7. Zusammenfassung

Zusammenfassung
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7. Zusammenfassung
SnRK1 Protein Kinasen (sucrose-non-fermenting-1-related) sind an die Regulation des
pflanzlichen
Metabolismus
beteiligt,
mittels
Steuerung
von
Genwirkung
und
Phosphorylierung. Das Ziel dieser Arbeit war, die Rolle von SnRK1 in der
Erbsensamenentwicklung zu untersuchen.
1. Eine Voll-Längen -cDNA wurde gefunden, indem eine V. faba-DNA-Bibliothek mit einem
RT-PCR Fragment als Sonde durchmustert wurde. Das Fragment wurde durch Primer
amplifiziert, die von bekannten pflanzlichen SNF1-ähnnliche Kinasen abgeleitet wurden. Die
V. faba-cDNA-Bibliothek diente als Schablone. Die resultierende DNA-Sequenz wurde als
VfSnRK1 bezeichnet und kodiert ein Protein von 509 Aminosäuresten. Die Voll-Längen
cDNA von SnRK1 aus P. sativum wurde als EST aus einer Erbsen-EST-Bibliothek isoliert
und kodiert ebenfalls ein Protein von 509 Aminosäureüberresten. Das PsSnRK1 hat eine
Domänenstruktur, die der von VfSnRK1 ähnlich ist. Die Nukleotidsequenz von PsSnRK1 ist
zu 97,6% identisch, die Identität der abgeleiteten Proteine beträgt 98,8%.
Die Southern-Blot-Hybridisierung von V.faba genomischer DNS, zeigt eine einzige Kopie im
Genom auf.
Zeitliche und räumliche Expressionsmuster wurden durch Northern- Blot-Hybridisierung in
unterschiedlichen Geweben von V. faba analysiert. Transkriptspiegel waren hoch in sinkOrganen wie Wurzeln, Hülsen und Fruchtknoten und kaum nachweisbar in der Samenschale.
Während der Samenentwicklung waren die Expressionsspiegel von VfSnRK1 zwischen 19
TNB (Tage nach Befruchtung) und 23 DAP am höchsten und nach 24 DAP verringert.
VfSnRK1p-Kinaseaktivität wurde mit einem SAMS-Peptidassay in einer zu 40% gesättigtem
Ammoniumsulfat Fraktion der Proteinextrakte von sich entwickelnden Embryos gemessen.
Das zeitliche Profil der Enzymaktivität bezogen auf Transkriptenmengen war ähnlich, aber
die Spitze der Aktivität war zwei Tage nach hinten verschoben.
2. Um die Struktur des VfSnRK1 Gens zu überprüfen, wurde die 5'-flankierende Region von
1,9 Kb Länge mittels „Genom walking“ kloniert. Unmittelbar stromaufwärts vom
Initiationskodon der Translation wurde ein Intron von 1,5-Kb-Länge gefunden. Um die
Promoter Aktivität zu prüfen, wurde zwei chimäre Konstrukte des β-glucuronidase-Gens
hinter den Promoterregionen mit und ohne Intron gemacht. Die transiente Expression in
Protoplasten zeigte, dass GUS- Expressionshöhe vom Vorhandensein des Intron abhängt und
bewies, dass diese Sequenz einen funktionellen Promoter darstellt. Die Promoteraktivität
wurde durch Cytokinine herunterreguliert.
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Zusammenfassung
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Diese Daten zeigen, dass SnRK1 an die Regelung des Zellenzyklus entweder direkt oder
indirekt beteiligt ist.
Eine spezifische Hochregulation der GUS-Aktivität wurde durch Behandlung mit
Abscisinsäure (ABS) und niedrigen Zuckerkonzentration beobachtet. Das zeigt die kritische
Rolle
der
Regulation
von
SnRK1
durch
Phytohormone
und
Zucker
in
der
Hülsenfruchtsamenentwicklung.
