnte unter entsprechenden Bedingungen durch eine direkte Proteinwechselwirkung mit dem Transkriptionsaktivator NifA die Expression der nif-Gene
modulieren.
(iii)
Durch eine direkte DNA-Bindung von HvrA an die Zielpromotoren könnte die
Genexpression ebenfalls beeinflusst werden.
3.1.1 HvrA beeinflusst die Genexpression durch eine spezifische Bindung an die
Promotoren
Die in dieser Arbeit durchgeführten Gel-Retardations-Experimente zeigen, dass HvrA an
ausgewählten Promotoren binden kann. Demzufolge scheint ein indirekter Einfluss von
HvrA auf die Nitrogenase-Regulationskaskade über einen bislang unbekannten Regulationsfaktor, wie im Modell (i) gefordert, eher unwahrscheinlich zu sein. Weiterhin kann
aus demselben Grund auch eine Inaktivierung des Transkriptiosaktivator NifA über eine
direkte Protein-Protein-Interaktion, wie im Modell (ii) beschrieben, ebenfalls ausgeschlossen werden. Darüber hinaus konnte auch in Yeast-Two-Hybrid-Analysen keine
Interaktion von HvrA mit eben diesen Transkriptionsaktivatoren nachgewiesen werden
(Bierhoff 2002). In Mutationsanalysen konnte die selektive Wirkung von HvrA auf die
Genexpression von nif- und anf-Genen gezeigt werden (Kern et al. 1998, Drepper 2000).
Ebenfalls zeigen die Ergebnisse der Gel-Retardations-Experimente, dass HvrA selektiv an
die Promotorfragmente PnifH und PanfH spezifisch bindet. In Übereinstimmung mit den
95
Diskussion
Mutationsanalysen (Drepper 2000) konnte keine Bindung von HvrA an das PnifA1-Fragment
nachgewiesen werden. Weiterhin ist den genetischen Studien zu entnehmen, dass HvrA
nicht in die Regulation der nifU2-rpoN-Genexpression involviert ist, jedoch aber für die
Expression des nifB1-Gens benötigt wird. Es konnte jedoch in den Gel-RetardationsExperimenten, wenn auch erst bei höheren HvrA-Konzentrationen, eine Bindung von
HvrA an das Promotorfragment PnifU2 beobachtet werden, wohingegen keine Bindung von
HvrA an das PnifB1-Fragment auftrat. Dieser Widerspruch kann möglicherweise darauf
zurückgeführt werden, dass die Bindung von HvrA an einigen Promotoren (z.B. PnifB1) erst
durch die Anwesenheit weiterer DNA-bindende-Proteine herbeigeführt wird bzw. im Fall
des nifU2-rpoN-Promotors auch unterbunden werden kann. So wurde bereits in E. coli
gezeigt, dass bei der Regulation des rrnB-Gens, welches für ein ribosomales RNAMolekül kodiert, H-NS und FIS (factor for inversion stimulation) beteiligt sind (Afflerbach
et al. 1999). Während das FIS-Protein die Transkription des rrnB-Gens induziert, wirkt
H-NS als Repressor. Die antagonistische Wechselwirkung der beiden Proteine an dem
Promotor ist darauf zurückzuführen, dass die Proteine (H-NS und FIS) um überlappende
Bindestellen in der Promotorregion konkurrieren. H-NS kann erst dann vollständig an die
DNA binden, wenn die zuvor an den Promotor gebundenen FIS-Proteine durch die H-NSProteine selbst verdrängt worden sind (Afflerbach et al. 1999).
Die Ergebnisse der Gel-Retardations-Experimete zeigen, dass der Einfluss von HvrA bei
der Regulation der nifH- und anfH-Gene in R. capsulatus, wie im Modell (iii) dargestellt,
auf eine direkte DNA-Bindung in den Promotorbereichen zurückzuführen ist. Durch die
Bindung an den Promotor fungiert HvrA, hier am Beispiel des nifH-Promotors, als ein
negativer Modulator der Genexpression (Abb. D-3). Neben dieser Funktion kann HvrA
aber auch in seiner Rolle als Schwachlichtaktivator der puf- und puh-Gene als positiver
Modulator die RegA-abhängige Genexpression unter entsprechenden Umweltbedingungen
(Schwachlicht) weiter erhöhen (siehe Abbildung D-3; Buggy et al. 1994). Diese
Eigenschaft von HvrA, durch die DNA-Bindung in den Promotorbereichen der zu
regulierenden Gene einen positiven oder negativen Einfluss auf die Genexpression
auszuüben, ist auch für H-NS aus E. coli beschrieben worden (Altung und Ingmer 1997,
Williams und Rimsky 1997).
96
Diskussion
Photosynthese
Stickstoff-Fixierung
NtrC
-P
−NH4+
σ70
RegA -P
+
−O2
+
puc
+
+
NifA1
NifA2
+
puf
nifA1
nifA2
puh
+
+
σ54
Spezifische
+
DNA-Bindung
nif-Gene
−
Schwachlicht
HvrA
Abb. D-3: Modell zur HvrA-vermittelten regulatorischen Koppelung zwischen Photosynthese und Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus
Das Modell stellt die Rolle von HvrA bei der regulatorischen Koppelung zwischen der Photosynthese und
der Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus dar. Eine Beschreibung des Modells erfolgt im Text. Die
physiologischen Voraussetzungen für den regulatorischen Effekt sind durch gestrichelte Boxen hervorgehoben. +: positiver Einfluss; –: negativer Einfluss
3.2
Signaltransduktion von HvrA
Mittlerweile ist bekannt, dass H-NS aus E. coli bei der Regulation von ca. 50 Genen
beteiligt ist (Schröder und Wagner 2002). In der Mehrzahl dieser Fälle fungiert H-NS als
negativer Modulator der Genexpression. Zum Beispiel wie im Fall von proU, dessen
Genprodukt am Transport von Osmoprotektoren beteiligt ist oder das cspA-Gen, welches
für das Haupt-„cold-shock protein“ kodiert (Lucht und Bremer 1994, Brandi et al. 1999).
