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Aus der Sektion Experimentelle Anästhesiologie der Anästhesiologischen
Universitätsklinik und dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Hygiene der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.Br.
Helicobacter pylori aktiviert den Transkriptionsfaktor
AP-1 über Mitogen-aktivierte Proteinkaskaden und induziert die
Protoonkogene c-fos und c-jun
INAUGURAL DISSERTATION
zur Erlangung
des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universtität
Freiburg i. Br.
vorgelegt 2003
von Tobias Meyer-ter-Vehn
geboren in München
Freiburg i.Br.
Dekan : Prof. Dr. M. Schumacher
1. Gutachter : Frau Prof. Dr. rer. nat. H.L. Pahl
2. Gutachter : Prof. Dr. Dr. hc. H.E. Blum
Promotionsjahr 2003
Meiner Familie gewidmet
Der Mensch muß bei dem Glauben verharren,
daß das Unbegreifliche begreiflich sei,
er würde sonst nicht forschen.
J.W. Goethe
Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht :
Meyer-ter-Vehn T, Covacci A, Kist M, Pahl HL (2000) Helicobacter pylori activates MAP
Kinase cascades and induces expression of the proto-oncogenes c-fos and c-jun. J. Biol.
Chem. 275 : 16064-16072.
Meyer-ter-Vehn T, Fleckenstein M, Diehl S, Pahl HL (2002) Helicobacter pylori stimulates
VEGF secretion from gastric epithelial cells through MAP kinase activation. submitted.
Vorträge :
Helicobacter pylori aktiviert MAP Kaskaden und induziert die Expression der ProtoOncogene c-fos und c-jun.
54. Jahrestagung der DGVS, 22.-25.September 1999, Leipzig
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ....................................................................................................... 1
1.1
Helicobacter pylori (H. pylori)............................................................................................................... 1
1.2
Entwicklung der H.pylori Forschung.................................................................................................... 1
1.3
Epidemiologie .......................................................................................................................................... 2
1.4
Pathogentitätsfaktoren von H.pylori..................................................................................................... 2
1.4.1
Urease ............................................................................................................................................... 3
1.4.2
Motilität ............................................................................................................................................ 3
1.4.3
Adhäsion........................................................................................................................................... 4
1.4.4
Zytotoxin VacA ................................................................................................................................ 4
1.4.5
Zytotoxin assoziiertes Protein CagA ................................................................................................ 5
1.4.6
Pathogenitätsinsel CagI..................................................................................................................... 6
1.4.7
Molekularer Mimikry ....................................................................................................................... 6
1.5
H.pylori assoziierte Erkrankungen ....................................................................................................... 7
1.5.1
MALT Lymphom ............................................................................................................................. 8
1.5.2
Adenocarcinom des Magens............................................................................................................. 8
1.6
Reaktionen des Magenepithels auf die H.pylori Infektion .................................................................. 9
1.6.1
Interleukin 8 in der H.pylori Infektion.............................................................................................. 9
1.7
Der Transkriptionsfaktor AP-1 ........................................................................................................... 10
1.7.1
Die Komponenten des AP-1 Transkriptionsfaktors ........................................................................ 11
1.7.2
Transkriptionelle Aktivität.............................................................................................................. 11
1.8
Die MAP Kinase Kaskaden.................................................................................................................. 12
1.8.1
Allgemeine Wirkung von MAPK Kaskaden .................................................................................. 14
1.8.2
ERK-Signalkaskade ........................................................................................................................ 14
1.8.2.1
Zellproliferation........................................................................................................................ 15
1.8.2.2
Weitere Effekte der ERK-Kaskade........................................................................................... 15
1.8.3
JNK-Signalkaskade......................................................................................................................... 15
1.8.4
MAPK und Apoptose ..................................................................................................................... 16
1.9
Regulation von c-fos und c-jun ............................................................................................................ 16
1.9.1
Induktion der c-fos Expression ....................................................................................................... 16
1.9.2
Regulation von c-Jun ...................................................................................................................... 17
1.9.3
Bedeutung von c-Fos und c-Jun in der Onkogenese ....................................................................... 17
1.10
2
Zielsetzung der Arbeit .......................................................................................................................... 18
MATERIAL ........................................................................................................ 19
2.1
Geräte..................................................................................................................................................... 19
2.2
Chemikalien........................................................................................................................................... 20
2.3
Zellkulturmaterial................................................................................................................................. 21
2.4
Synthetische Oligonukleotide............................................................................................................... 22
2.5
Plasmide................................................................................................................................................. 22
2.6
Zellinien ................................................................................................................................................. 22
2.7
Zelltransfektion ..................................................................................................................................... 23
2.8
Zytokine & Inhibitoren ........................................................................................................................ 23
2.9
Antikörper ............................................................................................................................................. 23
3
METHODEN ...................................................................................................... 25
3.1
Prokaryontische Zellkultur.................................................................................................................. 25
3.1.1
Kultivierung von H.pylori............................................................................................................... 25
3.1.1.1
Anzucht auf Nährböden............................................................................................................ 25
3.1.1.2
Anzucht in Flüssigmedium ....................................................................................................... 26
3.1.1.3
Langzeitkonservierung ............................................................................................................. 27
3.1.2
Spezifiaktion von H.pylori.............................................................................................................. 27
3.1.3
Vorbereiten der Bakterien für ein Stimulationversuch ................................................................... 28
3.2
Eukaryontische Zellkultur ................................................................................................................... 28
3.2.1
Passage der Zellen .......................................................................................................................... 29
3.2.1.1
Adhärente Zellen ...................................................................................................................... 29
3.2.1.2
Nicht adhärente Zellen.............................................................................................................. 29
3.2.2
Langzeitkonservierung.................................................................................................................... 30
3.2.3
Bestimmung der Zellanzahl ............................................................................................................ 30
3.2.4
Ausplattieren der Zellen.................................................................................................................. 30
3.3
Molekularbiologische Methoden ......................................................................................................... 31
3.3.1
Plasmide.......................................................................................................................................... 31
3.3.1.1
Plasmidpräparation ................................................................................................................... 31
3.3.2
DNA-Quantifizierung ..................................................................................................................... 32
3.3.3
DNA – Agarosegelelektrophorese .................................................................................................. 32
3.3.4
Herstellung von cDNA Sonden ...................................................................................................... 32
3.3.5
Markieren der cDNA Sonden mit α-(32P)-dCTP ............................................................................ 33
3.3.6
Northern Blot.................................................................................................................................. 33
3.3.6.1
RNA-Präparation ...................................................................................................................... 33
3.3.6.2
Gelelektrophorese der RNA ..................................................................................................... 34
3.3.6.3
Nothern Blot ............................................................................................................................. 34
3.3.6.4
Hybridisierung .......................................................................................................................... 35
3.3.7
Transfektion.................................................................................................................................... 35
3.3.7.1
Vorbereiten der Zellen.............................................................................................................. 36
3.3.7.2
Zellernte.................................................................................................................................... 36
3.3.7.3
Bestimmung der Luciferase Aktivität....................................................................................... 36
3.4
Proteinbiochemische Methoden........................................................................................................... 37
3.4.1
Stimulation von Magenepithelzellen durch H.pylori ...................................................................... 37
3.4.2
Gewinnung der Gesamtzellextrakte................................................................................................ 37
3.4.3
Proteinbestimmung nach Bradford ................................................................................................. 38
3.4.4
Gelretardierungsassay / EMSA....................................................................................................... 39
3.4.4.1
Markieren von Oligonukleotiden mit γ-(32P)-dATP ................................................................. 39
3.4.4.2
EMSA Mix ............................................................................................................................... 40
3.4.4.3
Supershift.................................................................................................................................. 41
3.4.4.4
Kompetitionsassay.................................................................................................................... 41
3.4.5
Westernblott / Immunoblott............................................................................................................ 41
3.4.5.1
SDS-PolyAcrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)................................................................... 42
3.4.5.2
Blotten ...................................................................................................................................... 43
3.4.5.3
Immundetektion........................................................................................................................ 44
3.4.5.4
Stripping ................................................................................................................................... 45
3.4.6
MAP Kinase Assay......................................................................................................................... 45
3.4.6.1
Immunpräzipitation .................................................................................................................. 45
3.4.6.2
Kinase Assay ............................................................................................................................ 46
4
4.1
ERGEBNISSE ................................................................................................... 47
Etablierung des AP-1 EMSA ............................................................................................................... 47
4.2
H.pylori induziert AP-1 in AGS Zellen ............................................................................................... 53
4.2.1
Identifikation der AP-Untereinheiten ............................................................................................. 53
4.2.2
Kinetik der AP-1 Aktivierung......................................................................................................... 55
4.2.3.
Aktivierung von AP-1 durch Mutanten des H.pylori Stamm G27.................................................. 56
4.3
H.pylori aktiviert die ERK/MAP Kinase Kaskade ............................................................................ 57
4.3.1
Kinetik der ERK Aktivierung ......................................................................................................... 62
4.4
H.pylori aktiviert JNK.......................................................................................................................... 63
4.5
H.pylori induziert die Transkription von c-fos................................................................................... 64
4.6
H.pylori bewirkt c-Jun Phosphorelierung .......................................................................................... 67
4.7
Etablierung von Reportergen Versuchen ........................................................................................... 69
4.7.1
Etablierung der Transfektion von AGS-Zellen............................................................................... 69
4.7.2
Serumdeprivation............................................................................................................................ 72
4.8
H.pylori induziert AP-1 und SRF abhängige Genexpression............................................................ 75
4.9
H.pylori induziert keine MRE abhängige Genexpression ................................................................. 76
4.10
H.pylori und Cyclin D1 Expression...................................................................................................... 77
4.11
VEGF und H.pylori............................................................................................................................... 80
4.11.1
Regulation der Angiogenese durch VEGF...................................................................................... 80
4.11.2
H.pylori induziert die Transkription von VEGF in AGS Zellen..................................................... 81
5
DISKUSSION .................................................................................................... 83
5.1
H.pylori aktiviert den Transkriptionsfaktor AP-1 via MAPK Kaskaden ....................................... 83
5.1.1
ERK Signaltransduktionsweg ......................................................................................................... 83
5.1.1.1
H.pylori aktiviert MEK1/2 und ERK1/2................................................................................... 84
5.1.1.2
ERK Kaskade und Neoplastische Transformation.................................................................... 84
5.1.1.3
ERK-Signalkaskade als Regulator des Zellzyklus.................................................................... 85
5.1.2
JNK Signaltransduktionsweg.......................................................................................................... 88
5.1.2.1
H.pylori aktiviert JNK .............................................................................................................. 88
5.1.3
MAPK Kaskaden in der Interaktion zwischen Wirt und Erreger.................................................... 89
5.2
Welcher Bestandteil von H.pylori aktiviert die MAPK-Kaskaden und AP-1 ? .............................. 90
5.3
H.pylori aktiviert VEGF....................................................................................................................... 92
6
ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................... 93
7
REFERENZEN .................................................................................................. 94
-1-
1. Einleitung
H.pylori ist ein gramnegatives, spiralförmiges,
2-5 µm großes Stäbchenbakterium, das
1 Einleitung
1.1
Helicobacter pylori (H. pylori)
unipolar 2-6 unbescheidete Flagellen mit terminalen Auftreibungen besitzt [Goodwin et al.,
1990]. Seinen Namen verdankt es zum einen seiner spiralförmigen Morphologie (Helix),
andererseits seiner präferentiellen Lokalisation im Pylorus des Magens. H.pylori besiedelt die
Magenschleimhaut des Menschen und lebt in engem Kontakt mit dem Magenepithel, wo es
durch die physiologische Schleimschicht vor dem sauren Milieu des Magens geschützt ist.
Die Kolonisation ist wirtsspezifisch – der Mensch ist somit nach heutigem Wissensstand das
einzige Reservoir der Spezies.
Biochemisch zeichnet sich H.pylori primär durch seine Ureaseaktivtät aus, die ihm das
Überleben im sauren Milieu des Magens ermöglicht. Weitere enzymatische Charakteristika
sind die Produktion von Zytochromoxidase und γ-Glutamyl-Aminopeptidase, die in
Verbindung mit der strikt mikroaerophilen Lebensweise der Identifikation des Erregers
dienen. Darüberhinaus besitzt es alkalische Phosphatase Aktivität, kann H2S bilden und wird
durch Cephalotin, nicht jedoch Nalixidinsäure im Wachstum gehemmt. Katalase und
Superoxiddismutase (SOD) dienen der Inaktivierung von Sauerstoffradikalen. H.pylori kann
weder Nitrate reduzieren noch Hippurate hydrolisieren oder Kohlenhydrate metabolisieren.
1.2
Entwicklung der H.pylori Forschung
Im Jahre 1874 stellte Boetcher als erster die Hypothese auf, das chronische Magenulkus
könne durch eine Infektion verursacht sein. Bizzozero berichtete 1893 über spiralförmige
Organismen in Magenschleimhautbiopsien von Hunden [Bizzozero 1893]. Konjetzny
beschäftigte sich mit dem Zusammenhang zwischen Ulkus und der chronischen Gastritis, in
der er die Ursache für das Magenulkus sah. Erst die durch die chronische Gastritis
geschädigte Magenschleimhaut ermögliche eine bakterielle Besiedelung, die die Gastritis
verstärke und zum Ulkus führen kann [Konjetzny 1923]. Eine erhöhte Ureaseaktivität stellten
Luck & Seth 1924 bei Patienten mit Magenbeschwerden fest. Die erste nähere Beschreibung
von H.pylori gelang Steer & Collin-Jones elektronenmikroskopisch an endoskopisch
entnommenen Magenbiopsien. Nachdem Marshall 1983 die erste Kultivierung von H.pylori
-2-
1. Einleitung
gelungen war, zeigte er 1985 im Selbstversuch die Kausalität zwischen Infektion und
Magenbeschwerden. Anfangs wurde der Keim der Gattung Campylobacter zugeordnet.
Hiervon unterscheidet er sich jedoch durch seine Begeißelung, die starke Ureaseaktivität, den
niedrigeren GC-Gehalt seiner DNA (37%) [Kist 1994] und bzgl. der 16S rRNA-Sequenz, so
daß das ursprünglich der Gattung Campylobacter zugeordnete Bakterium in Helicobacter
pylori umbenannt wurde [Goodwin, 1989]. Die Entschlüsselung des Genoms von H.pylori
Stamm 26695 gelang Tomb und seinen Mitarbeitern. Ein weiterer Helicobacter pylori Stamm
– J99 – wurde von der Firma „Genome Therapeutics“ vollständig sequenziert, so daß
Genomvergleiche zweier unterschiedlicher H.pylori Stämme ermöglicht wurden.
1.3
Epidemiologie
H.pylori ist ein weltweit verbreiteter Keim. Während in den Industrieländern ca. 30%-50%
der
Bevölkerung
infiziert
sind
[Pounder,
1995],
liegt
die
Prävalenz
in
den
Entwicklungsländern deutlich höher, so z.B. in Korea im Kindesalter bei mehr als 50% und
bei Erwachsenen bis zu 90 % [Baik, 1990]. Eindeutige Risikofaktoren sind ein niedriger
Hygienestandard und niedrige sozioökonomische Verhältnisse.
1.4
Pathogenitätsfaktoren von H.pylori
Die Fähigkeit eines Krankheitserregers, Barrieren des Wirtes zu überwinden und somit eine
ökologische Nische des Wirtsorganismus zu besiedeln, werden als Pathogenitätsfaktoren
bezeichnet. Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Pathogenitätsfaktoren von H.pylori:
Virulenzfaktor
Beteiligte Gene
Funktion
Urease
ureA, ureB
Harnstoffspaltung
ureI,ureE,ureF
Akzessorische Gene
ureG, ureH, hspA
Beweglichkeit
nixA
Transport von Nickel
flaA, flaB
Flagellenfilament
flgE
Flagellen-Hakenprotein
flbA
Koordination der Flagellensynthese
fliI
Transport der Strukturproteine
-3-
1. Einleitung
Zytotoxin
VacA
Destruktion von Wirtszellen
Immunstimulation
Cag –Gene
Induktion von Wirtsimmunantwort
Superoxiddismutase
SodB
Inaktivierung von Sauerstoffradikalen
Katalase
KatA
Mimikry
GalE
Synthese von Lewis x- & y- identischen
Fucosyltransferase
Oligosaccharidseitenketten im LPS
alpA/B, babA-2
Bindung an Wirtszellen
Adhäsion
Tabelle 1 : Übersicht über wichtige Pathogenitätsfaktoren von H.pylori
aus S.Bereswill, M.Kist : Mikrobiologie 7. Jg 1997 :131, sowie Habilitationsschrift von S.Bereswill: S.9
1.4.1
Urease
H.pylori zeichnet sich insbesondere durch die Produktion großer Mengen an Urease aus, die
Harnstoff in Kohlendioxid und Ammoniak spaltet. Die Ammoniak Moleküle können die
Magensäure neutralisieren und so H.pylori die Kolonisation des Magens ermöglichen
[Goodwin, 1986]. Desweiteren dient das gebildete Ammoniak dem Bakterium als
Stickstoffquelle [Williams, 1996]. Das native Enzym ist ein 550 kDa Proteinkomplex und
besteht aus 6 Dimeren der zwei Untereinheiten UreA und UreB. Für die enzymatische
Aktivität ist Nickel als Kofaktor essentiell. Die Urease ist sowohl im Zytosol als auch an der
Zelloberfläche lokalisiert, wo sie als immunogenes Protein die Migration von Monozyten und
Granulozyten stimuliert [Mai, 1991]. Mutanten, die in den Genen für UreA und UreB
inaktiviert wurden, konnten weder im Tierversuch die Magenschleimhaut kolonisieren [Eaton,
91], noch bei sauren pH-Verhältnissen überleben [Segal, 1992].
1.4.2
Motilität
Die unipolaren Flagellen, die aus den Proteinen FlaA und FlaB aufgebaut sind, verleihen
H.pylori eine hohe Motilität und ermöglichen damit ein Durchdringen der Mukusschicht
sowie eine Kolonisation des Magens. Flagellenlose Mutanten sind im Tierversuch nicht in der
Lage, den Magen zu besiedeln [Eaton, 1992]. Somit stellt die Beweglichkeit sicherlich einen
wichtigen Pathogenitätsfaktor dar.
-41.4.3
1. Einleitung
Adhäsion
Nachdem die chemischen (Magensäure) und physikalischen Barrieren (Mukusschicht)
überwunden sind, adhäriert H.pylori an das Magenepithel. Dabei bindet H.pylori v.a. an
Polysaccharidstrukturen
der
Magenepithelzellen,
so
z.B.
an
das
fibrilläre
N-
Acetylbeuraminyllactose bindende Hämaglutinin [Evans, 1988], sowie an ein 19,6 kD
Adhäsin [Doig, 1992] und an Glycerollipidstrukturen [Lingwood, 1992]. Desweiteren
adhäriert H.pylori mit dem BabA-2 Adhäsin an das Blutgruppenmarkerantigen Lewis b, das
neben Erythrozyten auch auf Magenepithelzellen exprimiert wird [Ilver, 1998 & Boren,
1993]. Das Lewis b Antigen wird nur von Menschen der Blutgruppe 0 exprimiert – diese
weisen eine erhöhte Inzidenz für Ulcera und Magenkarzinome auf. Die Mutation einer
weiteren Gruppe von bakteriellen Adhäsinen - AlpA und AlpB - führt zum Verlust der
Bindungsfähigkeit [Odenbreit, 1999]. Diese Adhäsine sind wahrscheinlich vom Lewis-b
Antigen Rezeptor unabhängig.
1.4.4
Zytotoxin VacA
Das Zytotoxin wird zunächst als 140 kDa Protein exprimiert, dessen Mittelteil sich nach
Abspalten von N- und C-terminalen Enden außerhalb der Zelle in zwei 37 und 58 kDa
Untereinheiten teilt, und sich dann zu einem 600 kDa Multimer zusammenlagert.
Das vakuolisierende Zytotoxin bewirkt eine charakteristische Vakuolenbildung in der
Wirtszelle. Dies führt zu Schleimhautläsionen und bis zur Nekrose des Epithels. Das Gen für
das Toxin, vacA, weist einen starken Polymorphismus auf, ist aber bei allen H.pylori
Stämmen vorhanden, wohingegen nur 50% aller H.pylori Stämme auch ein funktionelles
Toxin sezernieren. Dabei lassen sich klar Subtypen in der N-terminalen Gensequenz (s1, s2)
und im mittleren Bereich (m1, m2) abgrenzen. Stämme mit dem Genotyp s1 weisen eine
stärkere Toxizität des gebildeten Proteins auf und korrelieren mehr mit einer
Ulkuserkrankung, während der Genotyp s2 eher mit einer Gastritis assoziiert ist.
Die Sekretion des VacA Toxins zeigt eine starke Korrelation mit der Expression des
„Cytotoxin associated Gene“ CagA [Covacci, 1993], wobei dies durch die Nähe der beiden
Gene und nicht durch eine kausale Verknüpfung verursacht wird, da eine selektive Deletion
des CagA Gens nicht zu einer Reduktion der VacA Sekretion führt [Akopyants, 1998].
-51.4.5
1. Einleitung
Zytotoxin assoziiertes Protein CagA
Das 120-140 kDa große, stark immunogene CagA Protein wird von ca. 70-80% der
europäischen H.pylori Stämme exprimiert. Zuerst wurde die lokale IgA und systemische IgG
Antikörperantwort gegen CagA in Seren von Patienten 1988 von Apel beschrieben, sowie die
Infiltration der Magenmukosa mit polymorphkernigen Granulozyten. Die Klonierung und
molekulare Charakterisierung gelang Covacci 1993. Die Präsenz des Gens korreliert eng mit
dem Auftreten von H.pylori assoziierten Folgeerkrankungen - dementsprechend unterscheidet
man pathogene Typ I H.pylori Stämme, die CagA exprimieren, und weniger pathogene Typ II
H.pylori Stämme, die CagA nicht produzieren. Hierbei liegt, anders als bei VacA, immer ein
Verlust des cagA Gens vor. Cover konnte zeigen, daß das Ulcus duodeni zu 100% mit einer
Infektion durch cagA+ Stämme einhergeht, wohingegen bei einer blanden Gastritis nur in
60,8% cagA+ Stämme gefunden wurden. Im Vergleich mit cagA- Infektionen wiesen
Patienten, die mit einem cagA+ Stamm infiziert waren, eine erhöhte Inzidenz von
Adenokarzinom im distalen Abschnitt des Magens sowie MALT-Lymphomen des Magens
auf [Blaser 1995, Rudi 1997, Eck 1997]. Um die H.pylori Pathogenese in vitro zu studieren,
wurden Bakterien mit Magenepithelzellinien kokultiviert. cagA+ Stämme, nicht aber cagAführten zu einer Sekretion des Chemokins Interleukin 8 [Crabtree 94]. Diese Ergebnisse
bekräftigten frühere Beobachtungen, daß Magenbiopsien von Patienten mit einer H.pylori
Infektion gegenüber nichtinfizierten Patienten deutlich erhöhte IL-8 Spiegel, aber auch TNFα
und IL-6 Spiegel aufweisen [Crabtree 1991, 1993; Gionchetti 1994]. In vitro Versuche mit
H.pylori Mutanten, bei denen selektiv das cagA Gen oder das vacA Gen deletiert wurde,
zeigten jedoch keine Verminderung der IL-8 Sekretion in Vergleich zum Wildstamm
[Crabtree 95, Shamra 95]. Cag stellt somit ein Marker für erhöhte Virulenz dar, ist jedoch
nicht direkt in die Induktion von IL-8 involviert. Einen besseren Einblick in die CagAassoziierte Virulenz gewährte die Entdeckung der 40 kb großen Pathogenitätsinsel (PAI) in
direkter Nachbarschaft zum cagA Gen [Censini 1996]. Einige Gruppen konnten kürzlich
zeigen, daß H.pylori das CagA Protein über einen Typ IV Sekretionsmechanismus in die
Wirtszelle transferiert und es dort zu einer Phosphorelierung von CagA kommt, was
wiederum zu Veränderungen des Tyrosinphosphorelierungszustandes von Zellproteinen führt
[Odenbreit, 2000; Stein, 2000].
-61.4.6
1. Einleitung
Pathogenitätsinsel CagI
Da CagA offenbar nicht essentiell für die Sekretion von IL-8 ist, suchten Tummuru et al. nach
anderen IL-8 induzierenden Genen und fanden stromaufwärts von cagA die Gene picA und
picB (permits induction of cytokines). Eine ausführlichere Untersuchung der benachbarten
DNA-Sequenz ergab, daß ein 40 Kb großer heterologer DNA-Abschnitt insgesamt für über 25
Proteine kodiert (u.a. picA und picB), sowie charakteristische Eigenschaften einer
Pathogenitätsinsel (PAI) aufweist [Censini 1996]. Die Proteine der PAI wurden fortlaufend
mit cagA, cagB, … benannt, die Pathogenitätsinsel selbst als cag Region. Die cag Region ist
durch eine Insertion eines transposablen Elementes (IS605) in zwei Abschnitte – cagI und
cagII – unterteilt. Daß die PAI immer am Ende des Glutamtat-Razemase Gens inseriert ist,
weist auf ein Rekombinationsereignis als Ursprung hin.
H.pylori Stämme, die die PAI in ihrem Genom enthalten (cagA+/vacA+), werden als
pathogene Typ I Stämme klassifiziert; Stämme, die nicht über diesen Genabschnitt verfügen,
als Typ II Stämme, die als weniger pathogen gelten.
Die genaue Funktion der in der PAI kodierten Gene ist noch Gegenstand der aktuellen
Forschung; Homologievergleiche zu anderen bakteriellen Genen ergaben u.a. eine
Ähnlichkeit des cagE Gens zu dem Toxintransportprotein PtlC von Bordetella pertussis und
dem virulenzassoziierten VirB4 Protein von Agrobacterium tumefaciens auf. Es wird daher
vermutet, die in der cag Region liegenden Gene könnten für einen membrangebundenen
Komplex kodieren, der als Sekretionsapparat fungiert [Censini 1996, Covacci 1997].
1.4.7
Molekularer Mimikry
Als ein weiterer Pathogenitätsfaktor von H.pylori wird ein Autoimmunprozess diskutiert: bei
bis zu 50% der Patienten mit einer chronischen H.pylori Infektion lassen sich Antikörper
gegen Magengewebe nachweisen [Negrini, 1991 & Faller G, 1997].
Da das bakterielle Lipopolysaccharid (LPS) von mehr als 85 % der H.pylori Stämme
Seitenketten besitzt, die mit den Blutgruppenantigenen Lewis x und Lewis y des Menschen
identisch sind [Appelmelk, 1997], wurde eine Kreuzreaktivität zwischen dem H.pylori LPS
und den Lewis x/y Antigenen, die auf dem Magenepithel exprimiert werden, diskutiert. Im
Tierversuch generierten mit H.pylori infizierte Mäuse Antikörper, die mit menschlicher
Magenschleimhaut reagierten [Appelmelk,1996]. Neuere Arbeiten bezweifeln wieder einen
-7-
1. Einleitung
direkt kausalen Zusammenhang zwischen dem Lewis-Polymorphismus und dem Auftreten
antigastraler Antikörper [Faller, 1998].
1.5
H.pylori assoziierte Erkrankungen
Die H.pylori-Infektion kann sich vielfältig präsentieren. Während viele Infizierte
asymptomatisch bleiben oder eine geringgradige Oberflächengastritits entwickeln, bildet sich
bei anderen Individuen eine antrumbetonte Gastritis oder eine Pangastritis aus, kommt es zum
Ulcus duodeni oder seltener Ulcus ventriculi. Auch neoplastische Erkrankungen wie das
MALT-Lymphom und selten das Adenokarzinom des Magens sind mit der H.pylori Infektion
assoziiert. Die Gastritis stellt dabei die Vorstufe für Ulcus ventriculi und duodeni sowie für
die Entwicklung von Neoplasien dar [Blaser 1992]. Die vielfältige Präsentation dieser
Infektion ist zum einen auf die große Variabilität des Erregers zurückzuführen, zum anderen
auf die unterschiedliche Immunsituation und genetische Prädisposition des Infizierten.
