203 - Max-Planck

203
„K L E IN E “ E. coli K 1 2-BAK TE RIO P H AG EN I
Untersuchungen über „kleine“ E. coli K 12 Bakteriophagen
1. u n d 2. M itteilu n g
V on P.
H. H
o f s c h n e id e r
*
Aus dem Max-PIanck-Institut für Biochemie, München
und dem Laboratoire de Biophysique, Geneve *
(Z. Naturforschg. 18 b, 203— 210 [1963] ; eingegangen am 11. Dezember 1962)
Professor
A d o lf B u ten an dt
zum 60. Geb urtstag g ew id m et
1. M itt.: Die Iso lie ru n g u n d einige E ig e n sc h a fte n d e r „ k le in e n “ B a k te rio p h a g e n
M 12, M 13 u n d M 20
The isolation and some properties of three small bacteriophages M 12, M 13 and M 20 growing
on E. coli K 12-strains will be described. M 12 contains RNA. M 13 and M 20 probably single­
stranded DNA. By the phenol-procedure infectious nucleic acid of all three phages can be prepared.
„K leine“ B akteriophagen m it Teilchengewichten
von n u r w enigen M illionen sind fü r bestim m te F ra g e ­
stellungen besser geeignet als die w eitaus g rößeren
E. coli X- und T -B eakteriophagen. N achdem zuerst
1959 durch S i n s h e i m e r 1 der P h age
174 m it
dem Teilchengewicht 6,2 M illionen eingehend u n te r­
sucht w orden w ar, erw eiterten 1961 L o e b und Z i n ­
d e r 2 die K lasse der kleinen B akteriophagen durch
die Iso lieru ng des R N S-haltigen P hagens f 2.
In der vorliegenden M itteilung w ird ü b er V er­
suche berichtet, welche auf E. coli K 12-Stäm m en zur
Isolierung drei w eiterer „k lein e r“ B akteriophagen
führten. Die P hagen erhielten, ihrem F u n d o rt M ün­
chen entsprechend, die Bezeichnung M m it den Z ah­
len 12, 13 und 20. W ährend M 13 und M 20 als
N ucleinsäure DNS ** enthalten, enthält M 12 RN S.
Material und M ethoden
Bakterienstämme
E. coli K 12 H / s (Sammlung Genf Nr. GS 425),
E. coli K 12 C H fr (v. W e t t s t e i n , 1961),
E. coli C 600 ( A p p l e y a r d , 1954)3,
E. coli C ( W e ig l e und B e r t a n i , 1953)4,
E. coli Bam (Sammlung G enf),
E. coli CR 34-Stämme, vgl. nachfolgende 2. M ittei­
lung.
Standardmethoden nach A d a m s 5.
* Jetzige Anschrift: Max-Planck-Institut für Biochemie,
8 München 15, Goethestr. 31.
1 R. L . S i n s h e i m e r , J. molecular Biol. 1, 43 [1959].
2 T. L o e b u . D. Z i n d e r , Proc. nat. Acad. Sei. USA. 47, 282
[1961].
** Abkürzungen: DNS, DNSase: Desoxyribonucleinsäure,
-ase; RNS, RNSase, Ribonucleinsäure, -ase; EDTA Äthylendiamintetraessigsäure.
Elektronenmikroskopische
Negativ-Kontrast-Präpaparate 6> 7 wurden im Siemens-Elmiskop I nach E. R uska
aufgenommen.
Ergebnisse
Bei der W ahl des Isolierungsw egs w urde vom ge­
steckten Ziel ausgegangen: Es sollten kleine P hagen
m it g ro ß er W u rfg rö ß e gefunden w erden. D a nach
den E rfa h ru n g e n verschiedener A rbeitskreise in fek ­
tiöse N ucleinsäure von dem kleinen P hagen
174
relativ leicht, von grö ß eren P hag en jedoch relativ
schwer o der g a r nicht zu erhalten ist, m üßten in
einer M ischung u n b ek an n ter P hagen kleine P hagen
m it g ro ß er W u rfg rö ß e nach einem V erm eh ru n g s­
zyklus au f B akterien eine gute Chance haben, auf
dem W eg ü b er ih re infektiöse N ucleinsäure entdeckt
zu w erden.
Es w urden deshalb verschiedene A bw asserproben
nach V o rrein ig u n g durch n ied erto u rig e Z en trifu g a­
tion m it verschiedenen E. co/z-Stämmen inkubiert.
D a der von L o e b und Z i n d e r 2 beschriebene RNSP hag e f 2 ausschließlich auf E. coli F + und H frStäm m en wächst, wru rden zur Isolierung eines RNSP hag en speziell diese Stäm m e zur In k u b atio n b e ­
nutzt. Die „L y sate“ w urden nach A bschleudern der
B ak terien trü m m er und nicht lysierter B akterien
3 R. K. A p p l e y a r d , Genetics 3 9 ,
4 J. J. W e i g l e u . G. B e r t a n i ,
440 [1 9 5 4 ].
Ann. Inst. Pasteur 84,
175
[1 9 5 3 ].
5 M. H. A d a m s , Bacteriophages, Interscience Publisher, Inc.,
New York 1 9 5 9 .
c H . E. H u x l e y , Proc. Stockholm Conference on Electron
Microscopy 1 9 5 6 , p. 2 6 0 , Stockholm 1 9 5 7 .