Aber es sind auch Beispiele bekannt, in denen H-NS als positiver Modulator die
Genexpression herbeiführt, wie z.B. bei den flhD- und fliA-Genen, deren Genprodukte an
der Flagellenbiosynthese beteiligt sind (Kutsukake 1997, Bertin et al. 1994). Interessanterweise kontrolliert H-NS hauptsächlich Gene, die in Abhängigkeit verschiedener Umweltparameter wie u.a. der Temperatur, dem pH-Wert und der Osmolarität reguliert werden
(Altung und Ingmer 1997). Somit spielt H-NS in E. coli eine entscheidende Rolle bei der
Adaptation der sich ändernde Umweltbedingungen. In R. capsulatus kontrolliert HvrA die
Expression der photosynthetischen Gene und der Stickstoff-Fixierung in Abhängigkeit von
97
Diskussion
wechselnden Umweltparametern (Buggy et al. 1994, Kern et al. 1998). Nur unter
anaeroben und unter Standardlicht-Bedingungen werden die photosynthetischen Gene (puf,
puh und puc) exprimiert (Bauer und Bird 1996). Bei einem zusätzlichen Mangel an
Ammonium kommt es außerdem zur Synthese des Nitrogenase-Systems (Masepohl et al.
2002). Infolge einer verminderten Lichtintensität setzt dann HvrA die Genexpression von
den puf- und puh-Genen herauf (Buggy et al. 1994), während die Genexpression von nifB1
durch HvrA herabgesetzt wird (Drepper 2000). Diese Daten lassen vermuten, dass die
Lichtintensität
der
relevante
Umweltfaktor
ist,
welcher
eine
HvrA-vermittelte
Signaltransduktion in Gang setzt. Somit stellt sich die Frage, in welcher Weise ein Umweltreiz wie die Lichtintensität dazu führt, dass HvrA in entsprechender Weise in die
Regulationskaskade der Stickstoff-Fixierung eingreift. Dabei sind zwei unterschiedliche
Modelle denkbar:
(i)
In Folge eines Umweltreizes könnte HvrA kovalent modifiziert werden, was dann
die DNA-Bindeeigenschaften verändern würde, oder
(ii)
es erfolgt die HvrA-abhängige Regulation über die HvrA-Menge.
3.2.1 Wird HvrA posttranslational modifiziert?
Je nach Umweltbedingungen könnte die Aktivität von HvrA durch eine posttranslationale
Modifikation reguliert werden. In Rhodobacter sphaeroides, einem nahen Verwandten von
R. capsulatus, wird die Expression des photosynthetischen puf-Operons durch ein Histonähnliches Protein reguliert. Das als Spb bezeichnete Protein, welches eine hohe Homologie
zu HvrA aufweist, wirkt aber im Gegensatz zu HvrA als Starklichtrepressor der
photosynthetischen Genexpression (Shimada et al. 1993). Ein weiterer Unterschied zu
HvrA besteht in der Regulation von spb, das unabhängig vom Sauerstoffpartialdruck und
der Lichtintensität monocistronisch transkribiert wird (Shimada et al. 1996, Mizoguchi et
al. 1997). Die Aktivität von Spb wird in R. sphaeroides durch eine posttranslationale
Modifizierung reguliert. Die Eigenschaft, an den Promotor des puf-Gens zu binden, wird
durch eine Phosphorylierung aufgehoben (Shimada et al. 1993). Auch für HvrA aus
R. capsulatus ist es denkbar, dass eine Modifizierung die Bindeeigenschaften von HvrA
verändert. Da aber für H-NS aus E. coli eine Phoshorylierung ausgeschlossen werden kann
(Ussery et al. 1994, Schröder und Wagner 2002), scheint diese Art der Modifikation nicht
auf alle Histon-ähnlichen Proteine übertragbar zu sein. Eine weitere Möglichkeit einer
Modifizierung von HvrA könnte durch das in R. capsulatus vorkommende DraT/G-System
erfolgen (Masepohl et al. 1993). Dieses System gewährleistet die schnelle posttranslatio98
Diskussion
nale Inaktivierung des NifH-Proteins durch eine reversible ADP-Ribosylierung eines
spezifischen Arginin-Restes (Arginin 102; Masepohl et al. 1993). Dieser Vorgang wird
durch das draT-Genprodukt, eine ADP-Ribosyl-Transferase, bei Dunkelheit oder Anwesenheit von Ammonium katalysiert. Unter geeigneten Bedingungen wird dann die ADPRibose durch die Glykohydrolase (DraG) wieder hydrolytisch abgespalten. Das konservierte Sequenzmotiv G-R-G der Ribosylierungsstelle ist nicht nur in der DinitrogenaseReduktase (NifH) von R. capsualtus und anderen diazotrophen Bakterien wie Rhodospirillum rubrum und Azospirillum brasilense zu finden (Pope et al. 1985, Wolle et al.