Die häufigste Manifestation der H.pylori Infektion ist die chronische Gastritis vom Typ B
(bakteriell-infektiös).
Es
handelt
sich
um
eine
oft
asymptomatisch
verlaufende
Oberflächengastritits, die jedoch in eine chronisch-atrophische Gastritis übergehen kann.
Histologisch ist sie gekennzeichnet durch Infiltration der Magenmukosa mit neutrophilen
Granulozyten, Lymphozyten und Plasmazellen, Erosionen, Ersatz des Oberflächenepithels
durch Regenerationsepithel, intestinale Metaplasie, Depletion der Schleimschicht bis hin zur
Atrophie der Magenmukosa [Leung, 1992]. Die Entzündung ist meist verstärkt im
Antrumbereich; als Erklärung wird angenommen, daß die Parietalzellen des Korpus durch
Säureproduktion die Kolonisation für H.pylori erschweren.
Die Prävalenz einer H.pylori Infektion bei Ulcus duodeni beträgt 95 %, bei Ulcus ventriculi
70%. Das Risiko ein Ulcus duodeni zu entwickeln wird durch Infektion mit H.pylori um das
20-fache gesteigert [Stolte, 1992].
Pathophysiologisch werden zwei Varianten unterschieden : zum einen führt eine Infektion
des Korpusbereiches zu einer Reduktion der Säuresekretion, was einer Ausbreitung der
Infektion auf den ganzen Magen Vorschub leistet. Es kann zu atrophischen Veränderungen
und dem Ulcus ventriculi kommen. Ein Fortbestehen der Atrophie wird als neoplastische
Prädisposition gewertet [Blaser, 1992].
Eine prädominante Infektion des Antrums führt zu einer vermehrten Aktivierung der
Gastrinsekretion mit Gastrinämie und konsekutiv zu einer Hyperchlorhydrie, was wiederum
zum Ulcus duodeni prädisponiert. Für die verstärkte Gastrinsekretion durch H.pylori gibt es
-8-
1. Einleitung
mehrere Theorien : das von H.pylori produzierte Ammonium erhöht den pH Wert und
unterbricht somit die negative Rückkopplung der Säureproduktion auf die Gastrinproduktion
in den G-Zellen des Antrum. Auch bewirkt das von H.pylori produzierte N-α-Methylhistamin
eine ähnlich deutliche Stimulierung der Säurebildung in den Parietalzellen [Beales, 1997].
Desweiteren stimuliert H.pylori in vitro auch die Synthese der Histidin Decarboxylase, die für
die Synthese von Histamin ein Schlüsselenzym darstellt [Wessler, 2000]. Histamin wiederum
stellt einen wichtigen aktivierenden Stimulus für die Magensäureproduktion dar.
1.5.1
MALT Lymphom
Die chronische Infektion mit H.pylori führt durch die Dauerstimulation des lokalen
Immunsystems zur Ausbildung von Mukosa-assoziiertem lymphoidem Gewebe (MALT),
bestehend aus reaktiven T-Zellen, Plasmazellen und anderen B-Zellen – histologisch gleicht
es Lymphfollikeln aus Lymphknoten [Parsonnet, 1994]. Die MALT Lymphome, die man an
der Stelle der H.pylori Infektion, v.a. im Antrum, findet, resultieren aus der klonalen
Expansion von genetisch mutierten B-Zellen [Wotherspoon, 91]. Dabei ist der Übergang von
H.pylori Gastritis mit lymphoiden Infiltraten zum frühen Magen MALT-Lymphom oft
fließend und initial oft schwer zu unterscheiden. Die Eradikation von H.pylori führt zur
Regression niedrigmaligner MALT-Lymphome des Magens [Wotherspoon, 1993 & Stolte,
1992].
1.5.2
Adenocarcinom des Magens
Obwohl die Prävalenz des Magenkarzinoms zurückgeht, ist es weltweit die zweithäufigste
bösartige Neubildung nach dem Lungenkrebs [Neugut, 1996]. Mehrere epidemiologische
Studien zeigten, daß eine chronische Infektion mit H. pylori das Risiko für die Entwicklung
eines Adenokarzinoms des Magens um das 6-fache erhöht [Parsonnet, 1994; Eurogast Study
Group, 1995]. Deshalb klassifizierte die IARC/WHO 1994 H.pylori als Klasse I Karzinogen.
Neuere Untersuchungen am Tiermodell ergaben, daß die chronische Infektion mit H.pylori
neoplastische Veränderungen im Pylorusbereich induzieren kann. Nach 62 Wochen H.pylori
Infektion entwickelten 10 von 27 (= 37%) mongolischen Meerschweinchen ein
Adenocarcinom des Magens, wohingegen keines der Kontrolltiere (n=30) ein Malignom
aufwies [Watanabe, 1998; Honda, 1998; Sawada 1998]. Die pathologischen Veränderungen
-9-
1. Einleitung
schritten von einer regenerativen Hyperplasie der Magenschleimhaut (nach 6 Wochen) über
die Entstehung einer intestinalen Metaplasie (nach 26 Wochen) und von hyperplastischen
Polypen (nach 52 Wochen), bis hin zum Auftreten eines Adenokarzinoms (nach 62 Wochen)
bei einem Drittel der Tiere [Watanabe, 1998]. Alle diese Veränderungen werden auch bei der
H.pylori Infektion des Menschen beobachtet [Leung, 1992]. Der molekulare Mechanismus
jedoch, der zur malignen Transformation durch H.pylori führt, ist noch nicht aufgeklärt.
Einige Studien zeigten eine erhöhte Zellproliferation in Magenbiopsien von Patienten mit
H.pylori Infektion verglichen mit Patienten ohne Infektion [Peek, 1997; Fraser, 1994; Bechi,
1996; Lynch, 1995; Harvard, 1996]. Für die Erhaltung der Gewebeintegrität ist bei einer
erhöhten Zellproduktion auch ein erhöhter Zellabgang notwendig [Hall, 1994]. Studien, die
sich mit der Apoptose bei H.pylori Infektion beschäftigten, fielen unterschiedlich aus : einige
Forschergruppen berichten über eine erhöhte Apoptoserate der Magenmukosa bei Infektion
mit cagA+ H.pylori [Moss, 2001; Yamaguchi, 2000; Jang, 2000], und spekulieren, daß die
erhöhte Zellproliferation der Magenschleimhaut als Antwort auf die gesteigerte Apoptoserate
zu verstehen ist. Andere Untersuchungen erbrachten eine gesteigerte Proliferation mit
abgeschwächter Apoptoserate des Magenepithels bei Infektion mit cagA+ H.pylori Stämmen
[Peek, 1997, Rokkas, 1999]. Eine erhöhte Proliferationsrate mit einer erniedrigten
Apoptoserate könnte zu unkontrolliertem Zellwachstum führen [Peek 1997]. Einigkeit
herrscht darüber, daß cagA+ H.pylori in vitro bei der Kokultivation mit AGS Zellen in diesen
Apoptose induziert [Wagner, 1997; Rudi, 1998; Peek, 1999]. Erhöhter Zellumsatz und
chronische Schädigung des Magenepithels sowie die Entwicklung einer atrophischen Gastritis
werden als Ursachen für die maligne Transformation diskutiert.
1.6
1.6.1
Reaktionen des Magenepithels auf die H.pylori Infektion
Interleukin 8 in der H.pylori Infektion
Die durch H.pylori verursachte chronische Gastritis vom Typ B ist gekennzeichnet durch
Infiltration
der
Magenmukosa
mit
neutrophilen
Granulozyten,
Lymphozyten
und
Plasmazellen. Diese Histologie und das Vorhandensein von sowohl akuten wie chronischen
entzündlichen Komponenten legt die Präsenz eines löslichen Mediators nahe, der diese Zellen
anlocken kann. Das CXC-Chemokin Interleukin 8 ist ein starker chemotaktischer Faktor und
Aktivator von neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten. Gastrointestinales Epithel
sekretiert
IL-8
bei
Kontakt
mit
pathogenen
Bakterien
[Eckmann,
1993].
Die
- 10 -
1. Einleitung
Magenschleimhaut zeigt bei H.pylori Infektion eine verstärkte Interleukin 8 Expression
[Gionchetti, 1994; Crabtree, 1995b]. Die Kokultivation von AGS Zellen mit cagA+ Stämmen,
nicht aber cagA- führten zu einer Sekretion des Chemokins Interleukin 8 [Crabtree, 94;
Shamra 95], wobei cagA deletierte Mutanten nach wie vor IL-8 Sekretion induzieren können
[Crabtree 95; Shamra 95], cagA also nur ein Marker für diese Fähigkeit und nicht Verursacher
hierfür ist. Ein Modell für die durch H.pylori verursachte Gastritis ist also, daß das Bakterium
die Sekretion von IL-8 aus der Magenmukosa bewirkt, was zur Infiltration der
Magenschleimhaut mit Entzündungszellen führt.
Wie kommt es nun zu der Interleukin 8 Induktion ? Der humane IL-8 Promoter enthält
Bindungsstellen für NF-κB (-80 bis –70), NF-IL6 (-94 bis –81), sowie für AP-1 (-126 bis –
120) (Abb. 1).
Abb 1: Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren
im humanen IL-8 Promoter (aus Peek, 2001)
Reportergenversuche mit dem humanen IL-8 Promoter, in den die jeweiligen Bindungsstellen
für NF-κB, NF-IL6 und AP-1 mutiert wurden, ergaben folgendes : NF-κB ist unabdingbar für
die Sekretion von IL-8, die Mutierung der AP-1 Bindungsstelle führt zu einer Reduktion der
Reporteraktivität auf 30%, wohingegen NF-IL6 keinen wesentlichen Beitrag zur Aktivierung
des IL-8 Promoters durch H. pylori zu leisten scheint [Aihara, 1997]. A. Münzenmaier konnte
1997 zeigen, daß die Kokultivation von AGS Zellen mit cagA+ H.pylori Stämmen, nicht aber
mit cagA- zur Aktivierung von NF-κB führt, und dieses mit der Sekretion von IL-8 korreliert.
Dabei sind die meisten Gene der Pathogenitätsinsel notwendig für die NF-κB Induktion, nicht
jedoch cagA, cagF und cagN [Glocker, 1999].
Desweiteren führt die Stimulation von AGS-Zellen mit cagA+ H.pylori Stämmen zu
Neuordnung des Zytoskeletts sowie Phosphorelierung eines 145kDa Protein an einer TyrosinSeitenkette [Segal, 1997], welches später als von H.pylori in die Wirtszelle transloziertes
cagA identifiziert wurde [Odenbreit, 2000; Stein, 2000].
1.7
Der Transkriptionsfaktor AP-1
Der Transkriptionsfaktor AP-1 besitzt eine Schlüsselstelle in der Regulierung von
Zellproliferation und maligner Transformation, sowie in der Zelldifferenzierung [Karin,
- 11 -
1. Einleitung
1995]. Zuerst wurde er als Transkriptionsfaktor beschrieben, der an ein essentielles cisElement des humanen Metallotheonin IIA Promoters bindet [Lee, 1987a]. Kurze Zeit später
wurde AP-1 auch als Transkriptionsfaktor für die Tetra Phorbol Acetat (TPA) - induzierte
Expression von etlichen zellulären und viralen Genen beschrieben, so z.B. humane
Kollagenase, Stremolysin, Interleukin 2, oder das virale SV40 Protein [Angel, 1989]. TPA ist
ein hoch potenter Tumorpromoter und aktiviert die Proteinkinase C [Nishizuka, 1984]. Dabei
bindet AP-1 an die palindromische DNA-Sequenz 5‘-TGA G/C TCA-3‘, die auch TPA
Responsive Element (TRE) genannt wird [Angel 1989; Lee, 1987b]. Weitere Aktivatoren des
AP-1 Transkriptionsfaktors sind neben TPA u.a. Wachstumsfaktoren, T-Zell-Aktivatoren,
Neurotransmitter und UV-Bestrahlung [Angel, 1991].
1.7.1
Die Komponenten des AP-1 Transkriptionsfaktors
AP-1 besteht aus Homo- oder Heterodimeren der Onkogenfamilien Jun (c-Jun, JunB, JunD),
Fos (c-Fos, FosB, Fra1, Fra2) und ATF (ATF2, ATF3/LRF1, B-ATF), die alle der bZIP (basic
region leucine zipper) Familie von DNA-bindenden Proteinen angehören [zur Übersicht:
Angel, 1991; Karin, 1995; Karin 1997]. Jun Proteine bilden sehr stabile Heterodimere mit
Proteinen aus der Fos- und ATF-Familie, können aber auch Jun-Jun Homodimere bilden.
Dabei binden Jun-Fos und Jun-Jun Komplexe präferentiell an das TPA-Responsive Element,
während Jun-ATF und ATF-Homodimere eine hohe Affinität zu dem cAMP Responsive
Element (CRE) haben. Die Klasse der bZIP Proteine, die mit Jun und Fos Proteinen
Heterodimere bilden kann, wächst laufend – so kamen u.a. die Maf-Familie und das Neural
Retina Specific Gene Product Nrl neu zu der Klasse der möglichen Dimerisierungspartner von
Jun und Fos hinzu [Karin, 1997]. Dabei interagieren die Leucin Zipper Regionen, die meist Cterminal lokalisiert sind, durch hydrophobische Wechselwirkung und führen zur
Dimerisierung, wohingegen die N-terminale Region für die sequenz-spezifische DNABindung verantwortlich ist [Glover, 1995]. Die DNA-bindenden Regionen weisen dabei eine
hohe Homologie zu dem Hefe-Transkriptionsfaktor GCN-4 [Angel, 1991] auf.
1.7.2
Transkriptionelle Aktivität
Die transkriptionelle Aktivität von AP-1 in ruhenden Zellen ist gering, meist liegen Jun-Jun
Homodimere mit einer schwachen Transaktivierungspotenz vor. Im Gegensatz zu den
Transkriptionsfaktoren NF-κB und den Glucocorticoid Rezeptoren ist aber meist eine basale
- 12 -
1. Einleitung
Transaktivierung vorhanden; es reguliert also sowohl basale wie induzierbare Transkription.
Insbesondere proliferierende Zellinien, die in serumhaltigem Medium gehalten werden,
weisen eine deutliche basale AP-1 Aktivität auf. Die meisten Gene, die für AP-1
Komponenten kodieren, verhalten sich wie „immediate early genes“, d.h. Gene, deren
Transkription
nach
Stimulation
schnell
aktiviert
wird,
unabhängig
von
de-novo
Proteinsynthese [Karin, 1995]. AP-1 Aktivität wird sowohl transkriptionell als auch
posttranskriptionell reguliert.
1.8
Die MAP Kinase Kaskaden
Eine wesentliche Rolle spielen dabei die sogenannten Mitogen Activated Protein (MAP)
Kinase Kaskaden. Diese Signaltransduktionswege bestehen aus drei sequentiell agierenden
Proteinkinasen : eine MAP Kinase Kinase Kinase (MAPKKK) phosphoreliert und aktiviert
eine MAP Kinase Kinase (MAPKK), die wiederum ihrerseits eine MAP Kinase (MAPK)
phosphoreliert und damit aktiviert. Die aktivierte MAP Kinase aktiviert andere Effektor
Proteinkinasen, MAPK-activated protein kinases (MAPKAPK), oder transloziert in den
Zellkern, um dort Transkriptionsfaktoren zu phosphorelieren und damit die Transkription
eines Gens zu induzieren. Dieses Prinzip einer dreistufigen Proteinkinase Kaskade ist in der
Evolution stark konserviert. Vieles über die Regulation von MAPK Kaskaden wurde an den
homologen Enzymen der Hefe entdeckt : So aktiviert in der Hefe ein Phermon über die
Bindung an seinen Rezeptor ein membranständiges G-Protein und induziert damit die
Anlagerung des G-Protein bindenden Proteins STE20. Das aktivierte STE 20 bindet dann die
MAPKKK STE11 (entspricht in humanen Zellen c-Raf), wodurch STE11 in Membrannähe
lokalisiert und durch membranständige Kinasen aktiviert wird. Die Serin/Threonin Kinase
STE11 ihrerseits aktiviert die Threonin/Tyrosin MAPK Kinase STE7 (entspricht in humanen
Zellen MEK1/2), die wiederum durch Phosphorelierung des Thr-X-Tyr Motiv die MAPK
KSS/Fus3 (entspricht in humanen Zellen ERK1/2) aktiviert. Diese aktivierte Kinase
transloziert in den Zellkern und reguliert durch Phosphorelierung die Aktivität von
Transkriptionsfaktoren und somit die Genexpression, was schließlich zur Zellteilung oder
Differenzierung der Hefezellen führt.
- 13 -
Abb. 2 :
1. Einleitung
Übersicht über MAPK in der Hefe (aus Minden,
1997)
Säugetiere exprimieren mindestens vier verschiedene MAPK-Kaskaden, wobei die ERK1/2Signalkaskade, die JNK/SAPK-Kaskade und die p38 Kaskade besser untersucht sind,
wohingegen über die Regulation und physiologische Bedeutung der ERK5-Signalkaskade
noch nicht viel bekannt ist.
Die einzelnen Signalkaskaden weisen dabei eine gewisse Beeinflussung untereinander, den
sogenannten „Cross-Talk“, auf. So aktiviert z.B. die MAPKK MKK4 sowohl JNK als auch
p38. Verschiedene Mechanismen gewährleisten die Spezifität der einzelnen Kaskaden. Zum
einen wurden „Gerüst“-Proteine JIP1 und MP1 entdeckt, die beteiligte Proteinkinasen –
JNK1/2 / MKK7 / MLK1 bzw. ERK1/2 / MEK-1 / c-Raf1 - in räumliche Nähe bringen.
Desweiteren besitzen die Kinasen spezifische Bindungsdomänen, so daß sie jeweils mit den
passenden Upstream- oder Downstream- Kinasen interagieren. Darüberhinaus besitzen die
Kinasen Substratspezifität : so phosphoreliert MEK1/2 spezifisch das TEY Motiv von
ERK1/2, während MKK4 bzw. MKK3/6 spezifisch für die Motive TPY von JNK bzw. TGY
von p38 sind.
- 14 -
Abb.3 :
1.8.1
1. Einleitung
Übersicht der verschiedenen MAPK Kaskaden des Menschen (aus Whitmarsh, 1996)
Allgemeine Wirkung von MAPK Kaskaden
Die drei MAP Kinasen ERK, JNK und p38 können ETS Transkriptionsfaktoren
phosphorelieren, so insbesondere Elk-1 [Zink, 1995; Rinegaud, 1996], der an die SRE
Bindungsstelle im c-fos Promoter bindet, und so die c-fos Expression reguliert [Hipskind,
1991].
1.8.2
ERK-Signalkaskade
Die ERK-Signalkaskade wird am stärksten durch Mitogene stimuliert. Als Paradebeispiel
dient der Epidermal Growth Factor (EGF), der an seinen Rezeptor EGF-R bindet und somit
die Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) von EGF-R aktiviert. Die Autophosphorelierung des
Rezeptors bewirkt das Anlagern der Adapter Proteine Grb2 und Sos; letzteres wiederum
katalysiert den Austausch von GDP zu GTP an dem kleinen GTP bindenden Protein ras.
Anschließend
erfolgt
die
Aktivierung
der
ras
/
c-Raf
/
MEK1/2
/
ERK1/2
- 15 -
1. Einleitung
Signaltransduktionswege analog zur Aktivierung in der Hefe (s.o.). Ein weiterer Induktor der
ERK-Signalkaskade ist Tetraphorbolacetat (TPA), das als Diacylglycerol (DAG) Analogon
Proteinkinase C aktiviert, die wiederum über ras-abhängige Signalwege die ERK-Kaskade
anschaltet.
1.8.2.1 Zellproliferation
Mitogene bewirken die Zellteilung, und so ist eine Hauptaufgabe von ERK die Regulierung
der Zellproliferation. Zum einen stimuliert ERK die DNA Synthese durch Phosphorelierung
der Carbamyl Phosphatase Synthetase II, ein Schlüsselenzym in der Pyrimidin Synthese
[Graves, 2000]. Indirekt stimuliert ERK die Zellproliferation über den Transkriptionsfaktor
AP-1, der zu einer Cyclin D1 Induktion führt [Lavoie, 1996]. Treinieset et al. berichten, daß
dies allein für die Induktion von DNA-Synthese nicht hinreichend ist, sondern zusätzlich der
Aktivierung von Phosphatidyl-3-OH Kinase bedarf, die wiederum autokrin durch AP-1
induzierte Wachstumsfaktoren aktiviert werden kann [Treinies, 1999]. Ein weiteres Ziel von
ERK ist die pp90 Ribosomal S6 Kinase (RSK), die durch Inaktivierung von MYT1, einer
zellzyklusinhibitorischen Kinase, die Zellteilung fördert [Palmer, 1998].
1.8.2.2 Weitere Effekte der ERK-Kaskade
Während eine transiente Aktivierung von ERK in PC12 Zellen zur Zellproliferation führt,
bewirkt eine anhaltende Aktivierung der ERK-Kaskade mit Akkumulation von aktivierten
ERK im Zellkern eine Differenzierung dieser Zellen [Marshall, 1995]. Auch scheint ERK an
der Regulierung der Eicosanoide beteiligt zu sein, da es zytosolische Phospholipase A2
aktivieren kann und so zur Freisetzung von Arachnoidonsäure beiträgt [Lin, 1993].
1.8.3
JNK-Signalkaskade
Jun N-Terminal Kinase (JNK) wurde als Kinase kloniert, die den Transkriptionsfaktor Jun NTerminal an den Seitenketten Ser-63 und Ser-73 phosphoreliert und damit seine
transkriptionelle Aktivität entscheidend erhöht [Hibi, 1993]. Der JNK Signaltransduktionsweg
wird v.a. durch zellulären Streß aktiviert, so z.B. UV-Bestrahlung, Hitzeschock und die
proinflammatorischen Zytokine IL-1 und TNF-α [Karin, 1995; Minden 1997]. Desweiteren
- 16 -
1. Einleitung
kann JNK auch durch die Wachstumsfaktoren EGF und NGF aktiviert werden; aktiviertes ras
potenziert die UV-induzierte JNK-Aktivierung. Der Signalweg wird über Rac und Cdc42
vermittelt, zwei Mitglieder der Rho-Familie, die zu den kleinen GTP-bindenden Proteinen
gehört. Aktiviertes Cdc42 bindet an PAK65 und aktiviert diese damit. PAK65 wiederum
vermag die MAPKKK MEKK-1 zu stimulieren. Es folgt die bekannte dreistufige MAPKKaskade MEKK1 - JNKK/MKK4 – JNK. Neben Jun phosphoreliert JNK auch die
Transkriptionsfaktoren Elk-1 und ATF-2 [Zinck, 1995].
1.8.4
MAPK und Apoptose
Als Faustregel gilt, daß ERK mit Zellüberleben assoziiert ist, während JNK und p38 eher zur
Induktion der Apoptose führen [Xia, 1995]. Natürlich gibt es hierzu Ausnahmen, und die
tatsächliche Rolle der verschiedenen MAPK in vivo bezüglich Zellüberleben ist stark
zelltypspezifisch. Längere JNK-Aktivierung führt insbesondere in bestimmten neuronalen
Zellen zu Apoptose [Xia, 1995]. Auch ist JNK notwendig für die UV-induzierte Apoptose in
Fibroblasten [Tournier, 2000].
1.9
1.9.1
Regulation von c-fos und c-jun
Induktion der c-fos Expression
Der c-fos Promoter besitzt drei Hauptbindungsstellen für Transkriptionsfaktoren : das SerumResponse Element (SRE), das cAMP-Response Element (CRE) und das sis-induzierbare
Element (SIE) (Abb.4) [Whitmarsh, 1996]. Hier soll nur auf das SRE Element eingegangen
werden, das im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht wurde.
Das SRE Element bindet den dimeren Serum Response Factor sowie einen Ternary Complex
Factor (TCF). TCF gehören zu der Familie von DNA-bindenden Proteinen mit einer ETSDomäne, wie z.B. Elk-1 und SAP1. Wie weiter oben erwähnt, kann Elk-1 von allen drei MAP
Kinasen phosphoreliert und damit aktiviert werden.
- 17 -
Abb. 4 :
1.9.2
1. Einleitung
Regulation des c-fos und c-jun Promoters durch MAPK (aus Minden, 1997)
Regulation von c-Jun
Der Transkriptionsfaktor Jun wird sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell
reguliert. Der Promoter von c-Jun enthält zwei TPA-Responsive Elemente (TRE), an die
bevorzugt c-Jun/c-Fos oder c-Jun/ATF-2 Heterodimere und c-Jun/c-Jun Homodimere binden
(Abb.4). In ruhenden Zellen liegen einige Jun-Jun Homodimere mit schwacher
transkriptioneller Aktivität an dem TRE. Neu gebildetes c-Fos bildet mit dem in ruhenden
Zellen präexistierenden c-Jun c-Fos/c-Jun Heterodimere mit einer deutlich erhöhten
Transaktivierungspotenz. Durch positive Rückkopplung an das TRE des c-jun Promoters führt
dies zu einer verstärkten c-Jun Expression.
Posttranskriptionell wird c-Jun an den Seitenketten Ser-63 und Ser-73 von JNK
phosphoreliert und so seine transkriptionelle Aktivität entscheidend angehoben [Hibi, 1993;
Dérijard, 1994].
1.9.3
Bedeutung von c-Fos und c-Jun in der Onkogenese
Unkontrollierte Expression von c-Fos und c-Jun kann zur neoplastischen Transformation
führen [Curran, 1984; Miller 1984]. Die viralen Äquivalente v-Fos und v-Jun werden durch
- 18 -
1. Einleitung
die murinen FBJ und FBR Viren transduziert, die ein Osteosarkom induzieren können
[Curran, 1982a&b]. Transgene Mäuse, die c-Fos überexprimieren, entwickeln Osteo- und
Chondrosarkome. Saez konnte zeigen, daß c-Fos notwendig für die maligne Progression von
Hauttumoren ist. Die Behandlung von kultivierten Fibroblasten mit c-fos antisense RNA oder
die Injektion von Antikörpern gegen c-Fos stoppte das Zellwachstum [Raibowol, 1988; Holt,
1986]. Fibroblasten, die von c-jun -/- Knockout Mäusen gewonnen wurden, wiesen Störungen
in der Proliferation auf [Johnson, 1993], was eine Beteiligung von c-Jun an der
Zellproliferation in vivo nahe legt.
1.10 Zielsetzung der Arbeit
Da AP-1 eine solche Schlüsselposition in der Regulation der Zellproliferation besitzt, und die
Infektion mit H.pylori Hyperproliferation der Magenschleimhaut induziert (s. oben), sowie
manchmal zum Magenadenokarzinom führt, sollte in dieser Arbeit die Beteiligung des
Transkriptionsfaktors AP-1 bei der H.pylori Infektion in einem in vitro System mit der
Magenepithelzellinie AGS untersucht werden. Desweiteren sollte geklärt werden, ob H.pylori
AP-1 aktivieren kann, und so synergistisch mit der Induktion von NF-?B die Interleukin-8
Expression induzieren kann. Zuerst wurde ein DNA-Bindungsassay für AP-1 in Form eines
Gelretardierungsassays etabliert. Daraufhin sollten die Signalwege, insbesondere die MAP
Kinase Kaskaden, durch die H.pylori AP-1 aktiviert, näher betrachtet werden. Hierzu wurden
mehrere Ansätze gewählt, so u.a. der Einsatz von spezifischen Inhibitoren, in vitro
Kinaseassays und Westernblots. Da die Schwere der H.pylori Infektion und das Risiko
Magenkrebs zu entwickeln von dem einzelnen Erregerstamm abhängt und mit dem
Vorhandensein der Pathogenitätsinsel cag korreliert, sollte die Abhängigkeit der AP-1
Induktion von der Präsenz der einzelnen Gene der Pathogenitätsinsel näher untersucht
werden.