7 S. B r e n n e r u . R. W. H o r n e , B . B . A . 34, 1 0 3 [ 1 9 5 9 ] .
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung
in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der
Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:
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204
P. H. H O FS C H N E ID E R
gegen ED TA -B oratpuffer pu 9 dialysiert und phenolisiert. Nach dem P h e n o lv e rfa h re n 8 gew onnene
N ucleinsäure w urde entsprechend dem für infektiöse
DNS aus 0 X 174 benutzten V erfahren auf P la q u e ­
b ildung u n te rsu c h t9’ 10. Es traten insgesam t drei
m orphologisch verschiedene P laquetypen auf, deren
B ildung sensitiv gegen D N Sase und resistent gegen
R N Sase w ar. Ein Typ konnte dem P hagen 0 X 174
zugeordnet w erden. Aus den verbleibenden beiden
w eiteren T ypen w urden als M 13 und M 20 bezeichnete P hagen isoliert.
A uf E. coli K 1 2 H fr w urde ein w eiterer P laq u e­
typ entdeckt; daraus isolierte P hagen (M 12) e r­
gaben hohe L ysattiter, aber keine infektiöse N uclein­
säure. Es w urde deshalb angenom m en, daß dieser
P hage RNS enthalten könnte und daß deshalb wegen
im L ysat befindlicher, schwer ze rstö rb arer R N Sase
keine infektiöse N ucleinsäure nachgewiesen w erden
konnte. D ie w eitere A ufarbeitung des P hagen M 12,
insbesondere die chemische A nalyse seiner N u clein ­
säure. bestätigte diese A nnahm e.
D er P hag e M 1 2 bildet kleine, etwas trü b e P laques
m it stark hervorgehobenem R and. Im L ysat w erden
P hagen-T iter bis zu 10 1:J/m l gefunden. M 12 ist fü r
alle b ish er geprüften E. coli K 12 F + - und H frStäm m e, nicht aber fü r F - -Stämme infektiös. Im
E lektronenm ikroskop beträgt der D urchm esser des
angedeutet hexagonalen P hagen ~ 2 7 0 Ä (N egativK o n tra st-P rä p a ra t), das P hageninnere ist gegenüber
der P hagenhülle abgesetzt und hat eine körnige
S tru k tu r (Fig. 1 ) *.
Die P räparatio n sm eth o d en und chem isch-physika­
lischen D aten w erden in einem anderen Z usam m en­
hang m itgeteilt w erden. In P h en o l-P räp araten aus
gereinigten P hagen konnte infektiöse Phenol-R N S
sowohl au f F + - wie auf F ~-S täm m en nachgew iesen
w erden. W urde die für $ X 174-DNS beschriebene
M ethode 9- 10, jedoch ohne R inder-Serum album in-Z usatz verw endet, betrug der relative T iter d er RNSP rä p a ra tio n 1 0 ~ 8 —1 0 - 6 (P hagenausgangs-P räp aratio n = 1 ). Die P laquebildung w ar stark sensitiv
gegen R N Sase und kaum sensitiv gegen D N Sase.
* Fig. 1 - 3 s. Tafel S. 192 b.
8 H . S c h u s t e r , G. S c h r a m m u. W. Z i l l i g , Z . Naturforschg.
11b. 339 [1956].
9 P. H . H o f s c h n e i d e r . Z . Naturforschg. 15b. 441 [I960],
10 P. H . H o f s c h n e i d e r . Z . Naturforschg.. im Druck.
11 I. R. L e h m a n n , J. biol. Chemistry 235. 1479 [I960].
* Anm. im Druck: Dieses Ergebnis wird hinsichtlich M 13DNS durch Untersuchungen über Dichte, Schmelzkurve
und Reaktion mit Formaldehyd bestätigt. D. P r a t t , per­
sönliche Mitteilung 1963.
D ie P h ag en M 13 (hom ogen-trübe Plaques) und
M 20 (gro ß e klare P laques) wachsen auf E. coli
K 12 F +- und H fr-Stäm m en, M 20 auch auf E. coli
K 12 F ~ -S täm m en. D er L ysattiter b eträgt für M 13
bis zu 3 '1 0 1 2 /m l, für M 20 2 - 1 0 1 0 /m l. M 2 0 w ird
durch
174 A ntiserum nicht inaktiviert.
D ie infektiöse Phenol-D N S beider Phagen w ar
sensitiv gegen eine P rä p a ra tio n von P hospho­
diesterase
Sie ist dem nach verm utlich einsträngig,
da diese N u clease-P räp aratio n vegetative „doppelsträn g ig e“ DNS von 0 X 174 nicht a n g re ift12. *
E lektronenm ikroskopisch zeigt M 2 0 eine sp h ä ri­
sche S tru k tu r ähnlich (I>X 174 m it einem D urch­
m esser von ~ 3 0 0 Ä im N egativ-K ontrast-V erfahren
(Fig. 2 ). M 13 besitzt sehr w ahrscheinlich eine
stäbchenförm ige S tru k tu r ( ~ 8 0 0 0 '8 0 Ä ) . Im E lek­
tro nenm ikroskop stellen sich nach Z erstörung rest­
licher R ibosom en durch D ialyse, EDTA- und RNSaseZ ugabe ausschließlich biegsam e Stäbchen dar. Die
Stäbchen zeigten die von B rin to n 1 3 für B akterienpili
beschriebenen Fällungs- und D epolim erisations-Erscheinungen nicht. Die In fek tio sität blieb auch nach
V erd ü n n u n g der P hag en durch die fü r die elektronen­
m ikroskopische P rä p a ra tio n verw endete P h o sp h o r­
w olfram säu re erhalten. D am it ist ausgeschlossen, daß
durch die elektronenm ikroskopische P rä p aratio n die
P h ag en zerstö rt und anschließend n u r unspezifische
B egleitstrukturen dargestellt w urden.