3. Um den Effekt des Mangels an SnRK1 zu untersuchen, wurden transgene Erbsen- und
Tabakpflanzen mit einem Gen für VfSnRK1 in antisense Orientierung unter Steuerung des
Vicilin Promoter erzeugt. Ausgewählte transgene Linien mit verringerten Gehalt an PsSnRK1mRNA und bis zu 71 % verringerter SAMS Peptidaktivität wurden weiter charakterisiert.
Antisense Reduktion von SnRK1 bewirkte verringerte Samenfrischgewichte und Defekte in
der Pollenentwicklung.
4. Um den SnRK1-antisense-Phänotypus auf dem molekularen Niveau zu untersuchen, wurde
eine differentielle Genexpressionsanalyse der transgenen und der Wildtyp-Samen mittels
macroarray-Analyse
durchgeführt.
Dafür
wurden
zwei
cDNA
Bibliotheken
aus
Erbsenembryos und Samenschalen konstruiert. Eine Gesamtmenge von 8414 ESTs, in 1082
Clustern (1465 Contigs) und mit 6061 Sequensen wurden charakterisiert. Davon wurden 2353
Singletons abgeleitet, annotiert und charakterisiert. 4548 EST Klone, darunter 4018 EinzelcDNA-Fragmente, wurden für Arrayfilter verwendet.
Radioaktiv markierte cDNA-Proben wurden aus RNA von Embryonen sich entwickelnder
Samen von Wildtyp (11-21 DAP) und transgenen Pflanzen (13-19 DAP, Übergangsphase der
Samenentwicklung) vorbereitet und auf die DNA Macroarrayfilter hybridisiert. Die
Signalintensität (entspricht dem relativen mRNA Expressionsniveau) von 131 unterschiedlich
exprimierten DNA-Fragmenten wurde einer Clusteranalyse unterzogen.
Zwei Hauptgruppen von cDNAs, die eindeutige veränderte Expressionsmuster während der
Erbsensamenentwicklung zeigen, wurden durch k-mean clustering identifiziert.
Das erste Cluster von EST-Profilen stellt eine Gruppe Genen dar, die in den WT-Samen
während der Übergangsphase hochreguliert sind. Transgene Samen zeigten verzögerte
Induktion dieser Gene, 57 Profile gehören diesem Cluster an. 74 Profile bilden ein zweites
Cluster, das von Genen repräsentiert wird, die in WT Samen während der Übergangsphase
herunterreguliert sind, aber in den transgenen Samen eine verlängerte Expressionsaktivität
hatten.
Der Übergang zwischen früher und später Samenentwicklung der Erbse ist von den
großräumigen Änderungen der Genexpressionsmuster sowie Stoffwechselwegen verbunden.
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Die Macroarray-Analyse ist eine gute Methode, große Mengen von Genen gleichzeitig in
ihrer Expression zu vergleichen und kann helfen, komplexe Änderungen abzuschätzen und
mögliche Aufschlüsse über Regulationsprozesse zu finden.
Die
folgende
allgemeine
Zusammenfassunge
über
die
Rolle
SnRK1
in
der
Erbsensamenentwicklung ist möglich: SnRK1 spielt eine Rolle in Zellenzyklusregulation
vermutlich durch Vermittlung von Brassinosteroidsignalen sowie durch Regulation der
Transkription vieler Zellenzyklusgene auf Ebene des chromatin remodelling. SnRK1 steuert
weiterhin ubiquitin-abhängige Proteolyse, Cytokininsignaltransduktion sowie Regulation der
Proteinbiosynthese.
Unterdrückung
von
SnRK1-Aktivität
unterbricht
den
ABA-
Signaltransduktionsweg. Ein Vergleich der Resultate, der Macroarray Hybridisierungen mit
publizierten Informationen über die Rolle von SnRK1p ergibt damit ein konsistenteres Bild
der Rolle von SnRK1 während der Samenentwicklung.
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