Auch
sollte
die
transkriptionelle
Aktivität
der
induzierten
AP-1
Komplexe
im
Reportergenassay gemessen werden.
Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Suche nach weiteren durch H.pylori
aktivierten Zielgenen neben IL-8, die durch die Aktivierung der MAPK Kaskaden und die
Induktion von AP-1 beeinflußt werden. Hierbei wurden das den Zellzyklus regulierende Gen
Cyclin D1, sowie das in der Heilung der Ulcera wichtige Angiogenese Gen VEGF näher
betrachtet.
- 19 -
2. Material
2 Material
2.1
Geräte
1.5 ml Reaktionsgefäße
Eppendorf, Hamburg
Falcon 15ml Reaktionsgefäß
Becton Dickinson / UK
Falcon 50ml Reaktionsgefäß
Becton Dickinson / UK
Filme, X-OMAT
TM
AR. # 853 2665
Kodak, Rochester/ USA
Filmentwicklermaschine, Curix 60
Agfa-Geveart, Leverkusen
Geiger-Zählrohr
WellhöferDosimetrie, Schwarzenbruck
Gelkammern
Thoma, Freiburg
Geltrockner
Bio-Rad, München
Hybond-N Nylon-Membran
Amersham Life Science
Immobilon-P Transfer-Membran
Millipore, Bedford/Massachusetts
Laminar Flow Sterilbank
Heraeus, Stuttgart
Magnetrührer
IKA-Labortechnik, Staufen
Millex GP 0,22 µm Filter Unit #P25390
Millipore, Bedford, MA
Microbank Container
ProLab Diagnostik, Augsburg
Mikroskop
Hund, Wetzlar
Mikrospin G-25, #27-5325-01
Amersham Pharmacia Biotech
Mikrospin G-200, #27-5120-01
Amersham Pharmacia Biotech
Photometer
Pharmacia, Freiburg
Power-supply
Roth, Karlsruhe
Pipettenspitzen
Roth, Karlsruhe
Qiagen Plasmid Maxi Kit, #12162
Qiagen, Hilden
Rotator Wheels
PSI (pool of scientific instruments),
Laudenbach
Semi-dry-Elektroblotter
Owl scientific Inc. Woburn, USA
Spektrophotometer
Beckmann, Palo Alto, USA
DU 640
Thermomixer
Eppendorf, Hamburg
Waagen
Mettler-Toledo, Gießen
Whatman 3 mm Papier
Schneider&Düll, Dassel
Vortexer
Bender&Hobein, Zürich/ Schweiz
- 20 Zellinkubator
Zentrifugen
2.2
Heraeus, Stuttgart
Biofuge fresco
Heraeus, Stuttgart
Biofuge 13
Heraeus, Stuttgart
Megafuge 1.0
Heraeus, Stuttgart
Beckmann J2-21
Beckmann, Palo Alto / USA
Chemikalien
Aprotinin
Sigma, Deisenhofen
Acrylamid-Lösung, 30% (w/v)
Roth, Karlsruhe
Polyacrylamid; 0,8% (w/v) Bisacrylamid
Roth, Karlsruhe
Ammoniumperoxodisulfat (APS),
Merk, Darmstadt
# 529K791001
[γ-32P]-ATP, 3000Ci/mmol
Amersham Pharmacia Biotech
Bactor Dextrose
Bactor Peptamin
Bactor Trypton
Bactor Yeast Extrakt
Betamerkaptoethanol
Difco
Difco
Difco
Difco
Roth, Karlsruhe
Borsäure
Roth, Karlsruhe
Bradford Protein Assay, # 500-0006
Bio-Rad, München
Bromphenolblau
Roth, Karlsruhe
Bovines Serum Albumin
Sigma, Deisenhofen
CL4B-Sepharose, # 17-0780-01
Amersham Parmacia Biotech
Color Marker – Wide Range, (C3437)
Sigma, Deisenhofen
Dextran T500
Roth, Karlsruhe
DMSO
Roth, Karlsruhe
DTT (1,4-Dithiothreitol), #6908.2
Roth, Karlsruhe
ECL-Detektion Pack
Amersham Pharmacia Biotech
EDTA
Merck, Darmstadt
EGTA
Roth, Karlsruhe
Ethanol
Roth, Karlsruhe
ExpressHyb Hybridization Solution, #8015
Clontech, Heidelberg
Ficoll, 17-1440-03
Amersham Pharmacia Biotech
Fleischextrakt
Merck, Darmstadt
Glycerol
Roth, Karlsruhe
2. Material
- 21 HCl
Merck, Darmstadt
Hefeextrakt
Heparin-Na, Braun multi, 10 000I.E/ml
Difco
Braun Melsungen AG, Melsungen
HEPES
Roth, Karlsruhe
I-Block, # AI 300
Tropix, Bedford/Massachusetts
Isopropanol
Roth, Karlsruhe
L-Cyteiniumchloridmonohydrat
Merck
Leupeptin L-2023
Sigma, Deisenhofen
Methanol
Roth, Karlsruhe
MOPS
Sigma, Deisenhofen
MgCl2
Roth, Karlsruhe
NaCl
Roth, Karlsruhe
NaF
Sigma, Deisenhofen
Na-Desoxycholat
Roth, Karlsruhe
Na3VO4
Sigma, Deisenhofen
NP-40
Sigma, Deisenhofen
PBS
Sigma, Deisenhofen
Pepstatin A P-5318
Sigma, Deisenhofen
Peptone tryptisch aus Casein
Merck
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid),
Sigma, Deisenhofen
#P-7626
Prime It II Random Labeling Kit, #300385
Stratagene, Heidelberg
Skim Milk Powder, #70166
Fluka BioChemika
TEMED, T´,T´,T´,T-Tetramethylendiamin
Sigma, Deisenhofen
# T-8133
T4-PNK, # M0201S
New England Biolabs, Frankfurt
TWEEN 20
Roth, Karlsruhe
2.3
Zellkulturmaterial
BSA, Bovine Serum Albumin Fraction
Sigma, Deisenhofen
V 96%, # A-9647
DMEM,Dulbecco´s Modifiziertes Eagle
Medium, # 41966-029, Lot # 3056458
Gibco BRL, Karlsruhe
2. Material
- 22 Fötales Kälberserum (FCS), # F-7524;
2. Material
Sigma, Deisenhofen
Lot # 64H3386
L-Glutaminsäure, #11048-048
Gibco BRL, Karlsruhe
HAM’s F-12 Medium, #12-615
BioWhittaker, Verviers/Belgien
Lot #OMB0155
Penicillin/ Streptomyzin
Sigma, Deisenhofen
RPMI 1640 ohne Glu, # 31870-025,
Gibco BRL, Karlsruhe
Lot # 3056474
Trypsin/ EDTA
Gibco BRL, Karlsruhe
Zellkulturschalen
Becton Dickinson / UK
2.4
Synthetische Oligonukleotide
AP-1 Consesus Oligonucleotide, #E3201,
Promega, Mannheim
Lot # 81221
NF-κB Oligonucleotide, #E3291, Lot# 80223 Promega, Mannheim
Sequenzen :
AP-1 :
5‘ - CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA – 3‘
NF-κB :
5‘ – AGT TGA GGG GAC TTTCCC AGG C – 3‘
Poly (d(i-c)) stammte von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim (1219847) verwendet in
folgender Konzentration: 50 A 260 Units in 2,5 ml ddH2O aufgelöst.
2.5
Plasmide
Mercury Pathway Profiling System, #K2049-1 Clontech, Heidelberg
2.6
Zellinien
AGS :
Zellinie aus einem Resektat von einem Adenokarzinom des Magens, Patient
hat keine vorherige Chemotherapie erhalten; ATCC #CRL 1739
- 23 KATO III :
Zellinie von einem Magenkarzinom im metastitierten Zustand; ATCC #HTB103
NIH 3T3 :
2.7
murine, embryonal Fibroblasten ; ATCC #CRL-1658
Zelltransfektion
DOTAP Tranfection Agent, #1811177
Boehringer Mannheim
FuGENE 6 Transfection Reagent, #1814443
Boehringer Mannheim
Superfect Transfection Agent, #301305
Qiagen, Hilden
2.8
Zytokine & Inhibitoren
PD 98059, #513000
Calbiochem, Bad Soden
U 0126, #V1121, Lot # 95665
Promega, Mannheim
TNF- α
TPA
2.9
2. Material
Antikörper
c-Fos, rabbit polyclonal #052x
Santa Cruz Biotechnology
c-Fos all, rabbit polyclonal #253x
Santa Cruz Biotechnology
Fra-1, rabbit polyclonal #048x
Santa Cruz Biotechnology
Fra-2, rabbit polyclonal #171x
Santa Cruz Biotechnology
c-Jun, rabbit polyclonal #1694x
Santa Cruz Biotechnology
c-Jun all, rabbit polyclonal #044x
Santa Cruz Biotechnology
Jun B, rabbit polyclonal #073x
Santa Cruz Biotechnology
Jun D, rabbit polyclonal #074x
Santa Cruz Biotechnology
JNK1, rabbit poyclonal #571x
Santa Cruz Biotechnology
ERK 1/2, rabbit poyclonal #V1141
Promega, Mannheim
Active MAPK, rabbit poyclonal #V8031
Promega, Mannheim
Active JNK, rabbit poyclonal #V7931
Promega, Mannheim
Cyclin D1, mouse IgG2a #66271A
PharMingen, Hamburg
PhosphoPlus c-Jun (Ser63), c-Jun (Ser 73)
New England Biolabs, Schwalbach
- 24 Antibody Kit , #9260
MEK 1/2 Kinase Assay Kit, #9830
New England Biolabs, Schwalbach
p44/42 MAP Kinase Assay Kit, #9800
New England Biolabs, Schwalbach
Anti-mouse-Antibody, # NA 931
Amersham Pharmacia Biotech
Anti-rabbit-Antibody, # NA 934
Amersham Pharmacia Biotech
2. Material
- 25 -
3. Methoden
3 Methoden
3.1
Prokaryontische Zellkultur
Die Kultivierung sowie Spezifikation von Helicobacter pylori wurde an Sterilbänken bei
Laminarfluß und in Inkubationsschränken unter S2 Sicherheitsbedingungen durchgeführt.
Alle verwendeten Arbeitsmaterialien, Medien und Puffer waren autoklaviert oder steril
filtriert.
Folgende H.pylori Stämme wurden untersucht :
Stamm
Herkunft
Referenz
G27 & Mutanten
klinisches Isolat
Censini et al ,96
NTCT
Referenzstämme
Warren et al., 83
11638,
ATCC 43405
klinische
Isolate von einer
aktiven chron. Gastritis
151, 2012
klinisches Isolat
Apel et al., 82; Odenbreit et al., 96
69A, 2074
klinisches Isolat
Labor Kist, Freiburg
Tabelle 2 : Quellennachweis der H.pylori Stämme
3.1.1
Kultivierung von H.pylori
3.1.1.1 Anzucht auf Nährböden
Die Kultivierung auf Nährplatten, insbesondere zur Überprüfung auf Kontaminationen,
geschah auf HCB-Platten. Hierfür wurde mit einer ausgeglühten Impföse etwas Material von
tiefgefrorenen Bakterien, Flüssigkultur oder von einer anderen Agarplatte abgenommen und
auf der HCB-Platte im Dreiösenausstrich verteilt. Die Inkubation der HCB-Platten erfolgte in
speziellen Anaerobiertöpfen unter mikroaerophilen Bedingungen (5% O2, 10% CO2 und 85%
N2) bei 37°C und einem Unterdruck von 100 mbar. Erste Kolonien wuchsen innerhalb von 23 Tagen.
HCB-Platte :
10,0 g Peptone tryptisch aus Casein (Merck)
- 26 5,0 g
2,0 g
5,0 g
0,3 g
18,0 g
2,0 g
0,5 ml
10 ml
ad 1 l
3. Methoden
NaCl (Roth)
Fleischextrakt (Merck)
Hefeextrakt (Difco)
L-Cysteiniumchloridmonohydrat (Merck)
Bactor Agar (Difco)
Glukose
Vitamin K3
Hämin
ddH2O pH7,4
3.1.1.2 Anzucht in Flüssigmedium
Die Kultivierung von H.pylori in Flüssigmedium bietet einige Vorteile:
(1)
Die Kultivierungszeiten, bis die Bakteriensuspension gerade eben dicht zu werden
beginnt – dann weisen die Bakterien die höchste Motilität auf und eignen sich für
Stimulationsversuche am besten – ist bei Verwendung von Vorkulturen relativ gut
vorhersagbar. So gewonnene Bakterienkulturen weisen hohe Motilität auf und eignen
sich am besten für Stimulationsexperimente.
(2)
Gegenüber der Kultivierung auf Nährböden können leichter größere Mengen
Bakterien produziert werden.
Erkauft werden diese Vorteile durch eine höhere Anfälligkeit für Kontaminationen; diese
werden insbesondere nicht so leicht entdeckt wie bei der Anzucht auf Nährböden. Insofern
muß sehr genau auf steriles Arbeiten geachtet werden, und begleitend Kontrollen
(Mikroskopie und Kontrollkulturen auf Nährplatten) durchgeführt werden.
Für eine Vorkultur wurde 15ml Brucella Medium in eine 75ml-Kulturflasche mit
Belüftungskappe und integriertem Sterilfilter gegeben und mit der ausgeglühten Impföse die
Bakterien inokuliert. Um eine Kontamination der Belüftungskappe zu vermeiden, wurden die
Kulturflaschen in Schräglage in einen Anaerobiertopf gelegt und unter mikroaerophilen
Bedingungen bei 37°C auf einem Schüttler (100 U/min) für 1-2 Tage inkubiert. Die dichte
Kultur wurde unter dem Phasenkontrastmikroskop kontrolliert. Sofern hierbei eine frische
Kultur
herauskam
(Bakterien
beweglich,
wenig
Kokken),
wurden
100-150µl
Bakteriensuspension in eine neue Kulturflasche mit 15ml Brucellamedium gegeben und unter
denselben Bedingungen (s.o.) für 14-16 Stunden kultiviert.
- 27 Brucella Medium :
10 g
10 g
10 g
1g
5g
0,1 g
ad 1l
3. Methoden
Bactor Dextrose (Difco)
Bactor Trypton (Difco)
Bactor Peptamin (Difco)
Bactor Yeast Extrakt (Difco)
NaCl (Roth)
Natriumbisulfat (Roth)
ddH2O
Das Medium wurde autoklaviert und mit sterilfiltriertem, 10% fetalem Kälberserum (FCS)
supplementiert. Das Serum mußte vor Gebrauch 30 min auf 56°C erwärmt werden, um
Komponenten des Komplementsystems zu inaktivieren, und wurde anschließend durch einen
Millex-GP 0,22 µm Filter (Millipore) sterilfiltriert.
3.1.1.3 Langzeitkonservierung
Die Langzeitkultivierung erfolgte mittels Kryokonservierungsröhrchen namens Mikrobank
der Firma Prolab Diagnostik. 15 ml einer dichten Bakterienkultur wurden abzentrifugiert
(4000rpm, 5 min, Megafuge 1.0), das Pellet in dem Konservierungspuffer resuspendiert, und
die Konservierungskügelchen aus dem Röhrchen für 5 min mit dieser Suspension inkubiert.
Anschließend wurde die Suspension wieder abgesaugt und das Röhrchen mit den
Konservierungskügelchen bei -70°C gelagert. Alternativ wurde einer dichten Bakterienkultur
20 vol % Glycerin zugegeben und in einem Konservierungsröhrchen bei -70°C gelagert.
3.1.2
Spezifikation von H.pylori
Die Identifikation von H.pylori erfolgte durch Kontrollkulturen auf HCB-Platten sowie durch
Bestimmung der Katalase-, Oxidase- und Ureaseaktivität. Durch Phasenkontrastmikroskopie
konnte eine orientierende Spezifikation einzelner H.pylori Stämme erbracht werden - die
verschiedenen Stämme besitzen eine unterschiedliche Morphologie - und ebenfalls
orientierend die Kultur auf Kontamination mit anderen Bakterien geprüft werden.
Desweiteren
wurde
jede
für
Stimulationsexperimente
eingesetzte
H.pylori
Kultur
mikroskopisch auf die Vitalität der Bakterien, sowie die Kulturphase – spiralförmig (frühe
Kulturphase) oder kokkoid (späte Kulturphase) – überprüft. Nur spiralförmige Bakterien der
frühen Kulturphase, die zudem eine deutlich höhere Motilität aufwiesen als Bakterien aus
älteren Kulturen, wurden für die Stimulation von AGS-Zellen benutzt. Ein weiteres
- 28 -
3. Methoden
Phänomen und auch Problem der späteren Kulturphase bestand darin, daß sich die Bakterien
zu Klumpen zusammenlagerten. Hierfür war besonders H.pylori G27 und bestimmte seiner
isogenen Mutanten anfällig. Durch das Zusammenkleben der Bakterien wurde zum einen die
photometrische Dichtebestimmung der Bakterien unvalide – größere Bakterienaggregate
haben ein anderes Streuverhalten als eine dichte homogene Suspension einzelner Bakterien.
Zum anderen zeigten die verklumpten Bakterien eine deutlich geringere Motilität und
bewirkten nur eine schwache NF-κB bzw. AP-1 Stimulation.
3.1.3
Vorbereiten der Bakterien für einen Stimulationsversuch
Bakterien,
die
in
serumhaltigen
Stimulationsversuchen,
die
sich
Flüssigmedium
um
Teile
des
angezogen
MAP
wurden,
Kinase
/
mußten
c-Fos
/
vor
AP-1
Signaltransduktionsweges sowie AP-1 abhängige Genexpression drehten, von dem Serum
gereinigt werden, da dieses sonst mögliche Effekte von H.pylori überdecken würde. Hierfür
wurde eine entsprechende Menge Bakterienkultur aus der frühen Wachstumsphase (meist
15ml) in ein Falcon gegeben, herunterzentrifugiert (4000rpm, 5 min / Megafuge 1.0), in 1ml
unsupplementiertes (kein Antibiotikum, kein Serum) HAM’s F-12 Medium resuspendiert (bei
Stimulation von AGS-Zellen, ansonsten entsprechend anderes Medium) und in ein 1,5ml
Eppendorfgefäß transferiert. Nach zwei weiteren Waschschritten (Sedimentation bei 6000
rpm / 5 min in einer Tischzentrifuge (Biofuge 13) und Resuspension in serumfreiem Medium,
wurde die optische Dichte einer 1:20 in Medium verdünnten Bakteriensuspension bei
λ=695nm bestimmt und auf die unverdünnte Kultur hochgerechnet. Durch den
Verdünnungsschritt wurde meist der lineare Meßbereich des Photometers (OD zwischen 0,05
und 0,3) erreicht. Da bei der Sedimentation während den verschiedenen Waschschritten die
Bakterien gerne zur Klumpenbildung neigten, wurden die Bakterien nach den Waschschritten
mehrmals durch eine sehr dünne Nadel (26 Gauche) in eine Spritze gesaugt – durch die
auftretenden Scherkräfte konnten die Komplexe meist wieder vollständig aufgelöst werden
(mikroskopische Kontrolle).
3.2
Eukaryontische Zellkultur
Alle Arbeiten mit eukaryontischen Zelllinien inklusive der Stimulationsversuche von den
Zellen mit H.pylori Stämmen erfolgte in Sterilbänken unter Laminarfluß in einem separaten
- 29 -
3. Methoden
Zellkulturlabor mit S2 Sicherheitsbedingungen. Eingesetzte Materialien wurden vor Gebrauch
desinfiziert (Medien, Lösungen) oder waren steril verpackt bzw. autoklaviert.
Die verwendeten Zellinien und ihre Medien sind in folgender Tabelle zusammengestellt :
Cell Line
Bezug
Ursprung
Medium
AGS
ATCC
Adenokarzinom des
HAM’s F-12 + 10 %FCS + 50µg/ml Penicillin/
CRL 1739
Magens
Streptomycin + Glutamin
ATCC
Adenokarzinom des
RPMI 1640 + 10 %FCS + 50µg/ml Penicillin/
HTB 103
Magens
Streptomycin + Glutamin
ATCC
Murine, embyonale
RPMI 1640 + 10 %FCS + 50µg/ml Penicillin/
CRL-1658
Fibroblasten
Streptomycin + Glutamin
KATO III
NIH 3T3
Tabelle 3 : Quellennachweis der Zellinien
Die Kulturflaschen sowie Zellkulturschalen wurden in einem Brutschrank bei 37°C, 5% CO2
Atmosphäre inkubiert.
3.2.1
Passage der Zellen
3.2.1.1 Adhärente Zellen
Das Teilen der AGS-Zellen erfolgte nach Möglichkeit jeden 2.Tag, um die Zellen in der
logarithmischen
Wachstumsphase
zu
halten
und
so
optimale
Bedingungen
für
Stimulationsversuche zu gewährleisten. Nach einem Vorwaschschritt mit 2ml 1mM
Trypsin/EDTA wurde die Kulturflasche mit 5ml 1mM Trypsin/EDTA für 4 - 6 min bei 37°C
inkubiert. Danach wurde das Trypsin durch Zugabe von 10ml Mediums/ 10% FCS inaktiviert
und die gelösten Zellen in einem Verhältnis 1:8 -1:10 weiterkultiviert. Die übrigen Zellen
wurden entweder verworfen oder für Stimulationsversuche ausplattiert (s.u.) .
3.2.1.2 Nicht adhärente Zellen
Die Zellen wurden bei einer Zelldichte von ca. 106 pro ml Medium geteilt.
- 30 3.2.2
3. Methoden
Langzeitkonservierung
5 - 10 106 Zellen in Suspension wurden in ein 15ml Falcon Röhrchen transferiert und bei
1000 U/min 5 min abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1,5ml 90% FCS / 10% DMSO
resuspendiert und in ein Kryoröhrchen überführt. Das Einfrieren erfolgte langsam durch
Lagerung in Styropor bei -80°C über 3-4 Tage und zur Langzeitkonservierung dann in
flüssigem Stickstoff.
Das Auftauen erfolgte bei Raumtemperatur und Kultivierung in 25ml Medium mit
Mediumwechsel nach 1-2 Tagen.
3.2.3
Bestimmung der Zellanzahl
10µl der Zellsuspension wurden in der Neubauer Zählkammer ausgezählt und die Zellzahl auf
die Gesamtsuspension hochgerechnet.
3.2.4
Ausplattieren der Zellen
Bei Versuchen, bei denen Serum im Medium nicht mit den zu messenden Variabeln
interferierte (u.a. Stimulation von NF-κB), wurden ca. 5 105 Zellen in 5ml Serum
supplementiertem Medium – im folgenden SER+ genannt – in eine Kulturschale
(Durchmesser 6cm) gegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Bei Versuchen, bei denen das supplementierte Serum mit den interessierenden Variablen
interferiert – so z.B. aktiviert Serum den Transkriptionsfaktor AP-1 und die MAPKSignaltransduktionswege und führt zu hoher Hintergrundaktivität – sowie bei Versuchen, bei
denen sich die Zellen zur guten Stimulierbarkeit in der Ruhephase G0 befinden müssen,
wurden die Zellen zuerst von Serum gereinigt. Hierzu wurden die Zellen 2x 5 min bei 1000
U/min sedimentiert und in 10ml serumfreiem – im folgenden SER∅ genannt – Medium
resuspendiert. Anschließend wurden 8 – 12 105 Zellen in 5ml Medium SER∅ in eine 6cm
Kulturschale gegeben, durch Schwenken der Kulturschale möglichst homogen verteilt und für
8-14h im Brutschrank inkubiert. Bei Versuchen mit Kulturschalen anderer Größe wurden
folgenden Zellmengen verwendet :
- 31 Größe
SER∅ Ansatz
5
SER+ Ansatz
5 10
5
3. Methoden
Verwendungszweck
6cm
8 -12 10
EMSA
10cm
2-3 106
Westernblot
14cm
6-8 106
Northernblot
Tabelle 4 : Zellkulturschalgrößen
3.3
Molekularbiologische Methoden
3.3.1
Plasmide
Die verwendeten cDNA-Sonden für Northernblot wurden freundlicherweise von folgenden
Kollegen bereitgestellt :
c-fos
600bp Exon 4 in pBFH 480,
Dr. Judith Müller (ZKF, Universität Freiburg)
Schnittstelle : HindIII,EcoRI
VEGF
Cyclin D1
600 bp
Dr. J. Finkenzeller (Klinik für Tumorbiologie,
Schnittstelle : EcoRI, BamH1
Freiburg)
900bp in pCMX
Dr. Mattiaz Humar (ZKF, Universität Freiburg)
Schnittstelle : EcoRI, BamH1
β-Actin
1200 bp
Prof. Dr. Heike Pahl (ZKF, Universität Freiburg)
Schnittstelle : PstI
Tabelle 5 : Quellennachweis der verwendeten Plasmide
Die Reportergenkonstrukte pTal, pAP-1, pNF-κB, pSRE stammen aus dem „Mercury
Pathway Profiling Set“ (Clontech). pKoll-Luc, ein Luciferase Reporterkonstrukt mit einer
AP-1 binding site aus dem Kollagen Promoter, wurde von Dr. Rupec (Universitätshautklinik,
LMU München) zur Verfügung gestellt.
3.3.1.1 Plasmidpräparation
Die Plasmidpräparation erfolgte säulenchromatographisch mittels der Plasmid Maxi Kits von
Qiagen – die Plasmidausbeute betrug durchschnittlich 500-800 µg.
- 32 3.3.2
3. Methoden
DNA-Quantifizierung
Die Konzentration von Nukleinsäure kann photometrisch bestimmt werden, da Nukleinsäuren
bei
λ=260
nm
ein
Absorptionsmaximum
aufweisen,
wohingegen
dieses
bei
Aminosäuren/Proteinen eher bei λ=280 nm liegt. Die Konzentration ergibt sich aus der
Formel:
c(µg/µl) = E260 nm * Verdünnungsfaktor * const
Verdünnungsfaktor : i.a. wurde die DNA bzw. RNA 1:80 in ddH2O verdünnt
const :
50 für DNA / 40 für RNA
Der Quotient E260 nm/ E280 nm ist ein Maß für die Reinheit der DNA bzw. RNA; ein Wert von
1,8 oder höher entspricht ausreichender DNA-Reinheit.
3.3.3
DNA – Agarosegelelektrophorese
Für die Auftrennung von DNA wurde ein 0,8 bzw. 1 % TAE-Agarose Gel verwendet:
0,8 % / 1,0 % TAE –Gel :
0,4 / 0,5 g
50 ml
1 µl
Agarose
TAE – Puffer
Ethidiumbromid (1 µg/µl)
Für das Gel wurde die Agarose und der TAE-Puffer in einen Erlenmeierkolben gegeben, in
der Mikrowelle kurz zum Kochen gebracht, bis auf ca. 60°C abkühlen gelassen und dann das
Ethidiumbromid hinzugegeben. Die DNA-Proben wurden mit 6x Lade Puffer (0,2 %
Bromphenolblau, 0,2 % Xylencyanol, 30 % Glycerin) geladen, und die Elektrophorese
erfolgte bei 70 V / 25mA. Das Ergebnis wurde unter UV-Durchleuchtung mit Hilfe des EagleEye Apparates (Stratagene) dokumentiert.