Diskussion
D a V ergleichsuntersuchungen fehlen, kann nicht
g esagt w erden, w ie w eit die neu isolierten kleinen
B ak teriop h agen M 1 2 , M 13 und M 20 mit anderen
in letzter Zeit isolierten kleinen Bakteriophagen ver­
w andt sind. R N S -P h agen wurden seit der ersten
Iso lieru n g durch L oeb und Z inder 2 mehrfach gefu n ­
den 14_17, alle sow eit bekannt, auf E. coli K 12 F + S täm m en. M orphologisch besteht Ä hnlichkeit zw i­
schen M 12 und f 2 (L oeb und Z ixder 2), serologisch
ist M 1 2 m it fr (H offmann-B erling 17) verwandt.
12 P . H . H o f s c h n e i d e r ,
M oskau
1961,
V.
I n te r n a t . C o n g r . B io c h e m . S y m p . I,
im D ru c k .
13 C . C . B r i n t o n , p e r s ö n l i c h e M i t t e i l u n g
14
J. E.
D a v is ,
J.
[W a s h in g to n ]
15 G . P a r a n c h y c h
H . S tra u s s
u
.
R.
1962.
L . S in s h e im e r,
S c ie n c e
134. 1427 [1 9 6 1 ].
u
.
A. F.
G r a h a m , im D ru c k .
16 C h . W e is s m a n n , p e r s ö n l i c h e M i t t e i l u n g .
17 H . H o f f m a n n - B e r l i n g
D ru ck .
u
.
R.
M a rv in , N a tu re
[ L o n d o n ] , im
„K L E IN E “ E. coli K 1 2-BA K TE R IO P H A G EN II
205
S täbchenförm ige B akteriophagen w urden bereits
frü h e r m orphologisch beschrieben 18_20. Sie sind —
ih ren A bm essungen nach (70- 1 8 0 m //) — ausge­
sprochen große P hagen und m it M 13 nicht ver­
w andt.
D er D N S-Phage fd ( H o f f m a n n - B e r l in g 17) , für
den eine stäbchenförm ige Gestalt sicher nachgewie­
sen i s t 17, zeigt dieselben G rößenverhältnisse wie
M 13.
M 20 ist ein sphärischer P hage ähnlich
174
u nd S 13, doch m it anderem W irtsbereich.
Infektiöse P henol-N ucleinsäure ist von M 12, M 13
und M 20 nachw eisbar. D er relative T ite r infektiöser
Phenol-R N S aus einer gereinigten M 1 2 -P räp a ra tio n
liegt m it 1 0 ~ 8 — 1 0 - 6 w eit unter den m it derselben
M ethode fü r
174 DNS erh alten en W erten (IO - 4
bis 1 0 ~ 3 9’ 10) . D a sich infektiöse M 1 2 Phenol-RN S
auch auf E. coli C
nachw eisen läßt, ist die Be­
schränkung des P hagenw irtsbereichs auf F + -Stämme
verm utlich nicht durch eine W irtsk o n tro lle des P h a ­
gen, so n d ern durch fehlende A d so rp tio n an F~-Stäm m en bestim m t.
18 H.
19 U.
20 V. B y s t r ic k y u . L. S e v c o v ic o v a , Zbl. Bakteriol., Parasiten­
kunde Infektionskrankh., Abt. I, Orig. 171, 25 [1957].
R u sk a ,
Arch. ges. Virusforsch. 2, 345 [1942].
Arch. ges. Virusforsch. 2, 388 [1942].
K o ttm a nn ,
2. M i t t . : V ersuche ü b er die D N S -A b h än g ig k eit d e r V e rm e h ru n g des R N S -P h a g e n M 12
The development of the RNA-phage M 12 is not inhibited in a thymine less mutant after thymine
deprival. No DNA can be synthesized under these conditions as demonstrated by the infection of the
bacteria with heavy BdU-labeled X phages. A small burst-size is produced, but the progeny phages
still have the same density as the parental heavy phages.
The additional input of Mitomycin C or BdU does not diminish the rate of M 12 synthesis for
at least 40 min, even though both agents decrease the synthesis of the small DNS-phage M 13 rapidly
under similar conditions.
The conclusions are (1) no phage specific DNA is involved in the development of RNS phage
M 12 and (2) the transfer of the genetic information to the progeny may proceed only by RNA.
More details will be given in English in the legends of the figures.
Bei d er V erm eh ru n g eines R N S-Phagen kann m an
im P rin z ip zwei W ege fü r die W eitergabe der gene­
tischen In fo rm a tio n an die T ochter-Phagen konzi­
p ieren : E ntw eder läuft die genetische In form ations­
kette ausschließlich über RN S-Zwischenglieder ab,
welche die identische R eduplikation der V irus-RNS
gew ährleisten, oder es w ird eine DNS-Zwisehenm atrize gebildet, die als P rä g er fü r die R eduplika­
tion der V irus-R N S * dient. Sollte letzteres zutreffen,
m üßten E ingriffe in den DNS-Stoffwechsel infizierter
B akterien die V erm eh ru n g eines R N S-Phagen beein­
trächtigen. D er Nachweis bzw. der Ausschluß eines
solchen Z usam m enhangs kann d aher zur Entschei­
dung b eitrag en , ob die genetische Inform ationskette
d er R N S -P hagen ein DNS-Zwischenglied enthält.
D ie vorliegende M itteilung beschäftigt sich mit
V ersuchen über die V erm ehrung des RN S-Phagen
M 1 2 u n d der D N S-Phagen X und M 13 bei ver­
ändertem DNS-Stoffwechsel der infizierten B akterien.
D ie V erm eh ru n g der P h ag en w urde bei In h ib itio n
der D N S-Synthese in d er T hym in-M angelm utante
CR 34 H fr, bei D N S-A bbau durch M itom ycin C-Einw irkung u n d bei durch BdU g estörter D N S-Synthese
untersucht.
* Abkürzungen: BdU Bromdesoxyuridin, DNS Desoxyribonucleinsäure, RNS Ribonucleinsäure.
** Dr. D. P r a t t , Madison, danke ich sehr für die Überlassung
der C 34 F + und Hfr Mutanten.