1992), sondern auch im HvrA-Protein. Interessanterweise ist dieses Sequenzmotiv im CTerminus des HvrA-Proteins an Position 79-81 lokalisiert (Abb. D-4). Da die DNABindedomäne von H-NS im C-Terminus lokalisiert ist (Shindo et al. 1999, Schröder und
Wagner 2002), wird aufgrund der hohen Homologie von HvrA zu H-NS angenommen,
dass auch der C-Terminus von HvrA für die DNA-Bindung verantwortlich ist (Bertin et
al., 1999). So könnte unter bestimmten Umweltbedingungen (Schwachlicht bzw. Ammonium) durch das DraT eine ADP-Ribosylgruppe an die DNA-Bindedomäne HvrA
gebunden werden. Durch diese Modifizierung würde dann HvrA wahrscheinlich eine
höhere Affinität zur DNA haben. Darüber hinaus könnten durch das DraT/G-System synchron sowohl die Dinitrogenase-Reduktase-Aktivität als auch deren Expression inhibiert
werden. Die in Yeast-Two-Hybrid-Experimenten nachgewiesene Bindung von HvrA an
DraG lässt vermuten, dass eine solche regulatorische Verbindung zwischen HvrA und dem
DraT/G-System besteht (Bierhoff 2002). Die Ribosylierung von NifH durch DraT erfolgt
in R. capsulatus sehr schnell und effizient (Masepohl et al. 1993). Schon die Beschattung
der Zellen, z.B. durch einen Zentrifugationsschritt bei der Gewinnung von R. capsulatus
Gesamtzellextrakten, führt zu einer Ribosylierung des NifH-Proteins (Yakunin und
Hallenbeck 1998).
99
Diskussion
ADP-R
NifH
99-G-R-G-101
ADP-R
N
HvrA
?
79-G-R-G-81
C
DNA-Bindedomäne
Abb. D-4: Aminosäuresequenzvergleich zwischen dem NifH- und HvrA-Protein
Dargestellt ist ein Ausschnitt aus dem Aminosäurenvergleich zwischen dem C-terminalen Bereich von HvrA
und NifH im Ein-Buchstaben-Code. Am sog. G-R-G-Motiv von HvrA könnte, wie für NifH beschrieben,
eine kovalente Verknüpfung mit einer ADP-Ribosegruppe (ADP-R) erfolgen.
Da aber bei der Proteinisolierung von HvrA aus R. capsulatus ein unmodifiziertes HvrAProtein isoliert wurde, konnte diese Art ebenso wie andere Möglichkeiten der Modifizierung nicht verifiziert werden. Zusammenfassend bedeuten diese Ergebnisse, dass mit
dem für die Kultivierung von R. capsulatus RA7 verwendeten Medium Bedingungen
vorlagen, die keine Modifizierung von HvrA herbeiführen. Selbst die Abdunklung der
Zellen, welches durch die Zentrifugation der Zellen gegeben war, stellt kein Signal für eine
Modifizierung dar. Darüber hinaus wurde auch in 2D-gelelektrophoretischen Untersuchungen kein modifiziertes HvrA-Protein identifiziert (Bierhoff 2002). Auch dabei
konnte gezeigt werden, dass die Ammonium-Verfügbarkeit noch die Lichtintensität ein
Signal darstellten, welches zu einer Modifizierung führt. Somit ist es unwahrscheinlich,
dass, wie im Modell (i) vorgeschlagen, unterschiedliche Umweltbedingungen zu einer
Modifikation von HvrA in R. capsulatus führen.
Jedoch wurde mittels MALDI-TOF-Analysen gezeigt, dass das aus E. coli isolierte HvrAProtein modifiziert war, da es mit 12786,5 Da eine um 286,2 Da höheres MW aufwies. Die
Recherche, die darüber Aufschluss geben sollte, um welche Art der Modifikation es sich
handeln könnte, zeigte, dass sowohl eine Phosporylierung (Massenzunahme von 79,96 Da)
als auch ein ADP-Ribosylierung (Massenzunahme von 541,06 Da) ausgeschlossen werden
können. Erst kürzlich konnte die Modifikation von H-NS in E. coli mit poly-βHydroxybutyrat (PHB) nachgewiesen werden (Reusch et al. 2002, Schröder und Wagner
2002), welche eine Zunahme von bis zu 12 % der molekularen Masse von
H-NS mit sich bringt. Die amphiphilen Eigenschaften des Polymers verleihen einem
100
Diskussion
hydrophoben Protein nach der Konjugation mit PHB (PHB-konjugiertes Protein) eine hohe
Löslichkeit. Jedoch ist die genaue Funktion von PHB-konjugierten H-NS-Proteinen noch
nicht geklärt. Weiterhin konnte an eukaryontischen Histonen aus dem Thymus eines Kalbs
nachgewiesen werden, dass auch diese mit PHB konjugiert sind (Reusch et al. 2002). Im
Gegensatz zu H-NS, an dem Polymere aus ca. 21 poly-β-Hydroxybutyrat-Molekülen
gebunden sind, werden die eukaryontischen Histone nur mit zwei bis drei Resten des polyβ-Hydroxybutyrat-Polymers verknüpft. Da das ermittelte MW von einem Polymer aus drei
poly-β-Hydroxybutyrat-Molekülen ca. 275 Da beträgt, könnte das HvrA-Protein in E. coli
durch PHB modifiziert sein. Die hohe Homologie von H-NS und HvrA könnte der Grund
dafür sein, dass das in E. coli überexprimierte HvrA einem modifizierenden Prozess ausgesetzt war. Auch in R. capsulatus sind die für die poly-β-Hydroxybutyrat-Synthese
benötigten Gene vorhanden. Insofern ist es auch möglich, dass HvrA in R. capsulatus unter
bestimmten Bedingungen durch PHB modifiziert werden kann. Diese Art der Modifizierung würde dann die Bindeeigenschaften von HvrA aufgrund der chemischen
Eigenschaften von PHB verbessern. Bisher bleibt es aber noch fraglich, ob diese Art der
Modifizierung in R. capsulatus überhaupt zum Tragen kommt.