3.3.4
Zuerst
Herstellung von cDNA Sonden
wurde
die
cDNA
Sonde
aus
3µg
des
entsprechenden
Plasmids
durch
Restriktionsverdau geschnitten – die Reaktionsbedingungen wurde nach den Empfehlungen
- 33 -
3. Methoden
der Hersteller der Restriktionsenzyme gewählt. Daraufhin wurden die Reaktionsprodukte –
das Insert, der linearisierte Vektor und unverdautes Plasmid - in einem lowmelt Agarose Gel
aufgetrennt und das Insert unter einem λ=365 nm UV-Schirm ausgeschnitten. Die
ausgeschnittene Bande wurde gewogen, in ein Eppendorfreaktionsgefäß transferiert, mit 2
Volumen ddH2O resuspendiert und 10 min bei 65°C erhitzt. Aufbewahrt wurden die lowmelt
Sonden bei -20°C.
3.3.5
Markieren der cDNA Sonden mit α-(32P)-dCTP
Hierzu wurde der „Prime-It-II Labeling Kit“ (Stratgene) verwendet : 50ng Insert in lowmelt
Agarose (ca. 10-20 µl) wurden auf 23µl mit ddH2O verdünnt, 10 µl Random Primers
hinzugegeben, 5 min auf 95°C erhitzt und dann kurz runterzentrifugiert. Nach Zugabe von
10µl 5x dCTP Puffer, 5µl α-(32P)-dCTP (3000 Ci/ml) und 1µl Klenow Exo – Polymerase,
wurde der Ansatz durch Antippen an das Eppendorfreaktionsgefäß kurz gemischt, kurz
abzentrifugiert und bei 37°C für 30 min inkubiert. Danach wurde das Reaktionsprodukt
mittels einer G-200 SpinColumn aufgereinigt und die Aktivität der markierten Sonde in einem
β-Counter gemessen (durchschnittlich 106 cpm).
3.3.6
Northern Blot
3.3.6.1 RNA-Präparation
Die Gesamtzell-RNA wurde durch saure Phenol Extraktion (Trizol, Life Technologies)
gewonnen.
Die Zellen einer 14cm∅ Kulturschale wurden nach dem Stimulationsversuch in 5 ml 1xPBS
geerntet, in ein 15ml Falcon Röhrchen transferiert und abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde
nun in 5ml Trizol resuspendiert, 1ml Chloroform hinzugefügt, kräftig gemischt, in ein Corex
Röhrchen überführt und 3 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Durch eine 15 min
Zentrifugation (10000rpm, 4°C) wurde das Gemisch in eine obere wässrige Phase (beinhaltet
die RNA), eine mittlere weiße Phase (beinhaltet das Protein) und eine untere rote PhenolChloroform Phase (beinhaltet die DNA) getrennt. Die obere Phase wird in ein neues CorexRöhrchen transferiert und die RNA mit 1 Volumen (ca. 2.5ml) Isopropanol gefällt. Nach
Zugabe des Isopropanols erfolgte eine 10 min Inkubation bei Raumtemperatur und 10 min
- 34 -
3. Methoden
Zentrifugation (10000rpm, 4°C). Das RNA-Pellet wurde in 2,5ml Ethanol durch vortexen
gelöst, nochmals zentrifugiert (5 min, 8000 rpm, 4°C) und luftgetrocknet. Die RNA wurde in
20 µl RNAse freiem DEPC-ddH2O (Wasser mit 0,1 % Diethylpyrocarbonat, ein RNAse
Inhibitor) aufgenommen und bei -20°C aufbewahrt.
3.3.6.2 Gelelektrophorese der RNA
Zur Auftrennung der RNA wurde ein 1,0 % Agarose Gel in 1xMOPS-Puffer verwendet. Zur
Linearisierung der RNA wurde 0,6% Formaldehyd beigesetzt. Jeweils 10µg der RNA-Proben
(5-15µl) wurden in ein Eppendorfreaktionsgefäß gegeben, in einer Vakuumzentrifuge auf 4µl
konzentriert und mit 15,5 µl Probenpuffer und 5 µl 6x Ladepuffer auf das Gel geladen. Die
Elektrophorese erfolgte in 1x MOPS mit 0,6 % Formaldehyd (37%) für 1-2h bei 30mA.
1x MOPS :
20 mM
5 mM
1 mM
MOPS
NaOAc
EDTA
6x Ladepuffer :
50 %
0,4 %
0,4 %
1 mM
Glycerin
Bromphenolblau
Xylenblau
EDTA
Probenpuffer :
20 µl
35 µl
100 µl
845 µl
10x MOPS
Formaldehyd (37%)
Formamid (100%)
DEPC - ddH2O
3.3.6.3 Nothern Blot
Für den Transfer der RNA vom Gel auf eine Nitrozellulose Membran Hybond-N wurde das
TurboBlotter System (Schleicher & Schuell) verwendet, das nach dem Neutralblot Prinzip
arbeitet.
Das Gel wurde für 10 min in DEPC – ddH2O gewaschen, die Nitrozellulose Membran 1 min
in ddH2O und 5 min in 20x SSC inkubiert. Der Aufbau erfolgte nach Empfehlungen des
Herstellers; im wesentlichen wurde das Gel auf die Membran gelegt, die wiederum auf einem
- 35 -
3. Methoden
Stoß von Filterpapier platziert war. Nachdem nun auf das Gel ein größeres Filterpapier
aufgelegt wurde, das Verbindung zu einem Transferpuffer – Reservoir (20x SSC) hatte, ergab
sich ein Fluß von Ionen durch das Gel in die Membran, der die RNA auf die Membran
„blottete“. Als Transferpuffer diente 20x SSC. Nach mindestens 12h Inkubation wurde die
Membran 5 min in 2x SSC-Puffer gewaschen und durch UV-Bestrahlung an die Membran
fixiert.
20x SSC –Puffer :
3M
300 mM
NaCl
NaCitrat
3.3.6.4 Hybridisierung
Die Membran mit der fixierten RNA wurde 1 Stunde in 10ml Express-Hyb Lösung
(ClonTech) vorinkubiert. Die radioaktiv markierte DNA-Sonde wurde zur Trennung in
ssDNA für 10 min auf 95°C erhitzt, kurz abzentrifugiert, auf Eis gekühlt und dem
Hybridisierungspuffer beigegeben. Die Hybridisierung erfolgte mindestens 2h bei 68°C.
Daraufhin wurde der Blot dreimal für 10 min bei Raumtemperatur in 2x SSC mit 0,05 % SDS
und in einem zweiten stringenterem Waschschritt zweimal für 20 min bei 50°C in 0,1x SSC
mit 0,1% SDS inkubiert. Der Blot wurde bei -80°C für eine geeignete Zeit autoradiographiert.
3.3.7
Transfektion
Bei der Transfektion werden DNA-Plasmide in eukaryontische Zellen eingeschleust. In dieser
Arbeit wurden drei kommerzielle Transfektionskits auf liposomaler Basis – DOTAP
(Boehringer Mannheim), Fugene 6 (Boehringer Mannheim) und SuperFect (Qiagen) - für die
Eignung zur Transfektion der Magenepithelzell-Linie AGS getestet. Fugene 6 erwies sich
dabei als die effizienteste Methode, die darüber hinaus auch die am wenigsten zytotoxische
war.
Im weiteren soll nur die zum Schluß für die Reportergenversuche verwendete Methode mit
Fugene 6 näher beschrieben werden – alle drei Methoden wurde entsprechend den
Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Zur Optimierung der Transfektionseffizienz
wurden Parameter wie die eingesetzte Menge an DNA bzw. Transfektionsagens variiert (siehe
auch Etablierung der Transfektion von AGS-Zellen).
- 36 -
3. Methoden
3.3.7.1 Vorbereiten der Zellen
AGS-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 2ml HAM´s F-12 / 10%
Serum in einer Dichte von 4-6*104 in eine 6-well Platte ausplattiert. Nach 30-36 Stunden
Kultivierung im Brutschrank war eine 40-60% Konfluenz des Zellrasens erreicht und somit
ein geeigneter Zeitpunkt für die Transfektion der Zellen.
Zu 97 µl HAM´s F-12 Medium, dem kein Serum oder Antibiotikum zugefügt war, wurden 3
µl Fu6 Reagenz pipettiert, wobei das Transfektionsagens die Wand des Eppendorfgefäßes
nicht berühren durfte, und für 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. In ein zweites
Eppendorfgefäß wurde 2µg DNA des Reporterkonstrukts, sowie 50ng eines tk-Renilla
Luciferase Konstrukts als Standardisierungsvektor gegeben. Dieses Gemisch wurde nun
tropfenweise
dem
ersten
Eppendorfgefäß
mit
dem
in
Medium
verdünnten
Transfektionsreagens hinzugegeben. Zur Ausbildung von DNA-Liposomen Komplexen
wurde der Ansatz 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen und dann tropfenweise den
Zellkulturschalen hinzugefügt. Nach 8h Inkubation im Brutschrank wurden optional die
Zellen für 6h gehungert, indem das serumhaltige Medium durch serumfreies Medium ersetzt
wurde. Anschließend erfolgte die Stimulation der Zellen für 8 Stunden und daraufhin die
Zellernte.
3.3.7.2 Zellernte
Die Zellen wurden einmal mit 1x PBS gewaschen und anschließend in der Kulturschale mit
200 µl 1x PLB (Passive Lysis Puffer / Promega) für 2 min lysiert. Die Zellen wurden mittels
eines Gummischabers gesammelt, mit der Pipette durch Auf- und Abpipettieren weiter
homogenisiert und der Zelldebris durch Zentrifugation (13000rpm, 5 min, 4°C) abgetrennt.
Der Überstand wurde bei -80°C aufbewahrt.
3.3.7.3 Bestimmung der Luciferase Aktivität
Die Luciferase Aktivität wurde an einem LB 96P Luminometer (EG&G Bertold) mit 100 µl
Festinjektoren und unter Verwendung des Dual Luciferase Reporter Assay Systems
(Promega) bestimmt. Hierfür wurden 25 µl des Proteinextraktes in eine spezielle 96Wellplatte pipettiert und die Luciferase Aktivität nach Zugabe von 100 µl LARII-Puffers
(Promega) über ein 10 s-Intervall im Luminometer quantifiziert. In einem zweiten Schritt
- 37 -
3. Methoden
wurde durch Zugabe von 2 µl Renilla-Luceferin, das in 98 µl Stop&Glow Puffer gelöst war,
die erste Chemolumineszens Reaktion beendet und eine zweite, die durch die kotransfizierte
Renilla-Luciferase initiiert wurde, gestartet. Wieder erfolgte die Messung über ein 10 sIntervall. Die zweite Messung diente als Abgleich für die erste Messung, um Schwankungen
der Transfektionseffizienz auszugleichen.
3.4
3.4.1
Proteinbiochemische Methoden
Stimulation von Magenepithelzellen durch H.pylori
Für einen Stimulationsversuch wurde 1ml Bakterien Suspension mit einer optischen Dichte
von 1,0 bei λ=695nm (entspricht 108 Bakterien) pro 5 ml Medium zu den ausplattierten Zellen
gegeben und für die angegebene Zeit im Brutschrank kokultiviert.
3.4.2
Gewinnung der Gesamtzellextrakte
Adhärente Zellen wurden zuerst 1-2 mal mit 4°C 1x PBS gewaschen und anschließend in 5ml
selbigen Puffers mit einem Gummispatel abgekratzt, in ein 15ml Falcon transferiert, bei 1000
U/min 5 min abzentrifugiert und in 1ml 1x PBS resuspendiert. Dieses wurde in ein 1,5ml
Eppendorfröhrchen pipettiert, kurz sedimentiert (13.000 U/min, 15 sec), in 4 Volumen Totex
Puffer (=50µl) resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Zum Schluß wurde der Zelldebris
5 min bei 13000 U/min und 4°C abzentrifugiert und der Überstand in ein neues
Eppendorfröhrchen pipettiert. Für die Langzeitkonservierung wurde der Extrakt im flüssigen
Stickstoff schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt.
Für die Gewinnung von Proteinextrakten für MAP Kinase Assays oder auch Western Blots
wurden alternativ zu oben beschriebener Methode die Zellen zweimal mit 4°C 1x PBS
gewaschen und anschließend direkt in der Kulturschale mit 200µl NEB Lysis Puffer lysiert.
Nach 5-10 min Inkubation auf Eis erfolgte das Abkratzen mit dem Gummispatel; die
Zellsuspension wurde dann in ein Eppendorfröhrchen transferiert. Die Proteinextrakte wurden
4mal für 5 sec im Ultraschallbad homogenisiert und dann der Zelldebris analog oben entfernt.
- 38 Totex
3. Methoden
NEB Lysis Puffer
20 mM
HEPES (pH 7,9)
20 mM
Tris (pH 7.5)
350 mM
NaCl
150 mM
NaCl
1%
NP-40
1%
Triton X-100
0,1 mM
EDTA
1mM
EDTA
0,5 mM
EGTA
1 mM
EGTA
1mM
MgCl2
1 mM
Glycerolphosphate
1mM
Na3VO4
2.5 mM
NaPyrophosphat
1µg/ml
Leupeptin
1mM
PMSF **
*
5mM
Na3VO4
30 mM
NaPyrophosphat *
1%
Aprotinin
**
**
1mM
PMSF
5mM
DTT **
Tabelle 6 : Zelllysispuffer
*
wurde bei Zellextrakten als Phosphatase Inhibitoren hinzugefügt
Na3VO4 Zubereitung (0,2 M Stock) : [nach Gordon 1991]
Mw Na3VO4 : 184 g/mol
• 0,37 g Na3VO4 in 10ml lösen
• pH auf 10.0 mit 37 % HCl titrieren (Cave bei Erreichen des Zielbereiches)
• 1 Stunde bei 100° C kochen – Farbe schlägt von orange auf durchsichtig
• bei 4° C aufbewahren (verwendbar für ca. 1-2 Wochen)
**
Verbindung nicht stabil - wurde kurz vor dem Versuch dem Puffer hinzugefügt
3.4.3
Proteinbestimmung nach Bradford
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde 10µl Proteinextrakt zu 1ml Bioradreagenz
gegeben, das zuvor 5-fach verdünnt in 250 mM TRIS Puffer wurde, und nach 5 min
Inkubation bei Raumtemperatur die Lichtabsorption bei λ=595 nm gemessen. Der
Proteingehalt wurde mittels Standardverdünnungsreihe ermittelt, wofür in Lysis Puffer
verdünntes BSA verwendet wurde.
- 39 3.4.4
3. Methoden
Gelretardierungsassay / EMSA
Der Gelretardierungsassay oder Electrophoretic Mobility Shift Assay dient dem Nachweis
von Protein-DNA Wechselwirkung, wie sie u.a. physiologisch bei der Interaktion von
Transkriptionsfaktoren mit Promoter und Enhancer DNA-Sequenzen stattfindet. Hierzu wird
ein Proteinextrakt – entweder Gesamtproteinextrakt oder auch Kernextrakt – mit einem
radioaktiv markierten Oligonukleotid inkubiert, welches die Konsensusbindungssequenz des
zu untersuchenden Transkriptionsfaktors beinhaltet. Um unspezifische Bindungen zu
vermeiden, wird BSA zum Blockieren von proteinbindenden DNA-Sequenzen neben der
markierten Sonde und Poly [dIdC] zum Abfangen von unspezifisch DNA-bindenden
Proteinen hinzugefügt.
Zur Detektion der gebildeten DNA-Protein Komplexe wird das Reaktionsprodukt in der
Polyacrylamid Gelelktrophorese (PAGE) unter nativen nicht-denaturierenden Bedingungen
aufgetrennt und durch Autoradiographie oder im Phosphoimager visualisiert.
3.4.4.1 Markieren von Oligonukleotiden mit γ-(32P)-dATP
Die für den EMSA verwendete Sonde wurde mittels einer T4-Polynukleotidkinase radioaktiv
markiert:
Reaktionsansatz :
37 µl
5 µl
1 µl
5µl
1,5µl
ddH2O
10x PNKinase Puffer (NEB)
AP-1/ NF-κB Oligonukleotid (1.75 pmol/µl) (Promega)
γ-(32P)-dATP (3000 Ci/mmol)
T4-Polynukleotidkinase
Der Reaktionsansatz wurde bei 37°C 30 min inkubiert und anschließend mittels einer G-25
SpinColumn aufgereinigt. Zur Vorbereitung hierfür wurde die Säule eine Minute bei 3000
rpm in der Tischzentrifuge (Biofuge 13) abzentrifugiert, um die in der Säule befindliche
Flüssigkeit zu entfernen. Anschließend wurde das Reaktionsprodukt auf die Säule aufgebracht
und für 2 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Die so gewonnenen radioaktiv markierten
Oligonukleotide wurden bei 4°C gelagert und waren für ca. 10 Tage verwendbar.
- 40 -
3. Methoden
3.4.4.2 EMSA Mix
Zur Bildung der DNA-Protein Komplexe wurden 5µl des Proteinextraktes (ca. 10-20 µg) mit
15µl EMSA Bindungsmix 25 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für die Analyse wurde ein
4% natives Polyacrylamid Gel verwendet, die Elektrophorese wurde bei 210V in 0,5x TBE
Puffer durchgeführt. Die Gele wurden auf 3MM Filterpapier für 35 min bei 80°C
vakuumgetrocknet und dann autoradiographiert.
EMSA Mix :
2 µl
2 µl
2 µl
4 µl
2 µl
2 µl
1 µl
ddH2O
MgCl2 (50mM)
Puffer D+
5x Ficoll Puffer
BSA (10 µg/µl)
Poly [dIdC] (1 µg/µl)
γ-(32P) markerites Oligo
Bei NF-κB wird kein MgCl2 benötigt und diese 2 µl durch ddH2O ersetzt.
Puffer D+ :
20 mM
100 mM
0,25 %
20 %
0,5 mM
2mM
HEPES (pH 7,9)
KCl
NP-40
Glycerol
EDTA
DTT
5x Ficoll Puffer :
100 mM
300 mM
20 %
10 mM
0,1 mM
HEPES (pH 7,9)
KCl
Ficoll 400
DTT
PMSF
10x TBE Puffer :
890 mM
890 mM
20 mM
TRIS
Borsäure
EDTA
4 % PA-Gel :
60 ml
10 ml
3,5 ml
400 µl
ddH2O
Acrylamid (30%)
10x TBE
APS (10%)
- 41 40 µl
3. Methoden
TEMED (100%)
3.4.4.3 Supershift
Der Supershift dient der weiteren Spezifikation des zu untersuchenden DNA-bindenden
Proteins – bindet ein hinzugegebener Antikörper spezifisch an den DNA-Protein Komplex,
hat dieser größere Komplex eine langsamere Laufgeschwindigkeit in der PAGE - so wird die
Bande nach oben „geshiftet“. Ist der Antikörper gegen die DNA-bindende Domäne des
Transkriptionsfaktors gerichtet, kann es zur vollständigen Aufhebung der DNA-Protein
Interaktion kommen, und die Bande im EMSA verschwinden. Zur Durchführung wurden zu
den 15 µl EMSA Mix 2µl Antikörper und 3 µl 1:2 verdünnter Proteinextrakt gegeben.
3.4.4.4 Kompetitionsassay
Dieser Assay dient dem Nachweis der Spezifität der Bindung des Transkriptionsfaktors an das
markierte Oligonukleotid. Hierbei wird dem Bindungsmix 1µl 100x konzentriertes (1,75
pmol/µl) nicht radioaktiv markiertes Oligonukleotid hinzugegeben. Handelt es sich um das
gleiche Oligonukleotid wie das radioaktiv markierte, sollte die spezifische Bande im EMSA
durch kompetitive Hemmung verschwinden. Wird hingegen ein anderes Oligonukleotid als
das zu untersuchende im Überschuß hinzugefügt, sollte bei spezifischer Bindung des
Transkriptionsfaktors an seine Consensus-Sequenz-Oligonukleotid keine kompetitive
Hemmung stattfinden.
3.4.5
Westernblot / Immunoblot
Der Westernblot stellt eine Kombination dar aus der
(1)
Polyacrylamid Gel Elektrophorese (PAGE) zum Auftrennen von Proteinextrakten
meist unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) und nach Blotten der Proteine
aus dem Gel auf eine Membran - z.B. Nitrocellulose (NC) oder Polyvinylidene
difluorid (PVDF) Membran -
(2)
der Immundetektion einer speziellen Proteinbande mit Antikörpern gegen das zu
untersuchende Protein. Die Immundetektion erfolgte in 2 Stufen : ein erster
Antikörper erkennt das Protein, der zweite Antikörper, der gegen den ersten
- 42 -
3. Methoden
Antikörper gerichtet ist, ist mit einem Marker bestückt – in dieser Arbeit wurden
Zweitantikörper verwendet, die mit Horseradish Peroxidase (HRP) markiert waren,
und so mittels Chemolumineszens detektiert werden konnten.
3.4.5.1 SDS-PolyAcrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE)
Für die lineare Auftrennung der Proteine entsprechend ihrer Größe in der Gelelektrophorese
ist es zunächst wichtig, diese zu linearisieren und die Ladungen der Seitenketten, die mit der
in der Gelelektrophorese angelegten Spannung interferieren, zu egalisieren. Nach
Bestimmung des Proteingehaltes der Gesamtzellextrakte wurden hierfür gleiche Mengen (ca.
30µg) in einem Laemli Sample Puffer 5 min bei 95°C denaturiert und auf einem 10% SDSPolyacrylamidgel bei 30 mA für 1-1,5 h elektrophoretisch aufgetrennt. Das eingesetzte SDSPolyacrylamidgel unterteilte sich in ein oberes Sammelgel (1/3) und ein unteres Trenngel
(2/3). Zuerst wurde das Trenngel in die Gelkammer gegossen. Nachdem es nach ca. 30 min
auspolymerisiert war – der obere Rand wurde mit ddH2O bedeckt und so vor Austrocknung
geschützt – wurde das Wasser abgesaugt und das Sammelgel in die verbleibende Kammer
gegossen. Im Sammelgel wird das in die Ladetasche gegebene Proteinextrakt auf eine dünne
Bande fokussiert, im Trenngel erfolgt die Auftrennung der Proteine entsprechend ihrer Größe.
Trenngel :
3,3 ml
2 ml
2,7 ml
50 µl
4 µl
ddH2O
4x lower buffer
Acrylamid (30%)
APS (10%)
TEMED (100%)
Sammelgel :
2,5 ml ddH2O
1 ml 4x upper buffer
0,5 ml Acrylamid (30%)
40 µl APS (10%)
4 µl TEMED (100%)
lower buffer :
500 mM
0,4 %
TRIS-HCl pH 6,8
SDS
upper buffer :
1500 mM
0,4 %
TRIS-HCl pH 6,8
SDS
- 43 5x SDS running :
buffer
125 mM
1000 mM
0,5 %
TRIS
Glycin
SDS
4x Laemli buffer :
200 mM
40 %
8%
400 mM
0,4 %
TRIS
Glycerol
SDS
DTT
Bromphenolblau
3. Methoden
3.4.5.2 Blotten
Danach wurden die Proteine mit einem Semi-dry-Elektroblotter bei 0.8 mA/cm2 für 1h auf
eine Immobilon-P PVDF Membran transferiert.
Hierbei wurde folgender Aufbau gewählt :
Kathode
6 Stück 3MM Filterpapier äquilibriert in Kathodenpuffer
Gel
Membran
2 Stück 3MM Filterpapier äquilibriert in Anodenpuffer 2
4 Stück 3MM Filterpapier äquilibriert in Anodenpuffer 1
Anode
Anodenpuffer 1 :
300 mM
10 %
TRIS
Methanol
Anodenpuffer 2 :
25 mM
10 %
TRIS
Methanol
Kathodenpuffer :
25 mM
40 mM
10 %
TRIS
6-amino-Hexansäure
Methanol
- 44 -
3. Methoden
Die Membran wurde zuerst 15 sec in Methanol quellen gelassen und dann nacheinander 2 min
in ddH2O und 5 min in Anodenpuffer 2 inkubiert.
3.4.5.3 Immundetektion
Zur Vermeidung unspezifischer Bindungen wurde die Membran in 1x TBS mit 5% BSA ( bei
Antikörpern von NEB oder Santacruz) bzw. 0,2% I-Block (bei phosphospezifischen
Antikörpern von Promega) für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht
inkubiert. Nach Austausch des Blocking Puffers wurde der 1. Antikörper in einer Verdünnung
1:1000 – 1:5000 (den Angaben des Herstellers folgend / siehe Tabelle 7) dazugegeben und für
1 Stunde bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht inkubiert.
Antikörper
Hersteller
Verdünnung
c-Fos, rabbit polyclonal #052x
Santa Cruz
1:1000
PhosphoPlus c-Jun (Ser63), c-Jun (Ser 73)
NEB
1:1000
JNK1, rabbit poyclonal #571x
Santa Cruz
1:250
ERK 1/2, rabbit poyclonal #V1141
Promega
1:5000
Active MAPK, rabbit poyclonal #V8031
Promega
1:5000
Active JNK, rabbit poyclonal #V7931
Promega
1:5000
Cyclin D1, mouse IgG2a #66271A
PharMingen
1:500
Anti-mouse-Antibody, # NA 931
Amersham
1:1000
Anti-rabbit-Antibody, # NA 934
Amersham
1:1000
Antibody Kit , #9260
Tabelle 7 : Verdünnung der Antikörper
Nach dreimaligen Waschen der Membran in 1x TBS für 5 min wurde gebundener
1.Antikörper mit einem 2.Antikörper (anti-Mouse IgG oder anti-Rabbit IgG), an den eine
Peroxidase gekoppelt ist, dekoriert (Verdünnung 1:1000 in Milk Powder Blocking Puffer –
Inkubation 45 min bei Raumtemperatur).
Wieder folgte ein dreifacher Waschschritt in 1xTBS und dann die Detektion durch
Chemolumineszens.
Hierbei wird Luminol unter alkalischen Pufferbedingungen durch die an den Zweitantikörper
gekoppelte Peroxidase und Wasserstoffperoxid oxidiert und dabei das Luminol in einen
- 45 -
3. Methoden
angeregten Zustand versetzt. Bei Übergang in den Grundzustand wird ein Lichtquant
emittiert, welches auf einem Röntgenfilm detektiert werden kann. Zur Durchführung wurde
die Membran für 1 min in eine ECL-Chemolumineszenz Reagenz inkubiert und die nun
fluoreszierenden Immunkomplexe auf XAR-5 Filmen detektiert.
3.4.5.4 Stripping
Um einen Blot ein zweites Mal mit Antikörpern zu dekorieren, wurden die gebundenen
Antikörperkomplexe durch dreimaliges Waschen in Stripping Buffer bei 50°C gelöst.
Anschließend wurde die Membran wieder in Blocking Puffer inkubiert und dann neu mit
Antkörpern dekoriert.
Stripping Buffer :
3.4.6
62,5 mM
100 mM
2%
TRIS
β-Mercaptoethanol
SDS
MAP Kinase Assay
Der Kinase Assay ist eine Methode, die Aktivität einzelner Kinasen zu bestimmen. Die
entsprechende Kinase wird zuerst mittels eines an Sepharose gekoppelten Antikörpers
immunpräzipitiert, die daraufhin in vitro nach Zugabe von ATP ein entsprechendes Substrat
für eine bestimmte Zeit phosphoreliert. Als Substrat diente das rekombinant hergestellte
physiologische Substrat. Anschließend wurde der Phosphorelierungsgrad des Substrats (Maß
für die Aktivität der Kinase) mittels eines phosphospezifischen Antikörpers im Westernblot
detektiert.
3.4.6.1 Immunpräzipitation
Zu 200µg Gesamtzellextrakten, die mit dem NEB Lysis Puffer hergestellt wurden, wurde 15
µl Sepharose-immobilisierter phosphospezifischer Antikörper gegen MEK1/2 oder ERK1/2
gegeben, über Nacht bei 4°C auf der Rotationsschaukel inkubiert, und dann für zwei Minuten
bei 2000 U/min abzentrifugiert. Die Sepharose gekoppelten Antikörper wurden nun zweimal
in 500 µl NEB Lysis Puffer und danach zweimal in 500 µl NEB Kinase Puffer gewaschen.