1 T. O k a d a , K. Y a n a g is a w a u . F. Y . R y a n , Z. Vererbungs­
lehre 92, 463 [1961].
2 R. K. A p p l e y a r d , Genetics 39, 440 [1954].
3 G. K e l l e n b e r g e r , M. L. Z i c h i c h i u . J. W e i g l e . J. molecu­
lar Biol. 3, 399 [1961],
4 M. H. A d a m s , Bacteriophages Interscience Publishers Inc.,
New York 1959.
M aterial und M ethoden
Material
Bakterienstämme
E. coli CR 34 ( O k a d a et alii 1961)
E. coli CR 3 4 H fr (D. P r a t t , 1 9 6 2 ) **,
E. coli CR 3 4 F + (D. P r a t t , 1 9 6 2 ) **,
E. coli K 12 H As (Sammlung Genf, Nr. GS 425),
E. coli K 12 C (v. W e t t s t e i n , 1961).
E. coli C 6 0 0 ( A p p l e y a r d , 1 9 5 4 ) 2.
206
P. H. H O FSCH NE ID E R
Bakteriophagenstämme
/c b + , /c ~ b + (beide K e l l e n b e r g e r et alii 1961),
M 12, M 13, s. vorhergehende 1. Mitteilung.
Medien
Als Nährmedium wurde M-9-Medium angreichert
mit 0,5,% Aminosäuren (Casamino-acids Difco, gerei­
nigt mit Aktivkohle) verwendet ( = M 9 A ). Thymin
und Vit.
wurden, wenn erforderlich, mit 10 7 / ml zu­
gesetzt. Für Versuche mit Mitomycin C wurde die
Mg2®-Konzentration auf 5 -1 0 _ 4 -m. vermindert. Als
Adsorptionsmedium für A-Phagen wurde 0,01-m. Ma­
gnesiumsulfat verwendet.
Mitomycin C: Kyowa Fermentation Industry Tokyo/
Japan *.
Methoden
Standardmethoden nach
Präparation
A d a m s 4.
der P ha ge n
M12
und
M13
Die W irtsbakterien wurden in M 9 A-Medium an­
geimpft und bei einem Titer von ca. S 'lO ^ m l mit einer
Phagenm ultiplizität von 1 0 infiziert. Nach 2 Stdn.
wurde die Lyse "** abgebrochen und das Lysat nach
Zugabe von Chloroform durch niedertourige Zentrifu­
gation von Bakterien und Bakterientrüm m ern befreit.
Nach Zugabe von je 5 y RNSase und DNSase/ml und
halbstündiger Inkubation bei 37° wurden die Lysate
24 Stdn. bei 4° gegen 0,1-m. Kochsalz (100-faches Vo­
lumen 2 -maliger Wechsel der Vorlage) ausdialysiert.
Für alle weiter beschriebenen Versuche wurden die
Lysate in dieser Form verwendet. Die präparative Auf­
arbeitung der Lysate wird in anderem Zusammenhang
geschildert.
P r ä p a r a t i o n der BdU - m a r k i e r t e n
Ac b + - P h a g e n
E. coli C 34-Bakterien wurden beim Titer S ’ lO^/ml
abzentrifugiert, in Nährmedium ohne Thymin aufge­
nommen und 45 Min. bei 37° unter Belüftung inku­
biert. Anschließend wurden die Bakterien nochmals ab­
geschleudert, 10-fach konzentriert, in Adsorptions­
medium aufgenommen, infizert (M ultiplizität = 3),
mit thymin-freiem Nährmedium, das 20 7 BdU/ml ent­
hielt, wieder auf den Ausgangstiter verdünnt und bei
37 cC belüftet. Nach 3 Stdn. wurde die Lyse durch Zu­
gabe von Chloroform vervollständigt. Nach Zugabe von
je 5 7 RNSase und DNSase, wurden die Phagen hoch­
tourig (30 000 U/min l h) abgeschleudert, in 0,01-m.
Magnesiumsulfat aufgenommen, nach erneuter Zugabe
von DNSase gelöst und 24 Stdn. gegen 0,01-m. M agne­
siumsulfat ausdialysiert. Abschließend erfolgte eine
* Für die Überlassung der erforderlichen Mengen danke ich
Herrn Dr. H. K e r s t e n sehr.
** A nm .: Die Lyse durch M 13 ist sehr schlecht, eine Ab­
nahme der Trübung tritt kaum ein.
0 M . M e s s e l s o n , F. W. S t a h l u . J. V i n o g r a d , Proc. nat. Acad.
S e i . 43. 581 [1957].
Gradienten-Zentrifugation. Das Röhrchen wurde trop­
fenweise abgelassen; alle Phagen-Fraktionen m it der
Dichte Q ^ 1,52 g/ml wurden vereinigt und gegen
0.01-m. Magnesiumsulfat ausdialysiert. ~ 9 9 % der P ha­
gen dieser Sammelfraktion hatten eine Dichte von
o i> 1,52 g/ml.
V o r b e r e i t u n g der Ba k t e r i e n für V e r ­
suche unter Thy min mangel
C34 Hfr-Bakterien wurden in M 9 A-Medium, das
10 7 /m l Thymin enthielt, angeimpft und bei einem
Titer von ~ 5 - 1 0 8/ml abgeschleudert. Die Bakterien
wurden dann in 0 ,0 1 -m. Magnesiumsulfat gewaschen,
erneut abgeschleudert, in thymin-freiem Medium auf­
genommen ( ~ 5 - 1 0 8 /ml) und 1 —3 Stdn. bei 37 °C
unter Belüftung ausgehungert. Anschließend wurden
die Bakterien nochmals abgeschleudert, in 0,01-m. Ma­
gnesiumsulfat aufgenommen ( ~ 3 • 1 0 9 /ml) und dann
10-fach mit thymin-freiem Medium verdünnt. Die P ha­
geninfektion wurde z. T. vor dieser Verdünnung (2, / +
M 12), z. T. danach (M 12, M 13) ausgeführt.