3.2.2 Beeinflusst die HvrA-Menge die Regulation der Stickstoff-Fixierungsgene?
Da weder die Lichtintensität noch die Verfügbarkeit von Ammonium zu einer
Modifikation von HvrA geführt haben, wird nun der Frage nachgegangen, ob die HvrAabhängige Regulation der nif-Gene über die HvrA-Menge erfolgt. Die Signaltransduktion
könnte darin bestehen, die Mengen an HvrA in Abhängigkeit der relevanten Umweltsignale durch die Expressionsrate des hvrA-Gens zu ändern. Außerdem könnten auch
proteolytische Prozesse im Zuge einer Anpassung an sich ändernde Umweltbedingungen
die HvrA-Menge beeinflussen.
Die Proteolyse spielt bei der Regulation von Stoffwechselprozessen in der Zelle eine
wichtige Rolle. Neben der Degradation von missgefalteten Proteinen wird durch die
Proteolyse auch die Menge von Regulatorproteinen in der Zelle in Anpassung an die
jeweiligen Umweltbedingungen kontrolliert (Porankiewicz et al. 1999). So konnte bereits
gezeigt werden, dass das H-NS homologe Protein StpA in E. coli, welches eine 58 %ige
Identität zu H-NS aufweist, durch die Lon-Protease degradiert wird (Johansson und Uhlin
1999), wohingegen H-NS, von diesem Prozess unbeeinflusst, stabil in der Zelle vorkommt
(Johansson und Uhlin 1999, Johansson et al. 2001). Der zugrundeliegende Mechanismus
101
Diskussion
der selektiven Substraterkennung der Lon-Protease und das Signal, welches zur Degradation von StpA führen, sind allerdings noch ungeklärt.
Da auch R. capsulatus eine Lon-Protease aufweist (Kreuz 2002), ist es denkbar, dass durch
proteolytische Prozesse die Menge von HvrA reguliert wird. Die in dieser Arbeit durchgeführten HvrA-Akkumulationsexperimente, die Aufschluss darüber geben sollten, ob sich
die Mengen an akkumuliertem HvrA in Abhängigkeit von Umweltbedingungen unterscheiden, zeigen, dass HvrA unabhängig von der Verfügbarkeit von Ammonium in der
Zelle akkumuliert. Jedoch war eine um Faktor drei erhöhte HvrA-Akkumulation in den
unter Schwachlicht kultivierten R. capsulatus Zellen zu beobachten. In bereits durchgeführten hvrA-lacZ-Expressionsstudien konnte demonstriert werden, dass unter Schwachlichtbedingungen eine dreifach erhöhte Expression des hvrA-Gens auftritt (Drepper 2000).
Da nachgewiesen werden konnte, dass im Zuge der erhöhten hvrA-Expression auch mehr
HvrA in der Zelle akkumuliert wird, ist es wahrscheinlich, dass proteolytische Prozesse bei
der Regulation von HvrA in R. capsulatus keine große Rolle spielen.
Allerdings wurde festgestellt, dass die Lichtintensität einen entscheidenden physiologischen Reiz darstellt, welcher die Veränderung der HvrA-Mengen in der Zelle bewirkt.
Da auch in Mutationsanlysen gezeigt werden konnte, dass unter Schwachlichtbedingungen
ein Defekt im hvrA-Gen, im Gegensatz zu dem Wildtyp, zu einer signifikanten nifB1Expression führt (Drepper 2000), kann postuliert werden, dass HvrA unter Schwachlichtbedingungen einen negativen Einfluss auf die Genexpression hat. Ein weiteres Indiz
für diesen regulatorischen Mechanismus konnte durch Experimente erbracht werden, in
denen die intrazelluläre HvrA-Menge unter Starklicht artifiziell gesteigert wurde (Bierhoff
2002). Mit diesen Analysen wurde demonstriert, dass hohe intrazelluläre HvrAKonzentrationen zu einer deutlich verringerten Transkription des nifH-Gens führen.
Ausgehend von diesen Daten kann nun folgendes Modell der HvrA-vermittelten
Modulation der Nitrogenase-Gene formuliert werden: Unter Standardlichtbedingungen und
unter Nitrogenase-dereprimierenden oder -reprimierenden Bedingungen (− NH4+, + NH4+)
binden nur wenige HvrA-Proteine an die Promotoren der nif-Gene, so dass die Expression
der HvrA-kontrollierten Nitrogenase-Gene nur von dem zentralen Transkriptionsaktivator
NifA in Abhängigkeit von der Ammonium-Verfügbarkeit reguliert wird. Erst bei Abnahme
der Lichtintensität und der damit verbundenen Erhöhung der HvrA-Konzentration binden
mehr HvrA-Proteine an die Promotoren der nif-Gene und führen so zu einer Repression der
Genexpression. Der Mechanismus der HvrA vermittelten Modulation wird nun im
Anschluss betrachtet.