- 46 Kinase Puffer :
25 mM
10 mM
0.1 mM
5 mM
2mM
3. Methoden
TRIS
MgCl2
Na3VO4
β-Glycerolphosphat
DTT
3.4.6.2 Kinase Assay
Das Präzipitat wurde in 50 µl Kinase Puffer resuspendiert und mit 200 µM ATP und 2 µg
Substrat
–
entweder
rekombinantes
ERK2
oder
Elk-1-Gluthtation-S-Transferase
Fusionsprotein – supplementiert. Die Kinase Reaktion wurde 30 min bei 37°C ausgeführt.
Das Reaktionsprodukt wurde in der SDS-PAGE aufgetrennt und der Phosphorelierungsgrad
des Substrats durch Westernblot mit phosphospezifischen Antikörpern detektiert.
- 47 -
4. Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1
Etablierung des AP-1 EMSA
Der Gelretardierungsassay oder Electrophoretic Mobility Shift Assay dient dem Nachweis
von Protein-DNA Wechselwirkung, wie sie u.a. physiologisch bei der Interaktion von
Transkriptionsfaktoren mit Promoter und Enhancer DNA Sequenzen stattfindet. Hierzu wird
ein Proteinextrakt – entweder Gesamtproteinextrakt oder auch Kernextrakt – mit einem
radioaktiv markierten Oligonukleotid inkubiert, welches die Konsensusbindungssequenz des
zu untersuchenden Transkriptionsfaktors beinhaltet. Um unspezifische Bindungen zu
vermeiden, wird BSA zum Blockieren von Protein-bindenden DNA-Sequenzen neben der
markierten Sonde und Poly [dIdC] zum Abfangen von unspezifisch DNA-bindenden
Proteinen hinzugefügt.
Zur Detektion der gebildeten DNA-Protein Komplexe wird das Reaktionsprodukt in der
Polyacrylamid Gelelktrophorese (PAGE) unter nativen nicht-denaturierenden Bedingungen
aufgetrennt und durch Autoradiographie oder im Phosphoimager visualisiert.
Ein zentraler Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Reaktionen der MagenepithelWirtszelle nach Kokultivation mit H.pylori und dies im besonderen bezogen auf den
Transkriptionsfaktor AP-1 und die zu seiner Aktivierung führenden „Mitogen Activated
Protein Kinases“ (MAPK) Signaltransduktionswege.
Wir interessierten uns für die Frage, ob H.pylori AP-1 in Magenepithelzellen aktiviert. Bei
der Etablierung eines AP-1 EMSA ergaben sich folgende Schwierigkeiten :
(1) AP-1 und die es aktivierenden MAPK Signaltransduktionswege werden durch Serum
aktiviert. In proliferierenden Zellen/Zellinien, insbesondere in Tumorzellinien, führt dies
zu konstitutiv aktiven AP-1 und MAP-Kinasen, so daß eine mögliche zusätzliche
Aktivierung durch H.pylori verdeckt wird. Auch die Bakteriensuspensionen, die in
serumhaltigem Medium kultiviert werden, können das Ergebnis verfälschen : war es nun
das Bakterium oder nur das im Medium enthaltende Serum, das zu einer Aktivierung von
AP-1 führte ?
(2) AP-1 wird sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell reguliert (s. Einleitung
1.9) – bei letzterem kann die DNA-Bindungsaffinität von AP-1 durch Abspalten von
- 48 -
4. Ergebnisse
Phosphatgruppen an Thr231, Ser243, Ser249 durch unspezifische Phosphatasen erhöht
werden, und so im EMSA zu hohen Hintergrundwerten führen.
Ad (1)
Zuerst sollte mit Hilfe des EMSA untersucht werden, ob H.pylori in der Lage ist, den
Transkriptionsfaktor AP-1 zu aktivieren. Bei den ersten Versuchen erfolgten keine
Waschschritte zur Vermeidung von Störeffekten durch Serum : die Magenepithelzellinien
AGS und KATO III wurden in serumhaltigen Medium ausplattiert und die Bakterien in
12
TP
A
20
1
15
uc
ell
a1
0m
uc
in
ell
a1
h
G2
7
Br
Br
H. pylori Stamm :
-
serumhaltigem Brucella Medium zur Infektion hinzugefügt. Nach 1h Kokultivierung der
Exp 8 : Stimulation von in Serum
kultivierten (10% FCS) AGS Zellen
mit verschiedenen H.pylori Stämmen,
die ebenfalls in Serumhaltigen
Medium kultiviert wurden.
AGS Zellen in der logarithmischen
Wachstumsphase
wurden
mit
verschiedenen cagA+ H.pylori Stämmen
(G27, 151) und cagA- (2012), sowie
Bakteriummedium (Brucella) für 1h
kokultiviert.
Als
Negativkontrolle
dienten unstimulierte Zellen, als
Positivkontrolle
TPA
(100ng/µl).
Gesamtzellextrakte wurden im EMSA
auf DNA-Bindeaktivität von AP-1
untersucht. Das ausgefüllte Dreieck zeigt
die Position von spezifischen AP1/DNA Komplexen an, das leere
Dreieck
markiert
ungebundenes
Oligonukleotid.
1
2
3
4
5
6
7
Zellen mit verschiedenen H.pylori Stämmen wurden Gesamtzellproteinextrakte erstellt und
auf DNA-Protein Bindungen mittels EMSA untersucht. Abb. Exp 8 demonstriert das
wesentliche Problem : sämtlichen Linien, auch die als Nullkontrolle dienenden unstimulierten
Zellen, wiesen eine deutliche AP-1 Bande auf. Auch zu hohe Zelldichten kann Streß für die
Zelle bedeuten und so zur Aktivierung von AP-1 führen (Daten nicht gezeigt).
- 49 -
15
1
NT
AT
CC
TP
A
-
15
1
NT
CT
AT
CC
TP
A
AGS Serum 10%
-
H. pylori Stamm :
CT
AGS Serum 0%
4. Ergebnisse
1
2
3
4
7
8
5
6
9
10
Exp 23 : Vergleich von für 12h Serum gehungerten AGS Zellen mit nicht gehungerten Zellen
bzgl. der AP-1 Stimulierbarkeit durch H.pylori.
AGS Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden (1) entweder 2x in serumfreien
Medium gewaschen, dann in diesem ausplattiert und für 12h serumdepriviert oder (2) ohne
Waschschritt in serumhaltigen Medium ausplattiert. Nach 12 h wurden die Zellen für 1h mit
verschiedenen cagA+ H.pylori Stämmen stimuliert, und anschließend die Zellextrakte im EMSA auf
aktiviertes AP-1 untersucht.
Um eine niedrigere AP-1 Hintergrundsaktivität zu erreichen, wurde versucht, die Zellen
mittels 12h Kultivierung in HAM’s F-12 SER∅ Medium in die Ruhephase G0 zu bringen.
Abb. Exp. 23 stellt die Ergebnisse von gehungerten Zellen (Spur 1-5) und in Serum
kultivierten Zellen (Spur 6-10) gegenüber – die serumverarmten Zellen weisen eine deutlich
niedrigere AP-1 Aktivität in der Nullkontrolle auf.
Auch das als Nullkontrolle mitgeführte Bakterienmedium Brucella wies regelmäßig eine hohe
AP-1 Aktivität auf. Dies legte den Schluß nahe, daß gar nicht H.pylori als vielmehr das
serumenthaltende Nährmedium für die AP-1 Aktivierung verantwortlich war (Abb. Exp. 29).
4. Ergebnisse
1xP
BS
1m
FC
l
S(
100
%)
Br
1
uc(
10% 00µl
FC
S)
1m
l
Stimulus :
-
- 50 -
Exp. 29 : AP-1 Induktion von 12h gehungerten AGSZellen durch serumhaltiges Bakterienmedium oder FCS.
Für 12h serumdeprivierte Zellen wurden für 1h mit 1xPBS, 100 µl
FCS oder 1ml Bakterienmedium (10% Serum) inkubiert. Dann
wurden die Zellextrakte im EMSA auf aktiviertes AP-1 untersucht.
1
2
3
4
Nun wurden die Bakterien zuerst immer 3x in HAM’s F-12 SER∅ Medium gewaschen, bevor
sie für Stimulationsversuche eingesetzt wurden.
Nach Einführen dieser Waschschritte sowohl für die Bakterien als auch für die Zellen konnte
die Hintergrundsaktivität auf ein vertretbares Maß reduziert werden (Abb. Exp 34). Daß nun
tatsächlich H.pylori für die Stimulation von AP-1 verantwortlich ist, zeigt sich am besten
daran, daß der cag A- H.pylori Stamm 2012 nicht in der Lage ist, AP-1 zu aktivieren (Spur 3).
Würde die Aktivierung auf mögliche Kontamination mit Serum zurückzuführen sein, sollte
C
AT
C
CT
NT
20
12
1 51
H. pylori Stamm :
-
man erwarten, daß alle mit Bakterien stimulierten Zellen AP-1 Aktivität aufweisen.
Exp. 34 : AP-1 Induktion in 12h
gehungerten
AGS-Zellen
durch
H.pylori in serumfreiem Medium.
Für 12h serumdeprivierte Zellen wurden
für 1h mit verschienen H.pylori
Stämmen stimuliert. Dabei waren die in
serumhaligen
Medium
kultivierten
Bakterien
vor
dem
Stimulationsexperiment
3x
in
serumfreiem
Medium
gewaschen
worden. Zellextrakte wurden im EMSA
auf aktiviertes AP-1 untersucht.
1
2
3
4
5
- 51 -
4. Ergebnisse
Da nach zu langer Kultivierung der Zellen in serumfreiem Medium die Zellen in Apoptose
gehen und zuvor der Entzug von Überlebenssignalen in Form von Serumfaktoren als externer
Streß eine Aktivierung von AP-1 zu Folge hat, ist das Zeitfenster, indem die Zellen langsam
in die G0-Ruhephase übergehen, aber noch nicht in „Apoptose Streß“ geraten, begrenzt. Die
beste Stimulierbarkeit ergab sich nach 10-12h (Spur 1-3 und 4-6) (Abb. Exp 33), was sich in
weiteren Experimenten bestätigte. Werden die Zellen länger gehungert, steigt zum einen die
Hintergrund AP-1 Aktivität an (Spur 10), gravierender noch aber nimmt die Stimulierbarkeit
der Zellen ab (Spur 7&8 bzw. 10&11).
11
12
7
9
-
8
TP
A
7
G2
6
16
TP
A
5
7
7
4
TP
A
-
3
14
G2
1
-
2
7
TP
A
-
H. pylori Stamm :
12
G2
11:30
G2
Hungern [h] :
Exp 33 : Einfluß der Länge der Hungerzeit auf die AP-1 Induzierbarkeit in AGS-Zellen.
AGS Zellen wurden für unterschiedliche Zeiten Serum verarmt und anschließend für 1h mit H.pylori
G27 oder TPA (100ng/ml) stimuliert. Zellextrakte wurden im EMSA auf aktiviertes AP-1 untersucht.
Ad (2)
Eine weitere Möglichkeit, die zu hohen Hintergrundaktivitäten von AP-1 im EMSA führen
kann, wird durch die posttranslationale Regulierung von AP-1 bedingt. Wird AP-1 an den
Stellen Thr231, Ser243 und Ser249 durch Phosphatasen, die sich in jeder Zelle befinden und
bei der Erstellung der Zellextrakte ihre Wirkung an den AP-1 Molekülen entfalten können,
dephosphoreliert, erhöht sich hierdurch die DNA-Bindungsaffinität von AP-1 [Boyle, 1991].
Prinzipiell gibt es zwei Möglichkeiten, die Phosphatasen zu inhibieren : Man kühlt die
Zellkulturschalen direkt nach Beendigung des Stimulationversuches für die Zeit der
Proteinextraktgewinnung auf Eis, und senkt so die enzymatische Aktivität der Phosphatasen.
Alternativ kann man Phosphatase Inhibitoren (NaF, Na Pyrophosphat, Na Vanadat) dem
Lysis-Puffer hinzufügen.
- 52 -
4. Ergebnisse
Das Ernten und die Herstellung der Zellextrakte erfolgte von nun immer auf Eis.
Verschiedene Phosphatase Inhibitoren wurden bei Zellextrakten von unstimulierten Zellen
versus TPA-stimulierten Zellen ausgetestet (Abb. Exp 46). Bei AGS Zellen konnten die
besten Resultate mit Hinzufügen von 5mM Na3VO4 und 50mM NaF zum Lysis-Puffer erzielt
werden (Spur 7-10). Bei den KATO III Zellen ergaben sich auch nach Hinzugabe der
Phosphatase Inhibitoren oder Veränderung der Hungerzeiten (s.o.) keine wirklich
zufriedenstellende Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Dies mag unter anderem dadurch erklärt
werden, daß viele Tumorzellinien eine konstitutiv aktivierende ras-Mutation besitzen, die zu
permanent aktiven MAP-Kinasen und AP-1 führt, unabhängig, ob die Zellen vorher gehungert
wurden oder nicht. Aus diesem Grunde wurde für die weiteren Experimente v.a. die AGS-
4
35
50 0 mM
mM N
Na aC l
F
i
35
5 m 0 mM
M
Na NaC
l
3 VO
35
30 0 mM
mM N
Na aC l
PP
TP
A
5
TP
A
-
TP
A
-
4
-
3
TP
A
2
-
NF
To -κB
tex
1
TP
A
-
Lysis Buffer :
H. pylori Stamm :
27
0m
MN
aC
l
Zellinie verwendet.
6
7
8
10
9
Exp 46 : Einfluß des Lysispuffer auf die DNA-Bindungsaktivität von aktivierten AP1Molekülen.
Serumgehungerte AGS Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder für 1h mit TPA stimuliert
(100ng/ml). Anschließend wurden die Zellen auf Eis geerntet, Zellextrakte mit verschiedenen
Lysispuffer erstellt und dann im EMSA auf aktiviertes AP-1 untersucht.
Desweiteren wurde auch ein Lysis-Puffer der Firma NEB zur Herstellung von
Proteinextrakten für MAP-Kinase Assays, der auch Phosphatase Inhibitoren enthält, auf die
Tauglichkeit für EMSA getestet. Für AP-1 EMSA ergaben sich im Vergleich zu dem eigenen
Lysis Puffer mindestens gleichwertige Ergebnisse (Abb. Exp 62), bei den NF-κB EMSA
waren die Ergebnisse mit NEB Lysis-Puffer in punkto Auflösen der einzelnen DNA-Protein
Komplexe in der PAGE sogar besser (Daten nicht gezeigt). Da die mit NEB Lysis-Puffer
erstellten Proteinextrakte sowohl für EMSA, als auch für MAP-Kinase Assays und Western
Blots benutzt werden konnten, wurde dieser fortan eingesetzt.
4
5
6
7
TP
A
3
G2
7
TP
A
2
-
1
G2
H. pylori Stamm :
-
Lysis Buffer :
4. Ergebnisse
NE
B
NF
To -κB
te x
- 53 -
Exp.: 62 : Vergleich von NF-κB Lysis-Puffer mit Lysis-Puffer von NEB.
Serumgehungerte AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen oder für 1h mit H.pylori G27 oder TPA
(100ng/ml) stimuliert. Anschließend wurden die Zellen auf Eis geerntet, Zellextrakte mit
verschiedenen Lysis-Puffer erstellt und dann im EMSA auf aktiviertes AP-1 untersucht.
4.2
H.pylori induziert AP-1 in AGS Zellen
Als erstes sollte untersucht werden, ob H.pylori den Transkriptionsfaktor AP-1 in AGS-Zellen
aktivieren kann. Die Kokultivierung von AGS Zellen mit verschiedenen H.pylori Stämmen
für 1h führt – nach Herstellen der Zellextrakte und Analyse im EMSA - zum Erscheinen neuer
DNA-Protein Komplexe (Abb. Exp 96), die durch einen Kompetitionsassay als AP-1
identifiziert wurden (Abb. Exp 37, Spur 11,12). Dabei variiert die Fähigkeit, AP-1 Komplexe
zu induzieren, unter den verschiedenen H.pylori : während die Stämme G27 und ATCC
43405 deutliche DNA-Protein-Banden (Spur 2,5) erzeugten, zeigten Stamm 151 und NTCT
11638 mittlere Aktivierung von AP-1 (Spur 3,4). Der cag A- Stamm 2012, der somit als
apathogen eingestuft wird, vermochte keine Aktivierung von AP-1 (Spur 6). Als
Negativkontrolle wurden unstimulierte Zellen verwendet (Spur 1), zur Positivkontrolle TPA
stimulierte Zellen (Spur 7).
4.2.1
Identifikation der AP-Untereinheiten
-
4. Ergebnisse
NT
CT
AT 1163
CC
8
43
40
20
12
5
TP
A
H.pylori Strain :
G2
7
15
1
- 54 -
Exp. 96 : AP-1 Induktion in AGS Zellen durch verschiedene H.pylori Stämme
1 2Zellen
3 wurden
4
5für 6
7 verschienen cagA+ H.pylori Stämmen (G27, 151,
Für 12h serumdeprivierte
1h mit
NTCT,ATCC) und cagA Stämmen (2012) kokultiviert. Zellextrakte wurden im EMSA auf
aktiviertes AP-1 untersucht.
AP-1 tritt als Homo- oder Heterodimer auf, wobei sich die Subeinheiten aus den
Portoonkogenfamilien Fos (c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2), Jun (c-Jun, JunB, JunD) und ATF
(ATF2, ATF3, B-ATF) rekrutieren. Die Zusammensetzung des Homo- oder Heterodimeres
beeinflußt die DNA-Affinität und Spezifität sowie die Transaktivierungsfähigkeit. Um die
genaue Zusammensetzung des durch H.pylori induzierten AP-1 zu bestimmen, wurde eine
Supershift Analyse durchgeführt. Der Antikörper α-c-Fos all, der allgemein Proteine der FosFamilie erkennt, und der Antikörper α-c-Fos führten zu einem Shift der Bande (Abb. Exp37,
Spur 3,4), die Antikörper α-Fra1 und α-Fra2 hatten keinen Einfluß auf den DNA-Protein
Komplex (Abb. Exp37, Spur 5,6). Analog zeigten die Antikörper α-c-Jun und α-c-Jun all
(erkennt alle Jun-Proteine) Interaktion mit dem AP-1 Komplex (Abb. Exp37, Spur 7,8), nicht
jedoch die Antikörper gegen JunB und JunD (Abb. Exp37, Spur 9,10). Zusammengefaßt
besteht der durch H.pylori G27 induzierte AP-1 Komplex v.a. aus einem Heterodimer von cJun und c-Fos.
Antibody :
-
-
Fr
a-
Competitor :
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
H.pylori G27 :
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
-
-
AP
-1
NF
-κB
2
c-J
un
a ll
c-J
un
Ju
nB
Ju
nD
4. Ergebnisse
Fr
a-
1
s
c-F
o
c-F
o
sa
ll
- 55 -
+
+
11 12
Exp 37 : Supershift und Kompetitionsanalyse von H.pylori aktivierten AP-1
AGS Zelle wurden für 1h mit H.pylori G27 kokultiviert und Zellextrakte im EMSA auf AP-1
Aktivität untersucht. Spur 1, unbehandelte Zellen; Spur 2, mit G27 stimulierte Zellen; Spur 3-10,
Zellextrakat von Spur 2 wurden mit angegebenem Antikörper oder nicht markierten Oligonukleotid
(100x Überschuß) inkubiert. Das ausgefüllte Dreieck markiert die Position des AP-1/DNA
Komplexes, während der gefüllte Kreis die Lage der Antikörper/AP-1/DNA Komplexe markiert.
Das mittlere Dreieck kennzeichnet ungebundenes Oligonukleotid.
4.2.2
Kinetik der AP-1 Aktivierung
Neben der Zusammensetzung des AP-1 Dimers ist auch der zeitliche Verlauf entscheidend für
die physiologische Wirkung – siehe auch Einleitung (1.8.2). Die AP-1 Aktivierung erreichte
nach 90-120 min ihr Maximum (Abb. EXP115, Spur 5,6) und dauerte über mehrere Stunden
an (Abb. EXP 92). H.pylori bewirkt also eine anhaltende AP-1 Aktivierung mit einem
Maximum nach 90-120 min.
4. Ergebnisse
45
60
90
15
30
60
90
90
Zeit (h) :
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
G2
G2
G2
TP
A
TP
A
30
7
20
1
15
7
H. pylori :
0
H. pylori :
Zeit (min) :
2
7-∆
G
- 56 -
0
2
4
6
2
4
12
13
14
15
16
17
Exp. 115 : Kinetik der AP-1 Stimulation durch verschiedene H.pylori Stämme
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 1) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori G27
(Spur 2-6, 12-15) bzw. der isogenen Mutante G27-∆G (Spur 7-9), H.pylori 2012 (Spur 10) oder TPA
(100ng/ml) (Spur 11, 16,17) kokultiviert. Zellextrakte wurden im EMSA auf aktiviertes AP-1
untersucht.
4.2.3
Aktivierung von AP-1 durch Mutanten des H.pylori Stamm G27
In früheren Arbeiten aus unserem Labor konnte A. Münzenmeier und E. Glocker zeigen, daß
für die Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-κB durch H.pylori bakterielle Gene
notwendig sind, die auf der Pathogenitätsinsel cag I lokalisiert sind. Wie in der Einleitung
beschrieben, kodieren diese Gene für einen Typ IV Sekretionsapparat, der entweder selbst
durch Zelloberflächenkontakt für die NF-κB Aktivierung verantwortlich ist, oder für die
Sekretion eines NF-κB induzierendem Agens. Wir interessierten uns nun für die Gene, die für
die AP-1 Aktivierung notwendig sind. Hierfür wurden 12 isogene Mutanten des Stammes
G27, jede in einem Gen der Pathogenitätsinsel verändert, im EMSA auf ihre Fähigkeit
getestet, AP-1 zu induzieren. Mutationen in cagF und cagN veränderten nicht die Fähigkeit
von H.pylori G27 AP-1 zu aktivieren (Abb. EXP 65, Spur 4,13,14), wohingegen H.pylori
G27 mit Mutationen in cagE, cagG, cagH, cagI, cagL und cagM AP-1 nicht über
Hintergrundniveau zu aktivieren vermochten (Abb. EXP 65, Spur 3,5-12). Interessanterweise
stimmen diese Ergebnisse exakt mit denen für die Aktivierung von NF-κB überein [Glocker,
1998]; dieses Ergebnis spricht dafür, daß dieselben Pathogenitätsgene für die Aktivierung von
NF-κB und AP-1 verantwortlich sind, obwohl diese Transkriptionsfaktoren über ganz
- 57 -
4. Ergebnisse
unterschiedliche intrazelluläre Signaltransduktionswege reguliert werden. AP-1 kann durch
1
2
3
4
5
6
7
8
G2
7-∆
L
G2
7-∆
M
G2
7-∆
M
G2
7-∆
M
G2
7-∆
N
G2
7-∆
N
20
12
20
74
-
G2
7-∆
E
G2
7-∆
F
G2
7-∆
G
G2
7-∆
H
G2
7-∆
H
G2
7-∆
I
H.pylori Strain :
G2
7
eine Vielzahl von Signalwegen aktiviert werden, u.a. durch MAP Kinase Kaskaden.
9
10
11 12 13 14 15 16
Exp 65 : AP-1 Stimulation durch H.pylori mit Mutationen in der cag Pathogenitätsinsel
AGS Zelle wurden für 1h mit H.pylori G27 (Spur 2) und isogenen Mutanten (Spur 3-14), sowie den
cagA- Stämmen 2012 & 2074 kokultiviert. Kontroll-Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 1).
Zellextrakte wurden im EMSA auf aktiviertes AP-1 untersucht.
4.3
H.pylori aktiviert die ERK/MAP Kinase Kaskade
Verschiedene MAP-Kinase Kaskaden, u.a. der ERK, der SAPK/JNK und der p38
Signaltransduktionsweg, spielen in der Regulation von AP-1 eine wichtige Rolle. Um die
Signalkaskaden, durch die H.pylori AP-1 aktiviert, näher zu untersuchen, kann man sich
verschiedener Methoden bedienen. Ein indirekter Nachweis ist durch spezifische Inhibition
einer bestimmten Kinase möglich, entweder durch einen spezifischen chemischen Inhibitor
oder genetischen Knock-out bzw. Transfektion der entsprechenden isogen dominant
negativen Kinase. Der chemische Inhibitor beherbergt immer das Problem der Spezifität : mit
welcher Konzentration kann man spezifisch die zu untersuchende Kinase möglichst
- 58 -
4. Ergebnisse
vollständig inhibieren, ohne andere Enzyme zu beeinflussen ? Für die MEK1/2-Kinase
existieren zwei in der Fachliteratur anerkannte Inhibitoren, PD 98059 und U0126 [Dudley,
1995; Favata 1998]. Zellen mit einem Knock-out für die betreffende Kinase sind ein ideales
System, aber wegen den oft letalen oder proliferationsinhibierenden Auswirkungen des
Knock-out schwer zu realisieren. Die Überexpression einer dominant negativen Mutante der
zu untersuchenden Kinase ist eine oft verwendete Methode für die Untersuchung von
Signaltransduktionswegen. Jedoch bedeutet die unphysiologisch starke Expression der
dominant negativen Mutante eine Veränderung zum physiologischen Ruhezustand der Zelle,
so daß gewonnene Ergebnisse unter dieser Veränderung zu sehen sind.
In dieser Arbeit wurden die chemischen Inhibitoren von MEK1/2, PD 98059 und U0126,
verwendet. AGS-Zellen wurden 30 min vor der Stimulation durch H.pylori und TPA als
Positivkontrolle mit unterschiedlichen Konzentration der Inhibitoren behandelt. Beide
Inhibitoren führten bei Konzentrationen von 10 µM (PD 98059) bzw. 1 µM (U0126) zu einer
PD 98059
Inhibitor :
Concentration (µM) :
-
-
0.1
1
10 50
H.pylori G27 :
-
+
+
+
+
+
1
2
3
4
5
6
Inhibitor :
U0126
Concentration (µM) :
-
-
0.1
1
10
-
H.pylori G27 :
-
+
+
+
+
-
1
-
10
-
TPA :
-
-
-
-
-
+
+
+
1
2
3
4
5
6
7
8
Exp 49 : Effekt von MAP Kinase Inhibitoren auf die Stimulation von AP-1 durch H.pylori
AGS Zellen wurden 30 min vor Stimulationbeginn mit PD98059 oder U0126 in den angegebenen
Konzentrationen inkubiert. Daraufhin wurden sie für 1h mit H.pylori G27 oder TPA kokultiviert.
Zellextrakte wurden im EMSA auf aktiviertes AP-1 untersucht.
- 59 -
4. Ergebnisse
vollständigen Inhibition der AP-1 Aktivierung durch H.pylori G27 (Abb. Exp 49,79). Dies
bedeutet unter der Prämisse der Spezifität (s.o.) eine notwendige Beteiligung des MEK1 –
ERK 1/2 Signaltransduktionsweges an der Aktivierung von AP-1 durch H.pylori.
Der direkte Nachweis, ob H.pylori eine bestimmte Signalkaskade aktiviert, ist u.a. durch
einen Kinase Assay möglich. Hierfür wurden AGS-Zellen mit H.pylori G27 bzw. H.pylori
G27 und 2012, sowie TPA als Positivkontrolle, stimuliert und Zellextrakte erstellt. Aktivierte
MEK1/2 wurde mit einem phosphospezifischen Antikörper gegen phospho-Ser-217 und
phospho-Ser-221 immunpräzipitiert – dies sind die Regulationsstellen für MEK1, eine
Phosphorelierung entspricht der Aktivierung des Enzyms. Anschließend wurde die
Phosphorelierungs/Kinase Aktivität des Immunpräzipitats in vitro mit ERK2 als Substrat
getestet und der Phosphorelierungsgrad von ERK2 dann im Westernblot mit einem
H.
-
H.