Be s t i m m u n g der P h a g e n v e r m e h r u n g s Zei tkurven und der Ly s a t t i t e r
Alle Werte geben den Gesamttiter der intra- und
extracellulären Phagen an. M 12- bzw. M 13-infizierte
Bakterien wurden zur gewünschten Zeit durch Verdün­
nung 1 : 10 in EDTA (0,025%) — Lysozym (0,0025%)
Lösung (10 Min. 37 °C) lysiert, /.-infizierte Bakterien
durch Schütteln mit Chloroform.
Gradienten-Zentrifugation5’ 6 wurden im CaesiumChlorid o = l,51 g/ml 2 0 Stdn. im SW 39-Rotor der
Spinco-Modell L-Zentrifuge bei 25 000 U/Min. durch­
geführt.
E rg e b n is s e
1. D i e I n h i b i t i o n d e r D N S - S y n t h e s e
d u r c h T h y m i n m a n g e l bei der T h y m i n M a n g e 1m u t a n t e C R 3 4 H f r
Nachdem erste V ersuche gezeigt hatten, daß sich
der R N S-Phage M 12 in der M utante CR 34 H fr auch
u n ter Thym in-M angelbedingungen entwickelt, w ar fü r
die D eutung des Resultats wichtig zu wissen, ob die
D N S-Synthese bei dieser M utante u n ter T h y m in ­
m angel vollständig oder n u r teilweise zum E rliegen
kom m t. Es w urden deshalb K ontrollexperim ente m it
infizierten CR 34 H fr-B akterien durchgeführt, wobei
auf E rgebnisse von W^e i g l e 7 und von K a r a m a t a ,
K ellenberger
und T e r z i 8 zurückgegriffen w urde.
6
7
8
J. W e i g l e , M . M e s s e l s o n u . K. P a i g e n , J. molecular Biol. 7.
379 [1959].
J. W e i g l e , Persönliche M itteilung 1962.
D. K a r a m a t a , E. K e l l e n b e r g e r , G. K e l l e n b e r g e r u .
M. T e r z i , Pathol, et Microbiol. [Basel] 25, 575 [1962].
„ K L E IN E “ E. coli K 12-BAK TE RIO PH AG EN I
D em nadi sinkt in thym in-gehungerten, /-infizierten
CR 34-B akterien die W urfgröße auf ~ 1 a b 7, ob ­
wohl reichlich P hagenkopfprotein 8 und Lysozym 7
pro d u ziert w erden. Das heißt, es w ird eine starke
V erm inderung der P ro d u k tio n infektiöser P artikel
beobachtet, die durch eine einschneidende V erm inde­
rung oder eine U nterbrechung der D N S-Synthese
erk lärt w erden kann.
F ü r die T hym in-M angelm utante CR 34 H fr ergaben
sich dieselben R esultate. Nach Infektion der B akte­
rien sank die Zahl infektiöser P artik el zunächst
durch A dsorption ab, um nach etw a 45 M in. w ieder
anzusteigen. Bei einer Infektions-M ultiplizität von
5, 3 und 1 betrug die W urfgröße im C hloroform Lysat 0,5, 0,25 und 0 , 1 .
Um zu entscheiden, ob u n ter den gew ählten
T hym in-M angelbedingungen n u r eine V erm inderung
o der eine völlige Inhib itio n der D N S-Synthese ein ­
getreten w ar, w urden durch B dU -M arkierung schwer
gem achte /.cb-"-Phagen durch thym in-gehungerte
Bakterien passiert und im D ichtegradienten auf eine
V eränderung ih re r ursprünglichen D ichteverteilung
207
gep rü ft. Bei einer B akterien-K onzentration von etwa
108/m l und einer Infektions-M ultiplizität von 4 b e­
tru g die A dsorption nach 15 m in 95% und die W u rf­
grö ß e im C hloroform lysat ~ 1.
D as R esultat der G radienten-Z entrifugation ist in
F ig. 1 dargestellt. Als Dichtem arke dienen lysogene
Ac+ b + -Phagen. Die Bandenlage der 5 BdU -m arkierten schweren E lternphagen i c b + und der N achkom ­
m enphagen im D ichtegradienten sow ie F orm und
W eite b eid er B anden stim m en ü b erein . D ie V er­
teilu n g der T ochterphagen ^cb + zeigt w eder im D ichte­
bereich fü r halbschw ere Phagen m it sem ikonservati­
ver DNS noch im Bereich der nicht m ark ierten leich­
ten / c + b + -Phagen ein zweites M axim um .
E ine Substitution von BdU durch T hym idin in
der DNS der N achkom m enphagen — d. h. eine DNSN eusynthese — ist som it nicht erk en n b ar. Das A uf­
treten infektiöser P hagen im Lysat ist folglich so zu
deuten, daß neusynthetisiertes P h ag en p ro tein m it
„ a lte r“ elterlicher Phagen-D N S zu „n e u en “ P hagen
erg än zt w ird.
2. D i e V e r m e h r u n g v o n M 1 2 - P h a g e n
in C R 3 4 H f r - B a k t e r i e n u n t e r T h y m i n Mangelbedingungen
Fig. 1. Density distribution of BdU labeled lc b + phages
and its progeny-phages in a lysate of the thymine-starved
thymineless mutant CR 34. Parental and progeny phages
were mixed with Ac+b+ phages as density markers and cen­
trifuged separately. In the density gradient parental and pro­
geny phages have the same density-distribution as would be
expected if the “new” phages contain the “old” parental DNA
and no DNA-synthesis takes place.