102
Diskussion
3.3
Mechanismus der HvrA-vermittelten Modulation der nif-Genrepression
Nukleoid-assoziierte Proteine wie H-NS haben in der Regel einen negativen Einfluss auf
die Genexpression (Schröder und Wagner 2002). Charakteristisch für die Genmodulation
durch H-NS ist eine in einem ersten Schritt spezifische Bindung an einen distinkten DNABereich (dem sogenannten „hot-spot“; Rimsky et al. 2001). Diese „hot-spots“ sind in der
Promotorregion der zu regulierenden Gene lokalisiert und weisen in der Regel intrinsische
Kurvaturen auf. Diese initiale Bindung von H-NS (es konnte gezeigt werden, dass H-NS
als „Dimer“ an DNA bindet, sog. Basiseinheit) wird in der Literatur als „nucleation“
bezeichnet (Rimsky et al. 2001) und führt bei einer hohen H-NS-Konzentration zur
Rekrutierung von weiteren H-NS-Dimeren. Dies führt dann zur Anlagerung (Polymerisierung) weiterer H-NS-Moleküle in beide Richtungen entlang der DNA. Die Polymerisierung von H-NS ist das Resultat von unspezifischen DNA-Interaktionen und einer
Proteinoligomerisierung (Schröder und Wagner 2002). Als Folge der H-NS-Bindungen
entlang der Promotor-DNA wird die Transkription reprimiert. Neuere Studien zeigen, dass
die H-NS vermittelte Repression der Genexpression auf mindestens drei unterschiedliche
Mechanismen zurückzuführen ist:
(i)
Repression der Genexpression durch Verdrängung
Bei einigen der H-NS-regulierten Gene befindet sich die H-NS-Bindestelle in
relativer Nähe des Transkriptionsstartpunktes. Durch die Oligomerisierung der
H-NS-Moleküle an der Promotor-DNA wird die RNA-Polymerase-Bindestelle
besetzt, so dass eine gebundene Polymerase von der DNA verdrängt wird und keine
weitere mehr binden kann. In diesem Fall nimmt H-NS sogar die Rolle eines
klassischen Repressors ein (Collado-Vides et al. 1991).
(ii)
Repression der Genexpression durch Veränderung der DNA-Topologie
Dieses Modell leitet sich von der Beobachtung ab, dass H-NS durch die Bindung an
Promotorregionen die DNA-Topologie stark verändern kann. Die veränderte
Topologie des Promotors unterbindet dann die Bindung der RNA-Polymerase
(Williams und Rimsky 1997).
(iii)
Repression der Genexpression durch “trapping“
In neueren Analysen, die mittels Scanning Force Microscopie (SFM) durchgeführt
wurden, konnte nachgewiesen werden, dass die flankierenden Bereiche um einen
offenen Initiationskomplex von H-NS-Proteinen besetzt werden können und somit
die RNA-Polymerase arretieren (Schröder und Wagner 2000, Dame et al. 2002). Je
nach Topologie des Promotors können auch die an den Flanken der RNA103
Diskussion
Polymerase gegenüberliegenden H-NS-Proteine interagieren. Dadurch wird die
RNA-Polymerase durch eine Schlaufenbildung der DNA arretiert.
Da HvrA eine hohe strukturelle und funktionelle Homologie zu H-NS aufweist und auch
wie andere Histon-ähnliche Proteine als Homodimer an die DNA bindet (Bertin et al.,
1999), kann nun folgender Mechanismus aufgestellt werden:
Unabhängig von der Ammonium-Verfügbarkeit kommt es unter Standardlichtbedingungen
zu einer initialen Bindung von einem HvrA-Dimer an den nifH-Promotor. Da unter diesen
physiologischen Bedingungen die HvrA-Konzentration gering ist, werden auch nur wenige
Proteine an den Promotorbereich rekrutiert. Diese bilden einen Nukleo-Protein-Komplex
aus, der einen kleinen Bereich der Promotorregion abdeckt und den DNA-Abschnitt dahingehend verändert, dass die NifA-abhängige Transkriptionsaktivierung von nifH nur unter
NH4+-Mangelbedingungen erfolgt. Unter Schwachlichtbedingungen könnten dann aufgrund der erhöhten Akkumulation von HvrA größere Bereiche der Promotorregion durch
die Oligomerisierung der HvrA-Dimere abgedeckt werden, die dann sowohl die
Bindestellen des Transkriptionsaktivators NifA als auch der RNA-Polymerase betreffen
würden. So könnte die Bindung des Transkriptionsaktivators und der RNA-Polymerase
verhindert oder diese Proteine vom Promotor verdrängt werden (Abb. D-5). Darüber
hinaus kann auch durch die Bindung von HvrA an den nifH-Promotor die Topologie derart
verändert werden, dass die für die Transkriptionsaktivierung erforderliche Interaktion
zwischen dem Transkriptionsaktivator NifA und der RNA-Polymerase aufgehoben ist.
104
Diskussion
Starklicht
- NH4
+
UA S
-O2
NifA
HvrA
σ54 RNA-Pol
nif
an
Schwachlicht
- NH4+
UA S
-O2
NifA
HvrA
-Pol
σ54 RNA
nif
aus
Abb. D-5: Modell zur Funktion von HvrA bei der Licht-abhängigen Regulation der nifHGenexpression
In der Abbildung ist schematisch das Modell zur HvrA-abhängigen Regulation der nifH-Genexpression unter
Stark- und Schwachlichtbedingungen dargestellt. Der waagerechte Pfeil symbolisiert den Transkriptionsstartpunkt. Eine Beschreibung des Modells erfolgt im Text. UAS: upstream activator sequence
Wie H-NS fungiert auch das HvrA-Protein sowohl als positiver als auch als negativer
Modulator. Da aber noch keine genauen Daten vorliegen, wie durch ein Histon-ähnliches
Protein die Expressionsrate positiv beeinflusst wird, kann nur spekuliert werden, in
welcher Weise HvrA als positiver Regulator agiert. Im Fall der Transkriptionsaktivierung
der photosynthetischen Gene puf und puh wurde bereits postuliert, dass HvrA mit phosphoryliertem RegA, welches die Transkription herbeiführt, interagieren kann (Swem und
Bauer 2002). Möglicherweise könnte eine Interaktion zwischen RegA-P und HvrA die
DNA-Bindung des Transkriptionsaktivators verbessern, so dass die Expressionsrate der
puf- und puh-Gene gesteigert wird.