-
Treatment :
py
lor
py i G27
TP lori G
A
27
phosphospezifischen Antikörper gegen phospho-Thr-202 und phospho-Tyr-204 gemessen.
ERK P
ERK
1
2
4
5
6
Exp 71 : H.pylori induziert MEK1/2 in AGS Zellen
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2,3) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 4,5) oder
TPA (100ng/ml) (Spur 6) stimuliert. Anschließend wurden die Zellextrakte mit einem Antikörper
gegen aktivierte MEK1/2 Kinase immunpräzipitiert. Spur 1, Größenmarker. (Oben) Die präzipitierte
Kinase wurde in einem in vitro Kinase Assay auf ihre Aktivität überprüft, wobei rekombinantes
ERK-2 als Substrat diente. Daraufhin wurde der Phosphorelierungsgrad des Substrates im
Westernblot mit einem phosphospezifischen Antikörper gegen ERK-2 detektiert. (Unten) Der
Westernblot wurde gestrippt und mit einem Antikörper gegen ERK-2 dekoriert.
- 60 -
4. Ergebnisse
Mit H.pylori G27 kokultivierte Zellen wiesen eine deutliche Phosphorelierung von ERK2 auf
(Abb. Exp71, Spur 3), was auf eine Aktivierung von MEK1/2 durch H.pylori G27 hinweist.
Als Kontrolle, daß in jedem Ansatz gleiche Mengen an ERK2 verwendet wurden, wurde der
Westernblot gestrippt und mit einem Antikörper gegen ERK2 neu dekoriert – in allen Spuren
waren gleiche Mengen ERK2 vorhanden (Abb. Exp71).
Die Phosphorelierung von ERK durch MEK1 führt zu einer Aktivierung dieser Kinase, die
wiederum ihrerseits den Transkriptionsfaktor Elk-1 phosphoreliert und damit aktiviert. Es
steht zu erwarten, daß die Aktivierung von MEK1 durch H.pylori G27 konsekutiv zu einer
Aktivierung von ERK1/2 führt. Dies wurde nun in einem weiteren Kinase-Assay für ERK1/2
H.
H.
-
Treatment :
py
lor
py i G2
7
TP lori 2
A
01
2
überprüft. Die Immunpräzipitation erfolgte mit einem phosphospezifischen Antikörper gegen
Elk-1 P
Elk-1
1
2
3
4
5
Exp 76 : H.pylori induziert ERK in AGS Zellen
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 3) bzw. 2012
(Spur 4) oder TPA (100ng/ml) (Spur 5) stimuliert. Anschließend wurden die Zellextrakte mit einem
Antikörper gegen aktivierte ERK1/2 Kinase immunpräzipitiert. (Oben) Die präzipitierte Kinase
wurde in einem in vitro Kinase Assay auf ihre Aktivität überprüft, wobei rekombinantes Elk-1 als
Substrat diente. Daraufhin wurde der Phosphorelierungsgrad des Substrartes im Westernblot mit
einem phosphospezifischen Antikörper gegen Elk-1 detektiert. (Unten) Der Westernblot wurde
gestript und mit einem Antikörper gegen Elk-1 dekoriert.
- 61 -
4. Ergebnisse
ERK (Thr-202 und Tyr-204), welches die Regulationsstellen von ERK1/2 sind. Als Substrat
diente das physiologische Substrat Elk-1, dessen Phosphorelierungsgrad mit einem
phosphospezifischen Antikörper (Ser-383) im Western Blot detektiert wurde. Während
H.pylori G27 eine starke Phosphorelierung von Elk-1 bewirkte, was einer starken Aktivierung
von ERK1/2 entspricht, führte der cag A- H.pylori Stamm 2012 nur zu einer sehr schwachen
Elk-1 Phosphorelierung / ERK1/2 Aktivierung (Abb. Exp76). Auch dieser Westernblot wurde
gestrippt und zur Kontrolle mit einem Antikörper gegen Elk-1 dekoriert, was gleiche Mengen
Substrat in allen Ansätzen ergab (Abb. Exp76).
Für die Frage, ob H.pylori auch in vivo zu einer Phosphorelierung und Aktivierung von Elk-1
führt, wurden die Zell-Extrakte aus dem letzten Versuch im Westernblot mittels eines
phosphospezifischen Antikörpers gegen Elk-1 getestet. Wiederum zeigte sich, daß H.pylori
G27, nicht aber der cag A- Stamm 2012 eine Phosphorelierung und damit Aktivierung von
Elk-1 vermag (Abb. Exp 82). Der Nachweis, daß in allen Ansätzen gleiche Mengen an Elk-1
vorhanden waren, konnte aufgrund der physiologisch extrem geringen Konzentration von Elk1 sowie der hierfür nicht ausreichend hohen Sensitivität des „normalen“, nicht
phosphospezifischen Antikörpers gegen Elk-1 nicht direkt erbracht werden, eine Färbung des
ri 2
py
lo
TP
A
-
H.
Treatment :
H.
py
lo
ri G
27
01
2
Blots in Poinceau-Rot zeigte jedoch gleiche Mengen an Gesamtprotein in allen Spuren.
Elk-1 P
1
2
3
4
5
Exp. 82 : H.pylori bewirkt Phosphorelierung von Elk-1
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 3) bzw. 2012
(Spur 4) oder TPA (100ng/ml) (Spur 5) stimuliert. Spur 1, Größenmarker. Zellextrakte wurden im
Westernblot mit einem Antikörper analysiert, der spezifisch phosphoreliertes Elk-1 erkennt.
- 62 4.3.1
4. Ergebnisse
Kinetik der ERK Aktivierung
Da die Aktivität der MAP Kinasen exklusiv über die Phosphorelierung des Thr-X-Tyr Motivs
reguliert wird, kann der Aktivitätszustand der MAP Kinasen durch entsprechende
phosphospezifische Antikörper bestimmt werden. Dies bedeutet im Vergleich zum Kinase
Assay eine weniger komplexe Methode. Wir interessierten uns nun für den zeitlichen Verlauf
der durch H.pylori bewirkten ERK-Aktivierung. Hierzu wurden Proteinextrakte, mit denen
auch der zeitliche Verlauf für die AP-1 Aktivierung untersucht wurde (Abb. Exp 115), im
Westernblot mit einem Antikörper gegen das Motiv pTyr-E-pThr von aktivem ERK
untersucht. Die höchste Aktivität von ERK wurde nach 30-45 min erreicht (Abb. Exp 115 III;
Exp 115-3 : H.pylori bewirkt ERK Phosphorelierung in AGS Zellen.
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori
G27 (Spur 3-7) bzw. der isogenen Mutante G27-∆G (Spur 8-10), H.pylori 2012 (Spur 11) oder TPA
(100ng/ml) (Spur 12) kokultiviert. Spur 1, Größenmarker. Zellextrakte wurden im Westernblot mit
einem Antikörper analysiert, der spezifisch phosphoreliertes ERK1/2 erkennt. Der Blot wurde
gestrippt und mit einem nicht phosphospezifischen Antikörper gegen ERK1/2 redekoriert.
- 63 -
4. Ergebnisse
Spur 4,5). Der cagA- H.pylori Stamm 2012 sowie die isogene Mutante G27 ∆G vermochten
ERK nicht zu aktivieren (Abb. Exp 115 III; Spur 8-10,11). Für den Nachweis, daß sich in
jeder Spur gleiche Mengen an ERK befanden, der Unterschied der Banden also tatsächlich
verschiedene Phosphorelierungs/Aktivierungslevels repräsentierte, wurde der Blot gestrippt
und mit einem Antikörper, der sowohl phosphoreliertes wie unphosphoreliertes ERK erkennt
dekoriert.
4.4
H.pylori aktiviert JNK
Als nächstes stellten wir uns die Frage, ob H.pylori auch JNK aktivieren kann, die gleich wie
ERK den Transkriptionsfaktor Elk-1 zu phosphorelieren vermag, darüber hinaus aber auch die
Transaktivierungspotenz von c-Jun durch Phosphorelierung entscheidend erhöhen kann, und
über weitere Effektoren eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion von extrazellulären
Streß wie UV-Bestrahlung und präinflammatorischen Zytokinen spielt (s.Einleitung 1.8.3).
AGS Zellen wurden für die angegebenen Zeiten mit dem cagA+ H.pylori Stamm G27, dem
cagA- H.pylori Stamm 2012 sowie der isogenen G27-Mutante G27-∆G kokultiviert und
Proteinextrakte angefertigt. Diese wurden im Westernblot mit einem Antikörper, der
spezifisch das pThr-E-pTyr der aktiven JNK erkennt, analysiert. H.pylori stimuliert JNK;
dabei wurde das Maximum nach 30 min erreicht (Abb. Exp 115IV; Spur 4). Der cagAStamm 2012 sowie die Mutante G27-∆G hingegen bewirkten keine Aktivierung von JNK
(Abb. Exp 115IV; Spur 8-10,11). Um sicherzustellen, daß in allen Spuren gleiche Mengen an
JNK vorhanden waren, wurde der Blot gestrippt und mit einem nicht phosphospezifischen
Antikörper gegen JNK dekoriert.
- 64 -
4. Ergebnisse
Exp 115-4 : H.pylori bewirkt JNK Phosphorelierung in AGS Zellen.
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori
G27 (Spur 3-7) bzw. der isogenen Mutante G27-∆G (Spur 8-10), H.pylori 2012 (Spur 11) oder TPA
(100ng/ml) (Spur 12) kokultiviert. Spur 1, Größenmarker. Zellextrakte wurden im Westernblot mit
einem Antikörper analysiert, der spezifisch phosphoreliertes JNK1/2 erkennt. Der Blot wurde
gestript und mit einem nicht phosphospezifischen Antikörper gegen JNK1/2 redekoriert.
4.5
H.pylori induziert die Transkription von c-fos
Der c-fos Promoter enthält mehrere Kontrollelemente, u.a. ein „Serum Responsive Element“
(SRE). Die Aktivierung der MAPK/ERK führt zu Phosphorelierung des Transkriptionsfaktors
Elk-1, der dann als Teil des Tertianary Complex Factor (TCF) zusammen mit dem Serum
Response Factor (SRF) an das SRE im c-fos Promoter binden kann. Dies führt zu einer
Induktion der c-fos Transkription, und somit zu einem Ansteigen der c-fos mRNA. Wir
interessierten uns deshalb für die Frage, ob Kokultivation von AGS-Zellen mit H.pylori zu
einer Zunahme der c-fos mRNA führt. Hierzu wurden AGS-Zellen eine Stunde mit H.pylori
- 65 -
4. Ergebnisse
G27 oder mit TPA (100 ng/ml) stimuliert, Gesamt-RNA gewonnen und jeweils 10µg RNA im
Northernblot mit einer c-fos cDNA Sonde untersucht. Sowohl H.pylori als auch TPA
bewirkten einen deutlichen Anstieg von c-fos RNA, die bei unstimulierten Zellen nicht
detektierbar war (Abb. Exp 68). Zum Nachweis, daß in allen Spuren gleiche Mengen RNA
vorlagen, wurde der Blot gestrippt und mit einer Sonde für das Haushaltsgen β-Actin
-
-
H.
Treatment :
py
lor
TP
iG
A
27
hybridisiert.
28S
c-fos
18S
actin
1
2
3
4
Exp 68 : H.pylori induziert c-fos mRNA Expression in AGS Zellen
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 1,2) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 3) oder
TPA (100ng/ml) (Spur 4) inkubiert. Gesamt-RNA-Extrakte wurden angefertigt, und jeweils 10 µg
im Northernblot mit einer 500bp Sonde für c-fos untersucht (oben). Anschließend wurde der Blot
gestript, und mit einer 1200 bp Sonde für β-Actin rehybridisiert (unten). Die Positionen der 28S und
18S rRNA sind gekennzeichnet.
Für die Frage, ob die erhöhte c-fos RNA Menge auch zu einer verstärkten c-Fos Expression
mit erhöhter c-Fos Proteinkonzentration führt, wurden wieder AGS-Zellen für eine Stunde
(A) mit H.pylori G27 inkubiert, wobei in einem Ansatz die AGS Zellen 30 min vor
Stimulation mit dem MEK1/2 Inhibitor PD98059 behandelt wurden, oder (B) mit H.pylori
G27 und H.pylori 2012 kokultiviert. Zur Positivkontrolle wurden die Zellen mit TPA
stimuliert. Proteinextrakte wurden angefertigt und im Westernblot auf c-Fos Protein
- 66 -
4. Ergebnisse
untersucht. Stimulation von AGS-Zellen mit H.pylori G27 bewirkte eine deutliche c-Fos
Expression (Abb. Exp75B, Spur 3) gegenüber ruhenden Zellen (Abb. Exp75B, Spur 2),
wohingegen H.pylori 2012, der keine AP-1 Aktivierung im EMSA zeigte (Abb. Exp96, Spur
-
H.
PD 98059 :
-
-
+
-
Treatment :
-
H.
p
H. ylor
py i G
TP lori 27
20
A
12
Treatment :
H.
py
lor
py i G2
l
7
TP ori G
A
27
6), auch keine c-Fos Transkription induzierte (Abb. Exp75B, Spur 4).
c-Fos
1
2 3
4
c-Fos
5
Actin
1 2 3 4 5
Exp 75 : Effekt von H.pylori induziert c-Fos Proteinlevel in AGS Zellen
(A) AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 3,4) oder
TPA (100ng/ml) (Spur 5) stimuliert. AGS Zellen in Spur 4 wurden 30 min vor Stimulation mit
50µM PD98059 behandelt. Zellextrakte wurden im Westernblot mit einem Antikörper gegen cFos analysiert.
(B) AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 3) bzw.
2012 (Spur 4) oder TPA (100ng/ml) (Spur 5) stimuliert. Spur 1, Größenmarker. Zellextrakte
wurden im Westernblot mit einem Antikörper gegen c-Fos analysiert. Der Blot wurde gestript
und mit einem Antikörper gegen β-Actin redekoriert.
Der Inhibitor PD 98059 hob die Stimulation von c-Fos durch H.pylori vollständig auf (Abb.
Exp75A, Spur 4), was konsistent mit den früheren Ergebnissen ist, daß der MEK1/ERKSignaltransduktionsweg notwendig für die AP-1 Induktion durch H.pylori ist. Zur Kontrolle,
daß in jeder Spur gleiche Mengen an Protein geladen wurden, wurde der Blot gestrippt und
mit einem Antikörper gegen β-Actin dekoriert. Analog der Kinetik für AP-1 im EMSA (Abb.
Exp 115 & Exp 92), sollte nun mit denselben Proteinextrakten der zeitliche Verlauf der c-Fos
Proteinlevel im Westernblot studiert werden. c-Fos Protein erscheint zuerst nach 45 min
Stimulation mit H.pylori (Abb. Exp 115, Spur 5) und erreicht seine maximale Konzentration
gleich wie die AP-1 Bindungsaktivität im EMSA nach 90-120 min (Abb. Exp 115, Spur 6,7).
7
G2
H. pylori :
Zeit (min) :
4. Ergebnisse
TP
A
20
12
G2
7 -∆
G
- 67 -
0 15 30 45 60 90 90 90 90
c-Fos
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Stimulus :
Zeit (h) :
0
2
4
Se
G2
7
ru m
10
%
1
6
8
2
4
6
8
c-Fos
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Exp. 115 : Kinetik der c-fos Expression durch verschiedene H.pylori Stämme
(A) AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori
G27 (Spur 3-7) bzw. der isogenen Mutante G27-∆G (Spur 10), H.pylori 2012 (Spur 9) oder TPA
(100ng/ml) (Spur 8) kokultiviert. Zellextrakte wurden im Westernblot mit einem Antikörper
gegen c-Fos analysiert.
(B) Für die Langzeitkinetik wurden AGS Zellen unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die
angegebenen Zeiten mit H.pylori G27 (Spur 3-6) oder in serumhaltigen Medium (10%) (Spur 710) inkubiert. Zellextrakte wurden im Westernblot mit einem Antikörper gegen c-Fos analysiert.
4.6
H.pylori bewirkt c-Jun Phosphorelierung
Wie oben gezeigt wurde, besteht der durch H.pylori induzierte AP-1 Komplex aus c-Fos und
c-Jun (Abb. Exp37). c-Jun wird sowohl transkriptionell wie posttranslational durch
Phosphorelierung reguliert (siehe Einleitung 1.9.2). Wir gingen nun der Frage nach, auf
welche Weise H.pylori c-Jun aktiviert. Hierfür wurden AGS-Zellen für 15, 30, 60 und 90 min
- 68 -
4. Ergebnisse
mit H.pylori G27 sowie für 90 min mit H.pylori 2012 und TPA (Positivkontrolle) inkubiert.
Die Proteinextrakte wurden im Westernblot mit einem phosphospezifischen Antikörper für cJun (Ser-73) auf Phosphorelierung an dieser Stelle getestet. Inkubation von AGS-Zellen mit
H.pylori G27 für 60 min, stärker nach 90 min bewirkte eine solche Phosphorelierung,
wohingegen 90 min Inkubation mit H.pylori 2012 keine Phosphorelierung bewirkte.
Anschließend wurde der Blot gestrippt, und mit einem Antikörper gegen c-Jun (NEB) neu
dekoriert. Alle Proben zeigten eine vergleichbare Menge an c-Jun (Daten nicht gezeigt), was
darauf hinweist, daß H.pylori c-Jun durch Phosphorelierung und nicht transkriptionell
aktiviert.
Exp. 116 : H.pylori bewirkt c-Jun Phosphorelierung in AGS Zellen.
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori
G27 (Spur 1-5) bzw 2012 (Spur 6) oder TPA (100ng/ml) (Spur 7) kokultiviert. Zellextrakte wurden
im Westernblot mit einem Antikörper analysiert, der spezifisch an Ser-73 phosphoreliertes c-Jun
bindet.
- 69 -
4.7
4. Ergebnisse
Etablierung von Reportergen Versuchen
Nachdem im EMSA das Binden des Transkriptionsfaktors AP-1 an die Consensussequenz
nachgewiesen wurde, sollte nun die physiologische Wirkung dieser DNA-Protein Interaktion
mittels Reportergenversuche näher untersucht werden. Bei einem Reportergenkonstrukt
handelt es sich um ein Plasmid, das ein Reportergen – in dieser Arbeit wurde hierfür das
Luciferase-Gen gewählt – unter einem künstlichen Promoter beinhaltet. Je nach Versuch
besitzt dieser Promoter eine oder mehrere Bindungsstellen für den zu untersuchenden
Transkriptionsfaktor. Alternativ kann auch der Originalpromoter eines Genes oder Teile
davon verwendet werden, um die Regulation der Expression dieses Gens zu untersuchen.
4.7.1
Etablierung der Transfektion von AGS-Zellen
Bei der Transfektion werden DNA-Plasmide in eukaryontische Zellen eingeschleust. Hierfür
stehen eine Vielzahl von beschriebenen Methoden zur Verfügung :
(1)
Elektroporation
(2)
Calciumphosphat
(3)
Liposomale Transfektion
(4)
Virale / Retrovirale Transfektion
In dieser Arbeit wurden drei kommerzielle Transfektionskits auf liposomaler Basis – DOTAP
(Boehringer Mannheim), Fugene 6 (Boehringer Mannheim) und SuperFect (Qiagen) - für die
Eignung zur Transfektion der Magenepithelzellinie AGS getestet.
Folgende Parameter, die die Transfektionseffizienz beeinflussen, wurden optimiert :
•
Menge der zu transfizierenden DNA : 0,1 – 3 µg
•
Verhältnis DNA : Transfektionsagens
Desweiteren sind auch die Zeitpunkte, wann die Zellen transfiziert werden, wann stimuliert
wird und wann geerntet, wichtig für den Ausgang des Experimentes. Ein typischer Zeitplan
sah wie folgt aus :
- 70 -
4. Ergebnisse
Ausplattieren der
Zellen
30 -36 Stunden
Transfektion
8-10 Stunden
Serum
Deprivation
(optional)
6-10 Stunden
Stimulation
8 Stunden
Zellernte
Abb. : Zeitplan zur Transfektion von AGS-Zellen
Als erstes wurden die 3 liposomalen Transfektionsagentien miteinander verglichen. Hierzu
wurden 5*104 AGS Zellen in 2ml HAM’s F-12 SER+ für 24h kultiviert und dann mit einem
CMV-Luciferase Konstrukt transfiziert – dabei wurden folgende Menge an DNA und
Transfektionsagens benutzt :
Methode
DNA [µg]
Ratio DNA:Agens
max. RLU
Superfect
1-4
1:1 – 1:10
350000
DOPTAP
1-3
1:5 – 1:10
900000
Fugene 6
0,5 – 3
2:3 – 1:4
4000000
Nach 15h Transfektionsdauer wurden die Zellen geerntet und die Luciferase Aktivität, welche
unter identischen Bedingungen ein Maß für die Transfektionseffizienz des jeweiligen Agens
darstellt, bestimmt.
Für die Superfect Methode nahmen die RLU mit steigender Menge an DNA zu, das beste
Verhältnis von DNA zu Agens lag bei 1:1 – 1:2 . Anzumerken ist auch, daß bei größeren
Mengen Superfect (ab 10µl) die Zellen sichtlich in Mitleidenschaft gezogen wurden und eine
Großteil der Zellen Apoptose begangen.
- 71 -
4. Ergebnisse
DOTAP zeigte bei kleineren DNA-Mengen (1 µg) gute Ergebnisse, das beste Verhältnis von
DNA zu Agens betrug 1:7,5. Auch hier wirkte das Agens bei größeren Mengen (ab 15 µl)
zytotoxisch.
Mit Fugene 6 ließen sich die besten Ergebnisse erzielen. Besonders geeignet erwies sich ein
Verhältnis von 2 µg DNA zu 3 µl Fugene 6. Darüberhinaus war Fugene 6 auch am wenigsten
zytotoxisch.
Superfect
400000
350000
RLU
300000
250000
RLU
200000
150000
100000
50000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1:1 1:1 1:1 1:2 1:2 1:2 1:5 1:5 1:5 1:10
11
12
1:10
- 72 -
4. Ergebnisse
DOTAP
1000000
800000
600000
400000
RLU
200000
0
1
2
3
4
5
6
1:5
1:75
1:10
1:5
1:7,5
1:10
Fugene 6
5000000
RLU
4000000
3000000
RLU
2000000
1000000
0
1
2
3
4
5
6
2
2
2
3
3
3
Exp86: Transfektion eines pCMV-Luc in AGS Zellen mittels verschiedener liposomaler
Transfektionskits
(A) AGS Zellen wurden mit den angegebenen Mengen an pCMV-Luc Plasmids und Superfect
Transfektionsagenz (Qiagen) transient transfiziert. Nach 2 Stunden Inkubation der AGS Zellen
mit den DNA-Liposom Komplexen wurde das Medium ausgetauscht. Nach weiteren 13h
wurden die Zellen geerntet und die Zellextrakte auf die Luciferase Aktivität unter Verwendung
des Luciferase ReportergenAssay Systems (Promega) mit einem Luminometer (EG&G Bertold)
gemessen.
(B) Analog (A), jedoch wurde das DOTAP Transfektionsagnz (Boehringer/ Mannheim) verwendet.
Es erfolgte kein Mediumwechsel. Die Zellen wurden 15h nach Transfektion geerntet und auf
Luciferase Aktivität untersucht.
(C) Analog (B), jedoch wurde das Fugene6 Transfektionsagens (Boehringer/ Mannheim)
verwendet.
4.7.2
Serumdeprivation
Da Serum AP-1 aktiviert und Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase konstitutiv
aktives AP-1 aufweisen (vgl. Abschnitt über Etablierung des AP-1 EMSA), sollte nun der
- 73 -
4. Ergebnisse
Frage nachgegangen werden, ob sich das Verhältnis der Luciferase Aktivität von
unstimulierten Zellen zu TPA-stimulierten Zellen dadurch verbessern ließe, in dem man vor
einer 4-8 stündigen Stimulation eine Hungerphase von 6h einlegen würde, um so die Zellen in
die Ruhephase G0 zu bringen.
Subkonfluent gewachsene Zellen wurden mit 2 µg von dem AP-1 Reportergenkonstrukt pAP1 oder dem Kollagenreporterkonstrukt pKoll-Luc, das eine AP-1 Bindungsstelle beinhaltet,
mit dem Fugene Reagens transfiziert. Nach 15 h Transfektion wurden die Zellen entweder für
6h gehungert (Mediumwechsel mit serumfreien Medium) oder ohne Hungerphase für 4, 6 und
8 h mit 100 ng/ml TPA stimuliert. Die größten Unterschiede bzgl. der normalisierten RLU
(relative Luciferase Einheiten) zwischen unstimulierten und stimulierten Zellen wurden bei 6h
Hungern und 8h Stimulation erreicht. Die Normalisierung erfolgte durch 50ng
kotransfizierten Renilla-Luciferase-Normalisierungsvektor.
AP-1 Induktion nach Serum Deprivation
25,00
20,00
15,00
Luc/ Ren
10,00
5,00
0,00
Stimulation [h] : 0
Stimulus :
ø
4
4
ø TPA
6
ø
Reporter :
Hungern [h] :
6
TPA
8
ø
8
0
TPA ø
4
ø
4
TPA
6
6
ø TPA
8
ø
8
TPA
pAP-1
0
6
ø
6
8
TPA ø
8
TPA
pKoll-Luc
6
Exp97: AP-1 Stimulation im Reportergenversuch in AGS Zellen nach Serum Deprivation
Ein subkonfluente Monolayer von AGS Zellen wurde mit 2 µl pAP-1 Reporterplasmid (Spur 1-14)
bzw. pKoll-Luc Reporterplasmid (Spur 15-18) und 3µl Fu6 Transfektionsagenz transient
transfiziert. Als Normierung wurden 50ng ptk-Renilla kotransfiziert. Nach 15h Transfektion wurden
die Zellen entweder sofort mit TPA für die angegebene Zeit stimuliert (Spur 1-7) oder vor
Stimulation für 6h serumdepriviert (Spur 8-18) und dann stimuliert. Anschließend wurden die Zellen
geerntet und Zellextrakte auf Luciferaseaktivität untersucht.
Zur Kontrolle, ob die verstärkte RLU-Antwort tatsächlich auf die AP-1 Bindestelle vor dem
tk-Promoter in dem pAP-1 Vektor zurückzuführen ist, es sich also um eine AP-1 induzierte
Antwort handelt, wurde neben dem pAP-1 Plasmid auch das Mutter-Plasmid pTal, das nur
den tk-Promoter vor dem Luciferase Gen beinhaltet, sowie das Reporterkonstrukt pSRE,
welches Serum Responsive Elements als Enhancer besitzt, transfiziert. Der Zeitplan war
folgender : Tansfektionszeit 10h, Hungerphase 6h, Stimulation 8h.
- 74 -
4. Ergebnisse
Auch bei den mit dem Basisvektor pTal transfizierten Zellen wiesen die TPA-stimulierten
Zellen eine 3fach erhöhte Luciferase Aktivität auf; verglichen mit den Induktionsraten der
pAP-1 oder pSRE transfizierten Zellen, die bei 8-10 lagen, lagen sie aber deutlich niedriger.
Es handelt sich also zumindest zu einem wesentlichen Teil um AP-1 und SR-Faktor
vermittelte Prozesse. H.pylori ist somit in der Lage, physiologisch aktives AP-1 und SRF in
ähnlicher Stärke zu induzieren wie TPA.
G27 induziert pAP-1 und pSER
12
10
8
Induction
6
4
2
0
Stimulus : ø
Reporter :
TPA
pTal
ø
G27
pAP-1
TPA
ø
G27
TPA
pSER
Exp98 : H.pylori induziert AP-1 abhängige Luciferase Konstrukte
AGS Zellen wurden mit 2µl Reporterkonstrukt ohne TF-Bindungsstellen (pTal – Spur 1-3), AP-1
Bindungsstellen (pAP-1) (Spur 4-6) oder SRF-Bindungsstellen sowie 3 µl Fu6 transient transfiziert.