T u b e l: BdU labeled parental 2cb+ phages and 2 c + b + as
density markers.
Tube 2: Progeny of the BdU labeled Acb+ phages and
2 c+ b + as density markers.
To avoid confusion the experimental points from
tube 1 only are depicted.
W u rd en unter den beschriebenen A u shungerungs­
bed in g u n g en CR 34 H fr-B akterien m it M 1 2 -Phagen
infiziert, erreichte der T ite r im L ysat dieselben W erte
wie in den K ontrollen. Als K ontrollen w urden 2 V er­
suche angesetzt. Die Bakterien w urden ohne v o r­
heriges A ushungern infiziert oder den B akterien
w u rd e nach dem A ushungern ern eu t T hym in zuge­
setzt. Nach 1 Stde. A ushungern w ar d er L ysattiter
im Vergleich zum T iter nicht au sgehungerter, in ­
fizierter B akterien m it 1 0 1 2 P hagen/m l praktisch u n ­
verän d ert, und zw ar u nabhängig davon, ob nach der
A u shungerperiode den Bakterien T hym in zugesetzt
w urde o der nicht. Desgleichen w ar die S yntheserate
u n v erä n d ert (Fig. 4 ) . E rst wenn die A ushunger­
perio d e au f 2 oder 3 Stdn. ausgedehnt w urde, sank
der T ite r auf schließlich 40% ab (F ig. 2, K urve 2 ) .
D as A bsinken des T iters w urde durch Zugabe von
T hym in im Anschluß an die verlängerte A ushungerzeit nicht v erh in d ert (Fig. 2, K urve 1 ). Dies spricht
d afü r, daß der A bfall des Titers auf Folgeerschei­
nungen des Thym in-M angeltodes zurückzuführen ist.
D as A bsinken des T iters trat näm lich nicht ein, wenn
durch A ushungern der B akterien in thym in-freiem
Salz- an statt in thym in-freiem N ährm edium der
T hym in-M angel-Tod v erh in d ert w urde.
P. H. H O FS C H N E ID E R
208
3. D i e W i r k u n g v o n M i t o m y c i n C a u f
die V e r m e h r u n g des R N S - P h a g e n M 1 2
und des D N S - P h a g e n M13
0
1
2
3
hours of starvation — ►
Fig. 2. Demonstration of M 12 growth independent of DNAsynthesis. Thymineless bacteria CR 34 Hfr (108/ml) were
infected (m.o.i. 5 —10) after different periods of thymine
starvation. Curve (1) represents the titers when the medium
was completed with 10 y thymine/ml at infection time, curve
(2), when no thymine was added. The bacteria were lysed
artifically two hours after infection. DNA-synthesis, inhibited
in curve (2) by thymine deprival, has no detectable effect on
M 12 growth when the starvation period before infection is
not longer than two hours. The decrease in curve (1) and
(2) after 3 hours starvation my be due to the thymineless
death of the bacteria. Curves (3m), (3;.) and (4m), (4;) re­
present the results of simultaneous infection with M 12 and X.
When thymine is present (3m), (3;_) DNA-synthesis occurs
and both phages are developed. In Thyminefree medium
(4m , 4;) only M 12, but not A, is developed in normal
amounts. M 12 cannot start DNA-synthesis either by enzymeinduction or by thymine-contamination since it cannot help X
for development.
Es ist unw ahrscheinlich, daß bei der Infektion m it
M 12-Phagen den thym in-gehungerten Bakterien
gleichzeitig Thym in zugeführt w urde. D er V erd ü n ­
n u ngsfaktor des nuclease-behandelten und gut ausdialysierten Phagen-Stocks bis zur Infektion betru g
m indestens 10 :3 in allen Experim enten.
Um eineT hym inkontam ination (und gleichfalls eine
E nzym -Induktion) m it Sicherheit auszuschließen, w u r­
den ausgehungerte B akterien gleichzeitig m it M 12und m it /-P h a g en infiziert. Wie Fig. 2, K urve 4 ).
zeigt, ist eine V erm ehrung der /.-Phagen, welche auf
A nw esenheit von T hvm in schließen ließe, nicht zu fin­
den. Ein A nstieg des /-P h a g en titers über den In ­
fektionstiter hinaus w urde nur beobachtet, wenn ta t­
sächlich T hym in zugesetzt wurde (K urve 3 /.). Die
Synthese der M 12-Phagen w urde trotz der gleich­
zeitigen Infektion m it /-P hagen unter diesen V er­
suchsbedingungen nicht m eßbar beeinflußt (K urven
3\[ und 4m) •
M itom ycin C fü h rt w ahrscheinlich durch F re i­
setzung einer N uclease aus R ib o so m en 9 zu einem
A b b au von D N S. Es zerstö rt dadurch den v o rh an d e­
nen D N S-B estand und w irkt der D N S-Neusynthese
entgegen. M itom ycin C m üßte deshalb die V erm eh­
ru n g eines R N S-Phagen nicht n u r dann reduzieren,
w enn D N S-N eusynthese zu dessen V erm ehrung e r­
forderlich w äre, sondern auch, wenn der vor In fek ­
tio n vorhan d en e D N S-Bestand fü r die P hagenver­
m eh ru n g ben ö tig t w ürde.
P arallel zu den V ersuchen m it dem P hagen M 12
w urden entsprechende E xperim ente m it dem kleinen
D N S-Phagen M 13 durchgeführt, um den evtl. zu
erw arten d en M itom ycineffekt besser abschätzen zu
können.
W ie Fig. 3 zeigt, w ird in nicht ausgehungerten
CR 34 H fr-B akterien bei Z ugabe von 20 y M itom ycin C
5 M in. vor In fek tio n die V erm eh ru n g von M 12P hagen bis etwa zur vierzigsten M in. nicht beeinflußt
min ---- *■
Fig. 3. The different effect of Mitomycin C on the growthrates of the RNA phage M 12 and the DNA phage M 13.