Durch die HvrA-vermittelte Modulation der Genexpression verschiedener StickstoffFixierungs- und Photosynthese-Gene kommt HvrA die Funktion eines Regulators zu, der
auf ideale Weise in Abhängigkeit von relevanten Unweltbedingungen (Lichtintensität)
zwei wesentliche Stoffwechselprozesse in R. capsulatus miteinander verbindet.
105
Diskussion
4
Besitzt NrfA einen Einfluss auf die HvrA-vermittelten regulatorische
Prozesse?
In R. capsulatus sind NrfA und HvrA in die Regulation der Stickstoff-Fixierung involviert
(Drepper et al. 2002, Raabe et al. 2002). Wie bereits ausführlich dargestellt, hat NrfA in
R. capsulatus einen positiven Einfluss auf die nif- und anf-Genexpression, während HvrA
als negativer Modulator der Stickstoff-Fixierung fungiert (Kern et al. 1998, Drepper 2000).
In dem folgenden Abschnitt wird nun der Frage nachgegangen, ob NrfA und HvrA in
R. capsulatus im Hinblick auf ihre regulatorische Funktion bei der Genexpression des
Nitrogenase-Systems in Wechselwirkung treten.
Eine antagonistische Wirkung der beiden NrfA und HvrA homologen Proteine Hfq und
H-NS aus E. coli konnte bereits bei der Regulation der rpoS-Genexpression beschrieben
werden (Nogueira und Springer 2000). Wie oben beschrieben, wird das Hfq-Protein in
E. coli für die Expression des rpoS-Gens benötigt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden,
dass H-NS einen negativen Einfluss auf die Hfq-abhängige rpoS-Translation hat (Barth et
al. 1995). Als mögliche Mechanismen der wechselseitigen Beeinflussung dieser beiden
Proteine können zwei Modelle in Betracht gezogen werden: (i) Der negative Effekt, den HNS auf die rpoS-Translation ausübt, könnte auf eine direkte Protein-Protein-Interaktion
beider Proteine zurückgeführt werden (Nogueira und Springer 2000). Diese Hypothese
wird durch die Beobachtung gestützt, dass bei der Proteinisolierung von Hfq aus E. coli
das H-NS-Protein co-gereinigt wurde (Kajitani und Ishihama 1991). (ii) Weiterhin ist auch
bekannt, dass Hfq die Genexpression von H-NS positiv beeinflusst (Sledjeski et al. 2001).
In Folge der hns-Genexpression könnte dann unter entsprechenden Bedingungen H-NS die
Hfq-vermittelte rpoS-Translation verringern. So könnte die Einflussnahme beider Proteine
durch die Kontrolle der Genexpression erfolgen.
Mit den im Ergebnisteil dargestellten hvrA-Expressionsstudien wurde demonstriert, dass
NrfA in R. capsulatus nicht die Transkription von hvrA reguliert. Darüber hinaus lieferten
die Analysen der HvrA-Akkumulation in R. capsulatus keinen Hinweis darauf, dass NrfA
translational
die
HvrA-Synthese
beeinflusst.
Aufgrund
dieser
Datenlage
kann
angenommen werden, dass diese Art der gegenseitigen Beeinflussung in R. capsulatus
nicht stattfindet.
Bei der Reinigung des HvrA-Proteins aus E. coli und R. capsulatus konnte kein
co-gereinigtes Protein detektiert werden. In einem Yeast-Two-Hybrid-Experiment, in dem
die Proteininteraktion von HvrA mit NrfA untersucht wurde, konnte darüber hinaus keine
Wechselwirkung zwischen den Proteinen beobachtet werden (Bierhoff 2002). Somit
106
Diskussion
scheinen die beiden Proteine HvrA und NrfA in R. capsulatus nicht miteinander in
Wechselwirkung zu treten. Folglich kann ausgeschlossen werden, dass NrfA und HvrA in
R. capsulatus eine antagonistische Funktion bei der Regulation des Nitrogenase-Systems
haben. Darüber hinaus zeigen die durchgeführten Mutationsanalysen, dass NrfA im
Gegensatz zu HvrA die Expression der Nitrogenasegene auf unterschiedlichen regulatorischen Ebenen kontrolliert.
5
HvrA hat eine antagonistische Wirkung zu IHF
Neben HvrA beeinflusst auch das IHF-Protein in R. capsulatus die Expression der NifAabhängigen nifH-Genexpression. Aber im Gegensatz zu HvrA aktiviert IHF die nifHExpression (Simon 2002). Die transkriptions-aktivierende Eigenschaft wird auf eine IHF
induzierte Kurvatur des nifH-Promotors zurückgeführt, welche die Interaktion der an die
UAS gebundenen NifA Proteine mit der RNA-Polymerase erst ermöglicht (Goosen und
van de Putte 1995, Santero et al. 1992). Nähere Analysen haben gezeigt, dass zwischen
HvrA und IHF eine antagonistische Funktion bei der Regulation der nifH-Genexpression
besteht (Simon 2002). Während in einer hvrA-Mutante sowohl unter Nitrogenase-dereprimierenden als auch unter -reprimierenden Bedingungen eine erhöhte nifH-Expression
nachweisbar ist (Kern et al. 1998), führt eine himA-Mutantion (himA kodiert für eine
Untereinheit des IHF) zu einer verringerten Expressionsrate. In einer Doppelmutante
(himA, hvrA) kann der himA-Phänotyp teilweise subprimiert werden (Simon 2002).