Als Normierung wurden 50ng ptk-Renilla kotransfiziert. Nach 15h Transfektion wurden die Zellen
für 6h serumdepriviert und anschließend für 8h unbehandelt gelassen oder mit H.pylori G27 oder
TPA stimuliert. Zellextrakte wurden auf Luciferaseaktivität untersucht. Die gemessenen RLU
(Relative Light Units) wurden mit den RLU-Werten der Renilla Luciferase normiert. Die
unstimulierten Kontrolen wurde der Wert 1,0 zugewiesen und die stimulierten Werte jeweils auf
diesen bezogen.
In weiteren Versuchen wurde versucht, durch andere Wahl der Transfektion- / Hunger- /
Stimulations-Zeiten die Aktivierung des Basiskonstrukts pTal zu minimieren, aber es wurden
hierdurch auch die Induktionsraten der Plasmide pAP-1 und pSRE verändert (Daten nicht
gezeigt).
- 75 -
4.8
4. Ergebnisse
H.pylori induziert AP-1 und SRF abhängige Genexpression
AGS-Zellen wurden mit dem Basisvektor pTal sowie den AP-1 bzw. SRF getriebenen
Luciferase-Konstrukten pAP-1 und pSRE transfiziert und mit dem cag A+ H.pylori Stamm
G27 sowie dem cag A- H.pylori Stamm 2012 für 8 Stunden stimuliert. Als Negativkontrolle
wurden die Zellen unstimuliert gelassen, als Positivkontrolle diente TPA. Sämtliche Stimuli
führten zu einer unspezifischen Aktivierung des Basisvektors pTal um den Faktor 2-3. Der
cag A+ H.pylori Stamm G27, nicht jedoch der CagA - H.pylori Stamm 2012 vermochte eine
deutliche AP-1 bzw. SRF abhängige Antwort um den Faktor 5 bzw. 7 zu induzieren. Dies ist
konsistent mit den Ergebnissen für Aktivierung der MEK1-ERK1/2-Elk-1 Signalkaskade,
welche zur Induktion von SRF und konsekutiv von AP-1 führt, durch H.pylori G27, nicht
jedoch durch H.pylori 2012. Der Promoter von c-fos besitzt eine SRF-Bindungsstelle – und,
wie oben gezeigt wurde, führt die Stimulation mit H.pylori G27, nicht jedoch durch H.pylori
2012 zur Expression von c-fos. So fügen sich die Ergebnisse dieses Reportergenversuches
nahtlos in die früher erhobenen Ergebnisse und untermauern diese somit bezüglich ihrer
physiologischen Relevanz – es wird nicht nur Elk-1 phosphoreliert, es ist auch in der Lage,
SRF-abhängige Genexpression zu induzieren.
Indutkion von pAP-1 und pSER durch G27 und 2012
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
Induction
3,00
2,00
1,00
0,00
Stimulus :
Reporter :
ø
G27 2012 TPA
pTal
ø
G27 2012 TPA
pAP-1
ø
G27 2012 TPA
pSER
Exp110 : Abhängigkeit des cag Status von H.pylori auf die Induktion AP-1 abhängiger
Luciferase Konstrukte
Transfektion und Stimulation erfolgte analog zu Exp. 98. Zusätzlich wurde hier der cagA- H.pylori
Stamm 2012 auf die Induktion AP-1 abhängiger Luciferase Konstrukte untersucht.
- 76 4.9
4. Ergebnisse
H.pylori induziert keine MRE abhängige Genexpression
Die Exposition mit Metallen, wie z.B. Zink, bedeutet für die meisten Zellen eine
Stresssituation und führt oft zur Aktivierung einer Metall-Responsive-Element (MRE)
induzierten Genexpression, u.a. auch von Metalloproteinasen. Da die chronische Infektion mit
H.pylori auch eine andauernde Stressituation darstellt, untersuchten wir, ob die Stimulation
von AGS-Zellen mit H.pylori G27 eine MRE-abhängige Genexpression bzw. eine
Aktivierung des Promoter der mMTE bewirken kann. Hierzu wurden AGS Zellen mit den
Reportergenkonstrukten p4xMRE und pmMTE transfiziert und für 4 Stunden mit H.pylori
G27 kokultiviert; zur Positivkontrolle wurden die Zellen mit 200 µM ZnSO4 stimuliert. Die
mit
ZnSO4
behandelten
Zellen
wiesen
eine
sehr
deutliche
Aktivierung
beider
Reporterplasmide auf, wohingegen bei den mit H.pylori G27 stimulierten Zellen sich kein
Unterschied zu den unstimulierten Zellen ergab. H.pylori G27 führt demnach nicht zu der
Induktion einer MRE-abhängigen Genexpression – die Infektion mit H.pylori scheint
demnach molekularpathologisch nicht mit der Stressituation durch Metallexposition
vergleichbar zu sein.
G27 bewirkt keine MRE Antwort
12,00
10,00
8,00
6,00
Induction
4,00
2,00
0,00
ø
G27
ZnSO4
ø
G27
ZnSO4
Exp117 : Effekt von H.pylori G27 auf Induktion MRE-abhängiger Genexpression
AGS Zellen wurden mit 2µl Reporterkonstrukt pmMTE (Spur 1-3), oder Reporterkonstrukt
p4xMRE (Spur 4-6) sowie 3 µl Fu6 transient transfiziert. Als Normierung wurden 50ng ptk-Renilla
kotransfiziert. Nach 6h Transfektion wurden die Zellen für 4h unbehandelt gelassen oder mit
H.pylori G27 oder 200 µM ZnSO4 stimuliert. Zellextrakte wurden auf Luciferaseaktivität
untersucht. Die gemessenen RLU (Relative Light Units) wurden mit den RLU-Werten der Renilla
Luciferase normiert. Die unstimulierten Kontrollen wurde der Wert 1,0 zugewiesen und die
stimulierten Werte jeweils auf diesen bezogen.
- 77 -
4. Ergebnisse
4.10 H.pylori und Cyclin D1 Expression
Unkontrollierte Aktivierung von MAP Kinase Kaskaden und AP-1, welche beide wesentliche
Bestandteile der Signaltransduktion für Zellteilung und -proliferation sind, kann offensichtlich
zur
Transformation
und
zur
unkontrollierten
Proliferation
von
Zellen
führen.
Physiologischerweise wird die MAP Kinase ERK durch ein Mitogen aktiviert, z.B. das
Binden von EGF an seinen Rezeptor EGF-R mit konsekutiver Rezeptorphosphorelierung und
Aktivierung der Raf-MEK1-ERK1 Kaskade (s. Einleitung), welches konsekutiv zur AP-1
Aktivierung führt. Die Progression durch den Zellzyklus von G1 zur S Phase und damit
Übergang zur Zellteilung wird durch D-Typ Cycline reguliert, welche Komplexe mit „Cyclin
Dependent Kinase“ CDK 4 & 6 bilden. Diese Cyclin-D-CDK Komplexe wiederum
phosphorelieren daraufhin das Rb-Protein, wodurch der Rb-gebundener Transkriptionsfaktor
E2-F freigesetzt wird. Daraufhin initiiert E2-F die Transkription von Genen für die Synthese
von DNA und bewegt die Zelle so in die S-Phase.
D-Cycline ihrerseits werden wiederum durch AP-1 und die ERK/MAPK Signalwege reguliert
– u.a. besitzt der Cyclin D1-Promoter eine AP-1 Bindungsstelle [Watanabe, 1996] und ein
konstitutiv aktiver ERK/MAPK Signalweg führt zu G1/S Übergang im Zellzyklus [Lavoie,
1996]. Da eine chronische Infektion mit H.pylori zu einer Hyperproliferation des
Magenepithels und seltener auch zu einem Adenokarzinom des Magens führt (siehe auch
Einleitung), interessierten wir uns für die Frage, ob H.pylori auch in der AGS-Zellinie zu
einer Aktivierung von D-Cyclinen und Hyperproliferation der Zellen führt.
Hierzu wurden für 12h gehungerte AGS-Zellen für eine Stunde mit H.pylori G27 und TPA
(100ng/ml) stimuliert, Gesamt-RNA Extrakte hergestellt, und diese im Northernblot (Abb.
Exp 68) mit einer Sonde für Cyclin D1 hybridisiert : die in unstimulierten Zellen deutlich
nachweisbare Cyclin D1 Bande wurde nach Stimulation mit H.pylori G27 oder TPA deutlich
schwächer. Darüberhinaus wurde auch RNA aus AGS-Zellen, die durch eine 12h
Hungerperiode in die G0-Phase gebracht wurden, mit AGS-Zellen in der früh logarithmischen
Wachstumsphase verglichen. Die proliferierenden Zellen wiesen eine deutlich stärkere Cyclin
D1-Bande auf (Abb. Exp 68).
4. Ergebnisse
gG
row
Sta
r ve th P
ha
d
s
Lo
7
TP
A
G2
-
Stimilus :
-
e
- 78 -
cyclin D1
1
2
3
4
5
6
Exp 68cyc : H.pylori induziert cyclin D1 mRNA Expression in AGS Zellen
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 1,2) oder für 1h mit H.pylori G27 (Spur 3) oder
TPA (100ng/ml) (Spur 4) inkubiert. Gesamt-RNA-Extrakte wurden angefertigt. Desweiteren wurde
RNA von für 12h serumdeprivierten AGS Zellen (Spur 6) bzw. AGS-Zellen in der frühen
logarithmischen Wachstumsphase (Spur5) gewonnen. Jeweils 10 µg RNA wurden im Northernblot
mit einer 900bp Sonde für cyclin D1 untersucht. Die Positionen der 28S und 18S rRNA sind
gekennzeichnet.
Um sich die Cyclin D Expression auch auf Proteinebene anzuschauen, wurden für 12 h
komplett serumdeprivierte AGS Zellen für 2, 4, 6 und 8 Stunden mit H.pylori kokultiviert,
sowie als Positivkontrolle mit frischem 10% serumhaltigen Medium inkubiert und
anschließend Proteinextrakte hergestellt. Bei H.pylori stimulierten Zellen sank das in
ruhenden Zellen schwach detektierbare Cyclin D1 (Abb. Exp 92, Spur 1) unter die
Nachweisgrenze (Abb. Exp 92, Spur 2-5), wohingegen die serumbehandelten Zellen einen
deutlichen Anstieg der Cyclin D1 Konzentration mit Maximum nach 6 Stunden aufwiesen
(Abb. Exp 92, Spur 7-10).
Se r
7
G2
Stimilus :
Zeit (h) :
0 2
4
6
4. Ergebnisse
um
- 79 -
8
2
4
6
8
Cyclin D1
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Exp 92cyc : H.pylori bewirkt Cyclin D1 Expression in AGS Zellen
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori
G27 (Spur 3-6) oder in serumhaltigen Medium (10%) (Spur 7-10) inkubiert. Zellextrakte wurden im
Westernblot mit einem Antikörper gegen Cyclin D1 analysiert.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Kokultivation von AGS-Zellen mit H.pylori G27
zu einer Herunterregulierung von cyclin D1 sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene
führt und somit die Zellen eher in einen G0-Arrest versetzt werden als zur Proliferation
angeregt zu werden.
- 80 -
4. Ergebnisse
4.11 VEGF und H.pylori
Sowohl das Ulcus ventriculi et duodeni, als auch das Magenkarzinom werden von
Gefäßneubildung begleitet. Bei ersterem wird vermutet, daß die Neovaskularisation den
Heilungsprozeß unterstützt, in der Karzinogenese ist die Gefäßbildung essentiell für die
Nährstoffversorgung des wachsenden Tumors.
Im Randgebiet von Magenulcera bei H.pylori infizierten Patienten fanden sich erhöhte
VEGF-Level [Takahashi, 1997] – die Autoren vermuteten, daß dies im Zusammenhang mit
der Wundheilung des Ulcus zu sehen ist, wie VEGF allgemein in der Proliferationsphase der
Wundheilung eine wichtige Rolle spielt.
4.11.1 Regulation der Angiogenese durch VEGF
Die Angiogenese ist ein eng kontrollierter Prozeß, der von pro-angiogenetischen – u.a.
Vascular Endothelial Growth Factor – und anti-angiogenetischen Peptiden, wie z.B.
Angiostatin, reguliert wird. VEGF besitzt eine zentrale Rolle sowohl bei der Gefäßneubildung
als auch als Mitogen für endotheliale Zellen [Leung, 1989]. VEGF Expression wird durch
eine Vielzahl von Stimuli induziert. Präinflammatorische Zytokine, wie TNF-α, IL-1, IL-6
und IL-8, sowie die Wachstumsfaktoren bFGF, EGF, TGF-α & β [Gille, 1997; Enholm, 1997;
Cohen 1996] führen über die Aktivierung der Protoonkogene ras & c-Raf sowie die
konsekutive
Aktivierung
der
ERK-MAPK-Kaskade
zur
Aktivierung
der
Transkriptionsfaktoren AP-2 und SP-1, die an den Promoter von VEGF binden und die
Expression starten [Milani, 1998 ; Rak, 1995; Grugel, 1995]. Ein weiterer wichtiger Stimulus
für
die
VEGF
Synthese
ist
Hypoxie,
die
sowohl
durch
transkriptionelle
wie
posttranskriptionelle Mechanismen zur verstärkten Expression von VEGF führt - zum einen
durch die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren HIF-1 und AP-1 [Forsythe, 1996], zum
anderen durch Stabilisierung der VEGF mRNA [Stein, 1995]. Kürzlich fanden Pages et. al,
daß auch die Aktivierung der MAPK JNK und p38 die VEGF mRNA stabilisiert [Pages,
2000].
- 81 -
4. Ergebnisse
4.11.2 H.pylori induziert die Transkription von VEGF in AGS Zellen
Da VEGF in der Pathogenese der Ulcuserkrankung wie auch der Karzinogenese beteiligt ist,
und H.pylori die MAPK ERK und JNK aktivieren kann, stellten wir uns die Frage, ob die
verstärkte VEGF-Expression in Magenulcera direkt von H.pylori stimuliert wird, oder eher als
Reaktion des Körpers auf die Entzündung zu sehen ist.
Hierzu wurden für 12h gehungerte AGS-Zellen für 2, 4 und 6 Stunden mit H.pylori G27
Exp94 : H.pylori induziert VEGF mRNA Expression in AGS Zellen.
AGS Zellen wurden unbehandelt gelassen (Spur 2) oder für die angegebenen Zeiten mit H.pylori
G27 (Spur 3-6) stimuliert. Gesamt-RNA-Extrakte wurden angefertigt, und jeweils 10 µg im
Northernblot mit einer 600bp Sonde für VEGF untersucht. (Unten) Ethidiumbromid gefärbtes RNAGel.
- 82 -
4. Ergebnisse
stimuliert, Gesamt-RNA-Extrakte hergestellt, und diese im Northernblot (Abb. Exp 68) mit
einer Sonde für VEGF hybridisiert : in unstimulierten Zellen ließ sich keine VEGF-RNA
nachweisen, wohingegen nach 4 Stunden Stimulation eine deutliche Bande sichtbar wurde,
die nach 6 Stunden noch stärker wurde (Abb. Exp94, Spur 3,4). Die Kokultivation von AGSZellen mit H.pylori führt also zu einer deutlichen Induktion der VEGF-Expression.
Es konnte also gezeigt werden, daß H.pylori direkt die Expression von VEGF-mRNA
induziert. Spätere Versuche von cand.med. M. Fleckenstein ergaben weiterhin, daß die
Stimulation von AGS-Zellen mit H.pylori Stämmen auch die verstärkte Sekretion von VEGF
bewirkt (unveröffentlichte Daten).
- 83 -
5. Diskussion
5 Diskussion
In dieser Arbeit konnte erstmals die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 durch das
gramnegative Bakterium H.pylori in AGS Zellen gezeigt werden. Dabei korrelierte die
Aktivierung von AP-1 mit dem Vorhandensein des virulenzassoziierten cagA Gens und dem
Vorhandensein der Pathogenitätsinsel cag, wenngleich sich nicht alle Gene dieses 40 kbp
DNA-Abschnittes als notwendig erwiesen.
5.1
H.pylori aktiviert den Transkriptionsfaktor AP-1 via MAPK Kaskaden
Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, daß die Kokultivierung von AGS-Zellen mit H.pylori
Stämmen, die eine intakte Pathogenitätsinsel cag besitzen, den Transkriptionsfaktor AP-1
induzieren können, wobei erste DNA Bindeaktivität von AP-1 im EMSA nach ca. 45 min
nachweisbar wird und das Maximum nach ca. 2 Stunden erreicht wird. Für die Regulation von
AP-1 sind die MAPK Signaltransduktionswege von entscheidender Bedeutung. In Zellen von
Säugetieren sind mittlerweile vier verschiedene MAPK-Kaskaden beschreiben : die ERK1/2Kaskade, die JNK-Kaskade, der p38 Signalweg und die ERK5 Kaskade.
5.1.1
ERK Signaltransduktionsweg
Die ERK Signalkaskade ist oft an der Signalvermittelung von Wachstumsfaktoren und
konsekutiv
an
der
Regulation
der
Zellproliferation
beteiligt.
Nach
Binden
des
Wachstumsfaktors – u.a. EGF, NGF, VEGF, HGF – an seinen Rezeptor kommt es zu einer
Autophosphorelierung desselbigen und einer konsekutiven Anlagerung der Adapterproteine
Grb2 und Sos. Sos bewirkt einen Austausch von GDP gegen GTP an dem kleinen GTP
bindendem Protein ras und aktiviert es damit. Aktiviertes ras führt u.a. zur Bindung und
Aktivierung der MAPKKK c-Raf1 und weiter zu Aktivierung der MEK1/2-ERK1/2-Elk1
Signalkaskade. Mutationen von ras spielen in der Karzinogenese eine wesentliche Rolle –
viele epitheliale und hämatopoetische Tumoren weisen ein durch Mutation konstitutiv aktives
ras Protein auf [Bos, 1989]. Die für die Funktionalität von ras wichtigen Farnesylgruppen sind
Angriffspunkt der als Anti-Krebs Medikamente getesteten Farnesyltransferaseinhibitoren, die,
indem sie das Übertragen von Farnesylgruppen auf ras verhindern, dessen Funktion hemmen
und somit die ungehemmte Zellteilung bremsen sollen [Oliff, A; 1999].
- 84 -
5. Diskussion
5.1.1.1 H.pylori aktiviert MEK1/2 und ERK1/2
Einer der Downstream-Effektoren von ras ist MEK1/2. In unseren Experimenten konnten wir
zeigen, daß auch H.pylori G27 die MAPKK MEK1/2 stimuliert (Exp 71). Einen indirekten
Beweis für die Beteiligung von MEK1/2 an der H.pylori induzierten Aktivierung von AP-1
wurde durch Versuche mit selektiven Inhibitoren für MEK1/2, PD98059 und U0126, erbracht
(Exp49). Die Mechanismen, durch die H.pylori eine Aktivierung von MEK1/2 bewirkt, sind
noch nicht bekannt. Zur Zeit werden in unserem Labor Versuche durchgeführt, die klären
sollen, ob H.pylori auch in der Lage ist, ras oder c-Raf zu aktivieren, oder ob die H.pylori
induzierte Aktivierung von MEK1/2 mit der konsekutiven Stimulation von AP-1 über andere,
noch unbekannte Signalwege verläuft. Wessler et al. berichten, daß cagA+ H.pylori Stämme
den Histidin Decarboxylase Promoter transaktivieren, und konnten durch Kotransfektion von
dominant negativen Mutanten von Signalmediatoren zeigen, daß hierbei ERK und c-Raf eine
Rolle spielen, nicht aber ras und MEKK-1 [Wessler, 2000]. Bezüglich der Aktivierung des
Histidin Decarboxylase Promoters sind also c-Raf und ERK an der Signaltransduktion
beteiligt, nicht aber ras und MEKK-1. Im Analogieschluß könnte man folgern, daß ras und
MEKK-1 wohl auch nicht in der H.pylori induzierten, MEK1/2-ERK-Elk1 vermittelten AP-1
Aktivierung beteiligt sind. Da die Signaltransduktion aber selten rein linear erfolgt, sondern
oft mehrere Kaskaden gleichzeitig aktiviert werden, die sich wiederum untereinander
beeinflussen, sollte man hier den Versuch mit einem AP-1 getriebenen Reporterkonstrukt als
Auslese wiederholen.
Das physiologische Substrat von MEK1/2 ist die MAPK ERK. Kokultivation von AGS Zellen
mit H.pylori G27 bewirkt eine Aktivierung von ERK1/2, wie wir durch Messung der Aktivität
der immunpräzipitierten ERK1/2 in vitro, als auch im Westernblot mit für aktive MAPK
ERK1/2 spezifische Antikörper herausfanden. Weiterhin stimulierte H.pylori die Induktion
durch einen MEK1/2 vermittelten Signalweg, die Expression des Protoonkogens c-Fos (Exp
75) und die Phosphorelierung von c-Jun an der Seitenkette Ser-73 (Exp 116), wodurch dessen
transkriptionelle Aktivität potenziert wird [Hibi 1993].
5.1.1.2 ERK Kaskade und Neoplastische Transformation
- 85 -
5. Diskussion
Die chronische Infektion mit H.pylori ist mit einem 6-fach erhöhten Risiko für die
Entwicklung eines Magenadenokarzinoms assoziiert [Parsonnet, 1994; Eurogast Study Group,
1995]. Magenbiopsien von Patienten mit einer H.pylori Infektion wiesen im Vergleich zu
einer uninfizierten Kontrollgruppe Hyperproliferationen der Magenschleimhaut auf [Peek,
1997; Fraser, 1994; Bechi, 1996; Lynch, 1995; Harvard, 1996]. Beide Beobachtungen waren
mit der Präsenz des virulenzassoziierten cagA Gens sowie dem Vorhandensein der
Pathogenitätsinsel cag korreliert.
Mutationen, die eine konstitutive Aktivierung der ERK-Kaskade bewirken, sind oft mit
transformierenden Eigenschaften verbunden. So bewirkt die Expression von durch Mutation
konstitutiv aktivem MEK1/2 in Säugetierzellen Fokusformation dieser Zellen und Wachstum
in Softagar, sowie Tumorinduktion in Nacktmäusen [Mansour, 1994]. Die Aktivierung von
ERK1/2 ist sowohl notwendig, wie auch hinreichend für die Transformation von NIH 3T3
Zellen [Cowely, 1994]. Auch die konstitutive Aktivierung von c-Fos und c-Jun kann
Tumorwachstum vorantreiben. Die Überexpression von c-Fos in transgenen Mäusen kann zur
Entwicklung von Osteo- und Chondrosarkomen führen [Rüther, 1987]. Die Transformation
von Zellen durch c-Fos Überexpression ist dabei nicht abhängig vom Zellzyklus; vielmehr
scheint die deutliche Verzögerung, mit der die Transformation nach Beginn der Expression
von c-Fos auftritt, darauf hinzuweisen, daß vor der Transformation c-Fos Zielgene
akkumulieren müssen [Miao, 1994]. Die deregulierte c-Jun Expression bewirkt die
Transformation von Fibroblasten der Ratte [Curran, 1982 ; Schuermann, 1989].
Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse deuten daraufhin, daß die konstitutive
Aktivierung von MAP Kinasen und der Protoonkogene c-Fos und c-Jun durch eine Infektion
mit H.pylori die Magenschleimhaut zu einer Zellproliferation anregen könnte, sowie eine
neoplastische Transformation der Magenmukosa bewirken, die in der Entwicklung eines
Adenokarzinoms gipfeln könnte.
5.1.1.3 ERK-Signalkaskade als Regulator des Zellzyklus
Mitogene Stimuli wie z.B. Wachstumsfaktoren oder Immunstimulation von B- und T-Zellen
durch Aktivierung ihrer Rezeptoren können ruhende Zellen aus der G0 Phase (Ruhephase) in
den Zellzyklus bringen und die DNA-Synthese stimulieren. Der Zellzyklus teilt sich in die 4
Phasen G1 (Ruhephase), S (Synthesephase), G2 (Intermediärphase) und M (Mitosephase). Der
durch Mitogene ausgelöste Übergang von der G1 Phase in die S Phase wird über Cycline der
Klasse D vermittelt [Matsushime, 1991; Übersicht : Sherr, 1995], die mit den Cyclin
- 86 -
5. Diskussion
Dependent Kinases (CDK) CDK4 und CDK6 Komplexe bilden und diese dadurch aktivieren.
Die Proteine p21cip und p27
kip
, die an den Cyclin-CDK Komplex binden können und dessen
katalytische Aktivität inhibieren, agieren als Gegenspieler zu den Cyclinen. Dabei ist das
Verhältnis zwischen D-Typ Cyclinen, die in der G1 Phase stetig zunehmen, und den
Inhibitoren entscheidend : übersteigt die Anzahl der Cyclin-CDK Komplexe die Anzahl der
inhibitorischen Proteine, kommt es zur Phosphorelierung von Rb und damit zum Übergang in
die S-Phase. Dementsprechend führt die Überexpression von cyclin D1 in Fibroblasten zur
Beschleunigung der G1 Phase, wohingegen die Mikroinjektion von Antikörpern gegen Cyclin
D1 diese Zellen in der G1 Phase blockiert [Quelle, 1993].
Die Cyclin D-CDK Komplexe können das Retinoblastom (Rb) Protein phosphorelieren und
dadurch die Bindung zwischen dem Rb-Protein und E2F, einem für die DNA-Synthese
essentieller Transkriptionsfaktor, lösen. Das freigesetzte E2F wandert in den Zellkern,
stimuliert die DNA-Synthese und bringt die Zelle damit in die S-Phase. Auf ähnliche Weise
bewirken auch Tumorviren die Transformation : das E1A Gen (Adenovirus), das SV40 T
Antigen (Simvian Virus 40) und das TAX Gen (HTLV I) binden Rb Protein mit hoher
Affinität, so daß Komplexe von Rb Protein mit E2F gespalten werden und freies E2F entsteht
[Jansen Dürr, 1996].
Konstitutive Aktivierung von ERK führt zur Induktion von D-Typ Cyclinen [Lavoie, 1996] der cyclin D1 Promoter besitzt sowohl eine AP-1 wie eine Ets Bindungsstelle [Watanabe,
1996]. Aktives ERK kann auch über andere Mechanismen den Zellzyklus vorantreiben : ERK
kann in vitro den Zellzyklus Inhibitor p27kip phosphorelieren, so daß dieser von dem Cyclin
D-CDK Komplex gelöst wird und verstärkt der Ubiquitin vermittelten Degradation ausgesetzt
ist. Zu starke Aktivierung der MEK-ERK Signalkaskade durch ein konstitutiv hochaktives cRaf Konstrukt kann jedoch auch die Zellproliferation inhibieren [Woods, 1997]. Hierbei
bewirkt das überexprimierte c-Raf eine starke Expression des Zellzyklusinhibitors p21cip, was
in einem Proliferationsarrest resultiert. Wie in der Einleitung (1.8.2) bereits angesprochen, ist
sowohl die Dauer als auch die Intensität der Aktivierung der MEK-ERK Kaskade für die
physiologische Wirkung – Proliferation oder Wachstumshalt / Differenzierung –
entscheidend. Eine dritte proliferationsfördernde Wirkung von ERK besteht in der
Phosphorelierung (und Aktivierung) der Carbomyl Phosphatase Synthetase II, ein
Schlüsselenzym in der Pyrimidin Synthese [Graves, 2000].