E. coli K 12 C bacteria (2 -1 0 8/ml) were infected with M 12
or M 13 phages (m.o.i. = 5) at zero-time. Curve (1) control
for M 12. Curve (2) control for M 13. Curve (3) and curve
(4) 20 y M/ml added 5 min. before infection with M 12 and
M 13, respectively. Contrary to M 12 the growth-rate of M 13
is decreased in the first 40 min. of the growth cycle and the
final titer is only ~3% of the control instead of ~25%
for M 12.
9 H.
K ersten ,
B.B.A. 55,
5 58 [1 9 6 2 ].
„ K L E IN E “ E. coli K 1 2-BA K TE R IO P H A G EN II
(K urven 1 und 3 ). Die V erm ehrung
gen Avird dagegen deutlich verzögert
im 2-Stdn.-Lysat erreicht n u r 4%
(K urven 2 und 4 ) . In Fig. 4 ist das
der M 13-Phaund d er T iter
der K ontrolle
E rgebnis eines
209
zustande. D er M 13-T iter sank im 2-Stdn.-Lysat von
thym in-gehungerten und d an n infizierten B akterien
auf 2% ab. wenn zum Z eitpunkt der Infektion an
Stelle von T hym in (Fig. 5, K urve 3) BdU (K urve 4)
zugesetzt w urde.
Geht m an davon aus, daß dieser Effekt ü ber eine
B eeinflussung der P hagen-D N S-Synthese bzw. über
die m utagene W irk u n g des BdU bew irkt w ird, sollte
fü r einen R N S -P hagen eine vergleichbare W irkung
erw artet w erden, sofern in die V erm ehrung des P h a ­
gen eine D N S-Zw ischenm atrize eingeschaltet ist.
Es w urden deshalb entsprechende Versuche m it
M 12-Phagen d u rchgeführt. Sie ergaben, daß die
M 12-V erm ehrung durch BdU nicht beeinflußt w ird.
In thym in-gehungerten B akterien w urde w eder die
S yntheserate noch die E ndausbeute von M 1 2 beein­
flußt, w enn dem N äh rm ed iu m an Stelle von Thym in
(Fig. 5, K urve 1 ) BdU (K urve 2 ) zugesetzt w urde.
mm-— >■
Fig. 4. Demonstration of M 12 growth after thymine deprival
in presence of Mitomycin C. Thymineless CR 34 Hfr bacteria
(2 -1 0 8/ml) were starved one hour for thymine and infected
with M 12 phages (m.o.i. = 5) at zero-time. Curve (1)
growth-curve of M 12 in medium completed with 10 y / ml
thymine after the starvation period. Curve (2) growth-curve
of M 12 in thyminefree medium. Curve (3) conditions the
same as in curve (2), but 20 y Mitomycin/ml added 5 min.
before infection. The phage development is not changed by
Mitomycin C for the first 40 min. Later the phage develop­
ment is decreased which may be caused by the Mitomycindeath of the bacteria [curve (5), uninfected bacteria, number
of colony-formers], which is faster than the thymineless death
[curve (4), uninfected bacteria, number of colony formers,
curve starting one hour after starvation].
entsprechenden Versuchs dargestellt, jedoch unter
T hym in-M angelbedingungen. Bis zur vierzigsten
M in. erfolgt die M 1 2 -V erm ehrung unter M ito­
m ycin C (K urve 3) gleich schnell wie in den K on­
trollen (K urven 1 und 2 ). E rst später bleibt die
V erm eh ru n g im M itom ycin C-Ansatz zurück. Dies
ist verm utlich auf Folgeerscheinungen des Mitom ycin-C-Todes (K urve 5) der B akterien zurückzu­
fü h ren , welcher schneller ein tritt als der Thym inM angel-Tod (K urve 4 ).
4.
D er Effekt von BdU auf die V e r ­
m e h r u n g v o n M 12- u n d M 1 3 - P h a g e n
unter Thymin-Mangelbedingungen
W enn thym in-gehungerte CR 34 H fr-B akterien m it
dem D N S-Phagen M 13 infiziert w erden, kom m t
u n ter B dU -E inw irkung nu r eine kleine W urfgröße
0
30
60
90
120
min — *■
Fig. 5. The different effect of BdU on the growth-rates of the
RNA phage M 12 and the DNA phage M 13. Thymineless
bacteria CR 34 Hfr (3 '1 0 8/ml) were starved one hour for
thymine and infected with M 12 or M 13 (m.o.i = 5). Curve
(1) and (3) growth of M 12 and M 13, respectively, in medium
completed with 10 y thymine/ml (Control). Curve (2) and
(4) growth of M 12 and M 13, respectively, in thyminefree me­
dium containing 20 y BdU/ml. While the growth-rate of M 13
in a thyminefree BdU containing medium is very strongly de­
creased, the growth-rate of M 12 under these conditions is
that expected in a thyminefree medium without B dU ; that
means no effect of BdU on M 12 growth can be detected.
D iskussion
Die V erm eh ru n g des R N S-Phagen M 12 w ird in
der T hym in-M angelm utante CR 34 H fr nach 1-stdg.
210
K. M U N K U N D G. S A U E R
A ushungern in thym in-freiem N ährm edium nicht ge­
hem m t, obw ohl u n ter diesen B edingungen keine
D N S-Synthese m ehr nachw eisbar ist.
Es w erden zw ar auch bei T hym inm angel noch
2-Phagen freigesetzt, aber dieser B efund weist n u r
scheinbar auf D N S-Synthese h in : D ie „ n e u en “ P h a ­
gen enthalten in W irklichkeit „ a lte “ elterliche DNS.