Auch in E. coli sind antagonistische Wechselwirkungen von H-NS mit anderen Nukleoidassoziierten Proteinen beschrieben worden (Schröder und Wagner 2002). Bei der Regulation der frühen Gene des Bakteriophagen Mu konnte eine antagonistische Wirkung
zwischen H-NS und IHF gezeigt werden. Der antagonistische Mechanismus besteht darin,
dass sich H-NS und das IHF-Protein von der DNA gegenseitig verdrängen (van Ulsen et
al. 1997 a, b).
In den durchgeführten Gel-Retardations-Experimenten wurde eine schwache Bindung von
HvrA an die Subfragmente PnifH-down und PanfH-up, welche die IHF-Bindestelle enthalten,
gezeigt. Da möglicherweise für die initiale HvrA-Bindung an die Promotoren auch die
Struktur der Promotor-Fragmente entscheidend sein könnte, ist wohlmöglich durch die
Wahl der Subfragmente der nifH- und anfH-Promotorfragmente die Struktur verändert
worden, so dass eine initiale Bindung von HvrA an die Subfragmente bei geringeren
Protein-Konzentrationen ausbleibt. Der Umstand, dass bei hohen HvrA-Konzentrationen
eine Bindung von HvrA nur an die Subfragmente PnifH-down und PanfH-up zu beobachten
107
Diskussion
war, kann als Hinweis gewertet werden, dass die initiale HvrA-Bindung in der Nähe der
IHF-Bindestelle erfolgen könnte (Abb. D-6). Darüber hinaus kann anhand dieser Daten
auch vermutet werden, das HvrA und IHF möglicherweise um überlappende Bindestellen
konkurrieren.
HvrA Bindung
Promotorfragment
UAS IHF-BS -24/-12
nifH
nifH
nifH
DNA-Bindung
PnifH
+++
PnifH -up
(−)
PnifH -down
(+)
PanfH
+++
PanfH -up
(+)
PanfH -down
(−)
HvrA Bindung
UAS IHF-BS -24/-12
anfH
anfH
anfH
Abb. D-6: Lokalisation der putativen initialen HvrA-Bindestelle in der nifH- und anfHPromotorregion
Die Abbildung zeigt schematisch die unterschiedlichen Fragmente und Subfragmente der nifH- und anfHPromotorregion, die in den Gel-Retardations-Experimenten verwendet wurden, und der darin enthaltenen cisElemente. Die horizontalen Pfeile weisen auf die relative Lage des Transkriptionsstartpunktes des nifH- und
anfH-Gens hin. Der senkrechte Pfeil deutet die putative Binderegion von HvrA in den Promotorregionen an.
In der rechten Bildhälfte sind die Ergebnisse der DNA-Bindestudien von HvrA an die entsprechenden
Promotorfragmente von nifH (PnifH) und anfH (PanfH) abgebildet. Abkürungen: −24/−12 (σ54-Bindestelle),
UAS (upstream activator sequence), IHF (integration host factor-Bindestelle), spezifische HvrA-Bindung
+++, keine Bindung (–), schwache Bindung (+).
Auch die beschriebene antagonistische Wirkung von HvrA und IHF könnte in
R. capsualtus in Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen wie folgt verlaufen: Die
in R. capsulatus unter anaearoben Starklichtbedingungen bindenden HvrA- und IHFProteine induzieren eine Kurvatur, die eine Interaktion der an die UAS gebundenen NifAProteine mit der RNA-Polymerase ermöglicht. Unter Schwachlichtbedingungen binden
mehr HvrA-Proteine an den nifH-Promotor und verdrängen das IHF-Protein von der DNA.
108
Diskussion
Die IHF induzierte Kurvatur des nifH-Promotors wird dann durch die HvrA-Bindung
teilweise wieder aufgehoben, so dass die an die UAS gebundenen NifA-Proteine nicht
mehr in räumlicher Nähe zur RNA-Polymerase sind und somit die Transkription ausbleibt.
Möglicherweise spielen bei der Modulation der nifH-Genexpression neben der möglichen
Verdrängung der RNA-Polymerase und des NifA-Proteins auch noch die Veränderung der
Promotorstruktur eine Rolle. Das in Abbildung D-5 dargestellte Modell muss demnach
noch um den Aspekt der topologischen Veränderung erweitert werden.
6
Modell zur Funktion von IHF, NrfA und HvrA bei der Regulation der
Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus
Die drei Nukleoid-assoziierten Proteine IHF, NrfA und HvrA sind in R. capsulatus bei der
Regulation der Stickstoff-Fixierung beteiligt. Als übergeordnete Regulatoren beeinflussen
sie die Genexpression beider Nitrogenase-Systeme auf verschiedenen Ebenen. Dabei wird
IHF als positiver Regulator für die Expression von nifH und anfH benötigt (Simon 2002).
Darüber hinaus reguliert IHF auch die Expressionsrate von nifA1 und nifA2. NrfA
beeinflusst in R. capsulatus die Synthese der zentralen Transkriptionsaktivatoren NifA1,
NifA2 und AnfA. Dabei nimmt NrfA wahrscheinlich Einfluss auf postranskriptionale
Prozesse. Weiterhin wird auch die Genexpression der nif- und anf-Gene (nifH und anfH)
durch das Histon-ähnliche Protein HvrA moduliert. Durch die direkte spezifische Bindung
an die Promotorregionen von nifH wird in Anpassung an die Lichtintensität die Genexpression dieser Gene moduliert. Unter Schwachlichtbedingungen binden in Folge einer
erhöhten hvrA-Expression und Akkumulation mehr HvrA-Dimere an die Promotorregion
von nifH und setzen die Genexpression herab. Basierend auf den zusammengestellten
Ergebnissen der Funktionsuntersuchungen von NrfA und HvrA in R. capsulatus kann das
in Abbildung D-7 dargestellte Regulationsmodell aufgestellt werden.