Es liegt nahe zu vermuten, daß H.pylori über eine Aktivierung der MEK-ERK Kaskade und
Expression der Protoonkogene c-Fos und c-Jun eine Induktion von Cyclin D1 bewirken
könnte und so die Hyperproliferation in den Magenschleimhautbiopsien von H.pylori
- 87 -
5. Diskussion
infizierten Patienten zu erklären sei. Die Kokultivation von AGS Zellen mit H.pylori zeigte
jedoch sowohl auf mRNA Ebene (Exp 68cyc) als auch auf Protein Ebene (Exp 92_cyc), daß
H.pylori in AGS Zellen zu einer Reduktion von Cyclin D1 führt. Hierfür gibt es mehrere
Erklärungsmöglichkeiten :
(1) Die Inkubation der AGS-Zellen mit H.pylori bedeutet für diese ein Stressituation, in der es
biologisch nicht sinnvoll erscheint, in Mitose zu gehen. Dies deckt sich auch mit
morphologischen Beobachtungen, daß die AGS-Zellen bei Kokultivation mit H.pylori
G27 ähnlich wie bei Stimulation mit TPA Philopoden ausbilden, wohingegen sie bei
Proliferation wie unter Standardbedingungen in Kultur eher eine rundliche Form
aufweisen und sich in Nestern anhäufen.
(2) Bei der AGS-Zellinie handelt es sich um eine Zellinie, die aus einem Adenokarzinom des
Magens
gewonnen
wurde.
Diese
Zellen
proliferieren
unter
Zugabe
von
Wachstumsfaktoren in Form von Serum von sich aus. Dennoch können die Zellen durch
Serumdeprivation in einen Wachstumsarrest gebracht werden, und somit den
physiologischen Verhältnissen der Magenmukosa angenähert werden. Dieses System stellt
somit ein nützliches und in der Fachliteratur oft beschriebenes Modell für die
Magenschleimhaut dar, ist aber gerade bei Fragenstellungen bezüglich der Proliferation
auch begrenzt und nicht vollständig mit der normalen Magenmukosa des Menschen
gleichzusetzen. Weitere Versuche sollten mit Primärkulturen menschlicher Magenmukosa
durchgeführt werden, die bei Aspekten der Proliferation wohl ein besseres Modell sind.
(3) Die Kokultivierung von H.pylori mit AGS-Zellen bewirkt neben einer Aktivierung der
ERK-Signalkaskade auch die Aktivierung der p38-Signalkaskade (nicht gezeigte Daten),
die sonst v.a. durch präinflammatorische Zytokine, Endotoxine und osmotischen Streß
angeschaltet wird. Aktives p38 führt im Gegensatz zu ERK zu einer Herunterregulierung
von Cyclin D1 [Lavoie, 1996]. In dem verwendeten in vitro Modell mit AGS-Zellen
scheint dieser Effekt durch aktiviertes p38 den von aktivierten ERK1/2 zu überwiegen.
Shirin et al. berichtet im Einklang mit unseren Daten über einen Zellzyklus-Stop durch
H.pylori in AGS Zellen und eine dosisabhängige Induktion von Apoptose in AGS Zellen bei
Kokultivation mit H.pylori. Die Langzeitinfektion von AGS-Zellen führte jedoch zur
Selektion von Apoptose resistenten AGS Zellen, die den Zellzyklusinhibitor p27kip1 deutlich
schwächer als normal exprimieren [Shirin, 2000].
- 88 -
5. Diskussion
Im Tiermodell konnte gezeigt werden, daß mit H.hepaticus infizierte Mäuse hepatozelluläre
Tumore entwickeln, die eine erhöhte Expression von Cyclin D1, Cdk4 und c-Myc sowie ein
hyperphosphoreliertes Rb-Protein aufweisen [Ramljak, 1998]. Die Wirkung von H.pylori auf
den Zellzyklus scheint also stark von dem zellulären Hintergrund und dem verwendeten
Modell
–
in
vitro
oder
in
vivo
–
abzuhängen.
Weiterführend
wären
sicher
immunhistochemische Untersuchungen und in situ Hybridisierungen mit Cyclin D1
spezifischen Sonden an Magenbiopsien von H.pylori infizierten Patienten und einer
Kontrollgruppe. Hierbei ergibt sich allerdings wieder das Problem, daß sich der Verlauf der
H.pylori Infektion sehr verschieden gestalten kann und stark von Faktoren des Wirtes –
aktueller Gesundheitszustand, genetische Prädisposition – abhängt.
5.1.2
JNK Signaltransduktionsweg
Die JNK Signalkaskade ist mit der Signalweiterleitung durch extrazelluläre Stressoren
assoziiert; so wird sie u.a. durch UV-Bestrahlung, Hitzeschock und inflammatorische
Zytokine wie IL-1 und TNF-α aktiviert [Minden, 1997]. Die Aktivierung kann dabei durch
verschiedene Upstream-Mediatoren erfolgen, die auf der JNKK1/2 (auch als MKK4/7
bezeichnet) konvergieren, die die Phosphorelierung und Aktivierung von JNK bewirkt.
JNK kann Transkriptionsfaktoren der Jun Familie, so u.a. c-Jun an den Seitenketten Ser-63
und Ser-73 phosphorelieren und damit dessen transkriptionelle Aktivität entscheidend
verstärken. Darüberhinaus vermag es auch weitere Transkriptionsfaktoren zu aktivieren. So
kann JNK Elk1 phosphorelieren und ist so auch an der c-fos Induktion durch
proinflammatorische Zytokine und UV-Bestrahlung beteiligt [Minden, 1997]. Ein weiterer
Transkriptionsfaktor, der von JNK durch Phosphorelierung aktiviert werden kann, ist ATF-2.
Dieser wiederum bildet mit c-Jun Heterodimere, bindet an das TRE-Motiv im c-jun Promoter
und stimuliert so die c-Jun Expression [van Dam, 1993]. In vivo ist JNK und c-Jun mit der
Apoptose-Induktion verbunden. So führt die anhaltende Aktivierung von JNK-Aktivierung in
neuronalen Zellen zum programmierten Zelltod [Xia, 1995]. Auch sind JNK1 und 2
notwendig für die Apoptose Induktion nach UV-Bestrahlung [Tournier, 2000].
5.1.2.1 H.pylori aktiviert JNK
- 89 -
5. Diskussion
Die Kokultivation von AGS mit dem cagA+ H.pylori Stamm G27, nicht jedoch seine isogene
Mutante G27-∆G oder der cagA- Stamm 2012 bewirken eine Phosphorelierung von JNK1/2,
wobei das Maximum nach 30-45 min erreicht wird und sich dann langsam wieder zurück
bildet. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Resultaten aus der Arbeitsgruppe von
M.Naumann, der durch Reportengenversuche mit einem AP-1 getriebenen Promoter und
Kotransfektion einer dominant negativen JNKK1 auch die Notwendigkeit der JNKSignalkaskade für die Aktivierung von AP-1 belegen konnte [Naumann, 1999]. Desweiteren
konnte er ebenfalls durch Kotransfektion dominant negativer Mutanten zeigen, daß die
kleinen G-Proteine Rac und Cdc42, die seit längerem als Upstream-Mediatoren des JNKSignalweges beschrieben sind [Minden, 1997], auch für die AP-1 Induktion durch H.pylori
notwendig sind. Die Aktivierung von JNK könnte neben der Aktivierung von AP-1 und
Expression AP-1 abhängiger Gene auch mitverantwortlich für die erhöhte Apoptoserate des
Magenepithels bei einer H.pylori Infektion sein.
5.1.3
MAPK Kaskaden in der Interaktion zwischen Wirt und Erreger
Die ERK-Kaskade wird oft im Zusammenhang mit Proliferation und Differenzierung von
Zellen beschrieben, so daß man sie nicht primär mit der Pathogenese einer bakteriellen
Infektion in Verbindung bringen würde. Anders dagegen der JNK Signalweg, der zuerst als
Mediator als Reaktion auf UV-Bestrahlung entdeckt wurde [Hibi, 1993], heute aber
allgemeiner als Signalweg für extrazellulären Streß wie Hitzeschock oder auch als
Entzündungsmediator eingeordnet wird. Beide Signalwege bewirken die Aktivierung des
Transkriptionsfaktors AP-1 und so zum einem die Expression von Genen, die für
Zellproliferation und Differenzierung wichtig sind, zum anderen - insbesondere in
Verbindung mit dem Transkriptionsfaktor NF-κB – die Expression von proinflammatorischen
Zytokinen wie IL-8, IL-6, TNF-α, GRO-α und MIP. Desweiteren kann JNK zur Induktion der
Cyclooxygenase-2 führen, die als Schlüsselenzym für die Produktion der Prostaglandine in
der Entzündungsvermittelung eine kritische Position einnimmt [Xie, 1995].
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß H.pylori sowohl die ERK als auch die JNK
Signalkaskade aktiviert. Auch das intrazelluläre Bakterium Neisseria gonorrhoeae aktiviert
den JNK Signalweg [Naumann, 1998].
Doch nicht nur eine Aktivierung von MAPK-Kaskaden und der Transkriptionsfaktoren NFκB
und
AP-1
mit
einer
konsekutiven
Entzündungsantwort
konnten
in
der
Molekularpathogenese von bakteriellen Infektionen beobachtet werden; auch das Gegenteil,
- 90 -
5. Diskussion
die Herunterregulierung dieser Signalmediatoren und somit ein Entkommen von der
Immunantwort des Wirtes wurde beschrieben. So führt die Infektion von Makrophagen mit
Yersinia enterocolitica Stämmen, die das Yersinia Virulenzplasmid besitzen, zu einer
deutlichen Inhibierung der MAPK ERK, JNK und p38, sowie einer Inaktivierung des
Transkriptionsfaktors NF-κB, was zu einer deutlichen Supprimierung der TNF-α vermittelten
Immunantwort führt [Ruckdeschel, 1997]. Dabei interagiert das auf dem Virulenzplasmid
kodierte Gen YopJ, das durch einen Typ III Sekretionsapparat in die Wirtszelle geschleust
wird, mit der MAPKK-Protein Superfamilie sowie dem auch dieser Gruppe zugeordneten
IKK-β, die eine zentrale Rolle in der Aktivierung von NF-κB spielt. Durch das Binden an die
MAPKK Proteine wird deren Aktivierungsdomäne blockiert, so daß verschiedene Signalwege
(u.a. die MAPK-Kaskaden und der NF-κB Transduktionsweg), die entscheidend an der
Initiierung der Immunantwort des Wirtes beteiligt sind, gestört werden [Orth, 1999]. Auch das
Lipid Lipoarabinomannan aus der Hülle von Mycobacterium tuberculosis kann
die
Dephosphorelierung von Tyrosinseitenketten und die Inhibierung der MAPK ERK 2
bewirken [Knutson, 1998].
Neben diesen Pathomechanismen, die primär mit der Akutreaktion des Wirtes auf das
Pathogen assoziiert sind, könnte die Aktivierung des ERK-Signalweges durch eine chronische
Infektion mit H.pylori zu einer Hyperproliferation der Magenschleimhaut führen. Dies wäre
im Gegensatz zu ersteren ein Effektormechanismus für einen länger andauernden Prozeß und
somit eine neue Facette der MAPK Kaskaden in der Molekularpathogenese von Infektionen.
5.2
Welcher Bestandteil von H.pylori aktiviert die MAPK-Kaskaden und AP-1 ?
Ein wesentliches Ergebnis dieser Arbeit stellt sicherlich die Beobachtung dar, daß Wildtyp
Klasse I und cagA+ H.pylori Stämme, wie G27, 151, NTCT 11638 oder ATCC 43405, in der
Lage sind AP-1 zu aktivieren. Im Gegensatz dazu fehlt H.pylori Stämmen, die die
Pathogenitätsinsel nicht besitzen, so z.B. der cagA- Stamm 2012, oder isogene Stämme von
H.pylori G27 mit Mutationen in der Pathogenitätsinsel cag, diese Eigenschaft. Dabei läßt sich
dieser Unterschied auf vielen Ebenen feststellen : der cagA+ Stamm G27 aktiviert die MAPK
ERK und JNK, nicht jedoch cagA- Stamm 2012, oder die G27 Mutante ∆G (Exp 115 III &
IV). Gleiches gilt für die Expression von c-Fos (Exp 75), AP-1 Bindungsaktivität im EMSA
(Exp 96II), sowie AP-1 Funktionalität im Reportergenversuch (Exp 110). Da die
verschiedenen Bakterienstämme unter identischen Bedingungen kultiviert wurden, kann
ausgeschlossen werden, daß es sich bei der Aktivierung der Signalkaskaden um ein Artefakt
- 91 -
5. Diskussion
handelt, die Aktivierung also gar nicht auf H.pylori zurückzuführen sei, sondern auf äußere
Parameter wie z.B. das Kulturmedium der Bakterien. Dabei ist anzumerken, daß auch cagAStämme – u.a. 2012 – manchmal zur diskreten Induktion von AP-1 bzw. leichten Expression
von c-Fos (Exp 115 IV) im Vergleich zu unstimulierten Zellen führten. Auch die Interleukin 8
Sekretion von Magenepithelzellen kann bei Stimulation mit cagA+ H.pylori Isolaten
beträchtlich schwanken, und selbst cagA- Isolate können zu einem bestimmten Anteil
Interleukin 8 Sekretion induzieren [Sharma, 1995]. Diese Beobachtungen lassen vermuten,
daß neben cagA und den Genen der Pathogenitätsinsel weitere bakterielle Determinanten
existieren, die die Antwort der Wirtszelle beeinflussen können; so z.B. die genetische
Zusammensetzung der cag Insel, die eine große Heterogenität aufweist oder auch Gene
außerhalb der Pathogenitätsinsel cag, wie z.B. das kürzlich entdeckte „outer membrane
protein“ oipA von H.pylori, daß synergistisch mit dem cagE Gen die IL-8 aus
Magenepithelzellen fördert [Yamaoka, 2000].
Von den isogenen Mutanten des Stammes G27 konnten nur die Mutanten ∆F und ∆N ΑP-1
Bindungsaktivität im EMSA induzieren. Interessanterweise sind dies die gleichen Mutanten,
die auch NF-κB zu aktivieren vermochten [Glocker, 1998]. Diese Ergebnisse legen nahe, daß
der gleiche bakterielle Proteinkomplex zur Aktivierung von NF-κB und AP-1 führt.
Die Pathogenitätsinsel cag besteht aus 31 Genen, die wahrscheinlich für einen Typ IV
Sekretionsapparat kodieren [Censini, 1996]. Kürzlich konnte von einigen Gruppen gezeigt
werden, daß H.pylori das CagA Protein durch diesen Typ IV Sekretionsapparat in AGS Zellen
transferieren kann, und CagA dann in der Wirtszelle phosphoreliert wird [Odenbreit, 2000;
Stein, 2000]. Ein ähnlicher Mechanismus ist für das Tir-Protein von enteropathogenen
Escherichia coli (EPEC) beschrieben, das mit einer Typ III Sekretionsmaschine in
Epithelzellen geschleust wird, und dort phosphoreliert wird. Aktiviertes Tir bewirkt eine
Kondensation von Actin und dient als Rezeptor für das bakterielle Protein Intimin und ist so
an der Adhäsion von EPEC an Epithelzellen beteiligt [Kenny, 1997; Rosenshine, 1992].
Jedoch besitzen CagA und Tir keine Ähnlichkeit bzgl. ihrer Aminosäurensequenz und weisen
auch strukturell wenig Ähnlichkeit auf [Kenny, 1997].
Die Zytoskelett Neuordnung und Actin Polymerisation [Segal, 1996], die H.pylori in
Magenepithelzellen verursacht, könnte durch das translozierte CagA Protein vermittelt
werden. Die Kondensation von Actinfilamenten benötigt aktiviertes Arp2/3 Protein, das über
Proteine der WASP-Familie (Wildrich Albert Syndrom Protein) mit den Proteinen der Rho
Familie - u.a. Cdc 42 – interagiert. Phosphoreliertes CagA könnte WASP nachahmen, WASP
- 92 -
5. Diskussion
durch spezifische kleine Rho-GTPasen rekrutieren oder über andere Mechanismen das
Rearrangement des Zytoskeletts bewirken [Stein, 2000].
Da CagA weder direkt für die Interleukin 8 Sekretion notwendig ist [Carbtree 95, Shamra 95],
noch für die Aktivierung von NF-κB [Sharma, 1998], existiert anscheinend ein Unterschied
zwischen Rearrangement des Zytoskeletts und der präinflammatorischen, NF-κB abhängigen
Entzündungsantwort, die H.pylori in AGS auslöst. Die Notwendigkeit von cagA für die
Aktivierung von AP-1 bleibt zu untersuchen.
5.3
H.pylori aktiviert VEGF
Ein pathophysiologisches Charakteristikum für die Entwicklung des Ulcus ventriculi et
duodeni und des Magenkarzinoms ist die Neubildung von Gefäßen. Erhöhte VEGF- Spiegel
konnten am Rand von Ulcera bei Patienten mit H.pylori Infektion festgestellt werden
[Takahashi, 1997]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß H.pylori direkt die
Transkription von VEGF-mRNA in AGS stimuliert.
Einerseits könnte das erhöhte VEGF in Zusammenhang mit der Wundheilung der Ulcera
gesehen werden. Andererseits könnte VEGF auch in einer autokrinen Schleife
proliferationsfördernd wirken : Während in normaler Magenschleimhaut kein VEGF
vorhanden ist, konnten die VEGF Rezeptoren Flt-1 und KDR immunhistochemisch
nachgewiesen werden [Takahashi, 1997]. Die Stimulation der VEGF Rezeptoren aktiviert
MAPK Signalwege, die wiederum zur Zellproliferation führen können [Guo, 1995].
Desweiteren bewirkt VEGF die Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 [Nor, 1999].
Interessanterweise findet sich auch in Dysplasien des Magen-Darm-Traktes eine verstärkte
Bcl-2 Expression [Cho, 1998].
Sowohl die Hyperproliferation als auch die Entwicklung von apoptoseresistenten Zellen sind
im Zusammenhang mit der chronischen H.pylori Infektion beschrieben worden [Shirin,2000].
- 93 -
6. Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 durch
H.pylori Stämme sowie die beteiligten Signaltransduktionswege näher untersucht.
Desweiteren wurde die Induktion zweier putativer AP-1 abhängiger Gene, Cyclin D1 und
VEGF, analysiert. Die Versuche wurden durch Kokultivation von H.pylori mit der
Magenepithelzellinie AGS als ein Modellsystem für die H.pylori Infektion des Magens
durchgeführt.
Es konnte erstmals gezeigt werden, daß H.pylori Stämme, die die Pathogenitätsinsel cag
besitzen, den Transkriptionsfaktor AP-1 induzieren können, der durch Supershiftanalyse als
Heterodimer
der
Proteine
c-Fos
und
c-Jun
identifiziert
werden
konnte.
Die
Transaktivierungsaktivität des induzierten AP-1 Komplexes konnte im Reportergenassay
nachgewiesen werden.
Die durch Signaltransduktion der H.pylori verursachten AP-1 Stimulation erfolgt dabei über
die Aktivierung von MEK-1/2 und ERK1/2 sowie der Phosphorelierung des Transkriptionsfaktors Elk-1 und resultiert in einer Neusynthese des Protoonkogens c-Fos auf mRNA und
Proteinebene. Auch vermag H.pylori in AGS Zellen die MAPK JNK zu aktivieren und
konsekutiv die Transaktivierungskapazität von c-Jun durch Phosphorelierung zu erhöhen.
Als weiteres wichtiges Ergebnis ist festzuhalten, daß jeweils nur H.pylori Stämme, die eine
intakte Pathogenitätsinsel cag besitzen (G27, 151, 69A, NTCT 11638, ATCC 43405), zu einer
Stimulation der Signalkaskaden und Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 führten,
wohingegen H.pylori Stämme ohne Pathogenitätsinsel (Stamm 2012, 2074) oder isogene
Mutanten des H.pylori Stammes G27 mit Mutation der Gene cagE, cagG, cagH, cagI, cagL,
cagM im Vergleich zu Hintergrundsaktivität keine oder nur geringfügige Aktivierung der
Signalkaskaden verursachen. Die gleichen Gene werden auch für die Aktivierung des
Transkriptionsfaktors
NF-κB
benötigt,
was
dafür
spricht,
daß
der
bakterielle
Virulenzkomplex, der für die Stimulation der Transkriptionsfaktoren AP-1 und NF-κB
verantwortlich ist, identisch ist.
Zusammenfassend
vermag
H.pylori
neben
der
bekannten
Stimulation
des
Transkriptionsfaktors NF-κB auch den Transkriptionsfaktor AP-1, sowie die ERK und JNK
MAPK Signalkaskade zu aktivieren. Hierdurch kann nicht nur die akute Entzündungsreaktion
des Magens bei einer H.pylori Infektion auf einer molekularen Ebene besser erklärt werden,
sondern es können auch Phänomene der chronischen Infektion mit H.pylori wie die
Hyperproliferation der Magenschleimhaut sowie die neoplastische Transformation besser
verstanden werden.
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Abkürzungen
#
°C
λ
µ
Abb.
AK
AP-1
APS
ATCC
ATP
bp
bZIP
bzw.
BSA
Cag
cDNA
Ci
cpm
CMV
CTP
ddH2O
DEPC
DMSO
DNA
DNAse
DTT
EDTA
EPEC
ERK
EGF
EGF-R
EGTA
EMSA
FCS
h
GTP
H.pylori
HEPES
HSV
HTLV
IL
JNK
Kb
kD
Lb
m
M
MAPK
Nummer
Grad Celsius
Wellenlänge
Mikro
Abbildung
Antikörper
Activator Protein 1
Ammoniumperoxidsulfat
American Type Culture Collection
Adenosintriphosphat
Basenpaare
Transkriptionsfaktoren mit einer β-Zipperdomäne
beziehungsweise
Bovines Serumalbumin
Cytotoxin assoziiertes Gen
komplementäre DNA
Curie
counts per minute
Zytomegalievirus
Cytosintriphosphat
Bidestilliertes Wasser
Diethylpyrocarbonat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonuklease
Dithiothreitol
Ethylendiamintetraacetat
Enteropathogene Escherichia coli
Extracellular Regulated Kinase
Epidermal Growth Factor
Epidermal Growth Factor Rezeptor
Ethylenglycol-bis(β-aminethylether) N,N,N‘,N‘-tetraacetat
Elektrophoretic Mobility Shift Assay, Gelretentionsanalyse
Fetales Kälberserum
Stunden
Guanisintriphosphat
Helicobacter pylori
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N‘-2-Ethansulfonsäure
Herpes Simplex Virus
human T-cell leukenia virus
Interleukin
c-Jun N-terminal Kinase
Kilobasen
Kilo Dalton
Lewis b Antigen
Milli
Molar
Mitogen aktivierte Protein Kinase
Abkürzungen
- 108 MAPKK
MAPKKK
MCP-1
MHC
min
mRNA
MOPS
NF-κB
NP-40
p38
p42
p44
PAGE
PBS
pH
PMSF
Poly(dIdC)
RLU
RNA
RNAse
RT
rpm
s
S
s.o.
s.u.
SDS
Ser
SRE
SRF
SV 40
TBE
TEMED
Thr
tk
TNF
TPA
TRE
Tris
Tyr
U
UV
V
VacA
VEGF
v/v
WASP
z.B.
Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase
Mitogen aktivierte Protein Kinase Kinase Kinase
Monocyte Chemoattractant Protein 1
Major Histocompatibility Complex
Minuten
messanger RNA
3-N-Morpholinopropanesulfonsäure
Nuclear Factor κB
Nonidet-P-40
p38 MAP Kinase
ERK 1
ERK 2
Polyacrylamid Gelelektorphorese
Phosphat Buffered Saline
Pondus hydrogenii
Phenylmethylsulfonylfluorid
Poly-deoxy-Inosin-desoxy-Cytidinsäure
Relative Light Units
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
Raumtemperatur
Rounds per minute / Umdrehungen
Sekunden
Svedberg Konstante
siehe oben
siehe unten
Natriumdodecylsulfat
Serin
Serum Response Element
Serum Response Factor
simvian virus 40
Tris-Borat-EDTA Puffer
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethyldiamin
Threonin
Thymidinkinase
Tumornekrosefaktor
12-O-Tetradecanoyl-phorbol-13-acetat
TPA Response Element
Trishydroxymethylaminomethan
Tyrosin
Umdrehungen
Ultraviolett
Volt
Vakuolisierendes Cytotoxin A
Vascular Endothelial Growth Factor
volume per volume
Wildrich Albert Syndrom Protein
zum Beispiel
Abkürzungen
Danksagung
Ganz herzlich möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. Heike L. Pahl für die Überlassung des
Themas, sowie die umfassende Betreuung, die gute Einarbeitung und die immer vorhandene
Diskussionsbereitschaft während der gesamten Durchführung dieser Arbeit bedanken.
Weiterhin möchte ich mich bei Prof. Dr. M. Kist und PD Dr. Stefan Bereswill, sowie dem
gesamten Helicobacter pylori Labor für die gute Einarbeitung sowie die stets vorhandene
Hilfsbereitschaft bei Problemen mit der Kultivierung von H.pylori bedanken.
Für die gute Atmosphäre im Labor bedanke ich mich bei Alex, Alfonso, Christpoher, Erik,
Guido, Sabine und Snezana, als Team der ersten Stunde (zumindest meiner Labortätigkeit),
sowie später Stefan, Steffen, Gesa, Matijaz und meiner Nachfolgerin Monika, die mein
Projekt mit großem Engagement weitergeführt hat. Mein Dank gilt auch unserem
Nachbarlabor Schüle, insbesondere Philip und Judith, die mir oft methodisch weiterhalfen.
Zum Schluß möchte ich meiner Familie danken, die mich über meine Studienzeit stets
unterstützt hat und somit mein Studium und das Gelingen dieser Arbeit ermöglicht hat.
Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich ehrenwörtlich, daß ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt
und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Weiterhin erkläre ich, daß diese Dissertation weder in gleicher Weise noch in anderer Form
bereits in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen hat.
Auch habe ich keinen anderen Promotionsversuch unternommen.
Freiburg, den 19.7.2002
Curriculum vitae
Name :
Geburtstag :
Geburtsort :
Vater :
Mutter :
Familienstand :
Tobias Meyer-ter-Vehn
26.Dez.1972
München
Herr Prof. Dr. Jürgen Meyer-ter-Vehn, Physiker am MPI für
Quantenoptik, Garching
Frau Dipl. Sozialwirtin Helga Meyer-ter-Vehn, Mitarbeiterin bei der
Unternehmensberatung Roland Berger
ledig
Schulbildung
1979 - 1983
1983 - 1992
8.Juli 1992
Grundschule Garching Ost
Werner Heisenberg Gymnasium Garching
Allgemeine Hochschulreife
Studium
Nov1992 – Okt1994 Studium Physik an der TU München
Okt 1994
Diplomvorprüfung in Physik an der TU München
Okt1994 - Sep1996
Sep 1996
Sep 1997
Mär 2000
Doppelstudium Physik an der TU München und Medizin an der LMU
München. Dabei Erwerb sämtlicher Scheine des Hauptstudiums Physik.
Ärztliche Vorprüfung an der LMU
I. Staatsexamen - Medizin an der LMU München
II. Staatsexamen - Medizin an der ALU Freiburg
Mai - Jul 2000
Aug - Okt 2000
Nov/Dez 2000
Jan/Feb 2001
PJ-Tertial Neurologie an dem UKL Freiburg
PJ-Tertial Chirurgie am Kantonspital Chur / Schweiz
PJ-Tertial Innere Medizin an der University of Toronto / Kanada
PJ-Tertial Innere Medizin an der University of Birmingham / UK
Mai 2001
III. Staatsexamen Medizin an der ALU Freiburg
Beruf
Seit Okt 2001
AiP in der Abteilung für Rheumatologie und Immunologie (Prof. Peter)
am UKL Freiburg
Promotion
Mär1998 - Dez 1999 Doktorarbeit an der Klinik für Tumorbiologie - Sektion Experimentelle
Anästhesiologie der Anästhesiologischen Universitätsklinik Freiburg
Thema : Immunreaktion bei Helicobacter-pylori Gastritis
Sep 1999
Teilnahme an der Jahrestagung 1999 der DGVS in Leipzig mit
Vorstellung von eigenen Ergebnissen als Referat