D ie W urfgröße im T hym in-M angel-Lysat erreicht
nicht die Infektionsm ultiplizität. S ind die P hagen im
L ysat Nachkom m en von B dU -m arkierten schweren
E lternphagen, so sind im D ichtegradienten Dichte
und D ichteverteilung beider identisch. D ies w äre, im
F all einer D N S-Neusynthese, unter A usnutzung von
T hym in-Spuren oder von D N S -A bbauprodukten der
B akterien nicht denkbar.
Die M öglichkeit, daß durch die M 12-Infektion der
Enzym block der T hym in-M angelm utante durch I n ­
d uktion um gangen oder daß T hym in zugeführt w ird,
ist ausgeschlossen: Die ^.-Phagen-Entw icklung w ird
u n ter T hym in-M angelbedingungen durch sim ultane
Infektion m it M 12 nicht gesteigert. Ist T hym in zu­
gegen, verm ehren sich beide P hagen bei gleichzeiti­
ger Infektion gleich gut.
D as Mol.-Gew. von M 12 liegt, verglichen m it X,
um etwa eine G rößenordnung tiefer. D asselbe gilt
fü r den V ergleich der N ucleinsäuren. Es könnte des­
halb sein, daß eine sich unter T hym inm angel e r­
schöpfende D N S-Synthese, die als A-DNS nicht m eß­
b a r w ird, noch zur P ro d u k tio n zum indest einer M 12
D N S-M atrize ausreicht. T räfe dies zu und w ürde n u r
eine D N S-M atrize die Synthese der M 12-RNS
steuern, so sollte M itom ycin C durch F reisetzun g von
D N Sase im B akterium und Z erstörung dieser M atrize
die M 12-V erm ehrungsrate deutlich beeinflussen.
D ies w ar aber experim entell nicht zu beobachten.
E rst nach 40 M in. w ird die P h ag en p ro d u k tio n , w a h r­
scheinlich infolge des raschen M itom ycin C-Todes
der Bakterien, verm indert. Die V erm eh ru n g srate der
D N S-Phagen M 13 w urde im G egensatz dazu durch
M itom ycin C selbst bei T hym in-G egenw art w ährend
der gesam ten Entw icklungszeit stark verm indert.
E in entsprechendes R esultat ergaben die E x p eri­
m ente m it BdU. W urde thym in-gehungerten CR 34
VIII. Int. Congr. Microbiol. Montreal 1962.
11 E. H. S im o n , Virology 13, 105 [1961].
12 T. B e n - P o r a l , M. R e is s ig u . A. S. K a p l a n , Nature [Lon­
don] 190, 33 [1961].
10 S . S p ie g e l m a n n ,
H fr-B akterien BdU an Stelle von Thym in angeboten,
sank n u r die V erm ehrung des D N S-Phagen M 13
stark a b ; die M 12-A usbeute blieb u n verändert. D a
BdU n u r in DNS, nicht ab e r in RNS eingebaut w ird,
ist dieses E rgebnis so zu erklären, daß die genetische
In fo rm atio n sk ette von M 1 2 nicht ü b er eine DNSZw ischenm atrize, sondern ausschließlich ü b er RNSZw ischenglieder abläuft.
Auch die w eiter oben diskutierten E rgebnisse
schließen m it g ro ß er W ahrscheinlichkeit aus, daß
eine DN S-Zwischenm atrize bei der V erm ehrung der
M 12-Phagen eingeschaltet ist. W ürde die DNSZw ischenm atrize nach der Infektion gebildet w erden,
sollte die M 1 2 -V erm eh ru n g entgegen den E rg eb n is­
sen der Thym in-M angelversuche von D N S-Neu­
synthese ab h än g ig sein. Desgleichen ist das V o r­
kom m en einer phagen-spezifischen D N S-Sequenz im
W irtsgenom , die als Zw ischenmatrize in F unktion
treten könnte, unw ahrscheinlich, denn auch in die­
sem F all sollte die M 12-V erm ehrung mitom ycinsensitiv sein.
Gegen eine D N S-Zwischenm atrize sprechen w eiter
die Beobachtungen, daß eine H y b rid isatio n zwischen
P h ag en RNS u n d Bakterien-D N S nicht e in tr itt 1 0 und
daß — nach eigenen V ersuchen — in infizierten
B akterien keine „infektiöse M 12-DN S“ a u ftritt *.
V ersuche ü b er die V erm ehrung tierp ath o g en er
V iren in G ew ebskulturen führten zu E rgebnissen,
die den h ie r d iskutierten entsprechen 11. M it Actinom ycin C, welches die D N S-abhängige RNS-Polym erase in h ib iert, und m it M itom ycin C läßt sich n u r
die V erm eh ru n g von D N S-V iren, nicht ab er die­
jenige von R N S-V iren beeinflussen 12,13. Es ist daher
w ahrscheinlich, daß die R eduplikation der RNSV iren generell in einem D N S-unabhängigen System
erfolgt.
Meinen Kollegen, besonders Herrn Dr. J. W e i g l e
und F rau G. K e l l e n b e r g e r , danke ich sehr für hilf­
reiche Diskussionen, ebenfalls der D e u t s c h e n
F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und dem N a t i o n a l I n s t i t u t e o f H e a l t h (Grant No. E 4267
an Dr. K e l l e n b e r g e r ) für ihre Unterstützung.
13 E. R e i c h , R . M. F r a n k l i n , A. J. S h a t k i n u. E. L. T a t u m ,
Proc. nat. Acad. Sei. USA 48, 1238 [1962].
* Anm. im Druck: Zur selben Schlußfolgerung führen Ex­
perimente von S t . C o o p e r und N. D. Z i n d e r am RNS-Phagen f 2 (Virology 18, 405 [1962]).