109
Diskussion
NtrC -P
−NH4+
IHF
nifA
σ70
logWuchsphase?
+
+
NrfA
+
anfA
+
mRNA
mRNA
Schwachlicht
NifA
−NH4+
nif-Gene
Mo-Nitrogenase
+
IHF
–
IHF
AnfA
HvrA
−NH4+
+
anf-Gene
Fe-Nitrogenase
Abb. D-7: Modell zur Funktion von IHF, NrfA und HvrA bei der Regulation der
Stickstoff-Fixierung in R. capsulatus
Die Abbildung fasst schematisch die Funktion von IHF, NrfA und HvrA bei der Regulation der beiden
Nitrogenase-Systeme zusammen. Eine Beschreibung des Modells erfolgt im Text. Die physiologischen
Voraussetzungen für den regulatorischen Effekt sind durch gestrichelte Boxen hervorgehoben. +: positiver
Einfluss; –: negativer Einfluss
110
Zusammenfassung
E
Zusammenfassung
Rhodobacter capsulatus ist ein phototrophes Purpurbakterium, das in der Lage ist, mittels
einer konventionellen Molybdän-haltigen Nitrogenase (nif-kodiert) und einer Heterometall-freien, alternativen Nitrogenase (anf-kodiert) atmosphärischen Stickstoff (N2) zu
fixieren. Die Synthese und die Aktivität der beiden Nitrogenase-Systeme wird u.a. in
Abhängigkeit von der Ammonium-Verfügbarkeit und der Lichtintensität auf verschiedenen
regulatorischen Ebenen strikt kontrolliert. Bei Ammonium-Mangel wird der Responseregulator NtrC durch die Sensor-Kinase NtrB phosphoryliert. NtrC-P aktiviert darauf die
Expression der Gene nifA1 und nifA2 bzw. anfA, welche für die spezifischen Transkriptionsaktivatoren der weiteren nif- und anf-Gene kodieren. Auf der zweiten regulatorischen
Ebene werden die Aktivatorproteine NifA bzw. AnfA in Gegenwart von Ammonium
inhibiert. Die für die Stickstoff-Fixierung benötigten Energieäquivalente werden durch die
anoxygene Photosynthese bereitgestellt. Somit besteht eine enge stoffwechselphysiologische Koppelung beider Prozesse. Durch das Nukleoid-assoziierte Protein HvrA werden
darüber hinaus die Synthese des Photosystems und der Nitrogenase-Enzymkomplex auf
regulatorischer Ebene miteinander verbunden. Bei geringer Lichtintensität führt HvrA als
Schwachlichtaktivator zu einer erhörten Expression verschiedener Photosynthese-Gene.
Daneben fungiert HvrA jedoch auch als negativer Modulator der nifH- und nifB1Expression. Dabei scheint HvrA unter Schwachlichtbedingungen die Expression der nifGene vollständig reprimieren zu können.
Um den Mechanismus der HvrA-vermittelten Modulation der nif-Genexpression aufzuklären, wurden in Gel-Retardations-Experimenten die DNA-Bindeeigenschaften des aus
R. capsulatus isolierten HvrA-His6-Fusionsproteins an ausgewählten nif-Promotoren
untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HvrA spezifisch an einige der ausgewählten
nif-Promotoren (wie z.B. PnifH) bindet. Eine derartige spezifische HvrA-Bindung konnte
jedoch nicht für alle ausgewählten nif-Promotoren nachgewiesen werden. Somit kann die
HvrA-vermittelte negative Modulation verschiedener nif-Gene auf eine direkte DNABindung zurückgeführt werden. Sie scheint jedoch selektiv und somit auf bestimmte
Promotoren beschränkt zu sein. Die exakte Bestimmung der molekularen Masse des
gereinigten HvrA-His6 Proteins mittels massenspektroskopischen Verfahrens (MALDITOF) zeigte, dass der Regulator unter den getesteten Umweltbedingungen nicht kovalent
modifiziert wird. Immunoblot-Analysen, die Aufschluss darüber geben sollten, ob die
intrazelluläre HvrA-Konzentration in Abhängigkeit von der Lichtintensität variiert, war zu
entnehmen, dass unter Schwachlichtbedingungen die intrazelluläre HvrA-Konzentration
111
Zusammenfassung
signifikant gesteigert ist. Somit liegt die Vermutung nahe, dass die Aktivität des Regulators
HvrA nicht, wie zunächst angenommen, durch eine kovalente Modifikation des Proteins
reguliert wird. Es scheint vielmehr, dass ausschließlich die Erhöhung der zellulären HvrAMenge unter Schwachlichtbedingungen zu der beobachteten Repression der nif-Genexpression führt. Durch Mutationsanalysen konnte außerdem gezeigt werden, dass neben
HvrA ein weiteres Nukleoid-assoziiertes Protein in die Regulation der Stickstoff-Fixierung
eingreift. In vivo Nitrogenase-Aktivitätstests und Expressionsstudien mit verschiedenen
nif-Reportergenfusionen machten deutlich, dass die in einer nrfA-Mutante zu beobachtende
drastische Abnahme der Aktivität beider Nitrogenase-Systeme letztendlich auf eine
verminderte Synthese der Transkriptionsaktivatoren NifA1, NifA2 und AnfA zurückzuführen ist. Demzufolge regulieren in R. capsulatus die beiden Nukleoid-assoziierten
Proteine HvrA und NrfA auf zwei unterschiedlichen Ebenen die Synthese der Molybdänabhängigen und der alternativen Nitrogenase.
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